ES2828506T3 - Proceso para la extracción de bioplástico y producción de monómeros a partir del bioplástico - Google Patents

Abstract

Un proceso para la extracción de bioplástico de células microbianas productoras de bioplástico, que comprende las etapas de: A. proporcionar células microbianas productoras de bioplástico que comprenden bioplástico en forma de gránulos; B. proporcionar células bacterianas seleccionadas de la especie Bacillus pumilus; C. extraer el bioplástico en forma de gránulos mezclando las células microbianas productoras de bioplástico de la etapa A y las células bacterianas de la etapa B y permitir que se produzca la reacción sin interactuar ni consumir bioplástico de las células microbianas productoras de bioplástico; donde la extracción incluye una etapa de lisis por dichas células bacterianas seleccionadas de la especie Bacillus pumilus para desintegrar la estructura celular de las células microbianas productoras de bioplástico que comprenden bioplástico, donde dicho proceso para la extracción de bioplástico es una extracción y recuperación de gránulos de bioplástico sin disolventes orgánicos ni químicos.

Description

DESCRIPCIÓN

Proceso para la extracción de bioplástico y producción de monómeros a partir del bioplástico

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un bioproceso para la extracción y despolimerización de bioplásticos a partir de células microbianas productoras de bioplásticos.

Antecedentes técnicos

Después de la crisis del petróleo y durante las tres últimas décadas, los biopolímeros producidos a partir de biomasa y que tienen propiedades adecuadas para su uso como plásticos, por lo que se denominan bioplásticos, han cobrado mucho interés como alternativa renovable a los plásticos derivados del petróleo. Entre los diversos tipos diferentes de bioplásticos se encuentran los polihidroxialcanoatos (PHA) que pertenecen a la clase de polímeros de poliéster. Muchas cepas bacterianas y de Arquea pueden acumular gránulos de PHA como reservas intracelulares de carbono y energía.

El poli (3-hidroxibutirato), (PHB), es un homopolímero y es el tipo más común de PHA producido por microorganismos. Diversas cepas microbianas también son capaces de producir otros homopolímeros o copolímeros de PHA con composición monomérica variable, como poli(hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) (PHBV), poli(hidroxibutirato-cohidroxihexanoato) (PHBHx), poli(hidroxioctanoato-co-hidroxihexanoato) (PHOHx), etc.

Los PHA son de interés como plásticos biodegradables y bioderivados y tienen propiedades similares a los plásticos provenientes de fuentes fósiles ampliamente utilizados, el polietileno y el polipropileno. Los ejemplos de propiedades pueden ser la termoplasticidad, la buena resistencia a la humedad, las propiedades de barrera de aromas, etc. Además, la posibilidad de producir PHA con diferentes propiedades variando la composición monomérica, utilizando diferentes fuentes de carbono renovables, y su completa biodegradabilidad al descomponerse en el suelo, hacen que los PHA sean sustitutos muy interesantes de los plásticos convencionales. Además, los PHA muestran una gran biocompatibilidad en diferentes aplicaciones farmacéuticas y medicinales, además de sus prometedoras aplicaciones industriales y agrícolas.

El ácido poliláctico o poliláctido (PLA) es también un bioplástico alifático biodegradable derivado de recursos renovables, tales como el almidón de maíz, las raíces de tapioca, las serojas o el almidón, o la caña de azúcar. El PLA, al igual que el PHA, pertenece a la clase de los poliésteres. También se ha reportado la síntesis de PLA por bacterias recombinantes.

En el documento WO14032633 se describe un método para producir polihidroxialcanoatos a partir de sustrato de petróleo. Adicionalmente, en el documento WO12149162 se describe la producción de polihidroxialcanoato con microbios genéticamente modificados.

Sin embargo, los procesos y métodos que se conocen hoy en día y que, por ejemplo, se describen en estos documentos, presentan diversos inconvenientes. Los procesos de producción de bioplásticos de PHA implican métodos de extracción del material bioplástico producido de las células microbianas que producen dicho bioplástico. Hoy en día, tales métodos incluyen diversos productos químicos como parte del proceso. Los productos químicos que podrían utilizarse para extraer el bioplástico de las células pueden elegirse entre disolventes orgánicos, detergentes, ácido, álcali o hipoclorito. El uso de diferentes tipos de productos químicos en la producción de bioplásticos es a la vez costoso y no deseable debido a su alto impacto ambiental.

Se ha intentado evitar estos inconvenientes.

Los documentos WO08065749 y WO11145683 describen métodos para producir sustancias poliméricas naturales para el moldeo de un material biodegradable. En los documentos, el método de extracción utiliza una etapa de secado y molienda que lleva mucho tiempo, proporcionando un producto final de baja pureza.

El documento WO 2011/112154 describe la extracción de PHA de los microbios que contienen PHA usando hongos que liberan enzimas que hidrolizan las paredes celulares microbianas.

El documento WO 2006/103699 describe el uso de los actinomicetos para la lisis celular de las bacterias productoras de PHA.

Es necesario proporcionar bioplásticos de manera más respetuosa del medio ambiente y más eficiente en función de los costos para poder competir con los plásticos derivados del petróleo.

Por otra parte, se considera que los PHA son una nueva fuente renovable de productos químicos enatioméricamente puros mediante la despolimerización de los PHA en su composición monomérica, los ácidos R-3-hidroxialcanoicos (R-3-HA). Debido a las interesantes aplicaciones industriales y médicas de los R-3-HA, se están investigando diferentes métodos de despolimerización química y biológica para lograr un proceso económico y fácil de aplicar para la producción de R-3HA a partir de PHA.

Sumario de la invención

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso para la extracción de bioplástico de las células microbianas productoras de bioplástico, que comprende las etapas de:

A. proporcionar células microbianas productoras de bioplástico que comprenden bioplástico en forma de gránulos; B. proporcionar células bacterianas seleccionadas de la especie Bacillus pumilus;

C. extraer el bioplástico mezclando las células microbianas productoras de bioplástico de la etapa A y las células bacterianas de la etapa B y permitir que se produzca la reacción sin interactuar ni consumir bioplástico de las células microbianas productoras de bioplástico;

donde la extracción incluye una etapa de lisis por dichas células bacterianas seleccionadas de la especie Bacillus pumilus para desintegrar la estructura celular de las células microbianas productoras de bioplástico que comprenden bioplástico;

donde dicho proceso es una extracción y recuperación de gránulos de bioplástico sin disolventes orgánicos ni químicos.

En una realización, las células bacterianas son de Bacillus pumilus FH9.

En otra realización, el proceso de extracción comprende además una etapa de separación, donde las proteínas, los péptidos, o los aminoácidos o cualquier combinación de los mismos son separados del bioplástico. En otra realización más específica, la separación se realiza por decantación, filtración, centrifugación, agregación, flotación por aire o precipitación o cualquier combinación de las mismas. Una realización comprende además una etapa de lavado preferentemente después de la extracción y separación para lavar el bioplástico obtenido. En una realización, dicha etapa de lavado se realiza, preferentemente, utilizando agua como líquido de lavado.

En una realización, dichas células microbianas productoras de bioplástico son células bacterianas. En una realización, dichas células microbianas productoras de bioplástico son cepas bacterianas o de Archaea. En una realización, dichas células microbianas productoras de bioplástico se seleccionan de una cepa seleccionada del grupo de Ralstonia, Halomonas, Zobellella, Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus, Chromobacterium, Escherichia coli recombinante o cualquiera de las combinaciones de las mismas. Se podrían utilizar otras cepas acumuladoras de PHA u otras células microbianas productoras de bioplástico o cultivos mixtos.

En una realización, el bioplástico es un poliéster. En una realización, dicho bioplástico es un poliéster lineal. En otra realización, el bioplástico se selecciona de diferentes polihidroxialcanoatos (PHA), tales como poli(3-hidroxi- propionato) (PHP o P3HP), poli(3-hidroxibutirato) (PHB o P3HB), poli(4-hidroxibutirato) (P4HB), poli(3-hidroxivalerato) (PHV o P3HV), poli(4-hidroxivalerato) (P4HV), poli(5-hidroxivalerato) (P5HV), poli(3-hidroxihexanoato) (PHHx o P3HHx), poli(3-hidroxioctanoato) (p Ho , o P3Ho ), poli(3-hidroxidecanoato) (p Hd o P3HD), poli(3-hidroxiundecanoato) (PHU, P3HU), u otros PHA saturados o insaturados, de longitud de cadena corta o media; o ácido poliláctico (PLA); o sus copolímeros o cualquiera de sus combinaciones.

En una realización de la presente invención, no se utiliza ningún disolvente orgánico ni ningún químico ni ninguna combinación de los mismos en el proceso de extracción.

Se describe además un proceso para producir monómeros a partir de bioplástico, que comprende:

D. proporcionar bioplástico extraído producido utilizando el proceso para la extracción de acuerdo con la presente invención,

E. proporcionar una sustancia de despolimerización; y

F. despolimerizar el polímero bioplástico mezclando el bioplástico de la etapa D y la sustancia de despolimerización de la etapa E y permitir que se produzca la reacción.

En un aspecto, se proporciona la provisión de la sustancia de despolimerización mediante la adición de células microbianas que producen dicha sustancia de despolimerización del bioplástico. En un aspecto, dichas células microbianas agregadas producen una PHA despolimerasa extracelular termoestable. En un aspecto, dichas células microbianas se seleccionan de la cepa Schlegelella thermode-polymerans K14. En otro aspecto, el proceso de la presente invención comprende además una etapa de separación para la recuperación de la sustancia de despolimerización. En un aspecto, dicho proceso comprende además las etapas de:

G. proporcionar bioplástico producido de acuerdo con el proceso de extracción de bioplástico a partir de células microbianas productoras de bioplástico mencionado anteriormente;

H. proporcionar la sustancia de despolimerización de las etapas E y/o F al bioplástico;

I. mezclar el bioplástico de la etapa G y la sustancia de despolimerización de la etapa H y permitir que se produzca la reacción, para obtener monómeros del bioplástico,

con la condición de que la provisión de la sustancia de despolimerización de la etapa H se realice mediante la adición de células microbianas que produzcan la sustancia de despolimerización en la etapa E y/o F. En otro aspecto, la provisión de la sustancia de despolimerización se realiza mediante la adición de células microbianas que producen dicha sustancia de despolimerización del bioplástico. En un aspecto, dicha sustancia de despolimerización del bioplástico producida es una PHA despolimerasa extracelular termoestable. En un aspecto, dichas células microbianas se seleccionan de la cepa Schlegelella thermodepolymerans K14 o del microorganismo despolimerizante de PHA.

En una realización de la presente invención, el bioplástico es un poliéster lineal. En una realización, dicho bioplástico es polihidroxialcanoato (PHA).

Otro aspecto descrito en la presente invención es una composición de biopolímero obtenible mediante el proceso de acuerdo con la presente invención que comprende una pureza de biopolímero de al menos 88%, preferentemente al menos 90%, preferentemente al menos 95%, preferentemente al menos 97%, preferentemente al menos 98%.

Otro aspecto descrito en la presente invención se relaciona con el uso de un bioplástico extraído de acuerdo con la presente invención para la producción de productos seleccionados del grupo que comprende nanoperlas bioactivas, productos biocompatibles, productos biodegradables o renovables, termoplasto, productos elastómeros o precursores de polímeros. Un aspecto se refiere al uso de productos elegidos del grupo que comprende recubrimientos, láminas, pañales, bolsas de residuos, neumáticos, envases, artículos de un solo uso, matriz de purificación de proteínas, partes de implantes, reemplazos óseos, medicamentos de liberación lenta o portadores de fertilizantes/pesticidas.

Un aspecto se refiere al uso de un proceso de extracción de bioplástico para la producción de monómeros. En un aspecto, dichos monómeros son preferentemente monómeros de hidroxialcanoato (HA).

Otro aspecto se relaciona con el uso de un proceso de extracción de bioplástico para la producción de proteínas, péptidos o aminoácidos o cualquier combinación de los mismos. Un aspecto se refiere a la utilización del proceso de extracción de bioplástico para la producción de biomasa proteinácea residual, preferentemente de la industria de la fermentación microbiana o de la agroindustria o de las industrias de los animales y las aves de corral. Aun otro aspecto se refiere al uso de un proceso de extracción de bioplástico para la producción de biopolímeros con una pureza del 95% que no comprende el uso de disolventes orgánicos.

Un aspecto adicional se relaciona con el uso de un proceso de extracción de bioplástico de acuerdo con la presente invención para la producción de monómeros a partir de poliésteres lineales. Otro aspecto se refiere al uso de un proceso de extracción de bioplástico de acuerdo con la presente invención para la producción de un bioplástico o sus monómeros que se seleccionan del grupo de polihidroxialcanoatos (PHA): poli(3-hidroxipropionato) (PHP o P3HP), poli(3-hidroxibutirato) (PHB o P3HB), poli(4-hidroxibutirato) (P4HB), poli(3-hidroxivalerato) (p Hv o p3h V), poli(4-hidroxivalerato) (P4HV), poli(5-hidroxivalerato) (p5hV), poli(3-hidroxihexanoato) (PHHx o P3h Hx), poli(3-hidroxioctanoato) (PHO, o P3HO), poli(3-hidroxidecanoato) (PHD o P3HD), poli(3-hidroxiundecanoato) (PHU, P3HU), u otros PHA saturados o insaturados, de longitud de cadena corta o media; o ácido poliláctico (PLA); o sus copolímeros o cualquiera de sus combinaciones.

Otro aspecto se refiere al uso de un proceso de extracción de bioplástico para la producción de polímeros intracelulares microbianos. En una realización, dichos polímeros intracelulares microbianos se seleccionan del grupo de los lípidos (preferentemente triacilglicerol o TAG), partículas de polianhídrido (preferentemente polifosfato) o polisacáridos (preferentemente glucógeno).

En una realización, la presente invención se refiere al uso de una cepa bacteriana de la especie Bacillus pumilus para lisar células bacterianas productoras de bioplástico.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra un diagrama de flujo generalizado de la invención. Bioproceso para la extracción de PHA de células microbianas (A), despolimerización bacteriana de gránulos de PHA recuperados (B), despolimerización enzimática de gránulos de PHA recuperados en sus monómeros (C).

La figura 2 muestra la extracción de PHA mediante la lisis de materiales celulares que no son PHA de diferentes cepas bacterianas acumuladoras de PHA, Z. denitrificans (ZdF); H. boliviensis (HbF); R. eutropha (ReF); E. coli recombinante (EcF). Efecto de la inoculación de la cepa lítica FH9 sobre el peso seco celular (CDW, por sus siglas en inglés) de los pellets recuperados (A), Efecto de la inoculación de la cepa lítica FH9 sobre el contenido de PHA de los pellets recuperados (B). Se analizó la evolución del peso seco de las células y el contenido de PHA en diferentes intervalos de tiempo tras la inoculación de las células líticas FH9 en un medio basal complementado con diferentes cepas acumuladoras de PHA por separado en frascos de 1 litro a lo largo de 10 días (240 h).

La figura 3 muestra fotografías de microscopio electrónico de células microbianas productoras de bioplástico en diferentes intervalos de tiempo de lisis: 0, 6 y 24 horas. La barra negra en la esquina inferior izquierda es igual a 2 mm.

La figura 4 muestra un gráfico que ilustra el contenido de PHB de los pellets no lavados recuperados de un proceso de extracción de PHB. El eje X representa el tiempo de lisis en horas, y los ejes Y representan el peso seco celular de los pellets recuperados y el porcentaje de PHB recuperado (con respecto al peso seco celular (CDW), % en peso).

La figura 5 muestra micrografías electrónicas de los reactantes antes y después de la despolimerización (0 h y 39 h) que ilustran la degradación de los gránulos bioplásticos. Nótese que las células de despolimerización de PHA, si bien pueden degradar todos los gránulos de PHA liberados, no pueden atacar los gránulos de PHA que aún estaban dentro de algunas células intactas (células que no habían sido lisadas en una etapa anterior).

La figura 6 muestra un gráfico que ilustra el contenido de PHB (% en peso) recuperado del proceso de lisis de acuerdo con un aspecto de la presente invención es decir, la extracción de bioplástico a través de la lisis de las células microbianas y luego la despolimerización de los gránulos bioplásticos.

La figura 7 muestra los cromatogramas que ilustran cómo un pico a aproximadamente 20 minutos, lo que simboliza la cantidad de monómeros de PHB (3HB), que aumenta con el tiempo, luego disminuye una vez que las células de despolimerización de PHA comienzan a consumir los productos de despolimerización.

La figura 8 muestra una micrografía electrónica de gránulos de PHA en diferentes momentos de la despolimerización enzimática (2 h y 8 h), ilustrando el efecto de la PHA-despolimerasa en los lados de algunos gránulos como un contacto físico directo para facilitar el proceso de despolimerización de bioplástico.

La figura 9 muestra un gráfico que ilustra la disminución del peso seco celular (CDW) de los gránulos recuperados, y la disminución del contenido de p Hb como porcentaje del peso seco de los gránulos por la acción de la despolimerización, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, es decir, la despolimerización enzimática libre de células de los gránulos de PHA por la PHA-despolimerasa termoestable.

La figura 10 muestra cromatogramas que ilustran cómo un pico a aproximadamente 20 minutos, que simboliza 3HB, que se acumuló con el tiempo por la acción de la enzima PHA-despolimerasa y no se utilizó como en el caso de la despolimerización celular de PHA.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un bioproceso para la extracción de bioplásticos producidos en células microbianas. En la presente invención se describe además un bioproceso para la producción de monómeros a partir de dichos bioplásticos. Estos procesos se llevan a cabo sin el uso de ningún producto químico, tales como disolventes orgánicos, ácidos, álcalis u otros aditivos químicos. Por lo tanto, se proporciona una extracción y recuperación sin disolventes orgánicos y sin productos químicos de gránulos de biopolímero de alta pureza de diferentes cepas bacterianas. Además los bioplásticos se obtienen en forma natural sin degradación ni otras pérdidas. Además de los bioplásticos, también se obtienen materiales no bioplásticos durante el proceso de extracción. Los materiales no bioplásticos podrían comprender diferentes materiales celulares, tales como lípidos, ácidos nucleicos, proteínas, péptidos y/o aminoácidos y otras moléculas bioquímicas. El presente método de extracción implica la provisión de células microbianas que contienen materiales bioplásticos. Los bioplásticos se acumulan como gránulos en el citoplasma de la célula microbiana. Las células que contienen los bioplásticos son preferentemente células de bacterias o arqueas. Para llevar a cabo la extracción de acuerdo con el presente proceso, las células mencionadas que contienen los bioplásticos se ponen en contacto con inóculo de células bacterianas del género Bacillus, preferentemente de la especie Bacillus pumilus. Las células de Bacillus actúan sobre la pared celular de las células microbianas que contienen los bioplásticos, principalmente la lisan y utilizan sus componentes como nutrientes para el crecimiento. Al hacerlo, desintegran la estructura celular de las células que contienen bioplástico y descubren los gránulos del bioplástico. Los gránulos del bioplástico expuestos luego pueden ser recolectados. Se puede llevar a cabo la lisis de las células que contienen bioplástico mediante el uso de una o varias enzimas y/u otros materiales que afectan a la lisis. Se cree que el lisado obtenido tras la lisis de las células que contienen bioplástico comprende bioplástico expuesto (por ejemplo, en forma de gránulos), proteínas, péptidos, aminoácidos y otros residuos celulares en solución acuosa. Según lo descrito anteriormente, el bioplástico puede ser retirado y utilizado como un producto de alta gama y elevada pureza. También se puede utilizar en otros procesos. Además, las proteínas, los péptidos y/o los aminoácidos y otras biomoléculas también se pueden recuperar como productos de valor agregado adicionales.

Además, el proceso de acuerdo con la presente invención también permite la producción de los monómeros de los bioplásticos recuperados por despolimerización. La despolimerización se consigue utilizando sustancias despolimerizantes o células microbianas que producen dichas sustancias despolimerizantes. Las sustancias despolimerizantes pueden seleccionarse entre las enzimas y otras sustancias que afectan a la despolimerización. La despolimerización se puede realizar en una o más etapas. Como un proceso de una etapa, se pueden añadir sustancias despolimerizantes a los bioplásticos o a la mezcla completa del proceso de extracción que contiene los bioplásticos. Alternativamente, los bioplásticos o la mezcla completa del proceso de extracción que contiene los bioplásticos descritos anteriormente, pueden ponerse en contacto con células microbianas que producen sustancias despolimerizantes. A continuación, los bioplásticos se despolimerizarán al entrar en contacto con las sustancias despolimerizantes producidas. La mezcla formada puede contener una mezcla de monómeros y oligómeros. Cabe señalar que las células microbianas que producen las sustancias despolimerizantes pueden empezar a actuar, por ejemplo, consumiendo, los monómeros obtenidos, lo que puede dar lugar a una disminución del rendimiento de los monómeros. Mientras las células que producen sustancias despolimerizantes estén presentes con monómeros formados, existe el riesgo de que los monómeros sean consumidos por estas células. Para superar tal efecto, la despolimerización puede realizarse en múltiples etapas. Proporcionando una primera etapa en la que un bioplástico o una mezcla que contenga ese bioplástico se pone en contacto con células microbianas que producen sustancias despolimerizantes y se les permite reaccionar. Cuando se ha obtenido una cantidad deseable de sustancias despolimerizantes de las células, se termina la reacción. La mezcla obtenida comprende células, sustancias despolimerizantes, polímeros, monómeros, etc. Una etapa de separación separa las sustancias despolimerizantes de los demás contenidos. Las sustancias despolimerizantes separadas pueden luego utilizarse en una segunda etapa, y mezclarse con un bioplástico o una mezcla que contenga dicho bioplástico. Este proceso de dos etapas es una manera de aumentar el rendimiento de los monómeros que se van a obtener.

La producción de monómeros a partir de bioplástico producido de acuerdo con el presente proceso permite la producción de monómeros específicos de gran pureza. Este método de producción de monómeros puede ser muy atractivo por su simplicidad, eficiencia en función de los costos, eficiencia energética, elevada pureza del producto y bajo impacto ambiental. Los monómeros que pueden obtenerse en forma enantioméricamente pura pueden ser muy difíciles de obtener a través de rutas convencionales.

La presente invención se refiere a un proceso para la extracción de bioplástico de células microbianas productoras de bioplástico, que comprende las etapas de:

A. Proporcionar células microbianas productoras que comprenden bioplástico.

B. Proporcionar células bacterianas seleccionadas del género Bacillus

C. Extraer el bioplástico mezclando las células microbianas productoras de la etapa A y las células bacterianas de la etapa B y permitir que se produzca la lisis de las células microbianas productoras de bioplástico.

Este proceso hace posible extraer bioplástico de las células microbianas productoras. La presente invención ofrece una opción sin disolventes orgánicos y, por lo tanto, sugiere una tecnología alternativa más rentable y respetuosa del medio ambiente que los procesos de extracción de bioplásticos existentes.

Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a un proceso para producir monómeros a partir de bioplástico, que comprende las etapas de:

D. Proporcionar el bioplástico producido utilizando el proceso de extracción de bioplástico a partir de células microbianas productoras de bioplástico mencionado anteriormente;

E. Proporcionar células microbianas que produzcan una sustancia de despolimerización;

F. Despolimerizar el polímero bioplástico mezclando el bioplástico de la etapa D y las células productoras de la sustancia de despolimerización de la etapa E y permitir la reacción, seguido por la eliminación de la sustancia de despolimerización;

G. Proporcionar bioplástico producido de acuerdo con el proceso de extracción de bioplástico a partir de células microbianas productoras de bioplástico mencionado anteriormente;

H. Proporcionar la sustancia de despolimerización extraída de la etapa F;

I. Mezclar el bioplástico de la etapa G y la sustancia de despolimerización de la etapa H y permitir que se produzca la reacción para obtener monómeros del bioplástico.

Cabe señalar que el proceso para extraer bioplástico de células microbianas productoras y la despolimerización de gránulos de polímeros extraídos de acuerdo con la presente invención, por supuesto, puede comprender diferentes componentes estándar, tales como diversos tamaños de lote, deflectores, agitadores y demás. Además, el diseño del proceso para extraer bioplástico a partir de células microbianas productoras puede variar, y la presente invención, como se formula en las reivindicaciones y se ejemplifica en esta solicitud, debe considerarse que abarca las diferentes formas del producto.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso para la extracción de bioplástico de las células microbianas productoras de bioplástico, que comprende las etapas de

A. Proporcionar células microbianas productoras de bioplástico que comprenden bioplástico;

B. Proporcionar células bacterianas seleccionadas del género Bacillus, tal como Bacillus pumilus;

C. Extraer el bioplástico mezclando las células microbianas productoras de bioplástico de la etapa A y las células bacterianas de la etapa B y permitir que se produzca la reacción.

Las "células microbianas productoras de bioplástico", tal como se definen en la presente invención, son células de un microorganismo capaz de producir un bioplástico que puede ser extraído para su uso posterior.

Los "bioplásticos", tal como se definen en la presente invención, son plásticos derivados de fuentes renovables de biomasa, tales como, entre otros, azúcares tales como glucosa, sacarosa, fructosa, lactosa o xilosa); grasas y aceites vegetales; metanol; glicerol; almidón, celulosa, hemicelulosa, lignina o hidrolizado de suero; o gases (tales como CH4 o CO2); o cualquier combinación o sustratos residuales o corrientes de los mismos. Los plásticos petroquímicos, son derivados del petróleo. Los plásticos petroquímicos están basados en combustibles fósiles y esto contribuye a la carga de dióxido de carbono. Algunos, pero no todos, bioplásticos son biodegradables. Los bioplásticos biodegradables pueden descomponerse en ambientes anaeróbicos o aeróbicos, dependiendo de su composición. Existen diversos materiales de los que se pueden componer los bioplásticos, tales como, entre otros, almidones, celulosa u otros biopolímeros, o cualquier combinación de los mismos.

En una realización, la extracción de bioplástico de células microbianas productoras se realiza mediante lisis celular. En una realización específica, se utilizan células bacterianas líticas de la especie Bacillus pumilus, dichas células, en contacto con otras células microbianas productoras de bioplástico, contribuyen a una reacción de extracción que puede ser lisis. Como ejemplo, las células bacterianas líticas que contribuyen a la extracción pueden producir una sustancia de extracción que rompe la pared celular de la célula productora de bioplástico, liberando el bioplástico.

Las células bacterianas utilizadas para la extracción son, en una realización, parte de la especie Bacillus pumilus y las características celulares de B. pumilus son iguales a las de otras especies del género Bacillus incluyendo B. subtilis, B. megaterium, B. licheniformis y B. cereus. Por lo tanto, la extracción de bioplásticos a partir de células microbianas productoras de bioplástico puede realizarse con otras células bacterianas que no sean células de la especie B. pumilus. Según lo descrito, se debe considerar que la presente invención abarca diversas opciones de especies de extracción.

En una realización, las células bacterianas líticas se seleccionan del grupo que comprende 1T, 272T, 567T, ATCC 7061T, BCRC 11065T, BCRC 1706T, CCEB 639T, CCM 2144T, CCRC 11065T, CCRC 11706T, CCT 0513T, CCUG 26015T, CCUG 26016T, CECT 29T, CGMCC 1.3533T, CIP 52.67T, CN 2200T, CNCM 52.67T, DSM 27T, DSMZ 27T, Gordon 272T, GottheilT, HAMBI 1826T, IAM 12469T, IM 14177T, IAM 567T, IFO 12092T, JCM 2508T, KACC 10917T, KCTC 3348T, KCTC 3855T, LMD 48.24T, LMG 8928, LMG 7132T, LMG 7132 t1T, LMG 7132 t2T, Logan B0019T, LohnisT, Lohnis Kral GottheilT, Lohnis Kral Gottheil ATCC7061T, N. R. Smith 272T, N.R. Smith 272T, N.R.Smith272T, NBRC 12092T, NCCB 48024T, NCDO 766T, NCFB 1766T, NCIB 9369T, NCIM 9369T, NCIMB 9369T, NCTC 10337T, NRIC 1010T, NRRL NRS-272T, NRS-272T, OUT 8376T, PCM 1852T, Smith 272T, Smith N.R 272T, Smith N.R. 272T, Smith N.R., 272T, cepa "Král"T, VKM 508T, VKM B-508T, VTT E-95572.T, GB34, SAFR-032, SAFR031, ATCC 7061, F036B, M11, M38, QST 2808, GHA 180, BU F-33 o FH9; o cualquier combinación de los mismos.

En una realización, las células bacterianas líticas se originan de la cepa FH9, y en una realización específica, dicha FH9 produce enzimas extracelulares.

En otra realización específica, las enzimas producidas por la célula bacteriana lítica pueden ser proteasas, glicosidasas y/o lipasas y en aún otra realización específica las enzimas, tales como proteasas, glicosidasas y/o lipasas, actúan sobre la pared celular de las células productoras de bioplástico.

La presente invención ilustra un proceso en el cual se pueden recolectar y refinar diversos productos. En una realización, el proceso comprende además una etapa de separación, donde las proteínas, los péptidos, los aminoácidos, los ácidos nucleicos y otras biomoléculas, o cualquier combinación de los mismos, son separados del bioplástico.

La separación puede llevarse a cabo de diversas maneras y algunos ejemplos, aunque no exclusivamente, pueden ser la separación por decantación, filtración, centrifugación, agregación, flotación por aire o precipitación o cualquier combinación de las mismas. Esta etapa separa el plástico y hace posible separar aún más los componentes celulares del plástico. Como se mencionó anteriormente, algunos ejemplos de tales componentes pueden ser proteínas, péptidos, aminoácidos, ácidos nucleicos y/u otras biomoléculas. Esos componentes celulares pueden ser recogidos y/o procesados en etapas posteriores.

La presente invención es compatible adicionalmente con diversas etapas adicionales del proceso, cuando se producen bioplásticos, tal como, en una realización, el proceso comprende además una etapa de lavado preferentemente después de la extracción y separación, para lavar el bioplástico extraído obtenido. Esta etapa limpia el plástico de los componentes celulares que quedan. En una realización específica, la etapa de lavado se lleva a cabo utilizando agua como líquido de lavado.

Cabe señalar que el proceso de extracción de bioplásticos de acuerdo con la presente invención, por supuesto, puede comprender diferentes etapas, y también puede tener diversos diseños, que no se mencionan explícitamente. Pueden mencionarse como ejemplos una o más etapas de separación, concentración, agitación, control de la temperatura y/o control del pH, etc. Además, el diseño del equipo utilizado puede variar, y la presente invención, de acuerdo con las reivindicaciones, debe considerarse que abarca diferentes formas de equipos.

En una realización, la extracción de bioplástico se logra con células bacterianas líticas de la especie B. pumilus. En otra realización, las células bacterianas líticas se seleccionan del grupo de microorganismos productores de enzimas de degradación de la biomasa, tales como las bacterias productoras de proteasa/lipasa/glicosidasa. En otra realización específica, las células microbianas que contienen bioplásticos se seleccionan del grupo de Ralstonia eutropha, Halomonas boliviensis, Zobellella denitrificans y Escherichia coli recombinante.

La cepa bacteriana lítica FH9 ha sido depositada en DSMZ el 24 de marzo de 2014 con el Número: DSM 28594.

En una realización de la presente invención, el bioplástico es un poliéster, preferentemente un poliéster lineal. En otra realización específica, el bioplástico podría ser, entre otros, uno de polihidroxialcanoatos (PHA), tales como poli(3-hidroxipropionato) (PHP o P3HP), poli(3-hidroxibutirato) (PHB o P3HB), poli(4-hidroxibutirato) (P4HB), poli(3-hidroxivalerato) (PHV o P3HV), poli(4-hidroxivalerato) (P4HV), poli(5-hidroxivalerato) (P5HV), poli(3-hidroxihexanoato) (PHHx o P3h Hx), poli(3-hidroxioctanoato) (PHO, o P3Ho ), poli(3-hidroxidecanoato) (PHD o P3HD), poli(3-hidroxiundecanoato) (PHU, P3HU), u otros PHA saturados o insaturados, de longitud de cadena corta o media; o ácido poliláctico (PLA); o sus copolímeros o cualquiera de sus combinaciones.

Como se mencionó anteriormente, la presente invención describe una opción respetuosa del medio ambiente a las alternativas existentes puesto que en una realización, no se utiliza ningún disolvente orgánico ni producto químico ni cualquier combinación de los mismos en el proceso.

En una realización el bioplástico producido puede ser ácido poliláctico. Puede producirse la polimerización del ácido láctico en las células microbianas recombinantes al proporcionar a las células microbianas productoras de ácido láctico la enzima PHA sintasa de dicha cepa bacteriana sintetizadora de PHA. Dicho ácido poliláctico puede entonces extraerse como se ha descrito anteriormente, y opcionalmente despolimerizar el polímero para obtener monómeros enantioméricos.

En la presente, la pureza del producto se define como el porcentaje de bioplástico en peso en relación con la cantidad total del producto. En una realización, la presente invención se refiere a una composición de biopolímero, obtenible mediante el proceso para la extracción de bioplástico de células microbianas productoras de bioplástico, que comprende una pureza de biopolímero de al menos 88%, preferentemente al menos 90%, preferentemente al menos 95%, preferentemente al menos 97%, preferentemente al menos 98%, y una recuperación de al menos el 85% del PHA original acumulado en las células microbianas productoras.

Un aspecto descrito en la presente invención comprende el uso de un proceso de extracción de bioplástico de acuerdo con la presente invención para la producción de bioplástico con una pureza del 95% y la recuperación del 85%, que no comprende el uso de un disolvente orgánico.

Los bioplásticos se utilizan en diversas aplicaciones de la industria hoy en día, y son parte de muchos artículos de consumo, o son el único componente de los mismos. Además, el bioplástico producido de acuerdo con la presente invención es biocompatible e implica el uso, por ejemplo, en el campo de la cirugía.

Un aspecto comprende el uso de un bioplástico extraído de acuerdo con el proceso de extracción de bioplástico de células microbianas productoras de bioplástico, para la producción de productos seleccionados del grupo que comprende nanoperlas bioactivas (por ejemplo, la matriz de purificación de proteínas), productos biocompatibles (por ejemplo, piezas de implantes, sustituciones óseas), productos biodegradables (por ejemplo, medicamentos de liberación lenta o portadores de fertilizantes/pesticidas) o productos renovables de termoplasto o elastómero preferentemente escogidos del grupo que comprende bolsas, cajas, botellas, latas, recubrimientos, láminas, pañales, bolsas de basura, neumáticos, envases, artículos de un solo uso, pero no exclusivamente.

Casi todos los materiales celulares que no son PHA de las células que acumulan PHA se solubilizaron hasta obtener una solución transparente que podría representar una preparación rica en proteínas/aminoácidos. Este subproducto podría ser de gran interés como aditivo alimenticio o como suplemento complejo de nitrógeno y vitamina en los medios de fermentación microbiana como sustituto económico del extracto de levadura. Podría aprobarse y aceptarse la aplicación en piensos para animales, aves de corral o peces con respecto a su origen no animal.

Otro aspecto comprende el uso de un proceso de extracción de bioplástico, de acuerdo con la presente invención, para la producción de proteínas, péptidos, aminoácidos y/u otras biomoléculas o cualquier combinación de los mismos. Un aspecto se relaciona con la producción de proteínas, péptidos y/o aminoácidos a partir de residuos proteináceos de biomasa. Dichos residuos de biomasa pueden tener su origen en la industria de la fermentación microbiana o en las industrias agrícola, animal, pesquera, de algas o avícola.

Otro aspecto se refiere a un proceso para producir monómeros a partir de bioplástico, que comprende las etapas de:

D. Proporcionar el bioplástico producido utilizando el proceso de extracción de bioplástico a partir de células microbianas productoras mencionado anteriormente;

E. Proporcionar una sustancia de despolimerización; y

F. Despolimerizar el polímero bioplástico mezclando el bioplástico de la etapa D y la sustancia de despolimerización de la etapa E y permitir que se produzca la reacción.

De acuerdo con una realización, se lleva a cabo la provisión de una sustancia de despolimerización de la etapa E mediante la adición de células microbianas que produce dicha sustancia de despolimerización.

En una realización, la sustancia de despolimerización puede ser una enzima, por ejemplo, una PHA despolimerasa extracelular. La enzima se utiliza para la despolimerización del bioplástico. En una realización, la sustancia de despolimerización se proporciona mediante la adición de células microbianas que producen dicha sustancia de despolimerización. En una realización, la provisión de enzima se proporciona mediante la adición de células bacterianas termófilas que degradan el PHA, que por ejemplo está produciendo PHA-despolimerasa(s) extracelular(es) termoestable(s). En aún otra realización, las células microbianas usadas para la despolimerización son Schlegelella thermodepolymerans o cualquier otro microorganismo termófilo o mesófilo de despolimerización de PHA (bacterias, actinomicetos u hongos). En una realización, la sustancia de despolimerización es una PHA despolimerasa extracelular. En una realización específica, dicha enzima despolimerizante es una PHA despolimerasa extracelular y PHA oligómero hidrolasa o cualquiera de sus combinaciones.

Otro aspecto comprende el uso de un proceso de extracción de bioplástico de acuerdo con la presente invención para la producción de monómeros, por ejemplo, monómeros de hidroxialcanoato (HA).

En una realización, los monómeros obtenidos pueden ser eliminados mediante una etapa de separación.

Si la sustancia de despolimerización de la etapa E se realiza mediante la adición de células microbianas que producen la sustancia de despolimerización, se puede realizar la etapa de separación para eliminar la sustancia de despolimerización formada de la mezcla de despolimerización.

Si se elimina la sustancia de despolimerización, podrá utilizarse para despolimerizar adicionalmente el bioplástico producido de acuerdo con el proceso de extracción de bioplástico a partir de células microbianas productoras de bioplástico, de acuerdo con el proceso siguiente.

En otra realización, si la despolimerización en la etapa F se realiza mediante la adición de la sustancia de despolimerización que fue producida por las células microbianas, dicho proceso comprende además las etapas de:

G. Proporcionar bioplástico producido de acuerdo con el proceso de extracción de bioplástico a partir de células microbianas productoras de bioplástico mencionado anteriormente;

H. Proporcionar la sustancia de despolimerización de las etapas F al bioplástico;

I. Mezclar el bioplástico de la etapa G y la sustancia de despolimerización de la etapa H y permitir que se produzca la reacción para obtener monómeros del bioplástico.

La sustancia de despolimerización puede separarse de la mezcla del proceso y reutilizarse más adelante. Cuando se utilizan células en la etapa E y/o F, para la producción de la sustancia de despolimerización para la despolimerización del bioplástico, es decir, se deben producir monómeros, las etapas G-I, preferentemente no tienen células presentes.

Según lo indicado anteriormente, puede haber una reutilización de dicha sustancia de despolimerización. En una realización, la invención comprende una etapa de separación para la provisión de la enzima S. thermodepolymerans.

Otro aspecto se refiere a un proceso para producir monómeros a partir de bioplástico, que comprende las etapas de:

D. Proporcionar el bioplástico producido utilizando el proceso de extracción de bioplástico a partir de células microbianas productoras de bioplástico mencionado anteriormente;

E. Proporcionar células microbianas que produzcan una sustancia de despolimerización;

F. Despolimerizar el polímero bioplástico mezclando el bioplástico de la etapa D y las células productoras de la sustancia de despolimerización de la etapa E y permitir que se produzca la reacción, seguido por la eliminación de la sustancia de despolimerización;

G. Proporcionar bioplástico producido de acuerdo con el proceso de extracción de bioplástico a partir de células microbianas productoras de bioplástico mencionado anteriormente;

H. Proporcionar la sustancia de despolimerización extraída de la etapa F;

I. Mezclar el bioplástico de la etapa G y la sustancia de despolimerización de la etapa H y permitir que se produzca la reacción para obtener monómeros del bioplástico.

En una realización, las células microbianas que producen la sustancia de despolimerización son células bacterianas, preferentemente se utiliza una cepa bacteriana termófila para la despolimerización del bioplástico. En otra realización específica, se utiliza una PHA despolimerasa termoestable para la despolimerización del bioplástico. Además, en una realización específica, la sustancia de despolimerización de PHA es una PHA despolimerasa termoestable extracelular de Schlegelella thermodepolymerans o cualquier otro microorganismo de despolimerización de PHA (bacterias, actinomicetos u hongos).

Una realización ilustra un proceso para producir subproductos proteináceos celulares, utilizando el proceso de acuerdo con la presente invención que incluye la etapa de separar el bioplástico extraído de las proteínas, péptidos y/o aminoácidos o cualquiera de sus combinaciones. Las proteínas, péptidos y/o aminoácidos pueden ser considerados como algunos de los productos concebibles producidos como resultado de la presente invención. Otros productos pueden ser los monómeros o los polímeros producidos, así como también las sustancias de extracción aisladas tales como vitaminas, enzimas, cofactores, lípidos, carbohidratos, metabolitos, osmolitos, y/o similares.

Otro aspecto comprende el posible uso de un proceso de extracción y despolimerización de bioplásticos para la producción de otros polímeros intracelulares microbianos tales como los lípidos (triacilglicerol, TAG), partículas de polianhídrido (polifosfato) o polisacáridos (glucógeno), y la posible despolimerización en sus componentes.

El proceso de acuerdo con la presente invención es un bioproceso completo para la extracción de bioplásticos, PHA, de las células de las cepas productoras de bioplásticos. Se supone que este proceso puede aplicarse para la extracción de PHA de cualquier cepa que se acumule o de cultivos mixtos, como se demostró utilizando diferentes cepas productoras de PHA en esta invención. Se podría mejorar fácilmente la pureza de los gránulos mediante sencillas etapas de lavado utilizando solamente agua o con detergente comercial. La esterilización en autoclave de los gránulos es una etapa adicional para asegurar la inactivación de cualquier célula residual de las bacterias de la lisis.

La invención se amplió para producir el monómero de, por ejemplo, R-3HA, como un biométodo fácil y eficaz en función de los costos para productos químicos enantioméricamente puros. R-3HA tiene numerosas aplicaciones médicas, tales como su efecto de aumento sobre la proliferación celular. La cepa termófila degradó por completo el PHB utilizando su PHA despolimerasa extracelular. La bioconversión enzimática del polímero en R-3HB se logró a 70°C utilizando la preparación en bruto de PHA despolimerasa en una escala de litros. Esta invención es un proceso de extracción completamente libre de disolventes orgánicos y de productos químicos para los bioplásticos, PHA, y para su producción de monómeros, y esto además del subproducto rico en aminoácidos.

Esta tecnología también podría aplicarse para la utilización de otros materiales celulares microbianos que quedan de cualquier proceso biotecnológico, donde una enorme biomasa celular podría convertirse en un producto valioso.

EJEMPLOS

Proceso A: Extracción de gránulos de PHA de células microbianas productoras.

1) Lisis celular utilizando un microorganismo de lisis como herramienta para la extracción de gránulos de PHA de diferentes cepas microbianas productoras de PHA.

Las células recolectadas de las cepas productoras de PHA después del período de acumulación deseado se utilizaron como células húmedas (sin necesidad de la etapa habitual de secado, imprescindible para la extracción de PHA con disolventes). Se utilizaron los gránulos celulares de las cepas productoras de PHA como la principal fuente de carbono y nitrógeno. Se esterilizaron los gránulos en el medio de cultivo óptimo para la cepa microbiana de lisis, el medio basal, contiene (g/l) NH4Cl, 0,5; NaCl, 0,5; K2HPO4, 0,3; KH2PO4, 0,3; MgCl - 6H2O, 0,1; extracto de levadura, 0,1, caseína, 5,0. Se ajustó el pH del cultivo a 7,5 antes de la esterilización. Se prepararon los precultivos por bucle completo de colonias bien cultivadas de placas en frascos de Erlenmeyer de 250 ml, ambos con el mismo medio. Después de la inoculación, se incubaron los cultivos a 37°C durante 24 h en condiciones de agitación (180 rpm).

Se realizaron investigaciones de lisis celular en 1-1 frascos que contenían 200 ml de medio basal. El precultivo de la cepa FH9 se utilizó como inóculo de lisis. En los cultivos de lisis, la caseína se replegó con dos gramos de gránulos celulares húmedos de diferentes cepas acumuladoras de PHA, Zobellella denitrificans MW1, (3,04 g/l CDW, 65,4 % en peso de PHB); Halomonas boliviensis LC1 (4,43 g/l de CDW, 70,2 % en peso de PHB); Ralstonia eutropha H16 (4,69 g/l de CDW, 62,0 % en peso de PHB); Escherichia coli recombinante (1,39 g/l de CDW, 0,0 % en peso de PHB), y los cultivos de lisis se denominaron ZdF, HbF, ReF, EcF, respectivamente. El pH del cultivo se ajustó a 7,5 antes de la esterilización. Se incubaron los frascos a una temperatura de 37°C y 180 rpm. Se tomaron muestras de 10 ml de volumen para análisis en diferentes períodos de incubación (0, 12, 26, 48, 72 y 240 h).

Los caldos de cultivo se cosecharon después de 10 días por centrifugación a 10000 rpm durante 10 min. Los pellets recuperados se lavaron tres veces con H2O destilada y se centrifugaron a 6000 rpm durante 10 min. Se pudo aplicar una velocidad mucho más lenta para recuperar los gránulos agregados, mientras que la mayoría de las células de la cepa lisante, FH9, permanecen en el sobrenadante y pueden separarse fácilmente por decantación.

Se llevó a cabo el proceso A a mayor escala (3-I fermentador). Se esterilizaron aproximadamente 92 gramos de células húmedas de Z. denitrificans (13,4 g/l de CDW, 64,4 % en peso de PHB) en 1500 ml de medio basal. Se utilizó un precultivo bien cultivado de la cepa FH9 (100 ml) como inóculo de lisis para el cultivo del fermentador (ZdFF). Se realizó el cultivo por lotes en un fermentador de tanque agitado a 37°C, pH 8,0 durante 24 horas. Se retiraron muestras de tamaño de 10 ml del fermentador en diferentes intervalos de tiempo para el monitoreo de la reacción de lisis y para análisis bioquímicos posteriores. Después de 24 horas, se recolectó el cultivo de ZdFF por centrifugación a 10000 rpm durante 20 min. El pellet de lisis recuperado se mantuvo sin lavar a - 20°C para análisis y aplicación posteriores.

2) Lavado de gránulos de PHA extraídos

Se incluyeron etapas de lavado con agua para recuperar PHA de mayor pureza. Se mezclaron porciones de dos gramos de pellet de lisis húmedo del experimento del fermentador, ZdFF, en 40 ml de agua destilada durante 60 minutos a temperatura ambiente, con y sin esterilización en autoclave. También se investigó la adición de detergente comercial (100 ml). Después del lavado, se recuperaron los gránulos de PHA puro por centrifugación de una porción de 10 ml de la mezcla a 6000 rpm durante 3 min, se lavaron de nuevo con agua destilada o agua destilada más detergente, se mezclaron a temperatura ambiente durante 3 horas y luego se centrifugaron a la misma velocidad y tiempo. Se aplicó un examen de microscopio de luz para seguir el efecto del lavado sobre la purificación de las células restantes y los restos celulares. La precipitación y la decantación también podrían funcionar, pero, en ese caso, la recuperación y la pureza serán diferentes.

Luego se congelaron los pellets y se liofilizaron para el análisis posterior de GC y GPC de la pureza del PHA y de los cambios del peso molecular.

Proceso B: Despolimerización de PHA.

Se llevó a cabo la despolimerización de los gránulos de PHA recuperados para producir el ácido 3-hidroxialcanoico mediante un proceso completamente bio-basado.

Se utilizó en este proceso una potente cepa termófila para la producción de PHA-despolimerasa extracelular. Parte de los pellets recuperados de PHA sin lavar recuperados del proceso A (ZdFF) (18 g de peso húmedo [4,4 g/l de CDW] contienen principalmente gránulos de PHA extraídos más algunos otros productos de lisis y células) se utilizaron como única fuente de carbono para el crecimiento de la cepa termófila. Se esterilizaron los pellets en un fermentador que contenía 1500 ml de medio de cultivo para la cepa termófila degradante, medio de sales minerales que contenía (g/l): Na2HPO4 ■ 12H2O, 9,0; KH2PO4, 1,5; MgSO ■ 7H2O, 0,2; NH4Cl, 1,0; CaCl2 ■ 2H2O, 0,02; Fe(III)NH4-citrato, 0,0012; 1 ml de solución de elementos traza que contenía (g/l): EDTA, 50,0; FeCl3, 8,3; ZnCI2, 0,84; CuCl2 ■ 2H2O, 0,13; COCl2 ■ 6H2O, 0,1; MnCl2 ■ 6H2O, 0,016; h 3b03, 0,1. Se utilizaron pellets del ZdFF como la única fuente de carbono.

Se realizó el cultivo por lotes en un fermentador de tanque agitado a 50°C, pH 7,0 durante 39 horas. Se retiraron muestras de tamaño de 10 ml del fermentador en diferentes intervalos de tiempo para el monitoreo de la despolimerización y para análisis bioquímicos posteriores.

Proceso C: Despolimerización enzimática de PHA.

En un experimento de fermentador controlado a escala 3-I, se suspendieron diez gramos de pellets celulares húmedos del proceso A (ZdFF) en 1000 ml del sobrenadante del proceso B. Este sobrenadante funciona como una preparación en bruto sin células de la enzima de despolimerización de PHA. La despolimerización se realizó a 70°C y pH 8,2 durante 8 horas. Se controlaron los productos cada dos horas durante el proceso mediante análisis de HPLC fuera de línea.

Análisis:

Peso húmedo y seco. Peso húmedo de la célula (CWW, por sus siglas en inglés), peso del pellet celular después de la centrifugación a la velocidad y el tiempo asignados; peso seco de la célula (CDW, por sus siglas en inglés), peso estable de las células liofilizadas.

Análisis de GC: se metanolizaron 10-20 mg de células liofilizadas o pellets en cloroformo y metanol ácido (15% de H2SO4) durante 3-4 horas a 100°C. Se utilizó fase de cloroformo para los análisis por CG de los 3-hidroximetilésteres de los restos de PHA. También se metanolizaron los sobrenadantes liofilizados del proceso B y C y se utilizaron para detectar productos de despolimerización por GC.

El contenido en peso de PHA (PHA % en peso) se determinó por GC en muestras secas de peso conocido frente a una muestra estándar de PHA altamente purificado, y se utilizó también para el cálculo de la pureza y la recuperación.

Durante los procesos B y C, se utilizó HPLC para la detección de productos de despolimerización microbiana o enzimática liberados, ácido 3-hidroxialcanoico, a partir de gránulos de poli(ácido 3-hidroxialcanoico) suministrados.

Se realizaron observaciones en microscopio electrónico de luz y transmisión utilizando muestras frescas o congeladas tomadas de cultivos de los diferentes procesos, A, B y C. Se prepararon e investigaron muestras para estudiar el efecto físico de las células microbianas de lisis o despolimerización y/o de enzima sobre las células microbianas que acumulan PHA o sobre los gránulos de PHA recuperados, y la aparición o predominio de diferentes células de cultivo, lisis, lisadas o de despolimerización durante los procesos estudiados.

Se utilizó cromatografía de permeación en gel (GPC, por sus siglas en inglés) para determinar el efecto del proceso de bioextracción sobre el peso molecular del polímero recuperado, proceso A.

Resultados

1. Proceso A: Lisis de cepas microbianas productoras de PHA.

1.1 Lisis de diferentes cepas microbianas productoras de PHA.

Se utilizan muchas cepas bacterianas para la producción de PHA a escala industrial y de laboratorio. Prácticamente, para cada proceso y/o cepas, se asigna un método de extracción definido. Ninguno puede funcionar perfectamente con todas las cepas y todos los tipos de PHA. En la presente tecnología, se utilizó un nuevo método de extracción bio-basado que utiliza la cepa bacteriana, Bacillus pumilus FH9, para la extracción de gránulos de PHA de diferentes productores bacterianos de PHA. Se indujo a las células de la cepa FH9 a hidrolizar los materiales celulares no PHA de diferentes cepas acumuladoras de PHA como única fuente de nutrientes en el medio de lisis, lo que lleva a la inducción de enzimas hidrolizantes de la pared celular por parte de la cepa FH9.

Las cepas Ralstonia eutropha H16, Escherichia coli recombinante, Zobellella denitrificans MW1, Halomonas boliviensis LC1, son algunas de las bacterias bien estudiadas, las que se sabe que producen PHA a partir de diferentes fuentes de carbono tales como glicerol, glucosa, sacarosa, almidón u otros sustratos económicos. Se cultivaron por separado células de estas cepas en las condiciones estándar de acumulación de PHA (contenido de PHA 60-70 % en peso), luego se cosecharon y se transfirieron al medio de lisis (medio de cultivo de la cepa FH9). Se usaron células de E. coli recombinante sin contenido de PHA como control negativo para el experimento.

Tras la inoculación con la cepa lítica FH9, se controló la reacción de lisis por la disminución en el peso seco celular de los pellets recolectados (Fig. 2 A), y el aumento de su contenido de PHB (Fig. 2 B). Se registró una clara disminución del peso seco celular (CDW) para todas las cepas acumuladoras de PHA, como se muestra en la Figura 2 A. Después de 48 h, se solubilizaron casi todos los materiales celulares no PHA según lo revelado por el aumento en el contenido de PHB hasta los valores máximos, 93,6, 96,0 y 91,6 % en peso, para las células de cepas, Z. denitrificans, H. boliviensis y R. eutropha, respectivamente. Un tiempo más largo de incubación afecta la pureza de los gránulos de PHA recuperados, puede ser por el aumento de la masa celular de las células líticas en crecimiento. La mayor parte del efecto de lisis se logró en las primeras 26 h. En este contexto, es muy importante optimizar el tiempo de extracción para alcanzar la lisis adecuada, manteniendo una baja densidad celular de las células líticas, para una fácil separación de los gránulos de PHA de elevada pureza. A pesar de que la cepa FH9 muestra actividad de lisis en todas las cepas que acumulan PHA estudiadas, la pureza del gránulo de PHA recuperado de las cepas Z. denitrificans y H. boliviensis fue mayor que la de R. eutropha. Esto puede deberse a la diferencia en la estructura celular de las células que se están lisando o a la diferencia en la masa de crecimiento celular de las células líticas en cada cepa que puede ser difícil de separar de los gránulos de PHA liberados.

1.2 Lisado a gran escala de células que acumulan PHA para la extracción de PHA.

Se realizó un estudio a escala de biorreactor de 3 litros para la recuperación de gránulos de PHA de la cepa Z. denitrificans (64,4% en peso, PHB). Se esterilizaron las células que contenían p Ha como pellets húmedos en medio basal y se utilizaron como única fuente de carbono y nitrógeno. Se añadió una pequeña cantidad de extracto de levadura (0,1 g/l) como iniciador del crecimiento. Se inoculó el cultivo con inóculo activo de la cepa FH9, que mostró un rápido crecimiento y utilización de materiales celulares que no son PHA de Z. denitrificans, como se detectó por el aumento del contenido de PHB en los pellets cosechados de 64,4 a 83,8% en peso (Fig. 4).

Las imágenes del microscopio electrónico (Fig. 3) muestran una impresionante disruption física de la pared celular y otros materiales celulares que no son PHA, incluso después de solo 6 horas de la inoculación de la cepa FH9 (Fig. 3 B). Con el aumento del tiempo de fermentación, los gránulos de PHA se liberaron completamente y parecen estar libres de otros materiales celulares. Se observó que algunos gránulos libres se fusionaban (Fig. 3 B, C; tamaño 0,3-1,0 mm) formando gránulos mayores que el tamaño de gránulos normales dentro de las células (Fig. 3 A; tamaño <0,3 mm). También se observó que el predominio de las células FH9 (células de vástago) aumentó con el tiempo entre las 6h y las 24h (Fig. 3 B, C).

El gráfico microscópico de la figura 3 C muestra la forma esférica completa de los gránulos de PHA recuperados en una mezcla con células de la cepa FH9. Se ve que algunos gránulos tienen otro material celular alrededor. Esta puede ser la razón de la baja pureza del PHA recuperado detectada por GC (no de los pellets lavados del proceso A) (Fig. 4). Sin embargo, es evidente que durante las primeras 12 horas, se ha logrado una pureza mejorada significativa como resultado de la hidrólisis de materiales celulares que no son PHA por la acción de la cepa lítica, B. pumilus FH9.

El tiempo de lisis de 12 horas parece suficiente para la liberación de gránulos de PHA después de lisar los otros materiales celulares. El contenido de PHB en esta mezcla recuperada aumentó del 64,4% en peso al 81,8% en peso. Se alcanzó un contenido de PHB ligeramente superior por el aumento del tiempo de la lisis, alcanzando un contenido máximo de PHB a 20 h (83,8% en peso). Se logró una recuperación de PHB muy elevada cuando se recuperó 97-100% del contenido celular de PHA antes de la lisis al final del cultivo. La separación y el lavado de los gránulos liberados del caldo de cultivo podrían dar gránulos de polímero de mayor pureza. Este tiempo relativamente corto es muy prometedor para la aplicación industrial del proceso. Como extracción en una sola etapa si se compara con otros procesos de extracción más cortos pero de múltiples etapas reportados.

1.3 Recuperación de gránulos de PHA puro.

El producto del proceso de lisis utilizando la cepa FH9 fue una mezcla de gránulos de PHA con algunas moléculas que no son de PHA, probablemente proteínas y/o lípidos, además de las células en crecimiento de FH9. Esta mezcla se recuperó fácilmente por centrifugación. Se necesita una etapa de separación adicional para separar los gránulos de PHA de algunas de las células de lisado en crecimiento y los productos de lisis.

Se estudió una simple etapa de lavado para la recuperación de gránulos de PHA. Esto se combinó con el efecto de la esterilización en autoclave que eliminaría las células de lisis y/o las enzimas. Se empleó un detergente comercial para eliminar células o materiales proteináceos que pueden estar adheridos a los gránulos de PHA. Después de mezclar durante 3 horas a temperatura ambiente, se controlaron tanto el pellet como el sobrenadante bajo un microscopio de luz. En el sobrenadante, algunas células intactas de la cepa Z. denitrificans seguían suspendidas en el sobrenadante después de una centrifugación a baja velocidad, mientras que los gránulos agregados se precipitaban fácilmente.

El lavado de los pellets recuperados con agua mejoró significativamente la pureza del PHB recuperado del 82,2% en peso al 91,5% en peso. Se logró una mayor pureza (hasta un 94,5% en peso) cuando se utilizó detergente durante el lavado. El lavado no pudo mejorar la pureza si los pellets se esterilizaron en autoclave antes del lavado. Se pudo revelar que la condición severa durante la esterilización en autoclave dificultó mucho la separación de los gránulos de PHA de otros contaminantes como proteínas, células o residuos celulares. Si es necesario esterilizar en autoclave, es mejor esterilizar en autoclave los gránulos purificados después del lavado y no antes (Tabla 2). A la máxima pureza de PHB alcanzada (94,5% en peso de PHB), se mantuvo una alta recuperación de polímero (84,5% en peso). Esta recuperación alcanzada es, idealmente, igual que la recuperación máxima reportada para la extracción con cloroformo, sin embargo, la pureza fue ligeramente superior (98,3% en peso) (Tabla 2).

Se analizó el efecto del largo tiempo de lisis sobre el peso molecular (MW, por sus siglas en inglés) del PHB recuperado por GPC al final del cultivo de lisis de diez días. Se recuperaron PHB con Mw de 478618, 1009779 y 887406 Da de las cepas Z. denitrificans, H. boliviensis, R. eutropha, respectivamente (Tabla 1). Esto demuestra que no se registró ningún efecto destructivo sobre el MW para el PHB recuperado de todas las cepas estudiadas, en comparación con el PHB extraído con disolvente de células de las mismas cepas (Tabla 1), o el MW previamente reportado de PHB de H. boliviensis, R. eutropha. Este largo tiempo de lisis se aplicó para estudiar si habrá un efecto negativo de las células de lisis sobre el polímero recuperado. Esto asegura la incapacidad de la cepa FH9 para degradar el polímero objetivo mientras degrada los materiales celulares que no son PHA.

Además, el peso molecular del PHB recuperado de Z. denitrificans no se vio afectado por la etapa de lavado aplicada con agua y/o detergente, ya que se recuperaron casi los mismos valores de MW después del lavado (Tabla 2).

Tabla 1. Análisis de GPC de PHB recuperado mediante lisis de diferentes cepas acumuladoras.

Tabla 2. Efecto del lavado sobre la pureza y el peso molecular del PHB recuperado

2. Proceso B: Despolimerización bacteriana de PHA.

La producción de ácidos 3-hidroxialcanoicos enantioméricamente puros ha despertado mucho interés en los últimos años debido a su importancia como precursores de polímeros hechos a medida, y también para muchas aplicaciones medicinales y biotecnológicas. A este respecto, se diseñó un segundo proceso para la conversión de los gránulos de PHA recuperados del proceso A a sus monómeros mediante la despolimerización celular/enzimática. La cepa de despolimerización de PHA asignada es una bacteria termófila con crecimiento óptimo y capacidad de despolimerización de PHA a 50°C. Como se muestra en la figura 6, en solo 6 horas, el contenido de p Ha de los gránulos disminuyó del 87,4% en peso al 56,4% en peso; los gránulos de PHA se despolimerizaron completamente dentro de las 39h, como se muestra en los gráficos de microscopio electrónico en la figura 5. También estaba claro que las células despolimerizantes, si bien eran capaces de degradar todos los gránulos de PHA liberados, no podían atacar los gránulos de PHA que aún existían dentro de algunas células de Z. denitrificans intactas no lisadas por la cepa FH9 durante el proceso A (Fig. 5 B).

El gráfico del microscopio electrónico de barrido (Fig. 5 C) también muestra un contacto directo de las células de despolimerización de p Ha con la degradación de los gránulos de PHA durante el crecimiento. Los gránulos se utilizan como única fuente de carbono para las células despolimerizantes.

Se detectó por HPLC un claro pico de monómero liberado, 3HB, en un tiempo de retención de 20 min (Fig. 7 B). También se registró que, por el aumento del tiempo de cultivo, este pico desapareció. Esto debería deberse a la utilización de productos de despolimerización por parte de las células en crecimiento. En este contexto, se recomienda un tiempo de incubación más corto para inducir células de despolimerización de PHA solo para producir PHA despolimerasas extracelulares que pueden usarse para la despolimerización enzimática sin células de los gránulos de PHA. Esta estrategia evitará una mayor utilización de los productos de degradación como ocurrió en el caso del cultivo de células despolimerizantes.

3. Proceso C: Despolimerización enzimática de PHA para la producción de 3-HA.

Se investigó la despolimerización de los gránulos de PHA recuperados del proceso A para producir 3-HA en el proceso de despolimerización enzimática sin células. Este proceso se realizó para evitar la utilización de monómeros producidos por las células despolimerizantes. El sobrenadante del proceso B a las 39h se utilizó como enzima cruda PHA-despolimerasa. Aunque esta enzima cruda se cosechó al final del cultivo de despolimerización de células de PHA, mostró una notable despolimerización en solo dos horas a 70°C, la temperatura óptima para la actividad enzimática, y el contenido de PHA disminuyó al 50,4 % en peso (Fig. 9). Se despolimerizó más del 50% del contenido de PHA en un plazo de 8 horas, y se detectó un producto de degradación mediante análisis con HPLC en un tiempo de retención de 20 min (Fig. 10), el mismo pico que se registró en el proceso B. Para su confirmación, se liofilizaron tanto los sobrenadantes del proceso B (39 h) como del proceso C (8 h) y se sometieron a metanólisis para el análisis por GC de los productos de despolimerización. Se detectó 3-hidroximetiléster en el sobrenadante del proceso C, pero no se detectó en el proceso B. El análisis por GC reveló que el 24,8 % en peso del sobrenadante liofilizado del proceso C es 3-hidroximetiléster.

Curiosamente, en el gráfico de microscopio electrónico (Fig. 8), la forma esférica de los gránulos de PHA es claramente atacada desde un lado (Fig. 8 A, B) por la acción de la enzima despolimerasa como contacto físico directo para facilitar el proceso de despolimerización.

En la Figura 8 B, todavía se pueden ver algunas células de vástago en este proceso enzimático. Estas células podrían ser células de la cepa FH9 que permanecían en los pellets del proceso A, o células de la cepa S. thermodepolymerans presentes en el sobrenadante del proceso B, es decir, en la preparación enzimática cruda en sí.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para la extracción de bioplástico de células microbianas productoras de bioplástico, que comprende las etapas de:

A. proporcionar células microbianas productoras de bioplástico que comprenden bioplástico en forma de gránulos; B. proporcionar células bacterianas seleccionadas de la especie Bacillus pumilus;

C. extraer el bioplástico en forma de gránulos mezclando las células microbianas productoras de bioplástico de la etapa A y las células bacterianas de la etapa B y permitir que se produzca la reacción sin interactuar ni consumir bioplástico de las células microbianas productoras de bioplástico;

donde la extracción incluye una etapa de lisis por dichas células bacterianas seleccionadas de la especie Bacillus pumilus para desintegrar la estructura celular de las células microbianas productoras de bioplástico que comprenden bioplástico, donde dicho proceso para la extracción de bioplástico es una extracción y recuperación de gránulos de bioplástico sin disolventes orgánicos ni químicos.

2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, donde las células bacterianas seleccionadas de la especie Bacillus pumilus son de la cepa FH9 depositada como DSM 28594.

3. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde los bioplásticos se obtienen en forma natural sin degradación ni otras pérdidas.

4. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el proceso de extracción comprende además una etapa de separación, en la que se separan las proteínas, los péptidos o los aminoácidos o cualquier combinación de los mismos de los gránulos de bioplástico; preferentemente donde la separación se realiza por decantación, filtración, centrifugación, agregación, flotación por aire o precipitación o por cualquiera de sus combinaciones.

5. El proceso de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende además una etapa de lavado preferentemente después de la extracción y separación para lavar los gránulos de bioplástico obtenidos, dicha etapa de lavado se realiza preferentemente utilizando agua como líquido de lavado.

6. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde las células microbianas productoras de bioplástico se seleccionan del grupo de Ralstonia, Halomonas, Zobellella, Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus, Chromobacterium, Escherichia coli recombinante, o cualquiera de sus combinaciones u otras células microbianas productoras de bioplástico, o cultivos mixtos.

7. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el bioplástico es un poliéster, preferentemente un poliéster lineal.

8. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el bioplástico se selecciona entre polihidroxialcanoatos (PHA): poli(3-hidroxipropionato) (PHP o P3HP), poli(3-hidroxibutirato) (PHB o P3HB), poli(4-hidroxibutirato) (P4HB), poli(3-hidroxivalerato) (PHV o P3HV), poli(4-hidroxivalerato) (P4HV), poli(5-hidroxivalerato) (P5HV), poli(3-hidroxihexanoato) (PHHx o P3HHx), poli(3-hidroxioctanoato) (PHO, o p3h O), poli(3-hidroxidecanoato) (PHD o P3HD), poli(3-hidroxiundecanoato) (PHU, P3HU), u otros PHA saturados o insaturados, de longitud de cadena corta o media; o ácido poliláctico (PLA); o sus copolímeros o cualquiera de sus combinaciones.

9. Uso de una cepa bacteriana seleccionada de la especie Bacillus pumilus, o de una bacteria, Bacillus pumilus cepa FH9, número de depósito DSM 28594, o una variante de la misma, para lisar células microbianas productoras de bioplástico, sin interactuar con o consumir bioplástico de las células microbianas productoras de bioplástico.