CN109797114A - 一种微球菌及其在生产2,3-丁二醇中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微球菌及其在生产2,3‑丁二醇中的应用，属于生物技术领域。本发明提供的微球菌，分类名Micrococcus，保藏编号CGMCC No.14439。所述的微球菌在生产2,3‑丁二醇中的应用，按如下步骤进行：一、将微球菌接种至灭菌的改良LB培养基中，培养至所需浓度；二、将步骤一中培养得到的微球菌接种至发酵培养基中，于摇床中发酵，得到产物2,3‑丁二醇。该2,3‑丁二醇该2,3‑丁二醇除了可用于改善烟叶和白酒风味还可以作为防冻剂、液体燃料添加剂以及可通过进一步转化用于合成橡胶、燃料、食品及化妆品等的生产。除此之外，本发明筛选获得微球菌能够利用烟草工业废弃物为主要营养源,这可处理烟草工业产生的大量废弃物，在保护环境和合理利用资源方面都有着积极的作用。

Description

一种微球菌及其在生产2,3-丁二醇中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种微球菌及其应用，特别涉及一株筛选获得的微球菌及其在生产2,3-丁二醇中的应用。

背景技术

2,3-丁二醇(二甲基甲醇)是一种无色无味的液体，熔点是23～27℃，沸点是178～182℃，冰点-60℃，能与水混溶，也可溶于乙醇、乙醚。

2,3-丁二醇在化工、药物及燃料的生产中都有举足轻重的作用。具体表现在：2,3-丁二醇具有较低的凝固点可以作为防冻剂；其可被转化为1,3-丁二烯，在合成橡胶的生产中被应用；它也可以通过Diels-Alder反应聚合生成苯乙烯，并可与甲乙酮缩合并进行加氢反应生成辛烷，用来产生高质量的飞行燃料；2,3-丁二醇的燃烧值为27198J/g，这可与乙醇(29055J/g)和甲醇(22081J/g)的燃烧值相媲美，其经硫酸催化脱水制备甲基乙基酮，甲基乙基酮的燃烧值高于乙醇，被认为是一种有效的液体燃料添加剂；它脱氢可形成双乙酰和乙偶姻，在日常生活中作为增味剂、人造奶油和化妆品；酯化后即为合成聚亚胺酯的前体，可应用于药物载体、化妆品、洗液等。除此之外，2,3-丁二醇在我国还被添加到白酒中，用于改善白酒风味；其也是烟叶重要的香气物质，具有清香的烟气特征。近年来，随着工业生产的蓬勃发展和新能源兴起，对2,3-丁二醇的需求也在逐年增加。

工业化学生产2,3-丁二醇目前主要是雷佩法、顺丁烯二酸酐加氢法及丁二烯乙酰氧基化法。其中雷佩法生气能力强，生产过程不太复杂，成本较低，但是其生产受乙炔原料供应和价格的限制；而顺丁烯二酸酐加氢法及丁二烯乙酰氧基化法，虽然可以联产四氢呋喃，但是单原料价格高，这就限制了其应用。而备受关注的微生物合成2,3-丁二醇的效率却一直不高，主要表现在菌株需要改造，菌株发酵后副产物多，菌株发酵原料成本高等。这就制约了2,3-丁二醇生物制造工业化进程。

发明内容

为解决上述微生物合成2,3-丁二醇，菌株需要改造、发酵原料成本高等问题，本发明提供一种微球菌及其利用烟草工业废弃物生产2,3-丁二醇的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供一种微球菌，分类名Micrococcus，保藏日期2017年7月18日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.14439。

本发明还提供微球菌(Micrococcus)CGMCC No.14439在生产2,3-丁二醇中的应用。

利用微球菌(Micrococcus)CGMCC No.14439生产2,3-丁二醇的方法，是按如下步骤进行的：

一、将微球菌接种至灭菌的改良LB培养基中，培养至所需浓度；

二、将步骤一中培养得到的微球菌接种至发酵培养基中，于摇床中发酵，得产物2,3-丁二醇。

进一步，优选的是，步骤一中所述的培养至所需浓度是培养至OD₆₀₀在0.6～1.5。

进一步，优选的是，步骤一中所述的改良LB培养基的组分为：蛋白胨8～12g，酵母粉4～6g，氯化钠8～12g，烟叶沸水浸提液100～450mL，蒸馏水550～900mL，pH 7.0～7.5。

进一步，优选的是，步骤一中所述的培养温度为30～40℃。

进一步，优选的是，步骤一中所述的烟叶沸水浸提液的制备方法为烟叶加入蒸馏水中，煮沸提取，冷却后，纱布过滤，收集滤液，即得烟叶水浸提液。其中烟叶与蒸馏水的质量体积比为1:10～1:20(g/mL)，提取时间为20～50min。

进一步，优选的是，步骤二中所述的发酵培养基仅包含蒸馏水、烟草工业废弃物4～6g/L及葡萄糖10～20g/L。

进一步，优选的是，步骤二中所述接种量为2～5％(v/v)。

进一步，优选的是，步骤二中所述发酵，为恒温振荡培养箱中振荡培养，温度为30～40℃，培养时间为4～10天。

进一步，优选的是，步骤二中所述分离提纯，方法为发酵液经乙酸乙酯萃取后，旋蒸去除溶剂后，得到2,3-丁二醇。

经气相质谱联用仪检测给出2,3-丁二醇的峰面积，再根据2,3-丁二醇标准品所测出的标准曲线，计算出产量。

本发明所述的以烟草工业废弃物为原料生产2,3-丁二醇的微球菌(Micrococcus)CGMCC No.14439是从醇化中期的烟叶上通过选择性培养基分离得到的。

本发明所述的微球菌为革兰阳性杆菌，无芽孢，在显微镜下观察菌体的直径大小为0.8μm左右。菌体细胞呈圆球形。在LB固体培养基表面，菌体形成不透明的黄色菌落，菌落表面湿润凸起，边缘整齐。上述菌株经通用引物PCR获得16SrDNA序列与微球菌的16SrDNA序列有99％的相似性。

其中，上述PCR上游引物为27F:5’-agagtttgatcctggctcag-3’(SEQIDNO.2)；

下游引物为1492R：5’-cggctaccttgttacgactt-3’(SEQIDNO.3)。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

1)本发明筛选获得微球菌能够利用烟草工业废弃物为主要营养源,这可处理烟草工业产生的大量废弃物，在保护环境和合理利用资源方面都有着积极的作用。

2)该微球菌能够发酵烟草工业废弃物生产2,3-丁二醇，产量可达7.56g/L。该2,3-丁二醇可广泛用于化工、药物及燃料的生产加工中，也可以用于烟草及酒的增香。这提供了2,3-丁二醇生产的一种新途径，菌株不仅未经改造，而且易于分离和培养，这也有望解决野生菌株直接发酵生产2,3-丁二醇的问题。

3)本发明的菌株及该菌株利用烟草加工过程中剔除的烟梗或者废弃的烟叶等工业废弃物生产2,3-丁二醇的方法，提供了2,3-丁二醇生产的一种新途径，使用的发酵培养基不但成本低廉，而且可以处理烟草工业产生的大量废弃物，这在保护环境和合理利用资源方面都有着积极的作用，同时，利用废弃物作为发酵原料，也大大降低了生产成本，为推进2,3-丁二醇生物制造工业化进程奠定基础。

4)本发明中的菌株是从烟草工业废弃物中在烟叶沸水浸提物培养基上分离所得的，与其他菌株相比，它不受烟叶本身所含的物质如烟碱(尼古丁)、亚硝酸盐等的抑制，可以正常生长。这极大提高了其对毒性物质的耐受性，可使其应用更加广泛。

附图说明

本发明提供的微球菌分类名Micrococcus，保藏日期2017年7月18日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.14439。

图1本发明发酵获得2,3-丁二醇的质谱图；

图2本发明实验组与对照组的气相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过购买获得的常规产品。

实施例1利用烟草工业废弃物生产2,3-丁二醇微生物的分离

1.培养基及培养条件：

烟叶样品沸水浸提液培养基：将15g烟叶样品加入300mL蒸馏水，煮沸提取30分钟，冷却后，纱布过滤，收集滤液，即得烟叶水浸提液，将此浸提液分别按培养基量的30％替换LB培养基的成分所获得的固体培养基，其配制如下：

30％烟叶水浸提液固体培养基：300mL烟叶水浸提液；700mL蒸馏水；胰化蛋白胨7g；酵母提取物3.5g；NaCl 7g；pH自然，灭菌；

上述培养基制备时的灭菌条件为115℃灭菌30分钟。所得培养基为改良LB培养基。

上述培养基中添加20g/L的琼脂制备成固体培养基(即分离培养基)用于菌株筛选。

2.分离方法：

醇化中期的烟叶样品随机抽取2g，在无菌条件下剪碎，浸泡于100mL中无菌生理盐水中，在温度为37℃，转速为180转每分钟的条件下，摇床振荡培养60分钟，用无菌单层纱布过滤，取滤液，离心弃上清，并用5mL无菌水重悬，得原始菌悬液，取100μL原始菌液分别稀释10倍，100倍，1000倍，10000倍，100000倍，并分别吸取150μL涂布于上述步骤1中所制备分离培养基上，于37℃倒置培养48小时，培养得到的菌落采用平板划线法进行纯化，直至获得单菌落。

3.分离微生物的菌种鉴定

(1)将所选培养基分离的细菌，培养于改良LB液体培养基中，12～24小时后，得到相应菌株的菌悬液。

(2)取菌悬液，离心后弃上清，提取基因组DNA，以提取基因组DNA作为模板进行聚合酶链式反应(PCR)。

PCR上游引物为27F:5’-agagtttgatcctggctcag-3’(SEQIDNO.2)；

下游引物1492R：5’-cggctaccttgttacgactt-3’(SEQIDNO.3)。

PCR扩增体系(25μL)：

PCR扩增程序：

30个循环

(3)分别取5μLPCR反应液和DNAmaker2000，应用凝胶电泳进行PCR产物验证。

(4)将在1600bp左右有荧光带出现的PCR产物，送去测序公司测序，测序结果进行拼接后，输入NCBI的BLSAT(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行序列比对，该16SrDNA序列与与微球菌的16SrDNA序列有99％的相似性。该菌为革兰阳性杆菌，无芽孢，在显微镜下观察菌体的直径大小为0.8μm左右。菌体细胞呈圆球形。在LB固体培养基表面，菌体形成不透明的黄色菌落，菌落表面湿润凸起，边缘整齐。初步鉴定改菌种为微球菌。该菌株保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.14439。测序结果如SEQIDNO.1所示。

实施例2利用烟草工业废弃物生产2,3-丁二醇

以烟草工业废弃物为营养物的培养基组分为：蒸馏水，葡萄糖20g/L，烟草工业废弃物5g/L，pH值7.0～7.4；

在无菌条件下，将微球菌接种至灭过菌的改良LB培养基中培养，37℃培养至OD₆₀₀为0.6～1.5。

按照2～5％(v/v)的接种量将上述菌种，接种于装有50mL灭菌的烟草工业废弃物为营养物的培养基的250mL的摇瓶中，并设置不接菌株的对照组，于140转/分钟的摇床中，37℃培养。培养5天后利用GC-MS检测。

2,3-丁二醇的定性检测：取上述发酵液经12000转/分钟离心10分钟，弃除沉淀，将发酵液上清用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物，旋蒸去除部分溶剂，用无水硫酸钠除水后，用0.22μm膜过滤，利用GC-MS进行定性检测。采用DB-5毛细管色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)，进样口温度325℃，离子源温度230℃，升温程序为50℃维持1分钟，然后10℃/分钟程序升温至300℃，300℃维持5分钟。获得结果质谱图如图1所示，经与标准库比对为2,3-丁二醇。对照组及实验组的对比气相色谱图如图2所示，说明该菌株可以利用烟叶废弃物生产2,3-丁二醇。经气相质谱联用仪检测给出2,3-丁二醇的峰面积，再制作2,3-丁二醇标准品的标准曲线，根据标准曲线计算出产量，产量为7.56g/L。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一种微球菌及其在生产2,3-丁二醇中的应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1354

<212> DNA

<213> 鉴定测序结果

<400> 1

agggttaggc caccggcttc gggtgttacc gactttcgtg acttgacggg cggtgtgtac 60

aaggcccggg aacgtattca ccgcagcgtt gctgatctgc gattactagc gactccgact 120

tcatggggtc gagttgcaga ccccaatccg aactgagacc ggctttttgg gattagctcc 180

acctcacagt atcgcaaccc attgtaccgg ccattgtagc atgcgtgaag cccaagacat 240

aaggggcatg atgatttgac gtcgtcctca ccttcctccg agttgacccc ggcagtctcc 300

catgagtccc caccattacg tgctggcaac atggaacgag ggttgcgctc gttgcgggac 360

ttaacccatc atctcacgac acgagctgac gacaaccatg caccacctgt gaacccgccc 420

caaaggggaa accgtatctc tacggcgatc gagaacatgt caagccttgg taaggttctt 480

cgcgttgcat cgaattaatc cgcatgctcc gccgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt 540

tgagttttag ccttgcggcc gtactcccca ggcggggcac ttaatgcgtt agctgcggcg 600

cggaaaccgt ggaatggtcc ccacacctag tgcccaacgt ttacggcatg gactaccagg 660

gtatctaatc ctgttcgctc cccatgcttt cgctcctcag cgtcagttac agcccagaga 720

cctgccttcg ccatcggtgt tcctcctgat atctgcgcat tccaccgcta caccaggaat 780

tccagtctcc cctactgcac tctagtctgc ccgtacccac cgcagatccg gggttaagcc 840

ccggactttc acgacagacg cgacaaaccg cctacgagct ctttacgccc aataattccg 900

gataacgctc gcaccctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cggtgcttct 960

tctgcaggta ccgtcacttt cgcttcttcc ctactgaaag aggtttacaa cccgaaggcc 1020

gtcatccctc acgcggcgtc gctgcatcag gcttgcgccc attgtgcaat attccccact 1080

gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag tgtggccggt caccctctca 1140

ggccggctac ccgtcgtcgc cttggtgagc cattacctca ccaacaagct gataggccgc 1200

gagtccatcc aaaaccgata aatctttcca acacccacca tgcggtcggc gctcctatcc 1260

ggtattagac ccagtttccc aggcttatcc cagagttaag ggcaggttac tcacgtgtta 1320

ctcacccgtt cgccactaat ccacccagca agct 1354

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 27F

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 1492R

<400> 3

cggctacctt gttacgactt 20

Claims (8)

1.一种微球菌，其特征在于：分类名Micrococcus，保藏日期2017年7月18日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.14439。

2.权利要求1所述的微球菌在生产2,3-丁二醇中的应用。

3.根据权利要求2所述的微球菌在生产2,3-丁二醇中的应用，其特征在于是按如下步骤进行的：

一、将微球菌接种至灭菌的改良LB培养基中，培养至所需浓度；

二、将步骤一中培养得到的微球菌接种至发酵培养基中，于摇床中发酵，得到产物2,3-丁二醇。

4.根据权利要求3所述的微球菌在生产2,3-丁二醇中的应用，其特征在于步骤一中所述的培养至所需浓度是培养至OD₆₀₀在0.6～1.5。

5.根据权利要求3所述的微球菌在生产2,3-丁二醇中的应用，其特征在于步骤一中所述的改良LB培养基的组分为：蛋白胨8～12g、酵母粉4～6g、氯化钠8～12g，烟叶沸水浸提液100～450mL，和蒸馏水550～900mL，pH 7.0～7.5。

6.根据权利要求3所述的微球菌在生产2,3-丁二醇中的应用，其特征在于步骤一中所述的烟叶沸水浸提液的制备方法为烟叶加入蒸馏水中，煮沸提取，冷却后，纱布过滤，收集滤液，即得烟叶水浸提液。

7.根据权利要求3所述的微球菌在生产2,3-丁二醇中的应用，其特征在于步骤二中所述的发酵培养基仅包含水和烟草工业废弃物4～8g/L及葡萄糖15～25g/L。

8.根据权利要求3所述的微球菌在生产2,3-丁二醇中的应用，其特征在于步骤二中所述发酵，为恒温振荡培养箱中振荡培养，温度为30～40℃，培养时间为4～10天。