CN103865838A - 一种嗜冷孟氏假单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种嗜冷孟氏假单胞菌Pseudomonas mandelii CBS-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013618，保藏日期为2013年11月28日。还提供了上述嗜冷孟氏假单胞菌在制备聚羟基丁酸酯中的应用。该菌种能积累聚羟基丁酸酯，在48小时内有氧生长到细胞干重达29.3g/L，合成PHB量达22.3g/L，PHB产率高，大大降低了工业生产PHB的成本。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，特别涉及一种嗜冷孟氏假单胞菌，还涉及该菌株的应用。
背景技术
聚羟基脂肪酸脂（PHAs）是由单体羟基脂肪酸酯构成的可降解聚合物，它能被许多微生物合成。许多细菌用PHA作为碳源的储备物来避免营养的不足，包括氮、磷、镁元素(Dowes and Senior,1973)。同时，PHA能被细菌和古生菌合成(Steinuchel andByrom,1991)，研究较多的有产碱杆菌属(Alcaligene sp.)(Linko et al.,1993)、固氮菌属(Azotobacter sp.)(Page,1992)、芽孢杆菌属（Bacillus sp.）(Huang and Reusch,1996)、红假单胞菌属（Rhodopseudomonas sp.）(Yue et al.,2007)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)(Kimura et al.,1992)。
聚羟基丁酸酯（PHB）是最简单的PHA聚合物，拥有可降解性、质量轻、热塑性和抗磨损性的优点(Steinbuchel and Valeniin,1995)，PHB在被用作为可降解塑料、医用移植材料和优质化学品方面有很大的潜能。
由于嗜冷菌在相对较低温度下的高效、多样的生物合成能力，这些微生物给生物技术提供了重要的资源(Moyer and Morita,2007)。从极地纬度带获得的土样中有丰富的嗜冷菌，例如Jiang等人（2008）从阿拉斯加土样中首次分离得到了荧光假单胞菌，又如在南极洲的一个临时的池塘中分离得到了P.Extremaustralis sp.nov.strain14-3T。这两种嗜冷菌能在低温下积累PHB。然而，现有菌种即使长时间发酵后PHB产量也很少，因此，PHB的生物合成比标准的化学合成更昂贵，这也就限制了生物合成PHB的应用。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种在低温下能高产PHB的嗜冷孟氏假单胞菌。
本发明的第二目的是提供上述菌种在制备聚羟基丁酸酯中的应用。
技术方案：为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案为：一种嗜冷孟氏假单胞菌Pseudomonas mandelii CBS-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学，邮政编码为430072，其保藏编号为CCTCC NO：M2013618，保藏日期为2013年11月28日。
本发明嗜冷孟氏假单胞菌Pseudomonas mandelii CBS-1的分离过程为：来自中国吉林省长白山的土壤将菌源土壤悬浮在无菌水中，充分斡旋振荡，置于富集培养基中20℃下培养2天；取等量50μL的培养液加到平板培养基上，20℃培养过夜。
结合嗜冷孟氏假单胞菌Pseudomonas mandelii CBS-1的菌落形态特征、生理和生化特征，将所测16SrDNA序列通过BLAST比对，鉴定其为嗜冷孟氏假单胞菌(Pseudomonas mandelii)。嗜冷孟氏假单胞菌Pseudomonas mandelii CBS-1的16SrDNA序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了上述嗜冷孟氏假单胞菌Pseudomonas mandelii CBS-1在制备聚羟基丁酸酯中的应用。
所述应用，具体为：将嗜冷孟氏假单胞菌Pseudomonas mandelii CBS-1接种于基本培养基中发酵培养，分离，即得聚羟基丁酸酯。
所述基本培养基包括1%蔗糖作为碳源、谷氨酸钠作为氮源、1.0g/L KH2PO4、2.5g/LNa2HPO4、0-2g/L NaCl，pH为7.0-8.0，优选7.0-7.5，C/N比在5以上，优选5-30。
其中，培养温度为15-30℃，优选20-25℃，培养时间为48-72h。
有益效果：本发明提供了一种嗜冷孟氏假单胞菌，能积累聚羟基丁酸酯，在48小时内有氧生长到细胞干重达29.3g/L，合成PHB量达22.3g/L，PHB产率高，大大降低了工业生产PHB的成本。
与其他在低温下产PHB的菌种相比，CBS-1菌在工业化生产方面更有前景。例如，Pseudomonas mandelii CBS-1（缩写CBS-1）菌是使用蔗糖作为碳源的，所以PHB的生产与那些需要昂贵碳源的菌种相比经济得多。而且，CBS-1菌比Jiang et al.(2008)研究的菌种能达到更高的最大细胞密度值，他们选用的菌种要培养4天才能达到A2a5菌的最大细胞密度和PHB的最大浓度，而CBS-1菌只要48小时。因此，CBS-1菌能以低的成本积累大量的PHB，与A2a5菌相比，能以更低的成本、更高的效率生产更高产量的PHB。
附图说明
图1为包含PHB颗粒物的CBS-1菌的超薄切片的透射电子显微图，放大倍数2500x。
图2为CBS-1菌和其它相关菌属的系统进化树；展示了1000个复制品的分支支持率，基准尺代表着每个位置有0.001个核苷酸代替，括号里的号码是16S rRNA基因序列进入GenBank的登录号。
图3为培养条件对CBS-1菌生长的影响；其中，温度（A），C/N比率（B），pH(C)，NaCl浓度（D）。
图4为标准PHB和CBS-1菌产生的PHB的核磁共振氢谱。
图5为蔗糖作为碳源的培养基中25℃下有氧培养的CBS-1菌干重和PHB的产量；每个点代表三组平行实验的平均值。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做出进一步说明。
实施例1菌株的分离
1、菌种和培养基和培养条件
（1）菌源
来自中国吉林省长白山（海拔为2183m，北纬42°08′19.7″，东经128°10′8.3″）的土壤
（2）培养基
富集培养基：5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨和2.5g/L Nacl；
平板培养基：20g/L葡萄糖，2g/L(NH4)2SO4，13.3g/L KH2PO4，1.2g/LMgSO4.7H2O，1.7g/L柠檬酸，1.7g/L微量元素溶液，15g/L琼脂，0.5μg/mL尼罗蓝A。
2、菌株的分离和鉴定
（1）菌株的分离
将菌源土壤悬浮在无菌水中，充分斡旋振荡，置于富集培养基中20℃下培养2天；取等量50μL的培养液加到平板培养基上，20℃培养过夜。
恶嗪染料尼罗蓝A染色是检测生长的菌落中的聚羟基丁酸和其它PHAs的一种简单而高灵敏染色方法，在紫外下进行观察培养基，取带荧光的菌落划线接种到同样的平板培养基上，59个带荧光的菌落被纯化出来，20℃培养过夜。使用苏丹黑B染色，其中的27个能够被苏丹黑B染色。
苏丹黑B染色最大的、染色最深的的菌体即为CBS-1。
取菌株，平板活化2天，得培养物。
（2）菌株的鉴定
细胞形态：
按照以下步骤用透射电子显微镜来检测细胞形态：指数后期（最好细胞浓度为OD600值55-80）的2mL均等菌液中混合进4%戊二醛和1%四氧化锇，并用一系列含量（30%、50%、70%、80%、90%和100%）的丙醇脱水；脱水后的细胞包埋在环氧树脂中，再转移至样品池中，树脂分别在30℃、45℃和60℃下聚合24小时；超薄样品使用超微切片机来切，菌液随后用乙酸双氧铀和柠檬酸铅分别处理22分钟和5分钟，最后使用H-7650型号的透射电子显微镜观察(Hitachi,Tokyo,Japan)。
电子显微镜观察结果显示：CBS-1菌在潮湿、表面光滑的半透明平板上形成白色、圆形菌落，杆状，直径为3-4mm，长5-7mm，并且不形成芽孢，细胞单一或成群地出现，内部包含大颗粒物——PHB，见图1。
Biolog革兰氏阴性试验：
把纯培养物放在BUG琼脂平板(Biolog Catalog#70101)上生长，BiologTMGN96孔的微量滴定板含有95种不同的碳源，一个阴性对照和一个四唑染料(Biolog Inc.,Hayward,CA,USA)，细胞再从平板表面被悬浮到一种特定浓度的革兰氏阴性接种液中。Biolog GN2的微孔板的孔内接种着150μL稀释过的悬浮液，然后在30℃下培养24小时(Garland and Mills,1991)。根据厂家的说明，使用Biolog MicroStationTM来观察和分析微孔板，得到的结果与GN III数据库进行对比。
表1CBS-1菌和相关假单胞菌属的生化特征
+阳性;-,阴性.
aBiolog GN分析数据.
b数据来自Jiang et al.(2008)
结果显示：该菌株为革兰氏阴性菌。
16S rRNA序列的测定：
16S rRNA基因的PCR扩增使用的引物是一般细菌的引物——27F(5′-agagttgatcctggctcag-3′)和1492R(5′-ggytaccttgttacgactt-3′)(Lane,1991)，产物用Takara Corp来测序(Dalian，China)。应用BLAST算数法在GenBank数据库中把序列和16S rRNA基因进行比较(Altschul et al.,1990)，应用MEGA4.0程序建立邻接树。
序列以KC778401的登录号提交进GenBank，BLAST分析表明CBS-1菌十分接近孟氏假单胞菌（99%亲缘性），系统进化分析也把CBS-1菌和孟氏假单胞菌划分为一类（96%的亲缘性）（见图2）。
实施例2培养条件对菌种生长的影响
应用单一变量法(Tang and Luo,2008)来研究碳氮源、C/N值、温度、起始pH值和NaCl浓度对细胞生长的影响，尤其是以酵母粉、葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油和乙醇作为碳源时，以胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、谷氨酸钠、尿素和NH4Cl作为氮源时对菌生长的影响。所有的培养基均含有1.0g/L KH2PO4,2.5g/L Na2HPO4,pH为7.0，所有的细胞均在200rpm下培养3d，细胞离心收集，颗粒物在70℃下烘干至恒重。
条件及结果如下：
考察不同碳氮源对菌种生长的影响，结果见表2；所有的数据结果来源于至少三组独立实验得到的平均数和标准方差，t检验、方差分析和邓肯多重比较检验确定了亚硝酸盐到氮气转变率不同的统计数据。统计数据的p值小于0.05，所有的分析使用的是Windows版本11.0的SPSS。
表2不同碳氮源菌种生长的影响
结果显示：蔗糖作为碳源、谷氨酸钠作为氮源菌种生长最好。
采用蔗糖和谷氨酸钠在C/N值为5的条件下，NaCl浓度为1g/L，pH为7，考察温度的影响，结果见图3A，结果显示，温度为15-30℃菌种生长均较好，最佳条件为20-25℃。
为了测定C/N值的影响，我们分别使用蔗糖和谷氨酸钠作为唯一的碳源和氮源，考察C/N分别是1，5，10，15，20，25和30，温度为20℃，其他的条件如上所述；结果见图3B，结果显示：C/N比在5以上菌种生长均较好。
测试的pH值的范围5.0--9.0（0.5pH单位是一个间隔），温度为20℃，C/N值为5，其他的条件如上所述；结果见图3C，结果显示：pH值为6.5-8.5菌种生长均较好，最佳条件为7-8。
测试的NaCl浓度范围为0--50g/L(5g/L为一个间隔)，温度为20℃，C/N值为5，pH为7，其他的条件如上所述；结果见图3D，结果显示：NaCl浓度范围在0--2g/L菌种生长均较好，最佳条件为0-1.5。
实施例3PHB的生产
基本培养基：1.0g/L KH2PO4、2.5g/L Na2HPO4、1%（w/v）蔗糖作为碳源、谷氨酸钠作为氮源，pH值用0.5M NaOH调节至7.0，C/N比为5。
取10mL CBS-1菌种培养液（OD600为0.5）接种到150mL基本培养基中，在20℃，200rpm下培养至少培养三天，样品在72小时内每隔8小时收集一次。结果显示：达到稳定期（48h）后细胞积累量最多，细胞干重达到29.3g/L，PHB浓度达到22.3g/L(图5)。
细胞离心收集，加入浓度为10%SDS，沸水中处理15min。12000rpm离心10min，弃上清。沉淀用H2O洗涤2次，40℃烘干。加入氯仿，在60℃下处理1小时。不溶解的物质过滤去除。旋转蒸发，浓缩至干，加入甲醇洗涤，过滤后60-70℃烘干，即得。
用5-mm的1H探针来把1mL样品的核磁共振光谱记录在BRUAK AV-400型号的波谱测定仪上，CDCl3作为溶剂其最终的浓度达到10g/L。使用400MHz来检测PHB，标准的PHB购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA,#MSDS363502)，结果见图4。
在δ=5.2,2.5,和1.2ppm处，检测出是分别与-CH相一致的双重峰，与-CH2相一致的多重峰，与-CH3相一致的双重峰(Verlinden et al.,2011;De Rooy et al.2007)。在δ=7.3ppm处的最大峰值代表溶剂——CD3Cl，在δ=0.0ppm和δ=0.8ppm处的峰值代表内标准(CH3)4Si，在δ=1.6ppm处的小峰值是由于水溶剂的污染造成的。
结果与PHB标准品一致，由此可见：在以蔗糖作为碳源的生长条件下，CBS-1菌能够合成PHB。
Claims (5)
1.一种嗜冷孟氏假单胞菌Pseudomonas mandelii CBS-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013618，保藏日期为2013年11月28日。
2.权利要求1所述的嗜冷孟氏假单胞菌Pseudomonas mandelii CBS-1在制备聚羟基丁酸酯中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：将嗜冷孟氏假单胞菌Pseudomonas mandeliiCBS-1接种于基本培养基中发酵培养，分离，即得聚羟基丁酸酯。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述基本培养基包括1%蔗糖作为碳源、谷氨酸钠作为氮源、1.0g/L KH2PO4、2.5g/L Na2HPO4、0-2g/L NaCl，pH为7.0-8.0，优选7.0-7.5，C/N比在5以上。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：培养温度为15-30℃，培养时间为48-72h。
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