CZ2019631A3 - Způsob výroby polyhydroxyalkanoátů pomocí isolátu termofilního bakteriálního kmene Aneurinibacillus sp. H1 - Google Patents
Způsob výroby polyhydroxyalkanoátů pomocí isolátu termofilního bakteriálního kmene Aneurinibacillus sp. H1 Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2019631A3 CZ2019631A3 CZ2019631A CZ2019631A CZ2019631A3 CZ 2019631 A3 CZ2019631 A3 CZ 2019631A3 CZ 2019631 A CZ2019631 A CZ 2019631A CZ 2019631 A CZ2019631 A CZ 2019631A CZ 2019631 A3 CZ2019631 A3 CZ 2019631A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- culture medium
- hydroxybutyrate
- production
- pha
- glycerol
- Prior art date
Links
- 229920000903 polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 title claims abstract description 100
- 239000005014 poly(hydroxyalkanoate) Substances 0.000 title claims abstract description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 241000099082 Aneurinibacillus sp. Species 0.000 title abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 56
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 37
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 29
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 23
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 19
- 229920000070 poly-3-hydroxybutyrate Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 claims abstract description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 126
- WERYXYBDKMZEQL-UHFFFAOYSA-N butane-1,4-diol Chemical group OCCCCO WERYXYBDKMZEQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 18
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims description 16
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 11
- YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 4-Butyrolactone Chemical compound O=C1CCCO1 YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N valeric acid Chemical compound CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 5
- 229940070710 valerate Drugs 0.000 claims description 5
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical group OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000555286 Aneurinibacillus Species 0.000 claims description 3
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 2
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940095574 propionic acid Drugs 0.000 claims description 2
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 claims description 2
- 229940005605 valeric acid Drugs 0.000 claims description 2
- FHUDZSGRYLAEKR-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutanoic acid;4-hydroxybutanoic acid Chemical compound CC(O)CC(O)=O.OCCCC(O)=O FHUDZSGRYLAEKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 229920000520 poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) Polymers 0.000 abstract description 7
- 229920001013 poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) Polymers 0.000 abstract description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 29
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N R3HBA Natural products CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 3-hydroxybutyrate Chemical compound CC(O)CC([O-])=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 25
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 4-hydroxybutyrate Chemical compound OCCCC([O-])=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 19
- 239000000463 material Substances 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 15
- REKYPYSUBKSCAT-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypentanoic acid Chemical compound CCC(O)CC(O)=O REKYPYSUBKSCAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 13
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 12
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 11
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 11
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 208000037534 Progressive hemifacial atrophy Diseases 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000012017 passive hemagglutination assay Methods 0.000 description 8
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 6
- VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N nile red Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=O)C2=C1 VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 6
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 5
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 5
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 5
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241001528539 Cupriavidus necator Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 239000003225 biodiesel Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- JOOXCMJARBKPKM-UHFFFAOYSA-N 4-oxopentanoic acid Chemical compound CC(=O)CCC(O)=O JOOXCMJARBKPKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N Acetoin Chemical compound CC(O)C(C)=O ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000040345 Bacillus shackletonii Species 0.000 description 2
- 241000952606 Caldimonas taiwanensis Species 0.000 description 2
- 241001135720 Chelatococcus Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001528480 Cupriavidus Species 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 241001600125 Delftia acidovorans Species 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- 241000827781 Geobacillus sp. Species 0.000 description 2
- 241000204988 Haloferax mediterranei Species 0.000 description 2
- 241000206596 Halomonas Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000868182 Thermus thermophilus HB8 Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011090 industrial biotechnology method and process Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 2
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- FYSSBMZUBSBFJL-VIFPVBQESA-N (S)-3-hydroxydecanoic acid Chemical compound CCCCCCC[C@H](O)CC(O)=O FYSSBMZUBSBFJL-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 2-nitrophenyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 0.000 description 1
- HHLCERAMXZVWIV-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutanoic acid;4-hydroxybutanoic acid;3-hydroxypentanoic acid Chemical compound CC(O)CC(O)=O.OCCCC(O)=O.CCC(O)CC(O)=O HHLCERAMXZVWIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NDPLAKGOSZHTPH-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxyoctanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)CC(O)=O NDPLAKGOSZHTPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004483 ATR-FTIR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N Aesculin Natural products OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1Oc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 108010082340 Arginine deiminase Proteins 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 241000738299 Chelatococcus sp. Species 0.000 description 1
- WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N Cichoriin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)c1c(O)cc2c(OC(=O)C=C2)c1 WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920001634 Copolyester Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000205062 Halobacterium Species 0.000 description 1
- 241000260842 Halomonas boliviensis Species 0.000 description 1
- 241001148475 Halomonas halophila Species 0.000 description 1
- 241001653918 Halomonas sp. Species 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001072202 Homo sapiens Protein disulfide-isomerase Proteins 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000056981 Paraburkholderia sacchari Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036352 Protein disulfide-isomerase Human genes 0.000 description 1
- 241000481518 Ralstonia eutropha H16 Species 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 208000004350 Strabismus Diseases 0.000 description 1
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000009604 anaerobic growth Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000005102 attenuated total reflection Methods 0.000 description 1
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 229920000704 biodegradable plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000229 biodegradable polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012786 cultivation procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000000459 effect on growth Effects 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N esculin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C(=C1)O)=CC2=C1OC(=O)C=C2 XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N 0.000 description 1
- 229940093496 esculin Drugs 0.000 description 1
- AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N esculin Natural products OC1OC(COc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O)C(O)C(O)C1O AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- XXMIOPMDWAUFGU-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diol Chemical compound OCCCCCCO XXMIOPMDWAUFGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001261 hydroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- GFAZHVHNLUBROE-UHFFFAOYSA-N hydroxymethyl propionaldehyde Natural products CCC(=O)CO GFAZHVHNLUBROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 229940040102 levulinic acid Drugs 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 238000013365 molecular weight analysis method Methods 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012803 optimization experiment Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 108010010718 poly(3-hydroxyalkanoic acid) synthase Proteins 0.000 description 1
- 229920000071 poly(4-hydroxybutyrate) Polymers 0.000 description 1
- 229920002791 poly-4-hydroxybutyrate Polymers 0.000 description 1
- 238000012667 polymer degradation Methods 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229920001169 thermoplastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004416 thermosoftening plastic Substances 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/32—Processes using, or culture media containing, lower alkanols, i.e. C1 to C6
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
- C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Vynález se týká využití isolátu původního Gram-pozitivního termofilního bakteriálního kmene identifikovaného a označeného jako Aneurinibacillus sp. H1 k termofilní biotechnologické produkci polyhydroxyalkanoátů, zejména poly(3-hydroxybutyrátu), kopolymeru poly(3-hydroxybutyrát-co-3-hydroxyvalerátu) a kopolymeru poly(3-hydroxybutyrát-co-4-hydroxybuytrátu) v kultivačním médiu obsahujícím uhlíkatý substrát, komplexní zdroj dusíku a anorganický zdroj dusíku. Způsob podle vynálezu je vhodný pro produkci polyhydroxyalkanoátů v průmyslovém měřítku.
Description
Způsob výroby polyhydroxyalkanoátů pomocí isolátu termofilního bakteriálního kmene Aneurinibacillus sp. H1
Oblast techniky
Vynález se týká využití isolátu původního Gram-pozitivního termofilního bakteriálního kmene identifikovaného a označeného jako Aneurinibacillus sp. H1 k termofilní biotechnologické produkci polyhydroxyalkanoátů.
Dosavadní stav techniky
Polyhydroxyalkanoáty (PHA) jsou mikrobiální polyestery, které ve formě intracelulámích granulí akumuluje řada prokaryotických mikroorganismů jako zásobní formu uhlíku, energie a redukční síly. Po chemické stránce se jedná o polyestery hydroxykyselin, přičemž karboxylová skupina se obvykle nachází v poloze 3 případně 4. Podle délky monomemí jednotky rozlišujeme dva základní typy PHA - polymery s krátkou délkou řetězce (short-chain-lenght) tzv. scZ-PHA a materiály se střední délkou řetězce (medium-chain-lenght) tzv. mc/-PHA. Obecně platí, že PHA jsou velice často uvažovány jako potenciální náhrada za polymery petrochemického původu, a to z několika hlavních důvodů. Mechanické, termické a technologické vlastnosti PHA jsou velice podobné některým petrochemickým polymerům, nicméně na rozdíl od petrochemických materiálů jsou PHA i. kompletně připraveny biotechnologickou cestou s využitím obnovitelných případně i odpadních surovin, ii. jedná se o přirozeně a kompletně biodegradovatelné a kompostovatelné materiály, a to prakticky ve všech relevantních prostředích, a iii. PHA vykazují vysokou míru biokompatibility s lidským tělním prostředím. Tyto jejich vlastnosti z nich činí zajímavou materiálovou základnu pro velice širokou paletu aplikací.
Obecně platí, že PHA jsou termoplasty a je tedy je možné opracovávat standardními postupy. Vlastnosti PHA jsou závislé především na monomemím složení, základní parametry některých zástupců PHA jsou uvedeny v tabulce 1 [1].
Tabulka 1. Parametry vybraných vlastností některých PHA a jejich srovnání s polypropylenem [1],
P(3HB) -poly(3-hydoxybutyrát), P(3HB/3HV) - poly(3-hydroxybutyrát-co-3-hydroxyvalerát), P(4HB) - poly(4-hydroxybutyrát), P(3HB/4HB) - poly(3-hydroxybutyrát-co-4-hydroxybutyrát), PP - polypropylen
Nejčastějším a nejlépe prostudovaným PHA polymerem je homopolymer 3-hydroxybutyrátu (3HB), poly(3-hydroxybutyrát) - P(3HB). Materiál isolovaný z bakteriálních buněk vykazuje vysokou míru krystalinity - je tedy pevný, křehký a málo elastický. Teplota tání polymeru je přibližně 179 °C, přičemž teplota degradace materiálu (200 °C) je nepříjemně blízko teplotě tání, což významně komplikuje jeho tavení.
- 1 CZ 2019 - 631 A3
Mechanické i technologické vlastnosti materiálu je však možné významně zlepšit, pokud je do struktury materiálu inkorporována další monomemí jednotka. Velice často je to 3-hydroxyvalerát (3HV). Vzniká tak kopolymer poly(3-hydroxybutyrát-co-3-hydroxyvalerát) (P3HB-CO-3HV). Vlastnosti polymeru jsou potom závislé na obsahu 3HV, celkově je možné konstatovat, že se sníží krystalinita a Youngův modul, a naopak narůstá jeho průtažnost a elasticita. Zároveň vykazuje polymer nižší teplotu tání než homopolymer PHB při zachování téže hodnoty teploty degradace, což je samozřejmě z pohledu tavení polymeru velice pozitivní.
Dalším velice zajímavým materiálem je kopolymer obsahující 4-hydroxybutyrát (4HB), poly(3hydroxybutyrát-co-4-hydroxybutyrát) P(3HB-co-4HB). Tento materiál vykazuje vysoce amorfní strukturu a rostoucím obsahem 4HB výrazně klesá teplota degradace až téměř k hodnotě 50 °C a výrazně roste flexibilita, průtažnost a také Youngův modul. Není bez zajímavosti, že kopolymery P(3HB -CO-4HB) vykazují také zvýšenou biodegradabilitu, a to i v prostředí tělních tekutin [2], Díky svým vlastnostem má tedy P(3HB-co-4HB) vysoký aplikační potenciál především v oblasti biomedicíny. V roce 2007 americký úřad Food and Drug Adminstration (FDA) schválil použití P4HB pro medicínské využití (Tepha FLEX®Absorbable Suture” a “BioTREK™ Bioabsorbable Septal Repair”) a také byla publikována řada úspěšných studií využívajících P(3HB-co-4HB) v klinických aplikacích, jako transportní systém pro léčiva nebo scafoldy pro proliferaci buněk a tkáňové inženýrství [3 - 5],
Schopnost produkce P(3HB-co-4HB) indukované přídavkem strukturního prekurzoru 4HB jako jsou například gama-buryrolakton (GBL), 1,4-butandiol (1,4-BD), nebo přímo 4- hydroxybutyrátu byla pozorována pro několik přirozených bakteriálních producentů PHA, jako jsou například Cupriavidus necator [6], Cupriavidus malaysiensis [7], Comamonas acidovorans [8] nebo Burkholderia sacchari [9], Schopnost inkorporace 4HB do struktury polymeruje možné posílit například náhodnou mutagenezí tak, jak ve svém experimentu demonstrovali Kitamura a Doi, kteří zvýšenou schopnost inkorporace 4HB do struktury polymeru pozorovali u mutantních kmenů C. necator H16 neschopných růstu na 4HB jako jediném zdroji uhlíku [10], Schopnost produkce P(3HB-CO-4HB), a to i bez nutnosti aplikace strukturních prekurzorů 4HB, je do vhodného producenta také možno vnést pomocí nástrojů genového inženýrství, jak o tom pojednávají patenty US 6689589 B2 [11], US 006117658 A [12], US 8546125 B2 [13] případně další literární zdroje [14]·
Při medicínských aplikacích polyhydroxyalkanoátů je klíčovou vlastností materiálů jejich čistota a spektrum potenciálních kontaminantů. Pokud je polymemí materiál produkován a následně isolován z Gram-negativních bakterií, je velice často kontaminován endotoxiny na bázi lipopolysacharidů, které jsou lokalizovány na vnější membráně buněčné stěny Gram-negativních bakterií, a proto jsou spolu s PHA ko-isolovány z bakteriální biomasy. Tyto kontaminanty způsobují velice silnou imunitní odpověď, která může v extrémních případech končit až smrtí, jsou tedy při uvažované aplikaci PHA v oblasti medicíny extrémně nežádoucí. Proto je obsah endotoxinů monitorován, u zdravotního vybavení nesmí obsah endotoxinů obvykle přesáhnout hodnotu 20 Endotoxin Units (EU) nicméně například u materiálů které mají být v kontaktu cerebrosiálními tekutinami nesmí obsah endotoxinlů přesáhnout hodnotu 2,5 EU [15], Nicméně komerčně dostupné PHA materiály obvykle vykazují obsahy endotoxinů na úrovni 100 EU i více. Obsah endotoxinů může být u PHA biomateriálů snížen použitím vhodné isolační techniky [16], případně mohou být endotoxiny selektivně degradovány pomocí oxidačního činidla, jak to popisuje patent US 6245537 B1 [17], nicméně úplné odstranění je obtížné ne-li nemožné. Možné řešení skýtá využití Gram-pozitivních bakterií, které endotoxiny obsahují jen v minimálním množství, a PHA materiály připravené pomocí Gram-pozitivních bakterií proto prakticky nejsou endotoxiny kontaminovány.
Extrémofilové jsou schopní přežívat a růst v podmínkách, které jsou daleko od podmínek vhodných pro život většiny organismů. V moderních mikrobiálních biotechnologiích jsou v současné době procesy založené na využití extrémofilních mikroorganismů považovány za velice perspektivní,
- 2 CZ 2019 - 631 A3 protože extrémofily přinášejí řadu výhod. Předně je to výrazné zvýšení robustnosti procesu vůči kontaminaci, což umožňuje například využít kontinuální kultivační mód nebo redukovat případně úplně eliminovat nároky na sterilizaci zařízení a kultivačního média. Další výhodou extrémofilů jako produkčních jednotek je obvykle jejich vysoká růstová rychlost, schopnost utilizovat širokou paletu substrátů, a to včetně odpadů, možnost využití levnějších zdrojů fermentační vody, a to včetně mořské a snížení energetických nároků na kultivace. Další výhody často vyplývají z využití konkrétní skupiny extremofilů [18], Z těchto důvodů jsou v současné době procesy založené na extremofilních mikroorganismech často označovány jako průmyslové biotechnologie nové generace (Next Generation Industrial Biotechnologies, NGIB) [19], Pochopitelně je tedy i snaha využít výhod plynoucích ze zapojení extremofilů při biotechnologické produkci PHA [20], Z tohoto pohledu je velice zajímavá skupina halofilních mikroorganismů, tedy mikroorganismů, které se adaptovaly na vysokou salinitu prostředí. Schopnost produkce PHA byla popsána u řady halofilů, ať už jsou to středně halofilní Gram-negativní bakterie, jako jsou Halomonas halophila [21], Halomonas boliviensis [22] nebo Halomonas bluephagenesis [23], středně halofilní Grampozitivní Bacillus megaterium uyuni S29 [24] nebo extrémně halofilní Archea Haloferax mediterranei [25], Bylo prokázáno, že schopnost akumulace PHA představuje účinnou ochrannou strategii vůči negativním efektům hyperosmotického prostředí [26] a výrazným fluktuacím osmolarity prostředí [27], což je pravděpodobně důvodem častého výskytu schopnosti biosyntézy PHA mezi halofilními prokaryoty. Produkce PHA pomocí halofilních mikroorganismů je popsána také v patentové literatuře, je to například patent AT 513449 AI [28] který popisuje možný způsob výroby PHA a dalších hodnotných metabolitů s využitím odpadu po výrobě bioplynu za využití halofilních mikroorganismů, patent DE 102008045237 B4 [29] se věnuje možné ko-produkci PHA a kompatibilních látek v rámci jednoho biotechnologického procesu pomocí halofilní kultury, patent JP 5164182 B2 [30] deklaruje, že isolát označený jako Halomonas sp. HM-1 je velice slibný producent PHA, obdobně i patent JP 2011083204 A věnuje pozornost konkrétnímu kmenu rodu Halomonas [31],
Kromě halofilních kmenů jsou za slibné producenty PHA považovány také termofily mikroorganismy vykazující optimální růst při teplotách 45 °C a více. Jejich využití nabízí celou řadu výhod, předně je třeba zmínit, že procesy využívající termofily jsou často překvapivě energeticky výhodné. To je dáno minimalizací nákladů na chlazení a také tím, že kvýhřevu reaktoru je možné do velké míry využít metabolické teplo rychle rostoucí termofilní kultury a energii míchadla [18, 20], Vysoká kultivační teplota pochopitelně snižuje riziko kontaminace a je možné zvážit snížení sterility procesu. Například Ibrahim a Steinbuchel využili k produkci PHA termofilní kultury Chelatoccocus sp. a i bez sterilizace zařízení byl proces veden asepticky i po dlouhou kultivační dobu [32], Nicméně termofilních kmenů schopných produkce PHA nebylo doposud popsáno tolik jako halofilů. Biosyntéza PHA byla popsána především u Gramnegativních kultur jako například u bakterie Thermus thermophilus HB8. Tato bakterie je podle literárních údajů schopna růst při 75 °C, obsah PHA v biomase dosahuje 30 až 40 % hmota, a samotný polymer se skládá ze zajímavých monomemích jednotek, jako je například 3hydroxydekanoát, 3-hydroxyoktanoát, ale také 3HB a 3HV [33-34], Dalším Gram-negativním producentem PHA popsaným v literatuře je Caldimonas taiwanensis, která je schopna produkce P(3HB) a P(3HB-co-3HV) při teplotě 55 °C [35]. Ibrahim a Steinbuchel isolovali PHA produkující termofilní bakterie z čistírny odpadů a získali několik isolátů, které se dle sekvenace 16S rRNA genu a podle fyziologických a biochemických testů řadily do skupiny Chelatococcus, izoláty klasifikovali jako Chelatococcus thermostellatus. Tato Gram-negativní bakterie je schopna produkce PHA při teplotách okolo 50 až 55 °C, přičemž jako substrát preferuje glycerol nebo glukózu [36], V následujících experimentech výzkumná skupina okolo prof. Steinbuchelatestovala biotechnologický potenciál tohoto producenta s využitím různých pokročilých kultivačních módů (batch, fed-batch, repeated batch), zároveň byla úspěšně ověřena robustnost procesu vůči mikrobiální kontaminaci při snížených nárocích na sterilizace zařízení [32], Gram-pozitivních termofilních producentů PHA bylo doposud popsáno výrazně méně. Bacillus shackletonii isolovaný v prostředí čínské uhelné elektrárny je schopen produkce P(3HB) při teplotách 35 až 50 °C [37], Schopnost produkce P(3HB) byla také popsána u kmene Geobacillus sp. AY 946034, který je schopen růstu a produkce PHA při 60 °C [38], a nakonec byla schopnost produkce PHA
- 3 CZ 2019 - 631 A3 popsána u kmene Aneurinibacillus sp. XH2, který byl vyisolován v Číně na ropném ložisku, nicméně výtěžky popsané v literatuře jsou i přes použití bohatého a finančně náročného kultivačního média spíš nízké - lll,6mg/L [39], kmen je patentově chráněn patentem CN 103667153 B [40],
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je termofilní Gram-pozitivní kmen Aneurinibacillus sp. Hl. Tento bakteriální kmen byl isolován speciálním způsobem z kompostu a je uložen v České sbírce mikroorganismů (CCM) pod sbírkovým číslem 8960.
Kmen byl isolován z kompostu odebraného v Brněnské kompostámě, odběr vzorku kompostu byl realizován dne 15. 10. 2018. Cílem bylo vyisolovat termofilní producenty PHA. Podle zkušeností vynálezců není možné při práci s termofilními kmeny využít standardní postup aplikace Nilské červeně do agaru tak, jak je popsáno v literatuře, protože termofily často vykazují pozitivní barvení Nilskou červení bez ohledu na jejich schopnost akumulace PHA viz. obr. 1.
Při standardním isolačním postupu je možné PHA produkující kmeny odlišit od PHA neprodukujících pomocí aplikace Nilské červeně do agaru, kolonie producentů PHA pak pod UV zářením vykazují typickou oranžovou fluorescenci. Nicméně pokud je postup využit k isolaci termofílních kultur (kultivační teplota 50 °C a více) vykazuje pozitivní barvení Nilskou červení velká část kolonií bez ohledu na schopnost produkce PHA. Proto nebylo možné isolační postup s využitím Nilské červeně aplikovat na termofilní kultury a bylo nutno zvolit odlišnou strategii na základě předchozích poznatků o tom, že schopnost akumulace PHA zvyšuje odolnost bakterií vůči prudké změně osmolarity prostředí.
Byl vyvinut isolační protokol, kdy byla směsná kultura bakterií potenciálně obsahující PHA producenty vystavena nejdříve silně hypertonickému (100 až 200 g/L NaCl) a následně silně hypotonickému prostředí (destilovaná voda). Následně byly buňky vysety na misku, přičemž bylo možné předpokládat, že většina přeživších bakterií schopných tvořit kolonie je schopná produkce PHA. Schéma originálního isolačního postupuje uvedeno na obrázku 2.
Při isolaci termofilních PHA producentů byl jako startovací kultura využit kompost odebraný 15. 10. 2018 v podniku Centrální kompostáma Brno, provozovatel SUEZ Využití zdrojů a.s. Cca 1 g kompostu byl rozsuspendován ve 100 ml minerálního kultivačního média Ml o následujícím složení:
Složení minerálního média Ml:
- 4 CZ 2019 - 631 A3
Giycerd
NasHFOv 12 mlci
Yeast Extract
MgSCh 7 &O
CaCh' 2 HsO
2() g/L g/L L.5 g/L i g/L 03 g/L 0.2 g/L ILG2 g/L * Roztok stopových prvků 1 mL/L
Úprava pH pomocí 1 M H2SO4 nebo NaOH na hodnotu 7,0 * Složení roztok stopových prvků:
BOTA
Fečh
ZoCh
C<1r 2 H2O €c£Ir 6 HsO
MnCh’6%0
BBOj g/L g/L
0.84 g/L
OJ 3 g/L
OJ g/L
03¼ g/L
0J g/L
Vzorek byl následně submerzně kultivován při 50 °C po dobu 48 h. Následně byla takto připravená směsná kultura převedena (inokulační poměr 10 % obj.) do čerstvého kultivačního média a opět kultivována pň teplotě 50 °C po dobu 48 h. Takto připravená směsná kultura byla vystavena působení hypertonického prostředí a následně hypotonickému prostředí tak, jak je schematicky uvedeno na obrázku 2. Po expozici hypertonickému a hypotonickému šoku byla buněčná suspenze vyseta na misky obsahující totožné médium, které bylo využito k její submerzní kultivaci a inkubovánapři50 °C po dobu 48 h. Na miskách se objevily dva typy kolonií - matné ploché béžové kolonie s nepravidelným plazivým okrajem, které významně dominovaly (cca 90 % všech kolonií na miskách) a pak menší podíl drobných bílých kolonií s jasně ohraničeným okrajem. Oba typy kolonií byly vyšetřeny co do přítomnosti PHA pomocí metody infračervené spektroskopie využívající techniky zeslabeného úplného odrazu (ATR- FTIR) a přítomnost PHA byla prokázána pouze u dominantního typu kolonií, což jednoznačně prokazuje efektivitu použitého isolačního postupu. V rámci PHA produkujícího typu kolonií byl vybrán dominantní typ kolonie, která byla označena jako isolát Hl.
Průkaz přítomnosti PHA granul u získaných isolátů byl proveden nejen pomocí FTIR
- 5 CZ 2019 - 631 A3 spektroskopie, ale také mikroskopickým vyšetřením isolátů pomocí Transmisní Elektronové Mikroskopie (TEM), výsledky pro isolát H1 jsou zobrazeny na obrázku 3.
Bakteriální izolát byl následně identifikován pomocí standardních mikrobiologických testů.
Výsledky fenotypové identifikace isolátu Hl (provedeno Českou sbírkou mikroorganismů):
Mikroskopie: Gram-negativní tyčky (gram-pozitivní stěna potvrzena KOH testem), jednotlivě, v nepravidelných shlucích, spory oválné, zduřující buňku, umístěné centrálně
Morfologie kolonií: matné, ploché, béžové, okraj nepravidelný, plazivý
Pozitivní testy: kataláza, anaerobní růst, hydrolýza želatiny, kaseinu, ONPG a lecithinu, ureáza, kyselina z glukózy, xylózy a laktózy, růst v přítomnosti 7 % NaCl, růst při 60 °C, hemolýza
Negativní testy: hydrolýza škrobu, Tweenu 80, eskulinu, tyrosinu a DNA, acetoin, redukce nitrátů, kyselina z mannitolu, celobiózy, fruktózy a inositolu, růst v přítomnosti 10% NaCl, růst při 30 °C, růst při 65 °C Simmons citrát, arginin dihydroláza.
Kromě standardní fenotypové charakterizace byla také provedena identifikace kmene pomocí systému BIOLOG - v obou případech byla kultura identifikována jako Aneurinibacillus sp., bližší taxonomické zařazení nebylo na základě výsledků možné.
Dalším přístupem pro taxonomické zařazení isolátu byla parciální sekvenace 16S rRNA genu pomocí primerů 16S-F (5-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) a 16S-R (5GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ). Při srovnání sekvence byla nejvyšší podobnost nalezena pro Aneurinibacilus thermoaerophilus.
Byl tedy získán termofilní Gram-pozitivní izolát Aneurinibacillus sp. Hl, který může být s výhodou využit k biotechnologické produkci PHA. Kmen byl uložen jako patentová kultura v České sbírce mikroorganismů a bylo mu uděleno sbírkové číslo CCM 8960, doklady o uložení ve sbírce jsou přílohou patentové žádosti.
Předmětem vynálezu je způsob biotechnologické výroby polyhydroxyalkanoátů, které jsou produkovány mikroorganismem termofilního Gram-pozitivního kmene Aneurinibacillus sp. Hl, nebo jeho přirozeně se vyskytujícími mutanty, geneticky modifikovanými buňkami tohoto kmene, které mají stejné vlastnosti, získanými metodami mutageneze nebo technikami rekombinantní DNA v kultivačním médiu obsahujícím uhlíkatý substrát, komplexní zdroj dusíku a anorganický zdroj dusíku.
Uhlíkatým substrátem je výhodně čistý glycerol, odpadní glycerol, glukóza, případně jejich směs, kdy vyrobeným polyhydroxyalkanoátem je homopolymer poly(3-hydroxybutyrát); počáteční koncentrace glycerolu je ve výhodném provedení 20 g/L.
V případě, že kultivační médium obsahuje kromě uhlíkatého substrátu prekurzor s lichým počtem uhlíkových atomů, jako například propionát, kyselinu propionovou, valerát, kyselinu valerovou nebo jejich směs, vyrobeným polyhydroxyalkanoátem je kopolymer poly(3-hydroxybutyrát-co-3hydroxy valerát).
V případě, že kultivační médium obsahuje jako uhlíkatý substrát a/nebo přídavek 1,4-butandiolu nebo gamabutyrolaktonu nebo jejich strukturních analogů obsahujících obdobný strukturní motiv - hydroxylovou skupinu na posledním uhlíkatém atomu čtyř případně šesti- uhlíkatého skeletu, vyrobeným polyhydroxyalkanoátem je kopolymer poly(3-hydroxybutyrát-co-4-hydroxybuytrát).
Kultivační médium obsahuje jako uhlíkatý substrát výhodně 1,4-butandiol, nejlépe v počáteční
-6CZ 2019 - 631 A3 koncentraci 4 až 6 g/L. Uhlíkatým substrátem může být výhodně také 1,4-butandiol v kombinaci s glycerolem, nejvýhodněji v koncentraci glycerolu 2 až 8 g/L.
Kultivační teplota při výrobě polyhydroxyalkanoátů se pohybuje v rozmezí 45 °C až 65 °C, nejlépe v rozmezí 45 °C až 50 °C.
Podle výhodného provedení je komplexním zdrojem dusíku v kultivačním médiu pň výrobě polyhydroxyalkanoátů Trypton, nejlépe v koncentraci 0,5 g/L, anorganickým zdrojem dusíku v kultivačním médiu při výrobě polyhydroxyalkanoátů je výhodně dusičnan amonný, nejlépe v koncentraci 1,0 g/L.
Kultivační médium (dále označeno jako M2) pro provedení způsobu podle vynálezu v baňkovém měřítku i laboratorním bioreaktoru obsahuje výhodně následující složky v uvedených koncentracích:
Glycsfol · 12 HbO
KlbPOí
NH4NO3
Ttypton
MgSO* ' 7 HžO
Cá€E 2 HsO
FW ciírát
Raztók stopových prvků
Uhltatý šubštřát g/L 9g/L
1,5 g/L
0,5 g/L g/L 0^2 g/L <W12g<. I mt/L, kde roztok stopových prvků obsahuje následující složky v uvedených koncentracích:
| 02 Ch | 8,3 g/L |
| 0.,84 g/L | |
| CuCh 2 HžO | OJ 3 g/L |
| CcCh' 6 HžO | 0.1 g/L |
| MnCh 6 HžO | |
| OJ g/L |
přičemž pH kultivačního média je 7.
Objasnění výkresů
Obr. 1: Misky termofilních kultur barveny pomocí aplikace Nilské červeně do agaru, žádná z fluoreskujících kolonií nevykazovala schopnost produkce PHA.
Obr. 2: Postup obohacení směsné kultury o producenty PHA pomocí vystavení původní kultury silně hypertonickému a následně silně hypotonickému prostředí.
Obr. 3: Snímky z Transmisní Elektronové Mikroskopie isolátu Hl, šipky poukazují na přítomnost PHA granulí v bakteriálních buňkách.
- 7 CZ 2019 - 631 A3
Obr. 4: Záznam základních parametrů vsádkové produkce P(3HB) s využitím isolátu Aneurinibacillus sp. Hl a odpadního glycerolu jako substrátu v laboratorním bioreaktoru Sartorius B-Plus o maximálním pracovním obejmu 5 L.
Obr. 5: Záznam základních parametrů vsádkové produkce P(3HB-co-4HB) s využitím isolátu Aneurinibacillus sp. Hl a 1,4-budtandiolu jako substrátu v laboratorním bioreaktoru Sartorius BPlus o maximálním pracovním obejmu 5 L.
Příklady uskutečnění vynálezu
Kultivace byly prováděny v Erlenmeyerových baňkách o objemu 250 ml obsahujících 100 mL kultivačního média. Jako inokulum pro samotné produkční experimenty byla využita kultura kultivovaná po dobu 24 h v komplexním NB médiu, použitý inokulační poměr byl 5 %. Pokud není uvedeno jinak, kultivace probíhala po dobu 72 h na termostatované třepačce (180 rpm) při teplotě 45 °C. Po ukončení kultivace byly buňky z 10 mL suspenze centifugovány (6000 x g, 5 minut), promyty a následně vysušeny do konstantní hmotnosti při 105 °C. Koncentrace biomasy byla stanovena gravimetricky a obsah PHA a monomemí složení polymeru bylo stanoveno pomocí plynové chromatografie s plamenově-ionizační detekcí (GC-FID). Pro analýzu molekulové hmotnosti byl polymer vyextrahován pomocí chloroformu, přebytečné rozpouštědlo bylo odpařeno a molekulová hmotnost získaného polymeru byla stanovena pomocí vylučovací chromatografie (SEC-MALS).
Příklad 1
Produkce polymeru poly(3-hydroxybuytrátu)
Isoláty mohou být využity k produkci PHA s využitím různých základních uhlíkatých substrátů, kdy bakteriální kultura produkovala výhradně homopolymer 3-hydroxybutyrátu P(3HB), jak dokládá tabulka 2.
Tabulka 2. Produkce PHA s využitím různých uhlíkatých substrátů. Doba kultivace 72 h, 50 °C, 180 rpm, médium Ml, zdroje uhlíku byly aplikovány v koncentraci 20 g/L.
| Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*^^ Substrát | «*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*>*^ | ν«*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*>^^ R3BB) I%] | νΛ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ*Λ^^ [Λ |
| Suchému | 0,4 | i: OJ 0 | 16,524 0,31 | 0,07 4 0,02 |
| Mwra | 0,19 4. 0,08 | 0,05 | 0,03 4 6,(.0 |
| O&hfetoo | 0,22 4 * kúá | Š,943 OJ. 3 | 0,02 4 0s0G |
| 2,00 4 036 | 27,744 QJS | 0,554 0,10 | |
| 0J4 * 0,01 | |<32 4 OJI. | 0,03 4 0,00 | |
| 0,20 0,01 | 9,66 L 040 | 0,02 .1 0,60 | |
| 2J 9 4(007 | 45,9$ 4 0,10 | 0004 0,04 | |
| 0,01 4 0,00 | /tíž |
Z výsledků v tabulce 2 je patrné, že nejlepším substrátem je glycerol, na kterém isolát H1 vykazoval dobrý růst a významnou produkci polymeru. Významného výtěžku bylo dosaženo také s využitím glukózy, u ostatních substrátů je možné růst biomasy a produkci polymeru hodnotit spíše jako slabé, při použití oleje jako jediného testovaného uhlíkatého substrátu pak nebyla kultura H1 schopna růstu ani produkce P(3HB).
-8CZ 2019 - 631 A3
Dále byla testována schopnost produkce P(3HB) při různých teplotách, jak uvádí tabulka 3.
Tabulka 3. Produkce PHA s využitím různých kultivačních teplot. Doba kultivace 72 h, 50 °C, 180 rpm, médium Ml, zdroj uhlíku glycerol 20 g/L.
| SK® ·«. | |||
| ______________________Md | _____________________Ml | ||
| 3,6Ř ± 0,63 | 55,31 l 5,81 | 2.33x0 41 | |
| SíFC | 3,23 a 0,05 | 46,01 L 3,55 | 1,49 i· 03? |
| 1,46 : Uv5 | 50,18 ± L35 | 0,?3 ř (003 | |
| 0,^0 á 0,01 | 3<60 A 135 | (\24 t 0,01 | |
| 0 §9 3. 0,06 | 32,66 * 0,24 | $ < ^r·. [65 |
Jak dokládá tabulka 3, je isolát Aneurinibacillus sp. H1 schopen produkce P(3HB) v širokém rozmezí teplot, solidní produktivita byla dosažena i při teplotě 65 °C, nicméně teplotní optimum bakterie se pohybuje v rozmezí 45 až 50 °C, což už je teplota dostatečně vysoká k tomu, aby bránila růstu nejčastějším kontaminantům - běžným mesofilním bakteriím. Proces založený na využití isolátu Aneurinibacillus sp. H1 je tedy robustní vůči mikrobiální kontaminaci.
Produkční parametry procesu je dále možno výrazně zvýšit optimalizací základních kultivačních podmínek, především pak složením kultivačního média, jak dokládají tabulky 4, 5 a 6, ve kterých jsou demonstrovány výsledky výběru a optimalizace použitých komplexních a anorganických zdrojů dusíku.
Tabulka 4. Výsledky baňkového experimentu optimalizace počáteční koncentrace kvasničného extraktu (komplexní zdroj dusíku) a chloridu amonného (anorganický zdroj dusíku). Doba kultivace 72 h, 50 °C, 180 rpm, médium Ml, zdroje uhlíku glycerol 20 g/L.
| extrakt: | mid | Blamáž fe * I | ppmo [M | ................ML |
| δ | 3 | í 48 & 0,04 | 18,88 ' vaT | 0,71 4 6,02 |
| 3 | 1. | 091 4 0,00 | H í. >5 24 | 0.66 4 0,(0 |
| 3 | δ | M? - ojb | 2131 * i 31 | 0,33 4 0,04 |
| ___________________03 | )35..:.355.. | M $6 - 028 | Ι/ΐΒίΛΟϊ |
Tabulka 5. Výsledky baňkového experimentu identifikace optimálního anorganického zdroje dusíku. Doba kultivace 72 h, 50 °C, 180 rpm, médium Ml, zdroj uhlíku glycerol 20 g/L.
| __________zdre | .................Ml... | P(3 H B) [%1 | |
| 4 0,04 | 42,08 * 6,3^ | 0,?8 | |
| (Mhhsth | 3,36 .4 0,07 | $ í | 1 <>7 - η «χ» |
| 3,67 4 6,06 | 58.88 t 6,85 | 2,16 i 035 | |
| 1,43 4 0. Π | 44,75 J 6,25 | Ow = 0.Q8 |
Tabulka 6. Výsledky baňkového experimentu identifikace optimálního komplexního zdroje dusíku. Doba kultivace 72 h, 50 °C, 180 rpm, médium Ml, zdroj uhlíku glycerol 20 g/L.
-9CZ 2019 - 631 A3
| N | 0 Miraj | ||
| KvwtóH | LM 0,04 | 42 08 * 9,39 0«78 A 6.02 | |
| .Masový 1 | teptun | 2,89 ¢6 0,06 | 52,07 A 3 L50 0,10 |
| So'OYV p | cpKm | 1 ,ť.{8 0/3 | 4871 * 073 076 4.0,03 |
| Trypl | on | 3.46 -.t 0.09 | 53.61 5- 1,74 1,95 ± 0,08 |
| Hové&u a | wakt | 2,99 ~ 072 | 59,49^479 L46^9,12 |
Jako optimální zdroj komplexního dusíku byl identifikován Trypton, anorganický zdroj dusíku pak 5 NH4NO3, optimální koncentrace komplexního zdroje dusíku je 0,5 g/L a anorganického zdroje pak g/L.
Výstupem optimalizačních experimentů je kultivační médium M2 o následujícím složení:
GIvwxíI 20 g/L
WWhÚHý)
WOí LSgZL
ΝΗ4ΝΟ» I g/L
Try ptán 0,5 g/L g/L
CCb 2 072 g/L
030 H g/L * Roztok stopových prvků 1 mL/L
Úprava pH pomocí IM H2SO4 nebo NaOH na hodnotu 7,0 * Složení roztoku stopových prvků:
BOTA
FeCb
ZnCh
CuCh
CoCh'61LO
MsCh 6H2O
HaBCh g/L
8,3 g/L 0,84 g/L 0,13 g/L <M g/L
016 g/L
0/1 g/L
- 10 CZ 2019 - 631 A3
Jako zdroj uhlíku pro produkci P(3HB) byl testován čistý glycerol i odpadní glycerol, který vzniká jako vedlejší produkt při výrobě bionafty, viz tabulka 7.
Tabulka 7. Výsledky baňkového experimentu možnosti využití odpadního glycerolu jako substrátu pro produkci P (3HB). Doba kultivace 72 h, 50 °C, 180 rpm, médium M2.
Keseentrace Iemasa P(3BB) PÍ3HB)
| Substrát glycerol | W 10 20 30 | jg/LJ | 10 χ 1,20 i 7 10 ± 4.82 | OJI 1,70 1,45 | JjtíkL x 0^3 | ||
| 1,60 χ 0,50 3.27 (U 3 2,73 ±0,07 | I3,< 51,5 53.4 | ||||||
| OJI 9,19 | |||||||
| 10 | LOS χ Q,08 | 10J | x 1,33 | 0,12 | 0,02 | ||
| giycwoi | 20 | 2.88x0.13 | 4ÓJ | 15 ± 0,65 | L42 | £ | 9.03 |
| 30 | I,67±Q,33 | 46 J | 0 ± 5.55 | 0 77 | X | 9,13 |
Jak dokládají výsledky presentované v tabulce 7, kromě čistého glycerolu je jako substrát pro produkci P(3HB) možné využít také levný odpadní glycerol, který vzniká jako vedlejší produkt při výrobě bionafty. I přes přítomnost řady toxických látek (metanol, těžké kovy, volné mastné kyseliny atd.) je bakteriální kultura Aneurinibacillus sp. H1 schopna využívat odpadní glycerol s podobnou efektivitou jako glycerol čistý, optimální počáteční koncentrace jak čistého tak odpadního glycerolu je 20 g/L, při nižší koncentraci je kultura vystavena limitaci zdrojem uhlíku, což se negativně projeví na růstu i produkci P(3HB), při vyšší dávce glycerolu je kultura částečně inhibována substrátem, což je patrné na růstu biomasy především u odpadního glycerolu.
Proces produkce PHA byl kromě baněk otestován také v laboratorním bioreaktoru. Kultivace v laboratorním reaktoru byly provedeny ve fermentoru Biostat B-plus od firmy Sartorius. Maximální pracovní objem fermentoru byl 5 L, fermentor obsahoval 3,5 L kultivačního média média M2 s 20 g/L glycerolu a byl inokulován 350 mL inokula kultivovaného 24 hodin v médiu Nutrient Broth (popsáno níže). Během kultivace byla teplota regulována na hodnotě 45 °C, pH bylo regulováno přídavkem 1 M H2SO4 nebo 30 % hmota. NaOH na hodnotě 7, aerace byla nastavena na hodnotu 1,5 wm a míchání bylo pomocí řídicí jednotky regulováno tak, aby koncentrace rozpuštěného kyslíku dosahovala hodnoty 10 až 30 % saturace. V pravidelných intervalech byly odebírány vzorky na stanovení biomasy, PHA tak, jak je popsáno výše, zbytkový glycerol byl stanoven spektrofotometricky.
Nutrient Broth
Hwtó extrakt
Pepi®
WC i
W g/L g/L g/L
Záznam základních parametrů tohoto kultivačního postupuje předmětem obrázku 4.
Během vsádkové kultivace kultura vykazovala silný růst až cca do 8 hodiny kultivační, kdy se z kultivačního média vyčerpal dusík, což je patrné především z prudkého poklesu nároků na kyslík, který se projevil poklesem otáček míchadla. Následně byl primárně spotřebováván glycerol především za účelem biosyntézy P(3HB), obsah polymeru biomase v následují kultivační periodě narostl na hodnotu cca 25% hmota. V17h kultivační byla zastavena spotřeba báze, což pravděpodobně koreluje s vyčerpáním glycerolu. V tomto kultivačním čase bylo pravděpodobně
- 11 CZ 2019 - 631 A3 nejvýhodnější kultivaci ukončit. Po 21 h kultivace bylo dosaženo relativně vysokého výtěžku biomasy 5,7 g/L obsah P(3HB) v biomase dosáhl cca 26 % hmota, a výtěžek polymeru pak hodnoty 1,5 g/L. Pro navýšení výtěžku bylo proto potřeba jiné kultivační strategie umožňující nadávkovat vyšší množství uhlíkatého i dusíkatého substrátu a zároveň precizněji využít limitaci dusíkem jako nástroje pro iniciaci syntézy polymeru.
Příklad 2
Produkce kopolymeru poly(3-hydroxybutyrátu-co-3-hydroxyvalerátu)
Isolát Aneurinibacillus sp. H1 je kromě produkce P(3HB) homopolymeru schopen také produkce kopolymeru poly(3-hydroxybutyrátu-co-3-hydroxyvalerátu) (P(3HB-co-3HV)), pokud je do kultivačního média aplikován vhodný prekurzor obsahující lichý počet uhlíkových atomů, tato schopnost je demonstrována v tabulce 8, kde byly jako prekurzory 3HV využity kyselina levulinová, propionát, propanol a valerát.
Tabulka 8. Výsledky baňkového experimentu pro posouzení vhodnosti různých prekurzorů3HV pro produkci kopolymeru P(3HB-co-3HV). Doba kultivace 72 h, 50 °C, 180 rpm, médium M2, glycerol 20 g/L, prekurzor aplikován ve 24 h kultivační hodině, a to v koncentraci 2 g/L.
| Iwlát H1 | tem 1,08 * 0/16 | FO 36.70 | ýj%j $ i | 039 A 9,02 | 3BV ______ %| řf <'/ | |
| HI | l, H X 0.04 | M15 | 0 27 | 031 A 0,01 | W0 * 3C | |
| Hi | L47 > 0.04 | 45,11 | o Λ<\ s v.02 | í 0.04 | ||
| Hl | Vakrát | 1.90^.0,02 | 30.29 ·. | M,01 | 0.69.9 0,01 | 00,62 ' 0.8.3 |
Všechny testované prekurzory částečně inhibovaly růst mikrobiální kultury a tím také snižovaly výtěžek polymeru. Na druhou stranu především při použití propionátu a valerátu dokázala bakteriální kultura syntetizovat kopolymer P(3HB-co-3HV) s velice vysokým obsahem 3HV.
Příklad 3
Produkce kopolymeru poly(3-hydroxybutyrátu-co-4-hydroxybutyrátu)
Dalším velice zajímavým PHA polymerem, jehož biosyntézy je izolát Aneurinibacillus sp. H1 schopen, je kopolymer P(3HB-co-4HB). Za účelem indukce syntézy kopolymeru musí být obvykle bakteriální kultury kultivovány na 1,4-butandiolu, γ-butyrolaktonu a 1,6-hexandiolu případně jejich strukturních analozích, tedy látkách obsahujících obdobný strukturní motiv - hydroxylovou skupinu na posledním uhlíkatém atomu čtyř případně šesti- uhlíkatého skeletu, viz tabulka 9.
Tabulka 9. Výsledky baňkového experimentu pro posouzení možnosti produkce P(3HB-co-4HB) kopolymeru s využitím různých substrátů sloužících jako prekurzory 4HB. Doba kultivace 72 h, 50 °C, 180 rpm, médium M2, jednotlivé substráty byly aplikovány jako jediný zdroj uhlíku v počáteční koncentraci 8 g/L.
| Bhmasá /L] | MÁ | B [mol % | | ||
| 037 A 0.08 | 930931 | |||
| 0.82 4 <30 | 85.84 i 1.90 | 0,45 A OJI | 63,55 a. 3,27 | |
| 33 9.0.04 | 78,48 - 2 | 0,77 9. 0,04 | 79.91 A 1.84 |
- 12 CZ 2019 - 631 A3
Z výsledků uvedených v tabulce 9 je patrné, že nejvhodnějším substrátem pro produkci P(3HBco-4HB) je 1,4-butandiol, jehož využití umožňuje jednak dosažení nejvyššího výtěžku kopolymeru a zároveň nejvyššího obsahu 4HB v kopolymeru. Dalším možným vhodným substrátem je γbutyrolakton, i když v tomto případě jsou výtěžky i obsah 4HB v kopolymeru nižší, navíc obecně platí, že γ-butyrolakton je cenově náročnější substrát než 1,4-butandiol.
Dále byla testována vhodná počáteční koncentrace 1,4-butandiolu, viz tabulka 10.
Tabulka 10. Výsledky optimalizace počáteční koncentrace 1,4-butandiolu. Doba kultivace 72 h, 50 °C, 180 rpm. Médium M2.
| 4HB | ||||||
| ..................ML | PHA í%| | ...mm | __________ | Mw JkDa | | ||
| 3 | 1,22 i OJ š | SOJKÁM | (Ml 4 (M7 | 4« Mu - 0,70 | í LMí 7,58 | 1,05 |
| 4 | 54J8* L21 | 0/L ··· 4,02 | 128,07 * 3.85 | LU | ||
| 5 | 1,60 ά 6.23 | 45.73 ; í) (U | 0 73 ' n § i | 88,31 ; 0,24 | LI6 | |
| 6 | L33O0J.5 | 56, >2 > 0,¼ | 0,69 ± 08 | 92AI 40,04 | - v ; S3 | 1J3 |
| 7 | LU & | 038 ± Ol | 8W±0,4S | '2^81 | í > | |
| 0,96 ά 0,00 | 44,00 A 2,70 | 0,42 4 0,03 | 86,87 4 L32 | 8’ Fi 2 | LH | |
| i 2 | 0,72 šriW | 43,90 4 2,28 | 0,32 ± 0,03 | 83.o l * 0.04 | 4;* r 28 | i JO |
| US | 0,56 ± 0,05 | 43,38 ·,< L26 | 4.24 š- 0 02 | 85,99 s 4,40 | LU |
Jak dokládají data uvedená v tabulce 10, optimální počáteční koncentrace 1,4-butandiolu je v rozmezí 4 až 6 g/L, vyšší koncentrace mají negativní vliv na výtěžek, ale také na molekulovou hmotnost polymeru.
Proces produkce P(3HB-co-4HB) byl kromě baněk otestován také v laboratorním bioreaktoru Sartorius B-Plus o maximálním pracovním obejmu 5 L ve vsádkovém režimu, za podmínek stejných jako v příkladu 1 při testování produkce PHA v laboratorním bioreaktoru (viz výše).
Obrázek 5 je demonstrací průběhu vsádkové produkce P(3HB-co-4HB) s využitím 1,4-butandiolu jakožto jediného substrátu a isolátu bakteriální kultury Aneurinibacillus sp. Hl, jakožto produkčního kmene. Také v bioreaktoru bylo dosaženo produkce kopolymeru s vysokým obsahem 4-hydroxybutyrátu.
Nicméně, jak naznačují data prezentovaná v tabulkách 9 a 10 a také na obrázku 5, použití 1,4butandiolu jakožto jediného substrátu vede spíše k nižší produkci biomasy, a to ve svém důsledku také limituje možné výtěžky polymeru. Zdá se, že 1,4-butandiol je pomocí mikrobiální kultury Aneurinibacillus sp. Hl velice efektivně inkorporován do struktury kopolymeru, nicméně je to nepříliš vhodný substrát pro pokrytí energetických a dalších metabolických potřeb bakteriální kultury.
Pro nejvýhodnější počáteční koncentraci 1,4-butandiolu byla testována produkce P(3HB-co-4HB) v kombinaci s různou koncentrací glycerolu, viz tabulka 11.
Tabulka 11. Výsledky optimalizace počáteční koncentrace 1,4-butandiolu a glycerolu. Doba kultivace 72 h, 50 °C, 180 rpm. Médium M2, použitý isolát HL
- 13 CZ 2019 - 631 A3
| Glycerol .........hill........ | ........hii........... | PHA |%| | PHA ............... | 4HB | Mw IkDwl | PIH | |
| 4 | V | 2,9» * » 15 | 68*5 4. *62 | 1,83 *0J0 | 83,50 * i .40 | 125.70 * 3,06 | 1,66 |
| 4 | 4 | 2 70 - jyn? | 65 23 * 2-64 | 1*2 * 0,98 | >:>4.(í<: ) ,66 | í 08 | |
| .4 | (j | 2,2» * 0,26 | $0*7 Λ 0,8? | LI? ' 0.U | 42,4? i -,S8 | 52,72-1-4,51 | |
| 4 | 8 | 2,43 - GAM | 4*74 4 3,33 | *99 * 0,08 | >6 42 5 i 7? | 408*4,32 | 1,72 |
| 4 | 20 | 2 56 *11 | 44*9* 1 23 | 1,14*0,06 | 4 65 * y.yl | 1*3 |
Jak demonstrují data uvedená v tabulce 11, je tedy výhodné kombinovat 1,4-butandiol s glycerolem, který dokáže isolovaná bakteriální kultura efektivně využít. Současná aplikace glycerolu a 1,4-butandiolu má výrazně pozitivní vliv na výtěžky biomasy i polymeru a zároveň je pomocí volby poměrů obou substrátů možné regulovat poměr 3HB a 4HB v kopolymeru, nicméně je třeba mít na paměti, že vysoký poměr glycerol/1,4-butandiol má překvapivě negativní vliv na molekulovou hmotnost polymeru.
Průmyslová využitelnost
Způsob podle vynálezu umožňuje průmyslovou výrobu polyhydroxyalkanoátů s využitím nově isolované termofilní bakteriální kultury Aneurinibacillus sp. Hl. Biotechnologický proces může být operován za zvýšené teploty, což má pozitivní dopad především na robustnost procesu vůči nežádoucí mikrobiální kontaminaci. Jako substrát pro produkci polyhydroxyalkanoátů je možné využít glycerol, a to včetně odpadního glycerolu vzniklého při výrobě biodieselu.
Reference:
1. Kessler B and B. WITHOLT. Encyclopedia of bioprocess technology fermentation, biocatalysis, and bioseparation: Poly(3-hydroxyalkanoates). New York: J. Wiley, 1999, s. 20242040. ISBN 15912-44579.
2. Alejandra RC et al. 2012. Enzymatic degradation of poly(3-hydroxybutyrate-co-4hydroxybutyrate) by commercial lipases. Polymer Degradability and Stability 97, 597-604.
3. Shrivastav A et al. 2013. Advances in the applications of polyhydroxyalkanoate nanoparticles for novel drug delivery system. BioMed Research International Article ID 581684:12
4. Turesin F et al. 2001. Biodegradable polyhydroxyalkanoate implants for osteomyelitis therapy: in vitro antibiotic release. Journal of Biomaterial Science 12, 195-207.
5. Ma X-H et al. 2016. Myocardial patch formation by three-dimensional 3-hydroxybutyrateco-4-hydroxybutyrate cultured with mouse embryonic stem cells. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering 6, 629-634.
6. Cavalheiro JMBT et al. 2012. Effect of cultivation parameters on the production of poly(3hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) and poly(3-hydroxybutyrate-4-hydroxybutyrate-3hydroxyvalerate) by Cupriavidus necator using waste glycerol. Bioresource Technology 111,391397.
7. Huong K-H et al. 2018. Production of high molecular weight poly(3-hydroxybutyrate-cohydroxybutyrate) copolymer by Cupriavidus malaysiensis USMAA1020 utilising substrate with longer carbon chain. International Journal of Biological Macromolecules 116, 217-223.
8. Lee W-H et al. 2004. Effects of culture conditions on the composition of poly(3
- 14 CZ 2019 - 631 A3 hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) synthesized by Comamonas acidovorans. Polymer Degradation and Stability 84, 129-134.
9. Raposo RS et al. 2017. Feeding strategies for tuning poly (3-hydroxybutyrate-co-4hydroxybutyrate) monomeric composition and productivity using Burkholderia sacchari. International Journal of Biological Macromolecules 105, 825-833.
10. Kitamura S and Y. Doi 1994. Biodegradable Plastics and Polyesters: Production of copolyesters from organic acids by mutant strains of Alcaligenes eutrophus, p. 373-378. ISBN 9780444817082
11. US 6689589 B2 Biological systems for manufacture of polyhydroxyalkanoate polymers containing 4-hydroxyacids.
12. US 006117658A METHODS OF MAKING POLYHYDROXYALKANOATES COMPRISING 4-HYDROXYBUTYRATE MONOMER UNITS
13. US 8546125 B2 Recombinant hosts and methods for manufacturing polyhydroxyalkanoates
14. Lv L et al. 2015. Application of CRISPRi for prokaryotic metabolic engineering involving multiple genes, a case study: Controllable P(3HB-co-4HB) biosynthesis. Metabolic Engineering 29, 160-168.
15. Singh AK et al. 2019. Biomedical applications of microbially engineered polyhydroxyalkanoates: an insight into recent advances, bottlenecks, and solutions. Applied Microbiology and Biotechnology 103, 2007-2032.
16. Kunasundari B and Sudesh K. Isolation and recovery of microbial polyhydroxyalkanoates. eXPRESS Polymer Letters. 5, 620-634.
17. US 6245537 Bl Removing endotoxin with an oxdizing agent from polyhydroxyalkanoates produced by fermentation.
18. Kruger A et al. 2018. Towards a sustainable biobased industry - highlighting the impact of extremophiles. New Biotechnology 40, 144-153.
19. Chen G-Q and Jiang X-R. 2018. Next generation industrial biotechnology based on extremophilic bacteria. Current Opinion in Biotechnology 50, 94-100.
20. Koller M 2017. Production of Polyhydroxyalkanoate (PHA) Biopolyesters by Extremophiles. MOJ Polymer Science 1, 00011.
21. Kucera D et al. 2018. Characterization of the promising poly(3 -hydroxybutyrate) producing halophilic bacterium Halomonas halophila. Bioresource Technology 256, 552-556.
22. Garcia-Torreiro M et al. 2017. Application of flow cytometry for monitoring the production of poly(3-hydroxybutyrate) by Halomonas boliviensis. Biotechnology Progress 33, 276-284.
23. Ye J et al. 2018. Pilot Scale-up of Poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) Production by Halomonas bluephagenesis via Cell Growth Adapted Optimization Process. Biotechnology Journal 13, 1800074.
24. Rodriguez-Contreras, A et al. 2016. Poly[(R)-3-hydroxybutyrate] production under different salinity conditions by a novel Bacillus megaterium strain. New Biotechnology 33, 7377.
- 15 CZ 2019 - 631 A3
25. Melanie et al. 2018. Production of biopolymer polyhydroxyalkanoates (PHA) by extreme halophilic marine archaea Haloferax mediterranei in medium with varying phosphorus concentration. Journal of Engineering and Technological Sciences 50), 255-271Λ
26. Obruca et al. 2017. The presence of PHB granules in cytoplasm protects non-halophilic bacterial cells against the harmful impact of hypertonic environments. New Biotechnology 39, 6880.
27. Sedlaček et al. 2019. PHA granules help bacterial cells to preserve cell integrity when exposed to sudden osmotic imbalances. New Biotechnology 49, 129-136.
28. AT 513449 Al Use halophilic microorganisms for the production of valuable materials.
29. DE 102008045237 B4 Method for the simultaneous production of PHA and compatible solutes in halophilic bacteria.
30. JP 5164182 B2 Polyhydroxyalkanoate according halobacterium (PHAs) method of production and halophilic.
31. JP 2011083204 A Method for highly efficiently producing polyhydroxyalkanoate (phas) or the like with halophilic bacterium.
32. Ibrahim MH and Steinbuchel A 2010 High-cell-density cyclic fedbatch fermentation of a poly (3-hydroxybutyrate)-accumulating thermophile, Chelatococcus sp. strain MW10. Applied and Environmental Microbiology 76, 7890-7895.
33. Pantazaki et al. 2003. Polyhydroxyalkanoate (PHA) biosynthesis in Thermus thermophilus: purification and biochemical properties of PHA synthase. Molecular and Cellular Biochemistry 254, 173-183.
34. Papi et al. 2008. Identification of PHA loci in Thermus thermophilus HB8 genome. The FEBS Journal 275, 422-422.
35. Sheu et al. 2009. Thermophilic bacterium Caldimonas taiwanensis produces poly (3hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) from starch and valerate as carbon sources. Enzyme and Microbial Technology 44, 289-294.
36. Ibrahim et al. 2010. Isolation and characterizationofnewpoly (3HB)accumulatingstarshaped cellaggregatesformingthermophilicbacteria. Journal of Applied Microbiology 109, 1579-1590.
37. Liu et al. 2014. Isolation and characterization of a thermophilic Bacillus shackletonii K5 from a biotrickling filter for the production of polyhydroxybutyrate. Journal of Environmental Science in China 26, 1453-1462.
38. Giedraityte G and Kalediene L. 2015. Purification and characterization of polyhydroxybutyrate produced from thermophilic Geobacillus sp. AY 946034 strain. Chemija 26, 38-45.
39. Xiao et al. 2015. Thermophilic production of polyhydroxyalkanoates by a novel Aneurinibacillus strain isolated from Gudao oilfield, China. Journal of Basic Microbiology 55, 1125-1133.
40. CN 103667153 B Poly(3-hydroxybutyrate) generating thermophiles.
Claims (14)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Termofilní Gram-pozitivní bakteriální kmen Aneurinibacillus species Hl, uložený v České sbírce mikroorganismů pod označením CCM 8960, produkující polyhydroxyalkanoáty.
- 2. Způsob biotechnologické výroby polyhydroxyalkanoátů pomocí termofilního Grampozitivního bakteriálního kmene Aneurinibacillus species Hl podle nároku 1 nebo jeho přirozeně se vyskytujících mutantů, geneticky modifikovanými buňkami tohoto kmene, které mají stejné vlastnosti, získanými metodami mutageneze nebo technikami rekombinantní DNA v kultivačním médiu obsahujícím uhlíkatý substrát, komplexní zdroj dusíku a anorganický zdroj dusíku.
- 3. Způsob výroby podle nároku 2, vyznačující se tím, že uhlíkatým substrátem je čistý glycerol, odpadní glycerol a/nebo glukóza, kde vyrobeným polyhydroxyalkanoátem je homopolymer póly (3 -hydroxybutyrát).
- 4. Způsob výroby podle nároku 3, vyznačující se tím, že počáteční koncentrace čistého glycerolu nebo odpadního glycerolu je 20 g/L.
- 5. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že kultivační médium obsahuje také prekurzor s lichým počtem uhlíkových atomů, jako například propionát, kyselinu propionovou, valerát, kyselinu valerovou nebo jejich směs, kdy vyrobeným polyhydroxyalkanoátem je kopolymer poly(3 -hydroxybutyrát-co-3 -hydroxyvalerát).
- 6. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že uhlíkatým substrátem a/nebo prekurzorem v kultivačním médiu je 1,4-butandiol nebo gamabutyrolakton nebo strukturní analog těchto sloučenin obsahující hydroxylovou skupinu na posledním uhlíkatém atomu čtyř- nebo šestiuhlíkatého skeletu, kdy vyrobeným polyhydroxyalkanoátem je kopolymer poly(3-hydroxybutyrátco-4-hydroxybutyrát).
- 7. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že kultivační médium obsahuje jako uhlíkatý substrát 1,4-butandiol v počáteční koncentraci 4 až 6 g/L.
- 8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že kultivační médium obsahuje jako uhlíkatý substrát glycerol v koncentraci 2 až 8 g/L a 1,4-butandiol.
- 9. Způsob výroby podle nároků 2 až 8, vyznačující se tím, že kultivační teplota je v rozmezí 45 °C až 65 °C, nejlépe 45 °C až 50 °C.
- 10. Způsob výroby podle nároku 2, vyznačující se tím, že komplexním zdrojem dusíku v kultivačním médiu je Trypton.
- 11. Způsob výroby podle nároku 10, vyznačující se tím, že koncentrace Tryptonu v kultivačním médiu je 0,5 g/L.
- 12. Způsob výroby podle nároku 2, vyznačující se tím, že anorganickým zdrojem dusíku v kultivačním médiu je dusičnan amonný.
- 13. Způsob výroby podle nároku 12, vyznačující se tím, že koncentrace dusičnanu amonného v kultivačním médiu je 1,0 g/L.
- 14. Kultivační médium pro provedení způsobu podle nároku 2 obsahující následující složky v uvedených koncentracích:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2019631A CZ2019631A3 (cs) | 2019-10-10 | 2019-10-10 | Způsob výroby polyhydroxyalkanoátů pomocí isolátu termofilního bakteriálního kmene Aneurinibacillus sp. H1 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2019631A CZ2019631A3 (cs) | 2019-10-10 | 2019-10-10 | Způsob výroby polyhydroxyalkanoátů pomocí isolátu termofilního bakteriálního kmene Aneurinibacillus sp. H1 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ308626B6 CZ308626B6 (cs) | 2021-01-13 |
| CZ2019631A3 true CZ2019631A3 (cs) | 2021-01-13 |
Family
ID=74099625
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2019631A CZ2019631A3 (cs) | 2019-10-10 | 2019-10-10 | Způsob výroby polyhydroxyalkanoátů pomocí isolátu termofilního bakteriálního kmene Aneurinibacillus sp. H1 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2019631A3 (cs) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103667153B (zh) * | 2013-12-19 | 2015-05-13 | 中国石油大学(华东) | 一株产聚3-羟基丁酸酯的嗜热菌 |
-
2019
- 2019-10-10 CZ CZ2019631A patent/CZ2019631A3/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ308626B6 (cs) | 2021-01-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tan et al. | Unsterile and continuous production of polyhydroxybutyrate by Halomonas TD01 | |
| Quillaguamán et al. | Poly (β-hydroxybutyrate) production by a moderate halophile, Halomonas boliviensis LC1 | |
| Danis et al. | Preparation of poly (3-hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) films from halophilic archaea and their potential use in drug delivery | |
| Sathya et al. | Production of polyhydroxyalkanoates from renewable sources using bacteria | |
| Ojha et al. | Process optimization and characterization of polyhydroxyalkanoate copolymers produced by marine Pichia kudriavzevii VIT-NN02 using banana peels and chicken feather hydrolysate | |
| Belal | Production of poly-β-hydroxybutyric acid (PHB) by Rhizobium elti and Pseudomonas stutzeri | |
| US20070161097A1 (en) | Deregulated bacteria with improved polyhydroxyalkanoate production | |
| Sriyapai et al. | Production and optimization of polyhydroxyalkanoates (PHAs) from Paraburkholderia sp. PFN 29 under submerged fermentation | |
| US20100086980A1 (en) | Method for producing lactic acid | |
| Yasin et al. | Study of the fermentation conditions of the Bacillus cereus strain ARY73 to produce polyhydroxyalkanoate (PHA) from glucose | |
| Thuoc et al. | Bioconversion of crude fish Oil into poly-3-hydroxybutyrate by Ralstonia sp. M91 | |
| Wang et al. | Production of polyhydroxyalkanoates by three novel species of Marinobacterium | |
| Priyadarshi et al. | Polyhydroxyalkanoates: role of Ralstonia eutropha | |
| JP2015006182A (ja) | 中鎖ｐｈａ／長鎖ｐｈａの効率的な高収量製造のための新規な環境分離微生物であるシュードモナス属微生物ｉｐｂ−ｂ２６及びｎ−１２８の使用 | |
| JP6274494B2 (ja) | 微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の生産方法 | |
| Pu et al. | Metabolic engineering of Salinivibrio sp. TGB10 for PHBV biosynthesis with a high 3-hydroxyvalerate fraction from starch and propionate | |
| JP5717119B2 (ja) | Ｌ−乳酸の製造方法 | |
| Sharma et al. | An overview of microbial derived polyhydroxybutyrate (PHB): production and characterization | |
| CZ2019631A3 (cs) | Způsob výroby polyhydroxyalkanoátů pomocí isolátu termofilního bakteriálního kmene Aneurinibacillus sp. H1 | |
| Gayathiri et al. | Production, optimization and characterization of polyhydroxybutryate by Bacillus subtilis isolated from garden soil | |
| Koller et al. | Linking Salinity to Microbial Biopolyesters Biosynthesis: Polyhydroxyalkanoate Production by Haloarchaea and Halophilic Eubacteria | |
| CHAI et al. | Isolation and identification of P (3HB-co-4HB) producing bacteria from various locations in Kuala Terengganu | |
| Chobchuenchom et al. | Production of medium chain length polyhydroxyalkanoates by Pseudomonas putida ATCC47054 using glycerol and sodium octanoate as substrates | |
| Shah | Biopolymer (PHA) Producing Microbes and Its Application | |
| Jinda et al. | The isolation and screening of polyhydroxyalkanoates producing bacteria from wastewater and soil from palm oil manufacturing plant |