CN102676567A - 生产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的重组菌及其应用 - Google Patents
生产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的重组菌及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102676567A CN102676567A CN2012101327789A CN201210132778A CN102676567A CN 102676567 A CN102676567 A CN 102676567A CN 2012101327789 A CN2012101327789 A CN 2012101327789A CN 201210132778 A CN201210132778 A CN 201210132778A CN 102676567 A CN102676567 A CN 102676567A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- hydroxy
- hydroxybutyric acid
- propionic acid
- encoding sox
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的重组菌及其应用。该重组菌的构建方法，是将1，3-丙二醇脱氢酶编码基因、醛脱氢酶编码基因、3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因、4-羟基丁酸辅酶A转移酶编码基因和PHA聚合酶编码基因导入出发菌，得到重组菌。本发明的工程菌在500mL容积摇瓶中生产后，P(3HP-co-4HB)的产量最高可达6.2g/L，P(3HP-co-4HB)最高可达细胞干重的63％。本发明生产工艺简单，开生产的聚合物其热力学性能可以通过调节3HP和4HB的比例实现变化；应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物(P(3HP-co-4HB))的重组菌及其应用。
背景技术
利用代谢工程技术改造微生物已成为一种行之有效的方法来生产化学产品以及新型的生物材料。聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates或PHA)是一类在微生物细胞内合成并积累而且具有生物可降解性和生物相容性的聚合物(Steinbüchel，A.，Fuchtenbusch，B.，1998.Bacterial and other biological systems for polyesterproduction.Trends Biotechnol.16，419-427.)。随着对其深入的研究，聚羟基脂肪酸酯在环保材料、生物医学和生物能源方面将极具应用价值。
根据单体的结构组成，PHA可分为短链和中长链两类：前者的单体组成为C3到C5，后者的单体组成为C6到C14。
3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物(P(3HP-co-4HB))是一种新型的生物可降解高分子聚合物，属于短链共聚物的一种，之前报道的利用生物技术生产出的此聚合物中4-羟基丁酸的含量均低于2mol％(Zhou，Q.，Shi，Z.Y.，Meng，D.C.，Wu，Q.，Chen，J.C.，Chen，G.Q.，2011.Production of 3-hydroxypropionate homopolymer andpoly(3-hydroxypropionate-co-4-hydroxybutyrate)copolymer by recombinantEscherichia coli.Metab.Eng.13，777-785.)。除本申请之外，至今国际上还没有关于P(3HP-co-4HB)热力学性质的报道。
发明内容
本发明的目的：本发明的一个目的是提供产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物(P(3HP-co-4HB))的重组菌的构建方法并用这个重组菌生产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物。
本发明提供的方法，包括如下步骤：将1，3-丙二醇脱氢酶编码基因(dhaT)、醛脱氢酶编码基因(aldD)、3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因(pcs’)、4-羟基丁酸辅酶A转移酶编码基因(orfz)和PHA聚合酶编码基因(phaC)导入出发菌，得到重组菌。
所述1，3-丙二醇脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列8；所述醛脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列9；所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶的氨基酸序列为序列表中序列10；所述PHA聚合酶的氨基酸序列为序列表中序列11；所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶的氨基酸序列为序列表中序列12。
所述1，3-丙二醇脱氢酶基因的核苷酸序列为序列表中序列1；自序列1的5′端第1-1185位核苷酸为编码序列。
所述醛脱氢酶基因的核苷酸序列为序列表中序列2；自序列2的5′端第1-1521位核苷酸为编码序列。
所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶基因的核苷酸序列为序列表中序列3；自序列3的5′端第1-2571位核苷酸为编码序列。
所述PHA聚合酶基因的核苷酸序列为序列表中序列4；自序列41的5′端第1-1770位核苷酸为编码序列。
所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶的核苷酸序列为序列表中序列5；自序列5的5′端第1-1290位核苷酸为编码序列。
所述出发菌为大肠杆菌，优选为Escherichia coli S17-1。但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)。
所述1，3-丙二醇脱氢酶编码基因和所述醛脱氢酶编码基因通过重组载体A导入所述出发菌中；
所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因、所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶基因和所述PHA聚合酶编码基因通过重组载体B导入所述出发菌中；
所述重组载体A为pZQ01(Zhou，Q.，Shi，Z.Y.，Meng，D.C.，Wu，Q.，Chen，J.C.，Chen，G.Q.，2011.Production of 3-hydroxypropionate homopolymer andpoly(3-hydroxypropionate-co-4-hydroxybutyrate)copolymer by recombinantEscherichia coli.Metab.Eng.13，777-785.公众可从清华大学获得)；
所述重组载体B为将4-羟基丁酸辅酶A转移酶编码基因反向插入到pZQ03(Zhou，Q.，Shi，Z.Y.，Meng，D.C.，Wu，Q.，Chen，J.C.，Chen，G.Q.，2011.Productionof 3-hydroxypropionate homopolymer andpoly(3-hydroxypropionate-co-4-hydroxybutyrate)copolymer by recombinantEscherichia coli.Metab.Eng.13，777-785.公众可从清华大学获得)的BamH I识别位点间得到的载体。
由上述的方法构建的重组菌也属于本发明的保护范围
本发明的另一个目的是提供生产不同单体比例的3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：摇瓶培养所述的重组菌，收集产物，即得到3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物。
所述生产温度为30℃-40℃，所述生产培养基的pH为6-8；
所述生产温度具体为37℃，所述生产培养基的pH具体为7。
所述生产过程中，在所述摇瓶接种前，向所述摇瓶中添加1，3-丙二醇和/或1，4-丁二醇，使摇瓶中培养基中的1，3-丙二醇或1，4-丁二醇含量均不高于20g/L。
所述培养基中的1，3-丙二醇或1，4-丁二醇浓度均为1g/L-20g/L；所述培养基中的1，3-丙二醇和1，4-丁二醇浓度具体为1g/L和10g/L，5g/L和15g/L，5g/L和10g/L，10g/L和10g/L，10g/L和5g/L。
所述培养时间具体为48h；所述共聚物为3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物。
可采用生物工程领域中常用的方法将含有1，3-丙二醇脱氢酶、醛脱氢酶、3-羟基丙酸辅酶A连接酶、4-羟基丁酸辅酶A转移酶及PHA聚合酶基因的表达载体转化大肠杆菌宿主菌，如电击转化法、化学转化法或氯化锂转化法，优选为电击转化法。
可采用大肠杆菌的常规培养条件对重组大肠杆菌进行培养。
在摇瓶中，可采用如下的TB培养基进行生产，培养基成分含有24g/L酵母提取物，12g/L蛋白胨，4mL/L甘油，0.017mol/L KH2PO4，0.072mol/L K2HPO4，余量为水。溶液先在15psi高压下蒸汽灭菌20min，当冷至60℃或60℃以下时加入无菌的KH2PO4和K2HPO4的水溶液。
在实际的培养过程中，可向上述培养基中再添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL硫酸卡那霉素。
本发明的第三个目的是提供一种生产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的两种载体组合。本发明提供的组合物，由所述的方法中的重组载体A和重组载体B组成。
上述方法制备的3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物也属于本发明的保护范围。
本发明提供的3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物这种新型生物材料具有优良的热力学性质，以供应用开发之用。
本发明的实验证明，本发明提供了一种含有1，3-丙二醇脱氢酶基因，醛脱氢酶基因，3-羟基丙酸辅酶A连接酶基因，4-羟基丁酸辅酶A转移酶基因及PHA聚合酶基因的专用表达工程菌，该工程菌可高效表达1，3-丙二醇脱氢酶及醛脱氢酶基因，在脱氢酶的作用下转化底物1，3丙二醇或1，4-丁二醇为3-羟基丙酸或4-羟基丁酸，同时该工程菌也高效表达3-羟基丙酸辅酶A连接酶和4-羟基丁酸辅酶A转移酶基因，使3-羟基丙酸或4-羟基丁酸转化为3-羟基丙酸辅酶A或4-羟基丁酸辅酶A，该工程菌同时也高效表达PHA聚合酶基因，使3-羟基丙酸辅酶A和4-羟基丁酸辅酶A聚合为3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物P(3HP-co-4HB)。摇瓶实验表明将本发明的工程菌在500mL容积摇瓶中生产后，P(3HP-co-4HB)的产量最高可达6.2g/L，P(3HP-co-4HB)最高可达细胞干重的63％。本发明生产工艺简单，开生产的聚合物其热力学性能可以通过调节3HP和4HB的比例实现变化；应用前景广阔。
附图说明
图1为1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的转化关系示意图。
图2为P(3HP)，5种不同单体比例的P(3HP-co-4HB)，P(4HB)的实物图
图3A和3B、图4为P(3HP-co-37.89mol％4HB)的核磁图谱。
图5为pZQ01(图5中A)和pZQ03-orfz(图5中B)的质粒图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
所用酶试剂均购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒购自北京博迈德科技发展公司，回收DNA片段所用的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
培养基配方：
1)种子液摇瓶培养基
LB培养基：5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042)，10g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。
2)生产摇瓶培养基
TB培养基配置方法：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042)12g，酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)24g，甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100mL灭菌的170mmol/L KH2PO4，0.72mol/L K2HPO4的溶液(2.31g的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100mL。高压灭菌或用0.22um的滤膜过滤除菌)。K2HPO4，KH2PO4均购自国药集团化学试剂有限公司，目录号分别为10017528，1017628。
以上生产培养基补料成分：1，3-丙二醇和1，4-丁二醇。
在实际培养过程中，可向上述培养基中再添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL硫酸卡那霉素。
1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、3-羟基丙酸、4-羟基丁酸、3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的结构式及转化关系见图1所示，图1中的1表示1，3-丙二醇脱氢酶，2表示醛脱氢酶，3表示3-羟基丙酸辅酶A连接酶，4表示4-羟基丁酸辅酶A转移酶，5表示聚羟基脂肪酸聚合酶。
实施例1、表达工程菌的构建
一、表达载体pZQ03-orfz的构建
1)以质粒pKSSE5.3(Song，S.S.，Hein，S.，Steinbüchel，A.，1999.Productionof poly(4-hydroxybutyric acid)by fed-batch cultures of recombinant strainsof Escherichia coli.Biotechnol.Lett.21，193-197；该pKSSE5.3质粒是目前熟知的质粒，公众可从清华大学获得)为模板，以orfz Sense和orfz Antisense为引物，用pfu酶进行PCR反应扩增目的基因4-羟基丁酸辅酶A转移酶基因(orfz)，并在片段两端设计引入酶切位点。
orfz Sense：5’CGGTGTGGATCCCAAGGTGATG 3’(序列6)
BamH I
orfz Ant i sense：5’ATATAGGATCCCCGACTGGAAAGCG 3’(序列7)
BamH I
PCR反应条件：
先94℃预变性10min；再94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1min20秒，30次循环；然后72℃后延伸10分钟。
PCR扩增目的片断(20μL体系)：
模版DNA 0.4μL(0.05ug)，引物orfz Sense 0.5μL(0.5ug)，引物orfzAntisense 0.5μL(0.5ug)，pfu buffer 2.0μL，pfu酶0.2μL(1U)，dNTP 1.5μL(0.0002mol)，ddH2O 14.9μL。
PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。
得到的PCR产物，经过测序，该PCR产物具有序列表中的序列5的核苷酸序列，序列5由1290个核苷酸组成，即为4-羟基丁酸辅酶A转移酶基因(orfz)核苷酸序列，自序列5的5′端第1-1290位核苷酸为编码序列，编码氨基酸残基序列为序列表中序列12的蛋白。
用BamH I单酶切质粒pZQ03(Zhou，Q.，Shi，Z.Y.，Meng，D.C.，Wu，Q.，Chen，J.C.，Chen，G.Q.，2011.Production of 3-hydroxypropionate homopolymer andpoly(3-hydroxypropionate-co-4-hydroxybutyrate)copolymer by recombinantEscherichia coli.Metab.Eng.13，777-785.公众可从清华大学获得)得到线性酶切片段，与经BamH I酶切上述PCR产物得到的片段连接，得到连接产物，转化到大肠杆菌E.coli Transl-T1(北京全式金生物技术有限公司，CD501-01)中，得到转化子，提取转化子的质粒，测序，结果为该质粒为将序列表中的序列5反向插入到pZQ03的BamH I酶切位点得到的载体，该质粒记作pZQ03-orfz(质粒图谱如图5中B所示，orfz为4-羟基丁酸辅酶A转移酶编码基因，pcs’为3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因，phaC为聚羟基脂肪酸聚合酶编码基因，Amp为氨苄青霉素抗性基因，Re promoter表示来自于真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)的启动子序列，BamHI表示orfz两端的BamHI酶切位点)。
上述质粒pZQ03的序列中含有3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因和PHA聚合酶编码基因；3-羟基丙酸辅酶A连接酶基因的核苷酸序列为序列表中序列3，自序列3的5′端第1-2571位核苷酸为编码序列，其编码的蛋白为3-羟基丙酸辅酶A连接酶；3-羟基丙酸辅酶A连接酶的氨基酸序列为序列表中序列10；PHA聚合酶基因的核苷酸序列为序列表中序列4，自序列41的5′端第1-1770位核苷酸为编码序列，其编码的蛋白为PHA聚合酶，PHA聚合酶的氨基酸序列为序列表中序列11。
二、重组工程菌E.coli S17-1(pZQ01，pZQ03-orfz)的构建
将步骤一构建的表达载体pZQ03-orfz和pZQ01(质粒图谱如图5中A所示，dhaT为1，3-丙二醇脱氢酶编码基因，aldD为醛脱氢酶编码基因，Km为卡那霉素抗性基因，Re promoter表示来自于真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)的启动子序列，rep为复制起始子序列)。
用电击转化法同时转入到E.coii S17-1(ATCC编号：47055，可购自美国菌种保藏中心American Type Culture Collection)中，得到重组菌1；pZQ01(Zhou，Q.，Shi，Z.Y.，Meng，D.C.，Wu，Q.，Chen，J.C.，Chen，G.Q.，2011.Production of3-hydroxypropionate homopolymer andpoly(3-hydroxypropionate-co-4-hydroxybutyrate)copolymer by recombinantEscherichia coli.Metab.Eng.13，777-785.公众可从清华大学获得)的序列中含有1，3-丙二醇脱氢酶编码基因和醛脱氢酶编码基因，1，3-丙二醇脱氢酶基因的核苷酸序列为序列表中序列1，自序列1的5′端第1-1185位核苷酸为编码序列，编码的蛋白为1，3-丙二醇脱氢酶，其氨基酸序列为序列表中序列8。
将重组菌1涂布于添加100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL硫酸卡那霉素的LB固体培养平板上，在37℃静置培养12小时，挑取在固体平板上长出的单克隆，将其接种到添加100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12小时。
从重组菌1中提取质粒，用引物orfz Sense和orfz Antisense进行PCR验证，可以扩增得到1290个核苷酸的片段的即为阳性重组菌，将获得的阳性重组菌命名为E.coliS17-1(pZQ01，pZQ03-orfz)。
实施例2、用重组工程菌生产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物P(3HP-co-4HB)的实验
一、摇瓶培养摸索试验
1、以TB为培养基生产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物P(3HP-co-4HB)
重组工程菌E.coliS17-1(pZQ01，pZQ03-orfz)用LB培养基，在37℃，200rpm过夜培养；然后按5％接种量(v/v，1011cfu/ml)，分别接种至50mL含1，3-丙二醇(PDO)、1，4-丁二醇的TB培养基(BDO)(1，3-丙二醇、1，4-丁二醇的添加量如表1所述)中，于37℃，200rpm，摇瓶培养48小时，得到菌液。每个实验处理设置三组平行实验。运用气相色谱仪(GC，GC-2014，SHIMADZU)验证细胞中聚合物进行初步定性和定量分析(Kato，M.，Bao，H.J.，Kang，C.K.，Fukui，T.，Doi，Y.，1996.Productionof a novel copolyester of 3-hydroxybutyric acid and medium chain length3-hydroxyalkanaic acids by Pseudomonas sp 61-3 from sugars.Appl.Microbiol.Biotechnol.45，363-370.)。
气相检测3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的方法：
设定炉温为80℃，进样器温度为200℃，检测器温度为220℃，柱头压力为0.25Mpa，程序升温条件为：80℃停留1.5分钟，以30℃/min的速度升温至140℃，接着以40℃/min的速度升温至220℃并在此温度保持0.5分钟。样品的进样量为1μl，使用岛津公司生产的自动进样器。
气相样品准备：取40-60mg待测样品的干细胞(菌液10000rpm，10分钟条件下离心，所得细胞沉淀水洗一次之后，冰干(真空度＜10Pa，冷阱温度为-50℃，处理10小时)，得到冰干细胞，聚合物产于细胞中)，加2mL氯仿，2mL酯化液(纯甲醇中含3％(v/v)的浓硫酸及2g/L苯甲酸作内标)于酯化管中，加盖密封后于100℃下加热4小时。冷却后加入1mL蒸馏水，充分振荡后静置，待氯仿相与水相完全分层后，取下层氯仿于进样瓶中，运用气相色谱仪(GC，GC-2014，SHIMADZU)进行定量和定性分析。
标准样品准备：取30μl左右的30％浓度(体积浓度)3-羟基丙酸3HP(日本东京化成工业株式会社(TCI)，产品目录号H0297)水溶液于酯化管中，加2mL氯仿，2mL酯化液，加盖密封后在100℃进行酯化。在本实施例中的气相检测条件下，标准样品在第2.7分钟有明显出峰，表征酯化样品中的3-羟基丙酸。取10μl的99％浓度的γ-丁内酯(美国Sigma-Aldrich公司，目录号cat.：B10，360-8)于酯化管中，加2mL氯仿，2mL酯化液，加盖密封后在100℃进行酯化。经气相检测，标准样品在第3.0min有明显出峰，表征酯化样品中的4-羟基丁酸。γ-丁内酯是4-羟基丁酸的内酯结构，可替代市面上少见的4-羟基丁酸作为气相检测的标准样品。
以标准样品为对照，如果待测细胞的酯化样品(待测样品)在2.7分钟有明显的出峰，在第3.0分钟也有明显出峰，且无其它特异峰出现，说明待测细胞的酯化样品存在3-羟基丙酸(3HP)单体和4-羟基丁酸(4HB)单体。因为在冰干细胞中3HP和4HB只能以聚合物的形式存在(因为单体3HP和4HB会从细胞里分泌到细胞外，所以细胞内检测到的应该是聚合物)，所以可以证明有P(3HP-co-4HB)的积累。
结果为E.coli S17-1(pZQ01，pZQ03-orfz)在2.7分钟有明显的出峰，在第3.0分钟也有明显出峰，说明产生P(3HP-co-4HB)共聚物。
通过分析气相检测得到的出峰面积和样品量，可得到干细胞中含有共聚物的比重(wt％，重量百分含量)，以及培养体系中能够生产的共聚物的浓度(g/L)。
在含有1，3-丙二醇和/或1，4-丁二醇的TB培养基中培养E.coli S17-1(pZQ01，pZQ03-orfz)，48h后将菌液离心、水洗、冰干后得到干细胞待测样品，并通过气相色谱检测，结果如表1所示。该结果证实了细胞中3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的产生。结果如表1所示。
表1TB培养及不同条件下摇瓶培养的共聚物检测结果
由表1可以看出，在提供1，3-丙二醇和1，4-丁二醇的条件下，该工程菌能够积累P(3HP-co-4HB)共聚物。并且可以通过控制1，3-丙二醇或1，4-丁二醇的浓度来改变聚合物中单体的比例。
二、重组菌Escherichia coli S17-1(pZQ01，pZQ03-orfz)生产P(3HP-co-4HB)的大批量摇瓶实验
1、种子液的培养：重组菌Escherichia coli S17-1(pZQ01，pZQ03-orfz)菌株在20mL抗性LB培养基(含100μg/mL氨苄氯霉素，50μg/mL硫酸卡那霉素)中37℃，200rpm培养12小时，获得一级种子；
2、摇瓶生产：接种量为体积百分浓度5％(1011cfu/L)将一级种子接种至50mL抗性TB培养基中(1，3-丙二醇和1，4-丁二醇浓度分别为①10g/L和5g/L，②10g/L和10g/L，③5g/L和10g/L，④5g/L和15g/L，⑤1g/L和10g/L，五个批次处理)，每批次接种40个摇瓶，37℃，200rpm培养48小时。结果如表2所示。
表2TB培养五种目的浓度大批量生产的共聚物数据表
3、P(3HP-co-4HB)的提取
10000rpm离心10min收集上述五个批次获得的菌体，分别冰干机真空处理10h得到干菌体，每支酯化管称取0.5g干菌体粉末，加入5mL氯仿，混匀，密封，100℃处理4h，5000rpm离心10min，收集下层氯仿相，向氯仿相中加入10倍体积的无水酒精，搅拌混合均匀，静置过夜，收集析出的白色絮状物，在通风橱中挥发絮状物上的氯仿，干燥后的P(3HP-co-4HB)再次溶于氯仿中，加入等体积的去离子水，5000rpm离心10min，吸取下层氯仿相，并将氯仿相倾注于平板内，得到纯净的P(3HP-co-4HB)膜。同时，以上述同样的方法分别用1，3-丙二醇或1，4-丁二醇制备聚合物，并制备成聚合物膜分别称为P(3HP)膜和P(4HB)膜，根据不同的1，3-丙二醇，1，4-丁二醇的比例得到了五种不同单体比例的P(3HP-co-4HB)。上述五个批次制备的P(3HP-co-4HB)膜如图2所示，图2中，自左向右依次为P(3HP)膜、①-⑤批次的聚合物膜，P(4HB)膜。由此可见，由于聚合物中的单体比例不同，随着4HB单体摩尔比的增加，聚合物膜先逐渐变得透明，当4HB的摩尔浓度为67mol％时，聚合物膜为完全透明，之后随着4HB的比例增加，聚合物膜又变得不透明。
4、鉴定
核磁鉴定上述制备的P(3HP-co-4HB)成分，核磁仪器(JEOL公司，型号ECA-600SCC)；采用氘代氯仿CDCl3为氘代溶液；测试核种：1H；扫描次数：16次；采用14.1T超导磁场，氢核子共振频率为600MHZ。核磁结果证明为P(3HP-co-4HB)，并得到聚合物中各单体的比例。其中，批次③获得的聚合物P(3HP-co-37.89mol％4HB)的核磁图谱见图3A和3B、图4。
凝胶渗透色谱仪测得聚合物分子量(检测器为RID-10A，SHIMADZU)。单体比例和分子量分布见表3。
表3P(3HP-co-4HB)单体比例和分子量
表中，Mn(105Da)表示重均分子量Mw(105Da)表示数均分子量。
差示扫描量热仪(DSC，DSC-Q20，TA，USA)测得P(3HP-co-4HB)的热学性质，聚合物的热学性质见表4。表4是对P(3HP-co-4HB)的热学性质描述。
表4P(3HP-co-4HB)的热学性质
表中Tm表示熔融温度；Tg表示玻璃转化温度
万能材料试验机(AI-7000s，GOTECH，Taiwan)测得P(3HP-co-4HB)的力学性质，聚合物的力学性质见表5。σy表示屈服强度，σmt表示最大拉伸强度，εb表示断裂延伸率，E为杨氏模量，该共聚物相对于目前商业用途的PHA具有较高的断裂延伸率。
表5P(3HP-co-4HB)的力学性质
Claims (10)
1.产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的重组菌的构建方法，包括如下步骤：将1，3-丙二醇脱氢酶编码基因、醛脱氢酶编码基因、3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因、4-羟基丁酸辅酶A转移酶编码基因和PHA聚合酶编码基因导入出发菌，得到重组菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述1，3-丙二醇脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列8；所述醛脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列9；所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶的氨基酸序列为序列表中序列10；所述PHA聚合酶的氨基酸序列为序列表中序列11；所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶的氨基酸序列为序列表中序列12。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述1，3-丙二醇脱氢酶基因的核苷酸序列为序列表中序列1；所述醛脱氢酶基因的核苷酸序列为序列表中序列2；所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列3；所述PHA聚合酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4；所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列5；所述出发菌为大肠杆菌，优选为Escherichia coliS17-1。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：
所述1，3-丙二醇脱氢酶编码基因和所述醛脱氢酶编码基因通过重组载体A导入所述出发菌中；
所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因、4-羟基丁酸辅酶A转移酶编码基因和所述PHA聚合酶编码基因通过重组载体B导入所述出发菌中；
所述重组载体A为pZQ01；
所述重组载体B为将4-羟基丁酸辅酶A转移酶的编码基因插入到pZQ03的多克隆识别位点得到的重组载体。
5.由权利要求1-4中任一所述的方法构建的重组菌。
6.一种生产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的方法，包括如下步骤：将权利要求4所述的重组菌用添加了1，3-丙二醇和1，4-丁二醇的培养基培养，收集菌体，提取聚合物，即得到3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述培养温度为30℃-40℃，优选37℃；所述培养基的pH为6-8，优选为7。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述培养基中的1，3-丙二醇或1，4-丁二醇含量均不高于20g/L；所述1，3-丙二醇、1，4-丁二醇在培养基中的浓度均优选为1g/L-20g/L；所述培养时间为24-72小时，优选48小时；所述培养基为大肠杆菌培养基，优选为TB培养基，所述TB培养基含有24g/L酵母提取物，12g/L蛋白胨，4ml/L甘油，0.017mol/L KH2PO4，0.072mol/L K2HPO4。
9.一种产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的重组载体组合，重组载体A和重组载体B组成；所述重组载体A为pZQ01；所述重组载体B为将4-羟基丁酸辅酶A转移酶的编码基因插入到pZQ03的多克隆识别位点得到的载体。
10.权利要求6-9中任意一项所述方法制备的3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012101327789A CN102676567A (zh) | 2012-04-28 | 2012-04-28 | 生产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的重组菌及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012101327789A CN102676567A (zh) | 2012-04-28 | 2012-04-28 | 生产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的重组菌及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102676567A true CN102676567A (zh) | 2012-09-19 |
Family
ID=46809119
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2012101327789A Pending CN102676567A (zh) | 2012-04-28 | 2012-04-28 | 生产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的重组菌及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102676567A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105039376A (zh) * | 2014-08-14 | 2015-11-11 | 清华大学 | 产3-羟基丙酸均聚物/共聚物的重组菌及构建方法与应用 |
| WO2018233703A1 (zh) * | 2017-06-23 | 2018-12-27 | 北京蓝晶微生物科技有限公司 | 一种精细调控共聚物中4-羟基丁酸组成比例的基因盒及其应用 |
| CN109266597A (zh) * | 2018-09-30 | 2019-01-25 | 清华大学 | 一种微生物生产短中长链聚羟基脂肪酸共聚物的方法 |
| CN110079489A (zh) * | 2018-01-25 | 2019-08-02 | 北京蓝晶微生物科技有限公司 | 一种重组盐单胞菌以及利用其生产P(3HB-co-4HB)的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101445813A (zh) * | 2007-12-21 | 2009-06-03 | 清华大学 | 一种生产3-羟基丙酸的方法 |
| CN102382789A (zh) * | 2010-09-02 | 2012-03-21 | 天津国韵生物材料有限公司 | 含有2-酮戊二酸脱羧酶基因kgd的工程菌及其用途 |
-
2012
- 2012-04-28 CN CN2012101327789A patent/CN102676567A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101445813A (zh) * | 2007-12-21 | 2009-06-03 | 清华大学 | 一种生产3-羟基丙酸的方法 |
| CN102382789A (zh) * | 2010-09-02 | 2012-03-21 | 天津国韵生物材料有限公司 | 含有2-酮戊二酸脱羧酶基因kgd的工程菌及其用途 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 20111020 Qin Zhou等 Production of 3-hydroxypropionatehomopolymer and poly(3-hydroxypropionate-co-4-hydroxybutyrate) copolymer by recombinant Escherichia coli 777-785 1－10 第11卷, * |
| 20120427 De-Chuan Meng等 Production and characterization of poly(3-hydroxypropionate-co-4-hydroxybutyrate) with fully controllable structures by recombinant Escherichia coli containing an engineered pathway 317-324 1-10 第14卷, * |
| DE-CHUAN MENG等: "Production and characterization of poly(3-hydroxypropionate-co-4-hydroxybutyrate) with fully controllable structures by recombinant Escherichia coli containing an engineered pathway", <METABOLIC ENGINEERING> * |
| QIN ZHOU等: "Production of 3-hydroxypropionatehomopolymer and poly(3-hydroxypropionate-co-4-hydroxybutyrate) copolymer by recombinant Escherichia coli", <METABOLICENGINEERING> * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105039376A (zh) * | 2014-08-14 | 2015-11-11 | 清华大学 | 产3-羟基丙酸均聚物/共聚物的重组菌及构建方法与应用 |
| CN105039376B (zh) * | 2014-08-14 | 2018-08-03 | 清华大学 | 产3-羟基丙酸均聚物/共聚物的重组菌及构建方法与应用 |
| WO2018233703A1 (zh) * | 2017-06-23 | 2018-12-27 | 北京蓝晶微生物科技有限公司 | 一种精细调控共聚物中4-羟基丁酸组成比例的基因盒及其应用 |
| CN110079489A (zh) * | 2018-01-25 | 2019-08-02 | 北京蓝晶微生物科技有限公司 | 一种重组盐单胞菌以及利用其生产P(3HB-co-4HB)的方法 |
| CN110079489B (zh) * | 2018-01-25 | 2022-05-27 | 北京蓝晶微生物科技有限公司 | 一种重组盐单胞菌以及利用其生产P(3HB-co-4HB)的方法 |
| CN109266597A (zh) * | 2018-09-30 | 2019-01-25 | 清华大学 | 一种微生物生产短中长链聚羟基脂肪酸共聚物的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tanadchangsaeng et al. | Microbial synthesis of polyhydroxybutyrate from glycerol: gluconeogenesis, molecular weight and material properties of biopolyester | |
| Moorkoth et al. | Production and characterization of poly (3-hydroxy butyrate-co-3 hydroxyvalerate)(PHBV) by a novel halotolerant mangrove isolate | |
| Guo et al. | Simultaneous production and characterization of medium-chain-length polyhydroxyalkanoates and alginate oligosaccharides by Pseudomonas mendocina NK-01 | |
| Povolo et al. | Polyhydroxyalkanoate biosynthesis by Hydrogenophaga pseudoflava DSM1034 from structurally unrelated carbon sources | |
| CN101058799B (zh) | 一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法及其专用工程菌 | |
| Rodriguez-Contreras et al. | Novel poly [(R)-3-hydroxybutyrate]-producing bacterium isolated from a Bolivian hypersaline lake | |
| Shah | Original research article optimization and production of Polyhydroxybutarate (PHB) by Bacillus subtilis G1S1from soil | |
| CN101363034B (zh) | 一种利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法 | |
| CN102174542B (zh) | 产3-羟基丙酸均聚物和/或3-羟基丙酸共聚物的重组菌及其应用 | |
| Shen et al. | Benzene containing polyhydroxyalkanoates homo-and copolymers synthesized by genome edited Pseudomonas entomophila | |
| JPWO2010113497A1 (ja) | 微生物の培養方法、及び微生物による物質の製造方法 | |
| CN102676567A (zh) | 生产3-羟基丙酸和4-羟基丁酸的共聚物的重组菌及其应用 | |
| CN114134096A (zh) | 3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基戊酸三元共聚物p(3hb-4hb-3hv)及其微生物生产 | |
| Gnaim et al. | Marine bacteria associated with the green seaweed Ulva sp. for the production of polyhydroxyalkanoates | |
| Otari et al. | Production and characterization of the polymer polyhydroxy butyrate-co-polyhydroxy valerate by Bacillus megaterium NCIM 2475 | |
| CN105039376B (zh) | 产3-羟基丙酸均聚物/共聚物的重组菌及构建方法与应用 | |
| CN117165617A (zh) | 利用木糖生产p34hb的菌株及其构建方法和应用 | |
| CN116574645A (zh) | 一株蜡样芽孢杆菌mg1及应用 | |
| Jung et al. | Polyhydroxybutyrate (PHB) production from sugar cane molasses and tap water without sterilization using novel strain, Priestia sp. YH4 | |
| CN117143899B (zh) | 一种合成p34hb3hp的菌株及其构建方法和应用 | |
| CN102226206A (zh) | 一种聚羟基丁酸酯的制备方法 | |
| Zhang et al. | Effective production of Poly (3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) by engineered Halomonas bluephagenesis grown on glucose and 1, 4-Butanediol | |
| Thuoc et al. | Bioconversion of crude fish Oil into poly-3-hydroxybutyrate by Ralstonia sp. M91 | |
| CN104651284B (zh) | 鞘氨醇单胞菌T‑3及其共发酵生产生物多糖和聚β羟基丁酸的方法 | |
| CN101008011A (zh) | 生产聚羟基脂肪酸酯的重组菌株及其构建方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120919 |