CN102382789A - 含有2-酮戊二酸脱羧酶基因kgd的工程菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术及发酵技术领域，更具体地，本发明公开了一种利用糖类碳源生产3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚酯(P3HB4HB)的工程菌，在该工程菌的基因组上重组整合有合成P3HB4HB所需的外源基因，该外源基因包括聚-3-羟基丁酸酯合成基因phaCAB、4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶基因orfZ、4-羟基丁酸脱氢酶基因4hbD和2-酮戊二酸脱羧酶基因kgd。利用此工程菌可以使用价格相对便宜的糖类碳源来生产P3HB4HB，有效地降低其生产成本，推动其大规模工业化生产和商业应用开发。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术及发酵技术领域，更具体地涉及一种利用糖类碳源生产3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚酯(P3HB4HB)的工程菌及其用途，在该工程菌的基因组上重组整合有合成P3HB4HB所需的外源基因。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，简称PHA)是一类广泛存在于微生物体内的高分子生物聚酯，在细胞内主要作为碳源和能量的贮藏物质(Anderson AJ，Dawes EA.Occurrence，metabolism，metabolic role，and industrial use of bacterial polyhydroxyalkanoates.Microbiol Rev，1990，54：450-472)。3-羟基丁酸(3-hydroxybutyrate，简称3HB)和4-羟基丁酸4-羟基丁酸(4-hydroxybutyrate，简称4HB)的共聚酯“3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚酯”[poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)，简称P3HB4HB]是PHA家族中的一员，其结构如式I所示：
式I
其中，x和y表示聚合度。
P3HB4H最先由Doi Y等于1988年在罗氏真养杆菌Ralstoniaeutropha中发现(Doi Y，Kunioka M，Nakamura Y，et al.Nuclearmagnetic-resonance studies on unusual bacterial copolyesters of3-hydroxybutyrate and 4-hydroxybutyrate.Macromolecules，1988，21：2722-2727)。当向培养基中添加4-羟基丁酸或者4-氯丁酸时，R.eutropha可以合成P3HB4HB，4HB单体的含量可以在0到49mol％之间调节。
根据P3HB4HB聚合物中组成单体3HB与4HB比例的不同，P3HB4HB具有从非常坚硬的高度结晶体到柔软的弹性体等一系列不同的材料学性质。4HB含量较高时(64～100mol％)，P3HB4HB的拉伸强度可以由17Mpa提高到104Mpa，表现出热塑性弹性体的性质。当4HB比例由0mol％增加到82mol％时，P3HB4HB的断裂伸长率可以由5％增加到1320％(Saito Y，Nakamura S，Hiramitsu M，et al.Microbial synthesis and properties ofpoly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate).Polym Int，1996，39：169-174)。P3HB4HB的熔融温度随着4HB单体比例的增加先降低，然后逐渐升高，而玻璃化转变温度则随着4HB单体比例的增加呈线性降低趋势(Ishida K，Wang Y，Inoue Y.Comonomer unitcomposition and thermal properties ofpoly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)s biosynthesized byRalstonia eutropha.Biomacromolecules，2001，2：1285-1293)。
4HB单体被聚合到共聚酯后不含支链，使得P3HB4HB既可以被PHA降解酶降解，又可以被脂肪酶水解。4HB单体的掺入加速了酶解和水解的速度，水解速度取决于其单体组成，4HB含量越高时，P3HB4HB被脂肪酶水解的速度越快(Saito Y，Nakamura S，HiramitsuM，et al.Microbial synthesis and properties ofpoly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate).Polym Int，1996，39：169-174；Doi Y，Kanesawa Y，Kunioka M，et al.Biodegradation ofmicrobial copolyesters：poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)and poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate).Macromolecules，1990，23：26-31)，因此，P3HB4HB有着比其它PHA材料更为优异的降解性能，被认为是最有应用前景的PHA材料之一。
迄今为止，已经发现的可以合成P3HB4HB的野生型细菌包括罗氏真养杆菌Ralstonia eutropha，广泛产碱杆菌Alcaligenes latus，食酸丛毛单胞菌Comamonas acidovorans，睾丸酮丛毛单胞菌Comamonas testosteroni和类黄色噬氢菌Hydrogenophagapseudoflava。一般来说，P3HB4HB共聚酯中的3HB和4HB单体分别由不同类型的碳源来合成，用来产生3HB单体的碳源包括常规的蔗糖、葡萄糖、果糖和丁酸等，而4HB单体的掺入需要向培养基中加入与4HB结构类似的碳源，例如4-羟基丁酸、γ-丁内酯和1，4-丁二醇等。碳源的选用与生产菌的种类相关，不同的微生物喜好利用不同的碳源。4HB结构类似碳源的价格非常昂贵，对细胞毒性也较大，在发酵过程中常常需要以分批补料的方式添加，并且混合碳源的发酵策略也较为繁琐复杂。例如，4-羟基丁酸被认为是最有效地向共聚酯中掺入4HB单体的碳源，但它在我国是一种管制药品，很难以化学品的形式在市场上购买到。4HB结构类似碳源的添加已经成为制约P3HB4HB大规模工业化生产和应用的最大难题。如果能够利用价格相对便宜的糖类碳源来生产P3HB4HB，将会有效地降低其生产成本，推动其大规模工业化生产和商业应用开发。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用糖类碳源生产3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚酯(P3HB4HB)的工程菌，在所述工程菌的基因组上，重组整合有合成P3HB4HB所需的外源基因，该外源基因包括：来源于罗氏真养杆菌Ralstonia eutropha的聚-3-羟基丁酸酯合成基因phaCAB(自GENBANK号为AM260479的5′端第1557353-1561203位核苷酸)，来源于克氏梭菌Clostridium kluyveri的4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶基因orfZ(自GENBANK号为CP000673的5′端第3066385-3067674位核苷酸)，来源于克氏梭菌Clostridium kluyveri的4-羟基丁酸脱氢酶基因4hbD(自GENBANK号为CP000673的5′端第3061070-3062185位核苷酸)，以及来源于结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis的2-酮戊二酸脱羧酶基因kgd(自GENBANK号为CP000611的5′端第1390667-1394311位核苷酸)。
本发明所述工程菌的宿主菌可为大肠杆菌野生型，或是大肠杆菌的琥珀酸半缩醛脱氢酶基因突变株，优选为大肠杆菌的琥珀酸半缩醛脱氢酶基因突变株Escherichia coli JM 109SG。
优选地，上述合成P3HB4HB所需的外源基因通过重组表达载体整合到所述工程菌的基因组上，所述重组表达载体为pUK70CAB、pUK1624hbdorfZ和pUK81kgd，其中pUK70CAB物理图谱如图1所示，pUK1624hbdorfZ物理图谱如图2所示，pUK81kgd物理图谱如图3所示。
优选地，用于构建上述重组表达载体的出发载体为pEASY-Blunt(由全式金生物公司购买)和pKD 13(NCBI GenBank：HC688602.1)。
本发明所述的糖类碳源为葡萄糖、葡萄糖酸钠、果糖、甘露醇等可以被工程菌利用的单糖或其组合，或者为经过水解后含有上述单糖或其组合的多糖。
P3HB4HB的生物合成途径如图4所示。
另一方面，本发明的目的是提供一种P3HB4HB的生产方法，所述方法为：将上述工程菌，在添加上述糖类碳源的情况下，经过发酵培养得到P3HB4HB。
所述发酵培养的温度为28～38℃，优选为37℃。
所述发酵培养过程中所使用的发酵培养基为以下三种的任意一种，以下培养基均用去离子水配制：
1)每升培养基含：酵母提取物4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，NaCl8-12g/L，糖类碳源18-22g/L，其余为水。
2)每升培养基含：酵母提取物4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，糖类碳源20-60g/L，(NH4)2SO4 1.8-2.2g/L，MgSO4 0.38-0.45g/L，Na2HPO4·12H2O 9.6-9.7g/L，KH2PO41.2-1.8g/L，微量元素溶液I 8-12mL/L，微量元素溶液II 0.8-1.2mL/L，其余为水；其中每升微量元素溶液I含：Fe(III)-NH4-Citrate 4-6g/L，CaCl2·2H2O 1.8-2.2g/L，其余为0.4-0.6M HCl；每升微量元素溶液II含：ZnSO4·7H2O 80-120mg/L，MnCl2·4H2O 25-35mg/L，H3BO3280-320mg/L，CoCl2·6H2O 180-220mg/L，CuSO4·5H2O 8-12mg/L，NiCl2·6H2O 18-22mg/L，NaMoO4·2H2O28-32mg/L，其余为0.4-0.6M HCl。
3)每升培养基含：糖类碳源20-60g/L，(NH4)2SO41.8-2.2g/L，MgSO40.38-0.45g/L，Na2HPO4·12H2O 9.6-9.7g/L，KH2PO41.2-1.8g/L，微量元素溶液I 8-12mL/L，微量元素溶液II 0.8-1.2mL/L，其余为水；每升微量元素溶液I含：Fe(III)-NH4-Citrate 4-6g/L，CaCl2·2H2O 1.8-2.2g/L，其余为0.4-0.6M HCl；每升微量元素溶液II含：ZnSO4·7H2O 80-120mg/L，MnCl2·4H2O 25-35mg/L，H3BO3280-320mg/L，CoCl2·6H2O 180-220mg/L，CuSO4·5H2O 8-12mg/L，NiCl2·6H2O 18-22mg/L，NaMoO4·2H2O 28-32mg/L，其余为0.4-0.6MHCl。
本发明通过分子生物学和代谢工程的手段，构建能够利用糖类碳源发酵生产P3HB4HB的工程菌，使用该工程菌生产P3HB4HB无需添加4HB结构类似的碳源，例如4-羟基丁酸、γ-丁内酯和1，4-丁二醇等。因此，使用该工程菌可利用相对廉价的碳源进行发酵，降低了P3HB4HB的生产成本。
附图说明
图1：pUK70CAB的物理图谱(Km：卡那霉素抗性基因；phaC：PHA聚合酶基因；phaA：3-酮硫解酶基因；phaB：NADPH-依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶基因；attP：大肠杆菌attBHK022相应的attP位点；R6kgamma：R6kgamma复制子)。
图2：pUK1624hbdorfZ的物理图谱(Km：卡那霉素抗性基因；orfZ：4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶基因；4hbD：4-羟基丁酸脱氢酶基因；attP：大肠杆菌attBphi80相应的attP位点；R6kgamma：R6kgamma复制子)。
图3：pUK81kgd的物理图谱(Km：卡那霉素抗性基因；kgd：2-酮戊二酸脱羧酶基因；attP：大肠杆菌attBP21相应的attP位点；R6kgamma：R6kgamma复制子)。
图4：P3HB4HB的生物合成途径。
图5：构建工程菌E.coli JM 109SG 3hb4hb基因组的流程图。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中涉及分子生物学操作所用的酶，均购自MBIFermentas公司，相应的操作步骤完全按照相关的产品说明书进行；质粒提取、DNA片段回收所用的试剂盒购自美国OMEGA Bio-Tek公司，相应的操作完全按照其产品说明书进行；实验中涉及的引物合成和DNA测序工作由北京奥科生物技术公司完成。
下述实施例中涉及的细菌培养基如下，如无特殊指明，培养基均用去离子水配制；如无特殊指明，培养基的灭菌条件均为115℃，20分钟：
LB液体培养基：每升培养基含有5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L NaCl，pH 7.0，其余为水。
LB-Amp液体培养基：每升培养基含有5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L NaCl和100μg/mL氨苄青霉素，其余为水。
LB-Amp固体培养基：每升培养基含有15g/L琼脂、5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L NaCl和100μg/mL氨苄青霉素，其余为水。
LB-Km液体培养基：每升培养基含5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl和50μg/mL硫酸卡那霉素，其余为水。
LB-Km固体培养基：每升培养基含15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl和50μg/mL硫酸卡那霉素，其余为水。
LB-Km-Amp液体培养基：每升培养基含有5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，50μg/mL硫酸卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素，其余为水。
LB-Km-Amp固体培养基：每升培养基含15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，50μg/mL硫酸卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素，其余为水。
LBG液体培养基：每升培养基含有5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，20g/L葡萄糖，其余为水。
实施例1、构建大肠杆菌基因组整合质粒pKD13km
1.用AceIII单酶切质粒pKD13，胶回收2.5kb的片段，得到含有Km抗性基因和R6kgamma复制子的片段。
2.使用Takara的solutionI连接试剂盒(solutionI试剂盒为T4DNA连接酶，在Takara公司的货号为D6022)对步骤1中回收到的片段进行自连接反应(酶切后的片段与solutionI比例为1∶1)，将连接产物通过电转化的方法导入到E.coli S17-1(λpir)(Herrero，M，V.deLorenzo，and K.N.Timmis.1990.Transposon vectors containingnon-antibiotic resistance selection markers for cloning and stablechromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria.J.Bacteriol.172：6557-6567)中，并涂布于LB-Km固体培养基，37℃培养16h。
3.质粒验证：从LB-Km固体培养基上挑取单克隆到LB-Km液体培养基中，培养16h(37℃摇床，200rpm)，提取质粒，通过AceIII单酶切，得到一条大小为2.5kb的DNA片段，确认质粒构建成功。
实施例2、构建基因组整合表达载体pUK系列pUK162、pUK70、pUK63、pUK81和pUK154。
1.在标准的聚合酶链式反应条件下，以pEASY-Blunt为模板，以引物P1：CCATCGCCCTGATAGACGGT(SalI)和引物P2：ACTCTTCCTTTTTCAATTCAGAAG(EcoRI)为上下游引物扩增得到1365bp的DNA片段。经测序表明，该片段含有Km抗性基因。经过内切酶EcoRI和SalI处理后回收Km抗性基因片段。
2.在标准的聚合酶链式反应条件下，以pEASY-Blunt为模板，以引物P3：ATAAGAATTCGGCAACTATGGATGAACGAA(EcoR)和引物P4：ATATGTCGACTAATACGACTCACTATAGGGCGA(SalI)为上下游引物扩增得到1409bp的DNA片段。经测序表明，该片段含有pEASY-Blunt的复制子序列，经过内切酶EcoRI和SalI处理后回收复制子基因片段。
3.使用Takara的solutionI连接试剂盒(solutionI试剂盒为T4DNA连接酶，在Takara公司的货号为D6022)对步骤1和2中回收后的片段进行连接，将连接产物通过电转化的方法导入到E.coli JM109(从中国普通微生物菌种保藏管理中心购得)中，并涂布于LB-Km固体培养基，37℃培养16h。
4.质粒验证：从LB-Km固体培养基上挑取单克隆到LB-Km液体培养基中，培养16h(37℃摇床，200rpm)，提取质粒，通过BamHI单酶切，得到一条大小为2.7kb的DNA片段，确认质粒构建成功。
5.将步骤4中验证构建成功的质粒用限制性内切酶KpnI和SalI进行酶切处理，回收大小为2.6kb的片段。
6.在标准的聚合酶链式反应条件下，以pKD 13km为模板，以引物P5：GAGCGCTTTTGAAGCTCACGC(KpnI)和引物P6：GCGAGGCTTTGCCATGG(SalI)为上下游引物扩增得到1409bp的DNA片段，经测序表明该序列含有Km抗性基因和R6kgamma复制子序列。经内切酶KpnI和SalI处理后回收抗性基因和复制子片段。
7.使用Takara的solutionI连接试剂盒(solutionI试剂盒为T4DNA连接酶，在Takara公司的货号为D6022)对步骤5和6中回收后的片段进行连接，将连接产物通过电转化的方法导入到E.coliS17-1(λpir)中，并涂布于LB-Km固体培养基，37℃培养16h。
8.质粒验证：从LB-Km固体培养基上挑取单克隆到LB-Km液体培养基中，培养16h(37℃摇床，200rpm)，提取质粒，通过EcoRI单酶切，得到一条大小为4.2kb的DNA片段，确认质粒构建成功。
9.人工合成一段序列，其序列为tagggcgaattgggccctctagatgcatgctcgagcggccgccagtgtgatggatatctgcagaattgcccttacaagtttgtacaaaaaagctgaacgagaaacgtaaaatgatataaatatcaatatattaaattagattttgcataaaaaacagactacataatactgtaaaacacaacatatccagtcactatgaagggcaattccagcacactggcggccgttactagtggatccgagctcggtaccaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatcc，在标准的聚合酶链式反应条件下，以其为模板，以引物P7：TAAGGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACC(KpnI)和引物P8：ATATGTCGACATAATTACACTTCGTGAGCCTGCTTTTTTGTACAAAGTTGGC(SalI)为上下游引物扩增得到179bp的DNA片段。经测序表明该序列含有Lamda的attR序列，经内切酶处理后回收此片段。
10.使用Takara的solutionI连接试剂盒(solutionI试剂盒为T4DNA连接酶，在Takara公司的货号为D6022)对步骤5和9中回收得到的片段进行连接反应，将连接产物通过电转化的方法导入到E.coli JM 109中，并涂布于LB-Km固体培养基，37℃培养16h。
11.质粒验证：从LB-Km固体培养基上挑取单克隆到LB-Km液体培养基中，培养16h(37℃摇床，200rpm)，提取质粒，通过EcoRI单酶切，得到一条大小为2.7kb的DNA片段，确认质粒构建成功。
12.在标准的聚合酶链式反应条件下，以pET-28a(NCBIGeneBank：AX767071.1)为模板，以引物P9：ATAAGGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAACGAG(KpnI)和引物P10：ATAAGTCGACATAATTACACTTCGTGCATAGTGACTGGATATGTTGTGTTTTACAG(AlwNI)为上下游引物扩增得到347bp的片段，经测序表明该片段含有T7启动子序列。经内切酶处理后回收此片段。
13.将步骤11中验证构建成功的质粒利用内切酶BglI和KpnI进行酶切处理，然后回收2.7kb的片段，使用Takara的solutionI连接试剂盒(solutionI试剂盒为T4DNA连接酶，在Takara公司的货号为D6022)将回收的片段与步骤12得到的片段进行连接，将连接产物通过电转化的方法导入到E.coli JM 109中，并涂布于LB-Km固体培养基，37℃培养16h。
14.质粒验证：从LB-Km固体培养基上挑取单克隆到LB-Km液体培养基中，培养16h(37℃摇床，200rpm)，提取质粒，通过BamHI单酶切，得到一条大小为3kb的DNA片段，确认质粒构建成功。
15.人工合成一段序列，其序列为tatagggcgaattgaagctgcccttcaaataatgattttattttgactgatagtgacctgttcgttgcaacaaattgataagcaatgcttttttataatgccaactttgtacaaaaaagcaggctaagggcagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcc，在标准的聚合酶链式反应条件下，以其为模板，以引物P11：ATAAGGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACC(KpnI)和引物P12：AGCCTGCTTTTTTGTACAAAGTTGGC(BglI)为上下游引物扩增得到154bp的片段。经测序表明该片段含有Lamda attL启动子序列。经内切酶处理后回收此片段。
16.将步骤8中验证构建成功的质粒用内切酶DraIII和SalI进行酶切处理，回收4.2kb的片段，与步骤15得到的回收片段进行连接，将连接产物通过通过电转化的方法导入到E.coli S17-1(λpir)中，并涂布于LB-Km固体培养基，37℃培养16h。
17.质粒验证：从LB-Km固体培养基上挑取单克隆到LB-Km液体培养基中，培养16h(37℃摇床，200rpm)，提取质粒，通过EcoRI单酶切，得到一条大小为4.3kb的DNA片段，确认质粒构建成功。
18.将步骤14中验证构建成功的质粒用DraIII和KpnI进行酶切处理，回收464bp的片段；将步骤17中验证构建成功的质粒用BglI和KpnI进行酶切处理，回收4.3kb的片段。使用Takara的solutionI连接试剂盒(solutionI试剂盒为T4DNA连接酶，在Takara公司的货号为D6022)将上述两个回收的片段与步骤12得到的片段进行连接，将连接产物通过电转化的方法导入到E.coli S17-1(λpir)中，并涂布于LB-Km固体培养基，37℃培养16h。
19.质粒验证：从LB-Km固体培养基上挑取单克隆到LB-Km液体培养基中，培养16h(37℃摇床，200rpm)，提取质粒，通过BamHI单酶切，得到一条大小为4.8kb的DNA片段，确认质粒构建成功。
20.在标准的聚合酶链式反应条件下，以质粒pAH162，pAH70，pAH63，pAH81和pAH154为模板(Andreas Haldimann，Barryy L.Wanner.Conditional Replication，Integration，Excision，and RetrievalPlasmid-Host Systems for Gene Structure-Fuction Studies of Bacterica.JOURNAL OF BACTERIOLOGY.2001，183(12)：6384-6393)，分别以表1中的引物为上下游引物进行扩增，得到5个DNA片段，经测序验证分别为大肠杆菌中的5个attP位点的核心序列，经相应的内切酶处理后回收这些片段。利用DraIII和KpnI酶切处理步骤19中验证构建成功的质粒，回收大小为2.1kb的片段，分别与上述5个片段进行连接，连接反应完成后，分别获得质粒pUK162、pUK70、pUK63、pUK81和pUK154，然后通过电转化的方法分别将获得的重组质粒pUK162、pUK70、pUK63、pUK81和pUK154导入到E.coli S17-1(λpir)中，并涂布于LB-Km固体培养基，37℃培养16h。
21.质粒验证：从LB-Km固体培养基上挑取单克隆到LB-Km液体培养基中，培养16h(37℃摇床，200rpm)，分别提取质粒，通过BamHI单酶切，所得DNA片段大小如表1所示，确认质粒构建成功。分别得到大肠杆菌基因组整合表达载体pUK162，pUK70，pUK63，pUK81和pUK154。
表1构建基因组整合表达载体pUK162、pUK70、pUK63、pUK81和pUK154所用模板、引物以及所得DNA片段大小
实施例3、构建质粒pBHR68orfZ
1.用ClaI和EcoRI双酶切质粒pCK3(
B，Gottschalk G.Molecular analysis of the anaerobic succinate degradation pathway inClostridium kluyveri.J Bacteriol，1996，178：871-880)，胶回收得到1.8kb的片段，其含有orfZ基因及其启动子序列。
2.用ClaI和EcoRI双酶切质粒pBHR68(Spiekermann P，RehmBHA，Kalscheuer R，et al.A sensitive，viable-colony staining methodusing Nile red for direct screening of bacteria that accumulatepolyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage compounds.ArchMicrobiol，1999，171：73-80)，胶回收得到8.1kb的片段，含有phaCAB基因及其启动子序列、pBluescript II SK(-)来源的Amp抗性基因及复制子。
3.使用T4DNA连接酶连接步骤1和步骤2中回收的片段；连接反应完成后，获得质粒pBHR68orfZ，通过电转化的方法将获得的重组质粒pBHR68orfZ导入到E.coli JM 109中，并涂布于LB-Amp固体培养基，37℃培养16h。
4.质粒验证：从LB-Amp固体培养基上挑取单克隆到LB-Amp液体培养基中，培养16h(37℃摇床，200rpm)，提取质粒，并通过ClaI和EcoRI双酶切，得到大小分别为8.1kb和1.8kb的两段DNA片段，确认质粒构建成功。
实施例4、构建质粒pUK70CAB
1.在标准的聚合酶链式反应条件下，以质粒pBHR68orfZ为模板，以引物P23：AATTAAGAATTCCCAGGCCGGCAGGTCAGCC(EcoRI)和引物P24ATTAAGAATTCATGGCGACCGGCAAAGGCGC(EcoRI)为上下游引物得到大小为3.9kb的DNA片段。经测序验证为phaCAB基因。酶切回收含有phaCAB基因的片段。
2.用内切酶EcoRI处理质粒pUK70，回收2.6kb的片段。
3.使用Takara的solutionI连接试剂盒(solutionI试剂盒为T4DNA连接酶，在Takara公司的货号为D6022)将1和2得到的片段进行连接，连接反应完成后，获得质粒pUK70CAB，通过电转化的方法将获得的重组质粒pUK70CAB导入到E.coli S17-1(λpir)中，并涂布于LB-Km固体培养基，37℃培养16h。
4.质粒验证：从LB-Km固体培养基上挑取单克隆到LB-Km液体培养基中，培养16h(37℃摇床，200rpm)，提取质粒，通过BamHI单酶切，得到一条大小为6.3kb的DNA片段，确认质粒构建成功。
实施例5、构建质粒pUK1624hbdorfZ
1.在标准的聚合酶链式反应条件下，以质粒pBHR68orfZ为模板，以引物P25：AATTAAGAATTCTACTAGCTGCTGCGTTGA(EcoRI)和引物P26：AATTAAGAATTCGTTGGGCATAGAATCAGG(EcoRI)为上下游引物得到大小为1.5kb的DNA片段，经测序验证为orfZ基因。酶切回收含有orfZ基因的片段。
2.在标准的聚合酶链式反应条件下，以质粒pCK3(
B，Gottschalk G.Molecular analysis of the anaerobic succinatedegradation pathway in Clostridium kluyveri.J Bacteriol，1996，178：871-880)为模板，以引物P27：
AATTAAGAATTCATGAAGTTATTAAAATTGGCACCTG(EcoRI)和引物P28：
AATTAAGAATTCTTAATATAACTTTTTATATGTGTTTAC(EcoRI)为上下游引物得到大小为1.1kb的DNA条带，经测序验证为克氏梭菌Clostridium kluyveri的4-羟基丁酸脱氢酶基因4hbD(自GENBANK号为CP000673的5′端第3061070-3062185位核苷酸序列)，经处理后得到含有4hbD基因的片段。
3.用内切酶EcoRI处理质粒pUK162，回收2.6kb片段。
4.使用Takara的solutionI连接试剂盒(solutionI试剂盒为T4DNA连接酶，在Takara公司的货号为D6022)将步骤1、2和3得到的片段进行连接，连接反应完成后，获得质粒pUK1624hbdorfZ，通过电转化的方法将获得的重组质粒pUK1624hbdorfZ导入到E.coliS17-1(λpir)中，并涂布于LB-Km固体培养基，37℃培养16h。
5.质粒验证：从LB-Km固体培养基上挑取单克隆到LB-Km液体培养基中，培养16h(37℃摇床，200rpm)，提取质粒，通过BamHI单酶切，得到一条5.2kb的DNA片段，确认质粒构建成功，然后通过测序验证基因方向正确的克隆。
实施例6、构建质粒pUK81kgd
1.在标准的聚合酶链式反应条件下，以结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis H37Ra的基因组为模板，以引物P29：AATTAAGAATTCATGTACCGCAAGTTCCGCGACGACC(EcoRI)和引物P30：GAAATTGGTACCTCAGCCGAACGCCTCGTCG(KpnI)为上下游引物，得到一条大小为3.6kb的DNA条带。经测序表明，该片段含有结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis H37Ra的2-酮戊二酸脱羧酶基因kgd(自GENBANK号为CP000611的5′端第1390667-1394311位核苷酸)，用限制性内切酶酶切处理后，回收含有2-酮戊二酸脱羧酶基因kgd的DNA片段。
2.用内切酶EcoRI和KpnI处理质粒pUK81，回收2.6kb的片段。
3.使用Takara的solutionI连接试剂盒(solutionI试剂盒为T4DNA连接酶，在Takara公司的货号为D6022)将步骤1和2得到的片段进行连接，连接反应完成后，获得质粒pUK81kgd，通过电转化的方法将获得的重组质粒pUK81kgd导入到E.coli S17-1(λpir)中，并涂布于LB-Km固体培养基，37℃培养16h。
4.质粒验证：从LB-Km固体培养基上挑取单克隆到LB-Km液体培养基中，培养16h(37℃摇床，200rpm)，提取质粒，通过BamHI单酶切，得到一条6.3kb的DNA片段，确认质粒构建成功，然后通过测序验证基因方向正确的克隆。
实施例7、工程菌E.coli JM 109SG 3hb4hb的构建
构建工程菌E.coli JM 109SG 3hb4hb基因组的流程图如图5所示，具体步骤为：
1.将辅助质粒pAH69(Andreas Haldimann，Barryy L.Wanner.Conditional Replication，Integration，Excision，and Retrieval Plasmid-Host Systems for Gene Structure-Fuction Studies of Bacterica.JOURNAL OF BACTERIOLOGY.2001，183(12)：6384-6393)通过电转化的方法转化到大肠杆菌琥珀酸半缩醛脱氢酶突变体E.coli JM 109SG(Li ZJ，Shi ZY，Jian J，et al.Production ofpoly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)from unrelated carbonsources by metabolically engineered Escherichia coli，Metab Eng，2010，12：352-359)中，如图5所示，所用E.coli JM 109SG的基因组中含有attBHK022、attBP21、attBPhi80基因位点。
2.将实施例4构建的质粒pUK70CAB，通过电转化的方式转入到含有辅助质粒pAH69的E.coli JM 109SG中，在30℃恢复培养半小时，然后再在42℃培养半小时，以诱导pAH69上的Int酶表达，促使pUK70CAB重组到E.coli JM 109SG的基因组上，之后再在30℃恢复培养半小时。最后涂LB-Km固体平板，37℃培养16h。
3.在标准的聚合酶链式反应条件下，以引物P31：AGGAGTATCGAGATGGCA和P32：GGCATCAACAGCACATTC为上下游引物进行菌落PCR验证。阳性克隆可得到824bp的条带，该阳性克隆为已经将质粒整合到E.coli JM 109SG基因组上的大肠杆菌E.coli JM 109SG 70CAB。
4.将另一个辅助质粒pAH83(Andreas Haldimann，Barryy L.Wanner.Conditional Replication，Integration，Excision，and RetrievalPlasmid-Host Systems for Gene Structure-Fuction Studies of Bacterica.JOURNAL OF BACTERIOLOGY.2001，183(12)：6384-6393)通过电转的方式转入到E.coli JM 109SG 70CAB中，在42℃诱导pAH83上的Int酶和Xis酶表达，促使E.coli JM 109SG的重组基因组在序列attL和attR之间进行同源重组，通过attL和attR重组从基因组上除去载体骨架，即序列attR-Km-attL。
5.接着，分别将实施例5和实施例6中构建的pUK1624hbdorfZ和pUK81kgd整合到基因组上。该整合方式与pUK70CAB一致，只是pUK1624hbdorfZ的两个辅助质粒分别为pAH123和pAH129(Andreas Haldimann，Barryy L.Wanner.Conditional Replication，Integration，Excision，and Retrieval Plasmid-Host Systems for GeneStructure-Fuction Studies of Bacterica.JOURNAL OFBACTERIOLOGY.2001，183(12)：6384-6393)。pUK81kgd的两个辅助质粒为pAH121和pAH122(Andreas Haldimann，Barryy L.Wanner.Conditional Replication，Integration，Excision，and Retrieval Plasmid-Host Systems for Gene Structure-Fuction Studies of Bacterica.JOURNAL OF BACTERIOLOGY.2001，183(12)：6384-6393)。
6.分别将pUK1624hbdorfZ和pUK81kgd整合到基因组上以后，即得到P3HB4HB的生产工程菌E.coli JM 109SG 3hb4hb。
实施例8、工程菌E.coli JM 109SG 3hb4hb利用葡萄糖发酵生产P3HB4HB的摇瓶实验。
1.将E.coli JM 109SG 3hb4hb在LB液体培养基中培养12小时(37℃摇床，200rpm)作为种子液；按体积比4％的接种量将种子液接种到LB葡萄糖(LBG)液体培养基中，37℃摇床，200rpm，培养48小时。
2.使用气相色谱法(Gas chromatography，GC)对发酵产物定性检测，按照下述方法进行菌体中PHA含量的气相色谱法检测，其结果表明采用这种方法生产得到的PHA组分为P3HB4HB。
气相色谱法检测方法：
气相色谱分析使用HP 6890型气相色谱仪，色谱柱为HP-5毛细管柱，柱长30m，内径320μm，固定相为25nm厚的苯基甲基聚硅氧烷；检测器为火焰离子化检测器(Flame ionization detector，FID)；用高纯氮气作为载气，氢气作为燃气，空气为助燃气。
气相色谱分析的条件如下：
柱温：
80℃开始，停留1.5分钟；
30℃/分钟的速率升温到140℃，停留0分钟；
40℃/分钟的速率升温到220℃，停留0.5分钟。
总计时间为6分钟。
柱压：
10psi开始，停留1.5分钟；
2.5psi/分钟的速率升压到20psi，停留0.5分钟。
(psi为压力单位，即磅/平方英寸，1psi＝6.89476kPa)
进样口：温度为200℃，使用分流模式，分流比为30～100。
检测器：温度为220℃，氢气流量30mL/分钟，空气流量400mL/分钟。
检测步骤如下：
1)将上述发酵培养的E.coli JM 109SG 3hb4hb菌液，离心(10000rpm，10分钟)收集细菌，然后用蒸馏水洗涤后再次离心；将细胞冰冻干燥，测定细胞干重(Cell dry weight，CDW)；
2)取30-50mg左右干细胞于酯化管中，加入2mL酯化液(3％体积的浓硫酸溶于甲醇中，含2g/L苯甲酸作为内标)、2mL氯仿，加盖密闭，100℃烘箱中酯化4h；冷却至室温后，加入1mL蒸馏水，充分振荡，静置分层；待氯仿相与水相完全分离后，取氯仿相进行气相色谱分析；
3)根据样品浓度的不同，进样量为0.4-1μL，使用安捷伦公司的微量进样器。采用内标法对PHA进行定量分析，根据峰面积定量。PHA含量定义为PHA对细胞干重的比值，PHA产量＝PHA含量×细胞干重。
菌体内积累P3HB4HB的含量及细胞干重结果如表2所示，结果表明，E.coli JM 109SG 3hb4hb在上述培养条件下能够合成P3HB4HB，且P3HB4HB的含量可达细胞干重的50左右％。
表2菌株E.coli JM 109SG 3hb4hb培养积累P3HB4HB摇瓶结果
Claims (9)
1.一种利用糖类碳源生产3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚酯(P3HB4HB)的工程菌，其特征在于，在所述工程菌的基因组上重组整合有合成P3HB4HB所需的外源基因，该外源基因包括聚-3-羟基丁酸酯合成基因phaCAB、4-羟基丁酰辅酶A：辅酶A转移酶基因orfZ、4-羟基丁酸脱氢酶基因4hbD和2-酮戊二酸脱羧酶基因kgd。
2.权利要求1所述的工程菌，其中所述工程菌的宿主菌可为大肠杆菌野生型，或是大肠杆菌的琥珀酸半缩醛脱氢酶基因突变株。
3.权利要求2所述的工程菌，其中所述工程菌的宿主菌为大肠杆菌的琥珀酸半缩醛脱氢酶基因突变株Escherichia coli JM 109SG。
4.权利要求1-3中任一项所述的工程菌，其中所述外源基因通过重组表达载体整合到所述工程菌的基因组上，所述重组表达载体为pUK70CAB、pUK1624hbdorfZ和pUK81kgd，其中pUK70CAB物理图谱如图1所示，pUK1624hbdorfZ物理图谱如图2所示，pUK81kgd物理图谱如图3所示。
5.权利要求4所述的工程菌，其中用于构建所述重组表达载体的出发载体为pEASY-Blunt和pKD13。
6.权利要求1所述的工程菌，其中糖类碳源为葡萄糖、葡萄糖酸钠、果糖、甘露醇或其组合，或者为经过水解后含有葡萄糖、葡萄糖酸钠、果糖、甘露醇之一或其组合的多糖。
7.一种3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚酯的生产方法：将权利要求1-5任一项所述的工程菌，在添加糖类碳源的情况下，经过发酵培养得到3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚酯。
8.权利要求7所述的生产方法，其中所述发酵培养温度为28～38℃。
9.权利要求7-8中任一项所述的生产方法，其中糖类碳源为葡萄糖、葡萄糖酸钠、果糖、甘露醇或其组合，或者为经过水解后含有葡萄糖、葡萄糖酸钠、果糖、甘露醇之一或其组合的多糖。
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