CN101363034B - 一种利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法，是通过构建环境诱导型表达质粒表达PHB合成酶基因phbCAB，在不添加任何诱导剂的条件下，phbCAB基因通过环境胁迫等外界条件的诱导而表达，从而催化聚羟基脂肪酸酯(PHA)的合成。发酵结果表明，在不添加任何人工诱导剂的条件下，重组大肠杆菌DH5α/pEPI-phbCAB PHB含量高达到细胞干重的85.7％。本发明中重组大肠杆菌DH5α/pEPI-phbCAB具有重要的应用前景和价值。

Description

一种利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法

技术领域

本发明涉及一种生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法，尤其涉及一种利用重组大肠杆菌发酵生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法。属于基因工程和微生物发酵领域。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoat，简称PHA)，是由微生物合成的功能性生物聚酯。PHA具有生物可降解性、生物相容性、气体阻隔性、压电性、非线性光学活性以及由官能团引起的其它特殊性能。PHA的性质决定了它具有可作为生物可降解塑料、组织工程的支架材料等许多潜在的应用，因此，国内外都对其进行了大量的基础和应用开发研究。聚羟基丁酸酯(Polyhydroxybutyrate，PHB)是PHA家族中最简单，也是研究得最多、最透彻的成员。PHB在细胞内呈颗粒状，分子量一般为10⁶(随培养条件，抽提方法不同而变化)，熔点为18℃，具有高结晶性、光学活性和压电性质，是立体规整的聚合物。

PHB的合成途径已经比较清楚。以葡萄糖为原料，可以通过乙酰辅酶A缩合形成聚合物的前体物酰基辅酶A，然后在聚合酶的作用下合成PHB。但是由于原料成本较高，PHB的工业生产仍然受到限制。目前，市场上PHB的价格大约为20美元/千克，为普通石化塑料的10倍，因此，PHB还无法与石化塑料相竞争。随着石油价格的上涨及环境污染的问题的凸显，生物发酵生产PHB代替化学合成塑料的趋势越来越明显。

大肠杆菌作为一模式原核微生物，由于其遗传背景清楚、易培养、生长快及易操作性，已广泛应用于基因工程及化工原料合成代谢途径的构建中。大宗生化原料如氨基酸、有机酸等已经通过大肠杆菌中得以生产。在工业化大规模发酵生产PHB的过程中，除了降低发酵底物价格、能源消耗及提取消耗外，发酵过程中昂贵诱导剂的添加也是一个难于解决的问题。

目前，用于基因的表达系统，常见的有阿拉伯糖诱导型表达系统P_BAD；IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导型表达系统，如P_LAC、P_TRC、P_TAC、P_L、P_R和P_T7。然而，这些常见的表达系统存在着很大的缺陷，即只能用于实验研究水平，在大工业生产中很难得到利用。阿拉伯糖诱导型表达系统在添加阿拉伯糖的条件下诱导表达，但该表达系统依赖于阿拉伯糖的浓度。由于大肠杆菌存在利用阿拉伯糖的酶系，所以应用过程中，必须持续的添加阿拉伯糖来维持目的基因的充分表达。IPTG诱导型表达系统的应用远远广于阿拉伯糖诱导型表达系统，但该系统也存在着缺陷。IPTG本身对菌体有毒害作用，实验已证明IPTG抑制菌体的生长，所以在培养菌体过程中，何时添加IPTG诱导表达目的基因难以确定。同时，IPTG本身有比较昂贵，同样限制了该诱导表达系统在大工业生产中的利用。基于上面表达系统的缺陷，科研工作者开发出了温度诱导型表达系统和pH诱导型表达系统，即分别通过调节温度和pH来调控基因的表达。虽然这些表达系统具有应用前景，但是由于调节过程较为复杂，所以也限制了在实际生产中的应用。因此，利用合适的诱导系统来发酵生产PHB对于解决目前PHB生产成本过高的问题具有非常重要的意义。

发明内容

针对目前PHA发酵过程中代谢过程关键酶的诱导产生问题，本发明提供一种利用重组大肠杆菌通过环境诱导发酵生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法。具体以发酵生产PHB为例来阐述利用重组大肠杆菌发酵生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法。

本发明选择大肠杆菌作为基因工程改造的对象菌株，所用大肠杆菌菌株为大肠杆菌MG1655、JM109、DH5α、W3110或Xl1-blue中的一株。其中MG1655、JM109和W3110购买于ATCC(美国典型菌种保藏中心)；DH5α与X11-blue购买于DSMZ(德国微生物保藏中心)。真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)购买于CICC(中国工业微生物菌种保藏管理中心)。肥大产碱杆菌(Alcaligenes latus)、自养黄杆菌(Xanthobacter autotrophicus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)购买于ATCC(美国典型菌种保藏中心)。

本发明所述利用重组大肠杆菌发酵生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法，由下述步骤实现(具体以发酵生产PHA家族成员中的PHB为例来阐述)：

1.环境诱导型表达质粒的构建

基本方法是以大肠杆菌MG1655、JM109、W3110、DH5α或XL1-blue基因组为模板，通过设计引物PCR体外扩增环境诱导片段并将其命名为EPI；将EPI作为启动子插入到质粒pBluescript SK^-、pUC19、pUC18、pCL1920或pTrc99A中，取代原来的启动子序列，获得重组环境诱导型表达质粒。

(I)环境胁迫诱导(简称为EPI)片断克隆

根据GenBank上公布大肠杆菌MG1655、JM109、W3110、DH5α或XL1-blue的基因组序列，设计引物

pEPI primer1：5′-AATACATGTCCATACGCGCTGAACGTTGGTCA-3′

pEPI primer2：5′-ATACCCGGGAAGGTGGCTCCTACCCGTGATCCCT-3′

以大肠杆菌MG1655、JM109、W3110、DH5α或XL1-blue的基因组为模板，利用PCR(聚合酶链式反应)体外扩增环境胁迫诱导型启动子序列片断，命名为EPI，该环境诱导片段含有P_rpoS及P_rpoS下游的受DsrA调控的序列。

通过电泳检测目的条带的大小。引物中下划线部分为相应的酶切位点，前引物中为PscI酶切位点，后者为SmaI酶切位点。

(II)环境诱导型表达质粒的构建

将环境胁迫诱导片断EPI与克隆载体pBluescript SK^-、pUC19、pUC18、pCL1920或pTrc99A，利用PscI和SmaI核酸内切酶进行双酶切消化。PscI酶切反应温度为37℃，SmaI酶切反应温度为30℃。然后利用PCR产物回收试剂盒(购自OMEGA)回收纯化酶切的片段。将酶切片断利用T4连接酶(购买于MBI)连接。连接反应在16～25℃下进行，反应体系为5-15μl。经连接后得到重组的环境诱导型表达质粒。

进一步的优选方式，EPI作为启动子插入到质粒pBluescript SK^-中的PscI酶切位点与SmaI酶切位点之间，获得重组环境诱导型表达质粒，命名为pEPI。

(III)环境诱导型表达质粒的扩增

挑取LB平板中的大肠杆菌，培养过夜；将培养过夜的大肠杆菌DH5α按照1％的接种量转入装有50ml LB的300ml的三角瓶中培养，于30～37℃、180～250转/分钟下培养至OD₆₀₀为0.3～0.5。停止培养，置冰上20～30分钟，4℃，4000～5000转/分钟，离心10-20分钟，弃上清，加入冰冷的0.05～0.3mol/L CaCl₂溶液悬浮，冰上静置30～60分钟。离心浓缩，获得感受态细胞。放于-70℃保存。

将含有重组环境诱导型表达质粒pEPI的连接液加入50～100μl的DH5α感受态细胞中，混匀；置冰上30～40分钟；42℃热激，冰上静置2分钟，加入900μl的LB培养基，30～37℃，100转/分钟，培养1小时。将转化液涂布于含有质量百分比为1.5～2.0％的琼脂并加有终浓度为50～150微克/毫升的氨苄青霉素的固体LB培养基平板上，30～37℃条件下，静置培养12～16小时，调取单菌落筛选转化子。即将单菌落挑取转入LB液体培养基中，30～37℃，180～250转/分钟下培养过夜(培养基中添加氨苄青霉素至终浓度为50～150微克/毫升)。离心菌体，利用质粒提取试剂盒(购买于TIAN GEN公司)提取重组质粒pEPI，并验证质粒的正确性。

所述质粒pBluescript SK^-、pUC19、pUC18购自Fermentas公司，pCL1920购自德国微生物保藏中心，pTrc99A购自美国典型菌种保藏中心。

2.PHB表达重组质粒的构建

基本方法是将来源于真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、肥大产碱杆菌(Alcaligenes latus)、自养黄杆菌(Xanthobacter autotrophicus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的PHB合成酶基因phbCAB克隆至环境诱导型表达质粒中，获得PHB表达重组质粒。

上述PHB合成酶基因phbCAB的来源菌株优选真养产碱杆菌(A.eutrophus)。

根据Genbank公布的真养产碱杆菌的基因组序列，设计引物如下：

PHB primer1：5′-ATCCCCGGGGCGACCGGCAAAGGCGCGGCAGCTTCCA-3′

PHB primer2：5′-ATGGAATTCCAGCCCATATGCAGGCCGCCGTTGAGC-3′

以真养产碱杆菌的基因组序列为模板，PCR体外扩增phbCAB基因簇。

将上述PCR所得到的phbCAB片段和重组质粒利用SmaI和EcoRI进行双酶切处理，反应条件为：EcoRI于37℃下，SmaI于30℃下进行。酶切时间为12h-16h。将酶切反应液利用PCR产物回收试剂盒回收纯化。然后利用T4连接酶连接，反应温度为16℃-22℃，16h。从而获得表达phbCAB的重组质粒。

所述PHB合成酶基因phbCAB为来源于真养产碱杆菌的PHB合成过程中的三个关键酶基因：酮基硫酯酶(phbB)，羟基丁酰CoA脱氢酶(phbA)及PHB聚合酶(phbC)。

进一步的优选方式，phbCAB片段和重组质粒pEPI利用SmaI和EcoRI进行双酶切处理，然后利用T4连接酶连接，获得表达phbCAB的重组质粒pEPI-phbCAB。

3.产PHB重组大肠杆菌的构建及phbCAB表达重组质粒的扩增

基本方法是将含有表达phbCAB重组质粒的连接液转化大肠杆菌MG1655、JM109、W3110、DH5α或XL1-blue，通过氨苄青霉素抗性平板筛选产PHB重组大肠杆菌。

进一步的优选方式，将含有表达phbCAB重组质粒pEPI-phbCAB的连接液转化大肠 杆菌DH5α，获得产PHB的重组大肠杆菌DH5α/pEPI-phbCAB。

(4).发酵重组大肠杆菌生产PHB并检测

发酵重组大肠杆菌的发酵条件为：温度设为30～40℃，摇床转速设为150～300转/分，发酵时间36h～72h；

发酵培养基组成为Na₂HPO₄ 6g/L、KH₂PO₄ 3g/L、NaCl 0.5g/L、NH₄Cl 1g/L、酵母浸出物2g/L～4g/L、MgSO₄ 2mmol/L、CaCl₂ 0.1mmol/L、葡萄糖10g/L～30g/L。

挑取LB平板中筛选后的产PHB重组大肠杆菌，在无菌条件下用接种环接1～2环于20～100ml并加有终浓度为50～150微克/毫升的氨苄青霉素的发酵培养基中，30～40℃条件下，150～300转/分钟摇床振荡培养8～16小时，制得种子液；以1％～5％的接种量转接入装有100～400ml培养基的1000ml三角瓶中。发酵条件为30～40℃，150～300转/分钟。发酵36～72小时，每间隔4小时取样。

进一步的优选方式，发酵重组大肠杆菌的发酵条件为：温度设为37℃，摇床转速设为250转/分，发酵时间44h～48h。发酵培养基组成为Na₂HPO₄ 6g/L、KH₂PO₄ 3g/L、NaCl 0.5g/L、NH₄Cl 1g/L、酵母浸出物2g/L、MgSO₄ 2mmol/L、CaCl₂ 0.1mmol/L、葡萄糖20g/L。

PHB发酵检测

收集细胞：将所取的发酵液样品在4,000～5,000转/分钟的转速下离心10～30分钟，收集沉淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞2～3次后，4,000～5,000转/分钟离心10～30分钟收集细胞，烘干后称其干重。

将所得的干菌体，加入150微升的98％硫酸，沸水浴中加热60-90分钟，然后利用15％的氨水调节pH至2.2～2.6，经微孔滤膜过滤后，HPLC(高压液相色谱)检测PHB含量。检测条件为：分析柱C18；1‰的甲酸作流动相；紫外检测器；紫外波长为210nm。

本发明通过分析分析E.coli中环境压力应答基因的转录调控机制，首次利用基因工程技术成功构建了环境诱导型表达系统用于PHB的发酵生产。实现了在环境胁迫条件下大肠杆菌自发调控phbCAB基因的表达，积累PHB的过程。发酵结果表明，在不添加任何人工诱导剂的条件下，重组大肠杆菌DH5α/pEPI-phbCAB PHB含量高达到细胞干重的85.7％。本发明不仅解决了以往诱导剂添加问题，同时获得了PHB的高效率发酵菌株，从而大大降低了PHB发酵生产的成本，为PHB的大工业发酵生产找到了新的方法，该方法具有极为重要的广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明构建的环境胁迫诱导型质粒pEPI的酶切图谱。

图2为本发明构建的phbCAB表达质粒pEPI-phbCAB的酶切图谱。

图3为本发明所构建的重组大肠杆菌DH5α/pEPI-phbCAB的荧光显微照片。

图4为重组大肠杆菌DH5α/pEPI-phbCAB发酵结果(A)与对照组DH5α/pBluescriptSK--phbCAB发酵结果(B)的比较，其中对照组添加需要添加IPTG诱导phbCAB基因的表达，而DH5α/pEPI-phbCAB不添加任何诱导剂。

具体实施方式

实施例1、环境诱导型表达质粒的构建

1.大肠杆菌MG1655基因组的提取

根据细菌基因组提取试剂盒说明提取大肠杆菌MG1655的基因组，并通过琼脂糖电泳检测。琼脂糖浓度为质量百分比0.8％。

2.环境诱导型片断(EPI)的克隆

根据GenBank上公布大肠杆菌的基因组序列(2865574-2866200)，设计引物

pEPI primer1：5′-AATACATGTCCATACGCGCTGAACGTTGGTCA-3′与

pEPI primer2：5′-ATACCCGGGAAGGTGGCTCCTACCCGTGATCCCT-3′

以所提取的大肠杆菌MG1655的基因组为模板，利用PCR(聚合酶链式反应)体外扩增环境诱导型片断序列。

PCR反应体系如下：(引物浓度为20μmol/L)

10×缓冲液    5μl；

25mmol/L      MgCl₂4μl；

10mmol/L      四种dNTP混合液1μl；

上下游引物各  1μl；

TaqDNA聚合酶  0.5μl；

模板DNA1μl，加水补至50μl；

PCR反应条件：97℃预变性10分钟，94℃变性60秒，58℃退火30秒，72℃延伸60秒，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。电泳检测片段的大小。琼脂糖浓度为0.8％。

引物中下划线部分为相应的酶切位点，前引物中为PscI酶切位点，后者为SmaI酶切位点。

3.环境胁迫诱导型表达质粒的构建

(1)酶切反应

将环境诱导型片断与pBluescript SK^-利用PscI和SmaI核酸内切酶进行双酶切消化。PscI酶切反应温度为37℃，SmaI酶切反应温度为30℃。然后利用PCR产物回收试剂盒(购自OMEGA公司)回收纯化酶切的片段。

(2)连接反应

利用T4连接酶(购买于MBI公司)连接，反应组成体系为：

环境诱导型片断：6μl

pBluesc ript SK^-片断：2μl

连接液缓冲液(10X)：1μl

T4连接酶：1μl

连接反应在22℃下进行，反应时间为4小时，反应体系为10μl。经连接后得到重组环境诱导型表达质粒pEPI。

(3)感受态细胞的制备

挑取LB平板中的大肠杆菌DH5α，培养过夜；将培养过夜的大肠杆菌DH5α按照1％的接种量转入装有50ml LB的300ml的三角瓶中培养，于37℃、225转/分钟下培养至OD₆₀₀为0.4。停止培养，置冰上20分钟，4℃，4000转/分钟，离心10分钟，弃上清，加入冰冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液悬浮，冰上静置30分钟。离心浓缩。获得感受态细胞。放于-70℃保存。

(4)重组环境诱导型表达质粒pEPI的验证扩增

将含有重组质粒pEPI的10μl的连接液加入100μl的DH5α感受态细胞中，混匀；置冰上30分钟；42℃热激，冰上静置2分钟，加入900μl的LB培养基，37℃，100转/分钟，培养1小时。将转化液涂布于含有质量体积比为1.5％的琼脂并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄青霉素的固体LB培养基平板上，37℃条件下，静置培养16小时，挑取单菌落筛选转化子。

将单菌落挑取转入含有100微克/毫升的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，225转/分钟下培养过夜。利用质粒试剂盒提取重组质粒pEPI，验证质粒的大小。

重组质粒图谱见图1。

实施例2、PHB重组表达质粒的构建

PHB重组大肠杆菌的构建：

将PHB合成酶基因phbCAB插入到重组质粒pEPI的多克隆位点处，构建PHB合成酶表达重组质粒，命名为pEPI-phbCAB。将所构建的PHB合成酶表达重组质粒转入大肠杆菌，培养检测PHB在该环境诱导表达系统调控下积累。

(1)PHB重组质粒pEPI-phbCAB的构建

根据Genbank公布的真养产碱杆菌的基因组序列，设计引物如下：

PHB primer1：5′-ATCCCCGGGGCGACCGGCAAAGGCGCGGCAGCTTCCA-3′

PHB primer2：5′-ATGGAATTCCAGCCCATATGCAGGCCGCCGTTGAGC-3′

以以真养产碱杆菌的基因组序列为模板为模板，PCR体外扩增phbCAB基因簇。

将上述PCR所得到的phbCAB片段和质粒pEPI利用SmaI(30℃)和EcoRI(37℃)进行双酶切消化，反应时间为16h，然后利用PCR产物回收试剂盒(购买于OMEGA公司)回收纯化。利用T4连接酶连接，反应组成体系为：

phbCAB基因片段：6μl

pEPI片断：2μl

连接液缓冲液(10X)：1μl

T4连接酶：1μl

连接反应在22℃下进行，反应时间为4小时，反应体系为10μl。经连接后得到批HB重组表达质粒pEPI-phbCAB，该重组质粒pEPI-phbCAB存于连接液中。

所述PHB合成酶基因phbCAB为来源于真养产碱杆菌的PHB合成过程中的三个关键酶基因：酮基硫酯酶(phbB)，羟基丁酰CoA脱氢酶(phbA)及PHB聚合酶(phbC)。

实施例3、PHB重组大肠杆菌的构建

将含有重组环境诱导型表达质粒pEPI的连接液加入100μl的DH5α感受态细胞中，混匀；置冰上30分钟；42℃热激，冰上静置2分钟，加入900μl的LB培养基，37℃，100转/分钟，培养1小时。将转化液涂布于含有质量体积比为质量体积比为2.0％的琼脂并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄青霉素的固体LB培养基平板上，37℃条件下，静置培养16小时，调取单菌落筛选转化子。即将单菌落挑取转入LB液体培养基中，37℃，225转/分钟下培养过夜(培养基中添加氨苄青霉素至终浓度为100微克/毫升)。离心菌体，利用质粒提取试剂盒(购买于TIAN GEN公司)提取重组质粒pEPI，并验证质粒的正确性。含有pEPI-phbCAB重组质粒的大肠杆菌DH5α命名为DH5α/pEPI-phbCAB。

重组质粒pEPI-phbCAB酶切图谱见图2。

实施例4、PHB重组大肠杆菌DH5α/pEPI-phbCAB的发酵及检测培养基：发酵培养基：

Na₂HPO₄ 6g/L KH₂PO₄ 3g/L NaCl 0.5g/L NH₄Cl 1g/L酵母浸出物2g/LMgSO₄ 2mmol/L CaCl₂ 0.1mmol/L 葡萄糖20g/L。

挑取LB平板中的PHB重组大肠杆菌DH5α/pEPI-phbCAB，在无菌条件下用接种环接1环于50ml并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄青霉素的M9加富培养基中(添加2％的葡萄糖)，37℃条件下，250转/分钟摇床振荡培养12小时，制得种子液；以2％的接种量转接入装有200ml培养基的1000ml三角瓶中。发酵条件为37℃，250转/分钟。其中对照组为重组大肠杆菌DH5α/pBluescript SK^--phbCAB，对照组培养至12h，向发酵液中加入IPTG至IPTG终浓度达为0.4毫摩尔/升。发酵时间为48小时，每间隔4小时取样。

所述质粒pBluescript SK^--phbCAB为带有phbCAB基因的pBluescript SK^-质粒，通过IPTG的诱导而表达。构建所用引物为PHB primer1与PHB primer2。

PHB发酵检测

收集细胞：将所取的发酵液样品在4,000转/分钟的转速下离心20分钟，收集沉淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞2次后，4,000转/分钟离心20分钟收集细胞，烘干后称其干重。

PHB检测：将所得的干菌体，加入150微升的浓硫酸沸水浴中加热60分钟，然后利用15％的氨水调节pH至2.5，经微孔滤膜过滤后，HPLC(高压液相色谱)检测PHB含量。检测条件为：分析柱C18；1‰的甲酸作流动相；紫外检测器；紫外波长为210nm。检测结果见图4。

通过荧光显微照片图3可以看出，重组大肠杆菌DH5α/pEPI-phbCAB细胞内的明显的PHB颗粒。

通过图4可以看出，重组大肠杆菌DH5α/pEPI-phbCAB在不添加任何诱导剂的条件下可以以廉价的葡萄糖为底物发酵生产PHB，PHB含量达到85.7％。而对照组DH5α/pBluescript SK^--phbCAB在添加IPTG为诱导剂的条件下，PHB含量为45％。结果表明该表达系统可以高效的用于PHB的非人工诱导型发酵生产。

因此，利用该表达系统发酵生产PHB的方法在实际大工业发酵生产中具有巨大的应用前景。

序列表

<110>山东大学

<120>一种利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法

<141>2008-7-6

<160>4

<210>1

<211>32

<212>DNA

<213>pEPI primer 1(上游引物)

]  <400>1

aatacatgtc catacgcgct gaacgttggt ca         32

<210>2

<211>34

<212>DNA

<213>pEPI primer 2(下游引物)

<400>2

atacccggga aggtggctcc tacccgtgat ccct       34

<210>3

<211>37

<212>DNA

<213>PHB primer 1(上游引物)

<400>3

atccccgggg cgaccggcaa aggcgcggca gcttcca    37

<210>4

<211>36

<212>DNA

<213>PHB primer 2(下游引物)

<400>4

atggaattcc agcccatatg caggccgccg ttgagc     36

Claims (5)

1.一种利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法，其步骤包括：

(1)一种环境诱导型表达质粒的构建；

(2)聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒的构建；

(3)获得产聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌；

(4)发酵重组大肠杆菌生产聚羟基脂肪酸酯并检测；

其特征是：步骤(1)所述环境诱导型表达质粒的构建方法是以大肠杆菌MG1655、JM109、W3110、DH5α或XL1-blue基因组为模板，通过设计引物PCR体外扩增环境诱导片段并将其命名为EPI；将EPI作为启动子插入到质粒pBluescript SK^-、pUC19、pUC18、pCL1920或pTrc99A中，取代原来的启动子序列，获得重组环境诱导型表达质粒；步骤(2)所述聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒的构建的方法是将来源于真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phbCAB克隆至环境诱导型表达质粒中，获得聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒pEPI-phbCAB；步骤(3)所述获得产聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌的方法是将聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒转化大肠杆菌MG1655、JM109、W3110、DH5α或XL1-blue，获得产聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌；步骤(4)所述发酵重组大肠杆菌的发酵条件为：温度设为30～40℃，摇床转速设为150～300转/分，发酵时间36h～72h；发酵培养基组成为Na₂HPO₄ 6g/L、KH₂PO₄ 3g/L、NaCl0.5g/L、NH₄Cl 1g/L、酵母浸出物2g/L～4g/L、MgSO₄ 2mmol/L、CaCl₂0.1mmol/L、葡萄糖 10g/L～30g/L；

上述环境诱导片段EPI含有P_rpoS及P_rpoS下游的受DsrA调控的序列；其以大肠杆菌MG1655或W3110的基因组为模板，以pEPI primer 1和pEPI primer 2为引物，PCR体外扩增获得；其中，所述pEPI primer 1和pEPI primer 2分别是：

pEPI primer 1：5′-AATACATGTCCATACGCGCTGAACGTTGGTCA-3′

pEPI primer 2：5′-ATACCCGGGAAGGTGGCTCCTACCCGTGATCCCT-3′。

2.根据权利要求1所述利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征是：步骤(1)所述EPI作为启动子插入到质粒pBluescript SK^-中的PscI酶切位点与SmaI酶切位点之间，获得重组环境诱导型表达质粒pEPI。

3.根据权利要求1所述利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征是：步骤(3)所述聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒转化大肠杆菌DH5α，获得产聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌DH5α/pEPI-phbCAB。

4.根据权利要求1所述利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征是：步骤(4)所述发酵重组大肠杆菌的发酵条件为：温度设为37℃，摇床转速设为250转/分，发酵时间44h～48h。

5.根据权利要求1所述利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征是：步骤(4)所述发酵培养基组成为Na₂HPO₄ 6g/L、KH₂PO₄ 3g/L、NaCl 0.5g/L、NH₄Cl1g/L、酵母浸出物2g/L、MgSO₄ 2mmol/L、CaCl₂ 0.1mmol/L、葡萄糖20g/L。

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