CN112553133B - 木糖诱导生产n-乙酰神经氨酸的工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用木糖诱导生产N‑乙酰神经氨酸基因工程菌的构建及其应用。本发明在基因组上整合N‑乙酰氨基葡萄糖合成途径，并引入N‑乙酰氨基葡萄糖2‑差向异构酶基因bAGE以及N‑乙酰神经氨酸裂合酶基因shNAL，构建N‑乙酰神经氨酸合成途径，并敲除其分解代谢途径的关键基因nanTEK。同时对合成N‑乙酰神经氨酸所需的前体物质的代谢途径进行多拷贝强化并对部分旁路代谢途径进行敲除，得到一株N‑乙酰神经氨酸高产菌。摇瓶发酵36h N‑乙酰神经氨酸产量最高可达10.8g/L，生产强度可达0.3g/(L×h)，为目前报道的最高值，具有重要的工业应用价值。

Description

木糖诱导生产N-乙酰神经氨酸的工程菌及其应用
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用木糖诱导生产N-乙酰神经氨酸基因工程菌的构建及其应用。
背景技术：
神经氨酸又称唾液酸，是一类含有九个碳原子具有吡喃糖结构的酸性氨基糖。N-乙酰神经氨酸(N-acetyl neuraminic acid,Neu5Ac)是唾液酸家族中最重要的一员，在生命活动过程中具有重要意义。Neu5Ac通常位于细胞膜表面糖蛋白和糖脂的末端，在细胞识别和信号传输中起着十分关键的作用。合理摄入Neu5Ac可以促进婴儿大脑发育，维持老年人大脑正常功能，预防老年痴呆。其衍生物扎那米韦已经被设计用来抑制甲型和乙型流感病毒，一些其他的衍生物也可被用来作为靶向治疗癌症的纳米载体的稳定剂，具有重大市场价值。
Neu5Ac的合成方法除了从燕窝、蛋黄等天然材料中提取，还有酶催化法、全细胞催化法和微生物发酵法等多种方法。多年前就有学者使用Neu5Ac裂合酶作催化剂，以N-乙酰氨基甘露糖(ManNAc)和丙酮酸作为底物，酶法合成Neu5Ac。后来研究人员发现ManNAc可以用N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶催化N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)生成，大大降低了酶法合成Neu5Ac的成本，但需要外源添加ATP等物质使得总体生产成本依然较高。而全细胞催化法虽然不需要外源添加辅助因子也不需要分离提纯酶，但是GlcNAc转化率均低于60％，大大增加了GlcNAc的回收成本以及Neu5Ac纯化分离的难度，其次酶催化法过程复杂，需要培养菌体、收集菌体、缓冲体系催化生产等多个步骤。这些问题极大的限制了工业上利用全细胞催化法生产Neu5Ac的发展。
因此微生物发酵法逐渐成为了生产Neu5Ac的热点方向。微生物发酵法可以直接以葡萄糖等廉价碳源作为底物，不需要添加任何其他前体物质或者辅助因子即可合成Neu5Ac，具有广阔的应用前景和市场价值。Zhang等人利用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)作为生产菌株，摇瓶发酵得到Neu5Ac产量为2.18g/L。Pang等人利用大肠杆菌(E.coli)作为生产菌株，摇瓶发酵120h得到Neu5Ac产量为14.23g/L，但生产强度仅有0.12g/(L×h)。以上产量均为目前报道的不同宿主细胞中的最高产量，但仍然无法满足工业生产需求。
为了获得更高生产强度的Neu5Ac生产菌株，本专利通过对大肠杆菌代谢途径进行理性改造，构建Neu5Ac合成途径，并通过合理分配碳源等代谢工程策略构建出一株Neu5Ac产量高、生产周期明显缩短的大肠杆菌基因工程菌。
发明内容：
针对上述存在问题，本发明目的是提供一种利用木糖诱导生产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌，及其构建与应用，并制定了相应的发酵过程控制方案，有良好的工业应用前景。
本发明技术方案概述如下：
本发明提供了一株生产Neu5Ac的大肠杆菌基因工程菌，具有木糖诱导型启动子PxylF控制的来源于T7噬菌体的RNA聚合酶；整合了单拷贝由PT7启动子控制的氨基葡萄糖-6-磷酸N-乙酰转移酶基因Sc-gna1；双拷贝由PT7启动子控制的果糖-6-磷酸转氨酶基因glmS；并敲除了N-乙酰氨基葡萄糖分解代谢的相关基因nagA、nagB、nagC、nagE、manX、manY、manZ。在基因组上整合了由PT7启动子控制的N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶基因bAGE以及双拷贝由PT7启动子控制的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shNAL，并敲除Neu5Ac分解代谢途径的关键基因N-乙酰神经氨酸转运蛋白基因nanT、N-乙酰氨基甘露糖-6-磷酸差向异构酶基因nanE、N-乙酰氨基甘露糖激酶基因nanK，构建N-乙酰神经氨酸合成通路。整合由Ptrc启动子控制的磷酸转移酶基因yqaB和磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶基因pck，强化合成Neu5Ac所需前体物ManNAc和丙酮酸的供应。敲除丙酮酸脱氢酶基因poxB，乳酸脱氢酶基因ldhA，乙酸激酶基因ackA，丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB，进一步增加前体物质丙酮酸的积累。
所述T7RNA聚合酶基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
所述氨基葡萄糖-6-磷酸N-乙酰转移酶基因Sc-gna1源自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
所述果糖-6-磷酸转氨酶基因glms源自大肠杆菌(E.coli W3110)，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；
所述N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶基因bAGE源自项圈藻(Anabaena sp.)CH1，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；
所述N-乙酰氨基葡萄糖N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shNAL源自人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示；
所述磷酸转移酶基因yqaB源自大肠杆菌(E.coli W3110)，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；
所述磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶基因pck源自大肠杆菌(E.coli W3110)，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示。
优选地，所述基因工程菌以大肠杆菌E.coli W3110为出发菌株；
更优选地，所述基因工程菌为E.coli W3110 Neu5Ac。
本发明还提供上述生产Neu5Ac的基因工程菌的构建方法，具体如下：
本发明中采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli W3110进行定向改造，具体包括如下步骤：
(1)在lacIZ基因位点上整合由木糖启动子PxylF控制的T7RNA聚合酶(核苷酸序列为序列表SEQ ID NO:3)。
(2)构建GlcNAc合成通路。首先敲除GlcNAc的分解代谢途径nagA(Gene ID:945289)、nagB(Gene ID:945290)、nagC(Gene ID:945285)、nagE(Gene ID:945292)、manX(Gene ID:946334)、manY(Gene ID:946332)、manZ(Gene ID:946342)，同时在nagE基因位点上整合由PT7启动子控制的氨基葡萄糖-6-磷酸N-乙酰转移酶基因Sc-gna1(核苷酸序列为序列表SEQ ID NO:1)；在假基因位点yjiV(Gene ID:2847669)和ycjV(Gene ID:945890)整合由PT7启动子控制的果糖-6-磷酸转氨酶基因glms(核苷酸序列为序列表SEQ ID NO:2)。
(3)构建Neu5Ac合成通路。首先敲除Neu5Ac的分解代谢途径nanT(Gene ID:947740)、nanE(Gene ID:947745)、nanK(Gene ID:947757)，同时整合由PT7启动子控制的N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶基因bAGE(核苷酸序列为序列表SEQ ID NO:4)，在假基因位点gapC(Gene ID:2847738)和ylbE(Gene ID:4056025)上整合由PT7启动子控制的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shNAL(核苷酸序列为序列表SEQ ID NO:5)。
(4)强化前体物质ManNAc的积累。在假基因位点ilvG(Gene ID:2847699)上整合由Ptrc启动子控制的磷酸转移酶基因yqaB(核苷酸序列为序列表SEQ ID NO:6)
(5)加强前体物质丙酮酸的积累。在假基因位点ygaY(Gene ID:2847696)上整合由Ptrc启动子控制的磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶基因pck(核苷酸序列为序列表SEQ ID NO:7)，并敲除了部分丙酮酸分解代谢途径的关键基因：丙酮酸脱氢酶基因poxB(Gene ID:946132)，乳酸脱氢酶基因ldhA(Gene ID:946315)，乙酸激酶基因ackA(Gene ID:946775)，丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB(Gene ID:945514)。
本发明还提供了利用上述基因工程菌发酵生产Neu5Ac的方法：
(1)活化斜面培养：用接种环从-80℃冰箱保菌管中接种1-2环菌种，均匀涂布于斜面培养基中，35-39℃培养8-16h，转接到第二代斜面培养基中，35-39℃培养8-16h；
(2)种子瓶培养：用接种环将斜面上的菌体接种到装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中用于制备种子液，三角瓶使用十二层纱布封口，在35-39℃，180-240r/min的条件下振荡培养8-16h；
(3)发酵培养：将种子液按10-15％接种量接种到发酵培养基中，在35-39℃，180-240r/min的条件下振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在6.8-7.2，当通过苯酚红指示剂观察到pH没有缓慢降低甚至有所升高，表明菌体缺糖，补加0.5-2mL 60％(m/v)葡萄糖溶液，发酵周期为24-36h，产量达到6-10.8g/L，生产强度可达0.25-0.3g/(L×h)。
优选的，所述斜面培养基成分为：酵母粉3-8g/L、蛋白胨5-15g/L、NaCl 3-8g/L、牛肉膏5-15g/L、蔗糖0.5-2g/L、琼脂粉15-30g/L，其余为水。
优选的，所述种子培养基成分为：葡萄糖15-25g/L，酵母粉2-5g/L，(NH4)2SO4 1-5g/L，KH2PO4 1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.5-2.5g/L，柠檬酸1-5g/L，FeSO4·7H2O 1-5mg/L，MnSO4·7H2O 1-5mg/L，VH 0.05-5mg/L，VB1 0.1-2mg/L，微量元素混合液1-3ml/L，消泡剂1-2滴，其余为水，pH 6.8-7.2。
优选的，所述发酵培养基成分为：葡萄糖15-30g/L，木糖5-20g/L，酵母粉2-5g/L，(NH4)2SO42-10g/L，KH2PO44-10g/L，MgSO4·7H2O 2-8g/L，柠檬酸1-5g/L，NaCl 0.5-3g/L，FeSO4·7H2O 5-30mg/L，MnSO4·7H2O 1-5mg/L，CaCl2·2H2O 15-30mg/L,VH 0.05-2mg/L，VB10.1-1mg/L，微量元素混合液1-3ml/L，苯酚红指示剂1-3％，消泡剂1-2滴，其余为水，pH6.8-7.2。
优选的，微量元素混合液成分为：Na2MoO4·2H2O 1-3g/L，NiCl2·6H2O 0.5-1.5g/L，CaCl2·2H2O 2-8g/L，CuSO4·5H2O 0.1-0.5g/L，Al2(SO4)3·18H2O 1-1.5g/L，CoCl2·6H2O 0.5-1.5g/L，ZnSO4·2H2O 0.1-0.5g/L，H3BO30.05-0.2g/L，其余为水。
有益效果：
本发明以E.coli W3110为出发菌株，在基因组上整合N-乙酰氨基葡萄糖合成途径，并引入来自项圈藻的N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶基因bAGE以及来自人葡萄球菌的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shNAL，构建N-乙酰神经氨酸合成途径，并敲除其分解代谢途径的关键基因nanTEK。同时对合成N-乙酰神经氨酸所需的前体物质的代谢途径进行多拷贝强化并对部分旁路代谢途径进行敲除，得到一株N-乙酰神经氨酸高产菌。摇瓶发酵36h N-乙酰神经氨酸产量最高可达10.8g/L，生产强度可达0.3g/(L×h)，为目前报道的最高值，具有重要的工业应用价值。
附图说明：
图1：nanK基因敲除片段构建及电泳验证图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌对照；5：阳性菌鉴定片段。
图2：shNAL基因整合片段与gapC基因敲除片段及电泳验证图。其中：M：1kb DNAmarker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：PT7-shNAL基因片段；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段。
图3：基因工程菌产量图。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1：E.coli W3110 Neu5Ac基因工程菌的构建
采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对基因进行定向改造。本发明中采用的基因编辑方法参照文献(Li Y,Lin Z,Huang C,et al.Metabolic engineering of Escherichiacoli using CRISPR–Cas9 meditated genome editing.Metabolic engineering,2015,31:13-21.)进行。
该方法的具体步骤如下：
(1)pGRB质粒的构建：
使用CRISPR RGEN Tools设计靶序列(PAM:5’-NGG-3’)用于切割靶基因。合成正向引物和反向互补引物后，各取10μL于PCR管中，混合均匀后通过单链DNA的退火制备包含靶序列的DNA片段。反应条件：预变性95℃，5min；退火50℃，1min。将得到的DNA片段与通过反向PCR获得的线性化pGRB载体通过同源重组连接，得到pGRB质粒。同源重组所用试剂盒为
Figure BDA0002826855090000061
OneStepCloningKit系列。
(2)重组DNA片段的构建：
敲除目的基因所需重组DNA片段为目的基因上游同源臂和下游同源臂两个片段重叠而成。整合目的基因所需重组片段为整合位点基因的上、下游同源臂和目的基因三个片段重叠而成。以待敲除基因或整合目的基因的待整合位点的上、下游序列为模板，设计上、下游同源臂引物，通常使同源臂长度在500bp左右，以待整合基因为模板，设计整合基因的扩增引物。通过PCR的方法分别扩增上下游同源臂和目的基因片段后，再经重叠PCR制备重组片段。
(3)感受态细胞的制备：
在37℃，220rpm条件下，用装有100mL2×YT培养基的三角瓶培养菌体至OD600＝0.4-0.6时进行感受态制备。当细胞内携带pRedCas9质粒时，培养温度调整至32℃，且当菌体OD600＝0.1-0.2时添加0.1M的IPTG。制备过程参照常规标准操作。
(4)pGRB质粒和重组DNA的转化：
将pGRB质粒和重叠DNA片段同时电转化至含有pRedCas9的电转感受态细胞中。将经过电转化的菌体复苏培养2h后涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。用上游同源臂的上游引物和下游同源臂的下游引物，或设计专门的鉴定引物，进行菌落PCR验证，筛选阳性重组子。
(5)质粒的消除：
将阳性重组子置于含有0.2％阿拉伯糖的LB培养基中过夜培养后涂布于含有奇霉素抗性的LB平板上，再次32℃过夜培养。挑选单菌落对点含有氨苄青霉素和奇霉素抗性的LB平板，挑选氨苄青霉素平板不生长，奇霉素抗性平板生长的单菌落即为消除pGRB质粒的重组菌株。将阳性重组子转接到无抗性的LB液体培养基中，42℃过夜培养后涂布于无抗性的LB平板上，37℃过夜培养。挑选单菌落对点含有奇霉素抗性和无抗性的LB平板，挑选奇霉素抗性平板不生长，无抗性平板生长的单菌落即为消除pRedCas9质粒的重组菌株。
菌株构建的具体方法如下：
(1)前体物GlcNAc合成通路的构建
以大肠杆菌(E.coli W3110)基因组为模板，根据其nagBAC基因簇的上、下游序列设计上游同源臂引物nagBAC-F1、nagBAC-R1和下游同源臂引物nagBAC-F2、nagBAC-R2，先通过PCR得到其上、下游同源臂，再通过重叠PCR的方法获得重叠片段(nagBAC-U—nagBAC-D)。通过gRNA搜索工具(http://www.rgenome.net/cas-designer)查找合适的gRNA序列，合成gRNA-nagBAC-S与gRNA-nagBAC-A序列，通过PCR退火将两条单链引物互补配对以得到双链gRNA-nagBAC，将其与pGRB线性化载体同源重组得到pGRB-nagBAC。将重叠片段和pGRB-nagBAC电转化至含有pREDCas9载体的E.coli W3110感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用菌落PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-nagBAC，最终获得成功敲除nagBAC的阳性菌株。
以同样的方法继续敲除nagE、manXYZ基因，阻断GlcNAc的分解和转运途径。
以大肠杆菌(E.coli W3110)基因组为模板，根据其nagE基因簇的上、下游序列设计上游同源臂引物nagE-F1、nagE-R1和下游同源臂引物nagE-F2、nagE-R2，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组为模板，根据其Sc-gna1基因的序列设计引物，启动子PT7则设计在nagE基因上游同源臂的下游引物和Scgna1基因的上游引物中，先通过PCR得到其上下游同源臂(nagE-U、nagE-D)及目的基因(PT7-gna1)，再通过重叠PCR的方法获得重叠片段(nagE-U—PT7-gna1—nagE-D)。通过gRNA搜索工具(http://www.rgenome.net/cas-designer)查找合适的gRNA序列，合成gRNA-nagE-S与gRNA-nagE-A序列，通过PCR退火将两条单链引物互补配对以得到双链gRNA-nagE，将其与pGRB线性化载体同源重组得到pGRB-nagE。将重叠片段和pGRB-nagE电转化至含有pREDCas9载体的成功敲除nagBAC的阳性菌株感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用菌落PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-nagE，最终获得成功敲除nagE基因并整合PT7-gna1的阳性菌株。
以同样的方法在基因位点lacIZ上整合PxylF-T7RNAP，在假基因位点yjiV和ycjV上整合PT7-glms。构建并强化GlcNAc合成通路。
(2)Neu5Ac合成通路的构建
以大肠杆菌(E.coli W3110)基因组为模板，根据其nanK基因的上、下游序列设计上游同源臂引物nanK-F1、nanK-R1和下游同源臂引物nanK-F2、nanK-R2，先通过PCR得到其上下游同源臂，再通过重叠PCR的方法获得重叠片段(nanK-U—nanK-D)。通过gRNA搜索工具(http://www.rgenome.net/cas-designer)查找合适的gRNA序列，合成gRNA-nanK-S与gRNA-nanK-A序列，通过PCR退火将两条单链引物互补配对以得到双链gRNA-nanK，将其与pGRB线性化载体同源重组得到pGRB-nanK。将重叠片段和pGRB-nanK电转化至含有pREDCas9载体的步骤(1)获得的阳性转化子感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用菌落PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-nanK，最终获得成功敲除nanK的阳性菌株。
重叠片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图1。其中：M：1kb DNAmarker；1：上游同源臂251bp；2：下游同源臂228bp；3：重叠片段459bp；4：原菌对照903bp；5：阳性菌鉴定片段450bp。
以同样的操作敲除nanT、nanE、poxB、ldhA、ackA、pflB基因。敲除GlcNAc转运途径、前体物ManNAc的分解途径和丙酮酸的部分代谢途径。
以大肠杆菌(E.coli W3110)基因组为模板，根据其gapC基因簇的上、下游序列设计上游同源臂引物gapC-F1、gapC-R1和下游同源臂引物gapC-F2、gapC-R2，以人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)基因组为模板，根据其shNAL基因的序列设计引物，启动子PT7则设计在gapC基因上游同源臂的下游引物和shNAL基因的上游引物中，先通过PCR得到其上下游同源臂(gapC-U、gapC-D)及目的基因(PT7-shNAL)，再通过重叠PCR的方法获得重叠片段(gapC-U—PT7-shNAL—gapC-D)。通过gRNA搜索工具(http://www.rgenome.net/cas-designer)查找合适的gRNA序列，合成gRNA-gapC-S与gRNA-gapC-A序列，通过PCR退火将两条单链引物互补配对以得到双链gRNA-gapC，将其与pGRB线性化载体同源重组得到pGRB-gapC。将重叠片段和pGRB-gapC电转化至含有pREDCas9载体的上步构建的阳性转化子感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用菌落PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-gapC，最终获得成功敲除gapC基因并整合PT7-shNAL的阳性菌株。
重叠片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图2。其中：M：1kb DNAmarker；1：上游同源臂476bp；2：下游同源臂505bp；3：目的基因882bp；4：重叠片段1892bp；5：原菌对照1681bp；6：阳性菌鉴定片段1892bp。
以同样的方法在基因位点nanTE上整合PT7-bAGE，在假基因位点ylbE、ilvG和ygaY上整合PT7-shNAL、Ptrc-yqaB、Ptrc-pck。构建并强化Neu5Ac合成通路，最终构建菌株E.coliW3110 Neu5Ac。
表1 菌株构建过程中所涉及的引物
Figure BDA0002826855090000091
Figure BDA0002826855090000101
Figure BDA0002826855090000111
实施例2：利用基因工程菌E.coli W3110 Neu5Ac发酵生产Neu5Ac的方法
(1)活化斜面培养：
斜面培养基成分为：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、牛肉膏10g/L、蔗糖1g/L、琼脂粉20g/L。
用接种环从-80℃冰箱保菌管中接种2环菌种，均匀涂布于斜面培养基中，37℃培养12h，转接到第二代斜面培养基中，37℃培养12h。
(2)种子瓶培养：
种子培养基成分为：葡萄糖20g/L，酵母粉3g/L，(NH4)2SO42g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，柠檬酸2g/L，FeSO4·7H2O 2.8mg/L，MnSO4·7H2O 1.2mg/L，VH 0.1mg/L，VB1 0.5mg/L，微量元素混合液1ml/L，消泡剂1滴，其余为水，pH 7.0。
微量元素混合液成分为：Na2MoO4·2H2O 1.25g/L，NiCl2·6H2O 0.8g/L，CaCl2·2H2O 5g/L，CuSO4·5H2O 0.2g/L，Al2(SO4)3·18H2O 1.25g/L，CoCl2·6H2O 0.9g/L，ZnSO4·2H2O 0.25g/L，H3BO3 0.07g/L，其余为水。
用接种环将斜面上的菌体接种到装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中用于制备种子液，三角瓶使用十二层纱布封口，在37℃，220r/min的条件下振荡培养12h。
(3)摇瓶发酵：
发酵培养基成分为：葡萄糖20g/L，木糖10g/L(发酵0h添加)，酵母粉3g/L，(NH4)2SO44g/L，KH2PO46.67g/L，MgSO4·7H2O 2.5g/L，柠檬酸3.55g/L，NaCl1g/L，FeSO4·7H2O10mg/L，MnSO4·7H2O 1.2mg/L，CaCl2·2H2O 25mg/L,VH 0.1mg/L，VB1 0.5mg/L，微量元素混合液1ml/L，苯酚红指示剂2％，消泡剂1滴，其余为水，pH 7.0。
微量元素混合液成分为：Na2MoO4·2H2O 1.25g/L，NiCl2·6H2O 0.8g/L，CaCl2·2H2O 5g/L，CuSO4·5H2O 0.2g/L，Al2(SO4)3·18H2O 1.25g/L，CoCl2·6H2O 0.9g/L，ZnSO4·2H2O 0.25g/L，H3BO3 0.07g/L，其余为水。
将种子液按10％接种量接种到装有发酵培养基的500mL挡板瓶中，使其终体积为30mL，使用十二层纱布封口，在37℃，220r/min的条件下振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在6.8-7.2，当通过苯酚红指示剂观察到pH没有缓慢降低甚至有所升高，表明菌体缺糖，补加1mL 60％(m/v)葡萄糖溶液，摇瓶发酵36h后N-乙酰神经氨酸产量最高可达10.81g/L，最高生产强度可达0.3g/(L×h)，前体物质及Neu5Ac产量和OD600如图3所示。
实施例3：利用基因工程菌E.coli W3110 Neu5Ac发酵生产Neu5Ac的方法
(1)活化斜面培养：用接种环从-80℃冰箱保菌管中接种1-2环菌种，均匀涂布于斜面培养基中，37℃培养12h，转接到第二代斜面培养基中，37℃培养12h；
(2)种子瓶培养：用接种环将斜面上的菌体接种到装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中用于制备种子液，三角瓶使用十二层纱布封口，在37℃，220r/min的条件下振荡培养12h；
(3)发酵培养：将种子液按10％接种量接种到装有发酵培养基的500mL挡板瓶中，使其终体积为30mL，使用十二层纱布封口，在35℃，180r/min的条件下振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在6.8-7.2，当通过苯酚红指示剂观察到pH没有缓慢降低甚至有所升高，表明菌体缺糖，补加0.5mL 60％(m/v)葡萄糖溶液，发酵周期为24h，产量达到6g/L，生产强度可达0.25g/(L×h)。
斜面培养基成分为：酵母粉3g/L、蛋白胨5g/L、NaCl 3g/L、牛肉膏5g/L、蔗糖0.5g/L、琼脂粉15g/L，其余为水。
种子培养基成分为：葡萄糖15g/L，酵母粉2g/L，(NH4)2SO4 1g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸1g/L，FeSO4·7H2O 1mg/L，MnSO4·7H2O 1mg/L，VH 0.05mg/L，VB1 0.1mg/L，微量元素混合液1ml/L，消泡剂1滴，其余为水，pH 6.8-7.2。
发酵培养基成分为：葡萄糖15g/L，木糖5g/L(发酵0h添加)，酵母粉2g/L，(NH4)2SO42g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，柠檬酸1g/L，NaCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 5mg/L，MnSO4·7H2O 1mg/L，CaCl2·2H2O 15mg/L，VH 0.05mg/L，VB1 0.1mg/L，微量元素混合液1ml/L，苯酚红指示剂1％，消泡剂1滴，其余为水，pH 6.8-7.2。
微量元素混合液成分为：Na2MoO4·2H2O 1g/L，NiCl2·6H2O 0.5g/L，CaCl2·2H2O2g/L，CuSO4·5H2O 0.1g/L，Al2(SO4)3·18H2O 1g/L，CoCl2·6H2O 0.5g/L，ZnSO4·2H2O0.1g/L，H3BO30.05g/L，其余为水。
实施例4：利用基因工程菌E.coli W3110 Neu5Ac发酵生产Neu5Ac的方法
(1)活化斜面培养：用接种环从-80℃冰箱保菌管中接种1-2环菌种，均匀涂布于斜面培养基中，37℃培养12h，转接到第二代斜面培养基中，37℃培养12h；
(2)种子瓶培养：用接种环将斜面上的菌体接种到装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中用于制备种子液，三角瓶使用十二层纱布封口，在37℃，220r/min的条件下振荡培养12h；
(3)发酵培养：将种子液按15％接种量接种到装有发酵培养基的500mL挡板瓶中，使其终体积为30mL，使用十二层纱布封口，在39℃，240r/min的条件下振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在6.8-7.2，当通过苯酚红指示剂观察到pH没有缓慢降低甚至有所升高，表明菌体缺糖，补加2mL 60％(m/v)葡萄糖溶液，发酵周期为30h，产量达到8.2g/L，生产强度可达0.27g/(L×h)。
斜面培养基成分为：酵母粉8g/L、蛋白胨15g/L、NaCl 8g/L、牛肉膏15g/L、蔗糖2g/L、琼脂粉30g/L，其余为水。
种子培养基成分为：葡萄糖25g/L，酵母粉5g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 2.5g/L，柠檬酸5g/L，FeSO4·7H2O 5mg/L，MnSO4·7H2O 5mg/L，VH 5mg/L，VB12mg/L，微量元素混合液3ml/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 6.8-7.2。
发酵培养基成分为：葡萄糖30g/L，木糖20g/L(发酵5h添加)，酵母粉5g/L，(NH4)2SO4 10g/L，KH2PO4 10g/L，MgSO4·7H2O 8g/L，柠檬酸5g/L，NaCl 3g/L，FeSO4·7H2O 30mg/L，MnSO4·7H2O 5mg/L，CaCl2·2H2O 30mg/L，VH 2mg/L，VB1 1mg/L，微量元素混合液3ml/L，苯酚红指示剂3％，消泡剂2滴，其余为水，pH 6.8-7.2。
微量元素混合液成分为：Na2MoO4·2H2O 3g/L，NiCl2·6H2O 1.5g/L，CaCl2·2H2O8g/L，CuSO4·5H2O 0.5g/L，Al2(SO4)3·18H2O 1.5g/L，CoCl2·6H2O 1.5g/L，ZnSO4·2H2O0.5g/L，H3BO30.2g/L，其余为水。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津科技大学
<120> 木糖诱导生产N-乙酰神经氨酸的工程菌及其应用
<130> 1
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 480
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<400> 1
atgagcttac ccgatggatt ttatataagg cgaatggaag agggggattt ggaacaggtc 60
actgagacgc taaaggtttt gaccaccgtg ggcactatta cccccgaatc cttcagcaaa 120
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caatataacc ccatggtgat tgtggacaag cgcaccgaga cggttgccgc tacggggaat 240
atcatcatcg aaagaaagat cattcatgaa ctggggctat gtggccacat cgaggacatt 300
gcagtaaact ccaagtatca gggccaaggt ttgggcaagc tcttgattga tcaattggta 360
actatcggct ttgactacgg ttgttataag attattttag attgcgatga gaaaaatgtc 420
aaattctatg aaaaatgtgg gtttagcaac gcaggcgtgg aaatgcaaat tagaaaatag 480
<210> 2
<211> 1830
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E.coli W3110）
<400> 2
atgtgtggaa ttgttggcgc gatcgcgcaa cgtgatgtag cagaaatcct tcttgaaggt 60
ttacgtcgtc tggaataccg cggatatgac tctgccggtc tggccgttgt tgatgcagaa 120
ggtcatatga cccgcctgcg tcgcctcggt aaagtccaga tgctggcaca ggcagcggaa 180
gaacatcctc tgcatggcgg cactggtatt gctcacactc gctgggcgac ccacggtgaa 240
ccttcagaag tgaatgcgca tccgcatgtt tctgaacaca ttgtggtggt gcataacggc 300
atcatcgaaa accatgaacc gctgcgtgaa gagctaaaag cgcgtggcta taccttcgtt 360
tctgaaaccg acaccgaagt gattgcccat ctggtgaact gggagctgaa acaaggcggg 420
actctgcgtg aggccgttct gcgtgctatc ccgcagctgc gtggtgcgta cggtacagtg 480
atcatggact cccgtcaccc ggataccctg ctggcggcac gttctggtag tccgctggtg 540
attggcctgg ggatgggcga aaactttatc gcttctgacc agctggcgct gttgccggtg 600
acccgtcgct ttatcttcct tgaagagggc gatattgcgg aaatcactcg ccgttcggta 660
aacatcttcg ataaaactgg cgcggaagta aaacgtcagg atatcgaatc caatctgcaa 720
tatgacgcgg gcgataaagg catttaccgt cactacatgc agaaagagat ctacgaacag 780
ccgaacgcga tcaaaaacac ccttaccgga cgcatcagcc acggtcaggt tgatttaagc 840
gagctgggac cgaacgccga cgaactgctg tcgaaggttg agcatattca gatcctcgcc 900
tgtggtactt cttataactc cggtatggtt tcccgctact ggtttgaatc gctagcaggt 960
attccgtgcg acgtcgaaat cgcctctgaa ttccgctatc gcaaatctgc cgtgcgtcgt 1020
aacagcctga tgatcacctt gtcacagtct ggcgaaaccg cggataccct ggctggcctg 1080
cgtctgtcga aagagctggg ttaccttggt tcactggcaa tctgtaacgt tccgggttct 1140
tctctggtgc gcgaatccga tctggcgcta atgaccaacg cgggtacaga aatcggcgtg 1200
gcatccacta aagcattcac cactcagtta actgtgctgt tgatgctggt ggcgaagctg 1260
tctcgcctga aaggtctgga tgcctccatt gaacatgaca tcgtgcatgg tctgcaggcg 1320
ctgccgagcc gtattgagca gatgctgtct caggacaaac gcattgaagc gctggcagaa 1380
gatttctctg acaaacatca cgcgctgttc ctgggccgtg gcgatcagta cccaatcgcg 1440
ctggaaggcg cattgaagtt gaaagagatc tcttacattc acgctgaagc ctacgctgct 1500
ggcgaactga aacacggtcc gctggcgcta attgatgccg atatgccggt tattgttgtt 1560
gcaccgaaca acgaattgct ggaaaaactg aaatccaaca ttgaagaagt tcgcgcgcgt 1620
ggcggtcagt tgtatgtctt cgccgatcag gatgcgggtt ttgtaagtag cgataacatg 1680
cacatcatcg agatgccgca tgtggaagag gtgattgcac cgatcttcta caccgttccg 1740
ctgcagctgc tggcttacca tgtcgcgctg atcaaaggca ccgacgttga ccagccgcgt 1800
aacctggcaa aatcggttac ggttgagtaa 1830
<210> 3
<211> 2652
<212> DNA
<213> T7噬菌体
<400> 3
atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60
ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120
catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180
gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240
atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300
acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360
accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420
atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagctaag 480
cacttcaaga aaaacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcacgt ctacaagaaa 540
gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg 600
tggtcttcgt ggcataagga agactctatt catgtaggag tacgctgcat cgagatgctc 660
attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt aggtcaagac 720
tctgagacta tcgaactcgc acctgaatac gctgaggcta tcgcaacccg tgcaggtgcg 780
ctggctggca tctctccgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc 840
attactggtg gtggctattg ggctaacggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac 900
agtaagaaag cactgatgcg ctacgaagac gtttacatgc ctgaggtgta caaagcgatt 960
aacattgcgc aaaacaccgc atggaaaatc aacaagaaag tcctagcggt cgccaacgta 1020
atcaccaagt ggaagcattg tccggtcgag gacatccctg cgattgagcg tgaagaactc 1080
ccgatgaaac cggaagacat cgacatgaat cctgaggctc tcaccgcgtg gaaacgtgct 1140
gccgctgctg tgtaccgcaa ggacaaggct cgcaagtctc gccgtatcag ccttgagttc 1200
atgcttgagc aagccaataa gtttgctaac cataaggcca tctggttccc ttacaacatg 1260
gactggcgcg gtcgtgttta cgctgtgtca atgttcaacc cgcaaggtaa cgatatgacc 1320
aaaggactgc ttacgctggc gaaaggtaaa ccaatcggta aggaaggtta ctactggctg 1380
aaaatccacg gtgcaaactg tgcgggtgtc gataaggttc cgttccctga gcgcatcaag 1440
ttcattgagg aaaaccacga gaacatcatg gcttgcgcta agtctccact ggagaacact 1500
tggtgggctg agcaagattc tccgttctgc ttccttgcgt tctgctttga gtacgctggg 1560
gtacagcacc acggcctgag ctataactgc tcccttccgc tggcgtttga cgggtcttgc 1620
tctggcatcc agcacttctc cgcgatgctc cgagatgagg taggtggtcg cgcggttaac 1680
ttgcttccta gtgaaaccgt tcaggacatc tacgggattg ttgctaagaa agtcaacgag 1740
attctacaag cagacgcaat caatgggacc gataacgaag tagttaccgt gaccgatgag 1800
aacactggtg aaatctctga gaaagtcaag ctgggcacta aggcactggc tggtcaatgg 1860
ctggcttacg gtgttactcg cagtgtgact aagcgttcag tcatgacgct ggcttacggg 1920
tccaaagagt tcggcttccg tcaacaagtg ctggaagata ccattcagcc agctattgat 1980
tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg 2040
atttgggaat ctgtgagcgt gacggtggta gctgcggttg aagcaatgaa ctggcttaag 2100
tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggaga gattcttcgc 2160
aagcgttgcg ctgtgcattg ggtaactcct gatggtttcc ctgtgtggca ggaatacaag 2220
aagcctattc agacgcgctt gaacctgatg ttcctcggtc agttccgctt acagcctacc 2280
attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct 2340
aactttgtac acagccaaga cggtagccac cttcgtaaga ctgtagtgtg ggcacacgag 2400
aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtaccat tccggctgac 2460
gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat 2520
gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctca attggacaaa 2580
atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aacctccgtg acatcttaga gtcggacttc 2640
gcgttcgcgt aa 2652
<210> 4
<211> 1167
<212> DNA
<213> 项圈藻（Anabaena sp.）CH1
<400> 4
atgggcaaga acctgcaggc cctggcccag ctgtacaaga acgcactgct gaacgacgtg 60
ctgcctttct gggagaatca cagcctggac agtgaaggcg gctacttcac atgcctggac 120
cgccagggca aggtgtatga cacagataag ttcatctggc tgcagaaccg ccaagtttgg 180
accttcagca tgctgtgcaa tcagctggag aagcgcgaga attggctgaa gatcgcccgc 240
aatggcgcca agttcttagc acagcacggc cgcgacgacg agggtaattg gtactttgcc 300
ctgacacgtg gtggcgagcc gctggttcaa ccgtacaaca tcttcagcga ctgctttgcc 360
gccatggcct ttagccagta tgccttagcc agcggcgagg agtgggccaa ggatgtggcc 420
atgcaggcct acaacaacgt gttacgtcgc aaggataatc cgaagggcaa atataccaag 480
acctatccgg gcacacgccc tatgaaagcc ctggccgttc cgatgattct ggccaactta 540
accctggaga tggagtggct gctgccgcag gaaaccctgg agaacgtgct ggcagcaacc 600
gtgcaagagg tgatgggcga cttcttagac caggagcagg gcctgatgta tgaaaatgtg 660
gccccggacg gcagccatat cgattgcttc gagggccgcc tgattaaccc gggccatggt 720
atcgaggcca tgtggttcat catggacatc gcccgtcgca agaacgacag caagaccatc 780
aaccaggccg tggacgttgt gctgaacatc ctgaacttcg cctgggataa cgaatatggt 840
ggcctgtact actttatgga cgccgcaggt cacccgccgc agcaattaga gtgggaccag 900
aagctgtggt gggttcacct ggagagtctg gtggccctgg ccatgggtta ccgcttaacc 960
ggtcgcgacg catgctgggc ctggtaccag aagatgcacg actacagttg gcagcacttc 1020
gccgacccgg agtatggcga gtggttcggt tatctgaacc gtcgcggtga agtgctgctg 1080
aacttaaagg gcggcaagtg gaagggctgc tttcacgtgc ctcgcgccat gtatctgtgt 1140
tggcagcagt ttgaggcctt aagctaa 1167
<210> 5
<211> 882
<212> DNA
<213> 人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）
<400> 5
atggaagaac agctgaaagg tctgtatgcc gcgctgctgg tgccgttcga cgaaaacggt 60
caagttaagg aagagggtct gaagcagatc gcgaagaacg cgatcgaagt ggagcagctg 120
gatggtctgt atgtgaacgg cagcagcggc gaaaactttc tgatcagcaa agagcagaaa 180
aaacagatct tcaaggtggt gaaagaggcc gtgggcaacg atgttaagct gatcgcgcaa 240
gttggtagtc tggacctcaa cgaagccatc gaactgggca agtatgccac caatctgggt 300
tacgatgcgc tgagcgccgt tacgccattc tactacccgt tcagttttga agaaatcaaa 360
caatattatt ttgatatcat tgaggcgacc cagaacaaga tgatcatcta cgccatcccg 420
gatctgaccg gcgtgaacat cagcatcaac cagttcgagg agctgttcga caacgagaag 480
attgtgggcg tgaaatacac cgcgccgaat ttctttctgc tcgagcgcat ccgcaaggcg 540
ttcccggata agctgatcct cagtggcttc gacgagatgc tggtgcaagc cgtgatcagc 600
ggcgttgatg gcgcgatcgg cagtacctat aacgttaatg gccgccgcgc ccgtcagatt 660
tacgatctgg cgcgcgaggg taaagttgaa gaagcctaca agatccagca cgacacgaac 720
aacatcatcg agaccgttct gagcatgggc atctatccga cgctgaagga gattctgaaa 780
acccgcggca tcgatggtgg cgtgccgaaa cgcccgttta gcccgttcaa tgaggccaat 840
cgcaaggagc tcaaccagct gatcgaaacc tacaatctgt aa 882
<210> 6
<211> 567
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E.coli W3110）
<400> 6
atgtacgagc gttatgcagg tttaattttt gatatggatg gcacaatcct ggatacggag 60
cctacgcacc gtaaagcgtg gcgcgaagta ttagggcact acggtcttca gtacgatatt 120
caggcgatga ttgcgcttaa tggatcgccc acctggcgta ttgctcaggc aattattgag 180
ctgaatcagg ccgatctcga cccgcatgcg ttagcgcgtg aaaaaacaga agcagtaaga 240
agtatgctgc tggatagcgt cgaaccgctt cctcttgttg atgtggtgaa aagttggcat 300
ggtcgtcgcc caatggctgt aggaacgggg agtgaaagcg ccatcgctga ggcattgctg 360
gcgcacctgg gattacgcca ttattttgac gccgtcgtcg ctgccgatca cgtcaaacac 420
cataaacccg cgccagacac atttttgttg tgcgcgcagc gtatgggcgt gcaaccgacg 480
cagtgtgtgg tctttgaaga tgccgatttc ggtattcagg cggcccgtgc agcaggcatg 540
gacgccgtgg atgttcgctt gctgtga 567
<210> 7
<211> 1623
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E.coli W3110）
<400> 7
atgcgcgtta acaatggttt gaccccgcaa gaactcgagg cttatggtat cagtgacgta 60
catgatatcg tttacaaccc aagctacgac ctgctgtatc aggaagagct cgatccgagc 120
ctgacaggtt atgagcgcgg ggtgttaact aatctgggtg ccgttgccgt cgataccggg 180
atcttcaccg gtcgttcacc aaaagataag tatatcgtcc gtgacgatac cactcgcgat 240
actttctggt gggcagacaa aggcaaaggt aagaacgaca acaaacctct ctctccggaa 300
acctggcagc atctgaaagg cctggtgacc aggcagcttt ccggcaaacg tctgttcgtt 360
gtcgacgctt tctgtggtgc gaacccggat actcgtcttt ccgtccgttt catcaccgaa 420
gtggcctggc aggcgcattt tgtcaaaaac atgtttattc gcccgagcga tgaagaactg 480
gcaggtttca aaccagactt tatcgttatg aacggcgcga agtgcactaa cccgcagtgg 540
aaagaacagg gtctcaactc cgaaaacttc gtggcgttta acctgaccga gcgcatgcag 600
ctgattggcg gcacctggta cggcggcgaa atgaagaaag ggatgttctc gatgatgaac 660
tacctgctgc cgctgaaagg tatcgcttct atgcactgct ccgccaacgt tggtgagaaa 720
ggcgatgttg cggtgttctt cggcctttcc ggcaccggta aaaccaccct ttccaccgac 780
ccgaaacgtc gcctgattgg cgatgacgaa cacggctggg acgatgacgg cgtgtttaac 840
ttcgaaggcg gctgctacgc aaaaactatc aagctgtcga aagaagcgga acctgaaatc 900
tacaacgcta tccgtcgtga tgcgttgctg gaaaacgtca ccgtgcgtga agatggcact 960
atcgactttg atgatggttc aaaaaccgag aacacccgcg tttcttatcc gatctatcac 1020
atcgataaca ttgttaagcc ggtttccaaa gcgggccacg cgactaaggt tatcttcctg 1080
actgctgatg ctttcggcgt gttgccgccg gtttctcgcc tgactgccga tcaaacccag 1140
tatcacttcc tctctggctt caccgccaaa ctggccggta ctgagcgtgg catcaccgaa 1200
ccgacgccaa ccttctccgc ttgcttcggc gcggcattcc tgtcgctgca cccgactcag 1260
tacgcagaag tgctggtgaa acgtatgcag gcggcgggcg cgcaggctta tctggttaac 1320
actggctgga acggcactgg caaacgtatc tcgattaaag atacccgcgc cattatcgac 1380
gccatcctca acggttcgct ggataatgca gaaaccttca ctctgccgat gtttaacctg 1440
gcgatcccaa ccgaactgcc gggcgtagac acgaagattc tcgatccgcg taacacctac 1500
gcttctccgg aacagtggca ggaaaaagcc gaaaccctgg cgaaactgtt tatcgacaac 1560
ttcgataaat acaccgacac ccctgcgggt gccgcgctgg tagcggctgg tccgaaactg 1620
taa 1623

Claims (5)

1.一种利用木糖诱导生产N-乙酰神经氨酸基因工程菌，其特征在于，所述工程菌具有木糖诱导型启动子PxylF控制的来源于T7噬菌体的RNA聚合酶；整合了单拷贝由PT7启动子控制的氨基葡萄糖-6-磷酸N-乙酰转移酶基因Sc-gna1；双拷贝由PT7启动子控制的果糖-6-磷酸转氨酶基因glmS；并敲除了N-乙酰氨基葡萄糖分解代谢的相关基因nagA、nagB、nagC、nagE、manX、manY、manZ；在基因组上整合了由PT7启动子控制的N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶基因bAGE以及双拷贝由PT7启动子控制的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shNAL，并敲除Neu5Ac分解代谢途径的关键基因N-乙酰神经氨酸转运蛋白基因nanT、N-乙酰氨基甘露糖-6-磷酸差向异构酶基因nanE、N-乙酰氨基甘露糖激酶基因nanK，构建N-乙酰神经氨酸合成通路；整合由Ptrc启动子控制的磷酸转移酶基因yqaB和磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶基因pck；敲除丙酮酸脱氢酶基因poxB，乳酸脱氢酶基因ldhA，乙酸激酶基因ackA，丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB；
所述工程菌以E. coli W3110为出发菌株；
所述T7 RNA聚合酶基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 3所示；
所述氨基葡萄糖-6-磷酸N-乙酰转移酶基因Sc-gna1，核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示；
所述果糖-6-磷酸转氨酶基因glms，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示；
所述N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶基因bAGE，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 4所示；
所述N-乙酰氨基葡萄糖N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shNAL，核苷酸序列如序列表SEQID NO. 5所示；
所述磷酸转移酶基因yqaB，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 6所示；
所述磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶基因pck，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 7所示。
2.权利要求1所述的一种利用木糖诱导生产N-乙酰神经氨酸基因工程菌的构建方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术进行定向改造，具体包括如下步骤：
（1）在lacIZ基因位点上整合由木糖启动子PxylF控制的T7 RNA聚合酶；
（2）构建GlcNAc合成通路：首先敲除GlcNAc的分解代谢途径nagA、nagB、nagC、nagE、manX、manY、manZ；同时在nagE基因位点上整合由PT7启动子控制的氨基葡萄糖-6-磷酸N-乙酰转移酶基因Sc-gna1；在假基因位点yjiV和ycjV整合由PT7启动子控制的果糖-6-磷酸转氨酶基因glms；
（3）构建Neu5Ac合成通路：首先敲除Neu5Ac的分解代谢途径nanT、nanE、nanK；同时整合由PT7启动子控制的N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶基因bAGE，在假基因位点gapC和ylbE上整合由PT7启动子控制的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shNAL；
（4）强化前体物质ManNAc的积累：在假基因位点ilvG上整合由Ptrc启动子控制的磷酸转移酶基因yqaB；
（5）加强前体物质丙酮酸的积累：在假基因位点ygaY上整合由Ptrc启动子控制的磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶基因pck，并敲除丙酮酸脱氢酶基因poxB、乳酸脱氢酶基因ldhA、乙酸激酶基因ackA、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB。
3.权利要求1所述的基因工程菌在生产N-乙酰神经氨酸中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵生产Neu5Ac的方法如下：将种子液按10-15%接种量接种到发酵培养基中，在35-39℃，180-240 r/min的条件下振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在6.8-7.2，当通过苯酚红指示剂观察到pH没有缓慢降低甚至有所升高，表明菌体缺糖，补加0.5-2mL 60%葡萄糖溶液，发酵周期为24-36h。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基成分为：葡萄糖15-30 g/L，木糖5-20 g/L，酵母粉2-5 g/L，(NH4)2SO4 2-10 g/L，KH2PO4 4-10 g/L，MgSO4·7H2O 2-8g/L，柠檬酸1-5 g/L，NaCl 0.5-3g/L，FeSO4·7H2O 5-30 mg/L，MnSO4·7H2O 1-5 mg/L，CaCl2·2H2O15-30 mg/L,VH 0.05-2 mg/L，VB1 0.1-1 mg/L，微量元素混合液1-3 ml/L，苯酚红指示剂1-3%，消泡剂1-2滴，其余为水，pH 6.8-7.2；
微量元素混合液成分为：Na2MoO4·2H2O 1-3g/L，NiCl2·6H2O 0.5-1.5g/L，CaCl2·2H2O2-8g/L，CuSO4·5H2O 0.1-0.5g/L，Al2(SO4)3·18H2O 1-1.5g/L，CoCl2·6H2O 0.5-1.5g/L，ZnSO4·2H2O 0.1-0.5g/L，H3BO30.05-0.2g/L，其余为水。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113817658B (zh) * 2021-08-24 2023-06-16 天津科技大学 一株生产n-乙酰神经氨酸的基因工程菌及其构建与应用
CN114196693B (zh) * 2021-10-25 2023-11-24 福州一诺维生物科技有限公司 一种n-乙酰神经氨酸的制备方法
CN114574410B (zh) * 2022-01-28 2023-07-25 山东润德生物科技有限公司 一种高效生产n-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101363034A (zh) * 2008-08-08 2009-02-11 山东大学 一种利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法
WO2014121724A1 (zh) * 2013-02-07 2014-08-14 中国科学院天津工业生物技术研究所 5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10329592B2 (en) * 2015-11-23 2019-06-25 Jiangnan University Signal peptide, L-glutamic acid synthesized using konjac flour and methods of using same

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101363034A (zh) * 2008-08-08 2009-02-11 山东大学 一种利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法
WO2014121724A1 (zh) * 2013-02-07 2014-08-14 中国科学院天津工业生物技术研究所 5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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微生物产生的酶抑制剂研究1.蛋白酶抑制剂的筛选方法探讨;刘华珍等;《抗生素》;19831231;第8卷(第5期);全文 *

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