CN114350581A

CN114350581A - 一株生产胞嘧啶的大肠杆菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN114350581A
Application number: CN202111461720.4A
Authority: CN
Inventors: 范晓光; 宋雪静; 安俊侠; 王倩倩; 李静; 张兆昆; 徐庆阳
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2021-12-02
Filing date: 2021-12-02
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2041-12-02
Also published as: CN114350581B

Abstract

本发明公开了一株生产胞嘧啶大肠杆菌，所述大肠杆菌在尿苷生产菌E.coliUR11基础上，阻断胞嘧啶向尿嘧啶的转化，减少胞嘧啶向胞内的转运，强化CMP到胞嘧啶的水解反应，强化CTP到CMP的水解反应，强化UMP到UDP的磷酸化反应，阻断胞苷到尿苷的转化，强化UTP经胞苷三磷酸合成酶生成CTP的反应，阻断UMP和CMP水解为尿苷和胞苷。本发明通过合理的代谢改造策略，利用基因定向改造技术获得一株高产胞嘧啶的基因工程菌，所有的基因操作均在基因组上进行，无质粒引入，无抗性，菌株性状稳定，应用更为广泛。胞嘧啶产量和转化率分别达到53.36g/L和16.77％，均为现有报道的最高值。

Description

一株生产胞嘧啶的大肠杆菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其是一株生产胞嘧啶的大肠杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

胞嘧啶，学名4-氨基-2-羟基嘧啶，分子式为C₄H₅N₃O，分子量为111.10。是生物体内合成DNA、RNA的重要嘧啶类碱基。胞嘧啶作为医药与生物化工的重要中间体，具有广泛的应用。在农用抗生素方面，胞嘧啶核苷肽型抗生素具有高效、低毒、低残留等优点；在医药领域，可作为抗艾滋病抗病毒等药物中间体，例如合成抗癌药物吉西他滨、抗艾滋病药物拉米夫定等。随着生物制药的不断发展，胞嘧啶的市场需求日益增加。目前，主要通过有机化学合成法获得胞嘧啶，包括官能团转化法和Pinnera合成法。但这些方法存在前体物不易制备、不利于扩大化生产、污染环境等缺点。随着生物学的发展，微生物发酵法因其生产效率高、环境友好、原料易得等优点逐渐成为研究的重点。

大肠杆菌中胞嘧啶的合成需要经过一系列的代谢反应。第一步，谷氨酰胺、天冬氨酸和5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)等前体物质经过六步酶催化反应生成尿苷酸(UMP)。第二步，合成的UMP进行分流代谢，一部分UMP在核苷酸酶和尿苷磷酸化酶的催化下生成尿嘧啶或直接经过尿嘧啶磷酸核糖转移酶生成尿嘧啶；另一部分UMP在尿苷酸激酶、核苷二磷酸激酶、胞苷三磷酸合成酶的作用下生成胞苷三磷酸(CTP)，CTP脱磷酸后生成胞苷，胞苷再经过核苷酸酶的作用生成胞嘧啶。胞嘧啶合成路径长，反馈调节机制复杂，受多条代谢路径的干扰。另外，胞苷和胞嘧啶还可经过脱氨作用分别转化为尿苷和尿嘧啶，这使得细胞内胞嘧啶得不到有效积累。

现有技术中，CN 110408580 A公开了生产胞嘧啶的重组微生物及生产胞嘧啶的方法。该方法是以胞苷生产菌株作为研究对象，通过质粒方式过表达核苷酸酶和核糖激酶，催化胞苷到胞嘧啶的水解，得到重组菌株用于胞嘧啶的发酵。但上述方法获得的重组菌株胞嘧啶产量和糖苷转化率较低，无法真正用于工业化生产。本发明以前期构建的尿苷高产菌(CN 108130306 B)作为出发菌株，利用基因编辑技术改变菌株关键基因位点，优化细胞代谢途径，构建出一株通过微生物发酵法高产胞嘧啶的基因工程菌。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中胞嘧啶合成的不足之处，提供一株生产胞嘧啶的大肠杆菌及其构建方法与应用。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一株生产胞嘧啶的大肠杆菌，所述大肠杆菌在尿苷基因工程菌E.coli UR11的基础上，阻断胞嘧啶向尿嘧啶的转化，减少胞嘧啶向胞内的转运，强化胞苷酸(CMP)到胞嘧啶的水解反应，强化CTP到CMP的水解反应，强化UMP到尿苷二磷酸(UDP)的磷酸化反应，阻断胞苷到尿苷的转化，强化尿苷三磷酸(UTP)经胞苷三磷酸合成酶生成CTP的反应，阻断UMP和CMP水解为尿苷和胞苷。

进一步地，所述大肠杆菌在尿苷基因工程菌E.coli UR11的基因组上首先整合来源于T7噬菌体的RNA聚合酶基因T7RNAP，用于识别和转录由T7启动子控制的基因；敲除了胞嘧啶脱氨酶基因codA和胞嘧啶渗透酶基因codB，阻断胞嘧啶向尿嘧啶的转化，同时减少胞嘧啶向细胞内的转运。

进一步地，所述大肠杆菌在尿苷基因工程菌E.coli UR11的基因组上整合了嘧啶单磷酸核苷酶基因ygdH，加强CMP到胞嘧啶的水解反应；整合核苷三磷酸焦磷酸水解酶基因nudG，加强CTP到CMP的水解反应；在胞苷脱氨酶基因位点cdd整合携带突变点的尿苷酸激酶基因pyrH^(D93A)，减少UDP对尿苷酸激酶的反馈抑制，增加UMP向UDP的转化，同时阻断胞苷向尿苷的转化；在基因组上整合了携带突变点的胞苷三磷酸合酶基因pyrG^(E155K)，减少CTP对胞苷三磷酸合酶的反馈抑制，增加UTP向CTP的转化；敲除四种核苷酸酶基因，ushA、surE、yjjG和yrfG，阻断UMP向尿苷以及CMP向胞苷的水解反应，减少副产物尿苷和尿嘧啶的生成。

进一步地，所述尿苷基因工程菌E.coli UR11(ZL201810020944.3(CN 108130306B))是在E.coli W3110(ATCC27325)的基因组上整合了来源于B.csubtilis A260(CGMCCNo.11775)的嘧啶核苷操纵子pyrBCAKDFE，由强启动子Ptrc控制；敲除尿苷激酶基因udk、尿苷磷酸化酶基因udp和核苷水解酶基因rihA、rihB和rihC；在基因组上对其自身PRPP合成酶基因prsA进行双拷贝，由强启动子Ptrc启动；敲除高丝氨酸脱氢酶基因thrA；敲除鸟氨酸氨甲酰转移酶基因argF。

如上所述的生产胞嘧啶的大肠杆菌的构建方法，所述方法采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli UR11基因组进行定向改造。

进一步地，步骤如下：

(1)在基因位点lacI-lacZ整合来源于T7噬菌体的RNA聚合酶基因T7RNAP，其基因序列为SEQ ID NO.1，由木糖启动子PxylF控制；

(2)敲除胞嘧啶脱氨酶基因codA和胞嘧啶渗透酶基因codB，基因codA的基因序列为SEQ ID NO.2，基因codB的基因序列为SEQ ID NO.3；

(3)在假基因位点mbhA整合大肠杆菌内源的嘧啶单磷酸核苷酶基因ygdH，其基因序列为SEQ ID NO.4，由强启动子T7控制；

(4)在假基因位点yeeP整合大肠杆菌内源的核苷三磷酸焦磷酸水解酶基因nudG，其基因序列为SEQ ID NO.5，由强启动子Ptrc控制；

(5)在胞苷脱氨酶基因位点cdd整合大肠杆菌内源的携带突变点的尿苷酸激酶基因pyrH^(D93A)，其基因序列为SEQ ID NO.6，由强启动子Ptrc控制；

(6)在假基因位点ilvG整合大肠杆菌内源的携带突变点的胞苷三磷酸合酶基因pyrG^(E155K)，其基因序列为SEQ ID NO.7，由强启动子Ptrc控制；

(7)敲除四种核苷酸酶基因ushA、surE、yjjG、yrfG，其基因序列依次为SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11。

进一步地，所述T7启动子的基因序列为SEQ ID NO.12：

TAATACGACTCACTATAGGGTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACC。

所述Ptrc启动子的基因序列为SEQ ID NO.13：

TTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACC。

所述PxylF启动子的基因序列为SEQ ID NO.14：

GAGATAATTCACAAGTGTGCGCTCGCTCGCAAAATAAAATGGAATGATGAAACTGGGTAATTCCTCGAAGAGAAAAATGCAATAAGTACAATTGCGCAACAAAAGTAAGATCTCGGTCATAAATCAAGAAATAAACCAAAAATCGTAATCGAAAGATAAAAATCTGTAATTGTTTTCCCCTGTTTAGTTGCTAAAAATTGGTTACGTTTATCGCGGTGATTGTTACTTATTAAAACTGTCCTCTAACTACAGAAGGCCCTACACC。

如上所述的大肠杆菌在胞嘧啶生产方面中的应用。

利用如上所述的大肠杆菌发酵生产胞嘧啶的方法，所述方法通过反馈脉冲补料工艺来提高胞嘧啶的产量，具体步骤如下：

取生产胞嘧啶的大肠杆菌的菌液，均匀涂布于活化斜面，并进行传代培养；将活化斜面上的菌株接种到种子培养基中，37℃培养8-10h，培养过程中通过补加氨水维持pH值在6.8-7.2；将种子液按照15-20％的接种量接入发酵培养基中，开始发酵培养；发酵起始pH值控制在6.8-7.2；发酵8-10h通过补加氨水维持pH值在6.4-6.7；发酵12h后开始采用反馈脉冲式补料策略补加葡萄糖，将溶解氧值控制在20％-35％；发酵24-26h采用联动反馈脉冲式补料策略同时补加葡萄糖和玉米浆，将溶解氧值控制在15％-30％；整个发酵过程中温度控制在37℃，发酵周期为45h。

进一步地，所述活化斜面使用的斜面培养基为：葡萄糖1.5-2.5g/L，酵母粉5-10g/L，蛋白胨10-15g/L，牛肉膏10-15g/L，磷酸二氢钾1-1.5g/L，硫酸镁0.3-0.5g/L，氯化钠0.5-1.0g/L，琼脂25-30g/L；

或者，所述种子培养基为：葡萄糖10-30g/L，酵母粉4-10g/L，柠檬酸1-6g/L，蛋白胨1-6g/L，异亮氨酸0.1-0.5g/L，磷酸二氢钾2-9g/L，硫酸镁0.5-2.0g/L，硫酸亚铁10-40mg/L。

或者，所述发酵培养基为：葡萄糖10-30g/L，酵母粉4-10g/L，柠檬酸1-6g/L，异亮氨酸0.1-0.5g/L，蛋白胨1-6g/L，磷酸二氢钾2-9g/L，硫酸镁0.5-2.0g/L，硫酸亚铁10-40mg/L，硫酸锰1-10mg/L，氯化钴1-4mg/L，生物素1-4mg/L，VB11-4mg/L。

本发明取得的有益效果是：

1、本发明通过合理的代谢改造策略，以ZL201810020944.3(CN 108130306 B)构建的尿苷生产菌为出发菌，利用基因定向改造技术获得一株高产胞嘧啶的基因工程菌，该菌株为一株以葡萄糖为碳源，且遗传背景清晰的用于胞嘧啶生产的基因工程大肠杆菌。所有的基因操作均在基因组上进行，无质粒引入，因此获得的工程菌株性状稳定，无抗性，应用更为广泛。

2、本发明开发了适用于胞嘧啶发酵的新型发酵工艺，即在发酵的不同阶段，通过反馈脉冲式补料策略控制发酵过程的溶氧值，与传统的依靠改变搅拌速率和通气量相比，上述方法能够合理的控制菌体量，有效节约碳氮源用量，提高发酵产量。

3、本发明提供了高产胞嘧啶的发酵菌株和发酵工艺。采用反馈脉冲补料策略用于胞嘧啶发酵，在45h的发酵周期内发酵液胞嘧啶浓度可达53.36g/L，葡萄糖到胞嘧啶的转化率可达16.77％，均为现有报道的最高水平，具有很好的工业化应用前景。

附图说明

图1为本发明中胞嘧啶工程菌的代谢改造策略图；其中，UMP为尿苷酸、UDP为二磷酸尿苷、UTP为三磷酸尿苷、CTP为三磷酸胞苷、CDP为二磷酸胞苷、CMP为单磷酸胞苷；

图2为本发明中lacI-lacZ::PxylF-T7RNAP整合片段构建及验证电泳图；其中，M—1kb DNA Maker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—目的基因；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—阳性单菌落PCR鉴定片段；

图3为本发明中codA和codB基因敲除片段构建及验证电泳图；其中，M—1kb DNAMaker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—重叠片段；4—原菌PCR片段；5—阳性单菌落PCR鉴定片段；

图4为本发明中mbhA::T7-ygdH整合片段构建及验证电泳图；其中，M—1kb DNAMaker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—目的基因；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—阳性单菌落PCR鉴定片段；

图5为本发明中yeeP::ptrc-nudG整合片段构建及验证电泳图；其中，M—1kb DNAMaker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—目的基因；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—阳性单菌落PCR鉴定片段；

图6为本发明中cdd::Ptrc-pyrH^(D93A)整合片段构建及验证电泳图；其中，M—1kbDNA Maker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—目的基因；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—阳性单菌落PCR鉴定片段；

图7为本发明中ilvG::Ptrc-pyrG^(E155K)整合片段构建及验证电泳图；其中，M—1kbDNA Maker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—目的基因；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—阳性单菌落PCR鉴定片段；

图8为本发明中ushA基因敲除片段构建及验证电泳图；其中，M—1kb DNA Maker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—重叠片段；4—原菌PCR片段；5—阳性单菌落PCR鉴定片段；

图9为本发明中surE基因敲除片段构建及验证电泳图；其中，M—1kb DNA Maker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—重叠片段；4—原菌PCR片段；5—阳性单菌落PCR鉴定片段；

图10为本发明中yjjG基因敲除片段构建及验证电泳图；其中，M—1kb DNA Maker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—重叠片段；4—原菌PCR片段；5—阳性单菌落PCR鉴定片段；

图11为本发明中yrfG基因敲除片段构建及验证电泳图；其中，M—1kb DNA Maker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—重叠片段；4—原菌PCR片段；5—阳性单菌落PCR鉴定片段；

图12为本发明中实施例2中E.coli C10发酵过程曲线。

图13为本发明中实施例3中E.coli C10发酵过程曲线。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。

本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。

较优地，所述大肠杆菌在尿苷基因工程菌E.coli UR11的基因组上首先整合来源于T7噬菌体的RNA聚合酶基因T7RNAP，用于识别和转录由T7启动子控制的基因；敲除了胞嘧啶脱氨酶基因codA和胞嘧啶渗透酶基因codB，阻断胞嘧啶向尿嘧啶的转化，同时减少胞嘧啶向细胞内的转运。

较优地，所述大肠杆菌在尿苷基因工程菌E.coli UR11的基因组上整合了嘧啶单磷酸核苷酶基因ygdH，加强CMP到胞嘧啶的水解反应；整合核苷三磷酸焦磷酸水解酶基因nudG，加强CTP到CMP的水解反应；在胞苷脱氨酶基因位点cdd整合携带突变点的尿苷酸激酶基因pyrH^(D93A)，减少UDP对尿苷酸激酶的反馈抑制，增加UMP向UDP的转化，同时阻断胞苷向尿苷的转化；在基因组上整合了携带突变点的胞苷三磷酸合酶基因pyrG^(E155K)，减少CTP对胞苷三磷酸合酶的反馈抑制，增加UTP向CTP的转化；敲除四种核苷酸酶基因，ushA、surE、yjjG和yrfG，阻断UMP向尿苷以及CMP向胞苷的水解反应，减少副产物尿苷和尿嘧啶的生成。

较优地，所述尿苷基因工程菌E.coli UR11(ZL201810020944.3(CN 108130306B))是在E.coli W3110(ATCC27325)的基因组上整合了来源于B.csubtilis A260(CGMCCNo.11775)的嘧啶核苷操纵子pyrBCAKDFE，由强启动子Ptrc控制；敲除尿苷激酶基因udk、尿苷磷酸化酶基因udp和核苷水解酶基因rihA、rihB和rihC；在基因组上对其自身PRPP合成酶基因prsA进行双拷贝，由强启动子Ptrc启动；敲除高丝氨酸脱氢酶基因thrA；敲除鸟氨酸氨甲酰转移酶基因argF。

较优地，步骤如下：

较优地，所述T7启动子的基因序列为SEQ ID NO.12：

TAATACGACTCACTATAGGGTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACC。

所述Ptrc启动子的基因序列为SEQ ID NO.13：

TTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACC。

所述PxylF启动子的基因序列为SEQ ID NO.14：

如上所述的大肠杆菌在胞嘧啶生产方面中的应用。

用接种环蘸取生产胞嘧啶的大肠杆菌的菌液，均匀涂布于活化斜面，并进行传代培养；将活化斜面上的菌株接种到种子培养基中，37℃培养8-10h，培养过程中通过补加氨水维持pH值在6.8-7.2；将种子液按照15-20％的接种量接入发酵培养基中，开始发酵培养；发酵起始pH值控制在6.8-7.2；发酵8-10h通过补加氨水维持pH值在6.4-6.7；发酵12h后开始采用反馈脉冲式补料策略补加葡萄糖，将溶解氧值控制在20％-35％；发酵24-26h采用联动反馈脉冲式补料策略同时补加葡萄糖和玉米浆，将溶解氧值控制在15％-30％；整个发酵过程中温度控制在37℃，发酵周期为45h。

较优地，所述活化斜面使用的斜面培养基为：葡萄糖1.5-2.5g/L，酵母粉5-10g/L，蛋白胨10-15g/L，牛肉膏10-15g/L，磷酸二氢钾1-1.5g/L，硫酸镁0.3-0.5g/L，氯化钠0.5-1.0g/L，琼脂25-30g/L；

具体地，相关的制备及检测如下：

本发明以ZL201810020944.3(CN 108130306 B)构建的尿苷生产菌为出发菌，该菌详细构建过程可参考CN 108130306 B。

实施例1：胞嘧啶生产菌株大肠杆菌E.coli C10的构建(改造策略见图1)：

1、基因编辑方法

本发明中采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑方法，可参照文献(MetabolicEngineering,2015,31:13-21.)进行。CRISPR/Cas9是一种精确、高效的新型基因靶向修饰技术，该方法所用的两种质粒分别为pGRB与pREDCas9。pREDCas9质粒为温敏型质粒，携带gRNA质粒的消除系统，λ噬菌体的Red重组系统及Cas9蛋白表达系统，具有奇霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，适培温度32℃；pGRB质粒，以pUC18为骨架，包含启动子J23100，gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列，具有氨苄青霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，适培温度37℃。

2、菌株构建的具体过程

本发明菌株是以ZL201810020944.3(CN 108130306 B)构建的尿苷基因工程菌E.coli UR11为出发菌，该菌株是将B.csubtilis A260中的嘧啶核苷操纵基因(pyrBCAKDFE，包含pyrB、pyrC、pyrAA、pyrAB、pyrK、pyrD、pyrF、pyrE八个基因)按顺序依次整合在E.coliW3110基因组上，构建了尿苷的生物合成途径，敲除了udk、udp、rihA、rihB和rihC五个尿苷降解相关基因。在基因组上对其自身PRPP合成酶基因prsA进行双拷贝，敲除了高丝氨酸脱氢酶基因thrA和鸟氨酸氨甲酰转移酶基因argF。

2.1 PxylF-T7RNAP基因在lacI-lacZ基因位点处的整合

根据lacI-lacZ基因序列，设计上游同源臂引物UP-lacI-lacZ-S(SEQ ID NO.15)、UP-lacI-lacZ-A(SEQ ID NO.16)和下游同源臂引物DN-PxylF-lacI-lacZ-S(SEQ IDNO.17)、DN-lacI-lacZ-A(SEQ ID NO.18),以尿苷生产菌E.coli UR11基因组为模板，利用PCR技术扩增lacI-lacZ基因的上下游同源臂；根据T7RNAP的基因序列设计引物PxylF-T7RNAP-S(SEQ ID NO.19)、T7RNAP-PxylF-A(SEQ ID NO.20)，以实验室现有T7RNAP基因片段为模板，扩增目的基因。通过重组PCR的方法获得基因的整合片段(上游同源臂-下游同源臂-目的基因)。PxylF启动子设计在lacI-lacZ基因上游同源臂的反义链引物和目的基因的正义链引物中；PxylF终止子设计在目的基因反义链引物和lacI-lacZ基因位点下游同源臂的正义链引物中。通过引物gRNA-lacI-lacZ-S(SEQ ID NO.65)和gRNA-lacI-lacZ-A(SEQID NO.66)的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-lacI-lacZ。将整合片段和pGRB-lacI-lacZ电转化至含有pREDCas9质粒的E.coliUR11感受态细胞中，复苏培养获得单菌落，通过PCR菌落验证得到阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-lacI-lacZ，即菌株E.coli C1。验证图如图2所示。

2.2 codA和codB基因敲除

根据codA和codB基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-codA-codB-S(SEQ IDNO.21)、UP-codA-codB-A(SEQ ID NO.22)和下游同源臂引物DN-codA-codB-S(SEQ IDNO.23)、DN-codA-codB-A(SEQ ID NO.24)，以尿苷生产菌E.coli UR11基因组为模板，利用PCR技术扩增上下游同源臂，通过重组PCR的方法获得基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。通过引物gRNA-codA-codB-S(SEQ ID NO.67)和gRNA-codA-codB-A(SEQ ID NO.68)的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-codA-codB。将整合片段和pGRB-codA-codB电转化至含有pREDCas9质粒的E.coli C1感受态细胞中，复苏培养获得单菌落，通过PCR菌落验证得到阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-codA-codB，即菌株E.coliC2。验证图如图3所示。

2.3 T7-ygdH基因在mbhA假基因位点处的整合

根据假基因mbhA的上下游序列设计上游同源臂引物UP-mbhA-S(SEQ ID NO.25)、UP-mbhA-T7-A(SEQ ID NO.26)和下游同源臂引物DN-T7-mbhA-S(SEQ ID NO.27)、DN-mbhA-A(SEQ ID NO.28),以尿苷生产菌E.coli UR11基因组为模板，利用PCR技术扩增假基因的上下游同源臂；根据ygdH的基因序列设计引物T7-ygdH-S(SEQ ID NO.29)、ygdH-T7-A(SEQ IDNO.30)，扩增目的基因。T7启动子设计在假基因上游同源臂的反义链引物和目的基因的正义链引物中；T7终止子设计在目的基因反义链引物和假基因位点下游同源臂的正义链引物中。通过重组PCR的方法获得基因的整合片段(上游同源臂-下游同源臂-目的基因)。通过引物gRNA-mbhA-S(SEQ ID NO.69)和gRNA-mbhA-A(SEQ ID NO.70)的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-mbhA。将整合片段和pGRB-mbhA电转化至含有pREDCas9质粒的E.coliC2感受态细胞中，复苏培养获得单菌落，通过PCR菌落验证得到阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-mbhA，即菌株E.coliC3。验证图如图4所示。

2.4 Ptrc-nudG基因在yeeP假基因位点处的整合

根据假基因yeeP的上下游序列设计上游同源臂引物UP-yeeP-S(SEQ ID NO.31)、UP-yeeP-Ptrc-A(SEQ ID NO.32)和下游同源臂引物DN-Ptrc-yeeP-S(SEQ ID NO.33)、DN-yeeP-A(SEQ ID NO.34),以尿苷生产菌E.coli UR11基因组为模板，利用PCR技术扩增yeeP基因的上下游同源臂；根据nudG的基因序列设计引物Ptrc-nudG-S(SEQ ID NO.35)、nudG-Ptrc-A(SEQ ID NO.36)，扩增目的基因。Ptrc启动子设计在假基因上游同源臂的反义链引物和目的基因的正义链引物中；Ptrc终止子设计在目的基因反义链引物和假基因位点下游同源臂的正义链引物中。通过重组PCR的方法获得基因的整合片段(上游同源臂-下游同源臂-目的基因)。通过引物gRNA-yeeP-S(SEQ ID NO.71)和gRNA-yeeP-A(SEQ ID NO.72)的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-yeeP。将整合片段和pGRB-yeeP电转化至含有pREDCas9质粒的E.coliC3感受态细胞中，复苏培养获得单菌落，通过PCR菌落验证得到阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yeeP，即菌株E.coliC4。验证图如图5所示。

2.5 Ptrc-pyrH^(D93A)基因在cdd基因位点处的整合

根据cdd基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-cdd-S(SEQ ID NO.37)、UP-cdd-Ptrc-A(SEQ ID NO.38)和下游同源臂引物DN-Ptrc-cdd-S(SEQ ID NO.39)、DN-cdd-A(SEQ ID NO.40),以尿苷生产菌E.coli UR11基因组为模板，利用PCR技术扩增cdd基因的上下游同源臂；根据实验室现有携带突变点的目的基因pyrH^(D93A)序列设计引物Ptrc-pyrH^(D93A)-S(SEQ ID NO.41)、pyrH^(D93A)-Ptrc-A(SEQ ID NO.42)，扩增目的基因。Ptrc启动子设计在cdd基因上游同源臂的反义链引物和目的基因的正义链引物中；Ptrc终止子设计在目的基因反义链引物和cdd基因位点下游同源臂的正义链引物中。通过重组PCR的方法获得基因的整合片段(上游同源臂-下游同源臂-目的基因)。通过引物gRNA-cdd-S(SEQ ID NO.73)和gRNA-cdd-A(SEQ ID NO.74)的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-cdd。将整合片段和pGRB-cdd电转化至含有pREDCas9质粒的E.coliC4感受态细胞中，复苏培养获得单菌落，通过PCR菌落验证得到阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-cdd，即菌株E.coliC5。验证图如图6所示。

2.6 Ptrc-pyrG^(E155K)基因在ilvG假基因位点处的整合

根据ilvG假基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-ilvG-S(SEQ ID NO.43)、UP-ilvG-Ptrc-A(SEQ ID NO.44)和下游同源臂引物DN-Ptrc-ilvG-S(SEQ ID NO.45)、DN-ilvG-A(SEQ ID NO.46),以尿苷生产菌E.coli UR11基因组为模板，利用PCR技术扩增ilvG基因的上下游同源臂；根据实验室现有携带突变点的目的基因pyrG^(E155K)序列设计引物Ptrc-pyrG^(E155K)-S(SEQ ID NO.47)、pyrG^(E155K)-Ptrc-A(SEQ ID NO.48)，扩增目的基因。Ptrc启动子设计在ilvG假基因上游同源臂的反义链引物和目的基因的正义链引物中；Ptrc终止子设计在目的基因反义链引物和ilvG假基因位点下游同源臂的正义链引物中。通过重组PCR的方法获得基因的整合片段(上游同源臂-下游同源臂-目的基因)。通过引物gRNA-ilvG-S(SEQ ID NO.75)和gRNA-ilvG-A(SEQ ID NO.76)的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-ilvG。将整合片段和pGRB-ilvG电转化至含有pREDCas9质粒的E.coliC5感受态细胞中，复苏培养获得单菌落，通过PCR菌落验证得到阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-ilvG，即菌株E.coliC6。验证图如图7所示。

2.7 ushA基因敲除

根据ushA基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-ushA-S(SEQ ID NO.49)、UP-ushA-A(SEQ ID NO.50)和下游同源臂引物DN-ushA-S(SEQ ID NO.51)、DN-ushA-A(SEQ IDNO.52)，以尿苷生产菌E.coli UR11基因组为模板，利用PCR技术扩增ushA基因的上下游同源臂，通过重组PCR的方法获得ushA基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。通过引物gRNA-ushA-S(SEQ ID NO.77)和gRNA-ushA-A(SEQ ID NO.78)的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-ushA。将整合片段和pGRB-ushA电转化至含有pREDCas9质粒的E.coliC6感受态细胞中，复苏培养获得单菌落，通过PCR菌落验证得到阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-ushA，即菌株E.coliC7。验证图如图8所示。

2.8 surE基因敲除

根据surE基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-surE-S(SEQ ID NO.53)、UP-surE-A(SEQ ID NO.54)和下游同源臂引物DN-surE-S(SEQ ID NO.55)、DN-surE-A(SEQ IDNO.56)，以尿苷基因工程菌E.coli UR11基因组为模板，利用PCR技术扩增surE基因的上下游同源臂，通过重组PCR的方法获得surE基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。通过引物gRNA-surE-S(SEQ ID NO.79)和gRNA-surE-A(SEQ ID NO.80)的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-surE。将整合片段和pGRB-surE电转化至含有pREDCas9质粒的E.coliC7感受态细胞中，复苏培养获得单菌落，通过PCR菌落验证得到阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-surE，即菌株E.coliC8。验证图如图9所示。

2.9 yjjG基因敲除

根据yjjG基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-yjjG-S(SEQ ID NO.57)、UP-yjjG-A(SEQ ID NO.58)和下游同源臂引物DN-yjjG-S(SEQ ID NO.59)、DN-yjjG-A(SEQ IDNO.60)，以尿苷生产菌E.coli UR11基因组为模板，利用PCR技术扩增yjjG基因的上下游同源臂，通过重组PCR的方法获得yjjG基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。通过引物gRNA-yjjG-S(SEQ ID NO.81)和gRNA-yjjG-A(SEQ ID NO.82)的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-yjjG。将整合片段和pGRB-yjjG电转化至含有pREDCas9质粒的E.coliC8感受态细胞中，复苏培养获得单菌落，通过PCR菌落验证得到阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yjjG，即菌株E.coliC9。验证图如图10所示。

2.10 yrfG基因敲除

根据yrfG基因的上下游序列设计上游同源臂引物UP-yrfG-S(SEQ ID NO.61)、UP-yrfG-A(SEQ ID NO.62)和下游同源臂引物DN-yrfG-S(SEQ ID NO.63)、DN-yrfG-A(SEQ IDNO.64)，以尿苷生产菌E.coli UR11基因组为模板，利用PCR技术扩增yrfG基因的上下游同源臂，通过重组PCR的方法获得yrfG基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。通过引物gRNA-yrfG-S(SEQ ID NO.83)和gRNA-yrfG-A(SEQ ID NO.84)的退火制得含目的基因靶序列的DNA片段，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-yrfG。将整合片段和pGRB-yrfG电转化至含有pREDCas9质粒的E.coliC9感受态细胞中，复苏培养获得单菌落，通过PCR菌落验证得到阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yrfG和pREDCas9质粒，即菌株E.coliC10。验证图如图11所示。

3.菌株构建过程中用到的引物

菌株构建过程中的所有引物见下表：

实施例2：基因工程菌E.coli C1050L发酵罐生产胞嘧啶。

用接种环蘸取保菌管中的菌液，均匀涂布于活化斜面，并进行传代培养；将活化斜面上的菌株接种到种子培养基中，37℃培养8h，培养过程中通过补加氨水维持pH值7.2。将种子液按照15％的接种量接入发酵培养基中，开始发酵培养。发酵起始pH值控制在7.2。发酵10h通过补加氨水维持pH值在6.4。发酵12h后开始采用联动反馈脉冲式补糖策略将溶解氧值控制在20％-30％，即在1号补料泵上设定补料的脉冲速率为1/15s，当溶氧值高于30％时1号泵自动开启补加800g/L的葡萄糖溶液，当溶氧值低于20％时1号泵自动关闭。发酵24-26h采用联动反馈脉冲式补料策略将溶解氧值控制在15％-25％，即在1号补料泵上设定补料的脉冲速率为1/15s，2号补料泵上设定补料的脉冲速率为1/10s，当溶氧值高于25％时1、2号泵同时自动开启补加800g/L的葡萄糖溶液和10mL/L玉米浆，当溶氧值低于15％时1、2号泵同时自动关闭。整个发酵过程中温度控制在37℃，发酵周期为45h。发酵结束后发酵液中胞嘧啶浓度可达51.34g/L，糖酸转化率可达16.47％。发酵进程图见附图12。

所述斜面培养基配方为：葡萄糖2.5g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨15g/L，牛肉膏15g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钠1.0g/L，琼脂30g/L；

所述种子培养基配方为：葡萄糖30g/L，酵母粉10g/L，柠檬酸6g/L，蛋白胨6g/L，异亮氨酸0.5g/L，磷酸二氢钾9g/L，硫酸镁2.0g/L，硫酸亚铁40mg/L；

所述发酵培养基配方为：葡萄糖30g/L，酵母粉6g/L，柠檬酸3g/L，蛋白胨4g/L，异亮氨酸0.3g/L，磷酸二氢钾6g/L，硫酸镁2g/L，玉米浆30ml/L，硫酸亚铁10mg/L，硫酸锰3mg/L，氯化钴2mg/L，生物素2mg/L，VB12mg/L。

实施例3：基因工程菌E.coli C10 50L发酵罐生产胞嘧啶。

用接种环蘸取保菌管中的菌液，均匀涂布于活化斜面，并进行传代培养；将活化斜面上的菌株接种到种子培养基中，37℃培养10h，培养过程中通过补加氨水维持pH值在6.8。将种子液按照20％的接种量接入发酵培养基中，开始发酵培养。发酵起始pH值控制在6.8。发酵8h通过补加氨水维持pH值在6.7。发酵12h后开始采用反馈脉冲式补糖策略将溶解氧值控制在25％-35％，即在1号补料泵上设定补料的脉冲速率为1/18s，当溶氧值高于35％时1号泵自动开启补加800g/L的葡萄糖溶液，当溶氧值低于25％时1号泵自动关闭。发酵24-26h采用联动反馈脉冲式补料策略将溶解氧值控制在20％-30％，即在1号补料泵上设定补料的脉冲速率为1/18s，2号补料泵上设定补料的脉冲速率为1/12s，当溶氧值高于30％时1、2号泵同时自动开启补加800g/L的葡萄糖溶液和10mL/L玉米浆，当溶氧值低于20％时1、2号泵同时自动关闭。整个发酵过程中温度控制在37℃，发酵周期为45h。发酵结束后发酵液中可达53.36g/L，糖酸转化率可达16.77％。发酵进程图见附图13。

所述斜面培养基配方为：葡萄糖1.5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钠0.5g/L，琼脂25g/L；

所述种子培养基配方为：葡萄糖10g/L，酵母粉4g/L，柠檬酸1g/L，蛋白胨1g/L，异亮氨酸0.1g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁10mg/L；

所述发酵培养基配方为：葡萄糖30g/L，酵母粉7g/L，柠檬酸3g/L，蛋白胨4g/L，异亮氨酸0.5g/L，磷酸二氢钾7g/L，硫酸镁2g/L，玉米浆30ml/L，硫酸亚铁10mg/L，硫酸锰3mg/L，氯化钴2mg/L，生物素2mg/L，VB12mg/L。

本发明中的基因序列：

SEQ ID NO.1：T7噬菌体的RNA聚合酶基因T7RNAP

GAGATAATTCACAAGTGTGCGCTCGCTCGCAAAATAAAATGGAATGATGAAACTGGGTAATTCCTCGAAGAGAAAAATGCAATAAGTACAATTGCGCAACAAAAGTAAGATCTCGGTCATAAATCAAGAAATAAACCAAAAATCGTAATCGAAAGATAAAAATCTGTAATTGTTTTCCCCTGTTTAGTTGCTAAAAATTGGTTACGTTTATCGCGGTGATTGTTACTTATTAAAACTGTCCTCTAACTACAGAAGGCCCTACACCATGGGATTTACTAACTGGAAGAGGCACTAAATGAACACGATTAACATCGCTAAGAACGACTTCTCTGACATCGAACTGGCTGCTATCCCGTTCAACACTCTGGCTGACCATTACGGTGAGCGTTTAGCTCGCGAACAGTTGGCCCTTGAGCATGAGTCTTACGAGATGGGTGAAGCACGCTTCCGCAAGATGTTTGAGCGTCAACTTAAAGCTGGTGAGGTTGCGGATAACGCTGCCGCCAAGCCTCTCATCACTACCCTACTCCCTAAGATGATTGCACGCATCAACGACTGGTTTGAGGAAGTGAAAGCTAAGCGCGGCAAGCGCCCGACAGCCTTCCAGTTCCTGCAAGAAATCAAGCCGGAAGCCGTAGCGTACATCACCATTAAGACCACTCTGGCTTGCCTAACCAGTGCTGACAATACAACCGTTCAGGCTGTAGCAAGCGCAATCGGTCGGGCCATTGAGGACGAGGCTCGCTTCGGTCGTATCCGTGACCTTGAAGCTAAGCACTTCAAGAAAAACGTTGAGGAACAACTCAACAAGCGCGTAGGGCACGTCTACAAGAAAGCATTTATGCAAGTTGTCGAGGCTGACATGCTCTCTAAGGGTCTACTCGGTGGCGAGGCGTGGTCTTCGTGGCATAAGGAAGACTCTATTCATGTAGGAGTACGCTGCATCGAGATGCTCATTGAGTCAACCGGAATGGTTAGCTTACACCGCCAAAATGCTGGCGTAGTAGGTCAAGACTCTGAGACTATCGAACTCGCACCTGAATACGCTGAGGCTATCGCAACCCGTGCAGGTGCGCTGGCTGGCATCTCTCCGATGTTCCAACCTTGCGTAGTTCCTCCTAAGCCGTGGACTGGCATTACTGGTGGTGGCTATTGGGCTAACGGTCGTCGTCCTCTGGCGCTGGTGCGTACTCACAGTAAGAAAGCACTGATGCGCTACGAAGACGTTTACATGCCTGAGGTGTACAAAGCGATTAACATTGCGCAAAACACCGCATGGAAAATCAACAAGAAAGTCCTAGCGGTCGCCAACGTAATCACCAAGTGGAAGCATTGTCCGGTCGAGGACATCCCTGCGATTGAGCGTGAAGAACTCCCGATGAAACCGGAAGACATCGACATGAATCCTGAGGCTCTCACCGCGTGGAAACGTGCTGCCGCTGCTGTGTACCGCAAGGACAAGGCTCGCAAGTCTCGCCGTATCAGCCTTGAGTTCATGCTTGAGCAAGCCAATAAGTTTGCTAACCATAAGGCCATCTGGTTCCCTTACAACATGGACTGGCGCGGTCGTGTTTACGCTGTGTCAATGTTCAACCCGCAAGGTAACGATATGACCAAAGGACTGCTTACGCTGGCGAAAGGTAAACCAATCGGTAAGGAAGGTTACTACTGGCTGAAAATCCACGGTGCAAACTGTGCGGGTGTCGATAAGGTTCCGTTCCCTGAGCGCATCAAGTTCATTGAGGAAAACCACGAGAACATCATGGCTTGCGCTAAGTCTCCACTGGAGAACACTTGGTGGGCTGAGCAAGATTCTCCGTTCTGCTTCCTTGCGTTCTGCTTTGAGTACGCTGGGGTACAGCACCACGGCCTGAGCTATAACTGCTCCCTTCCGCTGGCGTTTGACGGGTCTTGCTCTGGCATCCAGCACTTCTCCGCGATGCTCCGAGATGAGGTAGGTGGTCGCGCGGTTAACTTGCTTCCTAGTGAAACCGTTCAGGACATCTACGGGATTGTTGCTAAGAAAGTCAACGAGATTCTACAAGCAGACGCAATCAATGGGACCGATAACGAAGTAGTTACCGTGACCGATGAGAACACTGGTGAAATCTCTGAGAAAGTCAAGCTGGGCACTAAGGCACTGGCTGGTCAATGGCTGGCTTACGGTGTTACTCGCAGTGTGACTAAGCGTTCAGTCATGACGCTGGCTTACGGGTCCAAAGAGTTCGGCTTCCGTCAACAAGTGCTGGAAGATACCATTCAGCCAGCTATTGATTCCGGCAAGGGTCTGATGTTCACTCAGCCGAATCAGGCTGCTGGATACATGGCTAAGCTGATTTGGGAATCTGTGAGCGTGACGGTGGTAGCTGCGGTTGAAGCAATGAACTGGCTTAAGTCTGCTGCTAAGCTGCTGGCTGCTGAGGTCAAAGATAAGAAGACTGGAGAGATTCTTCGCAAGCGTTGCGCTGTGCATTGGGTAACTCCTGATGGTTTCCCTGTGTGGCAGGAATACAAGAAGCCTATTCAGACGCGCTTGAACCTGATGTTCCTCGGTCAGTTCCGCTTACAGCCTACCATTAACACCAACAAAGATAGCGAGATTGATGCACACAAACAGGAGTCTGGTATCGCTCCTAACTTTGTACACAGCCAAGACGGTAGCCACCTTCGTAAGACTGTAGTGTGGGCACACGAGAAGTACGGAATCGAATCTTTTGCACTGATTCACGACTCCTTCGGTACCATTCCGGCTGACGCTGCGAACCTGTTCAAAGCAGTGCGCGAAACTATGGTTGACACATATGAGTCTTGTGATGTACTGGCTGATTTCTACGACCAGTTCGCTGACCAGTTGCACGAGTCTCAATTGGACAAAATGCCAGCACTTCCGGCTAAAGGTAACTTGAACCTCCGTGACATCTTAGAGTCGGACTTCGCGTTCGCGTAA

SEQ ID NO.2：胞嘧啶脱氨酶基因codA

GTGTCGAATAACGCTTTACAAACAATTATTAACGCCCGGTTACCAGGCGAAGAGGGGCTGTGGCAGATTCATCTGCAGGACGGAAAAATCAGCGCCATTGATGCGCAATCCGGCGTGATGCCCATAACTGAAAACAGCCTGGATGCCGAACAAGGTTTAGTTATACCGCCGTTTGTGGAGCCACATATTCACCTGGACACCACGCAAACCGCCGGACAACCGAACTGGAATCAGTCCGGCACGCTGTTTGAAGGCATTGAACGCTGGGCCGAGCGCAAAGCGTTATTAACCCATGACGATGTGAAACAACGCGCATGGCAAACGCTGAAATGGCAGATTGCCAACGGCATTCAGCATGTGCGTACCCATGTCGATGTTTCGGATGCAACGCTAACTGCGCTGAAAGCAATGCTGGAAGTGAAGCAGGAAGTCGCGCCGTGGATTGATCTGCAAATCGTCGCCTTCCCTCAGGAAGGGATTTTGTCGTATCCCAACGGTGAAGCGTTGCTGGAAGAGGCGTTACGCTTAGGGGCAGATGTAGTGGGGGCGATTCCGCATTTTGAATTTACCCGTGAATACGGCGTGGAGTCGCTGCATAAAACCTTCGCCCTGGCGCAAAAATACGACCGTCTCATCGACGTTCACTGTGATGAGATCGATGACGAGCAGTCGCGCTTTGTCGAAACCGTTGCTGCCCTGGCGCACCATGAAGGCATGGGCGCGCGAGTCACCGCCAGCCACACCACGGCAATGCACTCCTATAACGGGGCGTATACCTCACGCCTGTTCCGCTTGCTGAAAATGTCCGGTATTAACTTTGTCGCCAACCCGCTGGTCAATATTCATCTGCAAGGACGTTTCGATACGTATCCAAAACGTCGCGGCATCACGCGCGTTAAAGAGATGCTGGAGTCCGGCATTAACGTCTGCTTTGGTCACGATGATGTCTTCGATCCGTGGTATCCGCTGGGAACGGCGAATATGCTGCAAGTGCTGCATATGGGGCTGCATGTTTGCCAGTTGATGGGCTACGGGCAGATTAACGATGGCCTGAATTTAATCACCCACCACAGCGCAAGGACGTTGAATTTGCAGGATTACGGCATTGCCGCCGGAAACAGCGCCAACCTGATTATCCTGCCGGCTGAAAATGGGTTTGATGCGCTGCGCCGTCAGGTTCCGGTACGTTATTCGGTACGTGGCGGCAAGGTGATTGCCAGCACACAACCGGCACAAACCACCGTATATCTGGAGCAGCCAGAAGCCATCGATTACAAACGTTGA

SEQ ID NO.3：胞嘧啶渗透酶基因codB

GTGTCGCAAGATAACAACTTTAGCCAGGGGCCAGTCCCGCAGTCGGCGCGGAAAGGGGTATTGGCATTGACGTTCGTCATGCTGGGATTAACCTTCTTTTCCGCCAGTATGTGGACCGGCGGCACTCTCGGAACCGGTCTTAGCTATCATGATTTCTTCCTCGCAGTTCTCATCGGTAATCTTCTCCTCGGTATTTACACTTCATTTCTCGGTTACATTGGCGCAAAAACCGGCCTGACCACTCATCTTCTTGCTCGCTTCTCGTTTGGTGTTAAAGGCTCATGGCTGCCTTCACTGCTACTGGGCGGAACTCAGGTTGGCTGGTTTGGCGTCGGTGTGGCGATGTTTGCCATTCCGGTGGGTAAGGCAACCGGGCTGGATATTAATTTGCTGATTGCCGTTTCCGGTTTACTGATGACCGTCACCGTCTTTTTTGGCATTTCGGCGCTGACGGTTCTTTCGGTGATTGCGGTTCCGGCTATCGCCTGCCTGGGCGGTTATTCCGTGTGGCTGGCTGTTAACGGCATGGGCGGCCTGGACGCATTAAAAGCGGTCGTTCCCGCACAACCGTTAGATTTCAATGTCGCGCTGGCGCTGGTTGTGGGGTCATTTATCAGTGCGGGTACGCTCACCGCTGACTTTGTCCGGTTTGGTCGCAATGCCAAACTGGCGGTGCTGGTGGCGATGGTGGCCTTTTTCCTCGGCAACTCGTTGATGTTTATTTTCGGTGCAGCGGGCGCTGCGGCACTGGGCATGGCGGATATCTCTGATGTGATGATTGCTCAGGGCCTGCTGCTGCCTGCGATTGTGGTGCTGGGGCTGAATATCTGGACCACCAACGATAACGCACTCTATGCGTCGGGTTTAGGTTTCGCCAACATTACCGGGATGTCGAGCAAAACCCTTTCGGTAATCAACGGTATTATCGGTACGGTCTGCGCATTATGGCTGTATAACAATTTTGTCGGCTGGTTGACCTTCCTTTCGGCAGCTATTCCTCCAGTGGGTGGCGTGATCATCGCCGACTATCTGATGAACCGTCGCCGCTATGAGCACTTTGCGACCACGCGTATGATGAGTGTCAATTGGGTGGCGATTCTGGCGGTCGCCTTGGGGATTGCTGCAGGCCACTGGTTACCGGGAATTGTTCCGGTCAACGCGGTATTAGGTGGCGCGCTGAGCTATCTGATCCTTAACCCGATTTTGAATCGTAAAACGACAGCAGCAATGACGCATGTGGAGGCTAACAGTGTCGAATAA

SEQ ID NO.4：嘧啶单磷酸核苷酶基因ygdH

TTGATTACACATATTAGCCCGCTTGGCTCCATGGATATGTTGTCGCAGCTGGAAGTGGATATGCTTAAACGCACCGCCAGCAGCGACCTCTATCAACTGTTTCGCAACTGTTCACTTGCCGTACTGAACTCCGGTAGTTTGACCGATAACAGCAAAGAATTGCTGTCTCGTTTTGAAAATTTCGATATTAACGTCTTGCGCCGTGAACGCGGCGTAAAGCTGGAACTGATTAATCCCCCGGAAGAGGCTTTTGTCGATGGGCGAATTATTCGCGCTTTGCAGGCCAACTTGTTCGCGGTCCTGCGTGACATTCTCTTCGTTTACGGGCAAATCCATAACACCGTTCGTTTTCCCAACCTGAATCTCGACAACTCCGTCCACATCACTAACCTGGTCTTTTCCATCTTGCGTAACGCTCGCGCGCTGCATGTGGGTGAAGCGCCAAATATGGTGGTCTGCTGGGGCGGTCACTCAATTAACGAAAACGAGTATTTGTATGCCCGTCGCGTCGGAAACCAGCTGGGCCTGCGTGAGCTGAATATCTGCACCGGCTGTGGTCCGGGAGCGATGGAAGCGCCGATGAAAGGTGCTGCGGTCGGACACGCGCAGCAGCGTTACAAAGACAGTCGTTTTATTGGTATGACAGAGCCGTCGATTATCGCCGCTGAACCGCCTAACCCGCTGGTCAACGAATTGATCATCATGCCAGATATCGAAAAACGTCTGGAAGCGTTTGTCCGTATCGCTCACGGTATCATTATCTTCCCTGGCGGTGTGGGTACGGCAGAAGAGTTGCTCTATTTGCTGGGAATTTTAATGAACCCGGCCAACAAAGATCAGGTTTTACCATTGATCCTCACCGGCCCGAAAGAGAGCGCCGACTACTTCCGCGTACTGGACGAGTTTGTCGTGCATACGCTGGGTGAAAACGCGCGCCGCCATTACCGCATCATCATTGATGACGCCGCTGAAGTCGCTCGTCAGATGAAAAAATCGATGCCGCTGGTGAAAGAAAATCGCCGTGATACAGGCGATGCCTACAGCTTTAACTGGTCAATGCGCATTGCGCCAGATTTGCAAATGCCGTTTGAGCCGTCTCACGAGAATATGGCTAATCTGAAGCTTTACCCGGATCAACCTGTTGAAGTGCTGGCTGCCGACCTGCGCCGTGCGTTCTCCGGTATTGTGGCGGGTAACGTAAAAGAAGTCGGTATTCGCGCCATTGAAGAGTTTGGTCCTTACAAAATCAACGGCGATAAAGAGATTATGCGTCGTATGGACGACCTGCTACAGGGTTTTGTTGCCCAGCATCGTATGAAGTTGCCAGGCTCAGCCTACATCCCTTGCTACGAAATCTGCACGTAA

SEQ ID NO.5：核苷三磷酸焦磷酸水解酶基因nudG

ATGAAAATGATTGAAGTTGTTGCCGCCATCATTGAACGTGATGGCAAAATTTTACTCGCGCAACGCCCCGCCCAGAGCGATCAGGCGGGATTATGGGAGTTTGCCGGTGGTAAAGTCGAGCCGGATGAAAGTCAGCGGCAGGCGCTGGTGCGTGAGTTACGCGAAGAACTGGGCATCGAAGCAACTGTGGGTGAATATGTTGCCAGCCATCAGCGAGAAGTTTCGGGGCGGATTATCCATCTTCATGCCTGGCACGTACCCGACTTCCACGGGACGTTACAGGCACATGAACATCAGGCGCTGGTCTGGTGCTCACCTGAAGAGGCGCTGCAATATCCGCTGGCCCCTGCTGACATTCCATTATTAGAGGCGTTTATGGCTTTACGCGCCGCCAGACCAGCGGATTAG

SEQ ID NO.6：尿苷酸激酶基因pyrH^(D93A)(基因突变位点用下划线标出)

ATGGCTACCAATGCAAAACCCGTCTATAAACGCATTCTGCTTAAGTTGAGTGGCGAAGCTCTGCAGGGCACTGAAGGCTTCGGTATTGATGCAAGCATACTGGATCGTATGGCTCAGGAAATCAAAGAACTGGTTGAACTGGGTATTCAGGTTGGTGTGGTGATTGGTGGGGGTAACCTGTTCCGTGGCGCTGGTCTGGCGAAAGCGGGTATGAACCGCGTTGTGGGCGACCACATGGGGATGCTGGCGACCGTAATGAACGGCCTGGCAATGCGTGCTGCACTGCACCGCGCCTATGTGAACGCTCGTCTGATGTCCGCTATTCCATTGAATGGCGTGTGCGACAGCTACAGCTGGGCAGAAGCTATCAGCCTGTTGCGCAACAACCGTGTGGTGATCCTCTCCGCCGGTACAGGTAACCCGTTCTTTACCACCGACTCAGCAGCTTGCCTGCGTGGTATCGAAATTGAAGCCGATGTGGTGCTGAAAGCAACCAAAGTTGACGGCGTGTTTACCGCTGATCCGGCGAAAGATCCAACCGCAACCATGTACGAGCAACTGACTTACAGCGAAGTGCTGGAAAAAGAGCTGAAAGTCATGGACCTGGCGGCCTTCACGCTGGCTCGTGACCATAAATTACCGATTCGTGTTTTCAATATGAACAAACCGGGTGCGCTGCGCCGTGTGGTAATGGGTGAAAAAGAAGGGACTTTAATCACGGAATAA

SEQ ID NO.7：胞苷三磷酸合酶基因pyrG^(E155K)(基因突变位点用下划线标出)

ATGACAACGAACTATATTTTTGTGACCGGCGGGGTCGTATCCTCTCTGGGTAAAGGCATTGCCGCAGCCTCCCTCGCAGCCATTCTTGAAGCCCGTGGCCTCAATGTGACCATCATGAAACTGGATCCGTACATCAACGTCGATCCAGGTACTATGAGCCCAATCCAACACGGGGAAGTGTTCGTTACTGAAGACGGCGCTGAAACCGACCTGGACCTGGGGCACTACGAGCGTTTCATTCGTACCAAAATGAGCCGCCGCAACAACTTCACCACGGGTCGTATCTACTCTGACGTTCTGCGTAAAGAACGCCGCGGTGACTACCTCGGCGCAACCGTGCAGGTTATTCCGCACATCACTAACGCAATCAAAGAGCGCGTGCTGGAAGGTGGCGAAGGTCATGACGTAGTACTGGTAGAAATCGGCGGTACAGTAGGTGATATCGAATCCTTGCCGTTCCTCAAAGCGATTCGCCAGATGGCTGTTGAAATTGGCCGTGAGCACACTCTGTTTATGCACCTGACGCTGGTGCCGTACATGGCAGCGTCTGGTGAAGTCAAAACCAAACCGACTCAGCACTCTGTAAAAGAGCTGCTCTCCATCGGTATCCAGCCTGACATCCTGATTTGTCGTTCAGATCGCGCTGTTCCGGCGAACGAACGTGCGAAGATTGCATTGTTCTGTAATGTTCCGGAAAAAGCGGTTATTTCTCTGAAAGACGTCGATTCCATCTATAAAATTCCGGGCCTGTTGAAATCTCAGGGGCTGGACGATTATATTTGTAAACGATTCAGCTTAAACTGCCCGGAAGCGAATCTGTCCGAATGGGAACAGGTTATCTTCGAAGAAGCGAACCCGGTAAGTGAAGTCACCATCGGTATGGTCGGCAAGTACATTGAACTGCCGGATGCTTATAAATCAGTGATCGAAGCACTGAAACACGGTGGGCTGAAGAATCGTGTCAGCGTCAACATCAAACTGATCGATTCACAAGATGTTGAAACGCGCGGCGTTGAAATCCTTAAAGGTCTGGACGCAATCCTCGTACCTGGCGGTTTCGGCTATCGTGGCGTAGAAGGCATGATTACGACCGCGCGTTTTGCGCGTGAGAACAATATTCCTTATCTGGGCATTTGCCTGGGTATGCAGGTGGCGTTAATTGATTACGCTCGCCATGTTGCCAACATGGAGAACGCCAACTCTACGGAATTTGTGCCAGACTGTAAGTACCCGGTTGTGGCGCTGATTACCGAGTGGCGCGATGAAAACGGCAACGTTGAAGTTCGTAGCGAGAAGAGCGATCTCGGCGGTACCATGCGTCTCGGCGCACAGCAGTGCCAGTTGGTTGACGATAGCCTGGTTCGCCAGCTGTACAATGCGCCGACAATTGTTGAGCGTCATCGTCACCGTTACGAAGTCAACAACATGCTGTTGAAACAGATTGAAGATGCAGGTCTGCGCGTTGCGGGCCGTTCCGGGGATGATCAGTTGGTCGAGATCATCGAAGTTCCGAATCACCCGTGGTTCGTGGCTTGCCAGTTCCATCCGGAGTTTACTTCTACTCCACGTGATGGTCACCCGCTGTTTGCAGGCTTTGTGAAAGCCGCCAGCGAGTTCCAGAAACGTCAGGCGAAGTAA

SEQ ID NO.8：核苷酸酶基因ushA

ATGAAATTATTGCAGCGGGGCGTGGCGTTAGCGCTGTTAACCACATTTACACTGGCGAGTGAAACTGCTCTGGCGTATGAGCAGGATAAAACCTACAAAATTACAGTTCTGCATACCAATGATCATCATGGGCATTTTTGGCGCAATGAATATGGCGAATATGGTCTGGCGGCGCAAAAAACGCTGGTGGATGGTATCCGCAAAGAGGTTGCGGCTGAAGGCGGTAGCGTGCTGCTACTTTCCGGTGGCGACATTAACACTGGCGTGCCCGAGTCTGACTTACAGGATGCCGAACCTGATTTTCGCGGTATGAATCTGGTGGGCTATGACGCGATGGCGATCGGTAATCATGAATTTGATAATCCGCTCACCGTATTACGCCAGCAGGAAAAGTGGGCCAAGTTCCCGTTGCTTTCCGCGAATATCTACCAGAAAAGTACTGGCGAGCGCCTGTTTAAACCGTGGGCGCTGTTTAAGCGTCAGGATCTGAAAATTGCCGTTATTGGGCTGACAACCGATGACACAGCAAAAATTGGTAACCCGGAATACTTCACTGATATCGAATTTCGTAAGCCCGCCGATGAAGCGAAGCTGGTGATTCAGGAGCTGCAACAGACAGAAAAGCCAGACATTATTATCGCGGCGACCCATATGGGGCATTACGATAATGGTGAGCACGGCTCTAACGCACCGGGCGATGTGGAGATGGCACGCGCGCTGCCTGCCGGATCGCTGGCGATGATCGTCGGTGGTCACTCGCAAGATCCGGTCTGCATGGCGGCAGAAAACAAAAAACAGGTCGATTACGTGCCGGGTACGCCATGCAAACCAGATCAACAAAACGGCATCTGGATTGTGCAGGCGCATGAGTGGGGCAAATACGTGGGACGGGCTGATTTTGAGTTTCGTAATGGCGAAATGAAAATGGTTAACTACCAGCTGATTCCGGTGAACCTGAAGAAGAAAGTGACCTGGGAAGACGGGAAAAGCGAGCGCGTGCTTTACACTCCTGAAATCGCTGAAAACCAGCAAATGATCTCGCTGTTATCACCGTTCCAGAACAAAGGCAAAGCGCAGCTGGAAGTGAAAATAGGCGAAACCAATGGTCGTCTGGAAGGCGATCGTGACAAAGTGCGTTTTGTACAGACCAATATGGGGCGGTTGATTCTGGCAGCCCAAATGGATCGCACTGGTGCCGACTTTGCGGTGATGAGCGGAGGCGGAATTCGTGATTCTATCGAAGCAGGCGATATCAGCTATAAAAACGTGCTGAAAGTGCAGCCATTCGGCAATGTGGTGGTGTATGCCGACATGACCGGTAAAGAGGTGATTGATTACCTGACCGCCGTCGCGCAGATGAAGCCAGATTCAGGTGCCTACCCGCAATTTGCCAACGTTAGCTTTGTGGCGAAAGACGGCAAACTGAACGACCTTAAAATCAAAGGCGAACCGGTCGATCCGGCGAAAACTTACCGTATGGCGACATTAAACTTCAATGCCACCGGCGGTGATGGATATCCGCGCCTTGATAACAAACCGGGCTATGTGAATACCGGCTTTATTGATGCCGAAGTGCTGAAAGCGTATATCCAGAAAAGCTCGCCGCTGGATGTGAGTGTTTATGAACCGAAAGGTGAGGTGAGCTGGCAGTAA

SEQ ID NO.9：核苷酸酶基因surE

ATGCGCATATTGCTGAGTAATGATGACGGGGTACATGCACCCGGTATACAAACGCTGGCGAAAGCCTTGCGTGAGTTTGCTGACGTTCAGGTGGTCGCCCCCGATCGTAACCGCAGCGGCGCTTCAAATTCTCTGACACTGGAATCCTCCCTGCGCACGTTTACCTTTGAAAATGGTGATATTGCTGTGCAAATGGGAACCCCGACCGATTGCGTCTATCTTGGCGTGAATGCTCTGATGCGTCCGCGCCCGGACATTGTTGTGTCCGGAATTAACGCCGGGCCGAATCTGGGGGATGATGTTATTTATTCCGGTACGGTAGCCGCCGCGATGGAAGGCCGTCATTTAGGTTTTCCGGCGCTTGCCGTCTCGCTTGACGGGCATAAACATTACGACACTGCCGCGGCGGTAACCTGTTCAATTTTGCGCGCACTGTGTAAAGAGCCGCTGCGCACCGGGCGTATTCTTAATATTAACGTTCCGGATTTACCCTTGGATCAAATCAAAGGTATTCGCGTGACGCGCTGCGGTACACGACATCCGGCAGATCAGGTGATCCCGCAGCAAGATCCGCGCGGCAATACGCTGTACTGGATTGGCCCGCCGGGCGGTAAATGTGATGCTGGTCCGGGGACCGATTTTGCTGCGGTAGATGAGGGCTATGTCTCCATCACGCCGCTGCATGTGGATTTAACTGCGCATAGCGCGCAAGATGTGGTTTCAGACTGGTTAAACAGCGTGGGAGTTGGCACGCAATGGTAA

SEQ ID NO.10：核苷酸酶基因yjjG

ATGAAGTGGGACTGGATTTTCTTTGATGCCGATGAAACGCTGTTTACCTTTGACTCATTCACCGGCCTGCAGCGGATGTTTCTTGATTACAGCGTCACCTTTACCGCTGAAGATTTTCAGGACTATCAGGCCGTTAACAAGCCACTGTGGGTGGATTATCAAAACGGCGCGATCACTTCATTACAGCTTCAGCACGGGCGGTTTGAGAGCTGGGCCGAACGGCTGAACGTCGAGCCAGGTAAACTCAACGAAGCCTTTATTAATGCGATGGCGGAAATCTGCACGCCGCTGCCGGGCGCGGTTTCTCTGCTTAACGCCATTCGTGGCAACGCCAAAATCGGCATCATCACCAACGGCTTTAGTGCCTTGCAACAGGTGCGTCTGGAACGCACGGGCCTGCGTGATTACTTCGATTTGCTGGTGATTTCCGAAGAAGTTGGCGTTGCCAAACCGAATAAGAAAATTTTCGATTATGCGCTGGAACAGGCGGGCAATCCTGACCGTTCACGCGTGCTGATGGTTGGCGACACTGCCGAGTCCGATATTCTCGGTGGCATCAACGCCGGGCTTGCGACCTGCTGGCTGAATGCACACCATCGCGAGCAACCAGAAGGCATCGCGCCCACCTGGACCGTTTCTTCGTTGCACGAACTGGAGCAGCTCCTGTGTAAACACTGA

SEQ ID NO.11：核苷酸酶基因yrfG

ATGCATATCAACATTGCCTGGCAGGACGTAGATACCGTTCTGCTGGATATGGACGGCACGTTGCTCGACCTCGCCTTCGATAACTATTTCTGGCAAAAGCTGGTGCCTGAAACATGGGGCGCGAAAAACGGGGTTACGCCACAGGAAGCGATGGAATATATGCGCCAGCAATATCACGACGTACAGCATACGCTAAACTGGTACTGTCTTGATTACTGGAGTGAGCAACTGGGTCTGGATATCTGTGCGATGACCACCGAGATGGGACCGCGTGCCGTACTGCGTGAAGATACCATTCCGTTTCTTGAGGCACTGAAAGCCAGCGGTAAGCAGCGAATTTTGCTCACCAATGCGCATCCGCACAACCTGGCGGTAAAACTTGAGCATACCGGTCTGGACGCACACCTTGATTTATTACTTTCCACCCACACATTTGGTTATCCGAAAGAGGATCAGCGGTTATGGCATGCGGTGGCCGAAGCTACGGGTCTGAAAGCTGAAAGAACGCTGTTTATTGATGACAGCGAAGCGATTCTCGATGCTGCCGCGCAATTTGGTATTCGTTACTGCCTCGGCGTGACTAATCCTGATTCCGGGATTGCCGAGAAACAGTATCAACGCCATCCGTCACTGAATGACTACCGCCGCCTGATCCCCTCGCTAATGTGA

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一株生产胞嘧啶的大肠杆菌及其构建方法与应用

<160> 84

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2947

<212> DNA

<213> T7噬菌体的RNA聚合酶基因T7RNAP(Unknown)

<400> 1

gagataattc acaagtgtgc gctcgctcgc aaaataaaat ggaatgatga aactgggtaa 60

ttcctcgaag agaaaaatgc aataagtaca attgcgcaac aaaagtaaga tctcggtcat 120

aaatcaagaa ataaaccaaa aatcgtaatc gaaagataaa aatctgtaat tgttttcccc 180

tgtttagttg ctaaaaattg gttacgttta tcgcggtgat tgttacttat taaaactgtc 240

ctctaactac agaaggccct acaccatggg atttactaac tggaagaggc actaaatgaa 300

cacgattaac atcgctaaga acgacttctc tgacatcgaa ctggctgcta tcccgttcaa 360

cactctggct gaccattacg gtgagcgttt agctcgcgaa cagttggccc ttgagcatga 420

gtcttacgag atgggtgaag cacgcttccg caagatgttt gagcgtcaac ttaaagctgg 480

tgaggttgcg gataacgctg ccgccaagcc tctcatcact accctactcc ctaagatgat 540

tgcacgcatc aacgactggt ttgaggaagt gaaagctaag cgcggcaagc gcccgacagc 600

cttccagttc ctgcaagaaa tcaagccgga agccgtagcg tacatcacca ttaagaccac 660

tctggcttgc ctaaccagtg ctgacaatac aaccgttcag gctgtagcaa gcgcaatcgg 720

tcgggccatt gaggacgagg ctcgcttcgg tcgtatccgt gaccttgaag ctaagcactt 780

caagaaaaac gttgaggaac aactcaacaa gcgcgtaggg cacgtctaca agaaagcatt 840

tatgcaagtt gtcgaggctg acatgctctc taagggtcta ctcggtggcg aggcgtggtc 900

ttcgtggcat aaggaagact ctattcatgt aggagtacgc tgcatcgaga tgctcattga 960

gtcaaccgga atggttagct tacaccgcca aaatgctggc gtagtaggtc aagactctga 1020

gactatcgaa ctcgcacctg aatacgctga ggctatcgca acccgtgcag gtgcgctggc 1080

tggcatctct ccgatgttcc aaccttgcgt agttcctcct aagccgtgga ctggcattac 1140

tggtggtggc tattgggcta acggtcgtcg tcctctggcg ctggtgcgta ctcacagtaa 1200

gaaagcactg atgcgctacg aagacgttta catgcctgag gtgtacaaag cgattaacat 1260

tgcgcaaaac accgcatgga aaatcaacaa gaaagtccta gcggtcgcca acgtaatcac 1320

caagtggaag cattgtccgg tcgaggacat ccctgcgatt gagcgtgaag aactcccgat 1380

gaaaccggaa gacatcgaca tgaatcctga ggctctcacc gcgtggaaac gtgctgccgc 1440

tgctgtgtac cgcaaggaca aggctcgcaa gtctcgccgt atcagccttg agttcatgct 1500

tgagcaagcc aataagtttg ctaaccataa ggccatctgg ttcccttaca acatggactg 1560

gcgcggtcgt gtttacgctg tgtcaatgtt caacccgcaa ggtaacgata tgaccaaagg 1620

actgcttacg ctggcgaaag gtaaaccaat cggtaaggaa ggttactact ggctgaaaat 1680

ccacggtgca aactgtgcgg gtgtcgataa ggttccgttc cctgagcgca tcaagttcat 1740

tgaggaaaac cacgagaaca tcatggcttg cgctaagtct ccactggaga acacttggtg 1800

ggctgagcaa gattctccgt tctgcttcct tgcgttctgc tttgagtacg ctggggtaca 1860

gcaccacggc ctgagctata actgctccct tccgctggcg tttgacgggt cttgctctgg 1920

catccagcac ttctccgcga tgctccgaga tgaggtaggt ggtcgcgcgg ttaacttgct 1980

tcctagtgaa accgttcagg acatctacgg gattgttgct aagaaagtca acgagattct 2040

acaagcagac gcaatcaatg ggaccgataa cgaagtagtt accgtgaccg atgagaacac 2100

tggtgaaatc tctgagaaag tcaagctggg cactaaggca ctggctggtc aatggctggc 2160

ttacggtgtt actcgcagtg tgactaagcg ttcagtcatg acgctggctt acgggtccaa 2220

agagttcggc ttccgtcaac aagtgctgga agataccatt cagccagcta ttgattccgg 2280

caagggtctg atgttcactc agccgaatca ggctgctgga tacatggcta agctgatttg 2340

ggaatctgtg agcgtgacgg tggtagctgc ggttgaagca atgaactggc ttaagtctgc 2400

tgctaagctg ctggctgctg aggtcaaaga taagaagact ggagagattc ttcgcaagcg 2460

ttgcgctgtg cattgggtaa ctcctgatgg tttccctgtg tggcaggaat acaagaagcc 2520

tattcagacg cgcttgaacc tgatgttcct cggtcagttc cgcttacagc ctaccattaa 2580

caccaacaaa gatagcgaga ttgatgcaca caaacaggag tctggtatcg ctcctaactt 2640

tgtacacagc caagacggta gccaccttcg taagactgta gtgtgggcac acgagaagta 2700

cggaatcgaa tcttttgcac tgattcacga ctccttcggt accattccgg ctgacgctgc 2760

gaacctgttc aaagcagtgc gcgaaactat ggttgacaca tatgagtctt gtgatgtact 2820

ggctgatttc tacgaccagt tcgctgacca gttgcacgag tctcaattgg acaaaatgcc 2880

agcacttccg gctaaaggta acttgaacct ccgtgacatc ttagagtcgg acttcgcgtt 2940

cgcgtaa 2947

<210> 2

<211> 1284

<212> DNA

<213> 胞嘧啶脱氨酶基因codA(Unknown)

<400> 2

gtgtcgaata acgctttaca aacaattatt aacgcccggt taccaggcga agaggggctg 60

tggcagattc atctgcagga cggaaaaatc agcgccattg atgcgcaatc cggcgtgatg 120

cccataactg aaaacagcct ggatgccgaa caaggtttag ttataccgcc gtttgtggag 180

ccacatattc acctggacac cacgcaaacc gccggacaac cgaactggaa tcagtccggc 240

acgctgtttg aaggcattga acgctgggcc gagcgcaaag cgttattaac ccatgacgat 300

gtgaaacaac gcgcatggca aacgctgaaa tggcagattg ccaacggcat tcagcatgtg 360

cgtacccatg tcgatgtttc ggatgcaacg ctaactgcgc tgaaagcaat gctggaagtg 420

aagcaggaag tcgcgccgtg gattgatctg caaatcgtcg ccttccctca ggaagggatt 480

ttgtcgtatc ccaacggtga agcgttgctg gaagaggcgt tacgcttagg ggcagatgta 540

gtgggggcga ttccgcattt tgaatttacc cgtgaatacg gcgtggagtc gctgcataaa 600

accttcgccc tggcgcaaaa atacgaccgt ctcatcgacg ttcactgtga tgagatcgat 660

gacgagcagt cgcgctttgt cgaaaccgtt gctgccctgg cgcaccatga aggcatgggc 720

gcgcgagtca ccgccagcca caccacggca atgcactcct ataacggggc gtatacctca 780

cgcctgttcc gcttgctgaa aatgtccggt attaactttg tcgccaaccc gctggtcaat 840

attcatctgc aaggacgttt cgatacgtat ccaaaacgtc gcggcatcac gcgcgttaaa 900

gagatgctgg agtccggcat taacgtctgc tttggtcacg atgatgtctt cgatccgtgg 960

tatccgctgg gaacggcgaa tatgctgcaa gtgctgcata tggggctgca tgtttgccag 1020

ttgatgggct acgggcagat taacgatggc ctgaatttaa tcacccacca cagcgcaagg 1080

acgttgaatt tgcaggatta cggcattgcc gccggaaaca gcgccaacct gattatcctg 1140

ccggctgaaa atgggtttga tgcgctgcgc cgtcaggttc cggtacgtta ttcggtacgt 1200

ggcggcaagg tgattgccag cacacaaccg gcacaaacca ccgtatatct ggagcagcca 1260

gaagccatcg attacaaacg ttga 1284

<210> 3

<211> 1260

<212> DNA

<213> 胞嘧啶渗透酶基因codB(Unknown)

<400> 3

gtgtcgcaag ataacaactt tagccagggg ccagtcccgc agtcggcgcg gaaaggggta 60

ttggcattga cgttcgtcat gctgggatta accttctttt ccgccagtat gtggaccggc 120

ggcactctcg gaaccggtct tagctatcat gatttcttcc tcgcagttct catcggtaat 180

cttctcctcg gtatttacac ttcatttctc ggttacattg gcgcaaaaac cggcctgacc 240

actcatcttc ttgctcgctt ctcgtttggt gttaaaggct catggctgcc ttcactgcta 300

ctgggcggaa ctcaggttgg ctggtttggc gtcggtgtgg cgatgtttgc cattccggtg 360

ggtaaggcaa ccgggctgga tattaatttg ctgattgccg tttccggttt actgatgacc 420

gtcaccgtct tttttggcat ttcggcgctg acggttcttt cggtgattgc ggttccggct 480

atcgcctgcc tgggcggtta ttccgtgtgg ctggctgtta acggcatggg cggcctggac 540

gcattaaaag cggtcgttcc cgcacaaccg ttagatttca atgtcgcgct ggcgctggtt 600

gtggggtcat ttatcagtgc gggtacgctc accgctgact ttgtccggtt tggtcgcaat 660

gccaaactgg cggtgctggt ggcgatggtg gcctttttcc tcggcaactc gttgatgttt 720

attttcggtg cagcgggcgc tgcggcactg ggcatggcgg atatctctga tgtgatgatt 780

gctcagggcc tgctgctgcc tgcgattgtg gtgctggggc tgaatatctg gaccaccaac 840

gataacgcac tctatgcgtc gggtttaggt ttcgccaaca ttaccgggat gtcgagcaaa 900

accctttcgg taatcaacgg tattatcggt acggtctgcg cattatggct gtataacaat 960

tttgtcggct ggttgacctt cctttcggca gctattcctc cagtgggtgg cgtgatcatc 1020

gccgactatc tgatgaaccg tcgccgctat gagcactttg cgaccacgcg tatgatgagt 1080

gtcaattggg tggcgattct ggcggtcgcc ttggggattg ctgcaggcca ctggttaccg 1140

ggaattgttc cggtcaacgc ggtattaggt ggcgcgctga gctatctgat ccttaacccg 1200

attttgaatc gtaaaacgac agcagcaatg acgcatgtgg aggctaacag tgtcgaataa 1260

<210> 4

<211> 1365

<212> DNA

<213> 嘧啶单磷酸核苷酶基因ygdH(Unknown)

<400> 4

ttgattacac atattagccc gcttggctcc atggatatgt tgtcgcagct ggaagtggat 60

atgcttaaac gcaccgccag cagcgacctc tatcaactgt ttcgcaactg ttcacttgcc 120

gtactgaact ccggtagttt gaccgataac agcaaagaat tgctgtctcg ttttgaaaat 180

ttcgatatta acgtcttgcg ccgtgaacgc ggcgtaaagc tggaactgat taatcccccg 240

gaagaggctt ttgtcgatgg gcgaattatt cgcgctttgc aggccaactt gttcgcggtc 300

ctgcgtgaca ttctcttcgt ttacgggcaa atccataaca ccgttcgttt tcccaacctg 360

aatctcgaca actccgtcca catcactaac ctggtctttt ccatcttgcg taacgctcgc 420

gcgctgcatg tgggtgaagc gccaaatatg gtggtctgct ggggcggtca ctcaattaac 480

gaaaacgagt atttgtatgc ccgtcgcgtc ggaaaccagc tgggcctgcg tgagctgaat 540

atctgcaccg gctgtggtcc gggagcgatg gaagcgccga tgaaaggtgc tgcggtcgga 600

cacgcgcagc agcgttacaa agacagtcgt tttattggta tgacagagcc gtcgattatc 660

gccgctgaac cgcctaaccc gctggtcaac gaattgatca tcatgccaga tatcgaaaaa 720

cgtctggaag cgtttgtccg tatcgctcac ggtatcatta tcttccctgg cggtgtgggt 780

acggcagaag agttgctcta tttgctggga attttaatga acccggccaa caaagatcag 840

gttttaccat tgatcctcac cggcccgaaa gagagcgccg actacttccg cgtactggac 900

gagtttgtcg tgcatacgct gggtgaaaac gcgcgccgcc attaccgcat catcattgat 960

gacgccgctg aagtcgctcg tcagatgaaa aaatcgatgc cgctggtgaa agaaaatcgc 1020

cgtgatacag gcgatgccta cagctttaac tggtcaatgc gcattgcgcc agatttgcaa 1080

atgccgtttg agccgtctca cgagaatatg gctaatctga agctttaccc ggatcaacct 1140

gttgaagtgc tggctgccga cctgcgccgt gcgttctccg gtattgtggc gggtaacgta 1200

aaagaagtcg gtattcgcgc cattgaagag tttggtcctt acaaaatcaa cggcgataaa 1260

gagattatgc gtcgtatgga cgacctgcta cagggttttg ttgcccagca tcgtatgaag 1320

ttgccaggct cagcctacat cccttgctac gaaatctgca cgtaa 1365

<210> 5

<211> 408

<212> DNA

<213> 核苷三磷酸焦磷酸水解酶基因nudG(Unknown)

<400> 5

atgaaaatga ttgaagttgt tgccgccatc attgaacgtg atggcaaaat tttactcgcg 60

caacgccccg cccagagcga tcaggcggga ttatgggagt ttgccggtgg taaagtcgag 120

ccggatgaaa gtcagcggca ggcgctggtg cgtgagttac gcgaagaact gggcatcgaa 180

gcaactgtgg gtgaatatgt tgccagccat cagcgagaag tttcggggcg gattatccat 240

cttcatgcct ggcacgtacc cgacttccac gggacgttac aggcacatga acatcaggcg 300

ctggtctggt gctcacctga agaggcgctg caatatccgc tggcccctgc tgacattcca 360

ttattagagg cgtttatggc tttacgcgcc gccagaccag cggattag 408

<210> 6

<211> 726

<212> DNA

<213> 尿苷酸激酶基因pyrH(D93AUnknown)

<400> 6

atggctacca atgcaaaacc cgtctataaa cgcattctgc ttaagttgag tggcgaagct 60

ctgcagggca ctgaaggctt cggtattgat gcaagcatac tggatcgtat ggctcaggaa 120

atcaaagaac tggttgaact gggtattcag gttggtgtgg tgattggtgg gggtaacctg 180

ttccgtggcg ctggtctggc gaaagcgggt atgaaccgcg ttgtgggcga ccacatgggg 240

atgctggcga ccgtaatgaa cggcctggca atgcgtgctg cactgcaccg cgcctatgtg 300

aacgctcgtc tgatgtccgc tattccattg aatggcgtgt gcgacagcta cagctgggca 360

gaagctatca gcctgttgcg caacaaccgt gtggtgatcc tctccgccgg tacaggtaac 420

ccgttcttta ccaccgactc agcagcttgc ctgcgtggta tcgaaattga agccgatgtg 480

gtgctgaaag caaccaaagt tgacggcgtg tttaccgctg atccggcgaa agatccaacc 540

gcaaccatgt acgagcaact gacttacagc gaagtgctgg aaaaagagct gaaagtcatg 600

gacctggcgg ccttcacgct ggctcgtgac cataaattac cgattcgtgt tttcaatatg 660

aacaaaccgg gtgcgctgcg ccgtgtggta atgggtgaaa aagaagggac tttaatcacg 720

gaataa 726

<210> 7

<211> 1638

<212> DNA

<213> 胞苷三磷酸合酶基因pyrG(E155KUnknown)

<400> 7

atgacaacga actatatttt tgtgaccggc ggggtcgtat cctctctggg taaaggcatt 60

gccgcagcct ccctcgcagc cattcttgaa gcccgtggcc tcaatgtgac catcatgaaa 120

ctggatccgt acatcaacgt cgatccaggt actatgagcc caatccaaca cggggaagtg 180

ttcgttactg aagacggcgc tgaaaccgac ctggacctgg ggcactacga gcgtttcatt 240

cgtaccaaaa tgagccgccg caacaacttc accacgggtc gtatctactc tgacgttctg 300

cgtaaagaac gccgcggtga ctacctcggc gcaaccgtgc aggttattcc gcacatcact 360

aacgcaatca aagagcgcgt gctggaaggt ggcgaaggtc atgacgtagt actggtagaa 420

atcggcggta cagtaggtga tatcgaatcc ttgccgttcc tcaaagcgat tcgccagatg 480

gctgttgaaa ttggccgtga gcacactctg tttatgcacc tgacgctggt gccgtacatg 540

gcagcgtctg gtgaagtcaa aaccaaaccg actcagcact ctgtaaaaga gctgctctcc 600

atcggtatcc agcctgacat cctgatttgt cgttcagatc gcgctgttcc ggcgaacgaa 660

cgtgcgaaga ttgcattgtt ctgtaatgtt ccggaaaaag cggttatttc tctgaaagac 720

gtcgattcca tctataaaat tccgggcctg ttgaaatctc aggggctgga cgattatatt 780

tgtaaacgat tcagcttaaa ctgcccggaa gcgaatctgt ccgaatggga acaggttatc 840

ttcgaagaag cgaacccggt aagtgaagtc accatcggta tggtcggcaa gtacattgaa 900

ctgccggatg cttataaatc agtgatcgaa gcactgaaac acggtgggct gaagaatcgt 960

gtcagcgtca acatcaaact gatcgattca caagatgttg aaacgcgcgg cgttgaaatc 1020

cttaaaggtc tggacgcaat cctcgtacct ggcggtttcg gctatcgtgg cgtagaaggc 1080

atgattacga ccgcgcgttt tgcgcgtgag aacaatattc cttatctggg catttgcctg 1140

ggtatgcagg tggcgttaat tgattacgct cgccatgttg ccaacatgga gaacgccaac 1200

tctacggaat ttgtgccaga ctgtaagtac ccggttgtgg cgctgattac cgagtggcgc 1260

gatgaaaacg gcaacgttga agttcgtagc gagaagagcg atctcggcgg taccatgcgt 1320

ctcggcgcac agcagtgcca gttggttgac gatagcctgg ttcgccagct gtacaatgcg 1380

ccgacaattg ttgagcgtca tcgtcaccgt tacgaagtca acaacatgct gttgaaacag 1440

attgaagatg caggtctgcg cgttgcgggc cgttccgggg atgatcagtt ggtcgagatc 1500

atcgaagttc cgaatcaccc gtggttcgtg gcttgccagt tccatccgga gtttacttct 1560

actccacgtg atggtcaccc gctgtttgca ggctttgtga aagccgccag cgagttccag 1620

aaacgtcagg cgaagtaa 1638

<210> 8

<211> 1653

<212> DNA

<213> 核苷酸酶基因ushA(Unknown)

<400> 8

atgaaattat tgcagcgggg cgtggcgtta gcgctgttaa ccacatttac actggcgagt 60

gaaactgctc tggcgtatga gcaggataaa acctacaaaa ttacagttct gcataccaat 120

gatcatcatg ggcatttttg gcgcaatgaa tatggcgaat atggtctggc ggcgcaaaaa 180

acgctggtgg atggtatccg caaagaggtt gcggctgaag gcggtagcgt gctgctactt 240

tccggtggcg acattaacac tggcgtgccc gagtctgact tacaggatgc cgaacctgat 300

tttcgcggta tgaatctggt gggctatgac gcgatggcga tcggtaatca tgaatttgat 360

aatccgctca ccgtattacg ccagcaggaa aagtgggcca agttcccgtt gctttccgcg 420

aatatctacc agaaaagtac tggcgagcgc ctgtttaaac cgtgggcgct gtttaagcgt 480

caggatctga aaattgccgt tattgggctg acaaccgatg acacagcaaa aattggtaac 540

ccggaatact tcactgatat cgaatttcgt aagcccgccg atgaagcgaa gctggtgatt 600

caggagctgc aacagacaga aaagccagac attattatcg cggcgaccca tatggggcat 660

tacgataatg gtgagcacgg ctctaacgca ccgggcgatg tggagatggc acgcgcgctg 720

cctgccggat cgctggcgat gatcgtcggt ggtcactcgc aagatccggt ctgcatggcg 780

gcagaaaaca aaaaacaggt cgattacgtg ccgggtacgc catgcaaacc agatcaacaa 840

aacggcatct ggattgtgca ggcgcatgag tggggcaaat acgtgggacg ggctgatttt 900

gagtttcgta atggcgaaat gaaaatggtt aactaccagc tgattccggt gaacctgaag 960

aagaaagtga cctgggaaga cgggaaaagc gagcgcgtgc tttacactcc tgaaatcgct 1020

gaaaaccagc aaatgatctc gctgttatca ccgttccaga acaaaggcaa agcgcagctg 1080

gaagtgaaaa taggcgaaac caatggtcgt ctggaaggcg atcgtgacaa agtgcgtttt 1140

gtacagacca atatggggcg gttgattctg gcagcccaaa tggatcgcac tggtgccgac 1200

tttgcggtga tgagcggagg cggaattcgt gattctatcg aagcaggcga tatcagctat 1260

aaaaacgtgc tgaaagtgca gccattcggc aatgtggtgg tgtatgccga catgaccggt 1320

aaagaggtga ttgattacct gaccgccgtc gcgcagatga agccagattc aggtgcctac 1380

ccgcaatttg ccaacgttag ctttgtggcg aaagacggca aactgaacga ccttaaaatc 1440

aaaggcgaac cggtcgatcc ggcgaaaact taccgtatgg cgacattaaa cttcaatgcc 1500

accggcggtg atggatatcc gcgccttgat aacaaaccgg gctatgtgaa taccggcttt 1560

attgatgccg aagtgctgaa agcgtatatc cagaaaagct cgccgctgga tgtgagtgtt 1620

tatgaaccga aaggtgaggt gagctggcag taa 1653

<210> 9

<211> 762

<212> DNA

<213> 核苷酸酶基因surE(Unknown)

<400> 9

atgcgcatat tgctgagtaa tgatgacggg gtacatgcac ccggtataca aacgctggcg 60

aaagccttgc gtgagtttgc tgacgttcag gtggtcgccc ccgatcgtaa ccgcagcggc 120

gcttcaaatt ctctgacact ggaatcctcc ctgcgcacgt ttacctttga aaatggtgat 180

attgctgtgc aaatgggaac cccgaccgat tgcgtctatc ttggcgtgaa tgctctgatg 240

cgtccgcgcc cggacattgt tgtgtccgga attaacgccg ggccgaatct gggggatgat 300

gttatttatt ccggtacggt agccgccgcg atggaaggcc gtcatttagg ttttccggcg 360

cttgccgtct cgcttgacgg gcataaacat tacgacactg ccgcggcggt aacctgttca 420

attttgcgcg cactgtgtaa agagccgctg cgcaccgggc gtattcttaa tattaacgtt 480

ccggatttac ccttggatca aatcaaaggt attcgcgtga cgcgctgcgg tacacgacat 540

ccggcagatc aggtgatccc gcagcaagat ccgcgcggca atacgctgta ctggattggc 600

ccgccgggcg gtaaatgtga tgctggtccg gggaccgatt ttgctgcggt agatgagggc 660

tatgtctcca tcacgccgct gcatgtggat ttaactgcgc atagcgcgca agatgtggtt 720

tcagactggt taaacagcgt gggagttggc acgcaatggt aa 762

<210> 10

<211> 678

<212> DNA

<213> 核苷酸酶基因yjjG(Unknown)

<400> 10

atgaagtggg actggatttt ctttgatgcc gatgaaacgc tgtttacctt tgactcattc 60

accggcctgc agcggatgtt tcttgattac agcgtcacct ttaccgctga agattttcag 120

gactatcagg ccgttaacaa gccactgtgg gtggattatc aaaacggcgc gatcacttca 180

ttacagcttc agcacgggcg gtttgagagc tgggccgaac ggctgaacgt cgagccaggt 240

aaactcaacg aagcctttat taatgcgatg gcggaaatct gcacgccgct gccgggcgcg 300

gtttctctgc ttaacgccat tcgtggcaac gccaaaatcg gcatcatcac caacggcttt 360

agtgccttgc aacaggtgcg tctggaacgc acgggcctgc gtgattactt cgatttgctg 420

gtgatttccg aagaagttgg cgttgccaaa ccgaataaga aaattttcga ttatgcgctg 480

gaacaggcgg gcaatcctga ccgttcacgc gtgctgatgg ttggcgacac tgccgagtcc 540

gatattctcg gtggcatcaa cgccgggctt gcgacctgct ggctgaatgc acaccatcgc 600

gagcaaccag aaggcatcgc gcccacctgg accgtttctt cgttgcacga actggagcag 660

ctcctgtgta aacactga 678

<210> 11

<211> 669

<212> DNA

<213> 核苷酸酶基因yrfG(Unknown)

<400> 11

atgcatatca acattgcctg gcaggacgta gataccgttc tgctggatat ggacggcacg 60

ttgctcgacc tcgccttcga taactatttc tggcaaaagc tggtgcctga aacatggggc 120

gcgaaaaacg gggttacgcc acaggaagcg atggaatata tgcgccagca atatcacgac 180

gtacagcata cgctaaactg gtactgtctt gattactgga gtgagcaact gggtctggat 240

atctgtgcga tgaccaccga gatgggaccg cgtgccgtac tgcgtgaaga taccattccg 300

tttcttgagg cactgaaagc cagcggtaag cagcgaattt tgctcaccaa tgcgcatccg 360

cacaacctgg cggtaaaact tgagcatacc ggtctggacg cacaccttga tttattactt 420

tccacccaca catttggtta tccgaaagag gatcagcggt tatggcatgc ggtggccgaa 480

gctacgggtc tgaaagctga aagaacgctg tttattgatg acagcgaagc gattctcgat 540

gctgccgcgc aatttggtat tcgttactgc ctcggcgtga ctaatcctga ttccgggatt 600

gccgagaaac agtatcaacg ccatccgtca ctgaatgact accgccgcct gatcccctcg 660

ctaatgtga 669

<210> 12

<211> 61

<212> DNA

<213> T7启动子的基因序列(Unknown)

<400> 12

taatacgact cactataggg tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac 60

c 61

<210> 13

<211> 74

<212> DNA

<213> Ptrc启动子的基因序列(Unknown)

<400> 13

ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 60

acaggaaaca gacc 74

<210> 14

<211> 265

<212> DNA

<213> PxylF启动子的基因序列(Unknown)

<400> 14

gagataattc acaagtgtgc gctcgctcgc aaaataaaat ggaatgatga aactgggtaa 60

ttcctcgaag agaaaaatgc aataagtaca attgcgcaac aaaagtaaga tctcggtcat 120

aaatcaagaa ataaaccaaa aatcgtaatc gaaagataaa aatctgtaat tgttttcccc 180

tgtttagttg ctaaaaattg gttacgttta tcgcggtgat tgttacttat taaaactgtc 240

ctctaactac agaaggccct acacc 265

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> UP-lacI-lacZ-S(Unknown)

<400> 15

acaacaactg gcgggcaaac 20

<210> 16

<211> 47

<212> DNA

<213> UP-lacI-lacZ-A(Unknown)

<400> 16

cgagcgcaca cttgtgaatt atctccgccg agacagaact taatggg 47

<210> 17

<211> 54

<212> DNA

<213> DN-PxylF-lacI-lacZ-S(Unknown)

<400> 17

aaataccttg atactgtgcc ggcaggtagc agagcgggta aactggctcg gatt 54

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> DN-lacI-lacZ-A(Unknown)

<400> 18

ggatttcctt acgcgaaata cg 22

<210> 19

<211> 47

<212> DNA

<213> PxylF-T7RNAP-S(Unknown)

<400> 19

cccattaagt tctgtctcgg cggagataat tcacaagtgt gcgctcg 47

<210> 20

<211> 54

<212> DNA

<213> T7RNAP-PxylF-A(Unknown)

<400> 20

aatccgagcc agtttacccg ctctgctacc tgccggcaca gtatcaaggt attt 54

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> UP-codA-codB-S(Unknown)

<400> 21

atgatttctt cctcgcagtt ctc 23

<210> 22

<211> 44

<212> DNA

<213> UP-codA-codB-A(Unknown)

<400> 22

agacatcatc gtgaccaaag cagacggtga cggtcatcag taaa 44

<210> 23

<211> 44

<212> DNA

<213> DN-codA-codB-S(Unknown)

<400> 23

tttactgatg accgtcaccg tctgctttgg tcacgatgat gtct 44

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> DN-codA-codB-A(Unknown)

<400> 24

gctccagata tacggtggtt tgt 23

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> UP-mbhA-S(Unknown)

<400> 25

gccagcacga acataatccc 20

<210> 26

<211> 64

<212> DNA

<213> UP-mbhA-T7-A(Unknown)

<400> 26

taaagttaaa caaaattatt tctagaccct atagtgagtc gtattacacg gtggcaggtt 60

ttgg 64

<210> 27

<211> 55

<212> DNA

<213> DN-T7-mbhA-S(Unknown)

<400> 27

tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttggaccaa aagtgcgtcc gatac 55

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> DN-mbhA-A(Unknown)

<400> 28

cggcgtaatc acaaactggc 20

<210> 29

<211> 70

<212> DNA

<213> T7-ygdH-S(Unknown)

<400> 29

tagggtctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tataccttga ttacacatat 60

tagcccgctt 70

<210> 30

<211> 57

<212> DNA

<213> ygdH-T7-A(Unknown)

<400> 30

agacccgttt agaggcccca aggggttatg ctagttacgt gcagatttcg tagcaag 57

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> UP-yeeP-S(Unknown)

<400> 31

ggtcaggagg taacttatca gcg 23

<210> 32

<211> 74

<212> DNA

<213> UP-yeeP-Ptrc-A(Unknown)

<400> 32

aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaaatgg 60

cagggctccg tttt 74

<210> 33

<211> 86

<212> DNA

<213> DN-Ptrc-yeeP-S(Unknown)

<400> 33

aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca 60

aatactggat tttcttctga acctgt 86

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> DN-yeeP-A(Unknown)

<400> 34

acgatgtcag cagccagca 19

<210> 35

<211> 83

<212> DNA

<213> Ptrc-nudG-S(Unknown)

<400> 35

tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc 60

atgaaaatga ttgaagttgt tgc 83

<210> 36

<211> 81

<212> DNA

<213> nudG-Ptrc-A(Unknown)

<400> 36

caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat 60

ttgctaatcc gctggtctgg c 81

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> UP-cdd-S(Unknown)

<400> 37

gccgaaatca gtcaccacg 19

<210> 38

<211> 77

<212> DNA

<213> UP-cdd-Ptrc-A(Unknown)

<400> 38

aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaagttt 60

gaaaacgtgg atgcatg 77

<210> 39

<211> 83

<212> DNA

<213> DN-Ptrc-cdd-S(Unknown)

<400> 39

aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca 60

aattcaaccc gactctgcca ccg 83

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> DN-cdd-A(Unknown)

<400> 40

actaacaggc tgaggaacac gc 22

<210> 41

<211> 81

<212> DNA

<213> Ptrc-pyrH(D93A)-S(Unknown)

<400> 41

tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc 60

atggctacca atgcaaaacc c 81

<210> 42

<211> 88

<212> DNA

<213> pyrH(D93A)-Ptrc-A(Unknown)

<400> 42

caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat 60

ttgttattcc gtgattaaag tcccttct 88

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> UP-ilvG-S(Unknown)

<400> 43

accgaggagc agacaatgaa taa 23

<210> 44

<211> 76

<212> DNA

<213> UP-ilvG-Ptrc-A(Unknown)

<400> 44

aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaaggtg 60

atggcaacaa caggga 76

<210> 45

<211> 84

<212> DNA

<213> DN-Ptrc-ilvG-S(Unknown)

<400> 45

aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca 60

aatctatcta cgcgccgttg ttgt 84

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> DN-ilvG-A(Unknown)

<400> 46

gcgctggcta acatgaggaa 20

<210> 47

<211> 87

<212> DNA

<213> Ptrc-pyrG(E155K)-S(Unknown)

<400> 47

tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc 60

atgacaacga actatatttt tgtgacc 87

<210> 48

<211> 85

<212> DNA

<213> pyrG(E155K)-Ptrc-A(Unknown)

<400> 48

caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat 60

ttgttacttc gcctgacgtt tctgg 85

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> UP-ushA-S(Unknown)

<400> 49

tgtgagaggc tgatagcacc taaa 24

<210> 50

<211> 48

<212> DNA

<213> UP-ushA-A(Unknown)

<400> 50

gcatcaataa agccggtatt caccatactt ctctccctga cctgattt 48

<210> 51

<211> 48

<212> DNA

<213> DN-ushA-S(Unknown)

<400> 51

aaatcaggtc agggagagaa gtatggtgaa taccggcttt attgatgc 48

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> DN-ushA-A(Unknown)

<400> 52

gtttcaaatc catacctacg agca 24

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> UP-surE-S(Unknown)

<400> 53

acggagtttt tggttgtcgg 20

<210> 54

<211> 38

<212> DNA

<213> UP-surE-A(Unknown)

<400> 54

gcttaccatt gcgtgccaac agcaaactca cgcaaggc 38

<210> 55

<211> 38

<212> DNA

<213> DN-surE-S(Unknown)

<400> 55

gccttgcgtg agtttgctgt tggcacgcaa tggtaagc 38

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> DN-surE-A(Unknown)

<400> 56

taaacattac gacactgccg 20

<210> 57

<211> 22

<212> DNA

<213> UP-yjjG-S(Unknown)

<400> 57

actgacgaac cgctatcact gg 22

<210> 58

<211> 41

<212> DNA

<213> UP-yjjG-A(Unknown)

<400> 58

gaaacggtcc aggtgggcca gtcccacttc attattccac c 41

<210> 59

<211> 41

<212> DNA

<213> DN-yjjG-S(Unknown)

<400> 59

ggtggaataa tgaagtggga ctggcccacc tggaccgttt c 41

<210> 60

<211> 23

<212> DNA

<213> DN-yjjG-A(Unknown)

<400> 60

gtgatacgga aactgcatca cag 23

<210> 61

<211> 22

<212> DNA

<213> UP-yrfG-S(Unknown)

<400> 61

gaaactggca caaatgctga tg 22

<210> 62

<211> 44

<212> DNA

<213> UP-yrfG-A(Unknown)

<400> 62

gcgtctcctt cacattagcg aggcaatgtt gatatgcatg aggg 44

<210> 63

<211> 44

<212> DNA

<213> DN-yrfG-S(Unknown)

<400> 63

ccctcatgca tatcaacatt gcctcgctaa tgtgaaggag acgc 44

<210> 64

<211> 25

<212> DNA

<213> DN-yrfG-A(Unknown)

<400> 64

tctctacact ttccgcagtc tcttc 25

<210> 65

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-lacI-lacZ-S(Unknown)

<400> 65

agtcctaggt ataatactag tcagccgata gcggaacggg agttttagag ctagaa 56

<210> 66

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-lacI-lacZ-A(Unknown)

<400> 66

ttctagctct aaaactcccg ttccgctatc ggctgactag tattatacct aggact 56

<210> 67

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-codA-codB-S(Unknown)

<400> 67

agtcctaggt ataatactag tcggctggtt gaccttcctt tgttttagag ctagaa 56

<210> 68

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-codA-codB-A(Unknown)

<400> 68

ttctagctct aaaacaaagg aaggtcaacc agccgactag tattatacct aggact 56

<210> 69

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-mbhA-S(Unknown)

<400> 69

agtcctaggt ataatactag ttaccgggca taccgatgcg agttttagag ctagaa 56

<210> 70

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-mbhA-A(Unknown)

<400> 70

ttctagctct aaaactcgca tcggtatgcc cggtaactag tattatacct aggact 56

<210> 71

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-yeeP-S(Unknown)

<400> 71

agtcctaggt ataatactag tgcggtattc cgtctgttcc ggttttagag ctagaa 56

<210> 72

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-yeeP-A(Unknown)

<400> 72

ttctagctct aaaaccggaa cagacggaat accgcactag tattatacct aggact 56

<210> 73

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-cdd-S(Unknown)

<400> 73

agtcctaggt ataatactag tgacaagtac ttccccgctt tgttttagag ctagaa 56

<210> 74

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-cdd-A(Unknown)

<400> 74

ttctagctct aaaacaaagc ggggaagtac ttgtcactag tattatacct aggact 56

<210> 75

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-ilvG-S(Unknown)

<400> 75

agtcctaggt ataatactag ttatcggcac tgacgcattt cgttttagag ctagaa 56

<210> 76

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-ilvG-A(Unknown)

<400> 76

ttctagctct aaaacgaaat gcgtcagtgc cgataactag tattatacct aggact 56

<210> 77

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-ushA-S(Unknown)

<400> 77

agtcctaggt ataatactag tggtggatgg tatccgcaaa ggttttagag ctagaa 56

<210> 78

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-ushA-A(Unknown)

<400> 78

ttctagctct aaaacctttg cggataccat ccaccactag tattatacct aggact 56

<210> 79

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-surE-S(Unknown)

<400> 79

agtcctaggt ataatactag ttaaacatta cgacactgcc ggttttagag ctagaa 56

<210> 80

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-surE-A(Unknown)

<400> 80

ttctagctct aaaaccggca gtgtcgtaat gtttaactag tattatacct aggact 56

<210> 81

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-yjjG-S(Unknown)

<400> 81

agtcctaggt ataatactag tcgaagcctt tattaatgcg agttttagag ctagaa 56

<210> 82

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-yjjG-A(Unknown)

<400> 82

ttctagctct aaaactcgca ttaataaagg cttcgactag tattatacct aggact 56

<210> 83

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-yrfG-S(Unknown)

<400> 83

agtcctaggt ataatactag tgattactgg agtgagcaac tgttttagag ctagaa 56

<210> 84

<211> 56

<212> DNA

<213> gRNA-yrfG-A(Unknown)

<400> 84

ttctagctct aaaacagttg ctcactccag taatcactag tattatacct aggact 56

Claims

1.一株生产胞嘧啶的大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌在尿苷基因工程菌E.coliUR11的基础上，阻断胞嘧啶向尿嘧啶的转化，减少胞嘧啶向胞内的转运，强化胞苷酸CMP到胞嘧啶的水解反应，强化CTP到CMP的水解反应，强化UMP到尿苷二磷酸UDP的磷酸化反应，阻断胞苷到尿苷的转化，强化尿苷三磷酸UTP经胞苷三磷酸合成酶生成CTP的反应，阻断UMP和CMP水解为尿苷和胞苷。

2.根据权利要求1所述的生产胞嘧啶的大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌在尿苷基因工程菌E.coli UR11的基因组上首先整合来源于T7噬菌体的RNA聚合酶基因T7RNAP，用于识别和转录由T7启动子控制的基因；敲除了胞嘧啶脱氨酶基因codA和胞嘧啶渗透酶基因codB，阻断胞嘧啶向尿嘧啶的转化，同时减少胞嘧啶向细胞内的转运。

3.根据权利要求1所述的生产胞嘧啶的大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌在尿苷基因工程菌E.coli UR11的基因组上整合了嘧啶单磷酸核苷酶基因ygdH，加强CMP到胞嘧啶的水解反应；整合核苷三磷酸焦磷酸水解酶基因nudG，加强CTP到CMP的水解反应；在胞苷脱氨酶基因位点cdd整合携带突变点的尿苷酸激酶基因pyrH^(D93A)，减少UDP对尿苷酸激酶的反馈抑制，增加UMP向UDP的转化，同时阻断胞苷向尿苷的转化；在基因组上整合了携带突变点的胞苷三磷酸合酶基因pyrG^(E155K)，减少CTP对胞苷三磷酸合酶的反馈抑制，增加UTP向CTP的转化；敲除四种核苷酸酶基因，ushA、surE、yjjG和yrfG，阻断UMP向尿苷以及CMP向胞苷的水解反应，减少副产物尿苷和尿嘧啶的生成。

4.根据权利要求2或3所述的生产胞嘧啶的大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌在尿苷基因工程菌E.coliUR11是在E.coliW3110的基因组上整合了来源于B.subtilisA260的嘧啶核苷操纵子pyrBCAKDFE，由强启动子Ptrc控制；敲除尿苷激酶基因udk、尿苷磷酸化酶基因udp和核苷水解酶基因rihA、rihB和rihC；在基因组上对其自身PRPP合成酶基因prsA进行双拷贝，由强启动子Ptrc启动；敲除高丝氨酸脱氢酶基因thrA；敲除鸟氨酸氨甲酰转移酶基因argF。

5.如权利要求1至4任一项所述的生产胞嘧啶的大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述方法采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli UR11基因组进行定向改造。

6.根据权利要求5所述的生产胞嘧啶的大肠杆菌的构建方法，其特征在于：步骤如下：

(2)敲除胞嘧啶脱氨酶基因codA和胞嘧啶渗透酶基因codB，基因codA的基因序列为SEQID NO.2，基因codB的基因序列为SEQ ID NO.3；

(7)敲除四种核苷酸酶基因ushA、surE、yjjG、yrfG，其基因序列依次为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11。

7.根据权利要求6所述的生产胞嘧啶的大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述T7启动子的基因序列为SEQ ID NO.12；

所述Ptrc启动子的基因序列为SEQ ID NO.13；

所述PxylF启动子的基因序列为SEQ ID NO.14。

8.如权利要求1至4任一项所述的大肠杆菌在胞嘧啶生产方面中的应用。

9.利用如权利要求1至4任一项所述的大肠杆菌发酵生产胞嘧啶的方法，其特征在于：所述方法通过反馈脉冲补料工艺来提高胞嘧啶的产量，具体步骤如下：

10.根据权利要求9所述的发酵生产胞嘧的方法，其特征在于：所述活化斜面使用的斜面培养基为：葡萄糖1.5-2.5g/L，酵母粉5-10g/L，蛋白胨10-15g/L，牛肉膏10-15g/L，磷酸二氢钾1-1.5g/L，硫酸镁0.3-0.5g/L，氯化钠0.5-1.0g/L，琼脂25-30g/L；