CN116144560A - 一种苯丙氨酸大肠杆菌生产菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种苯丙氨酸大肠杆菌生产菌及其应用，所述菌株通过利用代谢工程手段对野生型大肠杆菌E.coil W3110进行改造获得，是高产、稳定、具有工业应用价值的L‑苯丙氨酸基因工程菌，其构建方法包括：1、DAHP酶(aroGfbr、aroF基因编码)的过表达与解除反馈抑制；2、CM/PDT酶(pheAfbr基因编码)的过表达与解除反馈抑制；3、芳香族氨基酸转氨酶(tyrB基因编码)的过表达；4、阻遏蛋白(TyrR、TrpR、lacI基因编码)的敲除；5、磷酸烯醇丙酮酸合酶(pps基因编码)的过表达；6、转酮酶(tktA基因编码)的过表达；7、PTS系统的改造；8、苯丙氨酸转运蛋白(yddG基因编码)强化。
Description
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，尤其是一种苯丙氨酸大肠杆菌生产菌及其应用。
背景技术
L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine，L-phe)属于芳香族氨基酸之一，为必需氨基酸，在食品和制药工业中均有诸多应用，如用作营养补充剂、合成食品添加剂和药品的前体。目前常用的生产方法为酶法与微生物发酵法，二者各有利弊，但由于酶的稳定性差、成本高等缺点，导致酶法在工业化中受限制较多。微生物发酵法因具有原料廉价易得，环境污染小，产物纯度高等优点而成为了工业化生产L-苯丙氨酸的主流方法。
早期的L-苯丙氨酸生产菌株主要通过诱变育种筛选获得，但由于诱变过程中正向突变频率较低，变异方向、性状难以掌控，使得突变菌株难以获得多个理想性状，生产性能难以提升。随着代谢工程与基因工程等技术手段的出现与发展，菌株的育种由非定向的随机诱变发展到了定向、理性改造的水平。大肠杆菌由于遗传背景清晰，易于培养，质粒系统完备，代谢可塑性强等优点，成为了构建L-苯丙氨酸工程菌株常用菌种。
近年来国内外学者对L-苯丙氨酸生产菌株的研究从未停止，但由于国内起步较晚，导致自主研发的生产菌株在性能与稳定性上均稍弱于国外的优势菌种，因此自主研发一株高产、稳定、高效的L-苯丙氨酸生产菌种是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种大肠杆菌菌株。
本发明所要解决的技术问题在于提供上述大肠杆菌菌株的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种苯丙氨酸大肠杆菌生产菌，为大肠杆菌菌株F-1，是通过野生型大肠杆菌E.coil W3110改造得到的，获得方法如下：以野生型大肠杆菌E.coil W3110(保藏号为：ATCC 27325)为出发菌株，敲除莽草酸途径关键阻遏蛋白基因tyrR，并同时在该基因位点整合由trc启动子强化的解除反馈抑制的预苯酸脱水酶基因pheAfbr。
优选的，上述苯丙氨酸大肠杆菌生产菌，所述基因pheAfbr的解除反馈手段为5’端的925位碱基由G替换为T(G309C)。
一种苯丙氨酸大肠杆菌生产菌，为大肠杆菌菌株F-2，是通过上述菌株F-1改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-1为出发菌株，敲除假基因yjit，并在此位点再次整合由trc启动子强化的解除反馈抑制的预苯酸脱水酶基因pheAfbr，进一步加强关键酶基因。
一种苯丙氨酸大肠杆菌生产菌，为大肠杆菌菌株F-3，是通过上述菌株F-2改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-2为出发菌株，敲除trc启动子阻遏蛋白基因LacI(该蛋白可抑制trc启动子的表达)。
一种苯丙氨酸大肠杆菌生产菌，为大肠杆菌菌株F-4，是通过上述菌株F-3改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-3为出发菌株，敲除菌株原有的CM/PDT酶基因pheA，并在该位点整合由trc启动子强化的转氨酶基因tyrB，解除原有反馈抑制的同时加强L-苯丙氨酸生物合成相关基因。
一种苯丙氨酸大肠杆菌生产菌，为大肠杆菌菌株F-5，是通过上述菌株F-4改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-4为出发菌株，敲除假基因mbha，并在此位点整合由trc强启动子启动的解除反馈抑制的DS酶基因aroGfbr，进一步加强关键酶基因。
优选的，上述苯丙氨酸大肠杆菌生产菌，所述基因aroGfbr解除反馈为将5’端的436位碱基由G替换为A(D145N)。本发明曾尝试使用不同强度的启动子增强该基因，最终结果显示trc启动子更具优势，且在此步操作之后，L-苯丙氨酸的产量增长了585％。
一种苯丙氨酸大肠杆菌生产菌，为大肠杆菌菌株F-6，是通过上述菌株F-5改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-5为出发菌株，敲除假基因位点yghx，并在此位点再次整合由trc启动子强化经过密码子优化的aroF基因，进一步加强关键酶基因。
一种苯丙氨酸大肠杆菌生产菌，为大肠杆菌菌株F-7，是通过上述菌株F-6改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-6为出发菌株，敲除假基因yghE，并在此位点整合由trc启动子强化的芳香族氨基酸基因tyrB，进一步加强芳香族氨基酸转氨酶的活力。
一种苯丙氨酸大肠杆菌生产菌，为大肠杆菌菌株F-8，是通过上述菌株F-7改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-7为出发菌株，敲除莽草酸途径关键阻遏蛋白基因trpR，并同时在此位点整合由trc启动子强化的转酮酶基因tktA，提高关键前体物质E4P的量。
一种苯丙氨酸大肠杆菌生产菌，为大肠杆菌菌株F-9，是通过上述菌株F-8改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-8为出发菌株，敲除假基因位点ygay，并在此位点整合由trc启动子强化的磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因pps，提高关键前体物质PEP的量。
一种苯丙氨酸大肠杆菌生产菌，为大肠杆菌菌株F-10，是通过上述菌株F-9改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-9为出发菌株，敲除编码PTS系统中的ptsG基因，并在此位点整合由M-12启动子启动的glf基因，后者编码葡萄糖透过酶。
ptsG基因的敲除可破坏PTS系统，降低PEP的消耗，提高前体物质含量，glf基因与glk基因的引入与强化可弥补PTS系统缺失造成的摄糖能力不足，进而达到提高PEP含量的同时，提高葡萄糖利用率的目的。
优选的，上述苯丙氨酸大肠杆菌生产菌，所述glf基因来源于运动假单胞杆菌，所述glk基因来源于大肠杆菌自身。
优选的，上述苯丙氨酸大肠杆菌生产菌，所述M-12启动子序列为序列表SEQ IDNO.11所示核苷酸序列。
一种苯丙氨酸大肠杆菌生产菌，为大肠杆菌菌株F-11，是通过上述菌株F-10改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-10为出发菌株，敲除了假基因yciQ，并在此位点整合了由trc启动子强化的glk基因，后者编码葡萄糖磷酸化酶。
一种苯丙氨酸大肠杆菌生产菌，为大肠杆菌菌株F-12，是通过上述菌株F-11改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-11为出发菌株，敲除了假基因ylbE，并在此位点整合了由trc启动子强化的yddG基因，后者编码芳香族氨基酸外排蛋白。
上述苯丙氨酸大肠杆菌生产菌在高产L-苯丙氨酸方面的应用。
上述基因工程菌每进行一步分子改造操作，均会进行5L发酵罐发酵验证实验，并检测最终的L-苯丙氨酸产量或糖酸转化率，以此为指标验证分子改造的合理性，具体发酵生产方法如下：
(1)将大肠杆菌菌株F-1～F-12中任一菌株从-80℃的20％甘油保菌管接入LB固体斜面活化培养，培养条件为37℃、12h，共活化两代，使用第二代固体斜面上的菌作为种子罐的出发菌；
(2)发酵罐种子培养，固体斜面菌体使用无菌生理盐水洗下后全部接入5L发酵罐内进行种子罐培养，培养基定容2L，36℃，pH7.0，溶氧30-50％，培养至OD600nm达到25；
(3)发酵罐发酵培养，接种量20％，培养基定容3L，34℃，溶氧30-50％。
上述发酵验证实验，采用的种子培养基为：葡萄糖30g/L，酵母粉6g/L，蛋白胨1g/L，MgSO4.7H2O 1.5g/L，KH2PO4 2.0g/L，硫酸铵2.0g/L，FeSO4.7H2O10mg/L，MnSO4.H2O 5mg/L，维生素H1mg/L。
上述发酵验证实验，采用的发酵培养基为：MgSO4.7H2O 1.5g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨1g/L，硫酸铵2g/L，K2HPO4.3H2O 6g/L，谷氨酸1g/L，FeSO4.7H2O 20mg/L，MnSO4 10mg/L，VB(1、3、5、12)各2mg/L。
有益效果：
本发明所述大肠杆菌菌株具有以下优点：1、无缺陷物质，L-苯丙氨酸生产菌常不可避免的需要敲除L-酪氨酸途径，因此必须外源添加L-酪氨酸，这无疑增加了生产成本，本发明提供的菌株可以避免原材料上的成本。2、发酵效率高，发酵周期为44h，L-苯丙氨酸发酵周期常超过50h，较短的发酵周期无疑提高了生产效率，降低了水、电等工业成本。3、性能稳定，在实验室内多批次5L罐发酵实验，生产性能未出现波动。4、无副产物生成，发酵结束后检测发酵液中氨基酸含量，常见的L-苯丙氨酸发酵副产物谷氨酸、色氨酸、乙酸含量均＜1g/L，且无其他副产物生成，一方面提高了糖酸转化率，另一方面降低了后续分离提取的难度。
经测定，构建的大肠杆菌F-12可以生产L-苯丙氨酸90.2g/L，糖酸转化率26.2％。
附图说明
图1为L-苯丙氨酸代谢改造路径示意图；
图2为pRed-Cas9和pGRB质粒图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。
实施方案中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100mL中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。
如图1所示，根据整个菌株改造过程的代谢路径示意图及前述技术方案对菌种进行改造，获得大肠杆菌菌株F-1～F-12。本发明涉及的基因序列如下：
trc启动子具有序列表SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。
aroGfbr基因具有序列表SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。
aroF基因具有序列表SEQ ID NO.3所示核苷酸序列
pheAfbr基因具有序列表SEQ ID NO.4所示核苷酸序列。
LacI基因具有序列表SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。
tktA基因具有序列表SEQ ID NO.6所示核苷酸序列。
pps基因具有序列表SEQ ID NO.7所示核苷酸序列。
tyrB基因具有序列表SEQ ID NO.8所示核苷酸序列。
glk基因具有序列表SEQ ID NO.9所示核苷酸序列。
Lac启动子具有序列表SEQ ID NO.10所示核苷酸序列。
M-12启动子序列为序列表SEQ ID NO.11所示核苷酸序列。
yddG基因具有序列表SEQ ID NO.12所示核苷酸序列。
glf基因具有序列表SEQ ID NO.13所示核苷酸序列。
实施例中采用的大肠杆菌E.coil W3110保藏号为：ATCC 27325。
实施例1
1.基因编辑的方法
本发明中采用的基因编辑方法参照文献(Li Y，Lin Z，Huang C，et al.Metabolicengineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9 meditated genomeediting.Metabolic Engineering，2015，31：13-21.)，该方法涉及的工程质粒pREDCas9、pGRB图谱见图2。其中pREDCas9携带gRNA表达质粒pGRB的消除系统、λ噬菌体的Red重组系统、Cas9蛋白表达系统以及奇霉素抗性(工作浓度：100mg/L)；pGRB以pUC18为骨架，包括启动子J23100、gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列以及氨节青霉素抗性(工作浓度：100mg/L)。
该方法的具体步骤如下：
1.1pGRB质粒构建
采用包含靶序列的DNA片段与线性化的pGRB载体片段重组的方法构建得到pGRB质粒，目的是为了转录相应的gRNA，与Cas9蛋白形成的复合体，并通过碱基配对和PAM识别目的基因靶位点，实现目的DNA双链断裂。
1.1.1靶序列设计
使用CRISPR RGEN Tools设计靶序列(PAM：5'-NGG-3')
1.1.2包含靶序列的DNA片段的制备
设计引物:5'-线性化载体末端序列(15bp)-靶序列-线性化载体末端序列(15bp)-3'，及其反向互补的引物，利用PCR退火程序得到DNA双链片段。反应条件：预变性95℃，5min；退火30-50℃，lmin。退火体系如下表1：
表1退火体系
1.1.3线性载体的制备
载体的线性化采用反向PCR扩增的方法。
1.1.4重组连接靶序列与线性化载体
使用
II One Step Cloning Kit重组酶重组连接靶序列与线性化的pGRB载体(反应体系见表2)，插入片段见1.1.2，线性化克隆载体见1.1.3，将得到了质粒化转至E.coli DH5α感受态细胞后筛选阳性转化子，菌株纯化后摇管扩大培养，使用试剂盒提取质粒，得到含靶序列的pGRB质粒。
表2质粒重组体系
1.2重组DNA片段的制备
重组DNA片段以整合位点的上下游同源臂及待整合的基因片段组成(仅作敲除目的则不需要目的片段)。以待敲除基因/目的基因的上同源臂的上游引物与下同源臂的下引物为扩增/重叠引物，以大肠杆菌基因组为模板，利用PCR扩增体系(如表3)得到同源臂/目的基因的DNA片段。以待敲除基因的上同源臂的上游引物与下同源臂的下游引物为重叠引物，以待整合基因为模板，利用PCR重叠体系(表4)制备重组片段。
表3 hS酶PCR扩增体系
表4重叠PCR扩增体系
PCR反应条件(宝生物PrimeSTARhS酶)：预变性(95℃)5min；变性(98℃)10s，退火((Tm-3/5)℃)15s，72℃延伸进行30轮循环；72℃继续延伸10min；维持(4℃)。
1.3质粒和重组DNA片段的转化
1.3.1pREDCas9的转化
利用电转的方法将pREDCas9质粒电转至目的菌株的电转感受态中，复苏培养后涂布在含奇霉素抗性的LB固体平板上，32℃培养12h。抗性平板上挑选单菌落用鉴定引物进行菌落PCR验证(见表5)，筛选阳性转化子。
表5菌落PCR体系
1.3.2含pREDCas9的目的菌株电转化感受态制备
32℃培养至OD600 nm＝0.1～0.2时，添加0.1M的IPTG(使其终浓度为0.1mM)，目的为诱导pREDCas9质粒上的重组酶表达。其他操作无特殊要求。
1.3.3pGRB的消除
在含有0.2％阿拉伯糖的LB培养基中培养12h，取适量菌液涂布于含有奇霉素抗性的LB平板上，32℃培养12h。使用含有氨苄青霉素和奇霉素抗性的LB平板(单抗平板，对照筛选阳性菌株)，挑选氨苄青霉素平板不生长，奇霉素抗性平板生长的单菌落保菌。
1.3.5pREDCas9质粒的消除
将阳性重组子转接到无抗性的LB液体培养基中，42℃培养12h，取适量菌液涂布于无抗性的LB平板上，37℃培养12h。使用含有奇霉素抗性和无抗性的LB平板(单抗平板，对照筛选阳性菌株)，挑选奇霉素抗性平板不生长，无抗性平板生长的单菌落保菌。
2.菌株构建过程中用到的引物见表6。
表6菌株构建过程中所涉及的引物
实施例2
以lacI基因敲除为例，本实施例旨在说明基因敲除的步骤。
具体步骤如下：1、以大肠杆菌E.coil W3110基因组为模板，以QClacI-Up-s、QClacI-Up-A与QClacI-DN-S、QClacI-DN-A为引物，以实施例1中1.2中表3所示体系获得上下游同源臂lacI-Up、lacI-DN；2、以实施例1中1.2中表4所示体系获得重叠片段△lacI；3、以lacI-PGRB-S、lacI-PGRB-A为引物，以实施例1中1.1所述获方法获得用于切断原有lacI基因的质粒lacI-PGRB；4、以实施例1中1.3.1所述方法获得含cas9质粒的待试菌株；5、以实施例1中1.3.2中的方法获得待试菌株感受态细胞；6、将步骤2中获得的重叠片段(200ng)与步骤3中获得的质粒(100ng)通过电转穿刺进入步骤5获得的感受态细胞中；7、复苏后取100-200μL涂布在含有氨苄抗性与奇霉素抗性的平板上，37℃培养12h；8、使用引物QClacI-Up-s、QClacI-DN-A，利用实施例1中1.3.1中表5所示的菌落PCR体系筛选验证获得阳性菌株；9、利用实施例1中1.3.3中所示方法消除PGRB质粒，并保菌；10、将步骤9中获得的菌株再次利用实施例1中1.3.2中的方法获得菌株感受态细胞，以备菌株下一步分子操作。至此，基因敲除完成。
实施例3
以敲除菌株原有的CM/PDT酶基因pheA，并在该位点整合由trc强启动子启动的转氨酶基因tyrB为例，该实施例旨在说明基因整合的操作步骤，且权利要求3-9中所述的方法均可采用本实施例中的操作实现，具体步骤如下：
1、以大肠杆菌E.coil W3110基因组为模板，分别以QCPheA-UP-S、QCPheA-UP-A与TyrB-S、TyrB-A与QCPheA-DN-S、QCPheA-DN-A为引物，以实施例1中1.2中表3所示体系获得上游同源臂、目的基因片段、下游同源臂QCPheA-UP、TyrB、QCPheA-DN；2、以实施例1中1.2中表4所示体系获得重叠片段△TyrB；3、以PheA-PGRB-S、PheA-PGRB-A为引物，以实施例1中1.1所述获方法获得用于切断原有pheA基因的质粒PheA-PGRB；4、以实施例1中1.3.1所述方法获得含cas9质粒的待试菌株；5、以实施例1中1.3.2中的方法获得待试菌株感受态细胞；6、将步骤2中获得的重叠片段(200ng)与步骤3中获得的质粒(100ng)通过电转穿刺进入步骤5获得的感受态细胞中；7、复苏后取100-200μL涂布在含有氨苄抗性与奇霉素抗性的平板上，37℃培养12h；8、使用引物QClacI-Up-s、QClacI-DN-A，利用实施例1中1.3.1中表5所示的菌落PCR体系筛选验证获得阳性菌株；9、利用实施例1中1.3.3中所示方法消除PGRB质粒，并保菌；10、将步骤9中获得的菌株再次利用实施例1中1.3.2中的方法获得菌株感受态细胞，以备菌株下一步分子操作。至此，敲除特定基因并整合目的基因完成。
实施例4
以F-12为生产菌株的发酵操作，其余F-1—F-11菌株均可以通过该步骤实现发酵操作，具体如下：
斜面种子培养：将大肠杆菌菌株F-12从-80℃的20％甘油保菌管接入LB固体斜面活化培养，培养条件为37℃、12h，共活化两代，使用第二代固体斜面上的菌作为种子罐的出发菌；
发酵罐种子培养：将二代固体斜面上的菌体使用无菌生理盐水洗下后全部接入5L发酵罐内进行种子罐培养，培养基定容2L，36℃培养，过程使用25％氨水调节pH维持在7.0，通过调节发酵罐搅拌速度与通风量调节溶氧维持在30-50％，培养至OD600 nm达到25时接发酵罐；
发酵罐分批补料发酵培养：接种量为20％，发酵初始体积为3L，36℃培养，过程使用25％氨水调节pH维持在7.0，通过调节发酵罐搅拌速度与通风量调节溶氧维持在30-50％，过程流加80％的葡萄糖溶液，将罐内残糖浓度控制在1g/L以下。
采用的斜面培养基为：LB培养基。
采用的种子培养基为：葡萄糖30g/L，酵母粉6g/L，蛋白胨1g/L，MgSO4.7H2O 1.5g/L，KH2PO4 2.0g/L，硫酸铵2.0g/L，FeSO4.7H2O 10mg/L，MnSO4.H2O 5mg/L，维生素H1mg/L。
采用的发酵培养基为：MgSO4.7H2O 1.5g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨1g/L，硫酸铵2g/L，K2HPO4.3H2O 6g/L，谷氨酸1g/L，FeSO4.7H2O 20mg/L，MnSO410mg/L，VB(1、3、5、12)各2mg/L。
F-12最终发酵结果(3次实验结果平均值)如下：L-苯丙氨酸产量90.2g/L，糖酸转化率26.2％，发酵周期44h，无副产物生成。
实施例5
本实施例旨在说明在假基因位点与在tyrR基因位点整合pheAfbr基因对L-苯丙氨酸生产菌株构建的影响，以L-苯丙氨酸产量为指标，结果如表7所示，其中，1#指在假基因位点整合pheAfbr基因(为保证实验严谨性，1#同样敲除了tyrR基因)，2#指在tyrR基因位点整合pheAfbr基因，即F-1菌株。
表7在不同位点整合pheAfbr基因对L-苯丙氨酸产量的影响
实施例6
使用实施例5中的发酵方法，本实施例旨在说明pheAfbr基因拷贝次数对L-苯丙氨酸生产菌株构建的影响，以L-苯丙氨酸产量为指标，结果如表8所示，其中，1#指单拷贝，2#指双拷贝(F-2菌株)，3#指3拷贝。
表8 pheAfbr基因拷贝次数对L-苯丙氨酸产量的影响
实施例7
本实施例旨在说明在敲除lacI基因对L-苯丙氨酸生产菌株构建的影响，因此构建菌株F-3以L-苯丙氨酸产量为指标，最终L-苯丙氨酸产量为6.2g/L，明显高于F-2菌株。
实施例8
本实施例旨在说明在假基因位点与在菌株原有的pheA基因位点整合tyrB基因对L-苯丙氨酸生产菌株构建的影响，以L-苯丙氨酸产量为指标，结果如表9所示，其中，1#指在假基因位点整合tyrB基因(为保证实验严谨性，1#同样敲除了菌株原有的pheA基因)，2#指在菌株原有的pheA基因位点整合tyrB基因，即F-4菌株。
表9在不同位点整合pheAfbr基因对L-苯丙氨酸产量的影响
实施例9
本实施例旨在说明由不同强度的启动子增强的aroGfbr对L-苯丙氨酸生产菌株构建的影响，以L-苯丙氨酸产量为指标，结果如表9所示，其中，1#指使用trc启动子增强(即F-5菌株)，2#指使用lac启动子增强，3#指使用T7启动子增强。
表10不同强度的启动子增强的aroGfbr基因对L-苯丙氨酸产量的影响
实施例10
本实施例旨在说明双拷贝aroGfbr基因与aroF、aroGfbr基因各拷贝一次对L-苯丙氨酸生产菌株构建的影响，以L-苯丙氨酸产量为指标，结果如表11所示，其中，1#指双拷贝aroGfbr基因，2#指aroF、aroGfbr基因各拷贝一次(即F-6菌株)。
表11 aroF、aroGfbr基因拷贝次数对L-苯丙氨酸产量的影响
实施例11
本实施例旨在说明tyrB基因拷贝次数对L-苯丙氨酸生产菌株构建的影响，以L-苯丙氨酸产量为指标，结果如表12所示，其中，1#指双拷贝(即F-7)，2#指3拷贝(单拷贝已在实施例7中验证)。
表12 tyrB基因拷贝次数对L-苯丙氨酸产量的影响
实施例12
本实施例旨在说明在假基因位点与在莽草酸途径阻遏蛋白编码基因trpR基因位点整合tktA基因对L-苯丙氨酸生产菌株构建的影响，以L-苯丙氨酸产量为指标，结果如表13所示，其中，1#指在假基因位点整合tktA基因(为保证实验严谨性，1#同样敲除了trpR基因)，2#指在菌株原有的trpR基因位点整合tktA基因(即F-8菌株)
表13不同位点整合tktA基因对L-苯丙氨酸产量的影响
实施例13
本实施例旨在说明由不同强度的启动子增强的pps基因对L-苯丙氨酸生产菌株构建的影响，以L-苯丙氨酸产量为指标，结果如表14所示，其中，1#指使用trc启动子增强(即F-9菌株)，2#指使用lac启动子增强，3#指使用T7启动子增强。
表14不同强度的启动子增强的pps基因对L-苯丙氨酸产量的影响
实施例14
本实施例旨在说明PTS系统改造对苯丙氨酸的生产的影响。
表15 PTS系统改造对L-苯丙氨酸产量与转化率的影响
实施例15
本实施例旨在说明加强芳香族氨基酸外排能力对苯丙氨酸的生产的影响。
表16加强芳香族氨基酸外排能力对苯丙氨酸的生产的影响
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，本发明菌株的构建步骤不分先后顺序，本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行的菌种改造等改进和润饰均视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种苯丙氨酸大肠杆菌生产菌，其特征在于：为大肠杆菌菌株F-1，是通过野生型大肠杆菌E.coil W3110改造得到的，获得方法如下：以野生型大肠杆菌E.coil W3110为出发菌株，敲除莽草酸途径关键阻遏蛋白基因tyrR，并同时在该基因位点整合由trc启动子强化的解除反馈抑制的预苯酸脱水酶基因pheAfbr；或
为大肠杆菌菌株F-2，是通过菌株F-1改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-1为出发菌株，敲除假基因yjit，并在此位点再次整合由trc启动子强化的解除反馈抑制的预苯酸脱水酶基因pheAfbr；或
为大肠杆菌菌株F-3，是通过菌株F-2改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-2为出发菌株，敲除trc启动子阻遏蛋白基因LacI；或
为大肠杆菌菌株F-4，是通过菌株F-3改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-3为出发菌株，敲除菌株原有的CM/PDT酶基因pheA，并在该位点整合由trc启动子强化的转氨酶基因tyrB；或
为大肠杆菌菌株F-5，是通过菌株F-4改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-4为出发菌株，敲除假基因mbha，并在此位点整合由trc强启动子启动的解除反馈抑制的DS酶基因aroGfbr；或
为大肠杆菌菌株F-6，是通过菌株F-5改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-5为出发菌株，敲除假基因位点yghx，并在此位点整合由trc启动子强化的aroF；或
为大肠杆菌菌株F-7，是通过菌株F-6改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-6为出发菌株，敲除假基因yghE，并在此位点整合由trc启动子强化的芳香族氨基转氨酶基因tyrB；或
为大肠杆菌菌株F-8，是通过菌株F-7改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-7为出发菌株，敲除莽草酸途径关键阻遏蛋白基因trpR，并同时在此位点整合由trc启动子强化的转酮酶基因tktA；或
为大肠杆菌菌株F-9，是通过菌株F-8改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-8为出发菌株，敲除假基因位点ygay，并在此位点整合由trc启动子强化的磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因pps；或
为大肠杆菌菌株F-10，是通过菌株F-9改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-9为出发菌株，敲除编码PTS系统中的ptsG基因，并在此位点整合由M-12启动子启动的glf基因，后者编码葡萄糖透过酶；或
为大肠杆菌菌株F-11，是通过菌株F-10改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-10为出发菌株，敲除了假基因yciQ，并在此位点整合了由trc启动子强化的glk基因，后者编码葡萄糖磷酸化酶；或
为大肠杆菌菌株F-12，是通过菌株F-11改造得到的，获得方法如下：以大肠杆菌F-11为出发菌株，敲除了假基因ylbE，并在此位点整合了由trc启动子强化的yddG基因，后者编码芳香族氨基酸外排蛋白。
2.根据权利要求1所述的苯丙氨酸大肠杆菌生产菌，其特征在于：所述基因pheAfbr的解除反馈手段为5’端的925位碱基由G替换为T。
3.根据权利要求1所述的苯丙氨酸大肠杆菌生产菌，其特征在于：所述基因aroGfbr解除反馈为将5’端的436位碱基由G替换为A。
4.根据权利要求1所述的苯丙氨酸大肠杆菌生产菌，其特征在于：所述glf基因来源于运动假单胞杆菌，所述glk基因来源于大肠杆菌自身。
5.权利要求1所述苯丙氨酸大肠杆菌生产菌在高产L-苯丙氨酸方面的应用。
6.根据权利要求5所述的苯丙氨酸大肠杆菌生产菌的应用，其特征在于：具体方法如下：
(1)将大肠杆菌菌株F-1～F-12中任一菌株从-80℃的20％甘油保菌管接入LB固体斜面活化培养，培养条件为37℃、12h，共活化两代，使用第二代固体斜面上的菌作为种子罐的出发菌；
(2)发酵罐种子培养，固体斜面菌体使用无菌生理盐水洗下后全部接入5L发酵罐内进行种子罐培养，培养基定容2L，36℃，pH7.0，溶氧30-50％，培养至OD600nm达到25；
(3)发酵罐发酵培养，接种量20％，培养基定容3L，34℃，溶氧30-50％。
7.根据权利要求6所述的苯丙氨酸大肠杆菌生产菌的应用，其特征在于：所述种子培养基为：葡萄糖30g/L，酵母粉6g/L，蛋白胨1g/L，MgSO4.7H2O1.5g/L，KH2PO4 2.0g/L，硫酸铵2.0g/L，FeSO4.7H2O 10mg/L，MnSO4.H2O5mg/L，维生素H1mg/L。
8.根据权利要求6所述的苯丙氨酸大肠杆菌生产菌的应用，其特征在于：所述发酵培养基为：MgSO4.7H2O 1.5g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨1g/L，硫酸铵2g/L，K2HPO4.3H2O 6g/L，谷氨酸1g/L，FeSO4.7H2O 20mg/L，MnSO410mg/L，VB(1、3、5、12)各2mg/L。
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