CN110699391B - 一种微波辅助碱法预处理牡丹果荚制备生物塑料聚-β-羟丁酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于化工制备技术领域，具体涉及一种微波辅助碱法预处理牡丹果荚制备生物塑料聚β‑羟丁酸的方法。该方法是通过以下步骤实现的：首先将牡丹果荚经粉碎机粉碎，微波辅助碱法预处理后，通过混合溶液洗涤，然后加入纤维素酶和葡聚糖苷酶进行酶解后进行发酵制得聚β‑羟丁酸。本发明提供的预处理方法，能够提高酶解产糖的纯度，以及目标PHB的产率及纯度，提高了牡丹果荚的利用率，变废为宝。

Description

一种微波辅助碱法预处理牡丹果荚制备生物塑料聚-β-羟丁 酸的方法

技术领域

本发明属于化工制备技术领域，具体涉及一种微波辅助碱法预处理牡丹果荚制备生物塑料聚β-羟丁酸的方法。

背景技术

聚-β-羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate，PHB)，是一种天然产物，用于存储微生物的能量并参与代谢过程。用于制备的PHB材料环保无毒，具有良好的生物相容性，在组织工程学中应用广泛；可用作药物缓释载体，热加工性能良好，在农用和食用包装材料等方面也具有潜在应用价值。此外，PHB在环境中可完全降解成水和二氧化碳，对人体没有危害，在环境压力和能源危机日益严峻的今天，得到人们的普遍关注。

利用廉价碳源来进行PHB的合成，如活性污泥、木质素、纤维素等，是PHB的一大研究方向。牡丹是我国特有的木本花卉和药用植物，每年都有大量的牡丹种子被采收用于牡丹籽油的生产。在实践中，通常牡丹果荚和种子一起进行采收，在晾晒后再进行分离，因此牡丹籽油生产中会产生大量的牡丹果荚，这些牡丹果荚或者被堆积废弃从而造成环境污染，或者被产地农民当做低值薪柴使用。研究中发现，牡丹果荚中木质纤维素（纤维素、半纤维素、木质素）的含量近50%，因此，如何提高牡丹果荚的利用率及如何提高聚β-羟丁酸的得率及纯度等问题成为了亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术中存在的牡丹果荚利用率低、造成环境污染等问题，本发明提供了一种微波辅助碱法预处理牡丹果荚制备生物塑料聚β-羟丁酸的方法。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种微波辅助碱法预处理牡丹果荚制备生物塑料聚β-羟丁酸的方法，包括以下步骤：

（1）牡丹果荚经粉碎机粉碎，过80~120目筛，取粉碎后样品，加入NaOH溶液，用3~20kw的微波，温度90±3°C，加热预处理1h；预处理结束后，倒掉上清，原材料用热水清洗至中性，抽滤，保留滤渣，滤渣加入1倍体积乙醇和甲醇的混合溶液，50°C浸润1h，抽滤，滤渣用混合溶液洗涤2次，通风干燥，粉碎，过80~120目筛，得牡丹果荚粉；

（2）将牡丹果荚粉中，以25~50 mL/g的比例加入柠檬酸钠缓冲溶液，加入6000~10000 U/g纤维素酶（绿色木霉）和0.6~1.5 U的β-葡萄糖苷酶，酶解，酶解反应结束后，沸水浴10 min灭活，收集上清液，冻干浓缩，得含有还原糖的冻干粉；

（3）工程菌E.coli JM109（pBHR68）于LB培养基37°C活化过夜，无机盐培养基37°C培养过夜，调整OD₆₀₀=1作为种子液；接种于含有还原糖冻干粉的发酵培养基中，按5-10%接种量接种，37°C，180 rpm培养48 h；

培养结束后，离心，菌体水洗1次，加入5%次氯酸钠溶液和氯仿等体积的萃取液超声提取30 min，氯仿层经旋干除溶剂，残余物用水洗涤2次，丙酮洗涤3次，风干后得到聚-β-羟丁酸（PHB）。

进一步的，步骤（1）中，所述牡丹果荚和氢氧化钠的料液比为1g：10mL；所述氢氧化钠溶液的浓度为20 g/L。

进一步的，步骤（1）中，所述乙醇和甲醇混合液中，乙醇和甲醇的体积比为5：2。

进一步的，步骤（2）中，所述柠檬酸钠缓冲液溶液的pH为 4.5，浓度为20 mmol/L。

本发明在酶解过程中，所述加酶量为每g样品中加入8000~10000U纤维素酶和0.8~1.2U的β-葡萄糖苷酶的混合酶，所述酶解为在50 °C，150 r/min条件下，酶解36-48 h。

进一步的，所述LB培养基为：每升培养基中含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1L，pH 7.4，121°C，灭菌15min；放凉后加入100 µg/mL氨苄青霉素1mL。

进一步的，所述无机盐培养基为：每升培养基中含磷酸氢二钠6.8g，磷酸二氢钾3.0g，氯化钠0.5g，氯化铵1.0g，蒸馏水1L，121°C，灭菌15min；放凉后加入100 µg/mL氨苄青霉素1mL。

进一步的，所述发酵培养基为：无机盐培养基中，含100 µg/mL氨苄青霉素，0.1mmol/L的IPTG，加入含氮量在0.6~1.0 g/L的酵母浸粉，含10~20 g/L酶解制备的还原糖。

本发明所使用的工程菌E.coli JM109（pBHR68）含有pBHR68重组质粒，其获得方法按照文献Spiekermann, Rehm et al. 1999制备：设计针对phbC、phbA、phbB基因片段的引物，从Ralstonia eutropha基因中扩增含有phbC、phbA、phbB基因的长片段；将该片段和表达载体pBluescriptSK(-)分别用SamI/EcoRI双酶切回收后，连接获得重组质粒pBHR68，电转化方法获得工程菌E.coli JM109（pBHR68）。

本发明建立牡丹果荚预处理后制备PHB的工艺，不仅解决环境污染和园林废弃物的处置问题，也为PHB制备提供廉价易寻的碳源，促进PHB新材料的发展。

本发明的有益效果为：本发明提供的预处理方法，能够提高酶解产糖的纯度，以及目标PHB的产率及纯度，提高了牡丹果荚的利用率，变废为宝。

附图说明

图1为果荚微波处理后FTIR红外光谱图。

图2为纤维素酶不同添加量对还原糖产量的影响。

图3为β-葡萄糖苷酶不同添加量对还原糖产量的影响。

图4为不同处理的果荚样品经酶解后的单糖组成分析。A）样品未经乙醇和甲醇混合溶液处理；B）样品经乙醇和甲醇混合溶液处理。

图5为PHB样品核磁共振氢谱。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不局限于此。

实施例1 微波辅助碱法预处理牡丹果荚

牡丹果荚经植物试样粉碎机粉碎，过80~120目筛，取50g粉碎样品，加入500 mL 的20g/L的NaOH溶液，浸润后，20 kw的微波90±3 °C，加热预处理1 h。然后用热水清洗原材料至中性，过滤，滤渣加入1倍体积乙醇和甲醇的混合溶液（乙醇和甲醇的体积比为5：2），50°C浸润1h，抽滤，滤渣用混合溶液洗涤2次，通风干燥，粉碎，过80~120目筛。

果荚微波处理后FTIR红外光谱图如图1所示，预处理后，木质素的几个特征吸收峰，C=O键（1725 cm^-1）、芳香环（1620 cm^-1）、半纤维素-木质素连接键（1156 cm^-1）等吸收峰强度均变弱，强度分别降低60.13%、41.50%、23.59%，表明该方法能有效破坏木质素对纤维素的键合，可提高酶解的效果。

实施例2 纤维素酶酶解实验

称取0.4 g处理后的样品，加入20 mL柠檬酸钠缓冲溶液（20 mmol/L，pH4.5），加入800~2000U纤维素酶（绿色木霉，400U/mg）和0~0.48 U的β-葡萄糖苷酶（黑曲霉，100U/g），50°C，150r/min条件下，酶解48 h。酶解反应结束后，沸水浴10min灭活，离心收集上清液，采用DNS法测定还原糖浓度。

图2和图3中，*柱形上不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。从图中可以看出，随着纤维素酶的加入量增大，还原糖产量显著提高，加酶量8000~10000U/g，还原糖浓度达到最高；此外，在纤维素酶加酶量为8000 U/g的基础上，加入β-葡萄糖苷酶能提高还原糖产量，1.2U/g的加酶量，较之未添加，还原糖产量提高42%。因此，使用纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的复合酶来水解牡丹果荚制备还原糖，作为发酵碳源，生物转化制备PHB。

实施例3 还原糖中的单糖组成分析

称取冻干的多糖样品 2 mg，加入2 M TFA （三氟乙酸）溶液0.5 mL，在120^oC条件下水解120 min，氮吹仪空气泵吹干；标准品含甘露糖（1μg/μL）、鼠李糖（1μg/μL）、葡萄糖醛酸（1μg/μL）、半乳糖醛酸（1μg/μL）、葡萄糖（2.5μg/μL）、半乳糖（1μg/μL）、木糖（1μg/μL）、阿拉伯糖（1μg/μL）、岩藻糖（1μg/μL）与样品进行相同的处理。

向试验样品中加入0.5mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）试剂和0.3M的NaOH溶液各0.5ml，充分混匀后，水浴70^oC反应30min。冷却至室温，加入0.3M HCl 0.5mL，充分混匀。平均分成两份到EP管中，其中一份备用，在备用样品中滴入一滴氯仿置于4冰箱。另外一份中加入0.5ml氯仿，充分震荡萃取，离心（5000rpm，5min）去除氯仿层，共萃取三次。水层（不低于0.4ml）用0.22μm滤膜过滤后，HPLC检测。

采用 Waters 1525 HPLC系统，Thermo ODS-2 C18柱（4.6 mm×150 mm），流动相为0.1 M pH 7.0 磷酸盐缓冲液(PB):乙腈为 82:18（v/v），流速为 1.0 mL/min，进样量为 2μL，检测波长为 254 nm。

结果如图4所示，经乙醇和甲醇混合溶液处理后的果荚样品的还原糖含量，以主要成分葡萄糖为例，是未经处理的样品的1.6倍，而经乙醇和甲醇混合溶液处理后的还原糖含量较单一的采用乙醇处理提高了0.7倍，较单一的采用甲醇处理提高了0.6倍；同时杂质峰数量少，峰面积减小；此外，乙醇和甲醇混合溶液处理后的样品，自然风干的时间要远远低于未经处理的样品，节省加工时间。本发明提供的混合液需要在特定比例下，处理后的还原糖含量最高，如果超出本发明提供的范围，其含糖量均降低。

实施例4 发酵制备PHB

挑取工程菌E.coli单菌落（工程菌制备方法具体采用Spiekermann, P., B. H.A. Rehm, R. Kalscheuer, D. Baumeister and A. Steinbüchel (1999). "Asensitive, viable-colony staining method using Nile red for direct screeningof bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storagecompounds." Archives of Microbiology171(2): 73-80），于LB培养基（含100 µg/mL氨苄青霉素）37°C活化过夜，然后转移到无机盐培养基（含100 µg/mL氨苄青霉素）37°C培养过夜，调整OD₆₀₀=1作为种子液。

于200mL的发酵培养基中（含5 g/L酵母浸粉，100 µg/mL氨苄青霉素，0.1 mmol/L的IPTG，20 g/L还原糖）加入20 mL种子液，37 °C，180 rpm培养48 h。

培养结束后，离心，菌体水洗1次，加入40 mL萃取液（等体积的5%次氯酸钠溶液和氯仿）超声提取30 min，收集氯仿层，水相用20mL氯仿萃取，旋干除氯仿，残余物用蒸馏水洗涤2次，丙酮洗涤3次，真空干燥后得到PHB，纯度为99%以上，具体核磁共振氢谱图如图5所示。

Claims (6)

1.一种微波辅助碱法预处理牡丹果荚制备生物塑料聚β-羟丁酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）牡丹果荚经粉碎机粉碎，过80~120目筛，取粉碎后样品，加入NaOH溶液，用3~20 kw的微波，温度90±3°C，加热预处理1h；预处理结束后，倒掉上清，原材料用热水清洗至中性，抽滤，保留滤渣，滤渣加入1倍体积乙醇和甲醇的混合溶液，50°C浸润1h，抽滤，滤渣用混合溶液洗涤2次，通风干燥，粉碎，过80~120目筛，得牡丹果荚粉；

（2）将牡丹果荚粉中，以25~50 mL/g的比例加入柠檬酸钠缓冲溶液，加入6000~10000U/g纤维素酶和0.6~1.5 U的β-葡萄糖苷酶，酶解，酶解反应结束后，沸水浴10 min灭活，收集上清液，冻干浓缩，得含有还原糖的冻干粉；

（3）工程菌E.coli JM109（pBHR68）于LB培养基37°C活化过夜，无机盐培养基37°C培养过夜，调整OD₆₀₀=1作为种子液；接种于含有还原糖冻干粉的发酵培养基中，按5-10%接种量接种，37°C，180 rpm培养48 h；

培养结束后，离心，菌体水洗1次，加入5%次氯酸钠溶液和氯仿等体积的萃取液超声提取30 min，氯仿层经旋干除溶剂，残余物用水洗涤2次，丙酮洗涤3次，风干后得到聚-β-羟丁酸；

步骤（1）中，所述乙醇和甲醇混合液中，乙醇和甲醇的体积比为5：2；

步骤（2）中，加酶量为每g样品中加入8000~10000U纤维素酶和0.8~1.2U的β-葡萄糖苷酶的混合酶，所述酶解为在50 ℃，150 r/min条件下，酶解36-48 h。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述牡丹果荚和氢氧化钠的料液比为1g：10mL；所述氢氧化钠溶液的浓度为20 g/L 。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述柠檬酸钠缓冲液溶液的pH为 4.5，浓度为20 mmol/L。

4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LB培养基为：每升培养基中含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1L，pH 7.4，121°C，灭菌15min；放凉后加入100 µg/mL氨苄青霉素1mL。

5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无机盐培养基为：每升培养基中含磷酸氢二钠6.8g，磷酸二氢钾3.0g，氯化钠0.5g，氯化铵1.0g，蒸馏水1L，121°C，灭菌15min；放凉后加入100 µg/mL氨苄青霉素1mL。

6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为：无机盐培养基中，含100 µg/mL氨苄青霉素，0.1 mmol/L的IPTG，加入含氮量在0.6~1.0 g/L的酵母浸粉，含10~20 g/L酶解制备的还原糖。

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