KR101684259B1 - 방사선 및 알카리 병용 전처리를 이용한 볏짚 당화 방법 및 이를 이용한 미세조류 지질 생산 방법 - Google Patents

방사선 및 알카리 병용 전처리를 이용한 볏짚 당화 방법 및 이를 이용한 미세조류 지질 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 방사선 및 알카리 병용 전처리를 이용한 볏짚 당화 방법 및 이를 이용한 미세조류 지질 생산 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방사선 및 알카리 병용 전처리를 이용한 볏짚 당화 방법은 다량의 감마선과 알카리를 병용 처리하였을 경우 셀룰로스 함량을 증가시키고, 다량의 리그닌 및 헤미셀룰로스를 제거하여 볏짚의 가분해성을 향상시키며, 효소 가수분해에서 글루코스 및 자일로스 수율을 증가시키고, 볏짚 가수 분해물을 탄소원으로 배양하였을 때 지질 생산 미세조류인 클로렐라 프로토테코이드가 지질을 생산하는 것을 확인함으로써 미세조류를 이용한 지질 생산에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

방사선 및 알카리 병용 전처리를 이용한 볏짚 당화 방법 및 이를 이용한 미세조류 지질 생산 방법{Rice straw saccharification method using combined pretreatment including radiation and alkali, and microalgal lipid production method using same}
본 발명은 방사선 및 알카리 병용 전처리를 이용한 볏짚 당화 방법 및 이를 이용한 미세조류 지질 생산 방법에 관한 것이다.
리그노셀룰로스계 바이오 매스(lignocellulosic biomass)는 셀룰로스(cellulose), 헤미셀룰로스(hemicellulose) 및 리그닌(lignin)으로 구성되어 있고, 이는 지구상에서 가장 풍부하고 재생가능한 원료(source)이다. 리그노셀룰로스계 바이오 매스에는 농업 잔여물(agricultural residue), 임업 잔여물(forestry residue), 동물 및 인간 폐기물(waste) 등이 포함되고, 이는 바이오 연료(biofuel) 및 부가가치의 바이오 물질(value-added biomaterial)을 위한 당의 잠재적이고 지속가능한 원료로 인식되어 왔다(Himmel et al., 2007). 게다가, 음식 및 에너지 자원 사이의 충돌, 에너지를 위한 빠른 성장 요구, 저장된 석유의 감소 및 화석 연료의 사용이 환경에 미치는 영향이 바이오 연료를 생산하기 위한 리그노셀룰로스계 바이오 매스에서 중요하게 강조되고 있다(Cassman 및 Liska, 2007). 그러나, 리그노셀룰로스는 구성요소들(components) 사이의 화학적 상호작용(chemical interaction)때문에 자연적인 바이오 매스의 난분해성(natural biomass recalcitrance)을 극복하기 위하여 전처리가 필요하고(Himmel et al., 2007), 많은 물리화학적 구조 및 조성 구성요소가 발효를 위해 필요한 당을 유리(liverate)시키는 리그노셀룰로스 바이오 매스의 효소 소화를 억제함으로써, 리그노셀룰로스 바이오 매스의 효소 가분해를 위한 리그닌의 파괴 및 셀룰로스 및 헤미셀룰로스의 노출을 위한 전처리가 필수적인 단계임이 당업계에 잘 알려져 있다.
물리적, 화학적 및 생물학적 전처리를 포함하는 다양한 전처리 방법은 효소 가수분해의 효과를 증가시키고, 리그노셀룰로스 바이오 매스를 사용하는 바이오 연료의 생산에 있어서 비용을 절감하기 위해 개발되었다(Sun and Cheng, 2002; Moiser, et al., 2005; Kumar, et al., 2009; Menon and Rao, 2012). 효소 가분해성을 증가시키기 위해 둘 또는 그 이상의 전처리 기술을 조합한 병용 전처리도 또한 일반적으로 수행되나, 많은 종류의 전처리 방법에 대한 선택권이 있고, 각각의 전처리 방법이 이의 고유한 이점(advantage) 및 약점(disadvantage)을 갖기 때문에 이상적인 선택이 어렵다. 게다가, 최적의 전처리 방법은 바이오 매스의 종류, 이의 경제성 및 환경적 영향에 따라 달라진다. 따라서, 다른 공정과 비교하여 발효당을 얻기 위해 전처리 및 이어지는 효소 가수분해 단계의 운영 비용을 감소시키기 위한 더 많은 범위(scope)가 존재한다.
감마선 및 전자선과 같은 전리 방사선(ionizing radiation)은 리그노셀룰로스계 구조 안으로의 침투 및 자유 라디칼(free radical)의 생성에 의하여 리그노셀룰로스의 구조를 변형 또는 방해할 수 있다. 이와 같은 이유로, 방사선 전처리가 리그노셀룰로스계 바이오 매스의 효소 가수분해를 증가시키기 위한 물리적 전처리 방법으로 오랫동안 연구되어 왔다. 예비 연구 결과는 방사선 전처리 후 리그노셀룰로스계 바이오 매스의 효소 가분해성이 증가하였음을 나타낸다(Kamakura 및 Kaetsu, 1978; Khan, 1986; Chodsu et al., 1993; Xin 및 Kumakura, 1993). 최근에는 리그노셀룰로스계 바이오 매스에 전리 방사선 전처리의 영향이 세부적으로 조사되고 있고(Chunping et al., 2008; Yang, et al., 2008; Bak et al., 2009; Driscoll, et al., 2009; Kim et al., 2011; Karthika et al., 2012; Chung et al., 2012; Sun et al., 2013; Karthika et al., 2012a), 방사선 조사가 리그노셀룰로스 바이오 매스의 결정도(crystallinity)를 감소시키고, 중합도(degree of polymerization)의 감소를 유도하며, 효소 접근성 및 효소 가분해성을 증가시키기 위한 표면적을 증가시킴이 확인되었다. 일반적으로, 리그노셀룰로스계 바이오 매스의 방사선 전처리는 기계적 밀링(mechanical milling), 및 산 또는 알카리 희석액 전처리와 같이 다른 물리적 또는 화학적 전처리와 조합해서 수행되고 있고, 이는 필요한 방사선량을 감소시키고, 리그노셀룰로스계 바이오 매스의 효소 분해(enzymatic degradation)를 촉진한다. 그러나, 선행연구에서 병용 전처리를 수행하였을 때 이론적인 글루코스 수율이 물리화학적(physico-chemical) 또는 화학적 방법으로 처리된 리그노셀룰로스로부터 수득된 것보다 일반적으로 낮았다(Bak et al., 2009). 효소 가수분해에 있어서 흡수 에너지(absorbed energy), 원료(source), 효소 로딩(enzyme loading) 및 효율성(efficiency)과 같은 바이오 매스의 본질(nature)의 차이로 다른 전처리 방법이 사용된다(Karthika et al., 2012). 따라서, 방사선 전처리와 다른 전처리 방법을 병용하여 리그노셀룰로스 바이오 매스에 처리하는 전처리 방법 및 이에 유용한 산업 효소는 경제성이 있도록 고안되어야 한다.
다양한 종류의 리그노셀룰로스계 바이오 매스중에서, 볏짚(rice straw)은 세계에서 가장 풍부하고 재생가능한 원료로 알려진 이후로 바이오 연로 생산을 위한 잠재력있는 후보로 알려져 있다(Binod et al., 2010; Sarkar et al., 2012). 지난 몇년간, 볏짚의 전처리 방법 및 볏짚을 바이오 연료, 특히 바이오 에탄올(bioethanol)로 전환시키기 위한 광범위한 연구가 수행되어왔다(Sun 및 Cheng, 2002; Kumar et al., 2009; Binod et al., 2010). 그러나, 리그로셀룰로스계 바이오 매스로부터의 바이오 에탄올 생산에 대한 광범위하고 유용한 정보에 비하여 리그노셀룰로스계 바이오 매스를 사용한 바이오 디젤 생산에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 또한, 이들은 미생물 대사를 억제하는 것으로 알려진 아세트산(acetic acid), 푸르푸랄(furfural), HMF, 중금속(heavy metal) 및 수용성 리그닌(water soluble regnin)과 같은 당(sugar) 외에 화합물 양 및 종류(type)에 차이가 있다(Silva et al., 2013). 따라서, 세포 성장 및 오일 생산에 있어서 리그노셀룰로스 가수 분해물에 의한 영향이 상기 가수 분해물을 탄소원으로 대규모 발효과정에 적용되기 전에 평가되어야 한다.
지난 10년간, 미세조류는 높은 오일 함량, 강한 환경 적응능력, 바이오 디젤 생산에 사용되는 에너지 작물보다 짧은 라이프 사이클(life cycle), 및 무경작 영역을 이유로 지속가능하고, 생분해성의 바이오 디젤 생산을 위한 가장 잠재적인 원료 중의 하나로 고려되어 왔다(Chisti, 2007; Li et al., 2008; Meng et al., 2009). 그러나, 조류에 기반을 둔 바이오 디젤 생산은 전체 배지 비용의 80%를 글루코스 비용이 차지할 정도로 발효 기질(fermentation substrate)의 비용이 높기 때문에 제한적이다(Li et al., 2007). 종속 배양(heterotrophic cultivation)하에서 미세조류, 높은 바이오 매스 및 지질(lipid) 생산에 대한 다양한 그룹 중에 빨리 성장하고, 높은 오일 함유량을 나타내는 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)가 유기 탄소 투입(organic carbon input)을 위한 비용을 줄일 수 있는 다양한 탄소원을 사용함을 확인하였다. 여기에는 예를 들어, 사탕수수 주스(sugar cane juice)(Cheng et al., 2009b), 폐 당밀(waste molasses)(Yan et al., 2011), 미가공의 글리세린(crude glycerol)(O'Grady and Morgan, 2011), 돼지 감자(jerusalem artichoke)로부터의 녹말 가수 분해물(starch hydrolysates)(Cheng et al., 2009a), 단수수(sweet sorghum)(Gao et al., 2010), 옥수수 가루(corn powder)(Xu et al., 2006) 및 카사바(cassava)(Wei et al., 2009; Lu et al., 2010)이 바이오 디젤의 생산을 위한 오일을 생산하기 위하여 종속 배양에서 클로렐라 프로토테코이드의 탄소원으로 사용되었다. 상기 결과는 이들 탄소원이 높은 오일 함유량을 갖는 클로렐라 프로토테코이드의 종속 배양을 통한 오일 생산 및 양질의 바이오 디젤 수득에 사용될 수 있음을 나타낸다. 그러나, 곡물을 원료로 한 바이오 연료 생산의 장기적인 실행 가능성은 논란의 여지가 있다(Cassman 및 Liska, 2007; Groom et al., 2008). 게다가, 곡물을 원료로 한 바이오 연료 생산은 연료 대 식품을 위한 농작물 및 땅의 용도에 대한 도덕적 딜레마를 갖고 있다(Sun 및 Cheng 2002; Cassman 및 Liska, 2007). 그럼에도 불구하고, 오직 몇몇의 연구에서 리그노셀룰로스 바이오 매스로부터의 가수 분해물이 미세조류 오일 생산을 위한 글루코스 또는 곡물을 원료로한 공급원료(feedstock)로 대체될 수 있음을 확인하였다(Li et al., 2007; EL-Sheekh et al., 2012). 따라서, 리그노셀룰로스계 가수 분해물을 사용한 미세조류 오일 생산을 위한 더 많고 깊은 연구가 지속가능하고 경제적인 바이오 디젤 생산을 위해 필요하다.
이에, 본 연구자들은 미세조류를 이용한 오일 생산방법을 연구하던 중, 감마선과 알카리를 병용 처리하였을 경우 셀룰로스 함량을 증가시키고, 다량의 리그닌 및 헤미셀룰로스를 제거하여 볏짚의 가분해성을 향상시키며, 효소 가수분해에서 글루코스 및 자일로스 수율을 증가시키고, 볏짚 가수 분해물을 탄소원으로 배양하였을 때 지질 생산 미세조류인 클로렐라 프로토테코이드가 지질을 유의적으로 생산하는 것을 확인함으로써 본 발명의 감마선 및 알카리 병용 전처리한 볏짚 당화 방법을 사용하여 제조된 볏짚 가수 분해물이 미세조류 지질 생산 방법에 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명의 볏짚 당화 방법 및 이를 이용한 미세조류 지질 생산을 위한 최적의 조건을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 방사선 및 알카리 병용 전처리를 이용한 볏짚 당화 방법 및 이를 이용한 미세조류 지질 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리그노셀룰로스계(lignocellulosic) 바이오 매스에 방사선 및 알카리를 병용처리하는 단계를 포함하는 리그노셀룰로스계 바이오 매스의 전처리 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 리그노셀룰로스계 바이오 매스의 당화 방법을 제공한다:
1) 리그노셀룰로스계 바이오 매스에 감마선 조사 및 알카리를 병용 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 전처리된 리그노셀룰로스계 바이오 매스에 당화 효소를 처리하는 단계.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 리그노셀룰로스계 바이오 매스의 당화액을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 리그노셀룰로스계 바이오 매스의 당화액을 포함하는 미세조류 배지를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 미세조류 지질 생산 방법을 제공한다:
1) 본 발명의 미세조류 배지에 미세조류를 배양하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 배양된 배양액으로부터 지질을 수득하는 단계.
본 발명의 방사선 및 알카리 병용 전처리를 이용한 볏짚 당화 방법은 감마선과 알카리를 병용 처리하였을 경우 셀룰로스 함량을 증가시키고, 다량의 리그닌 및 헤미셀룰로스를 제거하여 볏짚의 가분해성을 향상시키며, 효소 가수분해에서 글루코스 및 자일로스 수율을 증가시키고, 볏짚 가수 분해물을 탄소원으로 배양하였을 때 지질 생산 미세조류인 클로렐라 프로토테코이드가 지질을 생산하는 것을 확인함으로써 미세조류를 이용한 지질 생산에 유용하게 사용할 수 있는 최적의 방법을 확립하였다.
도 1은 볏짚에 감마선 및 알카리 병용 전처리에 의한 글루코스(glucose) 및 자일로스(xylose) 수율 변화를 나타낸 도이다.
도 2는 전처리된 볏짚의 가수분해에 있어서 Cellic CTec2 효소 로딩에 따른 글루코스 수율을 변화를 나타낸 도이다.
도 3a는 순수 글루코스 또는 볏짚 가수 분해물을 탄소원으로 종속 배양을 하였을 때 클로렐라 프로토테코이드의 글루코스 및 바이오 매스의 농도 변화를 나타낸 도이다:
○: 순수 글루코스를 탄소원으로 사용하였을 때 글루코스 잔여물의 농도;
●: 순수 글루코스를 탄소원으로 사용하였을 때 세포 농도;
△: 볏짚 가수 분해물을 탄소원으로 사용하였을 때 글루코스 잔여물의 농도; 및
▲: 볏짚 가수 분해물을 탄소원으로 사용하였을 때 세포 농도.
도 3b는 순수 글루코스 또는 볏짚 가수 분해물을 탄소원으로 혼합영양 배양을 하였을 때 클로렐라 프로토테코이드의 글루코스 및 바이오 매스의 농도 변화를 나타낸 도이다:
○: 순수 글루코스를 탄소원으로 사용하였을 때 글루코스 잔여물의 농도;
●: 순수 글루코스를 탄소원으로 사용하였을 때 세포 농도;
△: 볏짚 가수 분해물을 탄소원으로 사용하였을 때 글루코스 잔여물의 농도; 및
▲: 볏짚 가수 분해물을 탄소원으로 사용하였을 때 세포 농도.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 리그노셀룰로스계(lignocellulosic) 바이오 매스에 방사선 및 알카리를 병용처리하는 단계를 포함하는 리그노셀룰로스계 바이오 매스의 전처리 방법을 제공한다.
상기 리그노셀룰로스계 바이오 매스는 볏짚, 하드 우드, 소프트 우드, 초본류, 재생지(recycled paper), 폐지(waste paper), 목편, 펄프 및 종이 폐기물, 폐목재, 간벌목, 옥수수대, 옥수수심, 왕겨, 밀짚, 사탕수수대, 바가스, 농부산물, 농폐기물, 가축분뇨로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용하는 것이 바람직하나, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 볏짚인 것이 가장 바람직하다.
또한, 상기 방사선은 감마선, 전자선, UV 및 X선으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 감마선 인 것이 가장 바람직하다. 상기 감마선은 코발트(Co)-60, 크립톤(Kr)-85, 스트론튬(Sr)-90 또는 세슘(Cs)-137 등의 방사선 동위원소로부터 방출되는 감마선을 사용하여 조사하는 것이 바람직하며, 코발트(Co)-60 방사선 동위원소로부터 방출되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 방사선 조사량은 10 내지 300 kGy인 것이 바람직하고, 10 내지 200 kGy인 것이 더욱 바람직하며, 25 내지 100 kGy인 것이 가장 바람직하다. 상기 방사선 조사량이 10 kGy 이하이면 당화 효율이 떨어지는 문제점이 있고, 300 kGy를 초과하는 경우에는 조사선량에 비해 당화 효율의 변화가 없어 에너지 면에서 비효율적인 문제점이 있다.
또한, 상기 알칼리는 암모니아수, NaOH, Ca(OH)2, Na2S로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면 NaOH인 것이 가장 바람직하다. 또한, 상기 NaOH의 농도는 0.5 내지 3.0%(w/v)인 것이 바람직하고, 1.0 내지 2.0%(w/v)인 것이 더욱 바람직하며, 1.0%(w/v)인 것이 가장 바람직하다. 상기 알칼리 농도가 0.5%(w/v) 미만인 경우 당화 효율이 떨어지는 문제점이 있고, 3.0%(w/v)를 초과하는 경우에는 당화물의 pH 변화를 야기하는 문제점이 있다. 또한, 상기 알칼리의 처리는 리그노 셀룰로스계 바이오 매스 1 g 당 5 내지 20 ㎖ 처리하는 것이 바람직하고, 리그노 셀룰로스계 바이오 매스 1 g 당 9 ㎖ 처리하는 것이 보다 바람직하며, 만약 알칼리의 처리가 리그노 셀룰로스계 바이오 매스 1 g 당 5 ㎖ 미만인 경우, 당화 효율이 떨어지는 문제점이 있고, 20 ㎖을 초과하는 경우에는 사용량에 비해 당화 효율에 변화가 없어 비용면에서 비효율적인 문제점이 있다.
아울러, 상기 병용처리는 감마선 조사 및 알칼리를 순차적으로 처리하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 방사선 및 알카리 병용 전처리를 이용한 볏짚 당화 방법은 셀룰로스 함량을 증가시키고, 다량의 리그닌 및 헤미셀룰로스를 제거하여 볏짚의 가분해성을 향상시키며(표 1 참조), 효소 가수분해에서 글루코스 및 자일로스 수율을 증가시키는 것을 직접적으로 확인함으로써(도 1 참조), 리그노셀룰로스계 바이오 매스의 전처리에 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 리그노셀룰로스계 바이오 매스의 당화 방법을 제공한다:
1) 리그노셀룰로스계 바이오 매스에 감마선 조사 및 알카리를 병용 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 전처리된 리그노셀룰로스계 바이오 매스에 당화 효소를 처리하는 단계.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 리그노셀룰로스계 바이오 매스의 당화액 및 이를 포함하는 미세조류 배지를 제공한다.
상기 리그노셀룰로스계 바이오 매스는 볏짚, 하드 우드, 소프트 우드, 초본류, 재생지(recycled paper), 폐지(waste paper), 목편, 펄프 및 종이 폐기물, 폐목재, 간벌목, 옥수수대, 옥수수심, 왕겨, 밀짚, 사탕수수대, 바가스, 농부산물, 농폐기물, 가축분뇨로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용하는 것이 바람직하나, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 볏짚인 것이 가장 바람직하다.
또한, 상기 방사선은 감마선, 전자선, UV 및 X선으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 감마선 인 것이 가장 바람직하다. 상기 감마선은 코발트(Co)-60, 크립톤(Kr)-85, 스트론튬(Sr)-90 또는 세슘(Cs)-137 등의 방사선 동위원소로부터 방출되는 감마선을 사용하여 조사하는 것이 바람직하며, 코발트(Co)-60 방사선 동위원소로부터 방출되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 방사선 조사량은 10 내지 300 kGy인 것이 바람직하고, 10 내지 200 kGy인 것이 더욱 바람직하며, 25 내지 100 kGy인 것이 가장 바람직하다. 상기 방사선 조사량이 10 kGy 이하이면 당화 효율이 떨어지는 문제점이 있고, 300 kGy를 초과하는 경우에는 조사선량에 비해 당화 효율의 변화가 없어 에너지 면에서 비효율적인 문제점이 있다.
또한, 상기 알칼리는 암모니아수, NaOH, Ca(OH)2, Na2S로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면 NaOH인 것이 가장 바람직하다. 또한, 상기 NaOH의 농도는 0.5 내지 3.0%(w/v)인 것이 바람직하고, 1.0 내지 2.0%(w/v)인 것이 더욱 바람직하며, 1.0%(w/v)인 것이 가장 바람직하다. 상기 알칼리 농도가 0.5%(w/v) 미만인 경우 당화 효율이 떨어지는 문제점이 있고, 3.0%(w/v)를 초과하는 경우에는 당화물의 pH 변화를 야기하는 문제점이 있다. 또한, 상기 알칼리의 처리는 리그노 셀룰로스계 바이오 매스 1 g 당 5 내지 20 ㎖ 처리하는 것이 바람직하고, 리그노 셀룰로스계 바이오 매스 1 g 당 9 ㎖ 처리하는 것이 보다 바람직하며, 만약 알칼리의 처리가 리그노 셀룰로스계 바이오 매스 1 g 당 5 ㎖ 미만인 경우, 당화 효율이 떨어지는 문제점이 있고, 20 ㎖을 초과하는 경우에는 사용량에 비해 당화 효율에 변화가 없어 비용면에서 비효율적인 문제점이 있다.
또한, 상기 병용처리는 감마선 조사 및 알칼리를 순차적으로 처리하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 상기 미세조류는 난노클롭시스(Nannochloropsis), 클로렐라(Chlorella), 두나리엘라(Dunaliella), 시네데스무스(Scenedesmus), 셀레나스트룸(Selenastrum), 오실라토리아(Oscillatoria), 포르미듐(Phormidium), 스피루리나(Spirulina), 암포라(Amphora), 및 오크로모나스(Ochromonas)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하고, 클로렐라 미누티시마(Chlorella minutissima), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 클로렐라 바리아빌리스(Chlorella variabilis), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) 및 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 더욱 바람직하며, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)인 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 방사선 및 알카리 병용 전처리를 이용한 볏짚 당화 방법은 다량의 리그닌 및 헤미셀룰로스를 제거하여 볏짚의 가분해성을 향상시키고, 셀룰로스의 함량을 증가시키며(표 1 참조), 전처리 후 잔여물 회수를 감소시키고(표 2 참조), 미네랄의 농도를 변화시키는 것을 직접적으로 확인함으로써(표 3 참조), 리그노셀룰로스계 바이오 매스의 전처리에 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 미세조류 지질 생산 방법을 제공한다:
1) 본 발명의 미세조류 배지에 미세조류를 배양하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 배양된 배양액으로부터 지질을 수득하는 단계.
상기 리그노셀룰로스계 바이오 매스는 볏짚, 하드 우드, 소프트 우드, 초본류, 재생지(recycled paper), 폐지(waste paper), 목편, 펄프 및 종이 폐기물, 폐목재, 간벌목, 옥수수대, 옥수수심, 왕겨, 밀짚, 사탕수수대, 바가스, 농부산물, 농폐기물, 가축분뇨로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용하는 것이 바람직하나, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 볏짚인 것이 가장 바람직하다.
또한, 상기 방사선은 감마선, 전자선, UV 및 X선으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 감마선 인 것이 가장 바람직하다. 상기 감마선은 코발트(Co)-60, 크립톤(Kr)-85, 스트론튬(Sr)-90 또는 세슘(Cs)-137 등의 방사선 동위원소로부터 방출되는 감마선을 사용하여 조사하는 것이 바람직하며, 코발트(Co)-60 방사선 동위원소로부터 방출되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 방사선 조사량은 10 내지 300 kGy인 것이 바람직하고, 10 내지 200 kGy인 것이 더욱 바람직하며, 25 내지 100 kGy인 것이 가장 바람직하다. 상기 방사선 조사량이 10 kGy 이하이면 당화 효율이 떨어지는 문제점이 있고, 300 kGy를 초과하는 경우에는 조사선량에 비해 당화 효율의 변화가 없어 에너지 면에서 비효율적인 문제점이 있다.
또한, 상기 알칼리는 암모니아수, NaOH, Ca(OH)2, Na2S로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면 NaOH인 것이 가장 바람직하다. 또한, 상기 NaOH의 농도는 0.5 내지 3.0%(w/v)인 것이 바람직하고, 1.0 내지 2.0%(w/v)인 것이 더욱 바람직하며, 1.0%(w/v)인 것이 가장 바람직하다. 상기 알칼리 농도가 0.5%(w/v) 미만인 경우 당화 효율이 떨어지는 문제점이 있고, 3.0%(w/v)를 초과하는 경우에는 당화물의 pH 변화를 야기하는 문제점이 있다. 또한, 상기 알칼리의 처리는 리그노 셀룰로스계 바이오 매스 1 g 당 5 내지 20 ㎖ 처리하는 것이 바람직하고, 리그노 셀룰로스계 바이오 매스 1 g 당 9 ㎖ 처리하는 것이 보다 바람직하며, 만약 알칼리의 처리가 리그노 셀룰로스계 바이오 매스 1 g 당 5 ㎖ 미만인 경우, 당화 효율이 떨어지는 문제점이 있고, 20 ㎖을 초과하는 경우에는 사용량에 비해 당화 효율에 변화가 없어 비용면에서 비효율적인 문제점이 있다.
또한, 상기 병용처리는 감마선 조사 및 알칼리를 순차적으로 처리하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 상기 미세조류는 난노클롭시스(Nannochloropsis), 클로렐라(Chlorella), 두나리엘라(Dunaliella), 시네데스무스(Scenedesmus), 셀레나스트룸(Selenastrum), 오실라토리아(Oscillatoria), 포르미듐(Phormidium), 스피루리나(Spirulina), 암포라(Amphora), 및 오크로모나스(Ochromonas)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하고, 클로렐라 미누티시마(Chlorella minutissima), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 클로렐라 바리아빌리스(Chlorella variabilis), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) 및 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 더욱 바람직하며, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)인 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 당화 방법으로 제조한 볏짚 가수 분해물을 탄소원으로 사용하는 배지에서 지질을 생산하는 미세조류인 클로렐라 프로토테코이드를 배양하였을 때, 클로렐라 프로토테코이드가 성장하고, 지질을 생산함으로써(도 3 참조), 본원발명의 당화 방법으로 제조된 볏짚 가수 분해물이 미세조류를 이용한 지질 생산에 사용할 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해서 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 전처리에 의한 볏짚의 성분 변화 확인
바이오 매스에 있어서 무게 감소 및 조성 변화는 전처리 방법의 효과를 측정하는데 중요한 지표이다. 또한, 볏짚의 화학적 조성이 농장, 사용된 품종, 수확 시기, 및 보관 환경과 같은 다양한 구성요소에 의해 유의적으로 변하여 무처리 또는 전처리된 볏짚 바이오 매스 사이의 조성 및 무게 변화는 전처리 방법의 효과를 비교하기 위해 가장 먼저 분석된다.
<1-1> 볏짚의 준비
볏짚은 정읍(대한민국)에서 자란 것을 수득하였고, 전처리 전에 최대 5 ㎝로 절단하고 수돗물로 세척하여 부착물(extraneous matter)을 제거하였으며, 항량(constant weight)에 도달할 때까지 70℃의 오븐에서 건조시켰다. 그리고나서 폴리스티렌 봉투(polystyrene bag)에 담아 사용하기 전까지 보관하였다.
<1-2> 볏짚의 전처리
볏짚(rice straw)으로부터 글루코스(glucose) 회수을 증가시키기 위하여, 감마선 조사 및 알칼리(0.1% NaOH) 전처리 방법을 수행하였다.
구체적으로, 감마선 조사 및 알칼리 전처리를 위하여 볏짚을 잘게 다져서 유리 튜브에 넣고 이를 한국원자력연구원(대한민국, 정읍)의 코발트-60(Cobalt-60) 기계를 사용하여 10 kGy/h의 선량율(dose rate)로 감마선의 최적 흡수선량이 되도록 노출시켰다. 알칼리 전처리를 위해서는 볏짚 10 g을 90 ㎖의 1.0% NaOH(w/w) 용액과 혼합하여 실온(25 내지 30℃)에서 5일간 방치하였다. 전처리 후, 젖은 볏짚을 여과하여 모으고, 중성 pH가 될 때까지 탈염수(deionized water)로 세척하였다. 전처리된 모든 볏짚은 항량(constant weight)이 될 때까지 70℃에서 건조시켰다. 이어지는 단계를 수행하기 전에 모든 볏짚 샘플은 분쇄기(pulverizer, 코리아메디, 대한민국)를 사용하여 420 nm 체(sieve)를 통과시켜 갈아서 준비하였다.
<1-3> 전처리된 볏짚의 조성 분석
상기 실시예 <1-2>의 방법으로 전처리된 볏짚의 조성 변화를 확인하기 위하여 미국 국립 에너지 연구소(National Renewable Energy Laboratory)에서 고안한 두 단계 산 가수분해 프로토콜(two stage acid hydrolysis protocol)을 수행하였다.
구체적으로, 각각의 샘플을 72% 황산(sulfuric acid)으로 30℃에서 1시간 가수분해 한 뒤, 3% 황산으로 121℃에서 1시간 동안 가수분해를 수행하였다. 멸균된 가수분해 용액은 탄산 칼슘(calcium carbonate)를 첨가하여 pH 6.0이 되도록 중화시킨 뒤 감압 여과하였다. 그런 다음, 가수분해에 의해서 방출된 당(sugar)은 굴절율 검출기(refractive index detector)(Agilent 1260, Agilent Technologies, 미국)가 장착된 고성능 액체 크로마토그래피(high-pressure liquid chromatography) 시스템(Agilent 1200, Agilent Technologies, 미국)을 이용하여 측정되었고, 이때, 아미넥스 HPX-87P 컬럼(Bio-Rad Laboratories, 미국)에 65℃, 0.6 ㎖/분의 유속으로 HPLC를 사용하여 수행하였다. 모든 샘플은 0.2 ㎛ 필터로 여과되었고, HPLC에서 분석되기 전에 용리액(eluent)으로 희석되었다. 고순도의 단량체 당(pure monomeric sugar)의 다양한 농도를 이용하여 수행한 뒤, 이를 표준으로 사용하였다. 이론적인 글루코스 및 자일로스(xylose) 함량은 글루코스 및 자일로스 함량에 전환율(conversion factor)로서 0.9 및 0.88을 각각 곱하여 계산되었고, 이는 글루칸(glycan) 및 자일란(xylan)의 가수분해 동안 수득되는 질량(mass)을 위한 것이다. 수분 함량은 105℃에서 건조된 1 g의 볏짚 샘플의 손실된 무게를 항량으로 측정하였고, 산성 불용성 리그닌(acid insoluble lignin)[클라슨 리그닌(Klason lignin)]의 함량은 105℃에서 재 없는(ash-free), 오븐 건조된 필터 케이크(oven-dried filter cake)의 무게를 항량으로 측정하였으며, 감마선 조사 또는 알칼리-처리된 볏짚 샘플의 잔유물 회수(residue recovery), 탈 리그닌화(delignification), 및 셀룰로스(cellulose) 및 자일란의 손실은 대조군으로 미처리 볏짚 샘플을 사용한 중량 측정으로 결정되었다. 또한, 원소조성(elemental composition)은 한국기초과학지원연구원의 유도 결합 플라즈마(inductively coupled plasma, ICP)로 결정되었다.
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이 미처리 볏짚의 조성과 비교하였을 때, 알칼리 단독으로 전처리한 경우 셀룰로스 함량이 40.5%까지 증가하였고, 자일란, 리그닌, 추출물(extractives), 및 물의 함량은 각각 42.9%, 23.4%, 10.8%, 및 44.3%까지 감소하였다. 그러나, 감마선 및 알카리를 병용 전처리한 경우 셀룰로스 함량이 60%까지 추가적으로 증가하였고, 상기 증가량은 감마선 선량에 의존적이었다. 반면, 다른 구성요소의 수준은 감마선량에 의존적으로 감소하였다. 병용 전처리는 자일란, 리그닌, 추출물, 및 물의 제거율을 각각 63.8%, 40.2%, 32.3%, 및 58.7%로 증가시켰다. 또한, 세포의 성장을 억제하는 것으로 알려진 푸르푸랄(furfural) 및 히드록시메틸-푸르푸랄(hydroxymethyl-furfural)과 같은 당 분해 산물(sugar degradation product)는 확인되지 않았다(표 1). 리그닌은 물리적 장막(physical barrier)에 의하거나, 효소의 비생산적인 결합(unproductive binding)에 의한 탄수화물에의 접근을 제한함이 알려져 있다(Palonen, 2004; Berlin et al., 2007). 따라서, 셀룰로스 함량의 증가, 및 자일란 및 리그닌의 감소는 효소 가수분해의 과정을 촉진할 것이다. 다량의 리그닌 및 헤미셀룰로스(hemicellulose) 함량이 병용 전처리에 의해 제거된 이후, 병용 전처리가 볏짚의 효소 가분해성(emzymatic digestibility)을 증가시킬 수 있음이 명확하게 확인되었다.
전처리에 의한 볏짚 주요 구성요소의 변화 확인
전처리 조건 조성 분석(w/w, %)a
셀룰로스 자일란 클라손 리그닌 수용성 추출물 물 함량
미처리 37.5 10.5 18.4 9.3 9.7
25 kGy 37.1 10.8 18.2 9.2 9.6
50 kGy 37.4 10.6 18.3 9.5 9.3
75 kGy 37.3 10.3 18.2 9.4 9.1
100 kGy 37.9 10.6 18.5 9.4 9.1
NaOH 52.7 6.0 14.1 8.3 5.4
25 kGy + NaOH 52.7 5.9 13.6 8.1 5.5
50 kGy + NaOH 54.2 5.8 12.5 8.1 4.3
75 kGy + NaOH 56.9 4.4 11.5 7.2 4.3
100 kGy + NaOH 60.0 3.8 11.0 6.3 4.0
a결과는 세 번 수행해서 수득된 구성요소의 평균 백분율로 나타내었다.
알칼리 전처리 방법은 바이오 매스로부터 가수분해의 촉진 및 글루코스 회수(recovery)의 개선에 의한 바이오 매스의 팽윤(swelling)뿐만 아니라 효과적인 탈 리그닌화의 원인이 될 수 있음이 당업계에 알려져 있다(Kumar et al., 2009). 게다가, 다른 전처리 방법보다 더 낮은 온도 및 압력에서 사용할 수 있기 때문에, 산 전처리와 비교하였을 때 낮은 당 분해를 유발하는 대기조건(ambient condition)에서 수행될 수 있다. 따라서, 알카리 전처리는 산 또는 산화 시약(reagent)과 비교하여 리그노셀룰로직 바이오 매스(lignocellulosic biomass)의 구조를 파괴하기 위한 가장 효과적인 방법으로 확인되었다(Gaspar et al., 2007; Binod et al., 2010). 그러나, 이어지는 효소 가수분해 과정을 위해서 바이오 매스의 중화가 필요함에 따라 추가적인 세척단계가 요구되고, 상기 세척단계에서 수용성 헤미셀룰로스 및 리그닌이 제거될 수 있지만 셀룰로스를 포함하는 다를 구성요소의 함량도 이 과정에서 변화할 수 있다.
하기 표 2에 나타난 바와 같이, 전처리 후 잔여물 회수(residue recovery)에 근거하여 병용 전처리는 자일란 및 리그닌의 함량뿐만 아니라 전체 바이오 매스 회수를 유의적으로 감소시킬 수 있다(표 2). 비록 알칼리 처리가 산 또는 열수(hydrothermal) 처리보다 셀룰로스 함량에 있어서 적은 손실을 유발함이 알려져 있지만(Carvalheiro et al., 2008), 볏짚의 원래 무게에 근거하여 11 내지 15.4% 범위에서 셀룰로스 함량의 방사선 조사 의존적인 손실 또한 발생한다.
전처리된 볏짚의 고체 회수(solid recovery) 및 감마선 및 알칼리 처리된 볏짚의 주요 구성요소 손실 확인
전처리 조건 잔여물 회수
(w/w, %)a 		구성요소 손실(w/w, %)b
셀룰로스 자일란 리그닌
NaOH 65.1 8.5 62.8 50.2
25 kGy + NaOH 63.2 11.0 64.5 52.8
50 kGy + NaOH 60.5 12.5 66.5 58.6
75 kGy + NaOH 56.8 13.9 76.4 64.2
100 kGy + NaOH 52.9 15.4 80.9 68.5
a볏짚 100 g을 전처리하고, 결과는 세번 수행한 오븐-건조된 볏짚의 평균 백분율로 나타내었다.
b표 1의 잔유물 회수 및 구성요소 분석은 백분율에 근거하여 결정하였다.
또한, 표 3에 나타난 바와 같이 병용 전처리 후 중화된 볏짚에서 미네랄(mineral)의 농도에 유의적인 변화가 확인되었다. 미네랄중에서 칼륨(potassium), 칼슘(calcium) 및 마그네슘(magnesium)이 미처리된 볏짚의 주요 원소였으나, 병용 전처리한 경우 칼륨의 함량이 유의적으로 감소[22 폴드(fold)]하였고, 칼슘 및 마그네슘의 함량은 증가하였다. 나트륨(sodium) 함량 또한 전처리 후 증가하였고, 이는 알칼리 전처리에 의한 것일 것이다. 발효과정 동안 세포 성장을 억제하는 원인이 될 수 있는 비소(arsenic), 카드뮴(cadmium) 및 납(lead)과 같은 비-필수 중금속 양의 추적 또한 확인되었다(표 3). 이는 전처리 후 원소 분석이 발효 과정에서 이를 적용하기 위해 전처리된 바이오 매스의 조성을 심도있게 이해하기 위하여 필요하다.
병용 전처리 전과 후의 원소 조성 비교
원소(㎎/㎏) 미처리 100 kGy + NaOH
Al 156.83 ± 8.12 58.29 ± 5.65
As 1.21 ± 0.03 NDa
Ca 1605.93 ± 21.30 2805.35 ± 123.53
Cd 0.06 ± 0.01 0.07 ± 0.01
Cr 30.44 ± 1.43 14.30 ± 0.36
Cu 2.71 ± 0.06 6.46 ± 0.41
Fe 185.21 ± 6.36 215.27 ± 15.74
K 3743.71 ± 0.32 169.11 ± 12.96
Mg 629.97 ± 7.06 1016.06 ± 46.19
Mn 304.73 ± 12.51 515.47 ± 48.62
Mo 0.33 ± 0.01 NDa
Na 98.70 ± 0.95 383.19 ± 17.76
Ni 2.84 ± 0.19 2.01 ± 0.1
인산염(phosphate) 356.86 ± 5.83 73.55 ± 4.95
Pb 3.22 ± 0.02 5.12 ± 1.48
황산염(sulfate) 304.12 ± 1.09 277.20 ± 12.93
Zn 38.06 ± 0.43 55.49 ± 3.51
데이터는 ± 표준편차를 세 번 측정한 평균으로 나타내었다.
a탐지 한도 이하
< 실시예 2> 효소 가수분해에서 전처리에 의한 영향 확인
일반적으로 바이오 매스의 효소 가수분해의 효율은 셀룰라아제(cellulase), 자일라나제(xylanase) 및 글루코시다제(glucosidase)와 같은 효소의 조합물(combination)이 셀룰라아제 단독으로 사용했을 때보다 증가한다. 효소 가수분해는 산업 효소(industrial enzyme)로 현재 사용되고 있는 Cellic CTec2(Novozymes, 덴마크) 및 Cellic HTec2(Novozymes, 덴마크)로 수행되었고, Cellic HTec2는 볏짚에 있는 셀룰로스의 효율적인 효소 가수분해를 위하여 헤미셀룰로스 장벽(barrier)을 분해하기 위하여 사용되었다.
구체적으로, Cellic CTec2(120 FPU/㎖)의 FPU(filter paper unit)는 공지된 방법인 고쉬(Ghose)의 방법에 따라서 측정되었고, 제조사에 의해 제공된 Cellic HTec2(2500 FXU/㎖)의 FXU(fungal xylanase unit)는 로딩(loading)을 계산하기 위하여 사용되었다. 효소 가수분해는 12.5 ㎎/ℓ의 농도로 메로페넴(meropemen, Sigma-Aldrich, 미국)을 포함하는 50 mM 구연산 나트륨 완충액(sodium citrate buffer)로 수행되었고, 기질 농도(substrate consistency)는 20%(w/v)로 유지되었다. 볏짚 샘플을 완충액에 담그고, 효소를 첨가하기 30분 전에 가열하였으며, 상기 반응은 50℃, 200 rpm의 교반 항온수조(shaking water bath, JEIO TECH, 대한민국)에서 배양한 뒤, 효소의 지정된 양을 혼합하면서 시작되었다. 효소 가수분해의 진행은 상기 서술된 프로토콜(protocol)에 이어 HPLC를 사용한 볏짚 가수분해물(rice straw hydrolysate)에 있어서 감소된 당을 추정하여 일정한 간격을 두고 측정되었다. 모든 실험은 세 번 수행되었고, 그 값의 평균값을 나타내었다.
그 결과, 효소 가수분해 후 이론적인 글루코스 및 자일로스 수율(전처리 후 볏짚의 무게에 근거한)은 도 1에 나타난 바와 같다. 모든 볏짚 샘플에 있어서 초기 가수분해율(hydrolysis rate)은 이어지는 가수분해율보다 현저히 높았고, 이는 다른 연구 결과와 동일하게 나타났다. 무정형(amorphous) 셀룰로스의 선택적 초기 가수분해 또는 새로운 촉매점(catalytic site)의 이어지는 결핍(insufficiency)은 상기 현상을 설명할 수 있을 것이다(Eriksson et al., 2002; Zhong et al., 2009). 감마선 처리된 볏짚의 글루코스 및 자일로스 수율은 방사선 선량 의존적으로 증가하였고, 글루코스는 효소 볏짚 가수 분해물의 주요 구성요소였다. 미처리된 대조군과 비교하였을 때 감마선 전처리에 의해 글루코스 및 자일러스 수율은 2배 정도 증가하였으나, 셀룰로스 및 자일란의 단량체로의 전환은 여전히 50% 이하였으며, 이는 기존에 보고된 것과 일관된 결과를 나타내었다(Bak et al., 2009). 이는 방사선 전처리 방법이 매우 간단하지만, 이를 단독으로 사용하는 것은 볏짚의 전처리에 불충분함을 나타낸다. 알카리 전처리 결과, 감마선 전처리보다 높은 글루코스 및 자일로스 수율을 나타냈고, 셀룰로스 및 자일란의 단량체로의 변환율은 72 시간 후 각각 74.2% 및 85.8%를 나타내었다. 변환율을 증가시키기 위하여, 알카리 전처리를 감마선 조사 후에 수행하였고, 그 결과 볏짚의 전처리를 위해 병용 전처리가 가장 효율적인 방법이고, 72시간 후 셀룰로스 및 자일란의 최대 변환율은 각각 92.3% 및 98.9%로 나타났으며(도 1), 이는 기존에 보고된 것들 중에서 볏짚의 단량체 당(monomeric sugar)으로의 최대 변환율을 나타낸다(Xin 및 Kumakura, 1993; Zhang 및 Cai, 2008; Zhong et al., 2009; Waeonukul et al., 2012; Yang et al., 2012; Hou et al., 2013).
하나 또는 두 전처리의 병용에 대한 많은 연구에 있어서, β-글루코시다제(β-glucosidases) 및 헤미셀룰로스, 및 이온성 또는 비이온성 첨가제와 같은 보조 효소(accessory enzyme)의 첨가는 리그노셀룰로스의 가수분해율을 높이기 위해 사용됨이 잘 알려져 있다(Waeonukul et al., 2012).
본 발명에서는 볏짚의 가수분해에서 Cellic CTec2의 로딩의 영향, 구체적으로 셀룰로스에서 글루코스로의 변환을 확인하였고, 그 결과는 도 2에 나타난 바와 같이 Cellic CTec2 로딩이 높은 경우 셀룰로스의 초기 변환이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 셀롤로스 변환에서 효소 농도의 영향은 미처리된 볏짚에서 유의적이지 않았다. 미처리된 볏짚에 있어서 2 FPU를 사용하였을 경우 셀룰로스의 변환은 22%였고, 12 FPU를 사용하였을 때 28%로 증가하였다. 게다가, 효소 농도의 영향은 감마선 조사로 전처리된 볏짚보다 알카리 전처리된 볏짚에서 더욱 유의적이었다. 감마선 조사된 볏짚이 분해되었을 때, 변환율은 효소 2 FPU를 사용하였을 때 32%에서 12 FPU를 사용하였을 때 66%로 증가하였고, 알카리 전처리의 경우 2 FPU를 사용하였을 때 56%에서 12 FPU를 사용하였을 때 84%로 증가하였다. 또한, 효소 2 FPU를 감마선 및 알카리 전처리된 볏짚의 가수분해 반응에 첨가하였을 때, 셀룰로스의 변환은 분해 24 시간 후에는 47%였으나, 8 FPU를 첨가하였을 때 이론적인 글루코스 수율인 85.2%에는 24 시간 후에 도달하였다. 추가적으로, 가수분해 반응은 48 및 96시간 후 각각의 이론적인 글루코스 수율을 오직 5.4% 및 2.7%밖에 증가시키지 못하였고, 효소의 농도를 12 FPU로 증가시켜도 8 FPU를 첨가하고 24 시간이 지났을 경우와 비교하여 오직 2%밖에 증가하지 않았다(도 2).
< 실험예 1> 볏짚 가수 분해물 배지에서 클로렐라 프로토테코이드( Chlorella protothecoides )의 성장 확인
<1-1> 클로렐라 프로토테코이드의 준비
클로렐라 프로토테코이드 균주 25는 UTEX 조류 연구소(UTEX algae culture collection, Texas University of Austin, 미국)로부터 수득하였고, 배양을 위한 기본 배지로서 3 g/ℓ 효모 추출물(yeast extract)을 포함하는 BBM(Bold's basal medium)을 사용하였다(Bischoff 및 Bolds, 1963).
<1-2> 볏짚 가수 분해물 배지에서 클로렐라 프로토테코이드의 성장 확인
바이오디젤(biodiesel)을 생산하기 위한 볏짚의 가능성을 확인하기 위해, 알카리 및 감마선(100 kGy)으로 병용 전처리된 볏짚으로부터 준비된 볏짚 가수 분해물을 클로렐라 프로토테코이드의 성장을 위한 배지에서 탄소원(carbon source)으로 사용되었다.
구체적으로, 배치 배양(batch cultivation)은 10 g 탄소원(순수한 글루코스 또는 볏짚 가수 분해물의 적절한 부피를 첨가한 같은 양의 글루코스), 및 NaNO3 대신 질소원(nitrogen source)으로 3 g/ℓ 효모 추출물이 첨가된 150 ㎖ BBM을 포함하는 500 ㎖ 배필드 플라스크(baffled flask)에서 수행되었고, 배지의 pH는 6.8에 맞추었다. 조류(~ 5% V/V)를 접종하고, 회전 교반기에서 25℃, 120 rpm으로 교반하여 배양하였다. 혼합영양 배양(mixotrophic culture)을 위해서는 12시간을 주기로 빛에 노출시켰으며, 종속 배양(heterotrophic cultivation)은 어둠 속에서 유지되었다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 볏짚 가수 분해물을 단독 탄소원으로 사용하였을 때(종속 배양), 볏짚 가수 분해물의 글루코스는 거의 모두 사용되었고, 배양 8일 후 세포 농도는 6.5 g/ℓ에 도달하였다. 상기 결과는 정제된 글루코스를 사용하였을 때와 유사하였고, 10 g/ℓ 글루코스를 배지에 첨가하였을 때, 최대 세포 농도는 8.7 g/ℓ였다. 볏짚 가수 분해물 및 정제된 글루코스를 사용하였을 때 수율의 차이는 클로렐라 프로토테코이드의 성장을 억제하는 볏짚 가수 분해물 내의 다른 당 또는 유기산(organic acid)을 포함하는 불순물에 의한 것으로 예상된다. 볏짚 가수 분해물 배지에 있어서 클로렐라 프로토테코이드의 성장은 혼합영양 배양으로 수행되었고, 이때 세포량(cell mass)에 대한 탄소소비율은 92%였으며, 이는 종속 배양에서 65%보다 높았다. 그러나, 혼합영양 배양에서 최종 세포 농도는 4 g/ℓ로 종속 배양에서 최종 세포 농도인 6.5 g/ℓ보다 낮았다. 또한, 혼합영양 배양에 있어서 볏짚 가수 분해물을 사용했을 때보다 정제된 글루코스를 사용했을 때 세포 농도가 높았다(도 3).
미세조류 성장에 있어서 글루코스 농도의 영향은 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)에 의한 지질(lipid) 생산으로 확인할 수 있음이 공지되어 있다(Liang, et al., 2009). 혼합영양 배양하에서, 5% 및 10% 글루코스의 첨가는 성장 억제 효과를 나타내었고, 이는 1.5 및 6% 범위 내의 글루코스를 첨가한 클로렐라 프로토테코이드에서도 확인되었다(Xiong et al., 2008). 그러나, 미세조류 성장에 있어서 글루코스의 영향은 명확하게 확인되지 않았다.
따라서, 본 결과는 볏짚이 다른 배양 조건의 변화 없이 바이오 디젤을 생산하는 미세조류(microalgae)의 배양을 위한 비싼 탄소원을 대체 용도로 사용될 수 있음을 나타낸다.
< 실험예 2> 글루코스 또는 볏짚 가수 분해물 배지 사이의 조류 지질( lipid ) 생산 비교
글루코스 또는 볏짚 가수 분해물을 탄소원으로 사용하는 배지에서 배양한 조류의 전체 지질 함량 및 지방산 분석을 수행하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 지질 함량 분석을 위해서 미세조류 성장은 UV-Vis 분광광도계(spectrophotometer)(Biochrome, 영국)를 사용하여 배지만 있는 경우를 대조군으로 하여 액체 배지(culture broth)의 흡광도를 540 nm에서 측정하여 확인하였다. 조류(algal) 바이오 매스는 하기 수학식을 사용하여 계산하였고, 여기서 y(g/ℓ)는 건조 세포 무게, x는 540 nm에서 현탁된 현탁액(resuspension)의 흡광도(absorbance)이다.
Figure 112014065261087-pat00001
미세조류 바이오 매스의 건조 무게 측정을 위하여, 미세조류 배양액은 GF/C 유리 섬유 필터(glass fiber filter, GE Healthcare, 영국)를 사용하여 여과하고, 바이오 매스를 포함하는 필터는 70℃ 대류식 오븐(convection oven)으로 항량이 되도록 강제로 건조시켰다.
배양 후, 조류 세포는 4,000 rpm, 15분의 조건으로 원심분리하여 수득하고, 세포 펠렛(pellet)은 2일 동안 고진공(high vaccum)에서 동결건조하였으며, 0.2 g의 건조된 조류를 0.5 ㎖ 증류수 및 3 ㎖ 클로로포름(chloroform)/메탄올(methanol)(2:1, v/v)과 혼합하고, 상기 혼합된 혼합물을 20분 동안 교반한 뒤, 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 클로로폼 층(chloroform phase)을 무게를 재둔 튜브로 옮겼다. 상기 샘플은 5회 반복 추출되었고, 건조 블럭 수조(dry block bath)(MG-2000, EYELA, 일본)에서 60℃ 질소 가스 첨가에 의해 건조되었다. 실험 결과 지질 함량은 백분율로 나타내었다(지질 무게/바이오 매스의 무게 x %).
또한, 지방산 분석을 위하여, 지방산은 50 ㎎ 건조된 조류 세포로부터 1 ㎖ NaOH-CH3OH로 추출되었고, 각각 나눈 표본(aliquot)에 클로로포름에 녹인 10 g/ℓ 트리데카논산(tridecanoic acid, C13:0) 0.1 ㎖을 지방산의 정량을 위한 내부 표준(internal standard)으로 첨가하였다. 상기 혼합물은 75℃ 항온 수조에서 10분 동안 교반하였고, 실온에서 식혔다. 그리고나서 붕소 트라이플루오르화 메탄올(boron trifluoride-methanol) 용액(1:2, v/v)을 첨가하고, 75℃에서 10분간 교반하였으며, 실온에서 식혔다. 이어, 용액 층을 형성하기 위하여 0.3 ㎖ 포화된 염용액(saturated salt solution)을 첨가한 뒤, 이어서 2 ㎖ 헥산(hexane)을 첨가하고, 상기 혼합물을 원심분리하였다. 상층 지방산 층은 5975 불활성의 다수 선택성의 탐지 장치(5975 inert mass selective detector)가 장착된 Agilent HP 6890N 기계에서 GC-결합된 질량 분광법 분석(GC-linked mass spectrometry analysis)을 수행에 사용되었고, 모세관(capillary column) DB-5MS(길이 30 m, I.D. 0.25 ㎜, 두께 0.25 ㎛, Agilent Technologies)가 사용되었다. 이때, 샘플의 크기는 1 ㎕이고, 운반 기체로는 1.0 ㎖/분 유속의 헬륨이 사용되었으며, 용액 지연시간(solvent delay time)은 5 분이었고, 주입 온도는 200℃였다. 초기 오븐 온도는 1분 동안 130℃였고, 이는 분당 5℃씩 상승하여 200℃까지 증가하였고, 5분 동안 상기 온도를 유지하였다. 지방산은 NIST 05 질량 스펙트럼 데이타베이스(NIST 05 mass spectral database)와 그들의 질량 스펙트럼 패턴(mass spectral database) 및 보존지수(retention index)를 직접 비교함으로써 확인하였다. 데이타는 세 번 측정한 평균값으로 나타내었다.
그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이, 종속 배양에 있어서 전체 지질 함량 및 지방산 조성은 글루코스 및 볏짚 가수 분해물 배지에서 자란 클로렐라 프로토테코이드 사이에 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 세포 건조 무게를 기준으로 전체 지질 함량은 약 55%였고, 전체 지방산 함량은 45%였다. 클로렐라 프로토테코이드에서 가장 많은 지방산은 9-옥타데카노산(9-octadecenoic acid)이었고, 주요 지방산은 헥사데카노산(hexadecanoic acid), 9,12-옥타데카디에노산(9,12-octadecadienoic acid, Z,Z) 및 옥타데카트리에노산(octadecatrienoic acid)으로 확인되었다. 혼합영양 배양에 있어서 전체 지질 함량 및 지방산 조성은 글루코스 및 볏짚 가수 분해물 배지에서 자란 클로렐라 프로토테코이드 사이에 어떠한 차이도 나타내지 않았다. 클로렐라 프로토테코이드의 종속 배양 및 혼합영양 배양에서 전체 지질 함량은 같았고, 전체 지방산 함량에 있어서 혼합영양 배양에서 미미하게 감소한 것을 확인하였으나, 이는 통계적으로 유의하지 않았다. 지방산 조성에 대하여, 9-옥타데카노산 함량은 감소하였으나, 9,12,15-옥타데카트리에노산 함량은 증가하였다(표 4).
다른 탄소원에 따른 클로렐라 프로토테코이드의 지질 추출물의 지방산 조성 확인
구성요소 관련 FAME 함량(%)
종속 배양 혼합영양 배양
글루코스 볏짚
가수 분해물		 글루코스 볏짚
가수 분해물
7,10-Hexadecadienoic acid, mothyl ester 2.13 2.30 9.02 1.64
7,10,13-Hexadecatrienoic acid, methyl ester 3.11 3.91 4.17 5.90
Hexadecanoic acid, methyl ester 15.38 16.26 20.40 20.56
Heptadecanoic acid, methyl ester 0.47 0.60 0.59 0.48
9,12-Octadecadienoic acid(Z,Z)-, methyl ester 16.91 17.10 10.52 11.59
9-Octadecenoic acid, methyl ester 51.37 47.57 31.81 34.77
9,12,15-Octadecatrienoic acid methyl ester 9.57 10.93 21.76 23.14
Octadecanoic acid, methyl ester 1.05 1.32 1.74 1.92
TL/CDW(%)b 55.77 54.97 56.37 55.10
TFA/CDW(%)c 45.62 45.37 40.95 40.04
TFA/TL(%)d 81.80 82.54 72.65 72.66
TFA 수율(g/ℓ) 4.00 2.95 2.63 1.57
FAME 조성은 모든 FAME의 무게 백분율로 나타내었다.
데이타는 세 번 측정하여 표준편차와 함께 평균으로 나타내었다.
공지된 바에 의하면 클로렐라 불가리스의 지질함량 또한 종속 배양 및 혼합영양 배양에서 같았으므로, 따라서 상기 결과는 볏짚 가수 분해물이 지방산 함량 및 조성물의 어떠한 변화를 유발하지 않는 글루코스 대체 탄소원으로 사용될 수 있음을 나타낸다.

Claims (13)

1) 리그노셀룰로스계 바이오 매스에 전처리 단계로써 방사선을 조사한 후 알카리를 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 전처리된 리그노셀룰로스계 바이오 매스에 당화 효소를 처리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 리그노셀룰로스계 바이오매스의 당화액을 함유하는 것을 특징으로 하는 미세조류 생산용 탄소원용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 리그노셀룰로스계 바이오 매스는 볏짚인 것을 특징으로 하는 미세조류 생산용 탄소원용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 방사선은 감마선, 전자선, UV 및 X선으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 미세조류 생산용 탄소원용 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 감마선은 10 내지 150 kGy의 선량으로 조사되는 것을 특징으로 하는 미세조류 생산용 탄소원용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 알카리는 NaOH인 것을 특징으로 하는 미세조류 생산용 탄소원용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 NaOH의 농도는 1.0 내지 3.0%(w/v)인 것을 특징으로 하는 미세조류 생산용 탄소원용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 알카리는 리그노셀룰로스계 바이오 매스 1 g 당 5 내지 20 ㎖로 처리하는 것을 특징으로 하는 미세조류 생산용 탄소원용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 미세조류는 클로렐라 미누티시마(Chlorella minutissima), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 클로렐라 바리아빌리스(Chlorella variabilis), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) 및 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella protothecoides)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 미세조류 생산용 탄소원용 조성물.
제 1항의 미세조류 생산용 탄소원용 조성물을 포함하는 미세조류 지질 생산용 배지.
1) 리그노셀룰로스계 바이오 매스에 전처리 단계로써 방사선을 조사한 후 알카리를 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 전처리된 리그노셀룰로스계 바이오 매스에 당화 효소를 처리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 리그노셀룰로스계 바이오매스의 당화액을 함유하는 것을 특징으로 하는 미세조류 지질 생산방법.





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