BR122020002919B1 - Microrganismo recombinante para a produção de um derivado de ácido graxo ômega-hidróxi e método de produção de um derivado de ácidos graxos ômega-hidroxi - Google Patents

Microrganismo recombinante para a produção de um derivado de ácido graxo ômega-hidróxi e método de produção de um derivado de ácidos graxos ômega-hidroxi Download PDF

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Andreas W. Schirmer
Haibo Wang
Stephen B. Del Cardayre
Zhihao Hu
Louis G. Hom
Baolong Zhu
Cindy Chang
Emanuela E. Popova
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Genomatica, Inc.
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Abstract

A invenção se refere à derivados de ácido graxo ômega-hidroxilados e métodos para a produção destes. Aqui, a invenção inclui um novo e ecologicamente amigável método de produção, que fornece derivados de ácido graxo ômega-hidroxilados em alta pureza e rendimento. Além disso são incluídos microrganismos recombinantes que produzem derivados de ácido graxo ômega-hidroxilados através da fermentação seletiva.

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US N° 61/835.464, depositado em 14 de junho de 2013, as divulgações completas das quais são aqui incorporadas por referência.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[002] O presente pedido de patente contém uma listagem de sequências que foi submetida eletrônica no formato ASCII e é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Referida cópia ASCII, criada em 16 de junho de 2014, é designada LS00048PCT_SL.txt e é de 342.103 bytes de tamanho.
CAMPO
[003] A descrição se refere aos derivados de ácidos graxos ômega-hidroxilados e métodos para a sua produção. Aqui, a divulgação engloba um novo e método de produção ecológica, que fornece derivados de ácidos graxos ômega- hidroxilados em alta pureza e rendimento. Além disso, são englobados microrganismos recombinantes que produzem derivados de ácidos graxos ômega-hidroxilados por meio de fermentação seletiva.
FUNDAMENTOS
[004] Derivados de ácido graxo (w-hidroxi) ômega- hidroxilados têm muitas utilizações comerciais como componentes de agentes industriais. A indústria reconhece vários tipos de derivados de ácido graxo w-hidroxi incluindo os ácidos graxos u-hidroxi ; ésteres metílicos de ácido graxo u-hidroxi ; ácidos graxos u-oxo; ácidos graxos M-amino; ésteres metílicos de ácido graxo u-amino; alfa-, ômega-diácidos (α,u-diácidos); ésteres metílicos de ácido graxo ômega-carboxi (éster metílico de ácido graxo u- carboxi); alfa-, ômega-diésteres (α,u-diésteres); alfa-, ômega-dióis (α,u-dióis); e similares. Estas moléculas são também importantes como precursores de outros compostos. Por exemplo, ácidos a,u-dicarboxílicos, e outras moléculas α,u-bifuncionais são produtos químicos importantes com aplicações industriais em resinas de polímero, fluidos para o trabalho de metais, adesivos, inibidores de corrosão, eletrólitos de capacitor, lubrificantes sintéticos de diéster, fibras, curativos de revestimento em pó, plastificantes, revestimentos de poliéster, resinas epóxi, resinas de poliamida, sabores, perfumes, tensoativos, detergentes, aditivos e muito mais. Hoje em dia, os derivados de ácidos graxos u-hidroxi ainda são fabricados principalmente a partir de materiais à base de petróleo ou através da bioconversão de ácidos graxos e de parafina. Os métodos químicos para a produção destes compostos requerem a utilização de reagentes perigosos e são de energia intensiva e custos ambientais. Por outro lado, as vias de fermentação emergentes, enquanto os processos verdes, considerados, ainda são muito caros e estão limitados nos tipos de produtos que podem ser feitos. Assim, um processo para a produção direta de derivados de ácidos graxos u- hidroxi de vários tipos e funcionalidades de matérias- primas renováveis não só seria mais seguro para o ambiente, mas também consideravelmente mais rentável. A divulgação direciona a esta necessidade. SUMÁRIO
[005] Um aspecto da invenção proporciona um microrganismo recombinante para a produção de um derivado de ácido graxo (w-hidroxi) ômega-hidroxilado in vivo, quando cultivado num caldo de fermentação na presença de uma fonte de carbono a partir de uma matéria-prima renovável. O microrganismo inclui uma via de engenharia para expressar pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo incluindo uma tioesterase de EC 3.1.2.-,3.1.1.5, ou 3.1.2.14; ou um éster sintase de EC 2.3.1.75 ou EC 2.3.1.20; e uma w-hidroxilase modificada de EC 1.14.15.3. A w-hidroxilase modificada tem uma atividade enzimática (P450) de monooxigenase de citocromo P450 modificado, e catalisa de forma eficiente a w-posição de cadeias de hidrocarboneto in vivo. Numa modalidade, a w-hidroxilase modificada é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase de EC 1.14.15.3. Em outra modalidade, a w-hidroxilase modificada é um polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A-redutase. Numa outra modalidade, o polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A-redutase é uma proteína de fusão híbrida autossuficiente de CYP153A-RedRhF. Em ainda outra modalidade, a w-hidroxilase modificada que é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6 e tem uma ou mais mutações incluindo V141I, V141T, V141Q, V141G, V141M, V141L, R27L, R82D, R178N, A231T, N309R, N407A, V415R, T516V, P666A, P666D e/ou A796V. Aqui, a variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase tem pelo menos uma mutação na posição de aminoácido 27, 82, 141, 178, 231, 309, 407, 415, 516, 666 e/ou 796. O microrganismo recombinante produz derivados de ácidos graxos w-hidroxi, incluindo, mas não limitados a, ácidos graxos w-hidroxi e os ésteres metílicos de ácidos graxos w- hidroxi.
[006] Outro aspecto da invenção proporciona um microrganismo recombinante para a produção de um derivado de ácido graxo w-hidroxi in vivo, quando cultivado num caldo de fermentação na presença de uma fonte de carbono a partir de uma matéria-prima renovável O microrganismo inclui uma via de engenharia para expressar pelo menos duas sequências de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo incluindo uma tioesterase de EC 3.1.2.-, 3.1.1.5, ou 3.1.2.14; ou um éster sintase de EC 2.3.1.75 ou EC 2.3.1.20; e uma w-hidroxilase modificada de EC 1.14.15.3. A w-hidroxilase modificada tem uma atividade enzimática (P450) monooxigenase de citocromo P450 modificada e catalisa de modo eficiente a w-posição de cadeias de hidrocarboneto in vivo. Num aspecto, o microrganismo recombinante é manipulado para expressar ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo incluindo um álcool desidrogenase de EC 1.1.1.1/2 ou um álcool oxidase d EC 1.1.3.13 ou EC 1.1.3.20. Numa modalidade, a w-hidroxilase modificada é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase de EC 1.14.15.3. Em outra modalidade, a w-hidroxilase modificada é um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase. Numa outra modalidade, o polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase é uma proteína de fusão híbrida CYP153A-RedRhF autossuficiente. Em ainda outra modalidade, a w-hidroxilase modificada que é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6 e tem uma ou mais mutações incluindo V141I, V141T, V141Q, V141G, V141M, V141L, R27L, R82D, R178N, A231T, N309R, N407A, V415R, T516V, P666A, P666D e/ou A796V. O microrganismo recombinante produz derivados de ácidos graxos w-hidroxi, incluindo, mas não limitado a, ácidos graxos w-oxo e ésteres metílicos de ácido graxo w-oxi.
[007] Outro aspecto da invenção proporciona um microrganismo recombinante para a produção de um derivado de ácido graxo w-hidroxi in vivo, quando cultivado num caldo de fermentação na presença de uma fonte de carbono a partir de uma matéria-prima renovável. O microrganismo inclui uma via de engenharia para expressar pelo menos duas sequências de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo incluindo uma tioesterase de EC 3.1.2.-, 3.1.1.5, ou 3.1.2.14; ou um éster sintase de EC 2.3.1.75 ou EC 2.3.1.20; e uma w-hidroxilase modificada (monooxigenase de citocromo P450) de EC 1.14.15.3. Em um aspecto, o microrganismo recombinante é manipulado para expressar ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo incluindo um álcool desidrogenase de EC 1.1.1.1/2 ou um álcool oxidase de EC 1.1.3.13 ou EC 1.1.3.20. Em um outro aspecto, o microrganismo recombinante ainda é manipulado para expressar ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo incluindo um aldeído desidrogenase de EC 1.2.1.3/4/5 ou um aldeído oxidase de EC 1.2.3.1. A w-hidroxilase modificada tem uma atividade enzimática (P450) de monooxigenase de citocromo P450 modificado e catalisa de forma eficiente a w-posição de cadeias de hidrocarboneto in vivo. Numa modalidade, a w- hidroxilase modificada é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase de EC 1.14.15.3. Em outra modalidade, a w-hidroxilase modificada é um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase. Numa outra modalidade, o polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é uma proteína de fusão híbrida CYP153A-RedRhF autossuficiente. Em ainda outra modalidade, a w-hidroxilase modificada que é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6 e tem uma ou mais mutações, incluindo V141I, V141T, V141Q, V141G, V141M, V141L, R27L, R82D, R178N, A231T, N309R, N407A, V415R, T516V, P666A, P666D e/ou A796V. O microrganismo recombinante produz derivados de ácidos graxos w-hidroxi, incluindo, mas não limitados a, derivados de ácidos graxos w-hidroxi que são a,w-diácidos ou ésteres metílicos de ácidos graxos w-carboxi.
[008] Ainda, um outro aspecto da invenção proporciona um microrganismo recombinante para a produção de um derivado de ácido graxo w-hidroxi in vivo quando cultivado num caldo de fermentação na presença de uma fonte de carbono a partir de uma matéria-prima renovável. O microrganismo inclui uma via de engenharia para expressar pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo incluindo uma tioesterase de EC 3.1.2.-, 3.1.1.5, ou 3.1.2.14; ou um éster sintase de EC 2.3.1.75 ou EC 2.3.1.20; e uma w-hidroxilase modificada de EC 1.14.15.3. Num aspecto, o microrganismo recombinante é manipulado para expressar ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo incluindo um álcool desidrogenase de EC 1.1.1.1/2 ou um álcool oxidase de EC 1.1.3.13 ou EC 1.1.3.20. Em um outro aspecto, o microrganismo recombinante é manipulado para ainda expressar uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo incluindo um aldeído desidrogenase de EC 1.2.1.3/4/5 ou um aldeído oxidase de EC 1.2.3.1. Em ainda outro aspecto, o microrganismo recombinante é manipulado para expressar ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo incluindo uma acil-CoA ligase de EC 6.2.1.3 ou uma acil-CoA transferase de EC 2.8.3.6. A w- hidroxilase modificada tem uma atividade enzimática (P450) de monooxigenase de citocromo P450 modificado e de forma eficiente catalisa a w-hidroxilase modificada posição de cadeias de hidrocarboneto in vivo. Em uma modalidade, a w- hidroxilase modificada é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase de EC 1.14.15.3. Em outra modalidade, a w-hidroxilase modificada é um polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A-redutase. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A-redutase é uma proteína de fusão híbrida CYP153A-RedRhF autossuficiente. Em ainda outra modalidade, a w-hidroxilase modificada que é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6 e tem uma ou mais mutações incluindo V141I, V141T, V141Q, V141G, V141M, V141L, R27L, R82D, R178N, A231T, N309R, N407A, V415R, T516V, P666A, P666D e/ou A796V. O microrganismo recombinante produz derivados de ácidos graxos w-hidroxi, incluindo, mas não limitados a, derivados de ácidos graxos w-hidroxi que são α,w-diésteres.
[009] A divulgação engloba adicionalmente um microrganismo recombinante para a produção de um derivado de ácido graxo w-hidroxi in vivo quando cultivado num caldo de fermentação na presença de uma fonte de carbono a partir de uma matéria-prima renovável. O microrganismo inclui uma via de engenharia para expressar pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo incluindo uma tioesterase de EC 3.1.2.-, 3.1.1.5, ou 3.1.2.14; ou um éster sintase de EC 2.3.1.75 ou EC 2.3.1.20; e uma w- hidroxilase modificada de EC 1.14.15.3. Em um aspecto, o microrganismo recombinante é manipulado para expressar ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo incluindo um álcool desidrogenase de EC 1.1.1.1/2 ou um álcool oxidase de EC 1.1.3.13 ou EC 1.1.3.20. Num outro aspecto, o microrganismo recombinante é manipulado para expressar ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica para um polipeptídeo incluindo um amino transferase de EC 2.6.1 ou uma amina desidrogenase de EC 1.4.9, EC 1.4.98 ou EC 1.4.99. A w-hidroxilase tem uma atividade enzimática (P450) de monooxigenase de citocromo P450e catalisa eficazmente a posição w de cadeias de hidrocarboneto in vivo. Numa modalidade, a w-hidroxilase modificada é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase de EC 1.14.15.3. Em outra modalidade, a w- hidroxilase modificada é um polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A-redutase. Numa outra modalidade, o polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A-redutase é uma proteína de fusão híbrida de autossuficiente. Em ainda outra modalidade, a w-hidroxilase modificada que é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6 e tem uma ou mais mutações incluindo V141I, V141T, V141Q, V141G, V141M, V141L, R27L, R82D, R178N, A231T, N309R, N407A, V415R, T516V, P666A, P666D e/ou A796V. O microrganismo recombinante produz derivados de ácidos graxos w-hidroxi, incluindo, mas não limitados a, ácidos graxos w-amino e ésteres metílicos de ácidos graxos w- amino.
[0010] Outro aspecto da invenção divulga um microrganismo recombinante para a produção de um derivado de ácido graxo w-hidroxi in vivo, quando cultivada num caldo de fermentação na presença de uma fonte de carbono a partir de uma matéria-prima renovável. O microrganismo inclui uma via de engenharia para expressar pelo menos duas sequências de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo incluindo uma tioesterase de EC 3.1.2.-, 3.1.1.5, ou 3.1.2.14; ou um éster sintase de EC 2.3.1.75 ou EC 2.3.1.20; e uma w-hidroxilase modificada de EC 1.14.15.3. Num aspecto, o microrganismo recombinante é manipulado para expressar ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um álcool desidrogenase de EC 1.1.-.- e uma redutase do ácido carboxílico de 1.2.99. A w-hidroxilase tem uma atividade enzimática (P450) de monooxigenase P450 de citocromo que de modo eficiente catalisa a w-posição de cadeias de hidrocarboneto in vivo. Numa modalidade, a w-hidroxilase modificada é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase de EC 1.14.15.3. Em outra modalidade, a w- hidroxilase modificada é um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase. Numa outra modalidade, o polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é uma proteína de fusão híbrida CYP153A-RedRhF autossuficiente. Em ainda outra modalidade, a w-hidroxilase modificada que é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6 e tem uma ou mais mutações incluindo V141I, V141T, V141Q, V141G, V141M, V141L, R27L, R82D, R178N, A231T, N309R, N407A, V415R, T516V, P666A, P666D e/ou A796V. O microrganismo recombinante produz derivados de ácidos graxos w-hidroxi, incluindo, mas não limitado a, derivados de ácidos graxos w-hidroxi que são a,w-dióis.
[0011] A divulgação contempla adicionalmente uma cultura de células que compreende o microrganismo (supra), em que a cultura de células produz derivados de ácidos graxos w-hidroxi incluindo, mas não limitado a, ácidos graxos w-hidroxi incluindo os ácidos graxos livres w- hidroxi; ésteres metílicos de ácidos graxos w-hidroxi; ácidos graxos w-oxo; ésteres metílicos de ácido graxo w- oxo; a,w-diácidos; a,w-dióis; a,w-diésteres, ésteres metílicos de ácidos graxos w-carboxi; ácidos graxos w- amino; e ésteres metílicos de ácidos graxos w-amino.
[0012] Outro aspecto da invenção divulga um método de produção de um derivado de ácido graxo w-hidroxi incluindo o fornecimento de um microrganismo recombinante em um caldo de fermentação, o microrganismo possuindo uma via de engenharia para expressar pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo incluindo uma tioesterase de EC 3.1.2.-, 3.1.1.5 ou 3.1.2.14; ou um éster sintase de EC 2.3.1.75 ou EC 2.3.1.20; e uma w- hidroxilase modificada de EC 1.14.15.3. O método inclui ainda a adição de uma matéria-prima renovável contendo uma fonte de carbono ao caldo de fermentação, e o isolamento de um derivado de ácido graxo w-hidroxi a partir do caldo de fermentação. Numa modalidade, a w-hidroxilase modificada é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase de EC 1.14.15.3. Em outra modalidade, a w-hidroxilase modificada é um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- redutase. Numa outra modalidade, o polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é uma proteína de fusão híbrida CYP153A-RedRhF autossuficiente. Em ainda outra modalidade, a w-hidroxilase modificada que é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6 e tem uma ou mais mutações, incluindo V141I, V141T, V141Q, V141G, V141M, V141L, R27L, R82D, R178N, A231T, N309R, N407A, V415R, T516V, P666A, P666D e/ou A796V. Num aspecto, o derivado de ácido graxo w-hidroxi produzido é um ácido graxo w-hidroxi livre ou um éster metílico de ácidos graxos w-hidroxi.
[0013] Outro aspecto da invenção divulga um método de produção de um derivado de ácido graxo w-hidroxi incluindo o fornecimento de um microrganismo recombinante em caldo de fermentação, o microrganismo possuindo uma via de engenharia para expressar pelo menos duas sequências de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo incluindo uma tioesterase de EC 3.1.2.-, 3.1.1.5 ou 3.1.2.14; ou um éster sintase de EC 2.3.1.75 ou EC 2.3.1.20; e uma w-hidroxilase (monooxigenase de citocromo P450) de EC 1.14.15.3. Num aspecto particular, o microrganismo recombinante é manipulado para expressar ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo incluindo um álcool desidrogenase de EC 1.1.1.1/2 ou um álcool oxidase de EC 1.1.3.13 ou EC 1.1.3.20. O método inclui ainda a adição de uma matéria-prima renovável contendo uma fonte de carbono ao caldo de fermentação, e o isolamento de um derivado de ácido graxo w-hidroxi a partir do caldo de fermentação. Em um aspecto, o derivado de ácido graxo w-hidroxi produzido é um ácido graxo u-oxo ou éster metílico de ácido graxo de u- oxo.
[0014] Outro aspecto da invenção divulga um método de produção de um derivado de ácido graxo w-hidroxi incluindo o fornecimento de um microrganismo recombinante em um caldo de fermentação, o microrganismo possuindo uma via de engenharia para expressar pelo menos duas sequências de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo incluindo uma tioesterase de EC 3.1.2.-, 3.1.1.5 ou 3.1.2.14; ou um éster sintase de EC 2.3.1.75 ou EC 2.3.1.20; e uma w-hidroxilase modificada de EC 1.14.15.3. Num aspecto particular, o microrganismo recombinante é manipulado para expressar mais de uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo incluindo um álcool desidrogenase de EC 1.1.1.1/2 ou um álcool oxidase de EC 1.1.3.13 ou EC 1.1.3.20. Num outro aspecto específico, o microrganismo recombinante é manipulado para expressar ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo incluindo um aldeído desidrogenase de EC 1.2.1.3/4/5 ou um aldeído oxidase de EC 1.2.3.1. O método inclui ainda a adição de uma matéria-prima renovável contendo uma fonte de carbono ao caldo de fermentação, e o isolamento de um derivado de ácido graxo w-hidroxi a partir do caldo de fermentação. Em um aspecto, o derivado de ácido graxo a- hidroxi produzido é um a,w-diácido ou um éster dimetílico do ácido α,a-graxo. Numa modalidade, a a-hidroxilase modificada é uma variante de fusão híbrida da proteína de a-hidroxilase de EC 1.14.15.3. Em outra modalidade, a a- hidroxilase modificada é um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase. Numa outra modalidade, o polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A redutase é uma proteína de fusão híbrida CYP153A-RedRhF autossuficiente. Em ainda outra modalidade, a a-hidroxilase modificada que é uma variante da proteína de fusão híbrida de a-hidroxilase tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6 e tem uma ou mais mutações, incluindo V141I, V141T, V141Q, V141G, V141M, V141L, R27L, R82D, R178N, A231T, N309R, N407A, V415R, T516V, P666A, P666D e/ou A796V.
[0015] Outro aspecto da invenção divulga um método de produção de um derivado de ácido graxo a-hidroxi incluindo o fornecimento de um microrganismo recombinante em um caldo de fermentação, o microrganismo possuindo uma via de engenharia para expressar pelo menos duas sequências de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo incluindo uma tioesterase de EC 3.1.2.-, 3.1.1.5 ou 3.1.2.14; ou um éster sintase de EC 2.3.1.75 ou EC 2.3.1.20; e uma a-hidroxilase modificada de EC 1.14.15.3. Num aspecto particular, o microrganismo recombinante é manipulado para expressar ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo incluindo um álcool desidrogenase de EC 1.1.1.1/2 ou uma oxidase de álcool EC 1.1.3.13 ou EC 1.1.3.20. Num outro aspecto específico, o microrganismo recombinante é manipulado para expressar ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo incluindo um amino transferase de EC 2.6.1 ou uma amina desidrogenase de EC 1.4.9, EC 1.4.98 ou EC 1.4.99. O método inclui ainda a adição de uma matéria-prima renovável contendo uma fonte de carbono ao caldo de fermentação, e o isolamento de um derivado de ácido graxo w-hidroxi a partir do caldo de fermentação. Num aspecto, o derivado de ácido graxo w-hidroxi produzido é um ácido graxo w-amino ou éster metílico de ácido graxo w-amino. Numa modalidade, a w- hidroxilase modificada é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase de EC 1.14.15.3. Numa outra modalidade, a w-hidroxilase modificada é um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase. Numa outra modalidade, o polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é uma proteína de fusão híbrida CYP153A-RedRhF autossuficiente. Em ainda outra modalidade, a w-hidroxilase modificada que é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6 e tem uma ou mais mutações incluindo V141I, V141T, V141Q, V141G, V141M , V141L, R27L, R82D, R178N, A231T, N309R, N407A, V415R, T516V, P666A, P666D e/ou A796V.
[0016] A divulgação contempla ainda um método de produção de um derivado de ácido graxo w-hidroxi incluindo o fornecimento de um microrganismo recombinante em um caldo de fermentação, o microrganismo possuindo uma via de engenharia para expressar pelo menos duas sequências de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo incluindo uma tioesterase de EC 3.1.2.-, 3.1.1.5 ou 3.1.2.14; ou um éster sintase de EC 2.3.1.75 ou EC 2.3.1.20; e uma w-hidroxilase modificada de EC 1.14.15.3. Em um aspecto particular, o microrganismo recombinante é ainda mais manipulado para expressar um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo incluindo um ácido carboxílico redutase de EC 1.2.99.6 ou e uma álcool desidrogenase de EC 1.1.-.-. O método inclui ainda a adição de uma matéria-prima renovável contendo uma fonte de carbono ao caldo de fermentação, e o isolamento de um derivado de ácido graxo w-hidroxi a partir do caldo de fermentação. Num aspecto, o derivado de ácido graxo w- hidroxi produzido é um α,w-diol. Em uma modalidade, a w- hidroxilase modificada é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase de EC 1.14.15.3. Em uma outra modalidade, a w-hidroxilase modificada é um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é uma proteína de fusão híbrida CYP153A-RedRhF autossuficiente. Em ainda outra modalidade, a w-hidroxilase modificada que é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6 e tem uma ou mais mutações incluindo V141I, V141T, V141Q, V141G, V141M, V141L, R27L, R82D, R178N, A231T, N309R, N407A, V415R, T516V, P666A, P666D e/ou A796V.
[0017] Um outro aspecto da presente invenção divulga um método (supra), em que a matéria prima renovável é à base de carbono, incluindo mas não se limitando a, milho, cana-de-açúcar, sorgo, beterraba, gramínea, ensilagem, palha, madeira, celulose, esgoto, lixo, resíduos urbanos celulósicos, gás de combustão , gás de síntese, e dióxido de carbono. Num aspecto, a fonte de carbono é selecionada a partir de glicose, frutose, manose, galactose, xilose, arabinose, fruto-oligossacarídeo, galacto-oligossacarídeo, amido, celulose, pectina, xilano, sacarose, maltose, celobiose, turanose, hemicelulose, metil celulose, carboximetil celulose de sódio, succinato, lactato, acetato, etanol, metanol, glicerol, e suas misturas.
[0018] A divulgação contemplata adicionalmente uma composição de polímero produzida pelos métodos aqui (supra) divulgados, em que a composição de polímero inclui, mas não está limita a, poliuretano, poliéster poliol, resina poliéster, resina de revestimento de alquila, resina de fibra de vidro, resina de revestimento em gel, e poliéster termoplástico.
[0019] Outro aspecto da invenção proporciona um microrganismo recombinante para a produção de um derivado de ácido graxo w-hidroxi in vivo quando cultivado em um caldo de fermentação na presença de uma fonte de carbono a partir de uma matéria-prima renovável, o microrganismo compreendendo uma via de engenharia para expressar pelo menos três sequências de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo incluindo uma acila-ACP redutase de EC 1.2.1.42, um álcool desidrogenase de EC 1.1.-.-, e uma w- hidroxilase modificada de EC 1.14.15.3. A w-hidroxilase tem uma atividade enzimática (P450) de monooxigenase de citocromo P450 e de modo eficiente catalisa a w-posição de cadeias de hidrocarboneto in vivo. Em uma modalidade, a w- hidroxilase modificada é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase de EC 1.14.15.3. Numa outra modalidade, a w-hidroxilase modificada é um polipeptídeo fusão híbrida CYP153A-redutase. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é uma proteína de fusão híbrida CYP153A-RedRhF autossuficiente. Em ainda outra modalidade, a w-hidroxilase modificada é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6 e tem uma ou mais mutações, incluindo V141I, V141T, V141Q, V141G, V141M, V141L, R27L, R82D, R178N, A231T, N309R, N407A, V415R, T516V, P666A, P666D e/ou A796V. O derivado de ácido graxo w-hidroxi produzido é um α,w-diol. Em um aspecto, uma cultura de células incluindo os microrganismos aqui (supra) divulgados é também fornecida.
[0020] Ainda, um outro aspecto da invenção proporciona um método de produção de um derivado de ácido graxo w- hidroxi incluindo o fornecimento de um microrganismo recombinante em caldo de fermentação, o microrganismo possuindo uma via de engenharia para expressar pelo menos três sequências de ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo incluindo uma acila-ACP redutase de EC 1.2.1.42, um álcool desidrogenase de EC 1.1.-.-, e uma w- hidroxilase modificada de EC 1.14.15.3. O método inclui ainda a adição de uma carga de alimentação renovável contendo uma fonte de carbono ao caldo de fermentação, e isolando um derivado de ácido graxo w-hidroxi a partir do caldo de fermentação. Em uma modalidade, a w-hidroxilase modificada é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase de EC 1.14.15.3. Em outra modalidade, a w- hidroxilase modificada é um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase. Numa outra modalidade, o polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é uma proteína de fusão híbrida CYP153A-RedRhF autossuficiente. Em ainda outra modalidade, a w-hidroxilase modificada que é uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6 e tem uma ou mais mutações incluindo V141I, V141T, V141Q, V141G, V141M, V141L, R27L, R82D, R178N, A231T, N309R, N407A, V415R, T516V, P666A, P666D e/ou A796V. Aqui, o derivado de ácido graxo w-hidroxi é um α,w-diol. Em um aspecto, a matéria-prima renovável é à base de carbono e inclui milho, cana-de-açúcar, sorgo, beterraba, gramínea, ensilagem, palha, lumber, polpa, esgoto, lixo, resíduos urbanos celulósicos, gás de combustão, gás de síntese e dióxido de carbono. Num outro aspecto, a fonte de carbono é selecionada de glicose, frutose, manose, galactose, xilose, arabinose, fruto-oligosacarídeo, galacto-oligosacarídeo, amido, celulose, pectina, xilana, sacarose, maltose, celobiose, turanose, hemicelulose, metil celulose, carboximetil celulose de sódio, succinato, lactato, acetato, etanol, metanol, glicerol, e suas misturas. Ainda adicionalmente incluída é uma composição de polímero produzida pelo método, em que a composição de polímero inclui, mas não está a limitado a, poliuretano, poliéster poliol, resina de poliéster, resina de revestimento de alquila, resina de fibra de vidro, resina de revestimento em gel, e poliéster termoplástico.
[0021] A divulgação contemplata adicionalmente uma composição fragrância química produzida pelos métodos aqui (supra) descritos, em que a composição fragrância química é uma C9 e C16 macrolídeo saturado ou insaturado. A composição da fragrância química inclui entidades químicas selecionadas de ambrettolide, di-hidro ambrettolide, macrolactona de ácido 15-hidroxi pentadecanóico, e macrolactona de ácido 15-hidroxi pentadecenóico e/ou outros.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0022] A presente invenção é mais bem entendida quando lida em conjunto com as figuras anexas, as quais servem para ilustrar as modalidades preferidas. É entendido, contudo, que a divulgação não é limitada às modalidades específicas descritas nas figuras.
[0023] A Figura 1 descreve as vias para a produção de ácidos w-hidroxi-carboxílicos, ácidos w-oxo-carboxílico, ácidos w-amino carboxílicos e a,w-diácidos. Um derivado de ácido graxo com 12 átomos de carbono é mostrado como um exemplo.
[0024] A Figura 2A mostra as vias para a produção de ácidos w-hidroxi-carboxílicos, ácidos w-amimo carboxílicos e a,w-diácidos, através de intermediários de éster metílico. Um derivado de ácido graxo com 12 átomos de carbono é mostrado como um exemplo.
[0025] Figura 2B mostra uma via para a produção de a,w-diácidos via intermediários de éster dimetílico. Um derivado de ácido graxo com 12 átomos de carbono é mostrado como um exemplo.
[0026] A Figura 3 descreve uma via para a produção de a,w-dióis utilizando uma tioesterase e um ácido carboxílico redutase. Um derivado de ácido graxo com 12 átomos de carbono é mostrado como um exemplo.
[0027] A Figura 4 mostra uma via a produção de α,w- dióis utilizando acil-ACP redutase. Um derivado de ácido graxo com 12 átomos de carbono é mostrado como um exemplo.
[0028] A Figura 5 ilustra uma via que converte um ácido w-amino carboxílico em uma lactama. Um derivado de ácido graxo com 12 átomos de carbono é mostrado como um exemplo.
[0029] A Figura 6 mostra cromatógrafos GC/MS de extratos de cepas recombinantes de E. coli que expressam operons cyp153A que levam à formação de ácido dodecanóico 12-hidroxi quando alimentados com ácido dodecanóico. Um cromatógrafo CG/MS de um extrato de uma cepa de controle (MG 1655 ΔfadD) também é mostrada.
[0030] As figuras 7A a 7C ilustram os espectros de massa de ácido dodecanóico 12-hidroxi derivatizado (pico em 12,297 minutos) (Figura 7A), ácido dodecanóico 12-hidroxi derivatizado padrão autêntico (Figura 7B), e ácido 12- hidroxi-dodecanóico não derivatizado (pico em 11.393 minutos) (Figura 7C). Agente de derivatização era BSTFA + 1% TMCS. Os espectros de massa nas Figuras 7A e 7C foram a partir de extratos da cepa sAS.321 de E. coli.
[0031] As Figuras 8A a 8B ilustram o padrão de fragmentação de íon do ácido decanóico 12-hidróxi derivatizado (éster de trimetilsilila do ácido 12- trimetilsililoxidodecanóico) (Figura 8A) e do ácido dodecanóico 12-hidróxi não derivatizado (Figura 8B).
[0032] A Figura 9 mostra cromatógrafos GC/MS de extratos de cepas recombinantes de E. coli que expressam operons CYP153A que levam à formação de ácido dodecanóico 12-hidroxi quando alimentados com ácido dodecanóico. Cepa sAS.335 expressa um melhor operon CYP153A.
[0033] As Figuras 10A a 10C mostram os cromatógrafos GC/MS de extratos a partir de uma cepa de E. coli que expressa proteínas de fusão CYP153A-RedRhF que conduzem à formação de ácido dodecanóico 12-hidroxi a partir do ácido dodecanóico (Figura 10A), ácido dodecanóico 12-hidroxi e éster metílico do ácido dodecanóico 12-hidroxi (Figura 10B) e 1,12-dodecanodiol a partir de dodecanol (Figura 10C). Extratos da cepa de controle MG 1655 ΔfadD também são mostrados.
[0034] As Figuras 11A a 11B mostram os espectros de massa do derivado 1,12-dodecanodiol (pico em 11,948 minutos) a partir de um extrato da cepa sAS.336 (Figura l1A), e padrão autêntico de 1,12-dodecanodiol derivatizado (Figura llB). Agente de derivatização era BSTFA + 1% TMCS.
[0035] As Figuras 12A a 12B mostram os espectros de massa do éster metílico do ácido 12-hidroxi-dodecanóico a partir de um extrato da cepa sAS.336. Não derivatizado (pico em 11,662 minutos) (Figura 12A) e as amostras derivatizadas são mostradas (pico em 11,107 minutos) (Figura 12B). Agente de derivatização era BSTFA + 1% TMCS.
[0036] As Figuras 13A a 13B ilustram, através do padrão de fragmentação de íon de 1,12-dodecanodiol (Figura 13A) e éster metílico do ácido 12-hidroxidodecanóico (Figura 13B) sem derivatização.
[0037] As figuras 14A a 14C mostram cromatógrafos GC/MS de extratos de cepas recombinantes de E. Coli que expressam proteínas de fusão CYP153A-RedRhF produtoras de ácidos w-OH graxos (Figura 14A), ésteres metílicos de ácidos w-OH graxos (Figura 14b) ou a,w-dióis (Figura 14C) a partir da glicose. Todas as amostras foram derivatizadas com BSTFA + 1% TMCS.
[0038] A Figura 15 demonstra que os ácidos graxos w- hidroxi foram eficientemente segregados a partir das células produtoras.
[0039] A Figura 16 mostra a composição de ácidos graxos w-hidroxi produzidos a partir de duas cepas de E. coli quando cultivadas em glicose.
[0040] A Figura 17 mostra um cromatógrafo CG/MS de um extrato de cepas recombinantes de E. coli que expressam a proteína de fusão CYP153A-RedRhF, álcool oxidase e aldeído desidrogenase produzindo a,w-diácidos. Todas as amostras foram derivatizadas com BSTFA + 1% TMCS.
[0041] As Figuras 18A a 18B mostram os espectros de massa de derivado de ácido 1,14-tetradecanodioico (pico em 13,367 minutos) a partir de um extrato da cepa sEP.690 (Figura 18A), e derivado autêntico do padrão de ácido 1,14- tetradecanodioico (Figura 18B). Agente de derivatização era BSTFA + 1% TMCS.
[0042] A Figura 19A ilustra o padrão de fragmentação de íon de derivados de ácido 1,14-tetradecanodioico. Agente de derivatização era BSTFA + 1% TMCS.
[0043] A Figura 20 mostra o cromatógrafo GC/MS de um extrato a partir de uma cepa recombinante de E. coli que expressa cyp102A1 (F87A) produzindo pequenas quantidades de ácidos graxos subterminalmente hidroxilados (por exemplo, w-1, w-2 e/ou w-3). Um cromatógrafo GC/MS do extrato da cepa de controle AlcV334 também é mostrado. As amostras foram derivatizadas com BSTFA + 1% TMCS.
[0044] As Figuras 21A a 21E mostram os espectros de massa dos picos a partir de 7,195 a 7.510 RT (da Figura 20) identificado como ácido dodecanóico 11-hidróxi (Figura 21A), ácido dodecanóico 10-hidróxi (Figura 21B), ácido dodecanóico 9-hidróxi (Figura 21C), ácido dodecanóico 8- hidróxi (Figura 21D), ácido dodecanóico 7-hidróxi (Figura 21E). Os fragmentos de íons de diagnóstico são representados para cada posição de hidroxilação. As amostras foram derivatizadas com BSTFA + 1% TMCS.
[0045] As Figuras 22A a 22B mostram cromatógrafos GC/MS de extratos de cepas recombinantes de E. coli que expressam proteínas cyp102A7 produtoras de ácidos graxos w- 1, w-2, e w-3 hidroxi (Figura 22A), ou álcoois graxos w-1, w-2, e w-3 hidroxi (Figura 22B) a partir da glicose. Todas as amostras foram derivatizadas com BSTFA + 1% TMCS.
[0046] As Figuras 23A a 23C ilustram os espectros de massa e padrões de fragmentação de íons de derivados de dodecanol 9-hidróxi derivatizado (pico em 9,653 minutos) (Figura 23A), dodecanol 10-hidróxi derivatizado (pico em 9,808 minutos) (Figura 23B), e dodecanol 11-hidroxi derivatizado (pico em 9,905 minutos) (Figura 23C). Agente de derivatização era BSTFA + 1% TMCS. As amostras são provenientes de cepa XL963 de extratos de E. coli.
[0047] Figuras 24A a 24B mostram a quantidade de ácidos graxos subterminalmente hidroxilados (por exemplo, w-1, w-2 e/ou w-3) (Figura 24A) e álcoois graxos subterminalmente hidroxilados (Figura 24B) a partir de glicose produzidos por cepas de E. coli que expressam CYP 102A7.
[0048] A Figura 25 mostra os ácidos graxos w- hidroxilados produzidos por cepa stEP.798 de E. coli.
[0049] A Figura 26 mostra a,a-diácidos produzidos por cepa L1017 de E. coli.
[0050] A Figura 27 mostra os resultados da cultura de microrganismos que expressam variantes de proteínas de fusão híbridas de CYP153A redutase. Como mostrado, as variantes com V141T (SEQ ID: 46) produziu o título de ácido w-hidroxi hexadecenóico mais elevado e de maior conversão do ácido hexadecenóico.
DESCRIÇÃO DETALHADA Visão geral
[0051] O desenvolvimento de um método novo e ecológico para a produção de derivados de ácidos graxos w-hidroxi denota uma melhoria significativa para a indústria. O método permite que estes compostos sejam produzidos de forma eficiente a partir de uma fonte de carbono simples derivada de uma matéria prima renovável. Particularmente, o método proporciona a produção de derivados de ácidos graxos w-hidroxi a partir de materiais renováveis tais como carboidratos a partir de milho, cana, ou biomassa lignocelulósica; ou produtos de resíduos tais como o glicerol, gás de combustão, gás de síntese; ou a reforma de materiais orgânicos tais como a biomassa ou gás natural ou dióxido de carbono.
[0052] Mais especificamente, a presente invenção proporciona novos microrganismos recombinantes que foram modificados para converter matérias-primas renováveis, tais como carboidratos, para derivados de ácidos graxos w- hidroxi específicos incluindo ácidos graxos w-hidroxi; ésteres metílicos de ácido graxo w-hidroxi; ésteres metílicos de ácido graxo w-carboxi; ácidos graxos w-oxo, ácidos graxos w-amino, ésteres metílicos de ácidos graxos w-amino, a,w-diácidos; a,w-diésteres; a,w-dióis e similares. Como tal, as moléculas bifuncionais incluem, mas não estão limitadas a, ácidos graxos w-hidroxi; álcoois α,w-hidroxi graxos; ésteres metílicos de ácidos α,w-hidroxi graxos; α,w-hidroxi aminas; a,w-diácidos; ésteres metílicos de ácido α,w-di-graxo, a,w-dióis e similares. Os microrganismos recombinantes permitem processos de fermentação de baixo custo para a produção destes compostos. A divulgação engloba um metabolismo de ácido graxo microbiano e a conversão de seus intermediários para produtos químicos específicos.
[0053] As vantagens da presente invenção são numerosas. A invenção proporciona um método mais simples de produção, isto é, empregando um processo de fermentação simples, em vez de processos múltiplos químicos e/ou biocatalíticos, que é mais rápido e menos dispendioso e mais amigável ambientalmente porque menos produtos residuais são gerados. O uso de matéria-prima renovável (matérias primas sustentáveis) e/ou resíduos de produtos industriais (por exemplo, glicerol) como fonte de materiais acrescenta outro benefício custo e protege o meio ambiente. A invenção proporciona para a produção seletiva de produtos-alvo específicos, isto é, composições que incluem entidades químicas com comprimentos de cadeia seletivas e químicas. O acesso às diversas funcionalidades químicas permitem novas aplicações de mercado-alvo
Definições
[0054] Tal como aqui utilizados os termos "derivado de ácido graxo ômega-hidroxilado" e "derivado de ácido graxo w-hidroxilado" e "derivado de ácido graxo w-hidróxi" e "derivado de ácido graxo w-hidróxi" e "derivado de ácido w- OH graxo" são aqui utilizados indiferentemente e se referem a uma entidade química que se originou a partir do metabolismo de ácido graxo e que tem pelo menos um grupo OH na posição ômega, ou é derivado de um intermediário que tem pelo menos um grupo OH na posição ômega. Aqui, a "posição ômega" se refere ao átomo de carbono terminal de um derivado de ácido graxo na extremidade oposta em relação ao seu grupo funcional primário. Tais derivados de ácidos graxos w-hidróxi incluem, mas não estão limitados a, ácidos graxos w-hidróxi; ésteres metílicos de ácido graxo w- hidróxi; ésteres metílicos de ácido graxo w-carboxi; ácidos graxos w-oxo; ácidos graxos w-amino; ésteres metílicos do ácido graxo w-amino; bem como, a,w-diácidos; a,w-diésteres; e a,w-dióis. O termo "derivado de ácido graxo w-hidróxi" inclui "derivados de ácidos α,w-bifuncional graxos".
[0055] Uma "composição de derivado de ácido graxo w- hidroxi" tal como aqui referido é produzido por uma célula hospedeira recombinante e, tipicamente, compreende uma mistura de certos tipos de derivados de ácido graxo w- hidróxi com vários comprimentos de cadeia e/ou de saturação e/ou características de ramificação (por exemplo, α,w- diácidos de vários comprimentos de cadeia e/ou saturação e/ou características de ramificação; ou a,w-diésteres de vários comprimentos de cadeia e/ou de saturação e/ou de características de ramificação; ou a,w-dióis de vários comprimentos de cadeia e/ou de saturação e/ou características de ramificação; e semelhantes). Em alguns casos, a composição de derivado de ácido graxo w-hidróxi inclui principalmente um tipo de derivado de ácido w- hidróxi graxo tal como, por exemplo, éster metílico do ácido 1,12-dodecenediol, ou 1,14-tetradecanediol, ou 16- hidróxi hexadecanóico, ou ácido 16-hidroxi-hexadecenóico, ou ácido 15-hidroxi-pentadecanóico, ou ácido 15- hidroxipentadecenóico, ou ácido 18-hidróxi octadecenóico, ou os ésteres metílicos de qualquer um destes derivados de ácido graxo, ou outros. Em ainda outros casos, a composição de derivado de ácido graxo w-hidroxi compreende uma mistura de mais do que um tipo de derivado de ácido graxo w- hidroxi, a fim de proporcionar uma composição especificamente concebida (por exemplo, cerca de 20% de 1,12-dodecenediol e cerca de 80% de 1,16-hexadecanediol na mesma composição iria proporcionar tal exemplo).
[0056] O termo derivado de ácido graxo "subterminalmente" hidroxilado se refere a uma entidade química que possui pelo menos um grupo OH (ou é derivado de um produto intermédio que tem pelo menos um grupo OH) na posição ômega-1, e/ou posição ômega-2, e/ou posição ômega-3 e/ou posição ômega-4, etc. (por exemplo, w-1, w-2 e/ou w-3, etc.). Exemplos de espécies são um ácido w-1, w-2, e/ou w- 3-hidroxi graxo; ou um éster metílico de ácido w-1-hidroxi graxo; ou um ácido w-1, w-2, w-3, w-4, e/ou w-5-hidróxi dodecanóico; etc.
[0057] O termo "número de classificação da enzima (EC)" se refere a um número que indica uma atividade enzimática específica. Números EC classificam enzimas de acordo com a reação que catalisam sob um sistema de nomenclatura de enzima. Números EC especificam reações catalisadas por enzimas. Por exemplo, se enzimas diferentes de organismos diferentes catalisam a mesma reação, em seguida, eles têm o mesmo número EC. Além disso, diferentes dobras de proteínas pode catalisar uma reação idêntica e, portanto, seria atribuído um número EC idêntico (por exemplo, enzimas isofuncionais não homólogas, ou NISE). Números EC são estabelecidos pelo Comité da Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB), uma descrição da qual está disponível no website da nomenclatura da enzima IUBMB na world wide web. Por exemplo, a atividade enzimática (P450) de monooxigenase P450 de citocromo modificado, incluindo a atividade enzimática w-hidroxilase ou u-oxigenase é classificada sob EC 1.14.15.3 (também conhecidos como de cadeia longa de acil-[proteína-carreadora-de-acil] redutase). A funcionalidade de enzimas que se enquadram na família de enzimas P450 é conservada na maioria dos procariontes de uma espécie para outra. Assim, diferentes espécies microbianas podem realizar a mesma atividade enzimática que é classificada sob EC 1.14.15.3. Um exemplo de uma atividade enzimática que é caracterizada por EC 1.14.15.3 é a atividade enzimática de um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase ou uma sua variante tal como aqui (supra) discutido.
[0058] O termo "u-hidroxilase modificada de EC 1.14.15.3" e "u-hidroxilase modificada" são aqui utilizados indiferentemente e se referem a uma atividade enzimática de monooxigenase de citocromo P450 que catalisa eficazmente a posição u de cadeias de hidrocarboneto in vivo (por exemplo, num microrganismo).
[0059] Os termos "variante de proteína de fusão híbrida u-hidroxilase de EC 1.14.15.3" e "variante de proteína de fusão híbrida u-hidroxilase" são aqui utilizados indiferentemente e se referem a um polipeptídeo de fusão híbrida de u-hidroxilase modificada que tem pelo menos uma mutação na sua sequência de aminoácidos de modo a que a expressão da variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase em células hospedeiras recombinantes resulta em um aumento da titulação, rendimento e ou produtividade de ácidos w-OH graxos e/ou composições de derivados de ácido w-OH graxo quando comparado para a expressão de uma proteína de fusão P450 natural em uma célula hospedeira correspondente. Por exemplo, quando uma célula foi transformada com uma variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase é uma célula que expressa a variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase (por exemplo, uma célula recombinante). Numa modalidade, o título e/ou rendimento de um ácido w-OH graxo produzido por uma célula que expressa a variante da proteína de fusão híbrida de w- hidroxilase é pelo menos duas vezes a de uma célula correspondente que expressa uma proteína de fusão P450 natural. Numa outra modalidade, o título de e/ou rendimento de um de ácido w-OH graxo ou seu derivado produzido por uma célula que expressa a variante de proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase é pelo menos cerca de 1 vez, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, ou pelo menos cerca de 10 vezes maior do que a de um célula que expressa a proteína de fusão P450 natural correspondente. Numa modalidade, o título e/ou rendimento de um de ácido w- OH graxo ou seu derivado produzido por uma célula que expressa a variante de proteína de fusão híbrida de w- hidroxilase é pelo menos cerca de 1 por cento, pelo menos cerca de 2 por cento, pelo menos cerca de 3 por cento, pelo menos cerca de 4 por cento, pelo menos cerca de 5 por cento, pelo menos cerca de 6 por cento, pelo menos cerca de 7 por cento, pelo menos cerca de 8 por cento, pelo menos cerca de 9 por cento, ou cerca de 10 por cento maior do que a de uma célula correspondente que expressa a proteína de fusão P450 natural. Numa outra modalidade, o título e/ou rendimento de um ácido w-OH graxo ou um seu derivado, produzido numa célula recombinante, devido à expressão da variante da proteína de fusão híbrida de w-hidroxilase é pelo menos cerca de 20 por cento a pelo menos cerca de 80 por cento maior do que a de uma célula correspondente que expressa a proteína de fusão P450 natural. Em algumas modalidades, o título e/ou rendimento de um ácido w-OH graxo produzido por uma célula é, pelo menos, cerca de 20 por cento, pelo menos, cerca de 25 por cento, pelo menos, cerca de 30 por cento, pelo menos, cerca de 35 por cento, pelo menos, cerca de 40 por cento, pelo menos, cerca de 45 por cento, pelo menos, cerca de 50 por cento, pelo menos, cerca de 55 por cento, pelo menos, cerca de 60 por cento, em menos cerca de 65 por cento, pelo menos, cerca de 70 por cento, pelo menos, cerca de 75 por cento, pelo menos cerca de 80 por cento, pelo menos cerca de 85 por cento, pelo menos cerca de 90 por cento, pelo menos cerca de 95 por cento, pelo menos cerca de 97 por cento, pelo menos cerca de 98 por cento, ou, pelo menos, cerca de 100 por cento maior do que a da célula correspondente que expressa a proteína de fusão P450 natural.
[0060] O termo "polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A-redutase" se refere a uma sequência polipeptídica que tem, pelo menos, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6. O polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A-redutase é autossuficiente e possui atividade enzimática de w- hidroxilase que catalisa a reação de um ácido graxo para um ácido w-OH graxo. Um exemplo de um polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A-redutase é um polipeptídeo de fusão híbrida do tipo-RedRhF cyp153A.
[0061] O termo "número de acesso" ou "número de acesso NCBI" ou "número de acesso GenBank" se refere a um número que indica uma sequência específica de ácido nucleico. Números de acesso de sequência que são discutidos nesta descrição foram obtidos a partir de bases de dados fornecidos pelo NCBI (Centro Nacional de Informação Biotecnológica) mantida pelos Institutos Nacionais de Saúde, EUA, e do UniProt Base de Conhecimento (UniProtKB) e bases de dados Swiss-Prot fornecido pelo Instituto Suíço de Bioinformática (também referido como número de acesso UniProtKB).
[0062] Tal como aqui utilizado, o termo "nucleotídeo" se refere a uma unidade monomérica de um polinucleotídeo que é constituído por uma base heterocíclica, um açúcar, e um ou mais grupos fosfato. As bases que ocorrem naturalmente (guanina, (G), adenina (A), citosina (C), timina (T) e uracila (U)) são tipicamente derivados de purina ou pirimidina, embora deva ser entendido que naturalmente e os análogos de bases que não ocorrem naturalmente, também estão incluídas. O açúcar de ocorrência natural é a pentose (açúcar com cinco carbonos) desoxirribose (que forma DNA) ou ribose (que forma RNA), embora deva ser entendido que análogos de açúcares que ocorrem naturalmente e não naturalmente, também estão incluídos. Os ácidos nucleicos são geralmente ligados através de ligações de fosfato de modo a formar ácidos nucleicos ou polinucleotídeos, embora muitas outras ligações são conhecidas na técnica (por exemplo, fosforotioatos, boranofosfatos, e semelhantes).
[0063] Tal como aqui utilizado, o termo "polinucleotídeo" se refere a um polímero de ribonucleotídeos (RNA) ou desoxirribonucleotídeos (DNA), que pode ser de cadeia simples ou cadeia dupla e que pode conter nucleotídeos alterados ou não naturais. Os termos "polinucleotídeo", "sequência de ácido nucleico" e "sequência de nucleotídeos" são utilizados indistintamente aqui para referir uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, quer RNA, quer DNA. Estes termos se referem à estrutura primária da molécula, e, assim, inclui DNA de cadeia simples e dupla, e RNA de simples e dupla. Os termos incluem, como equivalents, análogos de RNA ou de DNA feitos a partir de análogos de nucleotídeos e polinucleotídeos modificados tais como, embora não limitado a polinucleotídeos metilados e/ou capeados. O polinucleotídeo pode estar em qualquer forma, incluindo, mas não para limitado a, plasmídeo, viral, cromosomal, EST, cDNA, MRNA, e rRNA.
[0064] Como aqui utilizado, os termos "polipeptídeo" e "proteína" são utilizados para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. O termo "polipeptídeo recombinante" se refere a um polipeptídeo que é produzido por técnicas recombinantes, em que geralmente o DNA ou RNA que codifica a proteína expressa é inserido num vetor de expressão adequado que é por sua vez usado para transformar célula hospedeira para produzir o polipeptídeo.
[0065] Tal como aqui utilizado, os termos "homólogo" e "homólogo" se referem a um polinucleotídeo ou um polipeptídeo compreendendo uma sequência que é pelo menos cerca de 50% idêntica ao polinucleotídeo correspondente ou sequência de polipeptídeo. De preferência polinucleotídeos homólogos ou polipeptídeos têm sequências de polinucleotídeos ou sequências de aminoácidos que possuem pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou em cerca de 99% menos de homologia para a correspondente sequência de aminoácidos ou sequência de polinucleotídeo. Tal como aqui utilizado, os termos sequência de "homologia" e sequência de "identidade" são utilizados indistintamente. Um perito na técnica está bem ciente de métodos para determinar homologia entre duas ou mais sequências. Resumidamente, cálculos de "homologia" entre duas sequências podem ser realizados como se segue. As sequências são alinhadas para fins de comparação ótima (por exemplo, as lacunas podem ser introduzidas em uma ou ambas de uma primeira e uma segunda sequência de aminoácidos ou sequência de ácido nucleico para alinhamento ótimo e sequências não homólogas podem ser ignoradas para efeitos de comparação). Em uma modalidade preferida, o comprimento de uma primeira sequência que é alinhada para fins de comparação é pelo menos cerca de 30%, de preferência pelo menos cerca de 40%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 50%, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 60%, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou cerca de 100% do comprimento de uma segunda sequência. Os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos nas posições de aminoácidos ou posições de nucleotídeo correspondentes da primeira e segunda sequências são então comparadas. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou de nucleotídeo como a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição. A percentagem de homologia entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências, tendo em conta o número de lacunas e o comprimento de cada lacuna, que devam ser introduzidas para alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação de sequências e determinação da percentagem de homologia entre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático, tais como os programas BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 (3):403-410). A percentagem de homologia entre duas sequências de aminoácidos também pode ser determinada utilizando o algorítmo de Needleman e Wunsch que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG, utilizando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso da lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso do comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 (Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453). A percentagem de homologia entre duas sequências de nucleotídeos também pode ser determinada utilizando o programa GAP no pacote de software GCG, utilizando uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso de lacuna de 40, 50, 60, 70, ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3 , 4, 5, ou 6. Um perito na técnica pode realizar cálculos de homologia inicial e ajustar assim os parâmetros do algoritmo. Um conjunto preferido de parâmetros (e aquele que deve ser utilizado se um praticante é incerto sobre quais os parâmetros deveria ser aplicado para determinar se uma molécula está dentro de uma limitação de homologia das reivindicações) é uma matriz de pontuação Blossum 62 com uma penalidade de lacuna de 12, uma lacuna se estende a penalidade de 4, e uma penalidade de lacuna de quadro de enquadramento de 5. Métodos adicionais de sequência de alinhamento são conhecidos nas técnicas de biotecnologia (ver, por exemplo, Rosenberg (2005) BMC Bioinfarmatics 6: 278); Altschul et al. (2005) FEBS J. 272 (20:5101-5109).
[0066] Um polipeptídeo "endógeno" se refere a um polipeptídeo codificado pelo genoma da célula hospedeira (por exemplo, célula microbiana parental) a partir da qual a célula recombinante é manipulada ou derivada.
[0067] Um polipeptídeo "exógeno" se refere a um polipeptídeo que não é codificado pelo genoma da célula microbiana parental. Uma variante (isto é, mutante) de polipeptídeo é um exemplo de um polipeptídeo exógeno.
[0068] O termo "heterólogo" em geral significa derivado de uma espécie diferente, ou derivado de um organismo diferente. Tal como aqui utilizado se refere a uma sequência nucleotídica ou uma sequência de polipeptídeo que não está naturalmente presente em um organismo particular. A expressão heteróloga significa que uma proteína ou polipeptídeo é experimentalmente adicionada a uma célula que normalmente não expressa essa proteína. Como tal, heterólogo se refere ao fato que uma proteína transferida foi inicialmente derivada a partir de um tipo de célula diferente ou de uma espécie diferente, em seguida, o destinatário. Por exemplo, uma sequência polinucleotídica endógena para uma célula de planta pode ser introduzida numa célula hospedeira bacteriana por meio de métodos recombinantes, e o polinucleotídeo da planta é, em seguida, um polinucleotídeo heterólogo numa célula hospedeira bacteriana recombinante.
[0069] Tal como aqui utilizado, o termo "fragmento" de um polipeptídeo se refere a uma porção menor de um polipeptídeo de comprimento completo ou proteína que varia em tamanho de quatro resíduos de aminoácidos com a sequência de aminoácidos inteira menos um resíduo de aminoácido. Em certas modalidades da presente descrição, um fragmento se refere a sequência de aminoácidos inteira de um domínio de um polipeptídeo ou proteína (por exemplo, um domínio de ligação ao substrato ou um domínio catalítico).
[0070] Tal como aqui utilizado, o termo "mutagênese" se refere a um processo pelo qual a informação genética de um organismo é alterada de uma forma estável. A mutagênese de uma proteína que codifica sequência de ácido nucleico produz uma proteína mutante. Mutagênese se refere também às mudanças nas sequências de ácidos nucleicos que não codificam, que resultaram em atividade de proteína modificada.
[0071] Tal como aqui utilizado, o termo "gene" se refere a sequências de ácidos nucleicos que codificam qualquer um produto de RNA ou de um produto de proteína, bem como sequências de ácido nucleico operativamente ligadas que afetam a expressão do RNA ou proteína (por exemplo, tais sequências incluem mas não estão limitadas ao promotor ou sequências potenciadoras) ou sequências de ácido nucleico operativamente ligadas que codificam sequências que afetam a expressão do RNA ou proteína (por exemplo, tais sequências incluem, mas não estão limitadas a sítios de ligação de ribossomo ou sequências de controle da tradução).
[0072] As sequências de controle de expressão são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, promotores, potenciadores, sinais de poliadenilação, terminadores de transcrição, locais de entrada interno do ribossomo (IRES), e semelhantes, que proporcionam a expressão da sequência de polinucleotídeo numa célula hospedeira. Sequências de controle de expressão interagem especificamente com proteínas celulares envolvidas na transcrição (Maniatis et al. (1987) Science 236:1237 -1245). Sequências de controle de expressão exemplares estão descritas em, por exemplo, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).
[0073] Nos métodos da divulgação, uma sequência de controle de expressão está operacionalmente ligada a uma sequência polinucleotidica. Por "operativamente ligada" significa que uma sequência de polinucleotídeo e uma sequência (s) de controle de expressão estão ligadas de tal maneira a permitir a expressão do gene quando as moléculas apropriadas (por exemplo, proteínas ativadoras da transcrição) são ligadas à sequência (s) de controle da expressão. Promotores operativamente ligados estão localizados a montante da sequência polinucleotídica selecionada em termos da direção de transcrição e tradução. Potenciadores operativamente ligados podem ser localizados a montante, dentro ou a jusante do polinucleotídeo selecionado.
[0074] Tal como aqui utilizado, o termo "vetor" se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico, isto é, uma sequência de polinucleotídeo, ao qual foi ligado. Um tipo de vetor útil é um epissoma (isto é, um ácido nucleico capaz de replicação extracromossômica). Os vetores úteis são aqueles capazes de replicação e/ou expressão de ácidos nucleicos aos quais estão ligados. Os vetores capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estão operacionalmente ligados são aqui referidos como "vetores de expressão". Em geral, os vetores de expressão com utilidade em técnicas de DNA recombinante estão muitas vezes na forma de "plasmídeos", que se referem genericamente a loops de DNA de cadeia dupla circular, na sua forma de vetor, não estão ligados ao cromossoma. Os termos "plasmídeo" e "vetor" são utilizados alternadamente aqui, na medida em que um plasmídeo é a forma mais comumente utilizada de vetor. No entanto, também estão incluídos tais outras formas de vetores de expressão que servem funções equivalentes e que se tornam conhecidos na técnica subsequentemente aqui. Em algumas modalidades, um vetor recombinante compreende ainda um promotor operacionalmente ligado à sequência de polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o promotor é de modo de desenvolvimento regulado, promotor específico de células, um induzível, um constitutivo, uma organela específica, um tecido específico. O vetor recombinante compreende tipicamente, pelo menos, uma sequência incluindo (a) uma sequência de controle de expressão operativamente acoplada com a sequência polinucleotídica; (b) um marcador de seleção acoplado operativamente à sequência de polinucleotídeo; (c) uma sequência de marcador operativamente acoplada à sequência de polinucleotídeo; (d) uma porção de purificação operacionalmente acoplada à sequência polinucleotídica; (e) uma sequência de secreção operativamente acoplada à sequência de polinucleotídeo; e (f) uma sequência de direcionamento operativamente acoplada à sequência de polinucleotídeo. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos é estavelmente incorporada no DNA genômico da célula hospedeira, e a expressão da sequência de nucleotídeos está sob o controle de uma região promotora regulável. Os vetores de expressão aqui descritos incluem uma sequência de polinucleotídeos aqui descrita numa forma adequada para a expressão da sequência de polinucleotídeo em uma célula hospedeira. Irá ser apreciado por aqueles peritos na técnica que o desenho do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão do polipeptídeo desejado, etc. Os vetores de expressão aqui descritos podem ser introduzidos nas células hospedeiras para a produção de polipeptídeos, incluindo os polipeptídeos de fusão, codificados pelas sequências de polinucleotídeos como aqui descrito. Expressão de genes que codificam para polipeptídeos em procariotas, por exemplo, E. coli, é mais frequentemente realizada com vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis dirigindo a expressão de qualquer um polipeptídeos de fusão ou de não fusão. Vetores de fusão adicionam um número de aminoácidos de um polipeptídeo codificado no mesmo, geralmente, para os grupos amino- ou carboxi-terminal do polipeptídeo recombinante. Tais vetores de fusão servem tipicamente um ou mais dos seguintes três finalidades: (1) aumentar a expressão do polipeptídeo recombinante; (2) aumentar a solubilidade do polipeptídeo recombinante; e (3) ajudar na purificação do polipeptídeo recombinante atuando como um ligante na purificação por afinidade. Muitas vezes, em vetores de expressão de fusão, um local de clivagem proteolítica é introduzido na junção da porção de fusão e o polipeptídeo recombinante. Isto permite a separação do polipeptídeo recombinante a partir da porção de fusão após a purificação do polipeptídeo de fusão. Em certas modalidades, uma sequência polinucleotídica da divulgação está operativamente ligada a um promotor derivado de bacteriófago T5. Em certas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de levedura, e o vetor de expressão é um vetor de expressão de levedura. Exemplos de vetores para expressão na levedura S. cerevisiae incluem pYepSecl (Baldari et al. (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan et al. (1982) Cell 30:933- 943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corp., San Diego, CA), e picZ (Invitrogen Corp., San Diego, CA). Em outras modalidades, a célula hospedeira é uma célula de inseto, e o vetor de expressão é um vetor de expressão de baculovírus. Vetores de baculovírus disponíveis para expressão de proteínas em células de inseto em cultura (por exemplo, células Sf 9) incluem, por exemplo, a série pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165) e a série pVL (Lucklow et al. (1989) Virology 170:31-39). Em ainda uma outra modalidade, as sequências de polinucleotídeos aqui descritas podem ser expressas em células de mamífero utilizando um vetor de expressão de mamífero. Outros sistemas de expressão adequados para células procarióticas e eucarióticas são bem conhecidos na técnica; ver, por exemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989).
[0075] Tal como aqui usado "acil-CoA" se refere a um tioéster de acila formado entre o carbono da carbonila da cadeia de alquila e o grupo sulfidrila da porção 4'- fosfopantetionila da coenzima A (CoA), o qual possui a fórmula R-C(O)S-CoA, em que R é qualquer grupo alquila tendo pelo menos 4 átomos de carbono.
[0076] Tal como aqui utilizado "acila-ACP" se refere a um tioéster de acila formado entre o carbono da carbonila da cadeia alquila e do grupo sulfidrila da porção fosfopanteteinila de uma proteína carreadora de acila (ACP). A porção fosfopanteteinila é pós-tradução ligada a um resíduo de serina conservada na ACP pela ação da sintase de proteína carreadora de holo-acila (ACPS), uma fosfopanteteinila transferase. Em algumas modalidades uma acila-ACP é um intermediário na síntese de acila-ACP totalmente saturada. Em outras modalidades uma acil-ACP é um intermediário na síntese de acila-ACPs insaturada. Em algumas modalidades, a cadeia de carbono terá cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou 26 carbonos. Cada um das acila-ACPs são substratos para enzimas que as converte em derivados de ácidos graxos.
[0077] Tal como aqui utilizado, o termo "via biossintética do ácido graxo" significa uma via biossintética que produz ácidos graxos e derivados destes incluindo os derivados de ácidos graxos w-hidroxilados. A via biossintética de ácidos graxos pode incluir enzimas adicionais ou polipeptídeos com atividades enzimáticas além daquelas aqui discutidas para a produção de derivados de ácidos graxos tais como os derivados de ácidos graxos w- hidroxilados possuindo as características desejadas.
[0078] Tal como aqui utilizado, o termo "clone" se refere tipicamente a uma célula ou grupo de células descendentes e essencialmente geneticamente idênticas a um único antepassado comum, por exemplo, as bactérias de uma colônia bacteriana clonada que surgiu a partir de uma única célula bacteriana.
[0079] Tal como aqui utilizado, o termo "cultura" típica se refere a um meio líquido que compreende as células viáveis. Numa modalidade, a cultura compreende uma reprodução de células num meio de cultura predeterminado sob condições controladas, por exemplo, uma cultura de células hospedeiras recombinantes cultivadas em meio líquido compreendendo uma fonte de carbono selecionada e nitrogênio. "A cultura" ou "cultivo" se refere a crescer uma população de células hospedeiras recombinantes sob condições adequadas num meio líquido ou sólido. Em modalidades específicas, a cultura se refere a bioconversão fermentativa de um substrato para um produto final. Meios de cultura são bem conhecidos e componentes individuais de tais meios de cultura estão disponíveis a partir de fontes comerciais, por exemplo, sob as marcas registadas Difco™ e BBL™. Num exemplo não limitativo, o meio nutriente aquoso é um "meio rico" compreendendo fontes complexas de nitrogênio, sais, e carbono, tal como o meio YP, que compreende 10 g/L de peptona e 10 g/L de extrato de levedura de tal um meio. A célula hospedeira de uma cultura pode ser adicionalmente manipulada para assimilar carbono eficientemente e utilizar materiais celulósicos como fontes de carbono de acordo com métodos descritos nas Patentes US 5.000.000; 5.028.539; 5.424.202; 5.482.846; 5.602.030; WO 2010127318. Além disso, em algumas modalidades a célula hospedeira é manipulada para expressar uma invertase de modo que a sacarose pode ser usada como uma fonte de carbono.
[0080] Tal como aqui utilizado, o termo "sob condições eficazes para expressar uma sequência de polinucleotídeo geneticamente modificado" significa qualquer condição que permite uma célula hospedeira produzir um derivado de ácido graxo w-hidroxi desejado. As condições adequadas incluem, por exemplo, as condições de fermentação.
[0081] O termo "microrganismo recombinante" se refere a uma célula hospedeira que tenha sido geneticamente modificada de tal modo que certas atividades enzimáticas na célula hospedeira foram alteradas, adicionadas e/ou apagadas em relação à célula parental ou célula hospedeira nativa. Uma célula hospedeira geneticamente modificada é um exemplo de um microrganismo recombinante. Como tal, um "nível modificado ou alterado de atividade de uma proteína", por exemplo uma enzima, em uma célula hospedeira recombinante se refere a uma diferença em uma ou mais características na atividade determinada em relação à célula hospedeira parental ou nativa na qual essa mesma modificação está ausente. Tipicamente, as diferenças de atividade são determinadas entre uma célula hospedeira recombinante, que possui atividade modificada, e a célula hospedeira de tipo selvagem correspondente (por exemplo, comparação de uma cultura de uma célula hospedeira recombinante em relação à célula hospedeira de tipo selvagem correspondente), não tendo essa atividade modificada. Atividades modificadas podem ser resultado de, por exemplo, quantidades modificadas da proteína expressa por uma célula hospedeira recombinante (por exemplo, como o resultado de um aumento ou diminuição do número de cópias de sequências de DNA que codifica a proteína, aumento ou diminuição do número de transcritos de mRNA que codifica a proteína, e/ou quantidades aumentadas ou diminuídas da tradução da proteína da proteína a partir de mRNA); alterações na estrutura da proteína (por exemplo, alterações para a estrutura primária, tais como, alterações à sequência de codificação da proteína que resultam em alterações na especificidade para o substrato, alterações nos parâmetros cinéticos observados); e alterações na estabilidade da proteína (por exemplo, aumento ou diminuição da degradação da proteína). Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um mutante ou uma variante de qualquer um dos polipeptídeos descritos aqui. Em certos casos, as sequências de codificação para os polipeptídeos aqui descritos são códon optimizados para a expressão numa célula hospedeira particular. Por exemplo, para a expressão em E. coli, um ou mais códons podem ser otimizados (tal como descrito em, por exemplo, Grosjean et al. (1982) Gene. 18: 199-209).
[0082] A expressão "sequências reguladoras" como aqui utilizada se refere tipicamente a uma sequência de bases de DNA, operativamente ligada a sequências de DNA que codifica uma proteína que finalmente controla a expressão da proteína. Exemplos de sequências reguladoras incluem, mas não se limitam a, sequências de RNA promotoras, sequências de ligação do fator de transcrição, sequências de terminação da transcrição, moduladores de transcrição (tais como elementos potenciadores), sequências de nucleotídeos que afetam a estabilidade de RNA, e sequências reguladoras translacionais (tais como, sítios de ligação de ribossomos (por exemplo, sequências de Shine-Dalgarno em procariotas ou sequências Kozak em eucariotas), códons de iniciação, códons de terminação).
[0083] Os termos "nível alterado de expressão" e "nível modificado de expressão" são utilizados alternadamente e significam que um polinucleotídeo, polipeptídeo, metabólito, ou um produto (tal como um derivado de ácido graxo u-hidroxi) está presente numa concentração diferente em uma célula hospedeira modificada, em comparação com a sua concentração em uma célula de tipo selvagem correspondente, nas mesmas condições.
[0084] Tal como aqui utilizado, o termo "título" se refere à quantidade de derivado de ácido u-graxo produzido por unidade de volume de cultura de células hospedeiras. O título pode se referir a um derivado de ácido u-graxo particular ou uma combinação de derivados de ácidos u- graxos produzidos por uma determinada cultura de células hospedeiras recombinantes.
[0085] Tal como aqui utilizado, o "rendimento de derivado de ácido graxo w-hidroxi produzido por uma célula hospedeira" se refere a eficiência pela qual uma fonte de entrada de carbono é convertida em um produto (por exemplo, ácido graxo w-hidroxilado, a,w-diácido, etc.) em uma célula hospedeira. O rendimento pode se referir a um derivado de ácido graxo w-hidroxi em particular ou uma combinação de derivados de ácidos graxos w-hidroxi produzidos por uma determinada cultura de células hospedeiras recombinantes. Os derivados de ácidos graxos w-hidroxi incluem, mas não estão limitados a, ácidos graxos w-hidroxi incluindo os ácidos graxos w-hidroxi livres; ésteres metílicos de ácidos graxos w-hidroxi; ácidos graxos w-oxo; ésteres metílicos de ácidos graxos w-oxo; compostos bifuncionais tais como α,w- diácidos; a,w-dióis; a,w-diésteres; ésteres metílicos de ácidos graxos w-carboxi; ácidos graxos w-amino; e amino ésteres metílicos de ácido graxo w-aminos.
[0086] Tal como aqui utilizado, o termo "produtividade" se refere à quantidade de um derivado de ácido graxo w-hidroxi ou derivados produzidos por unidade de volume de cultura de células hospedeiras por unidade de tempo. A produtividade pode se referir a um derivado de ácido graxo w-hidroxi em particular ou uma combinação de derivados de ácidos graxos produzidos por uma determinada cultura de células hospedeiras recombinantes.
[0087] Tal como aqui utilizado, o termo "taxa de utilização da glicose" significa a quantidade de glicose usada pela cultura por unidade de tempo, expressa como gramas/litro/hora (g/L/h).
[0088] Tal como aqui utilizado, o termo "fonte de carbono" se refere a um substrato ou composto adequado para ser usado como uma fonte de carbono para o crescimento de célula eucariótica simples ou procariótica. As fontes de carbono podem ser de várias formas, incluindo, mas não se limitando a polímeros, carboidratos, ácidos, álcoois, aldeídos, cetonas, aminoácidos, peptídeos e gases (por exemplo, CO e CO2). Exemplos de fontes de carbono incluem, mas não estão limitados a, monossacarídeos, tais como glicose, frutose, manose, galactose, xilose, e arabinose; oligossacarídeos, tais como fruto-oligossacarídeo e galacto-oligossacarídeo; polissacarídeos, tais como amido, celulose, pectina e xilano; dissacarídeos, tais como sacarose, maltose, celobiose, e turanose; material celulósico e variantes tais como hemicelulose metil celulose, e de carboximetilcelulose de sódio; succinato, lactato e acetato; álcoois, tais como etanol, metanol, e glicerol, ou suas misturas. A fonte de carbono também pode ser um produto da fotossíntese, tal como glicose. Em certas modalidades, a fonte de carbono é a biomassa. Em outras modalidades, a fonte de carbono é a glicose. Em outras modalidades a fonte de carbono é sacarose.
[0089] O termo "fonte de carbono a partir de uma matéria-prima renovável" quando utilizado isoladamente ou em referência a uma fonte de alimentação inclui qualquer material biológico (incluindo matérias-primas renováveis e/ou biomassa e/ou produtos de resíduos) a partir do qual o carbono é derivado exceto oleoquímicos (ou seja, óleos refinados de plantas e animais, tais como ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos, TAGs, ácidos hidroxi graxos, e semelhantes) e petroquímicos (ou seja, produtos químicos derivados do petróleo, tais como alcanos, alquenos, e semelhantes). Assim, o termo "fonte de carbono a partir de uma matéria-prima renovável", tal como aqui utilizado, exclui carbono derivado de oleoquímicos e petroquímica. Em algumas modalidades, a fonte de carbono inclui açúcares ou carboidratos (por exemplo, monossacarídeos, dissacarídeos ou polissacarídeos). Em algumas modalidades, a fonte de carbono é a glicose e/ou sacarose. Em outras modalidades, a fonte de carbono é obtida a partir de uma matéria-prima renovável, tais como carboidratos a partir de milho, cana- de-açúcar, ou biomassa lignocelulósica; ou resíduos de produtos como o glicerol, gás combustível, gás de síntese; ou a reforma de materiais orgânicos tal como a biomassa ou gás natural; ou é o dióxido de carbono que é fixado fotossinteticamente. Em outras modalidades, uma biomassa é transformada em uma fonte de carbono, o qual é adequada para a bioconversão. Em ainda outras modalidades, a biomassa não exige processamento adicional em uma fonte de carbono, mas pode ser utilizada diretamente como fonte de carbono. Uma fonte exemplar de tal biomassa é a matéria da planta ou vegetação, tais como gramínea. Outra fonte de carbono exemplar inclui produtos metabólicos de rejeito, tal como a matéria animal (por exemplo, estrume de vaca). Outras fontes de carbono exemplares incluem algas e outras plantas marinhas. Outra fonte de carbono (incluindo biomassa) inclui os resíduos provenientes da indústria, agricultura, silvicultura e doméstico, incluindo, mas não limitado a, resíduos de fermentação, biomassa de fermentação, glicerol/glicerina, ensilagem, palha, madeira serrada, esgoto, lixo, resíduos sólidos chave, sobras residuais urbanas celulósicas, e dos produtos alimentícios.
[0090] Tal como aqui utilizado, o termo "isolado", no que diz respeito aos produtos (tais como os derivados de ácidos graxos w-hidroxi) se refere aos produtos que são separados a partir de componentes celulares, meios de cultura de células, ou de precursores químicos ou sintéticos. Os derivados de ácidos graxos w-hidroxi e composições de derivado de ácido graxo w-hidroxi produzidos pelos métodos aqui descritos podem ser relativamente imiscíveis no caldo de fermentação, assim como no citoplasma. Portanto, os derivados de ácidos graxos w- hidroxi e composições de derivado de ácido graxo w-hidroxi pode coletar em uma fase orgânica, quer intracelularmente ou extracelularmente. Em um método preferido, os derivados de ácidos graxos w-hidroxi e composições de derivado de ácido graxo w-hidroxi coletam extracelularmente.
[0091] Tal como aqui utilizado, os termos "purificar", "purificado" ou "purificação" significa a remoção ou isolamento de uma molécula a partir do seu ambiente, por exemplo, isolamento ou separação. Moléculas "substancialmente purificadas" são, pelo menos, cerca de 60% livres (por exemplo, pelo menos cerca de 70% livres, pelo menos cerca de 75% livres, pelo menos cerca de 85% livres, pelo menos cerca de 90% livres, pelo menos cerca de 95% livres, pelo menos cerca de 97% livres, pelo menos cerca de 99% livres) a partir de outros componentes com os quais estão associadas. Tal como aqui utilizado, estes termos também se referem à remoção de contaminantes a partir de uma amostra. Por exemplo, a remoção de contaminantes pode resultar num aumento da percentagem de derivados de ácidos graxos na amostra. Por exemplo, quando um derivado de ácido graxo w-hidroxi é produzido em uma célula hospedeira recombinante, o derivado de ácido graxo w-hidroxi pode ser purificado, por remoção de proteínas da célula hospedeira. Após a purificação, a percentagem de derivado de ácido graxo w-hidroxi na amostra é aumentada. Os termos "purificar", "purificado" e "purificação" são termos relativos que não requerem uma pureza absoluta. Assim, por exemplo, quando um derivado de ácido graxo w- hidroxi é produzido em células hospedeiras recombinantes, um derivado de ácido graxo w-hidroxi purificado é um derivado de ácido graxo w-hidroxi que está substancialmente separado de outros componentes celulares (por exemplo, ácidos nucleicos, polipeptídeos, lipídeos, carboidratos, ou outros hidrocarbonetos).
[0092] O termo "produção de um derivado de ácido graxo w-hidroxi in vivo", como usado para o propósito do relatório descritivo e reivindicações, significa que a produção de um derivado de ácido graxo w-hidroxi em células hospedeiras viáveis e/ou geneticamente modificadas a partir de uma matéria-prima renovável tal como um carboidrato ou outros, em que a matéria prima renovável é adicionada a um caldo de fermentação como fonte de carbono de modo a que as células hospedeiras podem assumir e metabolizar a fonte de carbono durante a fermentação. Isto difere dos métodos em que os derivados de ácidos graxos w-hidroxi são produzidos in vitro, em que as enzimas purificadas ou lisadas celulares estão sendo utilizados e o substrato direto para a conversão enzimática, por exemplo, um ácido graxo ou um derivado de ácido graxo, está sendo adicionado à enzima purificada ou as soluções de lisados celulares. Isto também difere dos métodos em que os derivados de ácidos graxos w- hidroxi são produzidos em biotransformações, em que as células em repouso estão sendo utilizadas e o substrato direto para a conversão enzimática, por exemplo, um ácido graxo ou derivado de ácido graxo, está sendo adicionado exogenamente para as células em repouso.
Via de modificação e atividades enzimáticas
[0093] A síntese de ácidos graxos é um dos sistemas mais conservados do mecanismo da biossintética bacteriana. O complexo multienzimático do ácido graxo sintase (FAS) está presente em todas as bactérias e eucariotas. A maioria dos genes relacionados com o FAS são indispensáveis para o crescimento e sobrevivência celular. FAS eucariótica e bacteriana conduzem essencialmente o mesmo tipo de transformação bioquímica. Em eucariotas, a FAS é referida como o FAS I e a maioria dos seus domínios catalíticos são codificados por uma cadeia polipeptídica (não dissociáveis). Em procariotas, tais como bactérias, FAS é referido como FASII e suas enzimas individuais e proteínas carreadoras são codificadas por genes separados que codificam proteínas (discretas) dissociáveis. Como tal, FASII é um sistema complexo com variações significativas e peculiaridades distintas.
[0094] A proteína carreadora de acila (ACP), juntamente com as enzimas em uma via de FAS controla o comprimento, o grau de saturação e de ramificação dos ácidos graxos produzidos em um organismo nativo. As etapas nesta via são catalisadas por enzimas da biossíntese de ácidos graxos (FAB) e acetil-CoA carboxilase (ACC) de famílias de genes. Por exemplo, as enzimas que podem ser incluídas em uma via FAS incluem AccABCD, FabD, FabH, FabG, FabA, FabZ, Fabl, FabK, FabL, FabM, FabB, e FabF. Dependendo do produto desejado, um ou mais destes genes podem ser atenuados ou superexpressos. Como tal, procariotas foram modificadas para aumentar a produção de derivados de ácidos graxos a partir de matérias-primas renováveis, como a glicose ou outras fontes de carbono. Aqui o importante objetivo é o de aumentar a atividade de enzimas-chave de controle que regulam a produção de derivados de ácidos graxos, a fim de converter a cepa bacteriana em uma fábrica microbiana para produção dos derivados de ácido graxo, incluindo ésteres metílicos dos ácidos graxos (FAMEs), ésteres etílicos de ácido graxo (FAEEs) e álcoois graxos (FALC) (ver, por exemplo, Patente US N° 8.283.143, aqui incorporada por referência).
[0095] A presente descrição identifica polinucleotídeos que codificam polipeptídeos da função enzimática, a fim de modificar vias enzimáticas para a produção de compostos desejáveis, tais como os derivados de ácidos graxos w-hidroxi. Estes polipeptídeos, que são aqui identificados pelos números de acesso das enzimas (números EC), são úteis para vias de ácidos graxos modificados que levam à produção de moléculas bifuncionais, tais como os derivados de ácidos graxos w-hidroxi. Figuras 1-4 mostram vias que foram modificadas para produzir estes compostos. A Figura 5 ilustra uma via que leva a lactamas e polímeros tais como o nylon.
[0096] Numa modalidade, as vias estão representadas nas Figuras 1 a 4 que usam uma matéria-prima renovável, tais como a glicose para a produção de derivados de ácidos graxos w-hidroxi. A glicose é convertida a um acila-ACP pelo organismo nativo (ver etapa 1 nas Figuras 1 a 4). Os polinucleotídeos que codificam para polipeptídeos com atividade de enzima de degradação de ácido graxo podem ser opcionalmente atenuados de acordo com o produto desejado (ver Exemplos, infra). Exemplos não limitativos de tais polipeptídeos são acil-CoA sintetase (FadD) e acil-CoA desidrogenase (FadE). A Tabela 1 fornece uma lista completa de atividade enzimática (infra) dentro da via metabólica, incluindo várias enzimas de degradação de ácidos graxos que podem ser opcionalmente atenuadas de acordo com métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Patente US N ° 8.283.143, supra).
[0097] Por exemplo, FadR (ver Tabela 1, infra) é um fator regulador chave envolvido na degradação de ácidos graxos e vias biossintéticas de ácidos graxos (Cronan et al., Mol. Microbiol., 29 (4):937-943 (1998)). A enzima de E. coli FadD (ver Tabela 1, infra) e a proteína de transporte de ácidos graxos FadL são componentes de um sistema de captação de ácido graxo. FadL medeia o transporte de ácidos graxos na célula bacteriana, e FadD medeia a formação de ésteres acil-CoA. Quando nenhuma outra fonte de carbono é disponível, ácidos graxos exógenos são ocupados por bactérias e convertidos em ésteres de acil- CoA, que se podem se ligar ao fator de transcrição FadR e deprimem a expressão dos genes fad que codificam as proteínas responsáveis para o transporte de ácidos graxos (Fadl), ativação (FadD), e e-oxidação (FadA, FadB, e FadE). Quando fontes alternativas de carbono são disponíveis, bactérias sintetizam ácidos graxos como acils-ACPs, que são utilizadas para a síntese de fosfolipídeo, mas não são substratos para e-oxidação. Assim, acil-CoA e acila-ACP são ambos fontes independentes de ácidos graxos que podem resultar em produtos finais diferentes (Cavig1ia et al., J. Biol. Chem., 279 (12):1163-1169 (2004)). Tabela 1: Atividades enzimáticas
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[0098] As Figuras 1 e 2 mostram vias onde uma acil-ACP pode ser convertida para uma a,w-diácido por meio de duas vias semelhantes, empregando um ácido graxo livre C12 (FFA) como um precursor intermediário (ver Figura 1) ou éster metílico de ácido graxo C12 (FAME) como um intermediário (ver Figura 2A e 2B), respectivamente.
[0099] Numa modalidade, A Figura 1 mostra a produção de vários compostos químicos, incluindo ácidos graxos w- hidroxi, ácidos graxos w-oxo, a,w-diácidos, e ácidos graxos w-amino. Na etapa 2 da Figura 1, uma tioesterase é empregada para converter uma acil-ACP para uma FFA. Em certas modalidades, o gene que codifica uma tioesterase é tesA, ‘tesA, tesB, fatB1, fatB2, fatB3, fatA1, ou fatA. (Ver também Tabela 1 que mostra polipeptídeos que têm a atividade enzimática de uma tiesterase que pode ser utilizada para catalisar esta etapa, supra). Na etapa 3, uma w-hidroxilase também referida como w-oxigenase é usada para gerar os ácidos graxos w-hidroxi . Como pode ser visto na Figura 1, a posição ômega do ácido graxo é hidroxi.
Polipeptídeos de fusão híbrida de CYP153A-redutase expressos em células hospedeiras recombinantes
[00100] Exemplos de w-hidroxilases/w-oxigenases adequadas (EC 1.14.15.3) e seus parceiros redox são listados nas Tabelas 2A e 2B (supra). Estes são certos diferro não heme oxigenases (por exemplo, AlkB de Pseudomonas putida GPOL) ou certos heme tipo P450 oxigenases (por exemplo, cyp153A de Marinobacter aquaeolei) também conhecido como citocromo P450. Citocromos P450 são enzimas ubiquamente distribuídas, que possuem alta complexidade e mostram um amplo campo de atividade. Eles são proteínas codificadas por uma superfamília de genes que convertem uma ampla variedade de substratos e catalisam uma variedade de reações químicas. Cyp153A é uma subfamília do citocromo bacteriano P450 solúvel que hidroxila cadeias de hidrocarbonetos com uma elevada seletividade para a posição w (van Beilen et al. (2006) Appl Environ Microbiol 72:5965). Os membros da família cyp153A foram demonstradas in vitro para hidroxilar seletivamente o posição-w de alcanos, ácidos graxos ou álcoois graxos, por exemplo a partir de cyp153A6 de Mycobacterium sp. HXN-1500 (Funhoff et al. (2006) J. Bacteriol 188:5220-5227), cyp153A16a partir de Mycobacterium marinum e cyp153A a partir de Polaromonas sp. JS666 (Scheps et al. (2011) Org. Biomol. Chem. 9:67276733), bem como cyp153A de Marinobacter aquaeoli (Honda- Malca et al. (2012) Chem. Commun. 48:5115-5117).
[00101] Tal como acontece com todos os citocromos P450, Cyp153A w-hidroxilases requerem elétrons para a sua atividade catalítica, que são fornecidas através de proteínas redox específicas, tais como ferredoxina e ferredoxina redutase. Estas são proteínas discretas que interagem com cyp153A. Uma híbrida (quimérica) oxigenase autossuficiente cyp153A (isto é, uma oxigenase que não requer ferredoxina discreta e proteínas de ferredoxina redutase para a atividade) foi anteriormente criada através da fusão de cyp153A de Alcanivorax borkumensis SK2 (Kubota et al. (2005) Biosci. Biotechnol. Biochem. 69:2421-2430; Fujita et al. (2009) Biosci. Biotechnol. Biochem. 73:18251830) com o domínio redutase de P450RhF, que inclui o mononucleotídeo flavina (FMN) e sítios de ligação de NADPH e centro de ferredoxina [2FeS] (Hunter et al. (2005) FEBS Lett 579:2215-2220). P450RhF pertence à classe-I PFOR P450- fundida (Demot e Parret (2003) Trends Microbiol. 10:502). Esta proteína de fusão híbrida cyp153A-RedRhF foi demonstrada em biotransformações in vitro para hidroxilar octano na posição-w e também outros compostos tais como ciclo-hexano ou butilbenzeno. Exemplos de proteínas de fusão P450-redutase naturais são mostradas nas Tabelas 2C e 2D (supra).
[00102] Dada a sua alta seletividade para a posição-w de cadeias de hidrocarbonetos, as oxigenases da família cyp153A pareciam ser bons exemplos de candidatos adequados para produzir um derivados de ácidos graxos α,w- bifuncionais a partir de uma fonte de carbono renovável. Isto permitiria o desenvolvimento de processos comercialmente viáveis para produzir estes compostos valiosos. No entanto, tal como com outros citocromos P450, as proteínas da família cyp153A, até agora, na sua maioria tem sido aplicada a experimentos in vitro com enzimas purificadas ou lisados celulares em bruto ou em biotransformações celulares em repouso aos quais os derivados de ácidos graxos ou hidrocarbonetos são adicionados exogenamente (Kubota et al., Fujita et al., Honda-Malca et al., supra). No entanto, as biotransformações celulares em repouso ou procedimentos in vitro empregando fusão híbrida não são propícias para grande escala e de produção de custo eficiente de derivados de ácidos graxos w-hidroxi. O conhecimento amplamente aceito na técnica é que muitos citocromos P450, bem como w- hidroxilases tipo AlkB não são fáceis de expressar funcionalmente em microrganismos recombinantes porque as enzimas são frequentemente inativas e a sua química tem sido difícil de elucidar. De fato, o único trabalho in vivo utilizando uma fonte de carbono renovável com exceção de derivados de ácidos graxos tem sido até agora tentativas empregadas de w-hidroxilase AlkB e atingiu apenas título baixo de derivados de ácidos graxos w-hidroxi numa fermentação de elevada densidade celular (WO2013/ 024114A2).
[00103] Os requerentes criaram proteínas de fusão híbridas CYP153A-redutase e suas variantes que são capazes de produzir eficientemente os derivados de ácidos graxos w- hidroxi in vivo, a partir de uma fonte de carbono renovável. Mais especificamente, um gene de Marinobacter aquaeoli que codifica para uma proteína de fusão híbrida do domínio catalítico P450 CYP153A (G307A), onde uma glicina (G) foi substituída por uma alanina (A) na posição 307, foi fundida com um gene que codifica para o C-terminal FMN- e Fe/S contendo domínio de redutase de P450RhF de Rhodococcus sp. NCIMB9784 (ver Exemplo 6, infra. O polipeptídeo resultante é um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A- RedRhF (SEQ ID NO: 6) com uma sequência de ácido nucleico correspondente (SEQ ID NO: 5). Quando esta proteína de fusão híbrida CYP153A-redutase foi expressa em células de E. coli com uma fonte de carbono simples, tais como derivados de ácido graxo de glicose foram eficientemente convertidos para derivados de ácidos graxos w-hidroxi (ver Exemplos, infra). Outros exemplos de w-hidroxilases adequados (EC 1.14.15.3) e os seus parceiros redox que podem ser utilizados para gerar polipeptídeos de fusão híbrida CYP153A-redutase semelhantes são apresentados nas Tabelas 2A e 2B (supra).
[00104] A presente invenção proporciona microrganismos que podem eficientemente e seletivamente produzir derivados de ácidos graxos w-hidroxi incluindo derivados de ácido graxo α,w-bifuncionais in vivo. Numa modalidade, a proteína de fusão híbrida CYP153A-RedRhF foi concebida para ser expressa em um microrganismo tal que possa converter eficazmente os compostos tais como o ácido dodecanóico, ou éster metílico do ácido dodecanóico e ácido dodecanóico 12- hidroxi ou éster metílico do ácido dodecanóico 12-hidroxi in vivo a partir de uma fonte de carbono tal como glicose. Qualquer matéria-prima renovável, em vez de glicose pode ser utilizada como fonte de carbono. Assim, foi demonstrado pela primeira vez que uma proteína de fusão híbrida manipulada (por exemplo, ilustrado através da proteína de fusão híbrida CYP153A-RedRhF) que possui atividade enzimática de P450 pode eficientemente converter os ácidos graxos in vivo para compostos específicos w-hidroxilados desejáveis (por exemplo, ácidos graxos w-hidroxi , ésteres metílicos de ácidos graxos w-hidroxi ; α,w-hidroxi diácidos; α, w-hidroxi diésteres; e a,w-dióis) quando a proteína de fusão híbrida é coexpressa com uma tioesterase numa célula hospedeira (por exemplo, E. coli) e alimentar uma fonte de carbono a partir de uma matéria-prima renovável (ver Exemplo 6, bem como a Figura 25 e 26). Ao seguir a presente descrição, outras proteínas de fusão híbridas podem ser construídas por ligação a um gene P450 tal como um gene que codifica para uma proteína cyp153A a um gene da redutase, por exemplo, que codifica para um domínio redutase C-terminal de uma proteína PFOR de classe- I P450-fundido ou outro domínio redutase. Tabelas 2A e 2D (supra) dão exemplos para cyp153A e proteínas PFOR classe-1 P450-fundido, respectivamente. Seguindo estas instruções, as proteínas de fusão similares podem ser criadas a partir de outros tipos de w-hidroxilases/w-oxigenases.
[00105] A via para a,w-diácidos ou ácidos de w-amino graxos, como mostrado na Figura 2A através de um éster metílico de ácidos graxos w-hidroxi , ou uma rota para α,w- -diácidos como mostrado na Figura 2B, através de um éster metílico de ácido α,w-hidroxi graxo pode ser vantajosa, porque os ésteres metílicos não estão carregados, que proporciona vantagens para a produção em larga escala e de recuperação. Além disso, a rota através de éster metílico de ácidos graxos w-hidroxi permite lactamização enzimática direta via catálise por certas hidrolases. Na etapa 3 da Figura 1 ou Figuras 2A e 2B, uma álcool desidrogenase ou oxidase pode ainda converter o ácido graxo w-hidroxi a um ácido w-oxo graxo (por exemplo, Tabela 3A mostra polipeptídeos que têm a atividade enzimática de uma álcool desidrogenase ou oxidase que pode ser utilizado para catalisar esta etapa, supra). Por exemplo, enzimas adequadas que podem oxidar ácido dodecanóico 12-hidroxi ou éster metílico do ácido dodecanóico 12-hidroxi em ácido 12-oxo dodecanóico ou éster metílico do ácido 12-oxo dodecanóico são álcool oxidases (flavoproteínas, por exemplo, a partir de Pseudomonas putida alkJ) (EC 1.1.3.13, EC 1.1.3.20) (ver SEQ ID NO: 67) ou álcool desidrogenases de NAD(P) dependente (por exemplo, cddC a partir de Rhodococcus ruber (EC 1.1.1.1) (ver Tabela 3A, supra) Neste ponto, a via pode seguir duas vias diferentes daqui em diante, ou seja, converter o ácido graxo u-oxi para um α,w- diácido por meio de aldeído desidrogenase ou oxidase (por exemplo, Tabela 3B mostra polipeptídeos que têm a atividade enzimática de uma aldeído desidrogenase ou oxidase que podem ser utilizados para catalisar esta etapa, supra), ou converter o ácido w-oxo graxo a um ácido graxo w-amino através de uma aminotransferase ou transaminase ou aminoácido desidrogenase (por exemplo, a Tabela 4 mostra os polipeptídeos que têm a atividade enzimática de uma aminotransferase ou transaminase ou aminoácido desidrogenase que pode ser utilizado para catalisar esta etapa, supra). Por exemplo, transaminases adequadas para converter o ácido 12-oxo láurico ou éster metílico de ácido 12-oxo láurico a ácido 12-amino láurico ou éster metílico de 12-amino são mostrados na Tabela 4 (supra). Estas enzimas transferem o grupo amina de um dador adequado para a ácido w-oxo ou éster para gerar a amina do terminal correspondente. A disponibilidade de dadores de amina (por exemplo, alanina ou glutamato) pode ser melhorada in vivo através da coexpressão de respectivo aminoácido desidrogenase (por exemplo, alanina desidrogenase, glutamato desidrogenase, ver Tabela 4, supra). Além disso, a sobre-expressão de homólogos ou outras variantes de glutamato desidrogenase que podem utilizar o NADH em vez de NADPH pode fornecer melhoramentos adicionais para a produção. Exemplos de outras classes de enzimas, tais como metilamina desidrogenase ou lisina 6-desidrogenase, que são adequados para a conversão de ácido 12-oxo láurico ou éster metílico de ácido 12-oxo láurico a ácido 12-amino láurico ou éster metílico 12-amino são também listados na Tabela 4.
[00106] Numa outra modalidade, as Figuras 2A e 2B mostram a produção de vários compostos químicos, incluindo a,u-diácidos e ácidos graxos u-amino por ésteres metílicos como intermediários. Etapa 6 da Figura 2B mostra a produção de a,u-diésteres (utilizando uma acil-CoA ligase/transferase). Na etapa 2 das Figuras 2A e 2B, uma éster sintase é empregada para converter uma acil-ACP a um éster metílico de ácidos graxos (FAME). Em certas modalidades, um gene que codifica para uma éster sintase é um que codifica uma enzima da classificação de enzima EC 2.3.1.75 ou EC 2.3.1.20, uma cera de codificação/dgat, uma éster sintase bifuncional/acil-CoA:diacilglicerol aciltransferase de Simmondsia chinensis, Acinetobacter sp. ADP1, Alcanivorax borkumensis, Pseudomonas aeruginosa, Fundibacter jadensis, Arabidopsis thaliana, ou Alkaligenes eutrophus, ou uma que codifica AtfA1, AtfA2, ES9, ou ES8, ou uma variante dos mesmos (ver também a Tabela 9, que mostra os polipeptídeos que têm a atividade enzimática de uma éster sintase que pode ser utilizada para catalisar esta etapa, supra). Na etapa 3, uma u-hidroxilase (ou u- oxigenase) é usada para gerar os ésteres metílicos de ácidos graxos u-hidroxi (por exemplo, Tabela 2A mostra polipeptídeos que têm a atividade enzimática que pode ser utilizada para catalisar esta etapa, supra). Como pode ser visto na Figura 2A, a posição ômega do éster metílico de ácidos graxos é hidroxi. Na etapa 3 da Figura 2A, uma álcool desidrogenase ou oxidase pode ainda converter o éster metílico de ácidos graxos u-hidroxi a um éster metílico de ácidos graxos u-oxo (por exemplo, A Tabela 3A mostra polipeptídeos que têm a atividade enzimática de uma álcool desidrogenase ou oxidase que pode ser utilizada para catalisar esta etapa, supra). Do mesmo modo, a via pode seguir duas vias alternativas diferentes a partir de agora em diante, isto é, um percurso converte o éster metílico de ácidos graxos u-oxo a um a,u-diácido por meio de aldeído desidrogenase ou oxidase (ver Tabela 3B, supra), e, finalmente, uma esterase ou lipase (ver Tabela 5, supra) ou por conversão química; enquanto que uma outra via converte o éster metílico de ácidos graxos u-oxo a um ácido graxo u-amino por meio de uma aminotransferase ou transaminase ou aminoácido desidrogenase (ver a Tabela 4, supra), e, finalmente, uma esterase ou lipase (ver Tabela 5, supra). A etapa final (isto é, em que uma esterase ou lipase catalisa a conversão de um éster metílico do ácido α,u-graxo ou um éster metílico de ácidos graxos u-amino no produto final, como mostrado), pode ser o resultado de uma etapa enzimática bem como uma etapa de conversão química. Por exemplo, enzimas adequadas que podem hidrolisar esta etapa são listadas na Tabela 5. As lipases (EC 3.1.1.3) ou esterases (EC 3.1.1.1) escolhidas são localizadas no periplasma ou são secretadas para o sobrenadante. Sinais de secreção adequados ou sequências de ancoragem podem ser manipuladas de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em outra modalidade, a Figura 2B mostra a produção de α,u- diácidos via éster dimetílico de ácido α,u-graxo. Esta via é semelhante ao ramo esquerdo na figura 2A, mas utiliza acil-CoA sintase/acil-CoA ligase ou transferase adicional (ver Tabela 7 para os candidatos adequados, supra). O éster sintase/aciltransferase que catalisa a primeira etapa pode também catalisar a penúltima etapa.
[00107] Numa outra modalidade, as vias estão representadas nas Figuras 3 e 4 que podem utilizar uma fonte de carbono a partir de uma matéria-prima renovável (por exemplo, glicose) para produzir a,w-dióis a partir de álcoois graxos (FALC) produzidos na célula. Numa modalidade, a Figura 3 ilustra uma via em que a,w-dióis são feitos através do emprego de tioesterase e atividade redutase de ácido carboxílico (ver Tabela 1, supra, para os polipeptídeos que podem catalisar estas etapas). Aqui, uma tioesterase pode converter uma acil-ACP a um ácido graxo livre (FFA) na etapa 2. Um ácido carboxílico redutase pode converter o FFA resultante a um aldeído graxo na etapa 3. Na etapa 4, uma álcool desidrogenase (ver Tabela 1, supra) pode converter o aldeído graxo a um álcool graxo (FALC). Finalmente, na etapa 5, uma w-hidroxilase ou u-oxigenase (ver Tabela 2A, supra) pode converter uma FALC a um α,w- diol. Alternativamente, acil-ACP pode ser diretamente convertido a aldeído graxo por uma acil-ACP redutase, como ilustrado na Figura 4. (A Tabela 1 mostra os polipeptídeos que têm a atividade enzimática de uma tioesterase, ácido carboxílico redutase, acil-ACP redutase ou álcool desidrogenase a fim de catalisar estas etapas, supra.)
[00108] Em ainda outra modalidade, um caminho é mostrado que produz lactamas que podem ser quimicamente convertidas em polímeros. Isto é ilustrado na Figura 5 por meio de um exemplo de um ácido graxo u-amino tal como ácido 12-amino láurico que pode ser convertido para uma lactama por meio de uma acil-CoA transferase (ver Tabela 7, supra) e amida sintase (ver Tabela 8, supra). Neste exemplo particular, a lactama resultante é um 12- aminododecanolactama ou laurolactama. Um exemplo de um polímero derivado do mesmo é nylon 12, como mostrado na Figura 5. As enzimas adequadas para lactamizar diretamente éster metílico de ácido 12-amino láurico a correspondente lactama são determinadas hidrolases (ver Tabela 6, supra) que podem ser utilizadas em combinação com o outras enzimas no mesmo biocatalisador para a produção direta de laurolactama; ou podem ser utilizadas em uma biotransformação separada de éster metílico de ácido 12- amino láurico. Uma lipase ou esterase (ver Tabela 5, supra) pode também lactamizar diretamente éster metílico de ácido 12-amino láurico para a correspondente lactama.
[00109] A divulgação identifica polinucleotídeos que codificam para polipeptídeos com atividade enzimática que são úteis para as células hospedeiras recombinantes e métodos de produção. Os polipeptídeos com atividade enzimática contribuem para a produção de composições que incluem os compostos. Serão em geral reconhecidos que a identidade de sequência absoluta para esses polinucleotídeos não é necessária. Por exemplo, alterações na sequência de polinucleotídeo particular, (por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com a função enzimática) podem ser feitas e o polipeptídeo codificado rastreado para a atividade. Tais alterações compreendem tipicamente mutações conservadoras e mutações silenciosas (por exemplo, otimização do códon). Polinucleotídeos modificados ou geneticamente modificados e polipeptídeos de variantes codificadas podem ser rastreados para uma função desejada, incluindo, mas não limitado a, uma atividade catalítica aumentada, estabilidade aumentada, ou inibição diminuída (por exemplo, inibição de feedback diminuída), utilizando métodos conhecidos na técnica.
[00110] Além disso, a divulgação identifica atividades enzimáticas envolvidas em várias etapas (ou seja, reações) de vias modificadas envolvidas na produção dos derivados de ácido graxo w-hidroxilado tal como aqui descrito (supra) de acordo com o número de classificação de enzima (EC), e fornece polipeptídeos exemplares (por exemplo, enzimas) categorizados por esses números EC, e polinucleotídeos exemplares que codificam tais polipeptídeos. Tais polipeptídeos e polinucleotídeos exemplares, que são aqui identificados pelos números de acesso e/ou números identificadores de sequência (SEQ ID NOS), são úteis para vias de ácidos graxos modificados que levam à produção de derivados de ácidos graxos w-hidroxi incluindo outras moléculas bifuncionais, tais como a,w-diácidos em células hospedeiras parentais para obter as células hospedeiras geneticamente modificadas aqui descritas. Os polipeptídeos e polinucleotídeos aqui descritos são exemplificativos e não limitativos. As sequências de homólogos de polipeptídeos exemplificativos aqui descritos estão disponíveis para os peritos na técnica através de vários bancos de dados (por exemplo, as bases de dados Entrez fornecidos pelo Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI), as bases de dados ExPasy fornecidas pelo Instituto Suíço de Bioinformática, o banco de dados BRENDA fornecido pela Universidade Técnica de Braunschweig, e o banco de dados KEGG fornecido pelo Centro de Bioinformática da Universidade de Kyoto e da Universidade de Tóquio, todos os que estão disponíveis na rede mundial de computadores).
[00111] Numa modalidade, os microrganismos recombinantes, como aqui descritos (supra) produzem derivados de ácidos graxos w-hidroxi com uma cadeia de carbono par. Em outra modalidade, os microrganismos recombinantes podem ser modificados para produzir os derivados de ácidos graxos w-hidroxi com uma cadeia de carbono ímpar. Por exemplo, vias de w-hidroxilase pode ser expressas em células recombinantes (por exemplo, E. coli) que superproduzem derivados de ácido graxo de cadeia ímpar (superprodução de derivados de ácido graxo de cadeia ímpar por certas cepas de bactérias é descrito na Publicação do Pedido de Patente US2012/0070868, que é aqui incorporado por referência). Isto permite a produção de derivados de ácidos graxos w-hidroxilados de cadeia ímpar. Numa modalidade, uma cepa recombinante que superproduz ácidos graxos de cadeia ímpar quando combinado com a expressão de um w-hidroxilase (por exemplo, uma proteína de fusão híbrida CYP153A-RedRhF) e um ácido graxo descarboxilase, tal como oleT (por exemplo, ver rude et al. (2011) Appl. Environ. Microbiol. 77:1718) produz álcoois graxos de cadeia par com uma dupla ligação terminal, tais como, por exemplo, 9-deceno-1-ol, 11-dodeceno-1-ol, 13-tetradeceno-1- ol e 15-hexadeceno-1-ol.
[00112] Numa outra modalidade, os derivados de ácidos graxos subterminalmente hidroxilados são fornecidos. Estes são compostos que possuem pelo menos um grupo OH na posição ômega-1, e/ou posição ômega-2, e/ou posição ômega-3, e/ou posição ômega-4, etc. (por exemplo, w-1, w-2 e/ou w-3, etc.). Exemplos 8 e 9 mostram a produção destes compostos em células hospedeiras geneticamente modificadas empregando citocromo P450 oxigenases da família cyp102A (Whitehouse et al. (2012) Chem. Soc. Rev. 41: 1218). O citocromo P450 oxigenases da família cyp102A são adequados para a produção de derivados de ácidos graxos subterminalmente hidroxilados. No entanto, estas enzimas não são adequadas para produzir de forma eficiente derivados de ácidos graxos w-hidroxilados em hospedeiros recombinantes a menos que a sua especificidade de substrato é alterada de tal modo que elas predominantemente hidroxilam derivados do ácido graxo na posição-w, que até agora tem sido apenas parcialmente bem sucedidas (Lentz et al. (2006) ChemBioChem 7:345).
Variantes de Polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A- redutase expressa em células hospedeiras recombinantes
[00113] A presente invenção identifica variantes de polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A-redutase que resultam em título elevado, o rendimento e/ou produtividade das composições de ácidos graxos derivados w-hidroxilados, quando expressas em células hospedeiras recombinantes. Nos exemplos não limitantes da presente divulgação o polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A(G307A)-RedRhF (ver Exemplo 6, infra) foi utilizado como um modelo para conceber eficientemente variantes de polipeptídeos de fusão híbrida de CYP153A-redutase (ver Exemplos 14-10, infra) para produzir maiores quantidades de ácidos w-OH graxos e derivados de ácidos w-OH graxos. Por exemplo, uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase, quando expressa numa célula hospedeira pode eficientemente converter os compostos tais como o ácido dodecanóico a ácido dodecanóico 12-hidroxi in vivo a partir de uma fonte de carbono simples tal como a glicose. Qualquer fonte de carbono simples, por exemplo, como derivado de uma matéria- prima renovável é adequado. Foi demonstrado que uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A- reductase modificada (ou seja, ilustrada através de uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A-RedRhF modificada) pode converter eficientemente os ácidos graxos in vivo para compostos desejáveis específicos (incluindo os ácidos w-OH graxos), quando coexpressa com uma tioeterase numa célula hospedeira (por exemplo, E. coli) utilizando uma fonte de carbono (por exemplo, glicose) a partir de uma matéria-prima renovável (ver Exemplos, infra). Ao seguir a presente descrição, outras variantes de polipeptídeo de fusão híbrida podem ser construídas por ligação de um gene mutado tal como um gene que codifica para uma proteína CYP153A a um gene mutado que codifica para um domínio C- terminal redutase (ver Tabelas 2A a 2D, supra). As variações são aqui englobadas, por exemplo, mutação de ambos os genes (o domínio P5450 e redutase) ou mutação de um gene (ou o domínio redutase ou P450). Seguindo as instruções, as variantes de proteínas de fusão semelhantes podem ser criadas a partir de outros tipos de w- hidroxilases e expressas em células hospedeiras recombinantes para produzir derivados de ácidos w-OH graxos.
[00114] Deste modo, a presente invenção se refere a células hospedeiras recombinantes que expressam variantes de polipeptídeos de fusão híbrida de CYP153A redutase que resultam em título elevado, rendimento e/ou produtividade das composições de derivados do ácido graxo w-hidroxilado quando cultivadas com uma fonte de carbono (por exemplo, glicose, sacarose ou qualquer outra fonte de carbono derivada de uma matéria prima renovável). A variante de polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A-redutase tem uma ou mais mutações no domínio CYP153A ou domínio redutase ou ambos. Numa modalidade, a presente invenção proporciona uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A- redutase tendo pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da sequência de identidade com a SEQ ID NO: 6 e tendo uma ou mais mutações na posição de aminoácidos incluindo a posição 27, 82, 141, 178, 231, 309, 407, 415, 516, 666 e/ou 796, em que a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase catalisa a conversão de um ácido graxo a um ácido w-OH graxo in vivo. Mais especificamente, a variante do polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase tem uma ou mais das seguintes mutações, incluindo R27L em que arginina (R) é substituída por lisina (L); posição R82D em que arginina (R) é substituída por ácido aspártico (D); posição V141I onde valina é substituída por isoleucina (I); posição V141Q onde valina (V) é substituída por glutamina (Q); posição V141G onde valina (V) é substituída por glicina (G); posição V141M onde valina (V) é substituída por metionina (M); posição V141L onde valina (V) é substituída por leucina (L); posição V141T onde valina (V) é substituída por treonina (T); posição R178N onde arginina (R) é substituída por asparagina (N); posição A231T onde alanina (A) é substituída por treonina (T); posição N309R onde asparagina (N) é substituída por arginina (R); posição N407A onde asparagina (N) é substituída por alanina (A); posição V415R onde valina (V) é substituída por arginina (R); posição T516V onde treonina (T) é substituída por valina (V); posição P666A onde a prolina (P) é substituída por alanina (A); posição P666D onde prolina (P) é substituída por ácido aspártico (D); e posição A796V onde a alanina (A) é substituída por valina (V). Exemplos de variantes de polipeptídeos de fusão híbrida de CYP153A-redutase incluem a SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 46. Numa modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A redutase é uma variante da proteína de fusão do tipo cyp153A-RedRhF-híbrida. Em uma outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A-redutase em uma célula hospedeira recombinante resulta em um título mais elevado de uma composição derivada de ácido w-OH graxo, em comparação com o título de uma composição de ácidos w-OH graxos produzida por expressão de um polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A- redutase numa célula hospedeira correspondente. Em uma outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A-redutase em uma célula hospedeira recombinante resulta de um título mais elevado de uma composição de derivado de ácido w-OH graxo, incluindo, mas não se limitando a, composição derivada de ácido w-OH C12, w-OH C14, w-OH C16, w-OH C18, w-OH C12:1, w-OH Cl4:1, w-OH C16:l, w-OH C18:1 graxo.
[00115] Numa outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase tem uma mutação na posição de aminoácido 141, incluindo V141I e/ou V141T. Aqui, a expressão da variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase com mutações V141I ou V141T em uma célula hospedeira recombinante resulta em um título mais elevado de uma composição de ácido C12 ou C16 w-OH graxo, respectivamente, quando comparado com um título de uma composição de ácido w-OH C12 ou C16 graxo produzida por expressão de um polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A- redutase. Em uma modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase tem mutações V141I e A231T (SEQ ID NO: 32) e produz o aumento da quantidade de ácidos w-OH C12 graxos, quando expressa em uma célula hospedeira com uma função enzimática da tioesterase. Em uma outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase tem mutações R27L, R82D, V141M, R178N e N407A (SEQ ID NO: 34) e produz o aumento da quantidade de ácidos w-OH C12 graxos, quando expressa numa célula hospedeira com uma função enzimática da tioesterase. Em uma outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase tem mutação P666A (SEQ ID NO: 36) e produz o aumento da quantidade de ácidos w-OH C12 graxos, quando expressa numa célula hospedeira com uma função enzimática da tioesterase. Em uma outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase tem A796V mutação (SEQ ID NO: 38) e produz quantidades aumentadas de ácidos w-OH C12 graxos, quando expressa em uma célula hospedeira com uma função enzimática da tioesterase. Em uma outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase tem mutações A796V, P666D e T516V (SEQ ID NO: 40) e produz o aumento da quantidade de ácidos w-OH C12 graxos, quando expressa em uma célula hospedeira com uma função enzimática da tioesterase. Em uma outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase tem mutações V141I, A231T e A796V (SEQ ID NO: 42) e produz o aumento da quantidade de ácidos w-OH C12 e C16 graxos, quando expressa em uma célula hospedeira com uma função enzimática de tioesterase. Em uma outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase tem mutações R27L, R82D, V141M, R178N, N407A e A796V (SEQ ID NO: 44) e produz o aumento da quantidade de ácidos w-OH C12 graxos, quando expressa em uma célula hospedeira com uma função enzimática da tioesterase. Em uma outra modalidade, a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase tem mutações V141T, A231T e A796V (SEQ ID NO: 46) e produz o aumento da quantidade de ácidos w-OH C16 graxos, quando expressa em uma célula hospedeira com uma função enzimática da tioesterase.
[00116] A divulgação identifica variantes de polipeptídeos e polinucleotídeos relacionados com a fusão híbrida de CYP153A-redutase. As variantes de polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A-redutase incluem SEQ ID NOS: 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42,44 e 46. As variantes de ácido nucleico de fusão híbrida CYP153A-redutase (sequências de DNA) incluem SEQ ID NOS: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 e 47. No entanto, vai ser reconhecido que a identidade de sequência absoluta para variantes de polinucleotídeos de fusão híbridas CYP153A- redutase não é necessário. Por exemplo, alterações na sequência polinucleotídica particular pode ser feita e o polipeptídeo codificado rastreado para a atividade. Tais mudanças incluem tipicamente mutações conservativas e mutações silenciosas, tais como, por exemplo, através da otimização de códon. Polinucleotídeos modificados ou mutados (isto é, mutante) e polipeptídeos de variantes codificadas podem ser selecionados relativamente a uma função desejada, tal como, uma função melhorada em comparação com o tipo selvagem ou polipeptídeo modelo, incluindo, mas não se limitando ao aumento da atividade catalítica, estabilidade aumentada, ou inibição diminuída (por exemplo, diminuição da inibição de feedback), utilizando métodos conhecidos na técnica. A divulgação identifica atividades enzimáticas envolvidas em várias etapas (ou seja, reações) das vias biossintéticas de ácidos graxos aqui descritos de acordo com número de Classificação de enzima (EC), e fornece polipeptídeos exemplares (por exemplo, que funcionam como enzimas específicas e mostram atividade da enzima específica) categorizados por tais números EC, e polinucleotídeos exemplares que codificam para tais polipeptídeos. Esses polipeptídeos e polinucleotídeos exemplares, que são aqui identificados por números identificadores de sequência (SEQ ID NOS; supra), são úteis para vias de ácidos graxos de engenharia em células hospedeiras, tais como mostrado na Figura 1. É para ser entendido, no entanto, que os polipeptídeos e polinucleotídeos aqui descritos são exemplares e, por conseguinte, não limitativos. As sequências de homólogos de polipeptídeos exemplificativos aqui descritos estão disponíveis para os peritos na técnica, utilizando bases de dados, tais como, por exemplo, as bases de dados Entrez fornecidas pelo Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI), as bases de dados ExPasy fornecidas pelo Instituto Suíço de Bioinformática, o banco de dados BRENDA fornecido pela Universidade Técnica de Braunschweig, e o banco de dados KEGG fornecido pelo Centro de Bioinformática da Universidade de Kyoto e Universidade de Tóquio, todos os que estão disponíveis na World wide web.
[00117] Em uma modalidade, uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase para utilização na prática da divulgação tem pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades a variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é derivada de um polipeptídeo CYP153A (G307A) de Marinobacter aquaeolei onde uma glicina (G) é substituída por uma alanina (A), e fundida com um domínio de redutase de P450RhF a partir de Rhodococcus sp. NCIMB9784. Citocromo P450RhF é autossuficiente, exibe um elevado grau de promiscuidade de substrato e catalisa uma vasta gama de grupos funcionais. Em outras modalidades, uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase para utilização na prática da divulgação tem pelo menos cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84 %, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 46, e podem também incluir uma ou mais substituições, o que resulta em características e/ou propriedades úteis como aqui descritas. Em outras modalidades, uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase para uso na prática da divulgação tem 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% ou 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 46. Ainda em uma outras modalidades, o domínio catalítico de P450 da variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é derivado de uma espécie diferente de Marinobacter aquaeolei. Tais outras espécies incluem, mas não estão limitadas a, Acinetobacter sp., Mycobacterium marinum, Polaromonas sp., Alcanivorax borkumensis, Burkholderia fungorum, Caulobacter crescentus, Hyphomonas neptunium, Rhodopseudomonas palustris, Sphingomonas sp., Mycobacterium sp. Em ainda outras modalidades, o domínio redutase da variante do polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é derivado de uma espécie que não seja Rhodococcus sp. Tais outras espécies incluem, mas não estão limitadas a, Rhodococcus equi, Acinetobacter radioresistens, Burkholderia mallei, Burkholderia mallei, Ralstonia eutropha, Cupriavidus metallidurans.
[00118] Em uma modalidade relacionada, a divulgação inclui uma variante de polinucleotídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase que tem, pelo menos, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 47. Em algumas modalidades a sequência de ácido nucleico codifica uma variante do polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A redutase com uma ou mais substituições o que resulta em características e/ou propriedades melhoradas, tal como aqui descrito. Em ainda uma outra modalidade relacionada, uma variante de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-reductase para utilização na prática da divulgação é codificada por uma sequência de nucleotídeos com 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% ou 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 47. Em outro aspecto, a divulgação se refere a variantes de polipeptídeos de fusão híbridas CYP153A- redutase que englobam uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácido nucleico que hibridiza sob condições rigorosas ao longo de substancialmente todo o comprimento de uma sequência de ácido nucleico correspondente com a SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 47. Em algumas modalidades a variante do polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase é derivada de uma espécie Marinobacter aquaeolei. Em outras modalidades, o polipeptídeo de fusão híbrida P450 é derivado de Acinetobacter sp., Mycobacterium marinum, Polaromonas sp., Alcanivorax borkumensis., Burkholderia fungorum, Caulobacter crescentus, Hyphomonas neptunium, Rhodopseudomonas palustris, Sphingomonas sp., e Mycobacterium sp.
Variações e mutações
[00119] Uma variante de polipeptídeo, tal como aqui utilizado se refere a um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos que difere de um tipo selvagem ou polipeptídeo modelo por, pelo menos, um aminoácido. Por exemplo, a variante (por exemplo, mutante) pode ter uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos conservadores, incluindo, mas não se limitando à substituição de um aminoácido alifático, tal como alanina, valina, leucina e isoleucina, com outro aminoácido alifático; substituição de uma serina com uma treonina; substituição de uma treonina com uma serina; substituição de um resíduo ácido, tal como ácido aspártico e ácido glutâmico, com um outro resíduo ácido; substituição de um resíduo tendo um grupo amida, tal como asparagina e glutamina, com outro resíduo tendo um grupo amida; troca de um resíduo básico, tal como lisina e arginina, por outro resíduo básico; e substituição de um resíduo aromático, tal como fenilalanina e tirosina, com outro resíduo aromático. Em algumas modalidades, a variante do polipeptídeo tem cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ou mais substituições de aminoácidos, adições, inserções ou exclusões. Alguns fragmentos preferidos de um polipeptídeo que funcionam como uma variante ou mutante retém alguma ou a totalidade da função biológica (por exemplo, atividade enzimática) do correspondente polipeptídeo do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o fragmento retém pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% ou mais da função biológica do polipeptídeo do tipo selvagem correspondente. Em outras modalidades, o fragmento ou mutante retém cerca de 100% da função biológica do polipeptídeo tipo selvagem correspondente. Em outras modalidades, alguns fragmentos exibem aumento da função biológica em comparação com o polipeptídeo tipo selvagem correspondente. Uma orientação para determinar que resíduos de aminoácidos é que podem ser substituídos, inseridos ou eliminados sem afetar a atividade biológica pode ser encontrada utilizando programas de computador bem conhecidos na técnica, por exemplo, software Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI). Em algumas modalidades, um fragmento exibe aumento da função biológica em comparação com um polipeptídeo do tipo selvagem correspondente ou polipeptídeo modelo. Por exemplo, um fragmento pode exibir, pelo menos, um 10%, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, ou, pelo menos, uma melhoria de 90% na atividade enzimática em comparação com o correspondente polipeptídeo do tipo selvagem ou polipeptídeo modelo. Em outras modalidades, o fragmento exibe, pelo menos, 100%, pelo menos 200%, ou pelo menos uma melhoria de 500% na atividade enzimática em comparação com o correspondente polipeptídeo do tipo selvagem ou polipeptídeo modelo.
[00120] É entendido que os polipeptídeos aqui descritos podem ter substituições de aminoácidos conservadoras ou não essenciais adicionais que não têm um efeito significativo sobre a função de polipeptídeo. Seja ou não uma substituição particular será tolerada (isto é, não afetará adversamente a função biológica desejada, tal como uma atividade enzimática de w-hidroxilase), pode ser determinada como conhecido na técnica (ver Bowie et al. (1990) Science, 247.:1306-1310). Uma substituição de aminoácidos conservadora é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos possuindo cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por ex., treonina, valina, isoleucina), e laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
[00121] As variantes podem ocorrer naturalmente ou ser criadas in vitro. Em particular, estas variantes podem ser criadas através de técnicas de engenharia genética, tais como mutagênese dirigida ao local, mutagênese química aleatória, procedimentos de deleção com exonuclease III, ou técnicas de clonagem convencionais. Alternativamente, tais variantes, mutantes, fragmentos, análogos ou derivados podem ser criadora usando síntese química ou procedimentos de modificação. Métodos de preparar variantes são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, as variantes podem ser preparadas utilizando mutagênese aleatória e sítio dirigido. A mutagênese aleatória e sítio dirigido é geralmente conhecido na técnica (ver, por exemplo, Arnold (1993) Curr. Opin. Biotech. 4:450-455). A mutagênese aleatória pode ser conseguida utilizando PCR propensa a erros (ver, por exemplo, Leung et al. (1989) Technique 1: 11-15; e Caldwell et al. (1992) PCR Methods Applic. 2: 2833). Em PCR propensa a erros, a PCR real é executada sob condições em que a fidelidade da cópia da DNA polimerase é baixa, de tal forma que uma taxa elevada de mutações pontuais é obtida ao longo de todo o comprimento do produto de PCR. Resumidamente, em tais procedimentos, os ácidos nucleicos a ser mutagenizados (por exemplo, uma sequência polinucleotídica que codifica uma proteína P450 ou polipeptídeo de fusão híbrida de P450) são misturados com iniciadores de PCR, tampão de reação, MgCl2, MnCl2, Taq polimerase, e uma concentração adequada de dNTPs para alcançar uma elevada taxa de mutação de ponto ao longo de todo o comprimento do produto de PCR. Por exemplo, a reação pode ser realizada utilizando 20 fmol de ácido nucleico a ser mutagenizado, 30 pmol de cada iniciador de PCR, um tampão de reação compreendendo 50 mMKCl, 10 mM Tris HCl (pH 8,3), 0,01% de gelatina, 7 mM de MgCl2, 0,5 mM de MnCl2, 5 unidades de Taq polimerase, 0,2 mM de dGTP, 0,2 mM de dATP, 1 mM de dCTP e 1 mM de dTTP. A PCR pode ser realizada durante 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 45°C durante 1 min, e 72°C durante 1 min. No entanto, será apreciado por aqueles na técnica que estes parâmetros podem ser variados como apropriados. Os ácidos nucleicos mutagenizados são então clonados num vetor apropriado, e as atividades dos polipeptídeos codificados pelos ácidos nucleicos mutagenizados são avaliadas. Mutagênese sítio dirigido pode ser conseguida usando a mutagênese dirigida por oligonucleotídeos para gerar mutações sítio específicas em qualquer DNA clonado de interesse. Mutagênese de oligonucleotídeo é descrita na técnica (ver, por exemplo, Reidhaar-Olson et al. (1988) Science 241:53-57). Resumidamente, em tais procedimentos uma pluralidade de oligonucleotídeos de cadeia dupla portadores de um ou mais mutações a ser introduzidas no DNA clonado, que são sintetizados e inseridos no DNA clonado para ser mutagenizado (por exemplo, uma sequência polinucleotídica que codifica um polipeptídeo P450 ou polipeptídeo de fusão híbrida de P450). Os clones contendo o DNA mutagenizado são recuperados, e as atividades dos polipeptídeos que eles codificam são avaliadas.
[00122] Outro método para a geração de variantes é montagem por PCR. Montagem por PCR envolve a montagem de um produto de PCR a partir de uma mistura de fragmentos pequenos de DNA. Um grande número de diferentes reações de PCR ocorre em paralelo no mesmo frasco, com os produtos de uma reação iniciando os produtos da outra reação (ver Patente US 5.965.408). Ainda um outro método de geração de variantes é mutagênese por PCR sexual. Na mutagênese por PCR sexual, recombinação homóloga forçada ocorre entre moléculas de DNA de diferentes, mas altamente relacionadas, sequências de DNA in vitro como resultado da fragmentação aleatória da molécula de DNA com base na homologia de sequência. Isto é seguido pela fixação do cruzamento por extensão do iniciador numa reação de PCR. A mutagênese por PCR sexual é descrita em publicações conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 9110747-10751). As variantes podem também ser criadas através de mutagênese in vivo. Em algumas modalidades, as mutações aleatórias em uma sequência de ácido nucleico são geradas pela propagação da sequência de uma cepa bacteriana, tal como uma cepa de E. coli, que transporta mutações em um ou mais das vias de reparação do DNA. Tais cepas mutantes possuem uma taxa de mutação aleatória mais elevada do que a de uma cepa do tipo selvagem. Propagação de uma sequência de DNA (por exemplo, uma sequência polinucleotídica que codifica um polipeptídeo de fusão híbrida P450) em uma destas cepas irá eventualmente gerar mutações aleatórias dentro do DNA. Cepas mutantes adequadas para utilização em mutagênese in vivo estão descritas na publicação na técnica (ver, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente Internacional N° WOL991/016427). As variantes também podem ser geradas utilizando mutagênese por cassete. Na mutagênese por cassete, uma pequena região de uma molécula de DNA de cadeia dupla é substituída por um cassete de oligonucleotídeo sintético, que difere da sequência nativa. O oligonucleotídeo contém muitas vezes uma sequência nativa completamente e/ou parcialmente randomizada. Mutagênese de conjunto recursivo também pode ser utilizado para gerar variantes. Mutagênese de conjunto recursivo é um algoritmo para a engenharia de proteína (isto é, mutagênese de proteínas) desenvolvida para produzir populações diversas de mutantes fenotipicamente relacionados cujos membros diferem na sequência de aminoácidos. Este método utiliza um mecanismo de feedback para controlar rondas sucessivas de mutagênese combinatória de cassete (ver, por exemplo, Arkin et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., EUA 89: 7.811-7.815). Em algumas modalidades, as variantes são criadas usando mutagênese de conjunto exponencial. Mutagênese de conjunto exponencial é um processo para a geração de bibliotecas combinatórias com uma elevada percentagem de mutantes originais e funcionais, em que pequenos grupos de resíduos são aleatorizados em paralelo para identificar, em cada posição alterada, aminoácidos que conduzem a proteínas funcionais (ver, por exemplo, Delegrave et al. (1993) Biotech. Res. 11:15481552). Em algumas modalidades, as variantes são criadas usando procedimentos de embaralhamento, em que as porções de uma pluralidade de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos distintos são fundidas em conjunto para criar sequências de ácidos nucleicos quiméricos que codificam polipeptídeos quiméricos (tal como descrito em, por exemplo, Patentes dos EUA Nos. 5.965.408 e 5.939.250).
Vetores de Expressão
[00123] Em algumas modalidades, uma sequência de polinucleotídeo (ou gene) é fornecida para a célula hospedeira através de um vetor recombinante, que inclui um promotor operacionalmente ligado à sequência de polinucleotídeo. Em certas modalidades, o promotor é um promotor de forma de desenvolvimento regulada, uma organela específica, um tecido-específico, um induzivel, um constitutivo, ou um específico de células. Em algumas modalidades, o vetor recombinante inclui pelo menos uma sequência selecionada a partir de uma sequência de controle de expressão operativamente acoplada com a sequência de polinucleotídeo; um marcador de seleção operativamente acoplado à sequência de polinucleotídeo; uma sequência de marcador operativamente acoplada à sequência de polinucleotídeo; uma porção de purificação operacionalmente acoplada à sequência de polinucleotídeo; uma sequência de secreção operativamente acoplada à sequência de polinucleotídeo; e uma sequência de direcionamento operativamente acoplada à sequência de polinucleotídeo. Os vetores de expressão aqui descritos incluem uma sequência de polinucleotídeo numa forma adequada para a expressão da sequência de polinucleotídeo numa célula hospedeira. Irá ser apreciado por aqueles peritos na técnica que o desenho do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão do polipeptídeo desejado, e similares. Os vetores de expressão aqui descritos podem ser introduzidos nas células hospedeiras para a produção de polipeptídeos, incluindo polipeptídeos de fusão, codificados pelas sequências de polinucleotídeos, tal como descrito acima (supra). Expressão de genes que codificam para polipeptídeos em procariotas, por exemplo, E. coli, é mais frequentemente realizada com vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis direcionando a expressão de polipeptídeos ou de fusão ou de não fusão. Vetores de fusão adicionam um número de aminoácidos de um polipeptídeo codificado no mesmo, geralmente, para os grupos amino ou carboxi-terminal do polipeptídeo recombinante. Tais vetores de fusão servem tipicamente um ou mais das seguintes três finalidades, incluindo o aumento da expressão do polipeptídeo recombinante; o aumento da solubilidade do polipeptídeo recombinante; e o auxílio na purificação do polipeptídeo recombinante atuando como um ligante na purificação por afinidade. Muitas vezes, em vetores de expressão de fusão, um local de clivagem proteolítica é introduzido na junção da porção de fusão e o polipeptídeo recombinante. Isto permite a separação do polipeptídeo recombinante a partir da porção de fusão depois da purificação do polipeptídeo de fusão. Exemplos de tais enzimas, e as suas sequências de reconhecimento cognatas, incluem Factor Xa, trombina, e enterocinase. Vetores de expressão de fusão exemplares incluem vetor pGEX (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ; Smith et al. (1988) Gene 67:31- 40), vetor pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), e vetor de pRITS (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ), que fundem a glutationa-S-transferase (GST), proteína de ligação a maltose E, ou proteína A, respectivamente, para o polipeptídeo recombinante alvo.
[00124] Exemplos de vetores de expressão de E. Coli de não fusão induzível incluem vetor pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315) e vetor pET lld (Studier et al., Gene Expression Tecnology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89). Expressão do gene alvo a partir do vetor pTrc se baseia na transcrição de RNA polimerase do hospedeiro a partir de um promotor de fusão híbrida trp-lac. Expressão do gene alvo a partir do vetor pET 11d se baseia na transcrição a partir de um promotor de fusão T7 gn10-lac mediada por uma RNA polimerase viral coexpressa (T7 gn1). Esta polimerase viral é fornecida pelas cepas hospedeiras tais como BL21(DE3) ou HMS174(DE3) de um profago residente À albergando um gene de T7 gn1 sob o controle transcricional do promotor lacUV 5. Os sistemas de expressão adequados para ambas células procarióticas e eucarióticas são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory). Exemplos de vetores de expressão de E. coli de não fusão induzível incluem vetor pTrc (Amann et al. (1988) Gene. 69: 301-315) e vetor PET 11d (Studier et al. (1990). Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, pp 60-89).Em certas modalidades, uma sequência de polinucleotídeo da divulgação está operativamente ligada a um promotor derivado de bacteriófago T5. Numa modalidade, a célula hospedeira é uma célula de levedura. Nesta modalidade, o vetor de expressão é um vetor de expressão de levedura. Os vetores podem ser introduzidos em células procarióticas ou eucarióticas através de uma variedade de técnicas reconhecidas na arte para a introdução de ácido nucleico estranho (por exemplo, DNA) numa célula hospedeira. Métodos adequados para transformação ou transfecção de células hospedeiras podem ser encontrados em, por exemplo, Sambrook et al. (supra). Para a transformação estável de células bacterianas, é sabido que (dependendo da técnica de vetor de expressão e transformação usada) uma certa fração das células tomará e replicará o vetor de expressão. De modo a identificar e selecionar estes transformantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, resistência a um antibiótico) pode ser introduzido nas células hospedeiras juntamente com o gene de interesse. Os marcadores selecionáveis incluem os que conferem resistência a fármacos, tais como, mas não limitados a, ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Os ácidos nucleicos que codificam um marcador de seleção podem ser introduzidos numa célula hospedeira no mesmo vetor que codifica um polipeptídeo aqui descrito ou podem ser introduzidos num vetor separado.
Engenharia da via opcional
[00125] As células hospedeiras ou de microrganismos da invenção incluem cepas hospedeiras ou células hospedeiras que são geneticamente manipuladas ou modificadas para conter alterações, a fim de testar a eficácia de mutações específicas sobre as atividades enzimáticas (por exemplo, células recombinantes ou microrganismos). Várias manipulações genéticas opcionais e alterações podem ser utilizadas indiferentemente a partir de uma célula hospedeira para outra, dependendo de que vias enzimáticas nativas estejam presentes na célula hospedeira original. Numa modalidade, uma cepa hospedeira pode ser usada para testar a expressão de um polipeptídeo de fusão híbrida CYP153A-redutase ou uma sua variante em combinação com outros polipeptídeos biossintéticos (por exemplo, enzimas). Uma cepa hospedeira pode englobar uma série de alterações genéticas a fim de testar variáveis específicas, incluindo, mas não se limitando a, condições de cultura, incluindo componentes de fermentação, fonte de carbono (por exemplo, matérias-primas), temperatura, pressão, condições de contaminação da cultura reduzida, e níveis de oxigênio.
[00126] Em uma modalidade, uma cepa hospedeira engloba uma eliminação fadE e fhuA opcional. Acil-CoA desidrogenase (FadE) é uma enzima que é importante para a metabolização de ácidos graxos. Ela catalisa a segunda etapa na utilização de ácidos graxos (beta-oxidação), que é o processo de quebra de cadeias longas de ácidos graxos (acil-CoAs) em moléculas de acetil-CoA. Mais especificamente, a segunda etapa do ciclo de e-oxidação da degradação de ácidos graxos nas bactérias é a oxidação de acil-CoA para 2-enoil-CoA, a qual é catalisada por FadE. Quando E. coli carece de FadE, ela não cresce em ácidos graxos como fonte de carbono, mas pode crescer em acetato. A incapacidade de utilizar ácidos graxos de qualquer comprimento de cadeia é consistente com o fenótipo relatado de cepas fadE, ou seja, cepas mutantes fadE onde a função FadE é interrompida. O gene fadE pode ser opcionalmente eliminado ou atenuado para assegurar que acil-CoA, o que pode ser uma via de intermediários em uma via de derivado de ácido graxo, pode acumular na célula de tal modo que toda a acil-CoA pode ser eficientemente convertida em derivados de ácido graxo. No entanto, atenuação fadE é opcional quando o açúcar é utilizado como fonte de carbono desde que sob tal expressão de condição de FadE é possivelmente reprimida e FadE, portanto, pode somente estar presente em pequenas quantidades e não é capaz de eficientemente competir com éster sintase ou outras enzimas para substratos de acil-CoA. FadE é reprimida devido à repressão catabólita. E. coli e muitos outros micróbios preferem consumir açúcar sobre os ácidos graxos, por isso, quando ambas as fontes são açúcar disponível é consumida pela primeira vez reprimindo regulão fad (ver D. Clark, J. Bacteriol. (1981) 148(2):521-6)). Além disso, a ausência de açúcares e a presença de ácidos graxos induzem a expressão FadE. Intermediários Acil-CoA podem ser perdidos para a via beta oxidação desde que as proteínas expressas pelo regulão fad (incluindo FadE) são regulados positivamente e irão eficientemente competir por acil-CoAs. Assim, eles podem ser benéficos para ter o gene fadE eliminado ou atenuado. Como a maioria das fontes de carbono são principalmente a base de açúcar, é opcional atenuar FadE. Os códigos do gene fhuA para a proteína TonA, que é um transportador de energia acoplada e receptor na membrana externa de E. coli (V. Braun (2009) J Bacteriol. 191(11):. 3431-3436). Sua eliminação é opcional. A eliminação de fhuA permite que a célula se torne mais resistente ao ataque de fagos que podem ser benéfica em certas condições de fermentação. Assim, pode ser desejável eliminar fhuA numa célula hospedeira que é sujeita à contaminação potencial durante a fermentação é executada.
[00127] Numa outra modalidade, a cepa hospedeira (supra) também engloba sobre-expressão opcional de um ou mais dos seguintes genes incluindo fadR, fabA, fabD, fabG, fabH, FabV, e/ou fabF. Exemplos de tais genes são fadR a partir de Escherichia coli, fabA de Salmonella typhimurium (NP_460041), fabD de Salmonella typhimurium (NP_460164), fabG de Salmonella typhimurium (NP_460165), fabH de Salmonella typhimurium (NP_460163), fabV de Vibrio cholera (YP_001217283), e fabF de Clostridium acetobutylicum (NP_350156). A superexpressão de um ou mais destes genes, que codificam para enzimas e reguladores na biossíntese de ácidos graxos, pode servir para aumentar o título de compostos derivados de ácidos graxos incluindo ácidos w-OH graxos e os seus derivados sob várias condições de cultivo.
[00128] Em outra modalidade, as cepas de E. coli são usadas como células hospedeiras para a produção de ácidos w-OH graxos e seus derivados. Similarmente, estas células hospedeiras fornecem superexpressão opcional de um ou mais genes da biossíntese (ou seja, genes que codificam para enzimas e reguladores de biossíntese de ácidos graxos), que pode ainda aumentar ou melhorar o título de compostos derivados de ácidos graxos tais como os derivados de ácidos graxos (por exemplo, ácidos w-OH graxos e α,w- diácidos, etc.) sob várias condições de cultura, incluindo, mas não limitado a, fadR, fabA, fabD, fabG, fabH, fabV e/ou fabF. Exemplos de alterações genéticas incluem fadR a partir de Escherichia coli, fabA de Salmonella typhimurium (NP_460041), fabD de Salmonella typhimurium (NP_460164), fabG de Salmonella typhimurium (NP_460165), fabH de Salmonella typhimurium (NP_460163), fabV de Vibrio cholera (YP_001217283), e fabF de Clostridium acetobutylicum de (NP_350156). Em algumas modalidades, operons sintéticos que carregam destes genes biossintéticos podem ser manipulados e expressos em células de modo a testar a expressão P450 sob várias condições de cultivo e/ou aumentar ainda mais ácido w-OH graxo e, a produção de a,w-diácido. Tais operons sintéticos contem um ou mais genes biossintéticos. O operon ifab138, por exemplo, é um operon modificado que contém genes biossintéticos de ácidos graxos opcionais, incluindo FABV de Vibrio cholera, fabH de Salmonella typhimurium, fabD de S. typhimurium, fabG de S. typhimurium, fabA de S. typhimurium e/ou fabF de Clostridium acetobutylicum que podem ser utilizados para facilitar a superexpressão de derivados de ácidos graxos, a fim de testar as condições de cultivo específicas. Uma vantagem de tais operons sintéticos é que a taxa de produção do derivado de ácido w- OH graxo pode ser ainda aumentada ou melhorada.
[00129] Em algumas modalidades, as células hospedeiras ou microrganismos que são utilizados para expressar ACP e enzimas biossintéticas (por exemplo, w-hidroxilase, tioesterase, etc.) vão ainda expressar genes que englobam certas atividades enzimáticas que podem aumentar a produção de um ou mais derivado(s) de ácido graxo particular, tais como ácidos w-OH graxos, derivados de ácido w-OH graxo, a,w-diácidos, e semelhantes. Em uma modalidade, a célula hospedeira tem atividade de tioesterase (EC 3.1.2.* ou EC 3.1. 2.14 ou EC 3.1.1.5) para a produção de ácidos graxos que pode ser aumentada por superexpressam o gene. Em outra modalidade, a célula hospedeira tem atividade de éster sintase (EC 2.3.1.75) para a produção de ésteres de ácidos graxos. Em outra modalidade, a célula hospedeira tem atividade acil-ACP redutase (AAR) (EC 1.2.1.80) e/ou atividade de álcool desidrogenase (EC 1.1.1.1.) e/ou atividade álcool graxo de acil-CoA redutase (FAR) (EC 1.1.1.*) e/ou atividade de ácido carboxílico-redutase (CAR) (EC 1.2.99.6) para a produção de álcoois graxos. Em outra modalidade, a célula hospedeira tem atividade de acil-ACP redutase (AAR) (EC 1.2.1.80) para a produção de aldeídos graxos. Em outra modalidade, a célula hospedeira tem atividade de acil-ACP redutase (AAR) (EC 1.2.1.80) e atividade de decarbonilase (ADC) para a produção de alcanos e alquenos. Em outra modalidade, a célula hospedeira tem atividade de acil-CoA-redutase (EC 1.2.1.50), atividade de acil-CoA sintetase (FadD) (EC 2.3.1.86), e atividade de tioesterase (EC 3.1.2.* ou EC 3.1.2.14 ou EC 3.1.1.5) para a produção de álcoois graxos. Em outra modalidade, a célula hospedeira tem atividade de éster sintase (EC 2.3.1.75), atividade de acil-CoA sintetase (FadD) (EC 2.3.1.86), e atividade de tioesterase (EC 3.1.2.* ou EC 3.1.2.14 ou EC 3.1.1.5) para a produção de ésteres graxos. Em outra modalidade, a célula hospedeira tem atividade de OleA para a produção de cetonas. Em outra modalidade, a célula hospedeira tem atividade de OleBCD para a produção de olefinas internas. Em outra modalidade, a célula hospedeira tem atividade de acil-ACP redutase (AAR) (EC 1.2.1.80) e atividade de álcool desidrogenase (EC 1.1.1.1.) Para a produção de álcoois graxos. Em outra modalidade, a célula hospedeira tem atividade tioesterase (EC 3.1.2.* ou EC 3.1.2.14 ou EC 3.1.1.5) e atividade de descarboxilase para produção de olefinas terminais. A expressão das atividades enzimáticas em microrganismos e células microbianas é ensinada pelas patentes US Nos. 8.097.439; 8.110.093; 8.110.670; 8.183.028; 8.268.599; 8.283.143; 8.232.924; 8.372.610; e 8.530.221, que são aqui incorporadas por referência. Em outras modalidades, as células hospedeiras ou de microrganismos que são utilizados para expressar ACP e outras enzimas biossintéticas irão incluir algumas atividades de enzimas nativas que são reguladas positivamente ou superexpressas, a fim de produzir um ou mais derivados de ácido (s) graxo particular, tais como ácido w-OH graxo, derivados de ácido w-OH graxo, e α,w- diácidos. Numa modalidade, a célula hospedeira tem uma atividade de tioesterase nativa (EC 3.1.2.* ou EC 3.1. 2.14 ou EC 3.1.1.5) para a produção de ácidos graxos que podem ser aumentadas superexpressando o gene da tioesterase.
[00130] A presente invenção inclui cepas hospedeiras ou microrganismos que expressam genes que codificam para polipeptídeos de fusão híbrida de CYP153A-redutase e suas variantes, e outras enzimas biossintéticas (supra). As células hospedeiras recombinantes produzem derivados de ácido graxo incluindo derivados de ácidos graxos w-hidroxi (por exemplo, ácidos graxos w-hidroxi incluindo ácidos graxos w-hidroxi livres, ésteres metílicos de ácido graxo w-hidroxi, ácidos graxos w-oxo; ésteres metílicos ácido graxo w-oxi; a,w-diácidos; a,w-dióis; a,w-diésteres, ésteres metílicos de ácidos graxos w-carboxi; ácidos graxos a-amino; e ésteres metílicos de ácidos graxos u-amino) e composições e suas misturas. Os derivados de ácidos graxos são tipicamente recuperados a partir do meio de cultura e/ou são isolados a partir das células hospedeiras. Em uma modalidade, os derivados de ácido graxo são recuperados a partir do meio de cultura (extracelular). Em outra modalidade, os derivados de ácido graxo são isolados a partir das células hospedeiras (intracelular). Em outra modalidade, os derivados de ácido graxo são recuperados a partir do meio de cultura e isolados a partir das células hospedeiras. A composição de derivados de ácidos graxos produzidos por uma célula hospedeira pode ser analisada utilizando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, GC- FID, a fim de determinar a distribuição de determinados derivados de ácidos graxos, bem como comprimentos de cadeia e grau de saturação dos componentes das composições de derivados de ácido graxo tais como ácidos graxos a-hidroxi incluindo ácidos graxos a-hidroxi livres; ésteres metílicos de ácidos graxos a-hidroxi ; ácidos graxos a-oxo; ésteres metílicos de ácidos a-oxo graxos; compostos bifuncionais tais como a,a-diácidos; a,a-dióis; a,a-diésteres; ésteres metílicos de ácidos graxos a-carboxi; ácidos graxos a- amino; ésteres metílicos de ácidos graxos a-amino; e similares.
[00131] Em outras modalidades, as células hospedeiras ou de microrganismos que são utilizados para expressar ACP e outras enzimas biossintéticas irão incluir algumas atividades de enzimas nativas que são reguladas positivamente ou superexpressas, a fim de produzir um ou mais derivados de ácido graxo particular incluindo derivados de ácidos graxos w-hidroxi (por exemplo, ácidos graxos w-hidroxi incluindo os ácidos graxos w-hidroxi livres, ésteres metílicos de ácidos graxos w-hidroxi, ácidos graxos u-oxo; ésteres metílicos de ácidos graxos u- oxo; compostos bifuncionais tais como, a,w-diácidos, α,w- dióis; α,w- diésteres, ésteres metílicos de ácidos graxos w-carboxi; ácidos graxos w-amino; e ésteres metílicos de ácidos graxos w-amino). Numa modalidade, a célula hospedeira tem uma atividade de tioesterase nativa (EC 3.1.2.* ou EC 3.1.2.14 ou EC 3.1.1.5) para a produção de ácidos graxos que pode ser aumentada superexpressando o gene da tioesterase.
Células hospedeiras recombinantes e fermentação
[00132] De modo a produzir os derivados de ácidos graxos w-hidroxi, um número de modificações foram feitos para a produção de células hospedeiras (supra). Assim, a invenção proporciona células hospedeiras recombinantes que foram modificadas para proporcionar uma via de biossíntese de ácido w-graxo relativa a células hospedeiras não manipuladas ou nativas (por exemplo, células hospedeiras do tipo selvagem que funcionam como células de controle), o que é conseguido, por exemplo, através de melhorias da cepa específica. Os organismos hospedeiros de produção da presente invenção incluem plantas, animais ou células microbianas. Os microrganismos ou células microbianas tais como, bactérias, cianobactérias, leveduras, algas, ou fungos filamentosos, podem ser utilizados como hospedeiros de produção. Exemplos não limitativos de microrganismos que podem ser utilizados como hospedeiros de produção incluem E. coli, S. cerevisiae, e outros (infra). Cepas microbianas eficientemente convertem a glicose ou outras fontes de carbono a partir de uma matéria-prima renovável em ácidos graxos ou ésteres de ácidos graxos, tais como os ésteres metílicos de ácidos graxos (FAMEs), ésteres etílicos de ácidos graxos (FAEEs) e álcoois graxos (FALC). De modo a conseguir isso, as cepas foram cuidadosamente manipuladas para expressar as enzimas chave, incluindo tioesterases (por exemplo, TesA a partir de E. coli) para a produção de ácidos graxos, ou éter sintases (por exemplo, ES9 a partir de M. hydrocarbonoclasticus) para a produção de FAME. Os protocolos e procedimentos para fermentações de elevada densidade para a produção de vários compostos foram estabelecidos (ver Patentes US Nos 8.372.610; 8.323.924; 8.313.934; 8.283.143; 8.268.599; 8.183.028; 8.110.670; 8.110.093; e 8.097.439, aqui incorporada por referência).
[00133] As etapas enzimáticas aqui discutidas podem ser adicionadas a estes microrganismos que funcionam como biocatalisadores utilizando técnicas de engenharia genética para criar novos microrganismos com a capacidade para produzir os derivados de ácidos graxos bifuncionais, tais a,a-diácidos, como mostrado nas Figuras 1 e 2 , bem como a,w-dióis como mostrado nas Figuras 3 e 4. Os produtos são esperados para serem secretados fora das células, permitindo a fácil colheita por meio de centrifugação. Determinadas etapas enzimáticas recombinantes podem ser combinadas em um microrganismo para a produção direta de compostos específicos, tais como ácido 12-amino láurico ou éster metílico do ácido 12-amino láurico como ilustrado nas Figuras 1 e 2. Em alternativa, as biotransformações utilizando intermediários produzidos a partir de recursos renováveis podem ser aplicadas nos métodos de fermentação da presente invenção. Por exemplo, éster metílico do ácido láurico obtido a partir de um microrganismo recombinante que expressa as enzimas, tais como uma tioesterase ou éster sintase pode ser alimentado a um microrganismo recombinante que expressa as enzimas, tais como álcool desidrogenase ou oxidase; amino transferase ou transaminase; e/ou esterase ou lipase. Como tal, uma entidade química que foi obtida a partir de um microrganismo recombinante que expressa determinadas enzimas que catalisam certas etapas, que pode ser alimentada com ainda outro microrganismo recombinante expressando enzimas que catalisam outras etapas. Assim, as células hospedeiras proporcionam um sistema de produção em que os intermediários são intercambiáveis e procedimentos de fermentação podem ser aplicados a todas as células hospedeiras a fim de gerar os derivados de ácidos w- hidroxi graxos desejados. Notavelmente, os métodos para produzir de forma eficiente e direta derivados de ácidos graxos w-hidroxi, tais como, por exemplo, a,w-diácidos; a,w-dióis; ou ácidos graxos w-amino de glicose ou outras matérias-primas renováveis que não sejam os ácidos graxos exógenos ou parafinas não existiam até agora. No entanto, estes derivados de ácidos graxos bifuncionais são precursores importantes para a síntese de polímeros. O método baseado em fermentação para a produção de derivados de ácidos graxos w-hidroxi, tal como aqui apresentada fornece uma alternativa rápida e amigável do ambiente com métodos químicos empregados na técnica.
[00134] O presente método fornece a produção direta de derivados de ácido graxo w-hidróxi a partir de uma fonte de carbono derivada de matérias-primas renováveis (por exemplo, carboidratos de milho, cana, ou biomassa lignocelulósica; ou produtos residuais, tais como glicerol, gás de combustão, gás de síntese, ou a reforma de materiais orgânicos tal como biomassa). Em uma modalidade, o método se baseia em fontes alternativas renováveis e econômicas para a produção destes produtos químicos importantes. O método inclui a produção de derivados de ácido graxo w- hidróxi fornecendo um microrganismo recombinante (por exemplo, célula hospedeira) em um caldo de fermentação; adição de uma matéria-prima renovável a um caldo de fermentação; e isolamento do derivado de ácido graxo w- hidróxi do caldo de fermentação. A célula hospedeira de um microrganismo particular inclui uma via que foi manipulada para expressar, pelo menos, duas sequências de ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo incluindo uma tioesterase ou um éster sintase e uma w-hidroxilase.
[00135] Conforme aqui utilizado, o termo fermentação amplamente se refere à conversão dos materiais orgânicos em substâncias alvo pelas células hospedeiras, por exemplo, a conversão de uma fonte de carbono derivada de uma matéria- prima renovável por células hospedeiras recombinantes em derivados de ácido graxo w-OH e composições dos mesmos através da propagação de uma cultura de células hospedeiras recombinantes em meio que compreende uma fonte de carbono. As condições permissivas para a produção referem-se a quaisquer condições que permitam que uma célula hospedeira produza um produto desejado, tais como os derivados de ácido graxo w-OH. Similarmente, a condição ou condições em que a sequência de polinucleotídeo de um vetor é expressa significam quaisquer condições que permitam que uma célula hospedeira sintetize um polipeptídeo. As condições adequadas incluem, por exemplo, as condições de fermentação. Condições de fermentação podem incluir vários parâmetros incluindo, mas não se limitando a, variações de temperatura, níveis de aeração, taxas de alimentação e composição do meio. Cada uma destas condições, individualmente e em combinação, permite que a célula hospedeira cresça. A fermentação pode ser aeróbia, anaeróbia, ou suas variações (tal como microaeróbica). Exemplos de meio de cultura incluem caldos ou géis. Geralmente, o meio inclui uma fonte de carbono que pode ser metabolizada por uma célula hospedeira diretamente. Além disso, enzimas podem ser usadas no meio para facilitar a mobilização (por exemplo, a despolimerização da celulose ou amido em açúcares fermentáveis) e subsequente metabolismo da fonte de carbono.
[00136] Para a produção em pequena escala, as células hospedeiras manipuladas podem ser cultivadas em lotes de, por exemplo, cerca de 100 μL, 200 μL, 300 μL, 400 μL, 500 μL, 1 mL, 5 mL, 10 mL, 15 mL, 25 mL, 50 mL, 75 mL, 100 mL, 500 mL, 1L, 2L, 5L ou 10L; fermentadas; e induzidas para expressar uma sequência de polinucleotídeos desejada, tal como uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo de fusão híbrida de CYP153A-redutase sozinho ou em combinação com outras funcionalidades enzimáticas. Para produção em grande escala, as células hospedeiras manipuladas podem ser cultivadas em lotes de cerca de 10 L, 100 L, 1000 L, 10.000 L, 100.000 L, e 1.000.000 L ou maior; fermentados; e induzidas para expressar uma sequência de polinucleotídeos desejada. Alternativamente, fermentação em lote com alimentação em grande escala pode ser realizada. As composições derivadas de ácidos graxos w-OH aqui descritas são encontradas no ambiente extracelular da cultura de células hospedeiras recombinantes e podem ser facilmente isoladas a partir do meio de cultura. Um ácido graxo w-OH ou seu derivado pode ser secretado pela célula hospedeira recombinante, transportado para o ambiente extracelular ou passivamente transferido para o ambiente extracelular da cultura de células hospedeiras recombinantes. O ácido graxo w-OH ou seu derivado é isolado a partir de uma cultura de células hospedeiras recombinantes utilizando métodos de rotina conhecidos na técnica.
[00137] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é cultivada em um meio de cultura que compreende uma concentração inicial de uma fonte de carbono tal como uma matéria-prima renovável de cerca de 2 g/L a cerca de 100 g/L. Em outras modalidades, o meio de cultura compreende uma concentração inicial de cerca de 2 g/L a cerca de 10 g/L de uma fonte de carbono, de cerca de 10 g/L a cerca de 20 g/L de uma fonte de carbono, de cerca de 20 g/L a cerca de 30 g/L de uma fonte de carbono, de cerca de 30 g/L a cerca de 40 g/L de uma fonte de carbono, ou de cerca de 40 g/L a cerca de 50 g/L de uma fonte de carbono. Em algumas modalidades, a fermentação pode ser monitorada para o nível da fonte de carbono no meio de cultura. Em algumas modalidades, o método inclui ainda a adição de uma fonte de carbono suplementar ao meio de cultura quando o nível da fonte de carbono no meio é inferior a cerca de 0,5 g/L. Em algumas modalidades, a fonte de carbono suplementar é adicionada ao meio de cultura quando o nível da fonte de carbono no meio é inferior a cerca de 0,4 g/L, inferior a cerca de 0,3 g/L, inferior a cerca de 0,2 g/L, ou inferior a cerca de 0,1 g/L. Em algumas modalidades, a fonte de carbono suplementar é adicionada para manter um nível da fonte de carbono de cerca de 1 g/L a cerca de 25 g/L. Em algumas modalidades, a fonte de carbono suplementar é adicionada para manter um nível da fonte de carbono de cerca de 2 g/L ou mais (por exemplo, cerca de 2 g/L ou mais, cerca de 3 g/L ou mais, cerca de 4 g/L ou mais). Em certas modalidades, a fonte de carbono suplementar é adicionada para manter um nível da fonte de carbono de cerca de 5 g/L ou menos (por exemplo, cerca de 5 g/L ou menos, cerca de 4 g/L ou menos, cerca de 3 g/L ou menos). Em algumas modalidades, a fonte de carbono suplementar é adicionada para manter um nível da fonte de carbono de cerca de 2 g/L a cerca de 5 g/L, de cerca de 5 g/L a cerca de 10 g/L, ou de cerca de 10 g/L a cerca de 25 g/L. Em algumas modalidades, a fonte de carbono é glicose ou outro tipo de matéria-prima renovável tal como glicerol.
[00138] Em algumas modalidades, o derivado de ácido graxo w-hidróxi é produzido a uma concentração de cerca de 1 g/L a cerca de 200 g/L. Em algumas modalidades, o derivado de ácido graxo w-hidróxi é produzido a uma concentração de cerca de 1 g/L ou mais (por exemplo, cerca de 1 g/L ou mais, cerca de 10 g/L ou mais, cerca de 20 g/L ou mais, cerca de 50 g/L ou mais, cerca de 100 g/L ou mais). Em algumas modalidades, o derivado de ácido graxo w- hidróxi é produzido a uma concentração de cerca de 1 g/L a cerca de 17 g/L, de cerca de 1 g/L a cerca de 10 g/L , de cerca de 40 g/L a cerca de 170 g/L, de cerca de 100 g/L a cerca de 170 g/L, de cerca de 10 g/L a cerca de 100 g/L , de cerca de 1 g/L a cerca de 40 g/L, de cerca de 40 g/L a cerca de 100 g/L, ou de cerca de 1 g/L a cerca de 100 g/L.
[00139] Em algumas modalidades, o derivado de ácido graxo a-hidróxi é produzido em uma titulação e cerca de 25 mg/L, cerca de 50 mg/L, cerca de 75 mg/L, cerca de 100 mg/L, cerca de 125 mg/L, cerca de 150 mg/L, cerca de 175 mg/L, cerca de 200 mg/L, cerca de 225 mg/L, cerca de 250 mg/L, cerca de 275 mg/L, cerca de 300 mg/L, cerca de 325 mg/L, cerca de 350 mg/L, cerca de 375 mg/L, cerca de 400 mg/L, cerca de 425 mg/L, cerca de 450 mg/L, cerca de 475 mg/L, cerca de 500 mg/L, cerca de 525 mg/L, cerca de 550 mg/L, cerca de 575 mg/L, cerca de 600 mg/L, cerca de 625 mg/L, cerca de 650 mg/L, cerca de 675 mg/L, cerca de 700 mg/L, cerca de 725 mg/L, cerca de 750 mg/L, cerca de 775 mg/L, cerca de 800 mg/L, cerca de 825 mg/L, cerca de 850 mg/L, cerca de 875 mg/L, cerca de 900 mg/L, cerca de 925 mg/L, cerca de 950 mg/L, cerca de 975 mg/L, cerca de 1000 mg/L, cerca de 1050 mg/L, cerca de 1075 mg/L, cerca de 1100 mg/L, cerca de 1125 mg/L, cerca de 1150 mg/L, cerca de 1175 mg/L, cerca de 1200 mg/L, cerca de 1225 mg/L, cerca de 1250 mg/L, cerca de 1275 mg/L, cerca de 1300 mg/L, cerca de 1325 mg/L, cerca de 1350 mg/L, cerca de 1375 mg/L, cerca de 1400 mg/L, cerca de 1425 mg/L, cerca de 1450 mg/L, cerca de 1475 mg/L, cerca de 1500 mg/L, cerca de 1525 mg/L, cerca de 1550 mg/L, cerca de 1575 mg/L, cerca de 1600 mg/L, cerca de 1625 mg/L, cerca de 1650 mg/L, cerca de 1675 mg/L, cerca de 1700 mg/L, cerca de 1725 mg/L, cerca de 1750 mg/L, cerca de 1775 mg/L, cerca de 1800 mg/L, cerca de 1825 mg/L, cerca de 1850 mg/L, cerca de 1875 mg/L, cerca de 1900 mg/L, cerca de 1925 mg/L, cerca de 1950 mg/L, cerca de 1975 mg/L, cerca de 2000 mg/L (2 g/L), 3 g/L, 5 g/L, 10 g/L , 20 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L ou uma faixa limitada por quaisquer dois dos valores precedentes. Em outras modalidades, um derivado de ácido u-graxo é produzido com uma titulação superior a 100g/L, superior a 200 g/L, superior a 300 g/L, ou maior, tais como 500 g/L, 700 g/L, 1,000 g/L, 1200 g/L, 1500 g/L, ou 2000 g/L. O título preferido de derivado de ácido graxo u-hidróxi produzido por uma célula hospedeira recombinante de acordo com os métodos da presente invenção é de 5 g/L a 200 g/L, 10 g/L a 150 g/L, 20 g/L a 120 g/L e 30 g/L a 100 g/L. Em uma modalidade, o título de derivado de ácido graxo u- hidróxi produzido por uma célula hospedeira recombinante de acordo com os métodos da invenção é de cerca de 1 g/L a cerca de 250 g/L e, mais particularmente, de 90 g/L a cerca de 120g/L. O título pode se referir a um derivado de ácido u-graxo ou uma combinação de derivados de ácido u-graxo produzido por uma cultura de células hospedeiras recombinantes fornecidas.
[00140] Em outras modalidades, as células hospedeiras manipuladas para produzir derivados de ácido graxo u- hidróxi de acordo com os métodos da invenção tem um rendimento de pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18%, pelo menos 19%, pelo menos 20%, pelo menos 21%, pelo menos 22%, pelo menos 23%, pelo menos 24%, pelo menos 25%, pelo menos 26%, pelo menos 27%, pelo menos 28%, pelo menos 29%, ou, pelo menos, 30%, ou pelo menos 40% ou uma faixa limitada por quaisquer dois dos valores precedentes. Em outras modalidades, um derivado ou derivados de ácido graxo w-hidróxi é produzido com um rendimento de mais de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais. Alternativamente, ou em adição, o rendimento é de cerca de 30% ou menos, cerca de 27% ou menos, cerca de 25% ou menos, ou cerca de 22% ou menos. Assim, o rendimento pode ser limitado por qualquer um dos dois pontos da extremidade acima. Por exemplo, o rendimento de um derivado ou derivados de ácido graxo w- hidróxi produzidos pela célula hospedeira recombinante de acordo com os métodos da invenção pode ser de 5% a 15%, 10% a 25%, 10% a 22%, 15% a 27%, 18% e 22%, de 20% a 28%, ou 20% a 30%. Em uma modalidade particular, o rendimento de um derivado ou derivados de ácido graxo w-hidróxi ou derivados produzidos pela célula hospedeira recombinante é de cerca de 10% a cerca de 40%. Em outra modalidade particular, o rendimento de um derivado ou derivados de ácido graxo w- hidróxi produzidos pela célula hospedeira recombinante é de cerca de 25% a cerca de 30%. O rendimento pode se referir a uma combinação de derivado de ácido graxo w-hidróxi particular ou uma combinação de derivados de ácido graxo w- hidróxi produzidos por uma cultura de células hospedeiras recombinantes fornecidas. Além disso, o rendimento será também dependente da matéria-prima utilizada.
[00141] Em algumas modalidades, a produtividade de um derivado ou derivados de ácido graxo w-hidróxi produzidos por uma célula hospedeira recombinante é pelo menos 100 mg/L/hora, pelo menos 200 mg/L/hora, pelo menos 300 mg/L/ hora, pelo menos 400 mg/L/hora, pelo menos 500 mg/L/hora, pelo menos, 600 mg/L/hora, pelo menos 700 mg/L/hora, pelo menos, 800 mg/L/hora, pelo menos 900 mg/L/hora, pelo menos, 1000 mg/L/hora, pelo menos, 1100 mg/L/hora, pelo menos, 1200 mg/L/hora, pelo menos, 1300 mg/L/hora, pelo menos, 1400 mg/L/hora, pelo menos, 1500 mg/L/hora, pelo menos 1600 mg/L/hora, pelo menos 1700 mg/L/hora, pelo menos, 1800 mg/L/hora, pelo menos, 1900 mg/L/hora, pelo menos 2000 mg/L/hora, pelo menos, 2100 mg/L/hora, pelo menos, 2200 mg/L/hora, pelo menos 2300 mg/L/hora, pelo menos, 2400 mg/L/hora, ou, pelo menos, 2500 mg/L/hora. Por exemplo, a produtividade de um derivado ou derivados de ácido graxo w- hidróxi produzidos por uma célula hospedeira recombinante de acordo com os métodos da invenção pode ser de 500 mg/L/hora a 2500 mg/L/hora, ou de 700 mg/L/hora a 2000 mg/L/hora. Em uma modalidade particular, a produtividade é de cerca de 0,7 g/L/h a cerca de 3 g/L/h. A produtividade pode se referir a um derivado de ácido graxo w-hidróxi em particular ou uma combinação de derivados de ácido graxo w- hidróxi produzidos por uma cultura de células hospedeiras recombinantes fornecidas.
[00142] Estratégias para aumentar a produção de composições de ácido graxo w-OH por células hospedeiras recombinantes incluem o aumento do fluxo através da via de biossíntese de ácido graxo pela expressão de um gene de fusão híbrida de CYP153A-redutase e um gene da tioesterase no hospedeiro de produção. Como aqui utilizado, o termo célula hospedeira recombinante ou célula hospedeira refere- se a uma célula hospedeira, cuja composição genética foi alterada em relação à célula hospedeira de tipo selvagem correspondente, por exemplo, pela introdução deliberada de novos elementos genéticos e/ou modificação deliberada de elementos genéticos presentes naturalmente na célula hospedeira. A descendência de tais células hospedeiras recombinantes também contêm estes novos elementos genéticos e/ou modificados. Em qualquer um dos aspectos da invenção aqui descrito, a célula hospedeira pode ser selecionada a partir de uma célula de planta, célula de inseto, célula de fungo (por exemplo, um fungo filamentoso, tal como Candida sp., ou uma levedura de germinação, tal como Saccharomyces sp.), uma célula de alga e uma célula bacteriana. Em uma modalidade, as células hospedeiras recombinantes são microrganismos recombinantes. Exemplos de células hospedeiras que são microrganismos incluem, mas não estão limitadas a células do gênero Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Zymomonas, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophamonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia ou Streptomyces. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula bacteriana gram-positiva. Em outras modalidades, a célula hospedeira é uma célula bacteriana gram-negativa. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de E.coli. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de E.coli B, uma célula de E.coli C, uma célula de E.coli K, ou uma célula E.coli W. Em outras modalidades, a célula hospedeira é uma célula de Bacillus lentus, uma célula de Bacillus brevis, uma célula de Bacillus stearothermophilus, uma célula de Bacillus lichenoformis, uma célula de Bacillus alkalophilus, uma célula de Bacillus coagulans, uma célula de Bacillus circulans, uma célula de Bacillus pumilis, uma célula de Bacillus thuringiensis, uma célula de Bacillus clausii, uma célula de Bacillus megaterium, uma célula de Bacillus subtilis, ou uma célula de Bacillus amyloliquefaciens. Em outras modalidades, a célula hospedeira é uma célula de Trichoderma koningii, uma célula de Trichoderma viride, uma célula de Trichoderma reesei, uma célula de Trichoderma longibrachiatum, uma célula de Aspergillus awamori, uma célula de Aspergillus fumigatus, uma célula de Aspergillus foetidus, uma célula de Aspergillus nidulans, uma célula de Aspergillus niger, uma célula de Aspergillus oryzae, uma célula de Humicola insolens, uma célula de Humicola lanoso, uma célula de Rhodococcusopacus, uma célula de Rhizomucormiehei, ou uma célula de Mucormichei. Ainda em outras modalidades, a célula hospedeira é uma célula de Streptomyces lividans ou uma célula de Streptomyces murinus. Ainda em outras modalidades, a célula hospedeira é uma célula de Actinomycetes. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de Saccharomyces cerevisiae.
[00143] Em outras modalidades, a célula hospedeira é uma célula de planta eucariótica, uma célula de alga, uma célula cianobactéria, uma célula de bactéria verde-enxofre, uma célula de bactéria verde de não enxofre, uma célula de bactéria roxa de enxofre, uma célula de bactéria roxa de não enxofre, uma célula extremófila, uma célula de levedura, uma célula de fungo, uma célula modificada de qualquer uma das espécies aqui descritas, ou um organismo sintético. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é dependente da luz ou fixa carbono. Em algumas modalidades, a célula hospedeira tem atividade autotrófica. Em algumas modalidades, a célula hospedeira tem atividade fotoautotrófica, tal como na presença de luz. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é heterotrófica ou mixotrófica na ausência de luz. Em certas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de Arabidopsis thaliana, Panicum virgatum, Miscanthus giganteus, Zea mays, Botryococcuse braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Dunaliela salina, Synechococcus Sp. PCC 7002, Synechococcus Sp. PCC 7942, Synechocystis Sp. PCC 6803, Thermosynechococcus elongates BP-1, Chlorobium tepidum, Chlorojlexus auranticus, Chromatiumm vinosum, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter capsulatus, Rhodopseudomonas palusris, Clostridium ljungdahlii, Clostridium thermocellum, Penicillium chrysogenum, Pichiapastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pseudomonas fluorescens, ou Zymomonas mobilis. Em uma modalidade, a célula microbiana é de uma cianobactéria, incluindo, mas não se limitando a, Prochlorococcus, Synechococcus, Synechocystis, Cyanothece, Nostoc punctiforme. Em outra modalidade, a célula microbiana é de uma espécie de cianobactérias específicas incluindo, mas não se limitando a, Synechococcus elongatus PCC7942, Synechocystis sp. PCC6803, e Synechococcus sp. PCC7001.
Produtos derivados de microrganismos recombinantes
[00144] Como aqui utilizado, a fração de carbono modem de fM tem o mesmo significado como definido pelo Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST) Materiais de Referência Padrão (SRMs4990B e 4990C, conhecido como padrões de ácidos oxálicos HOxI e HOxII, respectivamente. A definição fundamental refere-se a 0,95 vezes a proporção de isótopo 14C/12C de HOxI (com referência a AD 1950). Isso é aproximadamente equivalente a madeira da revolução pré- industrial com correção de decadência. Para a atual biosfera viva (material vegetal), fM é aproximadamente 1.1. Bioprodutos (por exemplo, os derivados de ácido graxo incluindo ácidos graxos w-OH e derivados produzidos em conformidade com a presente invenção) incluem compostos orgânicos biologicamente produzidos. Em particular, os derivados de ácido graxo (por exemplo, ácidos graxos w-OH e seus derivados) produzidos através da via biossintética de ácido graxo aqui, não tem sido produzidos a partir de fontes renováveis e, como tal, são novas composições de matéria. Estes novos bioprodutos podem ser distinguidos a partir de compostos orgânicos derivados do carbono petroquímico com base nas impressões digitais isotópica- carbono duplo ou datação com 14C. Além disso, a fonte específica de carbono biofornecido (por exemplo, glicose vs. glicerol) pode ser determinada por impressão digital isotópica-carbono (ver, por exemplo, patente US n° 7.169.588). A capacidade de distinguir bioprodutos a partir de compostos orgânicos à base de petróleo é benéfica na localização destes materiais no comércio. Por exemplo, os compostos orgânicos ou produtos químicos, incluindo ambos perfis de isótopo de carbono baseado em petróleo e baseado biologicamente podem ser distinguidos dos compostos orgânicos e produtos químicos produzidos apenas de materiais à base de petróleo. Assim, os bioprodutos aqui podem ser seguidos ou localizados no comércio com base no seu perfil de isótopo de carbono único. Bioprodutos podem ser distinguidos a partir de compostos orgânicos à base de petróleo através da comparação da proporção de isótopo de carbono estável (13C/12C) em cada amostra. A proporção de 13C/12C em um dado bioproduto é uma consequência da proporção de 13C/12C em dióxido de carbono atmosférico no momento em que o dióxido de carbono é fixo. Ela também reflete a via metabólica precisa. As variações regionais também ocorrem. Petróleo, plantas C3 (a folha larga), plantas C4 (as gramíneas) e carbonatos marinhos todos mostram diferenças significativas em 13C/12C e os valores de δ13C correspondentes. Além disso, a matéria lipídica de plantas C3 e C4 analisam de forma diferente do que materiais derivados dos componentes de carboidratos das mesmas plantas como consequência da via metabólica. Dentro da precisão de medição, 13C mostra grandes variações devido a efeitos de fracionamento isotópico, o mais significante dos quais para bioprodutos é o mecanismo de fotossíntese. A principal causa das diferenças na proporção de isótopo de carbono em plantas está intimamente associada com as diferenças na via de metabolismo do carbono fotossintético nas plantas, em particular a reação ocorrendo durante a carboxilação primária (isto é, a fixação inicial de CO2 atmosférico). Duas grandes classes de vegetação são aquelas que incorporam o ciclo fotossintético C3 (ou Calvin-Benson) e aqueles que incorporam o ciclo fotossintético C4 (ou Hatch-Slack). Em plantas C3, a fixação de CO2 primário ou reação de carboxilação envolve a enzima ribulose-1,5- difosfato carboxilase, e o primeiro produto estável é um composto de 3 carbonos. Plantas C3, tais como folhosas e coníferas, são dominantes nas zonas de clima temperado. Em plantas C4, uma reação de carboxilação adicional envolvendo uma outra enzima, fosfoenol-piruvato carboxilase, é a reação de carboxilação primária. O primeiro composto de carbono é um ácido estável com 4 carbonos que é subsequentemente descarboxilado. O CO2 assim liberado é refixado pelo ciclo C3. Exemplos de plantas C4 são gramíneas tropicais, milho e cana-de-açúcar. Ambas plantas C4 e C3 plantas apresentam uma faixa de proporções isotópicas 13C/12C, mas os valores típicos são cerca de -7 a -13 por mil para plantas C4 e cerca de -19 a cerca de -27 por mil para plantas C3 (ver, por exemplo, Stuiver et al. (1977) Radiocarbon 19:355). Carvão e petróleo se enquadram geralmente nessa última faixa. A escala de medição de 13C foi originalmente definida por um conjunto de zero por calcário de formação de Pee Dee (PDB), onde os valores são dados em partes por mil desvios desse material. Os valores de δ13C são expressos em partes por mil (por mil), abreviados,%, e são calculados como se segue: δ13C(%)= [(13C/12C)amostra-(13C/12C)padrão]/( 13C/12C)padrão x 1000
[00145] Uma vez que o material de referência PDB (RM) foi exaurido, uma série de RMs alternativos foram desenvolvidos em cooperação com a IAEA, USGS, NIST, e outros laboratórios de isótopos internacionais selecionados. Notações para os desvios por mil de PDB é δ13C. Medições são feitas em CO2 por espectrometria de massa de proporção estável de alta precisão (IRMS) em íons moleculares de massas 44, 45, e 46. As composições descritas aqui incluem bioprodutos produzidos por qualquer um dos métodos aqui descrito, incluindo, por exemplo, produtos derivados de ácido graxo. Especificamente, o bioproduto pode ter um δ13C de cerca de -28 ou maior, cerca de - 27 ou maior, -20 ou maior, -18 ou maior, -15 ou maior, -13 ou maior, -10 ou maior, ou -8 ou maior. Por exemplo, o bioproduto pode ter um δ13C de cerca de -30 a cerca de -15, cerca de -27 a cerca de -19, cerca de -25 a cerca de -21, cerca de -15 a cerca de -5, cerca de -13 a cerca de -7, ou cerca de -13 a cerca de -10. Em outros casos, o bioproduto pode ter um δ13C de cerca de -10, -11, -12, ou -12,3. Bioprodutos produzidos de acordo com a invenção aqui também podem ser distinguidos a partir de compostos orgânicos à base de petróleo através da comparação da quantidade de 14C em cada composto. Porque 14C tem uma meia-vida nuclear de 5730 anos, os combustíveis à base de petróleo contendo carbono mais antigo podem ser distinguidos de bioprodutos que contêm carbono mais novo (ver, por exemplo, Currie, Source Apportionment of Atmospheric Particles, Characterization of Environment Particles, J. Buffle e HP van Leeuwen, Eds., 1 de Vol. I da IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series (Lewis Publishers, Inc.), 3-74, (1992)). O pressuposto básico na datação por radiocarbono é que a constância da concentração de 14C na atmosfera leva à constância de 14C em organismos vivos No entanto, por causa dos testes nucleares na atmosfera desde 1950 e a queima de combustíveis fósseis desde 1850, 14C adquiriu uma segunda característica de tempo geoquímica. Sua concentração em CO2 atmosférico, e, portanto, na biosfera viva, aproximadamente dobrou no pico do teste nuclear, em meados dos anos 1960. Ele tem gradualmente retornado à taxa de isótopo da linha de base (atmosférica) cosmogônica em estado estacionário (14C/12C) de cerca de 1,2 x 10-12, com uma "meia-vida" de relaxamento aproximada de 7 a 10 anos. Essa última meia- vida não deve ser tomada literalmente; em vez disso, deve- se usar a função de entrada/decaimento nuclear atmosférico detalhado para rastrear a variação de 14C atmosférico e biosférico desde o início da era nuclear. É essa última característica de tempo de 14C biosférico que mantém a promessa de datação anual de carbono recente da biosfera. 14C pode ser medido por espectrometria de massa com acelerador (AMS), com os resultados apresentados em unidades de fração de carbono modern (fM). fM é definido pelo Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST) Materiais de Referência Padrão (MRE) e 4990B 4990C. Como aqui utilizada, fração de carbono modern ou fM tem o mesmo significado como definido pelo Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST) Materiais de Referência Padrão (MRE) 4990B e 4990C, conhecidos padrões de ácidos oxálicos HOxI e HOxII, respectivamente. A definição fundamental refere-se a 0,95 vezes a proporção de isótopo 14C/12C de HOxI (com referência a AD 1950). Isso é aproximadamente equivalente à madeira da Revolução pré-industrial corrigido pelo decaimento. Para a atual biosfera viva (material vegetal), fM é de aproximadamente 1,1. As composições descritas aqui incluem bioprodutos que podem ter um fM14C de pelo menos cerca de 1. Por exemplo, o bioproduto da invenção pode ter um fM14C de pelo menos cerca de 1,01, um fM14C de cerca de 1 a cerca de 1,5, um fM14C de cerca de 1,04 a cerca de 1,18, ou um fM14C de cerca de 1,111 para cerca de 1,124.
[00146] Outra medição de 14C é conhecida como sendo a percentagem de carbono modern (pMC). Para um arqueólogo ou um geólogo usando datas de 14C, AD 1950 igual a zero anos de idade. Isso também representa 100 pMC. Bomba de carbono na atmosfera atingiu quase o dobro do nível normal em 1963 no auge de armas termonucleares. Sua distribuição dentro da atmosfera tem sido aproximada desde o seu aparecimento, mostrando valores que são maiores que 100 pMC para as plantas e animais que vivem desde AD 1950. Ela diminuiu gradualmente ao longo do tempo com o valor de hoje estando próximo de 107,5 pMC. Isso significa que um material de biomassa fresco, tal como milho, daria uma assinatura 14C próxima de 107,5 pMC. Compostos à base de petróleo terá um valor pMC de zero. Combinando carbono fóssil com o carbono do dia atual irá resultar em uma diluição do teor de pMC do dia atual. Presumindo 107,5 pMC representa o teor de 14C de materiais de biomassa do dia atual e O pMC representa o teor de 14C de produtos à base de petróleo, o valor de pMC medido para aquele material irá refletir as proporções dos dois tipos de componentes. Por exemplo, um material derivado de 100% de soja apresenta do dia atual poderia fornecer uma assinatura de radiocarbono próximo de 107,5 pMC. Se aquele material foi diluído com 50% de produtos à base de petróleo, daria uma assinatura de radiocarbono de aproximadamente 54 pMC. Um teor de carbono de base biológica é derivado atribuindo 100% igual a 107,5 pMC e 0% igual a 0 pMC. Por exemplo, uma amostra medindo 99 pMC irá dar um teor de carbono equivalente de base biológica de 93%. Esse valor é referido como o resultado médio de carbono de base biológica e assume todos os componentes dentro do material analisado originado ou a partir do material biológico do dia atual ou material à base de petróleo. Um bioproduto compreendendo um ou mais derivados de ácido graxo como aqui descrito pode ter um pMC de pelo menos cerca de 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100. Em outros casos, um derivado de ácido graxo aqui descrito pode ter um pMC de entre cerca de 50 e cerca de 100; cerca de 60 e cerca de 100; cerca de 70 e cerca de 100; cerca de 80 e cerca de 100; cerca de 85 e cerca de 100; cerca de 87 e cerca de 98; ou cerca de 90 e cerca de 95. Em ainda outros exemplos, um derivado de ácido graxo aqui descrito pode ter um pMC de cerca de 90, 91, 92, 93, 94 ou 94,2.
Derivados de ácido graxo w-hidróxi e formulações
[00147] Os compostos tais como derivados de ácido graxo w-hidroxila são moléculas que são valiosas e desejáveis em muitas aplicações industriais. A presente invenção produz tais compostos através de microrganismos recombinantes in vivo e desse modo gera uma faixa de produtos úteis. Tais produtos incluem derivados de ácido graxo w-hidróxi. Os derivados de ácido graxo w-hidróxi incluem, mas não estão limitados para, ácidos graxos w-hidróxi; ésteres metílicos de ácido graxo w-hidróxi; ácidos graxos w-amino; ácidos graxos w-oxo, ésteres metílicos de ácido graxo w-amino; ésteres metílicos de ácido graxo w-oxo; a,w-diácidos; α,w- diésteres; e a,w-dióis assim como suas composições. Enquanto a maioria dos derivados de ácido graxo w-hidróxi são aqui descritos, derivados de ácido graxo w-hidróxi ímpares são também incluídos, tais como aqueles que têm 7, 9, 11, 13, 15, 19, etc., carbonos.
[00148] Exemplos de ácidos graxos w-hidróxi incluem, mas não estão limitados a, ácido octanóico 8-hidróxi, ácido decenóico 10-hidroxi, ácido decanóico 10-hidroxi, ácido dodecenóico 12-hidroxi, ácido dodecanóico 12-hidroxi, ácido tetradecenóico 14-hidroxi, ácido tetradecanóico 14-hidroxi, ácido hexadecenóico 16-hidroxi, ácido hexadecanóico 16- hidroxi, ácido octadecenóico 18-hidroxi, e ácido octadecenóico 18-hidroxi.
[00149] Exemplos de ésteres metílicos de ácido graxo w- hidróxi incluem, mas não estão limitados a, éster metílico de ácido octanóico 8-hidroxi, éster metílico de ácido decenóico 10-hidroxi, éster metílico de ácido decanóico 10- hidroxi, éster metílico de ácido dodecenóico 12-hidroxi, éster metílico de ácido dodecanóico 12-hidroxi, éster metílico de ácido tetradecenóico 14-hidroxi, éster metílico de ácido tetradecanóico 14-hidroxi, éster metílico de ácido hexadecenóico 16-hidroxi, éster metílico de ácido hexadecanóico 16-hidroxi, éster metílico de ácido octadecenóico 18-hidroxi, e éster metílico de ácido octadecanóico 18-hidroxi.
[00150] Exemplos de ácidos graxos w-amino incluem, mas não estão limitados a, ácido octanóico 8-amino, ácido decenóico 10-amino, ácido decanóico 10-amino, ácido dodecenóico 12-amino, ácido dodecanóico 12-amino, ácido tetradecenóico 14-amino, ácido tetradecanóico 14-amino, ácido hexadecenóico 16-amino, ácido hexadecanóico 16-amino, ácido octadecanóico 18-amino e ácido octadecenóico 18- amino.
[00151] Exemplos de ésteres metílicos de ácido graxo w- amino incluem, mas não estão limitados a, éster metílico de ácido octanóico 8-amino, éster metílico de ácido decenóico 10-amino, éster metílico de ácido decanóico de 10-amino, éster metílico de ácido dodecenóico 10-amino, éster metílico de ácido dodecanóico 12-amino, éster metílico de ácido tetradecenóico 14-amino, éster metílico de ácido tetradecanóico 14-amino, éster metílico de ácido hexadecenóico 16-amino, éster metílico de ácido hexadecanóico l6-amino, éster metílico de ácido octadecenóico 18-amino e éster metílico de ácido octadecanóico 18-amino.
[00152] Exemplos de ácidos graxos w-oxo incluem, mas não estão limitados a, ácido octanóico8-oxo, ácido decenóico 10-oxo, ácido decanóico 10-oxo, ácido dodecenóico 12-oxo, ácido dodecanóico 12-oxo, ácido tetradecenóico 14- oxo, ácido tetradecanóico 14-oxo, ácido hexadecenóico 16- oxo, ácido hexadecanóico 16-oxo, ácido octadecanóico 18- oxo, e ácido octadecanóico 18-oxo.
[00153] Exemplos de ésteres metílicos de ácido graxo w- oxo incluem, mas não estão limitados a, éster metílico de ácido octanóico 8-oxo, éster metílico de ácido decenóico 10-oxo, éster metílico de ácido decanóico 10-oxo, éster metílico de ácido dodecenóico 12-oxo, éster metílico de ácido dodecanóico 12-oxo, éster metílico de ácido tetradecenóico 14-oxo, éster metílico de ácido tetradecanóico 14-oxo, éster metílico de ácido hexadecenóico 16-oxo, éster metílico de ácido hexadecanóico 16-oxo, éster metílico de ácido octadecenóico 18-oxo e éster metílico de ácido octadecenóico 18-oxo.
[00154] Exemplos de a,w-diácidos incluem, mas não estão limitados a, ácido 1,8-octanedóico, ácido 1,10- decenodióico, ácido 1,10-decanodióico, ácido 1,12- dodecenodióico, ácido 1,12-dodecanóico, ácido 1,14- tetradeceneodióico, ácido 1,14-tetradecanodióico, ácido 1,16-hexadecenodióico, ácido 1,16-hexadecanodióico, ácido 1,18-octadecenodióico, ácido 1,18-octadecanodióico.
[00155] Exemplos de a,w-diésteres incluem, mas não estão limitados a, diéster metílico 1,8-octanóico, dimetiléster 1,10-decenóico, dimetiléster 1,10-decanóico, dimetiléster 1,12-dodecenóico, dimetiléster 1,12- dodecanóico, dimetiléster 1,14-tetradecenóico, dimetiléster 1,14-tetradecanóico, dimetiléster 1,16-hexadecenóico, dimetiléster 1,16-hexadecanóico, dimetiléster 1,18- octadecenóico, dimetiléster 1,18-octadecanóico.
[00156] Os exemplos de a,w-dióis incluem, mas não estão limitados a, 1,8-octanodiol, 1,10-deceneodiol, 1,10- decanodiol, 1,12-dodecenediol, 1,12-dodecanodiol, 1,14- tetradecenediol, 1,14-tetradecanodiol, 1,16-hexadecenodiol, 1,16-hexadecanodiol, 1,18-octadecenodiol, e 1,18- octadecanodiol.
[00157] Embora os derivados de ácido graxo w-hidróxi de mesma cadeia sejam aqui descritos, derivados de ácido graxo w-hidróxi de cadeia ímpar também estão incluídos, tais como aqueles que têm 7, 9, 11, 13, 15, 19, etc., carbonos. Exemplos de ácido graxo w-hidróxi de cadeia ímpar incluem, mas não estão limitados, por exemplo, ao ácido undecenóico 11-hidroxi, ácido undecanóico 11-hidroxi, ácido tridecenóico 13-hidroxi, ácido tridecanóico 13-hidroxi, ácido pentadecenóico 15-hidroxi, ácido pentadecanóico 15- hidróxi, ácido heptadecenóico 17-hidroxi, e ácido heptadecanóico 17-hidroxi. Exemplos de a,w-diácidos de cadeia ímpar incluem, mas não estão limitados, por exemplo, a ácido 1,11-undecenodióco, ácido 1,11-undecanodióico, ácido 1,13-tridecenodióico, ácido 13-tridecanodióco, ácido 1,15-pentadecenodióico, ácido 1,15-pentadecanodióico, ácido 1,17-heptadecenodióico e ácido 1,17-heptadecanodióco. Exemplos de a,w-dióis de cadeia ímpar incluem, mas não estão limitados, por exemplo, 1,11-undecenodiol, 1,11- undecanodiol, 1,13-tridecenodiol, 13-tridecanodiol, 1,15- pentadecenodiol, 1,15-pentadecanodiol, 1,17-heptadecenodiol e 1,17-heptadecanodiol.
[00158] Os compostos e composições dos derivados de ácido graxo w-hidróxi da presente invenção podem ser formulados de tal modo que os produtos desejados podem ser feitos incluindo flavorizantes, fragrâncias, lubrificantes, géis, vários polímeros, resinas, fluidos industriais, adesivos, inibidores, eletrólitos de capacitor, fibras, curativos de revestimento em pó, plastificantes, revestimentos de poliéster, resinas epóxi, resinas de poliamida, tensoativos, detergentes, aditivos, e mais.
EXEMPLOS
[00159] Os exemplos a seguir ilustram ainda a invenção, mas não devem ser interpretados de forma alguma como limitando o seu escopo.
EXEMPLO 1: Cultivando cepas de E.coli recombinantes para a produção de derivados de ácido graxo w-hidróxi
[00160] As cepas foram cultivadas durante a noite em meio de Luria-Bertani (LB). As culturas foram diluídas 1:10 em meio LB fresco, cultivadas durante 2 a 3 horas (h) a 32°C, e, em seguida, novamente diluídas a 1:10 em meio de FA2 definido (ver Tabela 10, abaixo). Em alguns experimentos, o meio foi suplementado com 0,5 mM de ácido 8-aminolevulínico e uma solução de vitamina traço. Antibióticos, tais como espectinomicina (100 μg/mL) ou canamicina (50 μg/mL) foram adicionados quando cepas contêm plasmídeos com os respectivos marcadores de resistência à antibióticos. Após crescimento durante 4 a 5h a 32°C, as culturas foram induzidas com IPTG a 1 mM e cultivadas para outras l6 a 18h à mesma temperatura. Em alguns experimentos ácido dodecanóico, dodecanol ou éster metílico de ácido dodecanóico foram adicionados a uma concentração final de 1 g/L no momento da indução. As culturas que visam à produção de derivados de ésteres metílicos de ácido graxo foram suplementadas com metanol (2%, v/v) no momento da indução. Tabela 10: Composição do meio de FA2
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EXEMPLO 2: Análise de derivados de ácido graxo Q- hidroxilados
[00161] As culturas que produziram derivados de ácido graxo w-hidróxi foram colhidas e extraídas com acetato de butila utilizando um agitador (DVX-2500 multi-tube vortexer, VWR) a 2500 rpm durante 30 minutos. Extrato foi centrifugado em uma centrífuga Eppendorf (centrífuga 5424) a 15000 rpm durante 15 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante (100 μL) foi pipetado para um frasco de GC com inserto, derivatizado por adição de 100 μL de N,O-bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida (BSTFA) e 1% de trimetilclorosilano (TMCS) e misturou-se utilizando um vortex durante 30 segundos. Os sobrenadantes com e sem derivatização foram ambos injetados no GC-MS separadamente para gerar cromatogramas e espectro de massa para a identificação de composto. Os parâmetros de GC-MS foram os seguintes: Parâmetros de GC: Coluna analítica: DB-LHT, 15m x 250 μm x 0,1 μm, disponível de Agilent com cat# J&W 122-1111E Temperatura do forno: inicial a 50°C, mantida durante 5 minutos, para aumentar a 300°C a 25°C/min, e manter por 5,24 minutos por um tempo total de execução de 24 minutos.
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Combi PAL (CTC analytics) distribuído por LEAP Technologies
[00162] Parâmetros GC/FID: Cromatógrafo gasoso Agilent 7890 equipado com um FID, ou equivalente. Software ChemStation Data System B.04.03 software, ou equivalente. Coluna analítica: DB-1, ou equivalente (10m x 0,18 mm x 0,2 μM), ou equivalente. Auto-amostrador: Combi PAL, CTC analytics (Leap Technologies) Temperatura inicial: 60°C, mantida durante 0,5 minutos, aumentar para 300°C a 25°C/min, e manter 0,9 minutos para o tempo total de execução de 11 minutos
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Exemplo 3: Conversão de ácido dodecanóico em ácido dodecanóico 12(a)-hidróxi por cepas de E.coli expressando dois operons de cyp153A P450 oxigenase
[00163] Esse exemplo mostra a conversão de ácido graxo exogenamente adicionado para ácido graxo w-hidróxi por cepas de E.coli recombinantes que expressam operons de cyp153A P450 oxigenase. O propósito desse experimento foi investigar a eficiência dos operons de cyp153A P450 oxigenases. As cyp153A P450 oxigenases, até agora, só podem ser empregadas in vitro (ver, por exemplo, Honda-Malca et al (2012) Chem. Commun. 48:5115-5117) e o objeto desse experimento foi testar se estes operons poderiam produzir um derivado de ácido graxo w-hidróxi ao ser fornecidos com ácidos graxos exógenos in vivo.
[00164] Os operons de cyp153A de duas bactérias, Marinobacter aquaeoli (Número de Acesso YP_957888; SEQ ID NO: 3), e Mycobacterium marinum (Número de Acesso YP_001851443; SEQ ID NO: 59), foram amplificados por PCR a partir de DNA genômico destes organismos. Os operons são feitas dos genes que codificam ferredoxina (FD), cyp153A P450 oxigenase e ferredoxina redutase (FDR) (ver as Tabelas 2A e 2B, acima). A ordem natural dos genes e regiões intergênicas foram preservadas, mas um códon de partida GTG em cyp153Al6 de M. marinum foi substituído com um códon de partida ATG por PCR-crossover. Os amplímeros de PCR foram clonados em um vetor derivado de pLC1920 (replicon de SC101, marcador de resistência à espectinomicina), de tal forma que a transcrição de operons foi controlada pelo promotor de Ptrc induzível de IPTG. Os plasmídeos resultantes, pAS.Ol7 (ver Tabela 11, abaixo) e pAS.Ol8 foram transformados em E.coli MG 1655 em que ou o gene fadE (que codifica acil-CoA desidrogenase) ou o gene fadD (que codifica acil-CoA sintase) foi excluído. Estas cepas não podem degradar ácidos graxos, assim, aumentando a disponibilidade de ácidos graxos para uma maior conversão no produto pode ser obtida por supressão destes genes ou genes que codificam enzimas de degradação de outros ácidos graxos, tais como fadA ou fadB. Isso é, no entanto, opcional e pode ser implementado quando os ácidos graxos livres são fornecidos exogenamente ou são intermediários da via de um produto. (Tabela 1 (acima) fornece uma lista detalhada de atividade enzimática dentro das vias metabólicas, incluindo várias enzimas de degradação de ácidos graxos que podem ser atenuadas para aumentar a disponibilidade de ácidos graxos em uma cepa hospedeira.) As quatro cepas resultantes encontram-se resumidos na Tabela 12 (abaixo). As cepas foram analisadas para a conversão de ácido dodecanóico em ácido dodecanóico 12- hidroxi como descrito nos Exemplos 1 e 2.
[00165] Em comparação com a cepa de controle MG 1655 ΔfadD, que não expressa um operon de cyp153A, um novo pico em TR 12,303 minutos (após derivatização de BSTFA) foi detectado nos cromatogramas de GC-MS de todas as quatro cepas que expressam os operons de cyp153A (ver a Figura 6, somente as cepas sAS.320 e sAS.321 são mostradas aqui). O espectro de massa do pico em TR 12,303 minutos é mostrado na Figura 7A. O padrão de fragmentação indicou que esse pico era trimetilsilil éster de ácido dodecanóico 12- trimetilsililoxi, que é a forma derivatizada de ácido dodecanóico 12-hidroxi. Fragmentos de íon característicos para trimetilsilil ésteres de ácido graxo 12- trimetilsililoxi são mostrados na Figura 8A. Os íons em m/z = 129, 147, 204 e 217 (não mostrados na figura, mas presentes) são marcadores de diagnóstico úteis para estes compostos. O íon em m/z 255 foi utilizado para determinar o comprimento de cadeia após a perda de CH3 do lado carboxila (m/z = 345) e (CH3)3SiOH do lado hidroxila desse composto (ver figura 8A). A identificação correta desse pico foi ainda confirmada por comparação do seu tempo de retenção e um espectro de massa com trimetilsilil éster de ácido dodecanóico 12-trimetilsililoxi padrão como mostrado na Figura 7B. O espectro de massa desse composto antes da derivatização também foi registado e é apresentado na Figura 7C. Fragmentos de íon característicos do composto não derivatizado são mostrados na Figura 8B. Os íons em m/z = 98 e 84 (mostrados) são marcadores de diagnóstico úteis para ácidos graxos w-hidróxi. O íon em m/z 186 é um fragmento característico de ácido 12-hidroxidodecanóico pela perda de CH2O do lado hidroxila. O íon molecular do composto pode ser determinado como sendo 216 pela adição de CH2O ao íon do fragmento em m/z 186.
[00166] Desse modo, E.coli expressando os operons de cyp153A de Marinobacter aquaeoli e Mycobacterium marinum converteram ácido dodecanóico exógeno em ácido dodecanóico 12-hidroxi in vivo nas células do hospedeiro. Como tal, foi confirmado que a enzima pode de fato produzir derivados de ácido graxo w-hidróxi. No entanto, a eficiência de conversão dessa enzima era bastante baixa. Assim, não se espera que a atividade enzimática dos operons de cyp153A por si só seja ideal para a produção de derivados de ácido graxo w-hidróxi e determinou-se que mais engenharia fosse necessária para conceber uma enzima com uma eficiência de conversão maior. Tabela 11: Plasmídeos de expressão para a produção de derivados de ácido graxo w-hidroxilados
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Tabela 12: Cepas de E.coli que expressam cyp153A recombinante para a conversão de derivados de ácido graxo em derivados de ácido graxo w-hidroxilado
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EXEMPLO 4: Conversão de ácido dodecanóico e ácido dodecanóico 12(w)-hidróxi por uma cepa de E.coli expressando um operon de cyp153A P450 oxigenase modificado
[00167] Esse exemplo mostra a conversão de ácido graxo exogenamente adicionado em ácido graxo w-hidróxi por uma cepa de E.coli recombinante que expressa um operon de cyp153A P450 oxigenase modificado. Similarmente, o propósito desse experimento era investigar a capacidade e eficiência desse operon de cyp153A P450 oxigenase modificado para a produção de derivados de ácido graxo w- hidróxi in vivo.
[00168] Um mutante de cyp153A de M. aquaeoli no qual a glicina 307 foi substituída por alanina foi previamente descrita (ver Malca Ronda et al., (2012) Chem. Commun 48:5115). O plasmídeo pAS.017 (ver Exemplo 3, acima) foi modificado da seguinte maneira: o códon especificando Gly307 de cyp153_Maqu foi mudado de GGC para GCC, especificando Ala, e ainda duas regiões intergênicas nativas (IGRs) do operon de cyp156 foram substituídos com IGRs sintéticos (TAAGGAGGAAAACAAA) (SEQ ID NO: 65). O plasmídeo resultante foi denominado pAS.022 (ver Tabela 11, acima) e foi transformado em E.coli MG 1655 ΔfadD fornecendo cepa sAS.335 (ver Tabela 12, acima). A cepa foi analisada para a conversão de ácido dodecanóico em ácido dodecanóico 12-hidroxi como descrito nos Exemplos 1 e 2 (acima). Como pode ser visto na Figura 9, sAS.335 converteu mais ácido dodecanóico em ácido dodecanóico de 12-hidroxi do que sAS.320, e a quantidade de ácido dodecanóico 12- hidroxi foi quantificada como 37,4 ± 0,3 mg/L.
[00169] Então, E.coli que expressa um operons de cyp153A modificado de Marinobacter aquaeoli mostrou alguma melhoria da conversão de ácido dodecanóico exógeno em ácido dodecanóico 12-hidroxi quando fornecido com os ácidos graxos exógenos in vivo (como comparado com o Exemplo 3). No entanto, a eficiência de conversão dessa enzima era ainda muito baixa. Assim, ainda não se espera que a atividade enzimática dos operons de cyp153A modificados de Marinobacter aquaeoli por si mesmos sejam ideais para a produção de derivados de ácido graxo w-hidróxi e foi determinado que engenharia adicional é necessária para conceber uma enzima com uma eficiência de conversão maior.
EXEMPLO 5: Conversão de derivados de ácido graxo em derivados de ácido graxo w-hidroxilados por uma cepa de E.coli que expressa uma proteína de fusão híbrida de cyp153A-Red450RhF
[00170] Esse exemplo mostra a conversão de ácidos graxos exogenamente adicionados, ésteres metílicos de ácido graxo ou álcoois graxos em ácidos graxos, ésteres metílicos de ácido graxo w-hidróxi ou α,w-diδis, respectivamente, por uma cepa de E.coli recombinante que expressa uma proteína híbrida na qual um CYP P450 153A oxigenase é fundida com um domínio redutase. O propósito desse experimento foi o de criar uma proteína de fusão híbrida em que um cyp153A P450 oxigenase é fundido com um domínio redutase para uma melhoria significativa da produção de derivados de ácido graxo w-hidróxi .
[00171] Oxigenases do citocromo P450 autossuficientes são enzimas em que o parceiro redutase está fundido à proteína catalítica do citocromo P450. Uma classe de oxigenases do citocromo P450 bacteriano autossuficientes é representada por P450RhF de Rhodococcus sp. NCIMB 9784 (Roberts et al., (2003) J. Biol Chem 278:48914; Hunter et al., (2005) FEBS Lett. 579: 2215) e é referido como "Classe I-P450-fused PFOR" (Demot e Parret (2002) Trends Microbiol. 10:502).
[00172] Nesse experimento, um gene que codifica uma proteína híbrida de fusão feito da proteína catalítica cyp153A (G307 A) P450 de Marinobacter aquaeoli e o domínio redutase contendo FMN C-terminal e Fe/S de P450RhF de Rhodococcus sp. NCIMB9784 foi criado como se segue: o gene cyp165A(G307A_Maqu foi amplificado de pAS.022 e fundido com um domínio redutase de P450RhF sintético com códon otimizado por cross-over PCR. O gene de fusão resultante (SEQ ID NO: 5) foi clonado em um derivado-pLC1920 (isto é, replicon de SC101, marcador de resistência à espectinomicina) de tal modo que a sua transcrição foi controlada pelo promotor Ptrc induzível por IPTG. O plasmídeo foi designado pAS.023 (ver Tabela 11, acima) e foi transformado em E.coli MG 1655 ΔfadD fornecendo cepa sAS.336 (ver Tabela 12, acima).
[00173] Em seguida, a cepa sAS.336 foi analisada para a conversão de (i) ácido dodecanóico em ácido dodecanóico 12- hidroxi, (ii) éster metílico do ácido dodecanóico em ácido dodecanóico 12-hidroxi e (iii) dodecanol em 1,12- dodecanodiol como descrito nos Exemplos 1 e 2. Em comparação com a cepa de controle MG 1655 ΔfadD (acima), foram identificados novos picos em sAS.336 para todos os três compostos adicionados em cromatógrafos GC-MS (após derivatização de BSTFA, ver Figuras 10A a 10C). Ácido dodecanóico 12-hidroxi foi identificado como descrito no Exemplo 3 (acima). Os novos picos em RT 11946 e RT 11668 minutos (após derivatização de BSTFA) foram identificados como 1,12-dodecanediol e éster metílico de ácido dodecanóico 12-hidroxi, respectivamente.
[00174] O espectro de massa do pico em RT 11,948 minutos é mostrado na Figura 11A. O padrão de fragmentação de íon indicou que esse pico era 1,12-bis(trimetilsiloxi) dodecano, que é a forma derivatizada de 1,12-dodecanodiol. O padrão de fragmento de íon para a 1,12-bis (trimetilsiloxi)dodecano é mostrado na Figura 13A. O íon em m/z = 147 é um fragmento característico para todos os compostos relacionados com o diol, e íons em m/z = 55, 69, 83, 97, 111, e 125 são fragmentos de clivagem alílica característicos após a perda da porção de HOSi (CH3)3. O íon a m/z = 241 é um marcador de diagnóstico característico para determinar o comprimento da cadeia de um composto α,w- diol como se mostra na Figura 13A. A identificação correta desse pico foi ainda confirmada por comparação do seu tempo de retenção e o espectro de massa com a de um padrão autêntico de 1,12-dodecanodiol derivatizado com BSTFA + 1% TMCS (Figura 11b). O comprimento da cadeia de outros α,w- dióis pode ser determinado similarmente. Por exemplo, se um pico tem um fragmento em m/z 269 e outros íons característicos em m/z 147, 149, 111, 97, 83, 69, e 55, esse pico seria 1,14 bis(trimetilsiloxi)tetradecano. Para a identificação de a,w-dióis insaturados, regras similares podem ser aplicadas. Já que a,w-dióis insaturados tem duas unidades de massa inferiores ao seu contraparte saturado, o fragmento de diagnóstico característico é m/z = 239 para 1,12bis(trimetilsiloxi)dodeceno.
[00175] O espectro de massa do pico em RT 11,668 minutos é apresentado na figura 12A. Esse pico foi identificado como éster metílico de ácido 12- trimetilsiloxidodecanóico com base no padrão de fragmentação de íon desse composto. Como demonstrado na Figura 13B, a molécula é fragmentada a dois íons dominantes em m/z = 287 (M-CH3) e 255 (M-CH3-HOCH3). Além, disso, o espectro de massa revelou um íon característico em m/z = 271 (M-OCH3), sugerindo que essa molécula tem uma porção de éster metílico. O íon em m/z = 103 sugeriu que grupo trimetilsiloxi está na posição terminal. Os íons em m/z = 287 e 255 também são íons característicos para determinar o comprimento da cadeia desse composto (ver Figura 13b). Consequentemente, se um pico tem íons de fragmentação em m/z = 315 e 283 e outros íons em m/z 55 e 103, o pico pode ser identificado como éster metílico do ácido tetradecanóico 14-trimetilsiloxi. Essa regra foi usada para identificar os ésteres metílicos de ácido graxo w-hidróxi de comprimento de cadeia diferente produzido pela cepa stEP677 (ver Exemplo 6, abaixo).
[00176] A Tabela 13 (abaixo) mostra as quantidades de derivados de ácido graxo w-hidroxilados convertidos pela cepa sAS.336 dentro de 18 h a 32°C. Como pode ser visto na Tabela 13, a proteína de fusão cyp153A-RedRhF híbrida expressa de pAS.023 converteu derivados de ácido graxo exógeno eficientemente em derivados de ácido graxo w- hidroxilados em comparação com as outras enzimas que foram testados (acima). Desse modo, essa enzima manipulada foi selecionada para a produção de derivados de ácido graxo w- hidróxi in vivo via hospedeiros de produção manipulada através de matéria-prima renovável (ver Exemplo 6, abaixo). Tabela 13: Derivados de ácido graxo w-hidroxilados formados por sAS.336
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EXEMPLO 6: Produção de derivados de ácido graxo Q- hidroxilados de glicose por cepas recombinantes de E.coli que expressam uma proteína de fusão híbrida CYP153A- Red450RhF
[00177] Esse exemplo mostra a produção de ácido graxo w-hidróxi, éster metílico de ácido graxo w-hidróxi e α,w- dióis a partir de uma matéria prima renovável de carboidratos, tal como glicose, por cepas recombinantes de E.coli que expressam uma proteína quimérica híbrida em que um CYP153A P450 oxigenase é fundido com um domínio redutase.
[00178] O gene que codifica o gene de fusão híbrida CYP153A(G307A)-RedRhF foi amplificado de pAS.023 e clonado em um vetor derivado de pACYC (replicon de p15A, marcador de resistência à canamicina), de tal modo que a transcrição do gene de fusão foi controlada pelo promotor de Ptrc induzível por IPTG. O plasmídeo resultante foi denominado pEP.125 (ver Tabela 11, acima).
[00179] Seis cepas de E.coli recombinantes que foram separadamente manipuladas a produzir ácidos graxos ou derivados de ácido graxo a partir de um substrato de carboidrato tal como glicose (ver Tabela 14, abaixo), ou foram transformadas com plasmídeo ou pAS.023 ou pEP.125 de modo a criar cepas produtoras de derivado de ácido graxo w- hidroxilado (ver Tabela 15, abaixo). As cepas derivadas de ácido graxo ou de superprodução de ácido graxo também serviram de cepas de controle para identificar facilmente novos compostos nas cepas produtoras de derivados de ácido graxo w-hidróxi. Estas cepas derivados a ácido graxo ou de superprodução de ácido graxo são brevemente descritas aqui, mas não devem ser interpretadas como limitativas. A cepa de genoma ALcV334 foi criada como segue: o gene fadE (acil-CoA desidrogenase) foi eliminado e uma variante do gene tioesterase tesA foi superexpressa. Em adição às manipulações genéticas em ALcV334, o genoma da cepa XL897 continha as seguintes manipulações: um gene de fosfopanteteinil transferase e um operon da biossíntese de ácido graxo sintético (incluindo vários genes descritos na Tabela 1) foram superexpressos e diversos operons incluindo uma variante de ácido carboxílico redutase (CARB); uma variante de tioesterase (tesA); álcool desidrogenase (AlrA); uma variante de 3-ceto-acil-ACP sintase (fabB); e um regulador da transcrição (fadR) foram integrados. A cepa com DAML foi manipulado como se segue: o gene da acil-CoA desidrogenase (fadE) foi excluído, e os genes da tioesterase de E.coli (tesA) e acil-CoA sintase (fadD) foram superexpressos.
[00180] Os genomas de cepas stNH1293, KASH286 e stNT29 foram manipulados da seguinte forma: o gene da acil-CoA desidrogenase (FadE) foi excluído e um regulador da transcrição (fadR) e um operon da biossíntese do ácido graxo sintético foram superexpressos. Além disso, a cepa stNH1293 continha um plasmídeo que expressa uma tioesterase de planta, um gene (acp) da proteína carreadora de acila e um complexo de gene (acc) de acetil-CoA carboxilase. Cepa KASH286 continha um plasmídeo que expressa uma variante de um éster sintase. Cepa stNT29 continha um plasmídeo que expressa uma variante de um acil ACP redutase (AAR), um álcool desidrogenase (AlrA), proteína carreadora de acila (acp) e um complexo de gene (acc) de acetil-CoA carboxilase. Tabela 14: Cepas de E.coli recombinantes que superproduzem ácidos graxos ou derivados de ácido graxo
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[00181] As cepas manipuladas para produzir os derivados de ácido graxo w-hidroxilados (acima) foram então analisadas quanto à sua capacidade para produzir derivados de ácido graxo w-hidroxilados a partir de uma matéria-prima renovável, tal como glicose, como descrito nos Exemplos 1 e 2. Os ácidos graxos w-hidroxilados, ésteres metílicos de ácido graxo e álcoois graxos foram identificados como descritos nos Exemplos 3 e 5. Tabela 15: Cepas de E.coli recombinantes que expressam proteína de fusão cyp153A(G307A)-RedRhF para a produção de derivados de ácido graxo w-hidroxilados de matérias-primas de carboidratos renováveis
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[00182] Em comparação com as cepas de controle (ver Tabela 14, acima), foram identificados novos picos (como descritos no Exemplo 5) em todas as cepas que expressam a proteína de fusão cyp153A-RedRhF (ver Tabela 15, acima) correspondente a ácidos graxos w-hidróxi, ésteres metílicos de ácido graxo w-hidróxi e, a,w-dióis (ver também as Figuras 14A a 14C). A Tabela 16 mostra as quantidades de derivados de ácido graxo w-hidróxi produzidos por estas cepas recombinantes de glicose dentro de 20h. Como pode ser visto na Tabela 16, a quantidade de derivados de ácido graxo w-hidróxi que foram produzidos pelas células hospedeiras recombinantes foi significativa. Em particular, a produção de ácido graxo w-hidróxi foi revelada ser muito eficiente. É interessante notar que os ácidos graxos w- hidróxi produzidos pela cepa stEP675 foram revelados quase exclusivamente no sobrenadante (ver Figura 15), o que mostra que as células liberaram seu produto no sobrenadante. Figura 16 mostra a composição de ácidos graxos w-hidróxi produzidos pelas cepas stEP675 e stEP682. O ácido graxo w-hidróxi mais abundantemente produzido pela cepa stEP682 foi o ácido 12-hidroxidodecanóico (79%). Ácido 14-hidroxitetradecanóico (42%) era o ácido graxo w-hidróxi mais abundantemente produzido por stEP675.
[00183] Em geral, as cepas stEP675 produziram os seguintes ácidos graxos w-hidróxi: ácido 12- hidroxidodecenóico, ácido 12-hidroxidodecanóico, ácido 14- hdroxitetradecenóico, ácido 14-hidroxitetradecanóico, ácido 16-hidroxihexadecenóico, ácido 16-hidroxihexadecanóico e ácido 18-hidroxioctadecenóico (ver Figura 14A). Cepas stEP682 produziram os seguintes ácidos graxos w-hidróxi : ácido 12-hidroxidodecenóico, ácido 12-hidroxidodecanóico, ácido 14-hidroxitetradecenóico, ácido 14- hidroxitetradecanóico, ácido 16-hidroxihexadecenóico e ácido 16-hidroxihexadecanóico. Cepas stEP677 produziram além dos ácidos graxos w-hidróxi também os seguintes ésteres metílicos de ácido graxo w-hidróxi: éster metílico de ácido 12-hidroxidodecanóico, éster metílico de ácido 14- hidroxitetradecanóico e éster metílico de ácido 16-hidroxi- hexadecanóico (ver Figura 14B). Cepas stEP684 produziram além dos ácidos graxos w-hidróxi também os seguintes ésteres metílicos de ácido graxo w-hidróxi : éster metílico de ácido 14-hidroxitetradecanóico, éster metílico de ácido 16-hidroxihexadecenóico, e éster metílico de ácido 16- hidroxihexadecanóico. Cepas stEP676 produziram os seguintes a,w-dióis: 1,12-dodecenediol, 1,12-dodecanodiol, 1,14- tetradecanodiol, 1,16-hexadecenodiol e 1,16-hexadecanodiol (Figura 14C). Cepas stEP685 produziram os seguintes α,w- dióis: 1,14-tetradecanediol, 1,16-hexadecenodiol e 1,16- hexadecanodiol.
[00184] Em particular, esse exemplo mostrou que as cepas de E.coli manipuladas para superproduzir os derivados de ácido graxo, quando combinadas com a expressão de uma proteína de fusão híbrida CYP153A-RedRhF produziram eficientemente derivados de ácido graxo w-hidroxilados a partir da glicose como única fonte de carbono. Além disso, ácidos graxos w-hidroxilados foram eficientemente secretados no caldo de fermentação (isto é, as células que produzem ou células hospedeiras que secretam o produto no caldo de fermentação), que é uma característica desejável do presente método.
EXEMPLO 7: Produção de a,w-diácidos a partir da glicose por uma cepa de E.coli recombinante
[00185] Esse exemplo demonstra a produção de α,w- diácidos a partir de uma matéria-prima de carboidrato renovável tal como glicose por uma cepa de E.coli recombinante que expressa uma proteína híbrida quimérica em que cyp153A P450 oxigenase é fundida com um domínio de redutase e um álcool oxidase e um aldeído desidrogenase.
[00186] Os genes que codificam álcool oxidase alkJ (número de acesso CAB54054) (SEQ ID NO: 66) e aldeído desidrogenase alkH (número de acesso CAB51050) (SEQ ID NO: 68) foram amplificados a partir do DNA genômico de Pseudomonas putida ATCC 29347 e clonados em um vetor derivado de pACYC (replicon de p15A, marcador de resistência à canamicina) de tal forma que os dois genes constituem um operon e a transcrição do operon é controlada pelo promotor Ptrc induzível por IPTG. O plasmídeo resultante foi denominado pEP.126 (ver Tabela 11, acima). O plasmídeo pEP126foi co-transformado com plasmídeo pAS.023 (ver Tabela 11, acima) na cepa AlcV334 (ver Tabela 14, acima) produzindo a cepa sEP690. A cepa foi analisada quanto à sua capacidade de produzir a,w-diácidos a partir da glicose como descrito nos Exemplos 1 e 2. Em comparação com a cepa de controle AlcV334, vários novos picos foram identificados em sEP690 como pode ser visto na Figura 17. Estes picos foram identificados como as formas derivadas de a,w-diácidos e éster de ácido graxo α,w-bis(trimetilsilil). O padrão de fragmentação de íon de ésteres de ácido graxo de α,w-bis(trimetilsilil) são muito similares a álcoois graxos de α,w-bis(trimetilsiloxi), as formas derivadas de a,w-dióis (ver Exemplo 3), exceto que ésteres de ácido graxo α,w-bis(trimetilsilil) não gerar um íon em m/z = 103. Esse íon é, portanto, uma informação importante para distinguir álcoois graxos de α,w-bis(trimetilsilil) de ésteres de ácido graxo α,w-bis(trimetilsilil) (assim como álcoois graxos de w-1, w-2 e w-3 trimetilsiloxi descrito a seguir , abaixo).
[00187] Os principais compostos produzidos por cepas stEP690 eram ácido 1,12-dodecanodioico, ácido 1,14- tetradecenodióico, ácido 1,14-tetradecanodióico, ácido 1,16-hexadecenodióico, ácido 1,16-hexadecanodióico, ácido 1,18-octadecenodióico (ver a Figura 17). O composto mais abundantemente produzido por essa cepa foi o ácido 1,14- tetradecanodióico em RT 13,367 minutos. O espectro de massa desse composto após a derivatização de BSTFA é mostrado na Figura 18A. O íon molecular para esse composto é m/z = 387 (M-CH3) e o seu padrão de fragmentação é apresentado na Figura 19. A identificação do éster de bis(trimetilsilil) de ácido 1,14-bis tetradecanodióico foi ainda confirmada por comparação do seu espectro de massa e tempo de retenção com a do padrão autêntico do ácido 1,14-tetradecanodióico após derivatização de BSTFA (Figura 18B).
[00188] Tabela 16 mostra as quantidades de a,w-diácidos produzidos pela cepa sEP690 a partir da glicose dentro de 20h, que foi ~550 g/L. Esse exemplo mostrou que as cepas de E.coli manipulada para superproduzir os derivados de ácido graxo quando combinados com a expressão de uma proteína de fusão híbrida CYP153A-RedRhF e combinada com a expressão de um álcool oxidase (SEQ ID NO: 67) e aldeído desidrogenase (SEQ ID NO: 69) produziram eficientemente a,w-diácidos a partir da glicose como única fonte de carbono.
EXEMPLO 8: Produção de ácidos graxos subterminalmente hidroxilados por cepas de E.coli que expressam cyp102Al de Bacillus megaterium
[00189] O objetivo desse experimento foi investigar se é possível produzir ácidos graxos w-hidroxilados ou α,w- diácidos in vivo utilizando cepas hospedeiras geneticamente modificadas que expressam uma variante F87A do citocromo P450 cyp102A1 (P450-BM3) de Bacillus megaterium. Foi revelado que a produção de pequenas quantidades de ácidos graxos subterminalmente hidroxilados (w-1, w-2, w-3, w-4, w-5) era possível usando as cepas de E.coli recombinantes que expressam essa variante cyp102A1. No entanto, não foi possível produzir os ácidos graxos w-hidróxi ou α,w- diácidos empregando as mesmas cepas de E.coli.
[00190] O gene que codifica uma variante do gene cyp102A1 do Bacillus megaterium (P450-BM3) em que a fenilalanina na posição 87 é substituída com alanina (F87A) foi criado por cross-over PCR do DNA genômico de B. megaterium (Número de Acesso AAA87602; SEQ ID NO: 61). O DNA amplificado foi clonado no derivado de pCL (replicon de SC101, marcador de resistência à espectinomicina) e vetores de derivado de pACYC (replicon de p15A, marcador de resistência à canamicina), de tal modo que a transcrição dos genes foi controlada pelo promotor de Ptrc induzível por IPTG. Os plasmídeos resultantes, pSN.012 e pSN.009 (ver Tabela 17, abaixo) foram transformados na cepa superprodutora de ácido graxo AlcV334 (ver Tabela 14, acima, e Exemplo 6, acima) fornecendo cepas sSN.012 e sSN.013 (ver Tabela 18, abaixo). As cepas foram então analisadas quanto à sua capacidade de produzir ácidos graxos w-hidroxilados a partir da glicose como descrito nos Exemplos 1 e 2. Em comparação com a cepa de controle AlcV334, pequenos novos picos foram identificados em ambas as cepas (mostrados para sSN.012 na Figura 20 após derivatização de BSTFA). O padrão de fragmentação do espectro de massa dos novos picos entre RT 7,195-7,510 e 8,122-8,414 não correspondem aos ácidos graxos w-hidróxi (ver Exemplo 3, acima), no entanto eles correspondiam ao padrão de fragmentação esperado de ácidos graxos hidroxilados nas posições w-1, w-2, w-3, w-4, e o-5 subterminais. Embora os ácidos graxos subterminalmente hidroxilados mostrem padrões de fragmentação de íon similares como ácidos graxos w-hidróxi (ver Figura 8A para o ácido dodecanóico 12-hidroxi derivado), estes compostos apresentam fragmentos de íon adicionais dependendo do local de hidroxilação de m/z = 117 (w-1), 131 (w-2), 145 (w-3), 159 (w-4) ou 173 (w-5) após derivatização (ver Figuras 21A- 21E). Quanto ao comprimento da cadeia, a combinação dos íons em m/z = 117 e 345 são os íons característicos para ácido 11w-1-hidroxidodecanóico após derivatização. Similarmente, o par de combinação de íon em m/z = 131 e 331, m/z = 145 e 317, m/z = 159 e 303, m/z = 173 e 289 são os íons característicos para w-2, w-3, w-4 e w-5 ácidos hidroxidodecanóico. Portanto, picos de RT de 7,195 a 7,510 foram identificados como ácido 7(o-5), 8(o-4), 9(o-3), 10(w-2) e 11(w-1)-hidroxidodecanóico e os picos de RT 8,122 a 8,414 como ácido 9(o-5), 10(o-4), 11(o-3), 12(o-2) e 13(w-1)-hidróxi tetradecanóico. Os cromatogramas de CG/MS de cepas sSN.012 e sSN.013 também foram cuidadosamente inspecionados para a presença de a,w-diácidos, mas estas moléculas bifuncionais não podem ser detectadas.
[00191] Em conclusão, esse exemplo mostra que as cepas de E.coli manipuladas para superproduzir ácidos graxos quando combinadas com a expressão da variante F87A de CYP 102A1 de B. megaterium não produzem ácidos graxos α- hidroxilados, mas que produzem quantidades traços de ácidos graxos α-1, α-2, α-3, α-4, e α-5 hidróxi. Tem sido relatado que a mutação do ponto F87A em cyp102A1 de B. megaterium muda a especificidade do substrato da enzima in vitro de modo a que a enzima quase exclusivamente hidroxila ácido dodecanóico ou ácido tetradecanóico na posição α (ver Oliver et al. (1997) Biochem. 36: 1567). Também tem sido relatado que P450-BM3 (cyp102A3) e P450-BM3 (F87A) (cyp153 (F87A)) de B. subtilis produzem ácido 14-hidroxi tetradecanóico e ácido 1,14-tetradecanodióico (ver, por exemplo, WO 2012/071439). No entanto, isso não pôde ser confirmado e parece contradizer os resultados atuais. Além disso, relatórios recentes sobre alteração da especificidade do substrato de cyp102A3 de Bacillus subtilis, um homólogo próximo de cyp102A1 suporta os dados aqui apresentados (ver Lentz et al. (2004) J. Biotechnol 108:41 e Lentz et al. (2006) ChemBioChem 7:345). Como tal, uma mutação do resíduo de fenilalanina equivalente em cyp102A3 para valina (F88V) principalmente ácidos graxos hidroxilados nas posições α-1, α-2, α-3 e α-4, e nenhum produto α-hidroxilado foi observado in vitro com ácido dodecanóico ou ácido hexadecanóico como substratos. Assim, pode concluir-se que as variantes descritas acima de cyp102A1 de B. megaterium e cyp102A3 de B. subtilis não são adequadas para a produção de ácidos graxos w-hidróxi ou um a,w-diácidos como os últimos requerem ácidos graxos w- hidróxi como intermediários. Tabela 17: Plasmídeos de expressão construídos para a produção de derivados de ácido graxo subterminalmente Hidroxilados
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EXEMPLO 9: Produção eficiente de ácidos graxos Q-1, a-2 e Q-3 hidroxilados a partir da glicose por cepas de E.coli que expressam cyp102A7 de Bacillus licheniformis
[00192] O objetivo desse exemplo foi testar cepas de E.coli expressando cyp102A7 oxigenase do tipo P450-BM3 de Bacillus licheniformis para a produção de ácidos graxos subterminalmente hidroxilados. Os dados demonstraram a produção eficiente de ácidos graxos o-1, o-2 e o-3 hidroxilados e álcoois graxos por cepas de E.coli recombinantes que expressam cyp102A7 oxigenase do tipo P450-BM3. Isso foi surpreendente e inesperado.
[00193] O gene yrhJ que codifica cyp102A7 oxigenase do tipo P450-BM3 de Bacillus licheniformis (Dietrich et al., (2008) Appl. Microbiol. Biotechnol. 79:931) foi amplificado do DNA genômico ATCC14580 de Bacillus licheniformis (Número de Acesso AAU41718; SEQ ID NO: 63). O gene foi clonado em um derivado de pLC1920 (replicon de SC101, marcador de resistência à espectinomicina) de tal forma que um promotor de Ptrc induzível controla a sua transcrição. Além disso, o gene foi clonado em um derivado de pLC1920 de tal forma que um promotor de Ptrc induzível controla um operon feito de (e nessa ordem) yrhJ, uma variante de tioesterae (tesA), álcool desidrogenase (AlrA), uma variante de 3-ceto-acil- ACP sintase (fabB) e o regulador transcricional fadR. Os plasmídeos foram designados pHM105 e pSL170.02, respectivamente, e transformados em cepas de E.coli LC972 e XL959 (ver Tabela 14, acima). Estas cepas são brevemente descritas aqui (ver também a Tabela 14). O genoma da cepa LC972 foi manipulada como se segue: o gene da acil-CoA desidrogenase (FadE) foi excluído. Fosfopanteteinil transferase, duas cópias de uma variante da tioesterae (tesA) e um operon da biossíntese de ácido graxo sintético (que consiste de vários genes descritos na tabela 1) foram superexpressos. Cepa XL959 era LC972 com um plasmídeo derivado de pACYC expressar uma variante de ácido carboxílico redutase carB. As quatro novas cepas de E.coli recombinantes XL960 - XL963 (ver Tabela 18, acima) foram analisadas quanto à sua capacidade para produzir derivados de ácido graxo hidroxilado a partir da glicose como descrito nos Exemplos 1 e 2, exceto que 35°C foi utilizado como a temperatura de incubação. Nenhuma das cepas produziu quaisquer ácidos graxos w-hidroxilados ou derivados de ácido graxo. No entanto, todas as cepas produziram os derivados de ácido graxo subterminalmente hidroxilados como descrito no Exemplo 8. Figura 22A mostra um cromatógrafo após derivatização de BFTSA da cepa XL961. Os picos foram identificados como descritos no Exemplo 8 como os seguintes ácidos graxos w-1, w-2 e w-3 hidróxi: ácido dodecanóicol1- hidroxi (RT = 10,563), ácido dodecanóico 10-hidroxi (RT = 10,512), ácido dodecanóico 9- hidroxi (RT = 10,412), ácido tetradecanóico 13-hidroxi (RT = 11,279), ácido tetradecanóico 12-hidroxi (RT = 11.233), ácido tetradecanóico 11-hidroxi (RT = 11,133), ácido hexadecanóico 15-hidroxi (RT 11,679), ácido hexadecanóico 14-hidroxi (RT = 11,623) e ácido hexadecanóico 13-hidroxi (RT = 11,439). Pequenos picos que mais provavelmente correspondiam aos ácidos graxos insaturados subterminalmente hidroxilados também foram detectados.
[00194] Figura 22B mostra um cromatógrafo após derivação de BFTSA da cepa XL963. Os picos foram identificados como os seguintes álcoois graxos w-1, w-2 e w-3 hidróxi: Os picos em RT 8,303, 8,480 e 8,572 minutos foram 7, 8 e 9-hidroxidecanol, respectivamente, os picos em RT em 9,264, 9,653 e 9,905 foram de 9, 10 e 11- hidroxidodecanol, respectivamente, e os picos em RT 10,889, 11,044 e 11,124 foram de 11, 12 e 13-tetradecanol, respectivamente. O espectro de massa e o padrão de fragmentação de íon detalhados usados para identificar 9, 11 e 10-hidroxidodecanol são mostrados nas Figuras 23A, 23B e 23C. Dado que as cepas similares no Exemplo 8 produziram apenas quantidades traços de ácidos graxos subterminalmente hidroxilados, foi surpreendente e inesperado que todas as quatro cepas produziram quantidades substanciais destes produtos (até ~ 1,6 g/L). Figura 24A mostra as quantidades de ácidos graxos w-1, w-2 e w-3 hidroxila produzidos pelas cepas XL960 e XL961 e a Figura 24B mostra as quantidades de álcoois graxos w-1, w-2 e w-3 hidroxila produzidos pelas cepas XL962 e XL963. Assim, esse exemplo mostra que as cepas de E.coli manipuladas para superproduzir derivados de ácido graxo quando combinadas com a expressão de um cyp102A7 de B. licheniformis produziram eficientemente derivados de ácido graxo w-1, w-2 e w-3 hidroxila a partir de glicose como única fonte de carbono.
Exemplo 10: Produção de a,w-diésteres a partir da glicose pelas cepas de E.coli recombinantes
[00195] Um gene de acil-CoA sintase/ligase ou transferase é clonado a jusante de um gene que codifica uma proteína de fusão cyp153A-RedRhF em um vetor derivado de pCL de tal forma que os dois genes formam um operon e a transcrição do operon é controlada pelo promotor de Ptrc induzível por IPTG. Exemplos de padrões de fusão cyp153A e RedRhF adequados são apresentados nas Tabelas 2A e 2D. Exemplos de acil-CoA sintases/ligases ou transferases adequadas são fornecidos na Tabela 7. O plasmídeo resultante é transformado em um éster metílico de ácido graxo que produz a cepa de E.coli, por exemplo, KASH286 (ver Exemplo 6 e na Tabela 14, acima). A cepa é analisada quanto à sua capacidade para produzir derivados de ácido graxo w-hidroxilados a partir de glicose como descrito nos Exemplos 1 e 2. A cepa é esperada produzir a,w-diésteres.
Exemplo 11: Produção de derivados de ácido graxo a- amino a partir da glicose por cepas de E.coli recombinantes
[00196] Um gene que codifica uma proteína de fusão cyp153A-RedRhF, um gene que codifica um álcool oxidase ou desidrogenase e um gene que codifica uma aminotransferase ou transaminase são clonados em um vetor derivado de pCL de tal modo que os três genes formam um operon e a transcrição do operon é controlada pelo promotor de Ptrc induzível por IPTG. Exemplos de padrões de fusão de cyp153A e RedRhF adequados são apresentados nas Tabelas 2A e 2D. Exemplos de álcool oxidases ou desidrogenases adequadas são fornecidos na Tabela 3A e exemplos de aminotransferases ou transaminases adequadas são apresentadas na Tabela 4. O plasmídeo resultante é transformado em um ácido graxo que produz a cepa de E.coli, por exemplo, stNH1293 (ver Exemplo 6 e Tabela 14 , acima). A cepa é analisada quanto à sua capacidade para produzir derivados de ácido graxo w- hidroxilados a partir da glicose como descrito nos Exemplos 1 e 2. A cepa é esperada produzir os ácidos graxos w-amino. Alternativamente, o plasmídeo resultante é transformado em um éster metílico de ácido graxo que produz cepa de E.coli, por exemplo, KASH286 (ver Exemplo 6 e na Tabela 14, acima). A cepa é analisada quanto à sua capacidade para produzir derivados de ácido graxo w-hidroxilados a partir da glicose como descrito nos Exemplos 1 e 2. A cepa é esperada produzir os ésteres metílicos de ácido graxo w-amino.
Exemplo 12: Produção de derivados de ácido graxo a- hidroxilados de diversas matérias-primas
[00197] Conforme a biossíntese do ácido graxo é ubíqua na natureza, os Exemplos aqui fornecidos podem ser ainda implementados em outros organismos que naturalmente utilizam matérias-primas além dos carboidratos. Por exemplo, estas vias podem ser expressas em um microrganismo fotossintético, permitindo a produção de derivados de ácido graxo w-hidroxilados de CO2. Em particular, eles podem ser expressos no citoplasma de uma cianobactéria, que, quando cultivados sob condições adequadas, tais como em um fotobiorreator ou uma lagoa aberta, eles iriam produzir derivados de ácido graxo w-hidroxilados que podem ser isolados da cultura. Alternativamente, será evidente para aquele versado na técnica que estas vias podem ser expressas em um organismo utilizando monóxido de carbono, tais como aqueles do gênero Clostridia. Por exemplo, quando estes microrganismos manipulados são cultivados nas condições apropriadas (por exemplo, em um reator fornecido com CO a partir do gás de combustão de moinho de aço ou de gás de síntese derivado da reforma de materiais orgânicos, tais como o gás natural ou biomassa), eles irão produzir derivados de ácido graxo w-hidroxilados que podem ser recuperados da cultura.
Exemplo 13: Produção derivados de ácido graxo a- hidroxilados a partir da glicose pelas cepas de E.coli recombinantes que expressam várias proteínas de fusão híbrida de CYP153A-redutase
[00198] Esse exemplo mostra a produção de ácidos graxos w-hidróxi a partir de uma matéria-prima de carboidrato renovável, tal como glicose, por cepas de E.coli recombinantes que expressam proteínas híbridas quiméricas adicionais em que vários domínios de CYP153A P450 oxigenase estão fundidos com vários domínios de redutase.
[00199] Nesse experimento, genes que codificam as proteínas catalíticas de CYP153A P450 a partir de três micróbios e proteínas de domínio de redutase a partir de quatro micróbios foram amplificados a partir de DNA genômico ou sintetizados como DNA com códons otimizados (ver Tabela 19 abaixo). As proteínas de domínio de redutase compreendiam proteínas do tipo RedRhF assim como do tipo BM3. Os genes que codificam para as proteínas híbridas quiméricas foram reunidas e clonadas em um vetor derivado de pLC1920 como descrito no Exemplo 5 (acima). Os plasmídeos resultantes foram transformados em cepa de AlcV334 (ver Tabela 14). Estas seis cepas adicionais manipuladas para produzir derivados de ácido graxo w- hidroxilados foram então analisadas quanto à sua capacidade para produzir derivados de ácido graxo w-hidroxilados a partir de uma matéria-prima renovável, tal como glicose como descrito nos Exemplos 1 e 2. Tabela 20 abaixo mostra as quantidades de ácidos graxos w-hidroxilados produzidos por estas cepa em comparação com StEP675 dentro de 18h a 32°C. StEP675 é a cepa AlcV334 expressando uma proteína quimérica que consiste de CYP153A de M. aquaeolei e um domínio de redutase de Rhodococcus sp. NCIMB 9784 (ver Exemplo 6). Como pode ser visto na Tabela 20 abaixo, a maioria das cepas que expressam as proteínas de fusão híbrida de CYP153A-reductase produziram eficientemente derivados de ácido graxo w-hidroxilados a partir de glicose como única fonte de carbono. Em conclusão, as proteínas de fusão híbrida CYP153A-redutase quiméricas que consistem de proteínas de diferentes membros da família CYP153A e diferentes membros das famílias do tipo RedRhF ou do tipo BM3-redutase produziram eficientemente derivados de ácido graxo w-hidroxilados a partir de glicose como única fonte de carbono quando expressos em E.coli. Tabela 19: Cepas de E.coli recombinantes adicionais que expressam proteínas de fusão cyp153A redutase híbridas para a produção de derivados de ácido graxo w-hidroxilados de matérias-Primas de carboidrato renováveis
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Tabela 20: Derivados de ácido graxo w-hidroxilados produzidos por cepas de E.coli recombinantes a partir da Glicose
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[00200] Os seguintes protocolos e métodos referem-se aos exemplos 14 ao 19.
Protocolos e Métodos Rastreio de uma biblioteca
[00201] Todos os protocolos aqui descritos contam com um sistema de placa de 96 poços - Master block - 2 mL (Greiner Bio-One, Monroe, NC ou Corning, Amsterdam, Holanda) para o cultivo de culturas e placas (Costar, Inc.) para a extração de espécies de ácido graxo a partir do caldo de cultura. Os protocolos fornecidos abaixo são exemplos de condições de fermentação. Protocolos alternativos podem ser usados para avaliar a produção de espécies de ácido graxo.
[00202] Protocolo de cultura a 32°C Plim: 30 μL de cultura de LB (a partir de uma cultura de LB cultivada em uma placa de 96 poços) foi usada para inocular 290 μL de meio Plim (Tabela 21 abaixo), o qual foi então incubada durante aproximadamente 16 horas a 32°C agitando. 40 μL da semente durante a noite foi usada para inocular 360 μL de meio Plim. Após o cultivo a 32°C durante 2 horas, as culturas foram induzidas com IPTG (concentração final a 1 mM) (Tabela 21 abaixo). As culturas foram então incubadas a 32°C com agitação durante 20 horas, se não indicado de outra forma, após o que foram extraídas seguindo o protocolo de extração padrão detalhado abaixo.
[00203] Protocolo de cultura a 35°C Nlim: 40 μL de cultura de LB (a partir de uma cultura LB cultivada em uma placa de 96 poços) foi usada para inocular 360 μL de meio com LB (Tabela 21 abaixo), a qual foi então incubada durante cerca de 4 horas a 32°C agitando. 40 μL da semente de LB foi usada para inocular 360 μL de meio Nlim. Após o cultivo a 32°C durante 2 horas, as culturas foram induzidas com IPTG (concentração final a 1 mM) (Tabela 21 abaixo). As culturas foram então incubadas a 35°C com agitação durante 20 horas, se não indicado de outra forma, após o que foram extraídas seguindo o protocolo de extração padrão detalhado abaixo. Tabela 21: Nomes e formulações do meio
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[00204] Protocolo de extração padrão de espécies de ácido graxo: Para cada poço a ser extraído 80 μL de HCl a 1 M, seguido por 400 μL de acetato de butila (com 500 mg/L de pentadecanol como padrão interno) foi adicionado. As placas de 96 poços foram então seladas a quente utilizando um selador de placas (aquecedor ALPS-300; ABgene, ThermoScientific, Rockford, IL), e agitados durante 15 minutos a 2000 rpm utilizando misturador MIXMATE (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha). Após agitação, as placas foram centrifugadas durante 10 minutos a 4500rpm, à temperatura ambiente (Allegra X-15R, rotor SX4750A, Beckman Coulter, Brea, CA), para separar as camadas aquosas e orgânicas. 100 μL da camada orgânica foi transferida para uma placa de 96 poços (polipropileno, Corning, Amsterdam, Holanda) e derivatizada com 100 μL de BSTFA. A placa foi subsequentemente selada a quente e armazenada a -20°C até avaliadas por GC-FID utilizando o método de W-OH FFA foi realizado como se segue: 1 μL de amostra foi injetada sobre uma coluna analítica (DB-1, 10m x 180 μm x 0,2 μM de espessura da película, disponível de JW 121-101A) em um dispositivo Ultra Agilent 7890A GC (Agilent, Santa Clara, CA) com um detector de ionização de chama (FID) com uma divisão 1-20. O instrumento foi configurado para detectar e quantificar ácidos graxos C10 a C18 e ácidos graxos o- hidróxi. O protocolo detalhado acima representa condições padrões, que podem ser modificadas conforme necessário para otimizar os resultados analíticos.
Construção de bibliotecas expostas a erros
[00205] Técnicas convencionais conhecidas daqueles versados na técnica foram usadas para preparar bibliotecas expostas a erros. Em um exemplo, a base do vetor foi preparada utilizando endonucleases de restrição no vetor, enquanto a criação de diversidade no inserto de DNA foi gerada por amplificação por PCR a partir de um molde de DNA sob condições que favorecem a incorporação de nucleotídeos desemparelhados. Em uma abordagem, a clonagem da base do vetor e um inserto de DNA com diversidade foi realizada utilizando o sistema de clonagem INFUSION (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA), de acordo com o protocolo do fabricante.
Construção de bibliotecas de saturação
[00206] Técnicas convencionais conhecidas por aqueles versados na técnica foram usadas para preparar bibliotecas de saturação. Em um exemplo, a base do vetor foi preparada utilizando endonucleases de restrição no vetor, enquanto a criação de diversidade no inserto de DNA foi gerada utilizando iniciadores degenerados. Em uma abordagem, a clonagem da base do vetor e um inserto de DNA com diversidade foi realizada utilizando um sistema de clonagem INFUSION (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) de acordo com o protocolo do fabricante.
Construção de bibliotecas de combinação
[00207] Mutações identificadas como benéficas foram combinadas para fornecer variantes de polipeptídeo de fusão híbrida CYP153-redutase (por exemplo, variantes de proteína híbrida CYP153A-RedRhF) com outras melhorias na produção de espécies derivadas de ácido graxo w-OH. Técnicas padrões conhecidas daqueles versados na técnica foram usadas para preparar as bibliotecas de combinação. Em um exemplo, a base do vetor foi preparada utilizando endonucleases de restrição no vetor, enquanto a criação de diversidade no inserto de DNA foi gerada utilizando iniciadores para introduzir as mutações desejadas. Como descrito acima, em uma abordagem, a clonagem da base do vetor e um inserto de DNA com diversidade foi realizada utilizando um sistema de clonagem INFUSION (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA), de acordo com o protocolo do fabricante. Bibliotecas de combinação podem ser geradas utilizando o protocolo de PCR (tPCR) de transferência (Erijman et al., (2011) J. Structural Bio. 175:171-177).
Rastreio da biblioteca
[00208] Uma vez que a diversidade da biblioteca foi gerada em uma biblioteca por saturação exposta a erros ou biblioteca de combinação, ela foi rastreada utilizando um dos métodos descritos acima. Foram identificados dois tipos de resultados: (1) aumento da quantidade de ácidos graxos w-hidróxi (titulação de FFA wOH); e/ou (2) aumento da conversão de ácidos graxos em ácidos graxos w-hidróxi. As mutações nas variantes de proteína híbrida cyp153A-RedRhF dentro de cada batida foram identificadas por sequenciação, utilizando técnicas padrão utilizadas rotineiramente por aqueles versados na técnica. Tabelas 23, 24 e 25 listam abaixo as mutações (batidas) identificadas como benéficas em bibliotecas de saturação.
EXEMPLO 14: Construção de cepa e plasmídeo para rastreio da biblioteca
[00209] Esse exemplo descreve as cepas e plasmídeos construídos para rastreio de biblioteca de mutagênese combinatória ou de saturação.
[00210] Um gene que codifica uma proteína híbrida de fusão feita de proteína catalítica CYP153A(G307A)P450 proteína catalítica de Marinobacter aquaeoli e o domínio de redutase contendo FMN e Fe/S c-terminal de P450RhF de Rhodococcus sp. NCIMB9784 foi criado como se segue: O gene cyp165A(G307A_Maqu foi amplificado de DNA genômico e fundido com um domínio de redutase de P450RhF sintético com códon otimizado por cross-over PCR. O gene de fusão resultante (SEQ ID NO: 5) foi clonado em um derivado de pACYC (isto é, replicon de p15A, marcador de resistência à canamicina) de tal modo que a sua transcrição foi controlada pelo promotor de Ptrc induzível por IPTG. O plasmídeo foi designado pEP125 (ver Tabela 22, abaixo). O gene que codifica a proteína de fusão híbrida CYP153A(G307A)Red450RhF também foi amplificado a partir de pEP125 e clonado em um vetor derivado de pCL1920 (replicon de SC101, marcador de resistência à espectinomicina), de tal modo que a sua transcrição foi controlada pelo promotor de Ptrc induzível por IPTG e formou um operon com genes que codificam uma tioesterase de planta (fatB1), uma variante de 3-ceto-acil-ACP sintase (fabB) e um regulador da transcrição (fadR). O plasmídeo foi designado pLC81 (ver Tabela 22, abaixo).
[00211] Plasmídeos adicionais foram criados como se segue: O gene que codifica uma tioesterase de planta (fatB1) de Umbellularia californica foi sintetizado como DNA com códon otimizado e clonado em um vetor derivado de pLC1920 (replicon de SC101, marcador de resistência à espectinomicina), de tal modo que a sua transcrição foi controlada pelo promotor de Ptrc induzível por IPTG e se formou um operon com genes que codificam acetil-CoA carboxilase (accDACB), biotina ligase (BirA) e uma proteína carreadora de acila. O plasmídeo foi designado pNH305 (ver Tabela 22, abaixo). O plasmídeo pAS033 foi criado substituindo fatB1 em pNH305 com uma tioesterase de planta sintética com códon otimizado (fatA3) de Arabidopsis thaliana (ver Tabela 22, abaixo). O plasmídeo pEP146 foi criado substituindo fatB1 em pLC81 com uma tioesterase de planta sintética com códon otimizado (fatA3) de Arabidopsis thaliana (ver Tabela 22, abaixo). pEP146 também carregava uma mutação na proteína repA codificada pelo plasmídeo.
[00212] Cepas de base utilizadas para a transformação do plasmídeo eram GLP077 e BZ128. Resumidamente, o genoma da cepa de base GLPH077 foi manipulado como se segue: o gene de acil-CoA desidrogenase (FadE) foi eliminado e um regulador da transcrição (fadR) e um operon de biossíntese de ácido graxo sintético foram superexpressos. Resumidamente, o genoma da cepa de base BZ128 foi manipulado como segue: o gene fadE (acil-CoA desidrogenase) foi eliminado e um operon de biossíntese do ácido graxo sintético, um acil-ACP desidratase de ácido graxo β-hidr0xi (fabZ) anda variante de um tioesterase (tesA) foram superexpressos. Além disso, a cepa tinha sido anteriormente submetida à transposon assim como mutagênese e rastreio de N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG). Tabela 22: Plasmídeos utilizados para o rastreio da Biblioteca
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[00213] A proteína de fusão cyp153A(G307A)-Red450RhF híbrida foi testada para ver se a expressão em células hospedeiras pode produzir derivados de ácido graxo w-OH. Um microrganismo que expressa SEQ ID NO: 5 foi capaz de produzir mais de um 1 g/L de derivados de ácido graxo w-OH a partir de glicose. Desse modo, essa enzima manipulada foi selecionada para outros estudos de evolução.
EXEMPLO 15: Bibliotecas de saturação do domínio catalítico P450 de proteína de fusão cyp153A(G307A)- Red450RhF
[00214] Uma biblioteca por saturação completa do domínio catalítico P450 da proteína de fusão CYP153A- Red450RhF foi construída e rastreada para as variantes que mostraram melhorias em CYP153A(G307A)-Red450RhF (isto é, o polipeptídeo de molde). G307A (um resíduo de glicina substitui uma alanina na posição 307) é uma mutação benéfica que aumenta a atividade de w-hidroxilase de CYP153A (ver Malca Ronda et al., (2012) Chem. Commun. 48: 5115). Os critérios de seleção dos hits foi (1) aumento da quantidade de ácidos graxos w-hidróxi (titulação de FFA wOH); e/ou (2) aumento da conversão de ácidos graxos em ácidos graxos w-hidróxi.
[00215] Técnicas padrões conhecidas daqueles versados na técnica foram usadas para preparar bibliotecas de saturação. Os plasmídeos pEP125 e pLC81 (ver Tabela 22, acima) foram utilizados para produzir as bibliotecas saturação completa. Três bibliotecas de saturação foram rastreadas: para a primeira biblioteca pEP125 foi transformada em conjunto com pNH305 na cepa GLPH077, para a segunda biblioteca pLC81 foi transformada em BZ128, e para a terceira biblioteca pEP125 foi transformada em conjunto com pAS.033 em cepa GLPH077. As 1° e 2° bibliotecas foram rastreadas em particular para as variantes melhoradas na formação de ácido dodecanóico w-hidróxi e a terceira biblioteca foi rastreada em particular para melhorar as variantes na formação de ácido hexadecenóico w-hidróxi. As bibliotecas foram pesquisadas usando um dos protocolos padrão descritos acima. As variantes melhoradas são mostradas nas Tabelas 23 a 25 abaixo (ver abaixo). Em particular, as variantes da posição 141 foram identificadas várias vezes e verificou-se ser enzimas significativamente melhoradas ambas na formação do ácido dodecanóico w-hidróxi e ácido hexadecenóico w-hidróxi. Tabela 23: Resumo de variantes melhoradas da biblioteca por saturação do 1° sítio do domínio catalítico de CYP153A(G307A)-Red450RhF
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FIOC: melhora em vezes em relação ao controle; controle está em negrito Tabela 24: Resumo das variantes melhoradas da biblioteca por saturação do 2° sítio de domínio catalítico de CYP153A (G307A)-Red450RhF
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FIOC: melhora em vezes em relação ao controle; controle está em negrito Tabela 25: Resumo de variantes melhoradas da biblioteca por saturação do 3° sítio do domínio catalítico de CYP153A(G307A)-Red450RhF
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FIOC: melhora em vezes em relação ao controle; controle está em negrito
Exemplo 16: Bibliotecas por saturação do sítio parcial do domínio de redutase de proteína de fusão CYP153A (G307A)-Red450RhF
[00216] Uma biblioteca saturação parcial (cada 10° aminoácido foi mutado) dos domínios de redutase de proteína de fusão híbrida CYP153A-Red450RhF, foi construída e rastreada para as variantes que apresentaram melhoras em relação a CYP153A(Vl411, A231T, G307A)-Red450RhF (SEQ ID NO: 32), uma variante identificada na biblioteca de mutagênese de saturação do sítio do domínio catalítico de CYP153A P450. Os critérios de seleção das batidas foi (1) aumento da quantidade de ácido dodecanóico w-hidróxi (titulação de FFA wOH); e/ou (2) aumento da conversão de ácido dodecanóico em ácido dodecanóico w-hidróxi. Técnicas padrões conhecidas daqueles versados na técnica foram usadas para preparar bibliotecas de saturação. Para a biblioteca, pLC81 incluindo CYP153A (V141I, A231T, G307A)- Red450RhF foi transformada em BZ128. A biblioteca foi rastreada utilizando um dos protocolos padrões descritos acima. As variantes melhoradas são mostradas na Tabela 26 abaixo. Em particular, as variantes A796V (SEQ ID: 42) e P666A eram enzimas significativamente melhoradas. Tabela 26: Resumo das variantes melhoradas de uma biblioteca por saturação parcial do domínio de redutase de CYP153A(V141I A231T G307A)-Red450RhF
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FIOC: melhora em vezes em relação ao controle; controle está em negrito.
EXEMPLO 17: Biblioteca combinatória do domínio de redutase de proteína de fusão CYP153A(G307A)-Red450RhF
[00217] Mutações benéficas identificadas na biblioteca por saturação parcial do domínio de redutase (Exemplo 17) foram a base de uma biblioteca de combinação para melhorar ainda a proteína de fusão CYP153A(G307A)-Red450RhF. Os critérios de seleção foram de (1) aumento da quantidade de ácido dodecanóico w-hidróxi (titulação de FFA wOH); e/ou (2) aumento da conversão de ácido dodecanóico em ácido dodecanóico w-hidróxi.
[00218] A biblioteca de combinação foi construída em pLC81 incluindo CYP153A (V141I, A231T, G307A)-Red450RhF (SEQ ID: 32) e transformada em BZ128. Técnicas padrões conhecidas daqueles versados na técnica foram usadas para preparar bibliotecas de combinação. A biblioteca foi rastreada utilizando um dos protocolos padrões descritos acima. As variantes melhoradas são mostradas na Tabela 27 abaixo. Tabela 27: Resumo das variantes melhoradas de uma biblioteca de combinação do domínio de redutase de CYP153A (V141I, A231T, G307A)-Red450RhF
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FIOC: melhora em vezes em relação ao controle; controle está em negrito.
EXEMPLO 18: Biblioteca combinatória do domínio catalítico e domínio de redutase da proteína de fusão CYP153A(G307A)-Red450RhF
[00219] Mutações benéficas identificadas na biblioteca por saturação (Exemplos 16 e 17) foram a base de uma biblioteca de combinação para melhorar ainda a proteína de fusão CYP153A(G307A)-Red450RhF. Os critérios de seleção foram de (1) aumento da quantidade de ácido dodecanóico w- hidróxi (titulação de FFA wOH); e/ou (2) aumento da conversão de ácido dodecanóico em ácido dodecanóico w- hidróxi. A biblioteca de combinação foi construída em pLC81 e transformada em BZ128. Técnicas padrões conhecidas daqueles versados na técnica foram usadas para preparar bibliotecas de combinação. A biblioteca foi rastreada utilizando um dos protocolos padrões descritos acima. As variantes melhoradas são mostradas na Tabela 28. Tabela 28: Melhores variantes melhoradas de uma biblioteca combinatória de CYP153A(G307A)-Red450RhF
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*Titulação (mg/L) após 48h
Exemplo 19: Mutagênese por saturação do sítio da posição 141 e 309 de CYP153A(G307A, A796V)-Red450RhF
[00220] Foi observado que mudanças na posição 141 influenciaram especificidade do substrato. Portanto, uma mutagênese de saturação de sítio destas duas posições foi realizada em CYP153A(G307A, A796V)-Red450RhF. Os critérios de seleção para as batidas eram (1) aumento da quantidade de ácido hexadecenóico w-hidróxi; e/ou (2) aumento da conversão de ácido hexadecenóico em ácido hexadecenóico w- hidróxi.
[00221] Para a biblioteca, pEP146 incluindo CYP153A (G307A A796V)-Red450RhF (SEQ ID: 38) foi transformado em BZ128. Técnicas padrões conhecidas para aqueles versados na técnica foram usadas para preparar bibliotecas de saturação de sítio. A biblioteca foi rastreada utilizando um dos protocolos padrões descritos acima. Em particular, as variantes com V141T (SEQ ID: 46) mostram maior titulação de ácido hexadecenóico w-hidróxi e maior conversão de ácido hexadecenóico (Figura 27).
Exemplo 20: Produção de alta titulação de ácidos graxos Q-hidroxilados a partir de glicose pela cepa de E.coli recombinante que expressa uma proteína de fusão CYP153A- Red450RhF híbrida melhorada
[00222] Esse exemplo mostra a produção de alto rendimento de ácidos graxos w-hidróxi a partir de uma matéria-prima de carboidrato renovável, tal como glicose, por cepas de E.coli recombinantes que expressam uma proteína de fusão CYP153A-Red450RhF híbrida melhorada.
[00223] O gene que codifica uma proteína de fusão CYP153A-Red450RhF híbrida variante (SEQ ID NO: 46) foi clonado em um vetor derivado de pLC1920 (replicon de SC101 modificado, marcador de resistência à espectinomicina), de tal modo que a sua transcrição foi controlada promotor de Ptrc induzível por IPTG e é formado um operon com uma tioesterase de planta (fatA3), uma variante da 3-ceto-acil- ACP sintase (fabB) e um regulador da transcrição (fadR). O plasmídeo foi transformado em cepa L439 resultando na cepa stEP.798. Resumidamente, o genoma da cepa de base L439 continha as seguintes manipulações: o gene fadE (acil-CoA desidrogenase) foi eliminado e um operon de biossíntese de ácido graxo sintético e uma variante de uma tioesterase (tesA) foram superexpressos. Além disso, a cepa tinha sido anteriormente submetida ao transposon assim como mutagênese e rastreio de N-metil-N'-nitro-N nitrosoguanidina (NTG).
[00224] A cepa foi executada em um biorreator como se segue: Um frasco de banco de células da cepa foi cultivado em um frasco de agitação de LB contendo espectinomicina (115 mg/L) a 32°C até que a leitura de OD de cultura > 1. A transferência de 5% v/v dessa cultura é feita em meio com semente FA (2 g/L de cloreto de amônio, 0,5 g/L de cloreto de sódio, 0,3 g/L de fosfato monobásico de potássio, sulfato de magnésio a 1 mM, cloreto de cálcio a 0,1 mM, 20 g/L de glicose, 1 mL/L de uma solução de elementos traços, 10 mg/L de citrato férrico monoidratado tribásico, 100 mM de tampão bis tris, e 115 mg de espectinomicina), e cultivada durante a noite a 32°C. Essa cultura de semente foi depois utilizada para inocular um biorreator preparado para produção. O meio do biorreator inicial para esse processo continha: 0,5 g/L de cloreto de amônio, 1 g/L de cloreto de sódio, 4 g/L de potássio monobásico, 2,2 g/L de sulfato de magnésio heptaidratado, 140 mg/L de cloreto de cálcio diidratado, 10 mL/L de uma solução de elementos traços, 80 mg/L de citrato férrico monobásico triidratado, 0,6 mL/L de uma solução de vitaminas traço, e 5 g/L de pó de milhocina. Adições pos-estéreis para o biorreator incluíram: 0,2 mM de ácido aminolevulínico, 30 g/L de glicose, e 115 mg/L de espectinomicina.
[00225] Antes da inoculação, os parâmetros do biorreator foram estabilizados e ciclos de controle ligados - valor nominal de oxigênio dissolvido: 30%; valor nominal da temperatura: 29°C; valor nominal de aeração: 0,5 vvm; valor nominal de pH: 6,9. Biorreator foi inoculado com 5% v/v de uma cultura de semente e induzida com IPTG a 1 mM quando a densidade da cultura foi superior a DO 30. Uma solução de alimentação de glicose complexa (586 g/L de glicose, 2,2 g/L de sulfato de magnésio heptaidratado, 0,4 g/L fosfato de potássio monobásico, 80 mg/L de citrato férrico monoidratado tribásico, e 10 mL/L de uma solução de elementos traço) foi alimentada à cultura a uma taxa máxima de 10 g/L de glicose (com base no volume nominal da cultura), utilizando um gatilho de OD para indicar ao controlador quando o meio foi esgotado de glicose. O biorreator foi amostrado em toda a execução e colhido após 72 horas de cultivo.
[00226] Figura 25 mostra as quantidades de ácido graxo a-hidroxilado produzidas pela cepa stEP.798 ao longo de 72h a 30,5°C, a qual atingiu uma alta titulação de 16,0 g/L, após 72 h. Os ácidos graxos a-hidroxilados produzidos consistiram de 63,1% de ácido hexadecenóico a-hidróxi (Cl6:1), 26,4% de ácido hexadecanóico a-hidróxi (Cl6:0), 7,6% de ácido tetradecanóico a-hidróxi (Cl4:0), 1,9% de ácido tetradecenóico a-hidróxi (Cl4:1) e pequenas quantidades de ácido dodecenóico a-hidróxi (Cl2:0) e ácido dodecenóico a-hidróxi (Cl2:1) (Cl2 menos que l%). Além disso, stEP.798 produziu 3,0 g/L de ácidos graxos a 72 horas. Em conclusão, a expressão de uma proteína de fusão CYP153A-Red450RhF híbrida melhorada em uma cepa de E.coli com superprodução de ácido graxo permitiu produção de ácido graxo w-hidroxilado de alta titulação a partir de uma matéria-prima de carboidratos renovável.
Exemplo 21: Produção de alta titulação de a,w-diácidos a partir da glicose por cepas de E.coli recombinantes que expressam uma proteína de fusão CYP153A-Red450RhF híbrida melhorada
[00227] Esse exemplo mostra a produção de alto rendimento de a,w-diácidos a partir de uma matéria-prima de carboidratos renovável tal como glicose, por cepas de E.coli recombinantes expressam uma proteína de fusão CYP153A-Red450RhF híbrida melhorada e álcool oxidase heteróloga (alkJ) e aldeído desidrogenase (alkH).
[00228] O gene que codifica uma proteína de fusão CYP153A-Red450RhF híbrida variante (SEQ ID NO: 42) foi clonado em um vetor derivado de pLC1920 (replicon de SC101 modificado, marcador de resistência à espectinomicina), de tal modo que a sua transcrição foi controlada pelo promotor de Ptrc induzível por IPTG e é formado um operon com uma tioestearase de planta (fatB1), um álcool oxidase (alkJ), um aldeído desidrogenase (alkH), uma variante da 3-ceto- acil-ACP sintase (fabB) e um regulador da transcrição (fadR). O plasmídeo foi transformado em cepa L1012 resultando em cepa L1017. Resumidamente, o genoma da cepa de base L1012 continha as seguintes manipulações: os genes fadE (acil-CoA desidrogenase) e adhE (álcool desidrogenase) foram eliminados e um operon da biossíntese do ácido graxo sintético, um acil-ACP desidratase de ácido β-hidr0xi (fabZ) e uma variante de um tioesterase (tesA) foram superexpressos. Além disso, a cepa tinha sido anteriormente submetida ao transposon assim como mutagênese e rastreio de N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG).
[00229] A cepa foi executada em um biorreator como se segue: Um frasco de banco de células da cepa foi cultivado em um frasco de agitação de LB contendo espectinomicina (115 mg/L) a 32°C até que a leitura de OD de cultura > 1. A transferência de 5% v/v dessa cultura é feita em meio com semente FA (2 g/L de cloreto de amônio, 0,5 g/L de cloreto de sódio, 0,3 g/L de fosfato monobásico de potássio, sulfato de magnésio a 1 mM, cloreto de cálcio a 0,1 mM, 20 g/L de glicose, 1 mL/L de uma solução de elementos traços, 10 mg/L de citrato férrico monobásico monoidratado, 100 mM de tampão bis tris, e 115 mg de espectinomicina), e cultivada durante a noite a 32°C. Essa cultura de semente foi depois utilizada para inocular um biorreator preparado para produção. O meio do biorreator inicial para esse processo continha: 0,5 g/L de cloreto de amônio, 1 g/L de cloreto de sódio, 4 g/L de potássio monobásico, 2,2 g/L de sulfato de magnésio heptaidratado, 140 mg/L de cloreto de cálcio diidratado, 10 mL/L de uma solução de elementos traços, 80 mg/L de citrato férrico monobásico triidratado, 0,6 mL/L de uma solução de vitaminas traço, e 5 g/L de pó de milhocina. Adições pos-estéreis para o biorreator incluíram: 0,2 mM de ácido aminolevulínico, 30 g/L de glicose, e 115 mg/L de espectinomicina.
[00230] Antes da inoculação, os parâmetros do biorreator foram estabilizados e ciclos de controle ligados - valor nominal de oxigênio dissolvido: 30%; valor nominal da temperatura: 31°C; valor nominal de aeração: 0,5 vvm; valor nominal de pH: 6,9. Biorreator foi inoculado com 5% v/v de uma cultura de semente e induzida com IPTG a 1 mM quando a densidade da cultura foi superior a OD 30. Uma solução de alimentação de glicose complexa (586 g/L de glicose, 2,2 g/L de sulfato de magnésio heptaidratado, 0,4 g/L fosfato de potássio monobásico, 80 mg/L de citrato férrico monoidratado tribásico, e 10 mL/L de uma solução de elementos traço) foi alimentada à cultura a uma taxa máxima de 10 g/L de glicose (com base no volume nominal da cultura), utilizando um gatilho de pH para indicar ao controlador quando o meio foi esgotado de glicose. O biorreator foi amostrado em toda a execução e colhido após 48 horas de cultivo.
[00231] Figura 26 mostra as quantidades de a,w-diácidos produzidos pela cepa L1017 ao longo do curso 48h a 30,5°C. A cepa produziu 21,2 g/L de a,w-diácidos em 31h a qual atingiu uma alta titulação de 23,9 g/L após 48 h. Os α,w- diácidos produzidos consistiram de 85,9% de ácido α,w- dodecanóico (C12:0), 4,7% de ácido a,w-dodecenóico (C12:1), 5,7% de ácido a,w-tetradecanóico (C14:0), 2,9% de ácido a,w-tetradecenóico (C14:1) e pequenas quantidades ácido a,w-hexadecenóico (C16:10 (C16 menor que 1%). Além disso, L1017 produziu 9,3 g/L de ácidos graxos em 48h. Somente quantidades traço de ácido graxos w-hidróxi foram detectadas. Em conclusão, a expressão de uma proteína de fusão CYP153A-Red450RhF híbrida melhorada em uma cepa de E.coli com superprodução de ácido graxo com a co-expressão de álcool oxidase (alkJ) e aldeído desidrogenase (alkH) permitiu produção de a,w-diácidos de alta titulação a partir de uma matéria-prima de carboidratos renovável.
[00232] Conforme é aparente para aquele versado na técnica, várias modificações e variações dos aspectos e modalidades acima podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo dessa invenção. Tais modificações e variações estão dentro do escopo dessa descrição.

Claims (16)

1. Microrganismo recombinante para a produção de um derivado de ácido graxo w-hidróxi in vivo quando cultivado em um caldo de fermentação na presença de uma fonte de carbono de uma matéria-prima renovável, dito microrganismo caracterizado pelo fato de que compreendendo uma via biosintética engenheirada para expressar sequências de ácidos nucleicos que codificam: (a) um polipeptídeo de acil-ACP redutase de EC 1.2.1.42 ou EC 1.2.1.80; (b) um polipeptídeo de álcool desidrogenase de EC 1.1.-.- ou EC 1.1.1.1; e (c) um polipeptídeo de uma w-hidroxilase modificada de EC 1.14.15.3, em que a w-hidroxilase modificada é uma variante polipeptídica de fusão híbrida CYP153A-redutase e a w-hidroxilase modificada tem uma atividade enzimática da citocromo P450 monooxigenase e catalisa eficientemente a posição-w de cadeias de hidrocarbonetos in vivo; em que a variante do polipeptídeo de fusão híbrida w- hidroxilase consiste na SEQ ID NO: 6 e a variante do polipeptídeo de fusão híbrida w-hidroxilase tem uma ou mais mutações selecionadas de V141I, V141T, V141Q, V141G, V141M, V141L, R27L, R82D, R178N, A231T, N309R, N407A, V415R, T516V, P666A, P666D e A796V.
2. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita variante polipeptídica de fusão híbrida CYP153A-redutase é uma proteína de fusão híbrida CYP153A-RedRhF autossuficiente.
3. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a variante polipeptídicade fusão híbrida de w-hidroxilase tem uma mutação no aminoácido da posição 141 que é V141I e V141T.
4. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a variante do polipeptídeo de fusão híbrida tem uma sequência de aminoácido correspondente a: (1) SEQ ID NO: 32; (ii) SEQ ID NO: 34; (iii) SEQ ID NO: 36; (iv) SEQ ID NO: 38; (v) SEQ ID NO: 40; (vi) SEQ ID NO: 42; (vii) SEQ ID NO: 44; ou (viii) SEQ ID NO: 46.
5. Microrganismo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a acil-ACP redutase é AAR de Synechococcus elongatus.
6. Microrganismo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o derivado de ácido graxo w-hidróxi é α,w-diol.
7. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o α,w-diol é 1,12-dodecanodiol.
8. Cultura de células, caracterizada pelo fato de que compreende o microrganismo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
9. Método para produção de um derivado de ácido graxo w- hidróxi, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer um microrganismo recombinante em um caldo de fermentação, dito microrganismo compreendendo uma via biosintética engenheirada para expressar sequências de ácidos nucleicos que codificam: (a) um polipeptídeo de acil- ACP redutase de EC 1.2.1.42 ou EC 1.2.1.80; um polipeptídeo de álcool desidrogenase de EC 1.1.-.- ou EC 1.1.1.1; e um polipeptídeo de uma w-hidroxilase modificada de EC 1.14.15.3, em que a w-hidroxilase modificada é uma variante polipeptídica de fusão híbrida CYP153A-redutase e tem uma atividade enzimática de citocromo P450 monooxigenase e catalisa eficientemente a posição w de cadeias de hidrocarbonetos in vivo; e em que a variante do polipeptídeo de fusão híbrida w-hidroxilase consiste na SEQ ID NO: 6 e a variante do polipeptídeo de fusão híbrida w-hidroxilase tem uma ou mais mutações selecionadas de V141I, V141T, V141Q, V141G, V141M, V141L, R27L, R82D, R178N , A231T, N309R, N407A, V415R, T516V, P666A, P666D e A796V;; (b) cultivar o microrganismo recombinante em um caldo de fermentação compreendendo uma matéria-prima renovável à base de carbono; e (c) isolar um derivado de ácido graxo w-hidróxi do caldo de fermentação.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a variante polipeptídica de fusão híbrida de w-hidroxilase tem uma mutação no aminoácido da posição 141 que é V141I ou V141T.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a variante do polipeptídeo de fusão híbrida tem uma sequência de aminoácido correspondente a: (1) SEQ ID NO: 32; (ii) SEQ ID NO: 34; (iii) SEQ ID NO: 36; (iv) SEQ ID NO: 38; (v) SEQ ID NO: 40; (vi) SEQ ID NO: 42; (vii) SEQ ID NO: 44; ou (viii) SEQ ID NO: 46.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que a acil-ACP redutase é AAR de Synechococcus elongatus.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que o derivado de ácido graxo w-hidróxi é α,w-diol.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o α,w-diol é 1,12- dodecanediol.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizado pelo fato de que a dita matéria-prima renovável à base de carbono é milho, cana-de-açúcar, grama, ensilagem, palha, madeira serrada, esgoto, lixo, resíduos urbanos celulósicos, gás de combustão, gás de síntese ou dióxido de carbono.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizado pelo fato de que a dita matéria-prima renovável à base de carbono é glicose, frutose, manose, galactose, xilose, arabinose, frutooligosacarídeo, galacto- oligossacarídeo, amido, celulose, pectina, xilano, sacarose, maltose, celobiose, turanose, hemicelulose, metil celulose, carboximetil celulose de sódio, succinato, lactato, acetato, etanol, metanol, glicerol ou suas misturas.
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