TWI464261B - 以基因重組微生物進行碳源轉化生產生物降解高分子與生質燃料的方法 - Google Patents

以基因重組微生物進行碳源轉化生產生物降解高分子與生質燃料的方法 Download PDF

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Description

以基因重組微生物進行碳源轉化生產生物降解高分子與生質燃料的方法
本發明係關於一種利用基因重組微生物生產特定產物的方法，特別是關於一種以基因重組微生物進行碳源轉化生產生物降解高分子與生質燃料的方法。
當前我國生質柴油快速發展，並於民國99年已全面推動B2生質柴油添加，鑑於製造生質柴油後的廢棄產物粗甘油之產量隨之上升，造成環境污染；若將粗甘油精煉再利用，其經濟效益有限。因此，處理粗甘油此副產物成為發展生質柴油的重要關鍵。就世界趨勢而言，先進國家中皆有相關的能源政策法修訂決策，且多數都列入國家發展的重點項目。例如在特定時間點時須將使用石油燃料的車輛，以特定比例更換成使用替代性燃料的車輛，且逐步地增加。在此趨勢之下，生質柴油產能目標亦將對應地提高，屆時龐大生質柴油產能所製造的廢粗甘油勢必成為環境汙染之窘境。因此，若是可利用微生物將粗甘油作有效處理或利用，例如：以粗甘油生產聚羥基烷酯(Polyhydroxyalkanoate,PHA)此種生物性可分解塑料，如此將可提高生質柴油的附加價值。聚羥基烷酯(polyhydroxyalkanoate,PHA)為一種微生物型聚酯，一般主要作為碳源和能量的貯藏物質，當微生物面臨營養不平衡狀態時，會在胞內以疏水性的包涵體累積PHA在胞內，以疏水性顆粒的形式存在，在一定條件下其含量可以超過細胞乾重的90%。從化學結構上講，PHA是羥基脂肪酸(Hydroxyalkanoic acid，HA)的聚合物，結構通式如下所示：
分子量一般為幾萬至幾百萬，m=1-4,n=100-3000,R=C1~C15不等，不同的PHA及其單體具有不同的側鏈R基團，常見的PHA合成物包含聚羥基丁酯(PHB)、聚羥基戊酯(PHV)、PHB與PHV的共聚物PHBV(即分子鏈上同時有PHB和PHV)等數種。根據單體組成的不同，PHA具有從堅硬質脆的硬塑料到柔軟的彈性體等一系列不同的材料學性質。PHA可以由生物可再生資源為原料合成，進入自然界後可以被細菌等生物完全降解，可用以替代傳統的不可降解塑料，是一具有生物相容及生物降解等特性的熱塑性聚合物，因此在醫學與工業上有良好的應用性。
PHAs的生產開發始於1970s年代，當時，ICI公司採用天然土壤中微生物通過醱酵過程生產PHAs。同時，Massachusetts Institute of Technology(MIT)開始採用工程化技術以微生物生產PHAs。這項研發成果於1992年衍生了Metabolix公司。而ICI的技術專利則轉讓給了Zeneca公司，此後此項專利更出讓給了Monsanto公司。而Metabolix公司則於2001年從Monsanto公司收購相關技術專利並與自有成果進行了融合。Metabolix公司於2004年與Archer Daniels Midland(ADM)公司簽約，將使PHA生物可降解塑膠推向大規模工業化，將建設5萬噸產能量產裝置將於2007年底~2008年初投產。採用Metabolix微生物醱酵工藝的生產成本約為US$ 3-5/kg，但工業化量產裝置可望使生產成本低於USD 2-3/kg。Metabolix公司的目標是在創新型的改進裝置中生產PHAs，這一改良途徑可望使生產費用再降低到USD 1-2/kg以下。然而在PHAs生產中成本最高的為醱酵製程所需要的培養基成份，約佔操作成本的50~80%，以上下游原料成本分析探討，其中碳源及氮源成本達料源成本80%以上。高碳源成本形成PHAs商業化及提昇競爭力之障礙，因此若能利用生質柴油工廠所生產的粗甘油做為碳源，可有利於降低PHAs生產成本目標達成。
國外的研究學者於PHA領域上的研究概況，整體而言，包括菌種的改良(有E.coli 以及Wauteria eutropha)，以及基因的突變研究(如phaP，phaR等基因)，放大菌種的培養體積並利用醱酵槽大量生產、及工業化應用測試等技術，除了基因的研究外，亦同時著重於菌種的改質。在中國大陸方面，2008年北京奧運也採用生物可分解性高分子為大會環保訴求的重點，且已有計劃大規模宣傳其在生物分解性塑膠上的研究成果。另外韓國方面，不僅在基本的菌種改殖、代謝途徑的改良具有相當深入的研究之外，另於高密度醱酵量產PHAs的技術成果也頗具參考價值。而在德國的研究團隊亦有針對Ralstonia eutropha微生物，將整個基因序列完整的解碼，並在染色體中於phaC、phaB、phaA基因中發現了同源性基因，不僅對R. eutropha的研究有重要的突破，在其他菌種亦可利用基因比對的方式和基因工程的手法進行產品的改良。英國的研究團隊則利用Bacillus cereus SPV則可生產出多種形式的PHA系列生物聚酯高分子，如：3-hydroxybutyrate(3HB)，3-hydroxyvalerate(3HV)以及4-hydroxybutyrate(4HB)。瑞士的研究團隊則是強調使用不同於微生物系統的基因轉殖植物來生產PHA。美國方面，除了以基因重組大腸桿菌生產系統進行生物聚酯的生產研究之外，為了使下游的應用層面更為廣泛，還針對共聚合物的材料性質做探討。澳洲則是對於Pseudomonas菌屬生產PHA的基因層面調控系統有深入的探討，即使是同屬之間的細菌在基因層級的表現卻有明顯的差異。印度的研究團隊利用光合菌進行PHA生產，加拿大的研究團隊則針對PHAs材料的生物降解性進行測試。
有鑑於生質柴油快速發展的趨勢，以及利用微生物量產PHAs的需求而言，若能利用生質柴油工廠所生產的粗甘油做為碳源，藉由基因重組的技術得到可兼具高效率利用粗甘油作為碳源，且進一步有效生產PHAs，將可有利於降低PHAs生產成本。
緣此，本發明之一目的即是提供一種以基因重組微生物進行碳源轉化生產生物降解高分子與生質燃料的方法。
本發明為解決習知技術之問題所採用之技術手段係提供一種一種以基因重組微生物進行碳源轉化生產生物降解高分子與生質燃料的方法，其步驟包括：(A)以基因重組技術構築具有一甘油利用酵素基因及一聚羥基烷酯合成酶基因之基因重組微生物；(B)將該基因重組微生物培養於一含有甘油之環境中(例如純度70%以上之粗甘油)；(C)誘導該基因重組微生物表現該甘油利用酵素及該聚羥基烷酯合成酶並生產聚羥基烷酯之生物降解高分子及乙醇之生質燃料；(D)分離取得該聚羥基烷酯及乙醇；其中該基因重組微生物之細胞內所產生的聚羥基烷酯至少佔其生物量之30%(w/w)，且其甘油消耗可達90%(w/w)以上。前述基因重組微生物係係於民國101年3月6日寄存在財團法人食品工業發展研究所，其寄存編號為BCRC 940649。
較佳地，其中該甘油利用酵素基因包括一醛還原酶(aldehyde reductase,alrd)基因與一醛去氫酶(aldehyde dehydrogenase,aldH)基因；該聚羥基烷酯合成酶基因係為PhaCAB聚羥基烷酯合成酶基因；該甘油利用酵素基因係構築於一第一表現質體，且該第一表現質體可受一第一誘導劑誘發其表現，該第一誘導劑較佳為L-阿拉伯糖(L-arabinose)；該甘油利用酵素基因係構築於一第二表現質體，且該第二表現質體可受一第二誘導劑誘發其表現，該第二誘導劑較佳為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)；該基因重組微生物之培養溫度範圍係介於25℃~37℃，且其微生物接種量係為3%(v/v)以上，可培養於厭氧環境或耗氧環境下；該基因重組微生物係以兩階段誘導基因調控其甘油之消耗與聚羥基烷酯之生產；該基因重組微生物係為原核生物，較佳為為大腸桿菌(Escherichia coli )；或可為真核生物。
經由本發明所採用之技術手段，經由雙質體基因重組微生物的構築，並以兩階段基因誘導調控方式，包括以L-阿拉伯糖(L-arabinose)進行醛還原酶aldehyde reductase(alrd)與醛去氫酶aldehyde dehydrogenase(aldH)甘油利用酵素誘導，以及以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)進行PHAs合成酵素之誘導，使其培養於耗氧環境時，可利用逾90%(w/v)以上甘油並轉化生產聚羥基烷酯含量達30%(w/w)，基因重組微生物之甘油利用率為原生微生物之2倍。可用於紓緩全球發展替代性能源之環境汙染問題與創造其附加價值，藉微生物代謝甘油合成聚羥基烷酯與乙醇。改善習知技術缺點：例如產量規模未達可量產階段且醱酵原料成本(氮源、抗生素與誘導劑)過高等問題。經由本發明，除可將生質柴油廠之廢棄物粗甘油直接作為培養微生物之營養源，提供攜帶雙質體之微生物進行代謝與合成，舒緩粗甘油過剩、環境汙染等議題，更可生產環境友善之聚羥基烷酯替代性塑料與生質能源乙醇，未來可應用於例如生物技術產業、食品製造業、化學材料製造業、醫學、工業及化學製品製造業等方面。
本發明主要揭露一種以基因重組微生物進行碳源轉化生產生物降解高分子與生質燃料的方法，其係藉由基因重組技術構築具有一甘油利用酵素基因及一聚羥基烷酯合成酶基因之基因重組微生物，將該基因重組微生物培養於一含有甘油之環境中(例如純度70%以上之粗甘油)，且以兩階段誘導調控其生成，包括以L-阿拉伯糖(L-arabinose)進行醛還原酶(aldehyde reductase,alrd)與醛去氫酶(aldehyde dehydrogenase,aldH)之甘油利用酵素誘導，以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)進行聚羥基烷酯合成酶之誘導，以生產聚羥基烷酯之生物降解高分子及乙醇之生質燃料。未改殖原生型微生物之使用甘油效率為50%(w/v)且缺乏PHAs合成酵素，因而無法生產聚羥基烷酯。而本發明藉由經基因轉殖之基因重組微生物，使其培養於耗氧環境，可利用逾90%(w/v)以上甘油並轉化生產聚羥基烷酯含量達30%(w/w)，基因重組微生物之甘油利用率為原生微生物達2倍。
有些細菌能够在自然條件下積累PHA，包括以不同的生物合成途徑進行，其所需的酶及其受質特異性各有不同。根據合成途徑的不同和相關酶的產物特異性，PHA的單體結構也多種多樣，其中3-羥基脂肪酸單體包括了3-羥基丙酸到3-羥基十六酸的所有成員，此外還有4-、5-、6-羥基脂肪酸以及含有不飽和鍵、帶有甲基側鏈或者其他功能基團的3-羥基脂肪酸作為PHA單體的情况。而本發明係採用乙醯輔酶A合成PHA的途徑，其使用基因重組微生物之雙質體策略如第1圖所示，以甘油作為碳源經代謝後得到丙酮酸，經過糖酵解途徑生成乙醯輔酶A，β-酮基硫解酶PhaA催化2個乙醯輔酶A縮合形成乙醯乙醯輔酶A，然後在NADPH依賴的乙醯乙醯輔酶A還原酶PhaB的作用下還原為(R)-3-羥基丁醯輔酶A，最後由PHA合成酶PhaC聚合成PHA。
實施例一、 雙質體E. coli (dual-plasmid)菌株構築
本發明之雙質體E. coli (dual-plasmid)菌株係以下列材料及方法所構築：使用材料：本發明所使用的菌株及質體係列示如下，請參閱如表1所示。
首先從R. eutropha H16取得Genomic DNA，再以此作為模板(Template)進行聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction,PCR)，將醛還原酶aldehyde reductase(alrd)與醛去氫酶aldehyde dehydrogenase(aldH)蛋白基因增幅放大(amplification)後，經DNA電泳分析後確認目標基因片段正確性與限制酶酵素反應並將二基因分別構築(construction)至高複製數pET-23a和低複製數pBAD33之表現質體上，以及將取自R. eutropha H16之聚烴基烷酯合成脢基因phaC、phaB及phaA(簡稱phaCAB)構築至表現質體pBHB2，最後將pARD23、pARD33與pBHB2三表現質體，各別轉型至E. coli BL21 菌株內，完成重組單質體E. coli 菌株(如第2圖所示)。之後，分別測試單質體重組E. coli 菌株於誘導培養下，確認各別目標基因之mRNA表現、蛋白活性比較以及甘油利用效率之差異，經實驗結果整理後，進而取得甘油利用效率較佳的重組E. coli 菌株(pARD33)，並將此重組E. coli (pARD33)菌株與重組E. coli (pBHB2)菌株二表現質體進行雙質體E. coli (dual-plasmid)菌株構築(如第3圖所示)，構築完成的雙質體菌株將進行後續的甘油利用比較與PHB(聚羥基丁酯)累積的測試實驗。前述雙質體菌株係係於民國101年3月6日寄存在財團法人食品工業發展研究所，其寄存編號為BCRC 940649。
實施例二、搖瓶醱酵試驗
本階段所選用之培養基為Define medium，在實例中添加額外的碳源與氮源並舉列影響微生物細胞生長之環境條件與誘導濃度探討情形。
(1)原生 E . coli (WT)與重組 E. coli (dual-plasmid)之試驗
本發明準備數個500 mL之三角錐形搖瓶，取3 mL活化後實驗菌株至錐形搖瓶中(接種量為3%以上)，其中加入30 g L-1 之甘油與2.0 g L-1 之酵母萃取物，搖瓶內培養體積定量為100 mL。培養條件設定為溫度37℃(培養溫度範圍可介於25~37℃)和轉速200 rpm之環境下進行培養。隨後定時從搖瓶中取出適量培養液，再以分光光度計於Optical density 600 nm(OD600 )波長測定培養液之吸光度，目的為了解微生物生長情形。而甘油利用率與PHAs累積含量之分析，則藉由高效能液相層析儀(High performance liquid chromatography,HPLC)和氣相層析儀(Gas chromatography,GC)進行分析確認。
本實施結果整理於表2。由試驗結果可觀察出重組E. coli (dual-plasmid)之乾菌重(DCW)、甘油利用率、PHA含量、產率Yp/s 和ds/t 皆明顯優異於原生E. coli (WT)之表現，顯示所構築之Alrd與AldH之甘油利用酵素與PhaCAB之PHAs合成酵素，皆表達其功能。
表2、E. coli (WT)與重組E. coli (dual-plasmid)培養結果之比較
(2)原生 E. coli (WT)與重組 E. coli (dual-plasmid)於有、無誘導之試驗
本發明為探討誘導劑(L-arabinose與IPTG)對於基因重組微生物於甘油利用與PHA累積之影響，其試驗培養方法與分析方法如同前(1)所述，進行試驗有、無添加誘導劑之比較差異，試驗結果整理於表3。可觀察出E. coli (dual-plasmid)於有、無誘導情況下，甘油利用率優於E. coli (WT)而PHAs累積含量達29%以上，其中E. coli (dual-plasmid)於有誘導培養下，其甘油利用率與PHA累積含量表現皆高於無誘導培養，因此，本發明試驗施以誘導進行培養。
表3、E. coli (WT)與E. coli (dual-plasmid)於有、無誘導之結果
(3)重組 E. coli (dual-plasmid)培養於厭氧環境試驗
本發明為提高微生物之細胞密度，已進行與原生E. coli (WT)比較、有誘導和無誘導培養比較、不同誘導時間比較以及不同培養溫度比較，以上試驗皆於耗氧環境下進行培養。本次試驗依據先前試驗最佳結果，進一步將微生物培養於厭氧環境做各別試驗討論，其培養條件、分析步驟與方法如同前述所示，於37℃培養環境與9小時進行IPTG誘導合成PHAs，本階段試驗結果整理於表4。由結果可明顯觀察出雖未經轉殖的原生E. coli (WT)與重組E. coli (dual-plasmid)均不利於厭氧環境下生長，但重組E. coli (dual-plasmid)能於厭氧環境下合成PHAs，此試驗培養結果相較於耗氧環境，顯示重組E. coli (dual-plasmid)培養於耗氧與厭氧環境表現皆優異於原生E. coli (WT)且達高細胞密度培養則須於耗氧環境下進行。
表4、E. coli (dual-plasmid)於厭氧環境之培養結果
實施例三、醱酵槽醱酵試驗
本發明於實施例二的搖瓶醱酵試驗已完成高細胞密度培養條件之初步確認，並使用define medium培養基添加粗甘油作為唯一碳源培養，且加入L-arabinose與IPTG誘導啟動甘油利用酵素以及PHAs合成酵素，提供原生強迫菌株利用甘油代謝合成PHAs。而實施例三試驗為模擬放大搖瓶試驗結果作為評估大規模消耗甘油與PHAs量產之可能性分析，其醱酵槽試驗結果整理於表5。此醱酵槽結果中，PHAs含量雖未達到30%(w/w)，但甘油利用仍達到94%(w/w)之效率，已符合本發明之目的。
表5、E. coli (dual-plasmid)於醱酵槽培養結果
實施例四、乙醇生產試驗
本乙醇生產試驗是利用實施例二的搖瓶醱酵試驗所建立高細胞密度培養之條件，將證實本發明可作為生產乙醇方法之一，以限定培養基(define medium)添加粗甘油作為唯一碳源培養，加入L-arabinose與IPTG誘導啟動甘油利用酵素以及PHAs合成酵素作用，培養於溫度37℃和轉速200 rpm之搖瓶中進行72小時微生物培養試驗，試驗結果整理於圖2。由圖2可證實，本發明所使用之重組E. coli (dual-plasmid)菌株，利用雙質體策略不僅可以大量消耗甘油生產PHAs且乙醇生產含量可達0.8 g L-1 ，遠高於未經改殖原生E. coli (WT)菌株0.1 g L-1 的乙醇生產含量，其乙醇含量相差8倍。
本發明藉由基因重組微生物代謝甘油以合成聚羥基烷酯與乙醇，且目前利用的雙質體E.coli 無須進行pH調控即可將包括葡萄糖及甘油等碳源轉化成乙醇及聚烴基烷酯。本發明雖以原核生物之E.coli 為例，但亦可利用如真核生物之嗜甲基酵母菌Pichia pastoris 進行生產，並非僅限於原核生物。
由以上實施例可知，本發明所提供之以基因重組微生物進行碳源轉化生產生物降解高分子與生質燃料的方法確具產業上之利用價值，惟以上之敘述僅為本發明之較佳實施例說明，凡精於此項技藝者當可依據上述之說明而作其它種種之改良，惟這些改變仍屬於本發明之精神及以下所界定之專利範圍中。
第1圖係顯示本發明使用基因重組微生物之雙質體策略；
第2圖係顯示pARD23與pARD33以及pBHB2單質體構築示意圖；
第3圖係顯示pARD33與pBHB2之雙質體構築示意圖；
第4圖係顯示E. coli (dual-plasmid)於搖瓶試驗中之乙醇生產量。

Claims (8)

  1. 一種以基因重組微生物進行碳源轉化生產生物降解高分子與生質燃料的方法，其步驟包括：(A)以基因重組技術構築具有一甘油利用酵素基因及一聚羥基烷酯合成酶基因之基因重組微生物BCRC940649(Escherichia coli )，且該甘油利用酵素基因包括一醛還原酶(aldehyde reductase,alrd)基因與一醛去氫酶(aldehyde dehydrogenase,aldH)基因，且該聚羥基烷酯合成酶基因係為PhaCAB聚羥基烷酯合成酶基因；(B)將該基因重組微生物培養於一含有粗甘油之環境中；其中該粗甘油係為純度最低為70%之甘油；(C)誘導該基因重組微生物表現該甘油利用酵素及該聚羥基烷酯合成酶並生產聚羥基烷酯之生物降解高分子及乙醇之生質燃料；(D)分離取得該聚羥基烷酯及乙醇；其中該基因重組微生物之細胞內所產生的聚羥基烷酯至少佔其生物量之20%(w/w)，且其甘油消耗可達90%(w/w)以上。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該甘油利用酵素基因係構築於一第一表現質體，且該第一表現質體可受一第一誘導劑誘發其表現。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該第一誘導劑係為L-阿拉伯糖(L-arabinose)。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該甘油利用酵素基因係構築於一第二表現質體，且該第二表現質體可受一第二誘導 劑誘發其表現。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該第二誘導劑係為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該基因重組微生物之培養溫度範圍係介於25℃~37℃，且其微生物接種量係為3%(v/v)以上。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該基因重組微生物係培養於厭氧環境或耗氧環境。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該基因重組微生物係以兩階段誘導基因調控其甘油之消耗與聚羥基烷酯之生產。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Ingram LO et al.,, "Genetic Engineering of Ethanol Production in Escherichia coli", Applied and Environmental Microbiology, Vol.53, p.2420-2425, 1987/10 Hiroe A et al., "Rearrangement of Gene Order in the phaCAB Operon Leads to Effective Production of Ultrahigh-Molecular-Weight Poly[(R)-3-Hydroxybutyrate] in Genetically Engineered Escherichia coli", Applied and Environmental Microbiology, Vol.78, p.3177-3184, 2012/02/17 *

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