JP2004536553A - 始原ゲノムの本質部分突然変異、突然変異の組合せおよび任意反復による全細胞工学 - Google Patents

始原ゲノムの本質部分突然変異、突然変異の組合せおよび任意反復による全細胞工学 Download PDF

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Abstract

（ａ）複数の差別小分子標識を用意し、但し、その差別小分子標識は（ｉ）ビオチンを含む第一ドメイン、及び（ｉｉ）アミノ酸に共有結合し得る反応性基を含む第二ドメインを含むキメラ標識試薬を含み、そのキメラ標識試薬は少なくとも一つの同位元素を含む、
（ｂ）ポリペプチドを含む少なくとも２種のサンプルを用意し、
（ｃ）差別小分子標識をポリペプチドのアミノ酸に共有結合し、
（ｄ）標識ポリペプチドをビオチン結合カラムに結合し、非結合物質を洗浄してカラムから除き、標識ポリペプチドをカラムから溶離することにより標識ポリペプチドをそのカラムで単離し、
（ｅ）夫々のサンプルのタンパク質濃度をタンデム質量スペクトロメータ中で測定し、そして
（ｆ）夫々のサンプルの相対的タンパク質濃度を比較することを特徴とするサンプル中の相対的タンパク質濃度の比較方法。

Description

【０００１】
Ａ − 発明の属する分野
本発明は、細胞および生体全体の工学に関連する。特に、本発明は、細胞の形質変換、直接進化および希望する性質を有する新規の遺伝形質転換生体のスクリーニング方法に関する。つまり、一つの特徴としては、本発明は、特異的に活性化できる複数の特性を有する微生物や植物などの遺伝性転換生態の生成方法に関する。
本発明はタンパク質操作分野に関する。具体的には本発明はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製するための定方向進化法に関する。より具体的には本発明は、新規ポリペプチドが、それ自身が改良型生物学的分子である、および／または、別の改良型生物学的分子の産生に寄与するような、新規ポリペプチドをコードする新規ポリヌクレオチドを産生するために突然変異導入を使用する方法に関する。さらにより具体的には、本発明は非確率論的ポリヌクレオチドキメラ化および非確率論的部位特異的点突然変異導入の両方を実施するための方法に関する。
したがって、ある局面において本発明は、子孫ポリヌクレオチドの設計が親ポリヌクレオチドセットおよび／または親ポリヌクレオチドにより対応するようにコードされるポリペプチドの分析により導き出される、合成的および非確率論的な手段によりキメラポリヌクレオチドの子孫セットを産生する方法に関する。別の局面においては、本発明は、網羅的、体系的および非確率論的な手段を用いて部位特異的突然変異導入を実施する方法に関する。
さらに、本発明は、末端選抜（ｅｎｄ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）と名づけられた過程によることを含む、産生された子孫分子セットの中から特に望ましい種からなるサブセットを選抜する段階に関し、サブセットはその後更にスクリーニングされうる。本発明はまた、ポリペプチドおよび／または有用な特性を有する発現された別の生物学的分子を産生するためのポリヌクレオチドセットをスクリーニングする段階に関する。
本発明によりその製造が教示されている新規生物学的分子には、遺伝子、遺伝子経路、および、直接コードされるポリペプチドおよび／またはそのようなポリペプチドにより影響をうける任意の分子を含む、それにより発現が影響をうける任意の分子が含まれる。上記新規生物学的分子には炭水化物、脂質、核酸および／またはタンパク質成分を含有するものが含まれ、これらに限定されないが、具体的なこれらの例には抗生物質、抗体、酵素ならびにステロイド性ホルモンおよび非ステロイド性ホルモンが含まれる。
ある特定の非制限的局面においては、本発明は、酵素、特に耐熱性酵素、および定方向進化によるそれらの産生に関する。より詳細には、本発明は高温において安定であり低温において改良された活性を有する耐熱性酵素に関する。
【０００２】
Ｂ − 背景
発明が解決しようとする問題の概要
要約：遺伝的変質を得るための遺伝子操作の工程が、操作された生体に対し危険、有毒、有害または致命的な影響を及ぼし得ることは、明確である。このことは、遺伝操作が大きくになるにつれ、特に顕著となる。技術的な面から言えば、この問題は現在、多くの遺伝形質転換的特質を有する遺伝改変生体の生成の妨げとなる障害の一つとして見られている。
市場面においては、遺伝改変生体の購入価格はしばしば、その生体に導入された遺伝形質転換特質の数に左右、または比例することは明確である。その結果、多くの遺伝形成転換的特質を有する遺伝操作された生体の製造および購入は非常に高価であり、経済的には需要が低い。
一方、単独の遺伝形成転換的特質を有する生体の生成も、他の理由からではあるが、好ましくない費用の発生につながる。したがって、それぞれ単独の遺伝形成転換的特質を有する遺伝子改変生体の隔離製造、マーケティングおよび保管は、在庫管理費を含む、好ましくないコストがかかることは理解されるであろう。例えば、そのような生体には、それぞれの特質別に異なった貯蔵庫が必要になることがある。また、ある特殊な単独特質を有する生体の価値は、しばしばその特殊な特質の市場性に密接に関わっており、市場性が減少すると、そのような生体の在庫は、他の市場で販売することができない。
【０００３】
本発明は、特異的に活性化できる蓄積された多くの特性を有する遺伝子改変生体の製造方法を提供して、これらおよびその他の問題を解決するものである。そのような（特異的に活性化できる多くの蓄積された特性を有する）遺伝子改変生体を購入することにより、それを購入する顧客には、特異的に活性化できる、全て特性のうちのある種のものを選択し支払うオプションが提供されることになる。本発明により提供される経済的利点の１つは、例えば、多くの特質の保管に単独の保管倉庫が使用できるため、そのような遺伝子改変生体の保管が単純化されることである。 また、このタイプの単独生体は、様々な特質の需要を満たすことができる；その結果、そのような生体は、多様な市場で販売することができる。
特異的に活性化できる蓄積された多くの特性を有する遺伝子改変生体の製造を達成するため、本発明は、１つの特異的な面、つまり全体レベルにおいて細胞または生体をモニターするステップを含む工程を提供する。これにより、相当量の遺伝子操作の対象となる作業中の細胞または生体に関する情報を、隔離的ではなく、全体的に収集することができるのである。また本発明により、この種の全体的モニターは、形態的、性質的および物理的特性の検出のすべてを含むことができる。
それにより、本発明により提供される全体的モニターは、作業中の細胞または生体（例えばゲノム全体を含むすべての核酸、メッセンジャーＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびミトコンドリア核酸、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウィルス、およびすべてのエピゾーム核酸および共生核酸）に含まれるすべての遺伝物質の特定および／または定量を提供することができる。また本発明により提供される全体的モニターでは、作業中の細胞または生体が生成する遺伝子生成物をすべて含むこともできる。
【０００４】
更に、本発明により提供される全体的モニターは、少なくとも化学的に作業中の細胞または生体中の部分的なタンパク質である分子すべての特定および／または定量を含む。本発明により提供される全体的モニターはまた、少なくとも化学的に作業中の細胞または生体中の部分的な炭水化物である分子すべての特定および／または定量を含む。本発明により提供される全体的モニターはまた、少なくとも化学的に作業中の細胞または生体中の部分的なプロテオグリカンである分子すべての特定および／または定量を含む。本発明により提供される全体的モニターはまた、少なくとも化学的に作業中の細胞または生体中の部分的なグリコプロテインである分子すべての特定および／または定量を含む。本発明により提供される全体的モニターはまた、少なくとも化学的に作業中の細胞または生体中の部分的な核酸である分子すべての特定および／または定量を含む。本発明により提供される全体的モニターはまた、少なくとも化学的に作業中の細胞または生体中の部分的な脂質である分子すべての特定および／または定量を含む。
【０００５】
一面として、本発明は、例えば、特殊な活性特性（または活性フィンガープリント）を持つ活性されるべき酵素によって、多くの酵素うちの一つの酵素等、特異的に多くの特質から一つを活性化させる能力を提供する。酵素の活性特性には、その反応を引き起こすことおよび、その特異性が含まれる。つまり、酵素活性特性には、以下が含まれる：
触媒した反応
反応のタイプ
天然基質
基質スペクトラム
生成物スペクトラム
阻害剤
コファクター／補欠分子
金属成分／それに影響を与える塩
比活性
Ｋｍ 値
至適 ｐＨ
ｐＨ 範囲
至適温度
温度範囲
【０００６】
また、酵素が処理の過程（（抽出及び精製）や不適切な保存などによる様々な要因によりディファレンシアルに影響を受けることも判断に含まれる。従って、酵素の違いは以下の要因により明らかになり得る。
単離／調製
精製
結晶化
リナチュレーション
【０００７】
分子安定性の違いを選択された酵素のディファレンシアルな活性化あるいは不活性化に便宜的に用いることが可能であることも判断に含まれる。以下の要因に範囲を持たせ中に酵素を適当な時間の範囲で置くことによってそれらは可能である。
ｐＨ
温度
有機溶媒
種々の保存状態
【０００８】
つまり蓄積された複数の特質のうちの選択された特質を特異的に活性化させるためには、非常に特殊な特徴（例えば、特殊な酵素フィンガープリント）を持つ分子（例えば、酵素）によって与えられた、作業中の細胞または生体の特質が導入されることが望ましいことは、明らかである。更に、広範囲に渡る分子フィンガープリントを有する分子を得るためには、自然界の獲得できる限り多様な分子を回収することが有利であることは、明白である。つまり、培養された中温性の生体だけではなく、その多くは培養されていない極限環境微生物からも回収することは、有益である。
他の面では、自然界の潜在的な多様性を十分に回収することには、発見の段階および、発見されたものの最大活用の段階が含まれる。例えば、発見の段階では、商業的有用性を持つ生物分子の探査をすることができる。生物の多様性を十分回収する能力、つまり広範囲に渡る環境状況から生物分子を探し出すことは、商業的応用の中で得られるような極度な状況を含む、多様な状況下で機能するように適合させた新規の分子を発見する能力に必須であることは、明白である。
しかし、特定の商業的需要目的に適確に合った自然界の選択および／または生残性の基準があることは、非常に少ない。むしろ、多くの場合には、自然に発生する分子は、特定の満たされない商業的需要を満たすために、微調整から広範囲な変形まで、一定の量の変化を必要とする。つまり、特定の商業需要を満たすためには（例えば、特定の商業工程条件下で機能する分子の需要等）自然表現分子を実験的に変位させ、自然的進化により提供される、および／または近未来に提供され得る特質を超えるものを得ることも有利である。
【０００９】
Ｃ − 発明の概要
本発明は、一般に細胞および生体全体の工学に関するものである。特に、本発明は、好ましい特性を有する新規の遺伝形質転換生体を生成する細胞形質変換、指向進化、およびスクリーニング方法に関するものである。そのため一面として、本発明は、特異的に活性化できる複数の特質を持つ、微生物や植物等の遺伝形質転換生体の生成方法に関するものである。
【００１０】
一実施例においては、本発明は、望ましい特質を有する改良生体を生成する方法を導くものであり、以下の段階を含む：ａ）生体の初期個体群を得る、ｂ）突然変異生体群内の遺伝子改変すべてが全体として取られた時に、実質的な遺伝子改変群が現れているような、突然変異生体群を生成する、およびｃ）上記の改良された生体の存在を検出する。本発明は、ａ）、ｂ）そしてｃ）の段階すべてを提供するもので、どのような順序でも何度でも繰り返されてよい。；したがって、特に本発明は、多くの反復を伴った、段階ａ）、ｂ）、およびｃ）のすべての反復組合せからなる方法を提供するものである。
他の実施例では、本発明は、望ましい特質を有する改良された生体の生成方法を、以下の方法で導く：ａ）クローン個体群でもそうでなくてもよい、生体の初期個体群を得る、ｂ）突然変異生体群内の遺伝子改変すべてが全体として取られた時に、実質的な遺伝子改変群が現れているような、少なくとも１つの遺伝子改変を有する突然変異生体群を生成する、ｃ）少なくとも２つの遺伝子改変を検出する、およびｄ）少なくとも２つの検出された遺伝子改変を１つの生体に導入する。また、本発明によればａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）のすべての段階を、どのような順序でも何度でも更に繰り返すことができる；したがって、本発明は特に、ａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）の段階の反復組合せすべてからなる方法を提供するもので、反復の合計は、その間のすべての整数値を含む、１〜１００万回でもよい。
【００１１】
本書に明記される好ましい実施例においては、段階ｂ）の２つめの突然変異生体群の発生は、生体のそれぞれが特定の移植遺伝子突然変異を有する複数の生体の発生からなる。
ここで使われる「遺伝子改変を伴う突然変異生体の発生」は、例えば、イオン化および紫外線のような突然変異で知られるすべての放射を含む突然変異の分野で知られている方法であれば、どのような方法でも達成することができる。その他の有用な突然変異方法の例には、サイト飽和突然変異、トランスポゾンをベースにした方法、および相同的組替えが含まれる。
「組合せ」とは、同じ生体の遺伝子構造（例えば、ゲノム）内に複数の異なった遺伝子改変を組み入れることを意味し；この「組み合せ」を達成する方法の段階には性的組替え、相同的組替え、およびトランスポゾンをベースにした方法が含まれる。
ここで使われる「生体の初期個体群」は「作業中の生体の個体群」を意味し、それは、単純に少なくとも１つの生体を含む、作業中の生体の個体群を意味する。「生体の初期個体群」はクローンされた個体群でもそうでなくてもよい。
したがって、段階１）では「生体の初期個体群」は多細胞生体、単細胞生体、または両方の個体群でもよい。「生体の初期個体群」は、単細胞生体、多細胞生体または両方を有していてもよい。「生体の初期個体群」は、原核生物生体、真核生物生体または両方を有していてもよい。本発明によれば「生体の初期個体群」少なくとも１つの生体を含むもので、好ましい実施例も少なくともそれを含む。
【００１２】
「生体」は、すべての生物形、または自己複製またはホスト内での複製が可能である物体を意味する。「生体」の例には、以下の種類の生体が含まれる（この種類は、必ずしも相互排除的ではない）：動物、植物、昆虫、シアノバクテリア、微生物、真菌、細菌、真核生物、原核生物、マイコプラズマ、ウィルス性生体（ＤＮＡウィルス、ＲＮＡウィルスを含む）、およびプリオン。
これに限定されない、好ましい例の「生体」の種類にはまた、アーケア（古細菌）およびバクテリア（真性細菌）が含まれる。ここに限定されないアーケア（古細菌）の例には、クレン古細菌、ユーリ古細菌およびコル古細菌が含まれる。これに限定されないバクテリア（真性細菌）の例には、Ａｑｕｉｆｉｃａｌｅｓ、ＣＦＢ／緑色硫黄細菌群、クラミジア／Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ群、Ｃｈｒｙｓｉｏ遺伝子群、Ｃｏｐｒｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ群、シアノバクテリアおよびクロロプラスト、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ／Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ／Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｓ群、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ群、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ／Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ群、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｆｌｅｘｉｓｔｉｐｅｓ群、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、緑色非硫黄菌、ニトロスピラ群、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、プロテオ細菌、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｌｅｓ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ群、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ群、テルモトーガ、Ｔｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ群が含まれる。ここに限定されない例として、特に好ましい生体の種類にはアクイフェックス、アスペルギルス、桿菌、クロストリジウム、大腸菌、乳酸桿菌、ミコバクテリア、シュードモナス、ストレプトミセス、およびテルモトーガが含まれる。その他、ここに限定されない例として、特に好ましい生体にはＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＥＫ２９３、およびＷＩ３８等の培養生体が含まれる。ここに限定されないが、特に好ましい生体の例には、更に組み換え体分子の発現に役立つホスト生体を含む。生体には、更に、初代培養（例えば、哺乳類の組織から回収した細胞等）、不死化細胞、すべての培養および培養可能な細胞および多細胞生体、またすべての非培養および培養不可能な細胞および多細胞生体を含む。
【００１３】
好ましい実施例では、請求項の方法を行うには、ゲノム情報の知識が役立つ；つまり、本発明は、以下の好ましいがここに限定されない生体の例を提供するものであり、これらは、完全ではないにしろかなりの量のゲノム配列情報があるため、本発明に特に役立つ。（一次配列および／または注釈に関して）それらの生体は：ヒト、昆虫（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、高等植物（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、原生動物（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、線虫（例えば、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、真菌類（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、γ−プロテオバクテリア（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ 、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ、Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ ９ａ５ｃ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ Ｅｌ Ｔｏｒ Ｎ１６９６１、シュードモナス ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡ０１、Ｂｕｃｈｎｅｒａ ｓｐ． ＡＰＳ）、β−プロテオバクテリア（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＭＣ５８ （セログループＢ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｚ２４９１（セログループＡ））、その他のプロテオバクテリア（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ２６６９５、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ Ｊ９９、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１１６８、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、グラム陽性菌（例えば、Ｂａｃｈｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ）、クラミジア （例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓｓｅｒｏｖａｒ Ｄ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｍｕｒｉｄａｒｕｍ （Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ＭｏＰｎ）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＷＬ０２９、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＲ３９、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｊ１３８）、スピロヘータ（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ Ｂ３１、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、シアノバクテリア（例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ６８０３）、Ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔａｎｔ バクテリア（例えば、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ Ｒ１）、超好熱バクテリア（例えば、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍｅ ＭＳＢ８）、およびアーケア（例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ ｄｅｌｔａＨ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ ＯＴ３、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ Ｋ１）である。
【００１４】
ここに限定されないが特に好ましい、植物「生体」の種類の例を表１に示す。
【００１５】
表１． 植物生体およびここに限定されない植物生体および遺伝形質転換分子の供与源の例（例えば、核酸および核酸生成物）
Figure 2004536553
【００１６】
ここで使われる「遺伝子改変を有する突然変異生体群の発生」の意味には、置換、削除また、生体へのヌクレオチド配列の導入の手段が含まれる；また本発明は、この目的に適したヌクレオチド配列を提供するものであり、それは一本鎖でも二本鎖でもよく、その長さは、具体的にその間のすべての整数値を含むヌクレオチド１個からヌクレオチド１０，０００，０００，０００個 までの長さである。
生体の突然変異には、その生体を符号化する１つ以上の分子構造の改変を含む。これらの分子には、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プリオン分子を含み、 ゲノムのＤＮＡ、エピゾーム、核の、またはベクトル化された核酸（例えば、ウィルス性、コスミド、ファージ、ファージミド）等のような生体内の多様な分子によって例示される。
その一面として、ここで使われる「著しい遺伝子改変」は、好ましくは、具体的にその間のすべての整数値を含む、少なくとも１５〜１５０，０００ゲノム位置の（例えば、遺伝子、プロモーター、調節配列、コドン等）ヌクレオチド配列分断（例えば、機能的ノックアウト）である。また、ここで使われているように、「著しい遺伝子改変」は、具体的にその間のすべての整数値を含む、少なくとも１５〜１５０，０００個の遺伝子の、発現レベルでの改変（例えば、発現レベルの増減）または、発現パターンの改変（例えば、長期にわたるもの）であることが望ましい。その他の面に関連し、ここで使われる、「著しい遺伝子改変」は、好ましくは、具体的にその間のすべての整数値を含む、少なくとも１５〜１５０，０００の遺伝子生成物および／または表現型および／または特質の発現レベルでの改変（例えば、発現レベルの増減）または発現パターンの改変（例えば、長期にわたるもの）であることが望ましい。
【００１７】
また、ここで使われる、生体（または生体の種類）に関する「著しい遺伝子改変」は、生体（または生体の種類）内における、具体的にその間のすべての整数値である％を含む少なくとも約１％〜約１００％のゲノム位置またはヌクレオチド配列（例えば、遺伝子、プロモーター、調節配列、コドン等）の分断であることが好ましい。また他の面において、ここで使われる「著しい遺伝子改変」は、生体（または生体の種類）内の、具体的にその間のすべての整数値である％を含む、少なくとも約１％〜約１００％の遺伝子の、発現レベルでの改変（例えば、発現レベルの増減）または発現パターンの改変（例えば、長期にわたるもの）であることが好ましい。その他の局面に関し、ここで使われる「著しい遺伝子改変」は、生体（または生体の種類）内の、具体的にその間のすべての整数値である％を含む、少なくとも約１％〜約１００％の遺伝子生成物および／または表現型および／または特質の、発現レベルでの改変（例えば、発現レベルの増減）または発現パターンの改変（例えば、長期にわたるもの）であることが好ましい。
また更に、ここで使われる「著しい遺伝子改変」は、具体的にその間のすべての整数値を含む、少なくとも約１５〜１５０，０００の遺伝子プロモーターまたはその他のヌクレオチド配列（それぞれの配列が１〜１０，０００，０００塩基である）の導入または削除であることが望ましい。例えば、「サイト飽突然変異」および／または「連結の再構築」（ここに明記された特定の特徴をすべて含む）によって生成された、少なくとも約１５〜１５０，０００のヌクレオチド（遺伝子またはプロモーター）ライブラリーを「生体の初期個体群」に導入することができる。
ここに明記された複数の「遺伝子」操作が行われるときには必ず遺伝子経路（例えば、最終的に小分子の生成につながる）が含まれる。ノックアウト、発現レベルの改変、および発現パターンの改変は、この例に制限されないが、ヌクレオチド配列の突然変異や、遺伝子の発現に影響するプロモーターに対応して達成することができる。
ここで使われる「突然変異生体」は、遺伝突然変異により改変されたすべての生体を含む。
「遺伝突然変異」とは、限定されたり相互排除されるものではないが、生体に（例えば内包される、またはその部分と考えられる）付随する、ゲノム、ゲノム外、エピゾーム、ミトコンドリア、およびヌクレオチド配列すべてに関連する、ヌクレオチド配列の変化（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。
本発明によれば、「遺伝突然変異」の発現の検出は「検出可能要因の発現の検出」を意味し、それには、ここに限定されるものではないが、遺伝配列の変化が含まれる。したがって、本発明は、本発明の方法によっては必要となる、ゲノムＤＮＡの配列決定（および／または注釈）の手段を提供するもので、例としてここに示される配列決定（および／または注釈）の手段に限られるものではない。
ここで使われるところの、検出可能な「特質」は、生体に関連する検出可能な要因すべてを指す。したがって、そのような検出可能な「要因」には、例に限定されるものではにが、検出可能なすべての「ヌクレオチドノックイン」、検出可能なすべての「ヌクレオチドノックアウト」、検出可能なすべての「ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ」、および検出可能なすべての「遺伝子型」が含まれる。また実例としては、「特質」には、生体が生成した、または生成しなかったすべての物質が含まれる。したがって、「特質」には、生存力または非生存力、性質、成長率、大きさ、および形態が含まれる。「特質」には、遺伝子生成物または遺伝子経路生成物の発現の増加（または減少）が含まれる。「特質」にはまた小分子の生成（ビタミン、構成物質を含む）、除草剤耐性、乾燥耐性、病害虫耐性、すべての組換え型生体分子生成（例えば、ワクチン、酵素、タンパク製剤、キラル酵素）が含まれる。本発明に有用な特質その他の例を表２に示す。
表２ ここに限定されない、本発明の方法による有用な遺伝子、遺伝子生成物、表現型、または特質（例えば、ノックアウト、ノックイン、発現レベルの増減、発現パターンの増減）の例
【００１８】
表２ − その１ ここに限定されない遺伝子および遺伝子生成物の例
Figure 2004536553
Figure 2004536553
【００１９】
表２ − その１（続き） ここに限定されない形質転換遺伝子および遺伝子ノックアウトの例
Figure 2004536553
Figure 2004536553
【００２０】
表２ − その１（続き） ここに限定されない形質転換遺伝子および遺伝子ノックアウトの例
Figure 2004536553
【００２１】
表２ − その２ ここに限定されない入力特性／表現型の例
Figure 2004536553
Figure 2004536553
【００２２】
表２ − その２（続き） ここに限定されない形質転換入力特性／表現型の例
Figure 2004536553
【００２３】
表２ − その３ ここに限定されない出力特質／表現型の例
Figure 2004536553
Figure 2004536553
【００２４】
表２ − その４ ここに限定されない農学的特質を持つ特性／表現型の例
Figure 2004536553
Figure 2004536553
【００２５】
表２ − その５ ここに限定されない製品品質特性を有する特質／表現型
Figure 2004536553
Figure 2004536553
【００２６】
表２ − その６ ここに限定されない、除草剤耐性特性を有する特質／表現型の例
Figure 2004536553
【００２７】
表２ − その７ ここに限定されない病害虫耐性特性を有する特質／表現型の例
凡例
Figure 2004536553
Figure 2004536553
Figure 2004536553
【００２８】
表２ − その７（続き） ここに限定されない病害虫耐性特性を有する特質表現型の例
Figure 2004536553
【００２９】
表２ − その８ ここに限定されないその他の特性を有する特質／表現型
Figure 2004536553
【００３０】
ある特定の例においては、「希望する特質を有する生体の生成」は、ある器官または器官の部分に関する生体であり、他の部分は改変されていないものを含む。
「特質」はある条件下における生体に関連した検出可能な要因を意味する。「検出可能な要因」の例には、物質を生成する能力、物質を生成しない能力、物質を生成する能力の改変パターン（例えば増減）、生存力、非生存力、性質、成長率、大きさ、形態または形態学的特徴が含まれる。
本発明の実施例では、望ましい特質または特質の望ましい改良を有する生体の生成方法を以下の方法で提供する：ａ）少なくとも１つの始源生体を有する初期個体群を得る、ｂ）少なくとも１つの初期生体の実質的なゲノム部分を通して突然変異が起こるように、個体群に突然変異を起こさせる、ｃ）少なくとも１つの望ましい特質または特質の望ましい改良を有する突然変異生体を選択する、そしてｄ）任意に、少なくとも１つ以上の突然変異生体を繰り返し方法に供することにより、その方法を繰り返す。望ましい特質または特質の望ましい改良を有する突然変異生体は「ＵＰ−突然変異種」と称してもよく、またＵＰ−突然変異生体を有する関連の突然変異をＵＰ−突然変異と称してもよい。
一実施例においてｃ）の手段は、それぞれ異なった突然変異ゲノムを有する少なくとも異なる２つの突然変異生体の選択、および望ましい特質または特質の望ましい改良を有する生体の生成方法を含み、それには以下が含まれる。ａ）少なくとも１つの始源生体を有する初期個体群を得る、ｂ） 少なくとも１つの初期生体の実質的なゲノム部分を通して突然変異が起こるように、個体群に突然変異を起こさせる、ｃ）少なくとも２つの望ましい特質または特質の望ましい改良を有する突然変異生体を選択する、ｄ）２つ以上の突然変異生体の突然変異の組合せを創造する、ｅ）望ましい特質または特質の望ましい改良を有する少なくとも１つの突然変異生体を選択する、およびｆ）任意に、少なくとも１つ以上の突然変異生体を繰り返し方法に供することにより、その方法を繰り返す。
【００３１】
一実施例において、この方法は繰り返される。つまり、例えば、あるＵＰ−突然変異生体は上記の方法のために始源生体となりうる。また例えば、ゲノム内に２つ以上のＵＰ−突然変異の組合せを有するＵＰ−突然変異生体は、上記の方法のために始源生体となりうる。
つまり、一実施例においては、本発明は 望ましい特質または特質の望ましい改良を有する生体の生成方法を以下の方法で提供するものである：ａ）少なくとも１つの始源生体を有する初期個体群を得る、ｂ）少なくとも１つの初期生体の実質的なゲノム部分を通して突然変異が起こるように、個体群に突然変異を起こさせる、ｃ）望ましい特質または特質の望ましい改良を有する少なくとも１つの突然変異生体を選択する、およびｄ）任意に、少なくとも１つ以上の突然変異生体を繰り返し方法に供することにより、その方法を繰り返す。望ましい特質または特質の望ましい改良を有する突然変異生体は「ＵＰ−突然変異種」と称してもよく、またＵＰ−突然変異生体を有する関連の突然変異をＵＰ−突然変異と称してもよい。
少なくとも１つの初期生体の実質的なゲノム部分を通して突然変異が起こるように、個体群に突然変異を起こさせるということは、ゲノムの少なくとも約１％の遺伝子、またはゲノムの少なくとも約１０％の遺伝子、またはゲノムの少なくとも約２０％の遺伝子、またはゲノムの少なくとも約３０％の遺伝子、またはゲノムの少なくとも約４０％の遺伝子、またはゲノムの少なくとも約５０％の遺伝子、またはゲノムの少なくとも約６０％の遺伝子、またはゲノムの少なくとも約７０％の遺伝子、またはゲノムの少なくとも約８０％の遺伝子、またはゲノムの少なくとも約９０％の遺伝子、またはゲノムの少なくとも約９５％の遺伝子、またはゲノムの少なくとも約９８％の遺伝子に突然変異を起こさせることである。
【００３２】
ある特定の実施例において、本発明は、望ましい特質または特質の望ましい改良を有する生体の生成方法を以下の方法で提供するものである。：ａ）ゲノムの配列情報を得る；ｂ）得たゲノム情報に注釈を加える；ｃ）ゲノムの本質部分に突然変異を起こす；ｄ）望ましい特質または特質の望ましい改良を有する少なくとも１つの突然変異ゲノムを選択する；およびｅ）任意に、少なくとも１つ以上の突然変異ゲノムを繰り返し方法に供することにより、その方法を繰り返す。
つまり一面として、本発明は以下を含むプロセスを提供するものである。
【００３３】
１）作業中の細胞または生体を全体モニターする（これには、すべての検出可能機能および物理的要因の検出および／または測定が含まれる）。そのような要因の例には、形態、性質、成長、刺激物への反応性（例えば、抗生物質、異なった環境、等）が含まれる。その他の例には、化学的には少なくとも部分的に核酸、タンパク質、炭水化物、プロテオグリカン、グリコプロテイン、または脂質である分子を含む、すべての測定可能分子が含まれる。ある特徴において、マイクロアレーを使った方法を有する全体モニターが行われる。他の局面においては、ゲノムの本質的な部分の配列決定を含む、全体的モニターを行う。本質的な部分とは、例えばゲノムの少なくとも約１０％または、例えばゲノムの少なくとも約２０％または、例えばゲノムの少なくとも約３０％または、例えばゲノムの少なくとも約４０％または、例えばゲノムの少なくとも約５０％または、例えばゲノムの少なくとも約６０％または、例えばゲノムの少なくとも約７０％または、例えばゲノムの少なくとも約８０％または、例えばゲノムの少なくとも約９０％または、例えばゲノムの少なくとも約９５％または例えばゲノムの少なくとも約９８％である。
２）選択的に、特異的に活性化できる特質を含む、複数の特質（蓄積された特質）を作業中の細胞または生体に導入する。この目的に役立つ特質には、遺伝子に与えられた特質および遺伝子経路に与えられた特質が含まれる。
３）作業中の細胞または生体の全体モニターを行う。
４）手段１）および３）から得た情報を編纂し、作業中の細胞または生体に導入された改変をより理解するために処理および／または分析する。そのようなデータ処理には、測定要因同士または測定要因内の関係を特定することが含まれる。
５）任意のまたはすべての手段２）、３）、および４）を繰り返す。
本発明は遺伝形質転換特質の植物への導入に役立つ分子を提供するもので、それにはすべての知られている遺伝子と核酸が含まれる。これらの例に限定はされないが、本発明は、ここに記述された、またはここに参考として組みいられた参考文献に記述された遺伝子の数および／または組合せをすべて列挙するものである。更に、これらの例に限定はされないが、本発明はまたここに参考として組みいられた参考文献に記述された遺伝子および遺伝子経路をすべて列挙するものである。本発明は、検出可能な要因そして役立つ分子を提供するもので、それには、分子、すべての酵素、それらの基質、それらの生成物、および、すべての図を含む本文に記述された、またはここに参考として組みいられた参考文献に記述されたすべての遺伝子および遺伝子経路を含む。
【００３４】
本発明はまた、概して核酸工学およびそれに伴う暗号化組換え型タンパク質工学に関連する。より詳しくは、本発明は、対象となる活性のために、核酸の指向的進化、および進化した核酸を有するクローンのスクリーニングに関するもので、そのような特定のタンパク質、特に酵素を有する核酸活性が、対象となる活性である。
本発明による突然変異分子は、点突然変異を有するキメラ分子および分子を有していてもよく、それには、炭水化物、脂質、核酸、および／またはタンパク質化合物、および、ここに限定されない詳細な例としては抗生物質、抗体、酵素、ステロイドおよび非ステロイドホルモンを有する生物分子を含む。
本発明は、概して以下の方法に関する：１）一つ以上の祖先または親テンプレートから、少なくとも一つの点突然変異、追加、削除、および／またはキメラ化を達成する突然変異である、子孫分子の調整（ポリヌクレオチド配列からなる分子、ポリペプチド配列からなる分子、および部分的にポリヌクレオチド配列および部分的にポリペプチド配列からなる分子を含む）；２）好ましくは高スループット法を使用した、少なくとも一つの関連する特質のための、子孫分子のスクリーニング（例えば酵素活性の改良または安定化増加、または新規の化学療法効果等）；３）任意に、親および／または子孫分子の、構造および／または機能情報の獲得および／またはリスト作成；および４）任意に、手段１）〜３）の何れかの繰り返し。
【００３５】
好ましい実施例において、（例えば、親ポリヌクレオチドテンプレートから）「コドンサイト飽和突然変異誘発」と呼ばれるものが生成される−少なくとも最高３つの連続した点突然変異一式を有する（例えば新規のコドンを含む異なった塩基）子孫ポリヌクレオチド、それは例えば、すべてのコドン（または同じアミノ酸を暗号化する同義コドンのすべての系統群）は、それぞれのコドン位置によって表される。この子孫ポリヌクレオチドに対応し−また暗号化されて−、少なくとも一つの単独アミノ酸点突然変異を有する子孫ポリペプチドが生成される。好ましくは「アミノ酸サイト飽和 突然変異誘発」において、ポリペプチドに伴うそれぞれすべてのアミノ酸位置において１９の自然暗号化ポリペプチド形成α−アミノ酸置換で、それぞれに突然変異ポリペプチドの一つが発生する。これにより、親ポリペプチドに伴うそれぞれすべてのアミノ酸位置に、起源アミノ酸を含む合計２０の異なった子孫ポリペプチド、または、２０の自然暗号化アミノ酸に変わって、または追加して新たなアミノ酸が使用された場合には、場合によって２２以上の異なった子孫 ポリペプチドを生み出す。
つまり、他方では、２０の自然暗号化ポリペプチド形成α−アミノ酸に加えて、および／または組み入れて、この方法は、その他の希少および／または非自然暗号化アミノ酸またはアミノ酸誘導体を有する突然変異体の生成に有益である。また、他方では、この方法はまた、適切なホストの自然または非改変コドン認識システムに加えておよび／または組み入れて、改変、形質転換および／またはデザイナーコドン認識システムを利用して突然変異を引き起こすことに有益である。
（例えば１つ以上の改変ｔＲＮＡ分子を有するホスト細胞。）
また、本発明は、組換えに関するもので、より詳細には、生体内で部分的相同性のある範囲を含むポリヌクレオチド配列を再分類し、ポリヌクレオチドを分類して少なくとも１つのポリヌクレオチドを形成し、役立つ特質を有するポリペプチドの生成のためにポリヌクレオチドをスクリーニングすることによって、ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドの調整方法である。
【００３６】
その他の好ましい実施例において、本発明は、分子特性（例えば、酵素活性）や現在の技術で得られる特性の組合せに関し、得られた突然変異の効果をすべて分析、カタログ化するのに役立つ（特に飽和突然変異誘発を含む）。つまり、親ポリペプチド内のそれぞれのアミノ酸を、少なくとも１９の可能な置換物それぞれに変化させる効果を判定する総合的な方法を提供するものである。これにより、親ポリペプチド内のそれぞれのアミノ酸は、ポリペプチドの測定可能な潜在特性の範囲に応じて、特徴づけられまた、カタログ化されることになる。
また、本発明の方法は、分子の組換えおよび／または複雑な配列や、相同範囲を有する反復または連続した配列の範囲を還元する媒介となるよう、細胞の自然特性を活用する。
本発明の目的の一つは、強化された活性を有する生物学的に活性であるハイブリッドポリペプチドを暗号化するハイブリッドポリヌクレオチドを生成する方法を提供することである。これらのまたその他の目的を達成するにあたり、本発明の特徴によれば、ポリヌクレオチドを適切なホスト細胞に導入しハイブリッドポリヌクレオチドを生成する条件下でホスト細胞を成長させる方法が提供される。
本発明の他の特徴では、本発明は、ハイブリッドポリヌクレオチドに暗号かされた生物学的に活性であるハイブリッドポリペプチドのスクリーニング方法を提供する。本方法により、強化された生物学的活性を有する生物学的に活性であるハイブリッドポリペプチドの特定ができる。
【００３７】
その他の目的において、本発明の特徴と利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、この詳細な説明および特定の例は本発明の好ましい実施例を示すものではあるが、これは説明目的のみであり、本詳細な説明から当業者には、本発明の意図および範囲内で多様な変更や修正が明らかであることは、理解されるべきである。
また、他の特徴において、本発明は、どの表現型がどの遺伝子に対応しているのかを、生体内のすべての遺伝子を分断することにより、明らかにする方法に関する。
したがって、本発明は、生体の特徴を改変する遺伝子を判定する方法を提供するもので、以下からなる：ａ）生体の初期個体群を得る、ｂ）突然変異生体群の中のすべての遺伝突然変異が全体としてとられたときに、著しい遺伝子改変が発現するように、突然変異生体を生成する、またｃ）改変された特質を有する生体を判定する、およびｄ）改変された特質を有する生体内に突然変異があった遺伝子のヌクレオチド配列を判定する。
また、他の面では、本発明は、生体内の特定の遺伝子を機能的にノックアウトし、１つのコドンの位置のみで野生型と異なる遺伝子ライブラリーを生体に移植し、特質を改良する方法に関連する。
【００３８】
したがって、本発明は、改良特質を有する生体を生成する方法を提供するもので、以下からなる：
ａ） 実質的にクローン生体の個体群の内因性遺伝子を機能的にノックアウトする；
ｂ） １つのみのコドンにおいて改変遺伝子が内因性遺伝子と異なるように改変遺伝子をクローン生体の個体群に移植する、；および
ｃ） 改良された特質を有する突然変異生体を検出する；および
ｄ） 検出された生体に移植された遺伝子のヌクレオチド配列を判定する。
Ｅ． 用語の定義
本明細書で提供される実施例の理解を容易にするために、いくらかの頻出する方法および／または用語を記述する。
薬剤」という用語は、化学的化合物、化学的化合物の混合物、空間的に局在する化合物のアレイ（例えば、ＶＬＳＩＰＳペプチドアレイ、ポリヌクレオチドアレイ、および／または組み合わせ小分子アレイ）、生物高分子、バクテリオファージペプチドディスプレイライブラリー、バクテリオファージ抗体（例えば、ｓｃＦＶ）ディスプレイライブラリー、ポリソームペプチドディスプレイライブラリー、もしくは細菌、植物、菌類、もしくは動物（特にほ乳類）細胞または組織のような生物材料から作成された抽出物を示すために、本明細書において用いられる。薬剤は、下述のスクリーニングアッセイにおいて封入による抗新生物、抗炎症またはアポトーシス調節物として潜在活性について評価される。薬剤は、下述のスクリーニングアッセイにおける封入による特異的なタンパク質相互作用阻害剤として可能性のある活性について評価される（すなわち、あらかじめ測定された２つのペプチド間結合相互作用を選択的に阻害するが、実質的には細胞生存力を妨げない薬剤）。
【００３９】
制限酵素部位における「あいまいな塩基要求」とは、最大限の程度まで特定されないヌクレオチド塩基の必要を示し、すなわち、それは特定の塩基ではなくが（非制限的な例示においてＡ、Ｃ、ＧおよびＴから選択されるある特定の１塩基のような）、むしろ少なくとも２塩基またはそれ以上の塩基のうちいずれか１つであってもよい。一般的に、当技術分野並びに本明細書において、塩基におけるあいまい性を示すための使用され、一般的に許容される省略は、以下を含む：Ｒ＝ＧまたはＡ；Ｙ＝ＣまたはＴ；Ｍ＝ＡまたはＣ；Ｋ＝ＧまたはＴ；Ｓ＝ＧまたはＣ；Ｗ＝ＡまたはＴ；Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴ；Ｂ＝ＧまたはＴまたはＣ；Ｖ＝ＧまたはＣまたはＡ；Ｄ＝ＧまたはＡまたはＴ；Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ。
「アミノ酸」という用語は、アミノ基（−ＮＨ２）とカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を含む任意の有機化合物を示し；好ましくは、遊離基としてまたは縮合後のペプチド結合の一部としてのどちらかを意味する。「２０個の天然にコードされるペプチド形成α−アミノ酸」とは、当技術分野において以下を理解され、意味する：アラニン（ａｌａまたはＡ）、アルギニン（ａｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ａｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ａｓｐまたはＤ）、システイン（ｃｙｓまたはＣ）、グルタミン酸（ｇｌｕまたはＥ）、グルタミン（ｇｌｎまたはＱ）、グリシン（ｇｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ｈｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ｉｌｅまたはＩ）、ロイシン（ｌｅｕまたはＬ）、リジン（ｌｙｓまたはＫ）、メチオニン（ｍｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ｐｈｅまたはＦ）、プロリン（ｐｒｏまたはＰ）、セリン（ｓｅｒまたはＳ）、スレオニン（ｔｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ｔｒｐまたはＷ）、チロシン（ｔｒｙまたはＹ）、およびバリン（ｖａｌまたはＶ）。
「増幅」という用語は、ポリヌクレオチドのコピー数を増加することを意味する。
【００４０】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原のエピトープに結合可能な免疫グロブリン分子、並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、およびＳＣＡ断片のような免疫グロブリン分子の断片を示す。これらの抗体断片は、それらの元となる抗体の抗原（例えば、ポリペプチド抗原）に選択的に結合するいくつかの能力を保持しており、これらの断片は当技術分野における周知の方法（例えば、前記のＨａｒｌｏｗとＬａｎｅを参照のこと）を用いて作成されることができ、さらに以下に記述する。
（１）Ｆａｂ断片は、抗体分子の一価の抗原結合断片からなり、酵素パパインで抗体分子全部の分解によって作成され、無傷の軽鎖と重鎖の一部からなる断片を作出することができる。
（２）抗体分子のＦａｂ’断片はペプシンで抗体分子全部を処理し、その後還元し、無傷の軽鎖と重鎖の一部からなる分子を作出することによって得ることができる。２つのＦａｂ’断片は、この方法で処理された抗体分子によって得られる。
（３）抗体の（Ｆａｂ’）２断片は、抗体分子全部を酵素ペプシンで処理することによって、その後還元をすることなく得ることができる。（Ｆａｂ’）２断片は、２つのジスルフィド結合によって１つになった２つのＦａｂ’断片の二量体である。
（４） Ｆｖ断片は、２つの鎖として示される軽鎖の可変部と重鎖の可変部を含む、遺伝子操作された断片である。
（５） 一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、適当な柔軟なリンカーによって結合される軽鎖の可変部と重鎖の可変部を含む、遺伝子操作された一本鎖分子である。
応用分子進化（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）（「ＡＭＥ」）という用語は、進化設計アルゴリズムの、特定の有用な目標への適用を意味する。ＡＭＥのための多くの異なるライブラリー形式がポリヌクレオチド、ペプチド、及びタンパク質（ファージ、ｌａｃＩ、及びポリソーム）に関して報告されているが、これらの形式はいずれも、コンビナトリアルライブラリーを計画的に作製するためのランダム交差による組み合わせを提供していない。
【００４１】
「化学的特性」をもつ分子は、以下ような分子である：
１）１つ目の参照分子と部分的に相同性であり、かつ部分的に異種性である；
２）一方、２つ目の参照分子と部分的に相同性であり、かつ部分的に異種性であり；
３）また同時に、さらに１つまたはそれ以上の追加の参照分子と部分的に相同性であり、かつ部分的に異種性である可能性をあらかじめ排除していない分子である。非制限的な態様においては、キメラ分子は部分的な分子の配列を再集合させ構築することによって調製されてもよい。非制限的な局面においては、キメラのヌクレオチド分子は、結果として生じたキメラのポリヌクレオチドが大多数の鋳型の特性を持つように、多数の分子鋳型を用いてキメラのポリヌクレオチドを合成することによって調製してもよい。
本明細書で使用される「同族の」という用語は、主観で進化的かつ機能的に関連のある遺伝子配列を示す。例えば、限定ではないが、ヒトゲノムにおいてヒトＣＤ４遺伝子はマウス３ｄ４遺伝子と同族遺伝子であり、その理由は、これら２つの遺伝子の配列と構造は、高い相同性を持ち、両遺伝子はＭＨＣクラスＩＩ限定抗原の認識を介したＴ細胞活性のシグナリングの際に機能するタンパク質をコードすることを示していることである。
【００４２】
本明細書で用いられる「比較ウインドウ」という用語は、少なくとも２０個の隣接するヌクレオチドの位置の概念的部分であり、ポリヌクレオチド配列を少なくとも２０個の隣接するヌクレオチドの参照配列と比較できる概念的部分であり、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部が２つの配列の最適なアライメントについて参照配列（追加又は欠失を含まない）と比較した場合、２０％またはそれより少ない付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい概念的部分である。比較ウインドウを整列するための配列の最適なアライメントを、スミス（Ｓｍｉｔｈ）の局所的相同性アルゴリズム（ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ Ａｐｐｌ Ｍａｔｈ、１９８１；ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ、Ｊ Ｔｅｏｒ Ｂｉｏｌ、１９８１；ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏ、１９８１；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ、１９８１）によって、ニードルマンの相同性アライメントアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｍａｎとＷｕｎｃｓｃｈ、１９７０）によって、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）の相同性検索方法（ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ、１９８８）によって、これらのアルゴリズムのコンピューター上の実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ パッケージ放出品 ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ サイエンスＤｒ．、マディソン、ウィスコンシン州におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または検査および選択される様々な方法によって作成された最もよいアルゴリズムによって行なってもよい。
本明細書で使用される場合の「相補性決定領域」と「ＣＤＲ」という用語は、超可変領域または高頻度可変性ループ（ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ、１９８７；Ｃｌｏｔｈｉａら、１９８９；Ｋａｂａｔら、１９８７；およびＴｒａｍｏｎｔａｎｏら、１９９０）としても一般的に知られているカバット（Ｋａｂａｔ）とコーシア（Ｃｈｏｔｈｉａ）ＣＤＲ決定法によって例示されるような当技術分野で容認されている用語を示す。可変領域ドメインは、典型的には天然型免疫グロブリン鎖のアミノ末端のおよそ１０５〜１１５のアミノ酸（例えば１番目から１１０番目までのアミノ酸）を含むが、それより多少短いかまたは長い可変領域は、一本鎖抗体の形成にも適当である。
【００４３】
「保存性アミノ酸置換」とは、同様の側鎖を有する残基が交換可能なことを示す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンとスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンとグルタミンであり；芳香族側鎖側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；かつ含硫側鎖を有するアミノ酸の群は、システインとメチオニンである。好ましい保存性アミノ酸の置換の群は以下である：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミン。
「対応する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたはその一部に相同である（すなわち、同一であり、厳密には進化的には関連のない）ことを意味するために本明細書で使用される。それと対比して、「相補性」という用語は、相補性配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部に相同性であるということを意味するために、本明細書で使用される。例証として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」とは、参照「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」と相補的である。
「分解有効」量という用語は、酵素と接触しない基質と比較して、基質の少なくとも５０％を処理するために必要とされる酵素量を示す。好ましくは、基質の少なくとも８０％が分解される。
【００４４】
本明細書で使用されるような「規定された配列のフレームワーク」という用語は、作為抽出原理によって、一般的には実験データまたは構造データを元に選択される１組の限定配列を示す；例えば、限定配列のフレームワークはβ−シート構造を形成すると予測される１組のアミノ酸配列を含んでもよく、または他の異型間でロイシンジッパー７つ組の繰返しモチーフ、ジンクフィンガードメインを含んでもよい。「限定配列カーナル（ｋｅｒｎａｌ）」とは、変動性について限定される範囲を含む１組の配列である。（１）２０個の通常のアミノ酸の完全にランダムな１０ｍｅｒの配列は、（２０）１０の配列のうちの任意のもので、かつ（２）２０個の通常のアミノ酸の疑似乱数の１０ｍｅｒ配列であることができるが、いくらかの位置および／または全体においてある残基のための偏りを示すと考えられるが、それに対して（３）各々の残基の位置が許容できる２０個の通常のアミノ酸（および／または許容できる異例のアミノ酸／イミノ酸）のうちの任意のものであることが可能であった場合には、限定配列カーナルは、配列の部分集合である。定義された配列カーナルは、一般的には可変および不変残基位置を含み、かつ／またはアミノ酸残基の限定部分集合および選択される個々のライブラリーメンバー配列の全長を部分的または全長に渡るようなものなどから選択される残基を含むことができる可変残基位置を含む。限定配列カーナルは、アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列のどちらかを示すことができる。ＮがＡ、Ｔ、ＧまたはＣに相当し；ＫがＧまたはＴに相当し；かつＭがＡまたはＣに相当し例証ではあるが、限定ではない配列（ＮＮＫ）１０と（ＮＮＭ）１０ｖは、限定配列カーナルである。
【００４５】
ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡにおけるある配列においてのみ作用する制限酵素でＤＮＡの触媒的切断を示す。本明細書で使用される様々な制限酵素は、市販され入手可能であり、通常の当業者に周知であると思われるようなそれらの反応条件、補因子および他の必要条件が用いられた。分析的目的のために、典型的には１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ断片は、約２０μｌの緩衝溶液中の約２ユニットの酵素と共に使用される。プラスミド構築のためのＤＮＡ断片を単離するために、典型的には５μｇから５０μｇのＤＮＡをより多い用量中の２０ユニットから２５０ユニットまでの酵素で消化する。特定の制限酵素のための適当な緩衝液と基質の量を、製造業者によって指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が、通常は用いられるが、業者の指示に係って変更してもよい。消化後、反応物を直接ゲルで電気泳動し、所望の断片を単離する。
「定方向ライゲーション」とは、ポリヌクレオチドの５’端と３’端が好ましいライゲーション方向を特定するするために十分異なるライゲーションを示す。例えば、２つの平滑末端を持つ別の未処理および未消化のＰＣＲ産物は、消化されたクローニングベクターへライゲーションされ、そのマルチクローニングサイトにおいて平滑末端を作成する場合、典型的には好ましいライゲーション方向を持たない；従って、典型的にはこれらの環境下では、定方向ライゲーションは示されない。反対に、５’ＥｃｏＲＩ処理末端と３’ＢａｍＨ Ｉ処理末端を有する消化されたＰＣＲ産物がＥｃｏＲ ＩとＢａｍＨ Ｉで消化されたマルチクローニングサイトを有するクローニングベクターへライゲーションされる場合、定方向ライゲーションは、典型的には示されると考えられる。
【００４６】
「ＤＮＡシャッフリング」という用語は、実質的には相同性を示すが、同一ではない配列間の組換えを示すために配列本明細書において使用され、いくつかの態様においては、ＤＮＡシャッフリングがｃｅｒ／ｌｏｘシステムおよび／またはｆｌｐ／ｆｒｔシステム等のような異種性組換えを介した乗り換えを含んでもよい。
本発明において使用されるような「エピトープ」という用語は、フィターゼ特異的抗原のような抗体のパラトープが結合する、フィターゼポリペプチドのような抗原における抗原決定基を示す。抗原決定基は、通常はアミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的反応性である表面の群からなり、かつ３次元構造的特徴、並びに特定の電荷の特徴を有することができる。本明細書で用いられるような「エピトープ」とは、抗体本体を結合する可変領域と相互作用する結合相互作用を形成できる、抗原の一部または他の高分子を示す。典型的には、そのような結合相互作用は、１つのＣＤＲの１つまたはそれ以上のアミノ酸残基との分子間接触として明示される。
参照ポリペプチドについて言及する場合、「断片」、「派生物」および「類似体」という用語は、参照ポリペプチドと少なくとも本質的に同様の、少なくとも１つの生物作用または生物活性を保持するポリペプチドを含む。さらに、「断片」、「派生物」または「類似体」という用語は、有意により高い活性を持つ成熟酵素を作成する切断によって改変されうる低い活性のプロタンパク質のような「前駆型（ｐｒｏ−ｆｏｒｍ）」分子によって例示される。
方法は、本明細書で鋳型ポリペプチドから「アミノ酸置換の全範囲」が各々のアミノ酸の位置を示される。１組の後代ポリペプチドを作成するために提供される。本明細書で使用されるような「１アミノ酸置換の全範囲」とは、本明細書で記述されるような２０個の天然でコードされるポリペプチド形成α−アミノ酸に関連する。
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の作成に関連するＤＮＡ部分を意味し；それは、コード領域の前にある領域とその後に続く領域（リーダーとトレーラー）並びに個々のコード部分（エキソン）間に介在する配列（イントロン）を含む。
本明細書で使用されるような「遺伝的不安定性」とは、繰返し配列の欠失による配列の単純化を一般的には含む減少過程を介して欠失される、かなりの繰返し配列の本来の傾向を示す。欠失は、繰返し間の１コピーの繰返しおよび全てのものの欠失を含む傾向がある。
「異種の」という用語は、１つの１本鎖核酸配列が別の一本鎖核酸配列またはその相補鎖にハイブリダイズすることができないことを示す。従って、異種性領域は、ポリヌクレオチド領域またはポリヌクレオチドが、別の核酸またはポリヌクレオチドにハイブリダイズできないそれらの配列内の部位または領域を有すことを意味する。例えば、そのような領域または部位は変異の部位である。
【００４７】
「相同性」または「類似性」という用語は、１本鎖核酸の核酸配列が相補的な１本鎖核酸配列にハイブリダイスできることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、配列間の同一量と後述の温度と塩濃度のようなハイブリダイゼーション条件を含む多くの因子に係る可能性がある。好ましくは、同一領域は約５ｂｐより大きく、より好ましくは同一領域は１０ｂｐより大きい。
免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変領域は、ＣＤＲ’ｓとも呼ばれる３次元高頻度可変領域によって割り込まれる「フレームワーク」領域からなる。フレームワーク領域及びＣＤＲ部位は、正確に定義されている。「免疫学的に重要なタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（カバッタ（Ｋａｂａｔ）ら、１９８７）」を参照されたい。様々な軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種間で比較的保存されている。本明細書で使用される「ヒトフレームワーク領域」とは、天然型ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域と実質的に同一（約８５またはそれ以上、通常は９０〜９５またはそれ以上）であるフレームワーク領域である。抗体のフレームワーク領域は、組成物の軽鎖と重鎖のの組み合わせフレームワーク領域であり、この領域は、配置し、ＣＤＲ’ｓとアライメントするために役立つ。ＣＤＲ’ｓは、主に抗原のエピトープへの結合を担う。
本発明の利益は、「商業上の適用」（または商業的方法）に及び、その用語は、商業的な工業本体（または工業のみ）並びに非商業的適用（例えば、無利益の機関においての生物医学的な研究）を含むように使用される。直接関連する適用は、診断、医学、農業、製造業、および学究的分野の領域における適用を含む。
「同一の」または「同一性」という用語は、２つの核酸配列が同様の配列または相補的な配列を持つことを意味する。従って、「同一性のある部位」とは、ポリヌクレオチドまたは全ポリヌクレオチドの領域または部位が、別のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの部位と同一もしくは相補的であると意味する。
【００４８】
「単離された」という用語は、材料が元の環境（例えば、天然の場合には天然環境）から除去されることを意味する。例えば、生きている動物中に存在する天然型のポリヌクレオチドまたは酵素は単離されていないが、天然系において共存する材料のいくつかまたはすべてから分離される同様のポリヌクレオチドまたは酵素は単離されている。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではないので、ベクターの一部であり、かつ／またはそのようなポリヌクレオチドまたは酵素は、組成物の一部であることができ、かつさらに単離されることができる。
「単離された核酸」によって、核酸、例えば、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は意味され、それの由来となる生物の天然のゲノム中に存在する場合、それは通常隣接する５’近傍配列および３’近傍配列と近接しない。このように用語は、例えば、プラスミドまたはウイルスベクターのようなベクターに組み込まれる核酸を説明している； 異種細胞（または相同細胞のゲノムで、それが天然で生じる部位と異なる部位以外において）のゲノムに組み込まれる核酸；かつ、例えばＰＣＲ増幅または制限酵素消化によって生成されるＤＮＡ断片、またはインビトロ転写によって生成されるＲＮＡ分子のような別々の分子として存在する核酸を説明している。用語はまた、例えば、融合タンパク質の生成において使用可能な付加的ポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部を形成する組換え核酸を説明する。
本明細書で使用される「リガンド」とは、特定の受容体によって認識されるランダムペプチドまたは可変セグメント配列のような分子を示す。当業者が認識しているような分子（または高分子複合体）は、受容体とリガンドの両方であることができる。一般的には、より小さい分子量を持つ結合パートナーは、リガンドと呼ばれ、より大きい分子量を持つ結合パートナーは受容体と呼ばれる。
【００４９】
「ライゲーション」とは、二本鎖核酸断片間のリン酸ジエステル結合を形成する過程を示す（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８２、ｐ． １４６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９）。他の方法が提供されない限り、ライゲーションは、連結されるＤＮＡ断片のおよそ等モル量の０．５μｇにつき１０ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて、既知の緩衝液と条件を使用して行なうことができる。
本明細書で使用される「リンカー」または「スぺーサー」とは、ＤＮＡ結合タンパク質とランダムペプチドのような２つの分子を連結し、かつ、例えばランダムペプチドがＤＮＡ結合タンパク質から立体的障害が最小である受容体に結合することができるように、好ましい配置に２つの分子を配置するために役に立つ、１つの分子または分子の群を示す。
本明細書で使用されるような「進化するべき分子性質」とは、ポリヌクレオチド配列からなる分子、ポリペプチド配列からなる分子、およびポリヌクレオチド配列を部分的に含みポリペプチド配列を部分的に含む分子についての言及を含む。特に、直接関連するが限定ではない進化するような分子の性質の例は、温度；塩濃度；圧力；ｐＨ；およびグリセロール、ＤＭＳＯ、界面活性剤、および／または反応環境において接触される任意の他の分子種の濃度と関連するような特定の条件においての酵素活性を含む。付加的な特に直接関連するが、限定ではない開発される分子特性の例は、安定性、例えば、貯蔵の際に遭遇する可能性があるような特定の環境への特定の曝露時間後に示される残存分子特性の量を含む。
「突然変異」という用語は、野生型または両親型（ｐａｒｅｎｔａｌ）の核酸配列の配列変化またはペプチドの配列変化を含む。そのような変異は、転位または転換のような点変異であってもよい。変異は、欠失、挿入または重複であってもよい。変異はまた、１つの親分子の配列の一部または全体ならびに少なくとも１つの別の親分子の配列の一部または全体を含むように産生された子孫分子において例示されている、「キメラ化」であってもよい。本発明はキメラポリヌクレオチドおよびキメラポリペプチドの両方を規定する。
本明細書で使用されるような縮重した「Ｎ、Ｎ、Ｇ／Ｔ」ヌクレオチド配列は、「Ｎ」がＡ、Ｃ、ＧまたはＴであることができる３２個の起こりうるトリプレットを示す。
【００５０】
対象に適用される場合に本明細書で使用される「天然の」という用語は、対象が天然で見出されうることを示す。例えば、天然の供給源から単離されうる生物（ウイルスを含む）において存在し、研究者によって意図的には改変されていないポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然に存在している。一般的には、天然という用語は、種に典型的であるような病気を持たない（疾患のない）個体も存在するような対象を言及する。
本明細書で使用される「核酸分子」とは、少なくとも１塩基または１塩基対からなり、それは、それぞれ１本鎖または２本鎖であるかどうかに係る。さらに、核酸分子は、核酸分子が以下の群によって例示されるが、それに限定されないような包括的または化学的にヌクレオチド含有分子の任意の群に属してもよい：ＲＮＡ、ＤＮＡ、ゲノム核酸、非ゲノム核酸、天然の核酸と非天然核酸、および合成核酸。これは、非限定的な例として、ミトコンドリア、リボソームＲＮＡのような任意の器官と関連する核酸、および天然の組成物とともには天然には存在しない１つまたはそれ以上の組成物がキメラの状態で含まれる核酸分子を含む。
さらに、「核酸分子」とは、アミノ酸と糖によって例示されるが、それに限定されないような１つまたはそれ以上のヌクレオチドが元となる組成物の一部を含んでもよい。従って、限定ではないが、例として、部分的にヌクレオチドに基づき、かつ部分的にタンパク質に基づくリボザイムは、１つの「核酸分子」と考えられる。
さらに、限定ではなく例として、放射活性標識または別の非放射活性標識のような検出可能な部分で標識された核酸分子は、同様に１つの「核酸分子」と考えられる。
特定の酵素を「コードする核酸配列」またはその酵素の「ＤＮＡコード配列」またはそれを「コードする塩基配列」という用語、並びに他の同義語は、適当な調節配列制御下に置かれた場合、転写され、かつ酵素へ翻訳されるＤＮＡ配列を示す。「プロモーター配列」とは、細胞中のＲＮＡポリメラーゼを結合でき、下流の（３’方向）コード配列の転写を開始できるＤＮＡ調節領域である。プロモーターは、ＤＮＡ配列の一部である。この配列領域は、その３’末端において開始コドンを持つ。プロモーター配列は、バックグラウンド以上の検出可能なレベルで転写を開始するために必要なエレメントである最小の塩基数を含む。しかしながら、ＲＮＡポリメラーゼは配列に結合し、転写が開始コドン（プロモーターを持つ３’末端）で開始された後で、転写は３’方向で下流に進む。プロモーター配列内で、転写開始部位（ヌクレアーゼ Ｓ１によるマッピングによって都合よく定義された）並びにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（共通配列）は見出されると考えられる。
【００５１】
「酵素（タンパク質）をコードする核酸」または「酵素（タンパク質）をコードするＤＮＡ」または「酵素（タンパク質）をコードするポリヌクレオチド」という用語および他の同義語は、酵素のコード配列並びに付加的なコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドだけを含むポリヌクレオチドを含む。
好ましい態様においては、「特定の核酸分子種」とは、その一次構造によって例示されるがそれに限定されないようなその化学的構造によって定義される。別の態様においては、特定の「核酸分子種」とは、核酸種の機能によって、または核酸種に由来する産物の機能によって定義される。従って、非限定的な例として、「特定の核酸分子種」とは、それに起因する１つまたはそれ以上の活性または特性によって定義されることができ、その発現産物に起因する活性または特性を含む。
「核酸分子ライブラリーへ作用核酸試料を集合させること」の本明細書における定義は、ベクターへのライゲーションと宿主への形質転換に係るような、ベクターに基づくコレクションへ核酸試料を組み込む過程を含む。関連するベクター、宿主、及びその他の試薬並びにそれについての特定の非制限的な例についての説明は、下文で提供される。「核酸ライブラリーへの作用核酸試料を構築することこと」の本明細書における定義は、アダプターへのライゲーションによるようなベクターに基づかないコレクションへ核酸試料を組み込む過程も含む。好ましくは、アダプターは、ＰＣＲプライマーへアニーリングし、ＰＣＲによる増幅を容易にできる。
従って、非制限的な態様においては、「核酸ライブラリー」とは、１つまたはそれ以上の核酸分子のベクターに基づくコレクションからなる。別の好ましい態様においては、「核酸ライブラリー」は核酸分子のベクターに基づかないコレクションからなる。さらに、別の好ましい態様においては、「核酸ライブラリー」とは、部分的にベクターに基づき、かつ部分的にベクターに基づかない組み合わせの核酸分子のコレクションからなる。好ましくは、ライブラリーを含む子コレクションは、個々の核酸分子種によって探すことが可能で、分離可能である。
【００５２】
本発明は、「核酸構築物」またはその代わりの「ヌクレオチド構築物」またはその代わりの「ＤＮＡ構築物」を提供する。「構築物」という用語は、ベクターまたはベクターの一部のような１つまたはそれ以上の付加的な分子の部分へ化学的に任意に結合できるポリヌクレオチド（例えば、フィターゼポリヌクレオチド）のような分子を説明するために本明細書において使用される。決して限定ではないが特定の局面において、ヌクレオチド構築物は、宿主細胞の形質転換に適したＤＮＡ発現構築物によって例示される。
「オリゴヌクレオチド（または同意義の「オリゴ」）」とは、化学的に合成されてもよい１本鎖ポリヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のどちらかを示す。そのような合成的オリゴヌクレオチドは、５’リン酸基を持ってもよく、または持たなくともよい。リン酸基を持たないものは、キナーゼ存在下でＡＴＰでリン酸基を付加することなく別のオリゴヌクレオチドへは連結しないと考えられる。合成的オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていない断片へ連結すると考えられる。ポリメラーゼに基づいて増幅するために（ＰＣＲによるような）、「連続して少なくとも１つの最初の相同性配列、縮重するＮ、Ｎ、Ｇ／Ｔ配列、および２番目の相同性配列からなる，３２倍の縮重オリゴヌクレオチド」を記述する。本文脈において使用されるような「相同性」とは、オリゴとポリメラーゼに基づいて増幅されやすい親ポリヌクレオチド間の相同性に関するのものである。
本明細書において使用されるような「動作可能に結合された」という用語は、機能的関係におけるポリヌクレオチドエレメントの結合を示す。核酸は、別の核酸配列との機能的な関係におかれた場合、「動作可能に」結合される。例えば、プロモーターまたはエンハンサーが、コード配列の転写に影響を及ぼす場合には、動作可能に結合される。動作可能に結合されるということは、結合されるＤＮＡ配列が、典型的には隣接し、かつ２つのタンパク質コード領域を連結するために必要なところで、隣接し、および読み枠にあることを意味する。
ＲＮＡポリメラーゼが２つのコード配列を１つのｍＲＮＡへ転写される場合、コード配列は、別のコード配列へ「動作可能に連結され」、その後、両コード配列に由来するアミノ酸を持つ単一のポリペプチドへ翻訳される。発現される配列は、最後にはプロセシングされ、所望のタンパク質を生成さえすれば、コード配列は、互いに隣接する必要がない。
【００５３】
本明細書において使用されるような「親ポリヌクレオチドセット」という用語は、１組の１つまたはそれ以上の別個のポリヌクレオチド種から成る。通常この用語は、好ましくは親のセットの突然変異誘発によって得られる後代のポリヌクレオチドセットに関して使用されることが適当であり、その場合には「親の」、「出発」および「鋳型」という用語は、相互互換可能に使用される。
本明細書で使用されるような「生理学的条件」という用語は、生存可能な生物と相互互換可能であり、かつ／または生存可能な培養された酵母細胞またはほ乳類細胞における細胞内で典型的な条件である、温度、ｐＨ、イオン強度、粘性、および生化学的パラメーターなどを示す。例えば、典型的な実験培養条件下で増殖させた酵母細胞における細胞内条件は、生理学的条件である。インビトロ転写カクテルに適したインビトロ反応条件は、一般的には生理学的条件である。一般的には、インビトロ生理学的条件は、５０〜２００ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌ（ｐＨ６．５〜８．５、２０〜４５Ｃ）および０．００１〜１０ｍＭの、２価の陽イオン（例えば、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋）；好ましくは約１５０ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌ（ｐＨ ７．２〜７．６）、５ｍＭの２価の陽イオンを含み、かつ多くの場合、０．０１〜１．０％の非特定のタンパク質（例えば、ＢＳＡ）を含む。多くの場合、非イオン性界面活性剤（トゥィーン、ＮＰ−４０、トライトン Ｘ−１００）が、約０．００１から０．２％（ｖ／ｖ）、一般的には０．０５から０．２％（ｖ／ｖ）において存在する。特定の水溶条件は、従来の方法に係る現場の人によって選択されてもよい。一般的な手引きについては、以下の緩衝水溶液条件が適用可能でありうる：２価の陽イオンおよび／または金属キレターおよび／または非イオン性の界面活性剤および／または膜画分および／または抗気泡薬剤および／またはシンチラントを任意に添加した１０〜２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５〜５０ｍＭ トリス ＨＣｌ（ｐＨ５〜８）。
標準的な慣行（５’から３’へ）は、２本鎖ポリヌクレオチドの配列を説明するために使用される。
【００５４】
本明細書で使用されるような「集団」という用語は、ポリヌクレオチド、部分またはポリヌクレオチドまたはタンパク質のような構成物のコレクションを意味する。「混合された集団」とは、：核酸またはタンパク質の同じファミリーに属する（すなわち、関連する）が、それらの配列が異なり（すなわち、同一ではない）、このためにそれらの生物活性が異なる構成要素のコレクションを意味する。
「前駆型（ｐｒｏ−ｆｏｒｍ）」を有する分子は、参照前駆型分子と比較して特性の相違を持つより成熟した分子の形に到達する途中で、１つまたはそれ以上の共有結合的かつ非共有結合的化学修飾（例えば、糖鎖付加、タンパク質分解切断、二量体形成またはオリゴマー形成、温度誘発構造変化またはｐＨ誘発構造変化、補因子との会合など）の任意の組み合わせをされる分子を示す。２つまたはそれ以上の化学的修飾（例えば、２つのタンパク質分解切断、または１つのタンパク質分解切断および糖鎖除去）を成熟分子の生成の途中で区別できる場合、参照前駆体分子は「前前駆型」分子と呼んでもよい。
本明細書で使用されるような「偽ランダム」という用語は、例えば、任意の偽ランダムな位置以外の位置においての残基の変動性の程度は、ある程度の残基の変化を許されるが、制限されているような、限定される変動性を持つ１組の配列を示す。
本明細書で使用されるような「準反復単位」とは、再集合される繰返しを示し、定義によっては同一ではない。実際に、方法は、同一の出発配列の変位誘発によって作製された事実上同一であるコード単位のためだけでなく、いくつかの領域において有意に異なる同様の配列または関連する配列の繰返しの再集合のために提示された。それにもかかわらず、配列がこのアプローチによって再び再集合するのに十分な相同性を持つ場合には、それは「準反復」単位として示されうる。
本明細書で使用される「ランダムペプチドライブラリー」とは、１組のランダムペプチドをコードする１組のポリヌクレオチド配列を示し、かつそれらのポリヌクレオチド配列によってコードされる１組のランダムペプチド、並びにそれらのランダムペプチドを含む合タンパク質を示す。
【００５５】
本明細書で使用される「ランダムペプチド配列」とは、２つまたはそれ以上のアミノ酸単量体から成り、統計学的またはランダムな方法によって構築されたアミノ酸配列を示す。ランダムペプチドは、不変配列を含んでもよいフレームワークまたは足場となるモチーフを含むことができる。
本明細書で使用されるような「受容体」とは、所定のリガンドに対しての親和性を持つ分子を示す。受容体は、天然型分子または合成分子であることができる。受容体は、改変されていない状態で使用され、他の種との集合体として使用されうる。受容体は、直接または特定の結合物質を介してのどちらかで結合メンバーに共有結合的または非共有結合的に接触されうる。受容体の例には、モノクローナル抗体と特定の抗原決定基（ウイルス、細胞、または他の材料におけるような）に反応性である抗血清、細胞膜受容体、複合糖質と糖タンパク質、酵素、およびホルモン受容体を含む抗体を含むが、これらに限定されない。
「組換え」酵素は、組換えＤＮＡ技術によって生成された、つまり、所望の酵素をコードする外因的ＤＮＡ構築物によって形質転換された細胞から生成された酵素を示す。「合成」酵素は、化学合成によって調製された酵素である。「関連するポリヌクレオチド」という用語は、ポリヌクレオチドの領域または部位が同一であり、ポリヌクレオチドの領域または部位が異種性であることを意味する。
【００５６】
本明細書で使用されるような「還元的再組み合わせ」とは、繰返し配列によって調節される欠失（かつ／または挿入）現象によって生じる分子変化の増加を示す。
以下の用語は、２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド間の配列の関係を記述するために使用される：「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列の同一性」、「配列の同一性の割合」および「実質的な同一性」。
「参照配列」とは、配列比較のための基準として使用される限定配列であり；参照配列は、例えば、配列の列挙において示される、全長のｃＤＮＡ部分または遺伝子配列のような、より大きい配列の部分集合であってもよく、または完全なｃＤＮＡまたは完全な遺伝子配列を含んでもよい。一般的には、参照配列は、長さが少なくとも２０ヌクレオチドであり、しばしば少なくとも長さが２５ヌクレオチドであり、多くの場合、長さが少なくとも５０ヌクレオチドである。２つのポリヌクレオチドは、各々（１）２つのポリヌクレオチド間で類似の配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部）を含み、（２）さらに２つのポリヌクレオチド間で異なる配列を含んでもよいので、典型的には２つ（またはそれ以上の）ポリヌクレオチド間の配列の比較は、「比較ウインドウ」に関して２つのポリヌクレオチドの配列を比較することによって行なわれ、配列が類似している局所的な領域を同定かつ比較する。
本明細書で使用されるような「繰返しの指標（ＲＩ）」とは、クローニングベクターに含まれる準反復単位の平均コピー数である。
【００５７】
「制限酵素部位」という用語は、制限酵素の作用の明示に必要な認識配列を示し、かつ触媒的制限酵素部位を含む。切断部位は、あいまい性が低い配列（すなわち、制限酵素部位の出現頻度について主要な決定因子を含む配列）を含む制限酵素部位の一部の中に含まれてもよく、または含まなくてもよい。従って、多くの場合、関連する制限酵素部位は、内在的切断部位（例えば、ＥｃｏＲ Ｉ部位のＧ／ＡＡＴＴＣ）または隣接する切断部位（例えば、ＥｃｏＲ ＩＩ部位の／ＣＣＷＧＧ）内のあいまい性が低い配列を含む。別の場合では、関連する制限酵素 ［例えば、Ｅｃｏ５７ Ｉ部位またはＣＴＧＡＡＧ（１６／１４）］は、外部の切断部位（例えば、Ｅｃｏ５７Ｉ部位のＮ１６部分）を持つあいまい性が低い配列（例えば、Ｅｃｏ５７Ｉ部位のＣＹＧＡＡＧ）を含む。酵素（例えば、制限酵素）がポリヌクレオチドを「切断する」と言われる場合、制限酵素は、ポリヌクレオチドの切断を触媒、または促進することを意味することが理解されている。
非制限的な局面において、「選択可能なポリヌクレオチド」とは、５’終端領域（または末端領域）、中間領域（すなわち、内部領域または中央領域）、および３’終端領域（または末端領域）から成る。この局面で使用されるような５’終端領域は５’ポリヌクレオチド末端の方に位置される領域（または５’ポリヌクレオチド末端）であり；従って、それはポリヌクレオチドの５’の半分の一部または全部である。同様に、３’終端領域は、３’ポリヌクレオチド末端の方に位置される領域（または３’ポリヌクレオチド末端）であり；従って、それはポリヌクレオチドの３’の半分の一部または全部である。この非制限的な例示において使用されるように、任意の２つの領域間またはすべての３つの領域の間でさえも重複する配列であってもよい。
【００５８】
「配列の同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列が比較ウインドウに関して（ヌクレオチド基準によるヌクレオチドにおいて）同一であることを意味する。「配列の同一性の割合」とは、比較ウインドウに関して最適にアライメントした２つの配列を比較し、両配列においてマッチする位置の数となる同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が見出される数を測定し、比較ウインドウにおける位置の合計数（すなわち、ウインドウの大きさ）によってマッチする位置の数を割り、かつスコアを１００で掛け、配列同一性の割合を得ることによって計算される。本明細書で使用されるこの「実質的な同一性」とは、配列の同一性の割合が、比較ウインドウに関して参照配列の２０％またはそれより少ない割合を占める、欠失または付加を含んでもよいポリヌクレオチド配列と参照配列を比較することによって計算される、少なくとも２５〜５０ヌクレオチドの比較ウインドウの参照配列と比較した場合、ポリヌクレオチドが少なくとも８０％の配列が同一で、好ましくは少なくとも８５％が同一、多くの場合には９０％から９５％までの配列が同一、最も一般的には少なくとも９９％の配列が同一である配列を含み、ポリヌクレオチド配列の特徴を示す。
当技術分野において周知であるような２つの酵素間の「類似性」とは、アミノ酸配列と１つの酵素のその保存されたアミノ酸の置換を２つ目の酵素の配列と比較することによって決定される。類似性は、当技術分野でよく知られている手順、例えば、ＢＬＡＳＴプログラム（国立生物学情報センターのＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ）によって決定されてもよい。
【００５９】
本明細書で使用されるような「一本鎖抗体」という用語は、一般的にはスぺーサーペプチド（例えば、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｘ）を介して結合するポリペプチド結合におけるＶＨドメインとＶＬドメインを含み、かつアミノ末端および／またはカルボキシ末端の付加的なアミノ酸配列を含んでもよいポリペプチドを示す。例えば、一本鎖抗体は、コードしているポリヌクレオチドに結合するためのつなぎ鎖の部分を含んでもよい。例として、ｓｃＦＶは一本鎖抗体である。一本鎖抗体は、一般的には免疫グロブリンスーパーファミリーの遺伝子によって実質的にコードされ（例えば、本明細書に参照として組み入れられている、ＷｉｌｌｉａｍとＢａｒｃｌａｙ、１９８９、ｐｐ．３６１３６８を参照のこと）、最も多くの場合には齧歯動物、ヒト以外の霊長類、鳥類、ブタウシ亜科動物、ヒツジ、ヤギ、またはヒトの重鎖または軽鎖の遺伝子配列によってコードされる、少なくとも１０個の隣接するアミノ酸の１つまたはそれ以上のポリペプチド部分からなるタンパク質である。機能的な一本鎖抗体は、一般的には、特定の標的分子、典型的には受容体または抗原（エピトープ）に結合する特性を保持するように免疫グロブリンスーパーファミリー遺伝子産物の十分な部分を含む。
１対の分子のメンバー（例えば、抗体抗原対または核酸の対）は、別の非特異的な分子よりも高い親和性で互いに結合する場合には、お互いを「特異的に結合する」と呼ばれる。例えば、非特異的なタンパク質よりも効率よく結合する、抗原に対する抗体は、抗原に特異的に結合すると記述される。（同様に、核酸プローブは、塩基対相互作用によって標的と特異的な２本鎖を形成する場合には、核酸の標的に特異的に結合すると記述されることができる（上を参照のこと）。
）
「特異的なハイブリダイゼーション」とは、実質的には関連のないポリヌクレオチド配列が混合液中でハイブリッドを形成しない、１つ目のポリヌクレオチドと２つ目のポリヌクレオチド（例えば、１つ目のポリヌクレオチドとは異なるが実質的に同一の配列を持つポリヌクレオチド）間のハイブリッド形成として本明細書で定義される。
【００６０】
「特異的なポリヌクレオチド」という用語は、いくらかの終点を持ち、ある核酸配列を持つポリヌクレオチドを意味する。１つのポリヌクレオチドが、異なる末端以外は、２つ目のポリヌクレオチドの一部として同一配列を持つが、２つのポリヌクレオチドは、２つの異なる特異的なポリヌクレオチドを含む。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、配列間で少なくとも９０％が同一であり、好ましくは９５％が同一であり、最も好ましくは少なくとも９７％が同一である場合には、ハイブリダイゼーションが起こることを意味する。本明細書によって完全に参照として組み入れられている、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、を参照されたい。
配列番号：１の１つのようなフィターゼポリペプチドの配列と「実質的に同一である」配列を持つポリペプチドもまた、本発明において含まれる。「実質的に同一である」アミノ酸配列は、保存性アミノ酸の置換、例えば同じクラスの別のものからあるアミノ酸への置換（例えば、別のものからイソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンのような１つの疎水性アミノ酸への置換、または、リジンからアルギニンへ、アスパラギン酸からグルタミン酸へ、またはアスパラギンからグルタミンへの置換のような別ものから１つの極性アミノ酸への置換）によってのみ参照配列と異なる配列である。
さらに、「実質的に同一である」アミノ酸配列は、参照配列と異なり、もしくは、特に、そのような置換が分子の活性化部位ではない１つの部位で起こる場合の１つまたはそれ以上の非保存性置換、欠失、または挿入によって異なる配列であり、かつポリペプチドが反応特性を本質的に保持していることを提供される。例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸をフィターゼポリペプチドから除去でき、それによって結果的にポリペプチドの構造を改変できる。例えば、フィターゼの生物活性に必要のないアミノ末端のアミノ酸またはカルボキシ末端のアミノ酸を除去できる。そのような改変は、より小さい活性フィターゼポリペプチドの開発になりうる。
【００６１】
本発明は、「実質的に純粋な酵素」を提供する、「実質的に純粋な酵素」という用語は、他のタンパク質、脂質、糖質、核酸、および天然で関連する他の生物材料が実質的にないポリペプチド（例えば、フィターゼポリペプチド、またはその断片）のような分子を記述するために本明細書で使用される。例えば、ポリペプチドのような実質的に純粋な分子は、乾重量において関心対象の分子の少なくとも６０％であることができる。ポリペプチドの純度は、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、カラムクロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））、およびアミノ末端アミノ酸配列解析を含む標準的な方法を用いて測定されうる。
本明細書で使用されるような「実質的に純粋な」という用語は、目的とする種が、存在する優勢な種（すなわち、１モルを基準として、それは組成物中の任意の他の個々の高分子種より豊富である）であり、好ましくは、目的とする種が存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（１モルを基準として）を含む、実質的に純粋な画分が組成物であることを意味する。一般的には、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の約８０％から９０％より多く含まれると考えられる。最も好ましくは、目的種は、組成物が本質的には単一の高分子種から成り、本質的に均一になるまで精製される（混入種を通常の検出方法によって組成物において検出できない）。溶媒種、小分子（５００Ｄａより小さい）、かつ元素のイオン種は、高分子種とは考えられない。
本明細書で使用されるような「可変セグメント」という用語は、ランダム配列、偽ランダムな配列、または限定カーナル配列の一部を示す。「可変セグメント」とは、ランダム配列、偽ランダムな配列、または限定カーナル配列を含む新生ペプチドの一部を示す。可変セグメントは、可変残基部分と不変残基部分の両方を含むことができ、かつ可変残基の位置における残基の変動性の程度を限定してもよく：両方の選択は現場の人の判断で選択される。典型的には、可部分は、長さが約５アミノ酸残基から２０アミノ酸残基まで（例えば、８残基から１０残基）であるが、可変セグメントは、それより長くてもよく、抗体断片、核酸結合タンパク質、受容体タンパク質などのような抗体の一部または受容体タンパク質を含んでもよい。
【００６２】
「野生型」という用語は、ポリヌクレオチドがいかなる変異も含まないことを意味する。「野生型」の部分は、天然で見出される活性レベルにおいて活性があり、タンパク質が天然で見出されるアミノ酸配列を含むことを意味する。
「作用試料」などにおける「作用」という用語は、例えば、単に、人が用いている試料である。同様に、例えば「作用分子」とは、人が用いている分子である。
１．スクリーニングと選択
１．１． スクリーニングと選択の概要
スクリーニングとは、一般にどの細胞がスクリーニングマーカーを発現し、どの細胞が発現しないかを判定するステップ、および望ましい特性を有する細胞を物理的に分離する２ステップの過程である。スクリーニングマーカーには、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、および緑蛍光タンパク質が含まれる。スクリーニングはまた、細胞を全体的に観察することによっても行うことができる。それには、ここに限定はされないが以下に関連する方法を利用することができる：ゲノム研究、ＲＮＡプロファイル、プロテオミクス、メタボロミクス、および脂質プロファイル、また、コロニーの大きさ、ハロー形成などの要因等を観察することによっても行える。また、例えば、治療薬または「デザイナー化学薬品」等の望ましい化合物生成のスクリーニングは、受容体または配位子、例えば担体またはずい柱等上への細胞生成物の結合を観察することによって達成できる。そのようなスクリーニングはまた、ＥＬＩＳＡ内にあるような抗体に結合することによっても達成できる。場合によっては、スクリーニングプロセスは、自動が好ましく、それによって適切な数のコロニーや細胞がスクリーニングできる。自動スクリーニング機器の例としては、蛍光活性細胞分類（ＦＡＣＳ）、特にアガロース内で固定された細胞に関連して（Ｐｏｗｅｌｌら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：３３３−３３７（１９９０）；Ｗｅａｖｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ２：２３４− ２４７ （１９９１）参照）、自動ＥＬＩＳＡ分析、シンチレーション近接分析 （Ｈａｒｔ、Ｈ．Ｅ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６：２６５−２６７（１９７９））および寒天培地またはマイクロタイター容器上の蛍光、色付きまたはＵＶ吸収混合物の形成（Ｋｒａｗｉｅｃ、Ｓ．、Ｄｅｖｅｌ． Ｉｎｄｕｓｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３１：１０３−１１４（１９９０））等があげられる。
【００６３】
選択とは、特定および物理的分離が同時に達成されるスクリーニングの形式であり、例えば、ある種の遺伝状況においては、選択可能マーカーの発現により、他の細胞が死んでいるときに生き残る細胞のマーカーの発現（またはその逆）が可能になる。選択可能マーカーには、例えば、製剤、毒素耐性、または栄養合成遺伝子等が含まれる。選択はまた、基質の解毒ができるホストを選択するため毒性基質上での成長、栄養源を利用する能力を有するホストを選択するため、新規の栄養源上での成長、栄養源の利用能力に応じた培養組織内の競争成長等によっても行う。
特に、非クローンであるが特異的に発現したタンパク質（例えば、媒体中の生分解性の汚染物質等の新しい化合物に対応して誘発されたもの）は、特異的表示によってスクリーニングすることができる。（Ａｐｐｌｅｙａｒｄら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｔ． ２４７：３３８−３４２ （１９９５））。 Ｈｏｐｗｏｏｄは（Ｐｈｉｌ Ｔｒａｎｓ Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄ Ｂ ３２４：５４９−５６２）構成物質生成用のスクリーニングの評価を提供している。Ｏｍｕｒａ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏ． Ｒｅｖ． ５０：２５９−２７９ （１９８６）およびＮｉｓｂｅｔは（Ａｎｎ Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２１：１４９−１５７ （１９８６））高感受性細菌、β−ラクタマーゼおよびＤ，Ｄ− カルボキシペプチダーゼ抑制、β−ラクタマーゼ誘発、色原体基質および単クローン抗体スクリーニングの検出を含む、抗菌剤のスクリーニングを公開している。
抗生物質の標的物質もまたスクリーニング標的として、高スループットスクリーニングで利用される。抗菌性は、菌成長の抑制によって典型的にスクリーニングされる。薬剤は 酵素および色原体基質を含むプレートまたは自動受容体分析を利用して酵素抑制剤として特定される。加水分解酵素（例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ）は寒天培地に基質を含み、加水分解透明帯を記録するか、または比色インジケーターを使用することによりスクリーニングすることができる。（ＳｔｅｅｌｅらＡｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４５：８９−１０６（１９９１））これはまた、酵素活性の効果を検出するために、染色の使用と組合せることもできる。（例えば、セルロースおよびヘミセルロースの分解を検出するためのコンゴレッド。）
【００６４】
タグ付き基質を使用することもできる。例えば、リパーゼおよびエステラーゼは、ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌに結合した脂肪酸の異なった長さを利用してスクリーニングできる。リパーゼまたはエステラーゼの活性は、脂肪酸からこのタグを除き、そのため、蛍光を消滅または強化させる。これらの酵素は、マイクロタイタープレート中でロボット機器によりスクリーニングすることができる。
１．２． 高スループット細胞スクリーニング：多様な「オミックス」タイプの利用
機能的なゲノム研究では、一旦ヌクレオチド配列情報が得られると遺伝子機能を判定する。プロテオミクス（発現、ポスト翻訳変更、相互作用等のタンパク質特性研究、）およびメタボロオミクス（代謝産物プールの分析）は、機能的ゲノム研究の完成する、急速に出現している分野であり、細胞プロセスの包括的および統合的な視野を提供するものである。この分野に使用される多様な技術および方法には、バイオ情報学、遺伝子配列チップ、ｍＲＮＡの特異的表示、疾病モデル、タンパク質判定および発現、および標的の実証の使用が含まれる。これらの成果の多くの究極の目的は知られてない機能の遺伝子の高スループットスクリーニングを開発することであった。参考としてＧｒｅｅｎｂａｕｍ Ｄ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ、１１（９）：１４６３−８ （２００１）参照のこと。
【００６５】
１．２．１ ゲノム研究
本発明の実施例は細胞スクリーニングを提供する；ある特定の実施例では、細胞スクリーニングには、ゲノム研究が含まれることがある。”高スループットゲノム研究”とは、マイクロアレイまたはその他のゲノム技術を使用するゲノムまたは遺伝子データ分析技術の、大量の遺伝子またはタンパク質の迅速な特定、またその構造の識別、正常または異常細胞または組織からの発現または機能への応用のことである。観察者は、顕微鏡でスライドを観察する者でも、デジタル画像を見る者でもかまわない。または、観察者は、ユーザの関与の有無に関係無く、生物学的配列サンプルの自動的に観察、分析、定量が行われるコンピュータによる画像分析システムでもよい。ゲノム研究は、広範囲に渡る多様な研究技術を意味するが、しばしば、同時に多くの遺伝子の遺伝発現を測定することを意味する。Ｌｏｃｋｈａｒｔ、Ｄ．Ｊ．およびＷｉｎｚｅｌｅｒ、Ｅ．Ａ． ２０００． ゲノム研究、遺伝子発現およびＤＮＡ配列。Ｎａｔｕｒｅ、 ４０５（６７８８）：８２７−３６．
【００６６】
１．２．１．１． 生物学的チップ
１．２．１．１．１． 概要
本発明の一局面は、シリカチップ上に超小型パターンに固定されたオリゴヌクレオチドプローブの配列の使用を提供するものである。分析形式によっては、オリゴヌクレオチドプローブは、例えば共有結合のアタッチメントで、担体につながれており、対象となる核酸中の特定の核酸配列を検出するのに使われる担体に、オリゴヌクレオチドプローブの配列が固定されている。例えば、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ ８９／１０９７７および８９／１１５４８参照のこと。他にも、大量のオリゴヌクレオチドプローブを使用して、対象となる核酸の完全な核酸配列を提供することが提案されているが、この提案では、固定プローブのアレイの使用方法は、提案されていない。米国特許第５，２０２，２３１、５，００２，８６７、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ ９３／１７１２６参照。米国特許第５，１４３，８５４およびＰＣＴ特許公開第ＷＯ ９０／１５０７０および９２／１００９２参照のこと。これらは、本書に参考として組み入れられるものとする。「ＤＮＡチップ」と呼ばれる大量オリゴヌクレオチドプローブの超小型配列は、広範囲にわたる応用に有望である。これを実現するには、新規の方法および試薬が必要であり、本発明は、そのニーズに応えるものである。
【００６７】
１．２．１．１．３． 核酸配列を利用する特定の方法
本発明は、ポリヌクレオチドの知られている配列（参照配列）をその配列の変形（対象配列）と比較する多くの方法を提供するものである。比較は、すべてのゲノム、染色体、遺伝子、エクソンまたはイントロンのレベルで行われてもよいし、または、個々の突然変異サイトおよびその隣接する塩基に焦点を当ててもよい。この方法により、例えば、ある特定の変形が、以前特徴付けられたかには関連せずに対象となる配列の突然変異または多形等の変形の検出が可能になる。この方法は、変形の特質を定義し、また、対象配列中の位置を特定する。
この方法は、担体中に固定されたオリゴヌクレオチドプローブ配列を使用する。対象配列は、配列内の特定のプローブで雑種核酸の範囲を特定することにより分析される。この方法は、プローブの選択で完全に一致したプローブと、１塩基または他の程度の不一致を示すプローブの識別を容易にする。
この方法は、通常対象配列中の対象となるそれぞれのヌクレオチドのサンプリングを幾度か行い、その特定に高い信頼度を達成している。この信頼度のレベルは、対象となるヌクレオチドに隣接するヌクレオチドをサンプリングすることで更に高めることができる。
チップ上のプローブの数は、かなり多い。（例えば、１０５〜１０６）。しかし、通常は合計数のうち少数の決まった長さのプローブしか表示されない。すべての可能なプローブのうち、決まった長さの少数のプローブしか使わないことの利点は以下のとおりである：（ｉ）雑種核酸作成の有無に拘わらず配列のそれぞれの位置の情報が豊富である。；（ｉｉ）非特定雑種核酸作成が最小限度に抑えられる；（ｉｉｉ）雑種核酸の差異と配列の差異の関係、特に、知られている標準の雑種核酸パターンに関してシンプルである；および（ｉｖ）高解像度フォトリソグラフィを使って合成中それぞれのプローブを独立して操作できるため、どの配列にもアレイのデザインおよび最適化が図れる。例えば、どのプローブの長さも他とは個別に変更できる。
チップは、アレイ内のプローブに固定されたラベル付き対象物の強度を比較することで読まれる。
【００６８】
１．２．１．１．５．４． 欠失、挿入および複数突然変異プローブ
チップによっては、欠失突然変異の分析のために特別デザインされた追加プローブを提供しているものもある。追加プローブセットは、前記の最初のプローブセット中のそれぞれのプローブに対応するプローブからなっている。しかし、追加プローブセットの中のプローブは、最初のプローブセットの対応するプローブとは、追加プローブセットからのプローブでは質問位置を占めるヌクレオチドが欠失している点で異なっている。任意で、追加プローブセットのプローブが、最初のプローブセットの対応するプローブに関連する末端の一つに追加のヌクレオチドを有することもある。追加プローブセットのプローブは、最初のプローブセットの対応するプローブよりも強力に、質問位置に対応するヌクレオチドで単独塩基を有する対象配列に対し雑種交配を行う。追加のプローブセットは、質問位置だけではなく検出された隣接するヌクレオチドにも提供される。
同様に他のチップは、挿入の分析のために追加のプローブセットを提供するものである。例えば、前述のように追加のプローブセットは最初のプローブセットのそれぞれのプローブに対応するプローブを有している。しかし、追加プローブセットのプローブは、余分なＴヌクレオチドが質問位置に隣接して挿入してある。任意に、最初のプローブセットのプローブと対応した関連する終端の一つに一つ少ないヌクレオチドを有する。追加プローブセットのプローブは、最初のプローブセットのプローブよりも強力に、Ａヌクレオチドが質問位置に対応する隣接位置に挿入されている、対象となる配列に雑種交配を行う。
Ｃ、ＧまたはＴ／Ｕヌクレオチドが質問位置に隣接して挿入されている同様な追加プローブセットが作成される。通常、そのようなプローブセットには、それぞれのヌクレオチドの１つが組合せで使われる。
他のチップでは、複数の隣接した突然変異を有する対象配列を分析する追加プローブを（複数突然変異プローブ）提供している。複数突然変異プローブは通常上記の最初のセットの対応するプローブと同一であるが質問位置を占める塩基と１つ以上の位置で、ヌクレオチドに対応して参考配列中の置換が起こり得ることが異なる。複数突然変異プローブ内の１つ以上の追加位置は、考えられる置換が起こった時に、参照配列内の対応する位置を占めるヌクレオチドに保管したヌクレオチドで占められる。
【００６９】
１．２．１．２． 配列決定
本発明は、細胞スクリーニングのステップからなることがある細胞工学を行う方法を提供する。好ましい実施例で、本発明は、ゲノム配列のステップからなり得る細胞スクリーニングのステップを提供する。一例としては、ゲノム配列は、酵素／Ｓａｎｇｅｒ方法によって達成することができ（Ｆ． Ｓａｎｇｅｒ、Ｓ． Ｎｉｃｋｌｅｎ、およびＡ． Ｒ． Ｃｏｕｌｓｏｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｉ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４：５４６３−５４６７（１９７７）に記述）また、クローニングおよびサブクローニングに関わる（米国特許Ｎｏ．４７２５６７７；ＣｈｅｎおよびＳｅｅｂｕｒｇ、ＤＮＡ ４、１６５−１７０（１９８５）；Ｌｉｍら、Ｇｅｎｅ Ａｎａｌ．、Ｔｅｃｈｎ．５、３２−３９（１９８８）；ＰＣＲプロトコル：方法と応用のガイド。Ｉｎｎｉｓら、編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９０）；Ｉｎｎｉｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５、９４３６−９４４０（１９８８）に記述）。
また他の例においては、配列は以下の参考文献に記述されている化学／ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ方法により達成できる：Ａ． Ｍ． ＭａｘａｍおよびＷ． Ｇｉｌｂｅｒｔ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、７４：５６０−５６４（１９７７）およびＣｈｕｒｃｈら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、８１：１９９１（１９８４）。またその他の例においては、ゲノム配列決定は、ＧｕｏおよびＷｕが説明する方法（ＧｕｏおよびＷｕ、Ｎｕｃｌｅｕｓ Ｒｅｓ．、１０：２０６５（１９８２）；およびＭｅｔｈ． Ｅｎｚ．，１００：６０（１９８３））または、以下の参考文献の例にある、３’ヒドロキシ保護およびラベル付き核酸を利用した方法によって達成できる：Ｃｈｕｒｃｈｉｃｈ、Ｊ．Ｅ．、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２３１：７３６（１９９５）；Ｍｅｔｚｋｅｔ、Ｍ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌｅｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２：４２５９ （１９９４）；Ｂｅａｂｅａｌａｓｈｖｉｌｌｉ、Ｒ．Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、８６８：１３６ （１９８６）；Ｃｈｉｄｇｅａｖａｄｚｅ、Ｚ．Ｇ．；Ｋｕｋｈａｎｏｖａ、Ｍ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、８６８：１４５（１９８６）；Ｈｉｒａｔｓｕｋａ、Ｔ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、７４２：４９６（１９８３）；Ｊｅｎｇ、Ｓ．Ｊ．およびＧｕｉｌｌｏｒｙ、Ｒ．Ｊ． Ｊ．、 Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、３：４４８ （１９７５）。
【００７０】
本発明は、特定の実施例ではＤＮＡ増幅の方法が含まれることもある、細胞スクリーニングの方法からなる細胞工学を行う方法を提供する。ある特定の実施例においては、本発明は、ＤＮＡ増幅を提供する。ＤＮＡは、クローニング（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：研究室マニュアル。Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（Ｃ．Ｒ．ＮｅｗｔｏｎおよびＡ．Ｇｒａｈａｍ、ＰＣＦ、ＢＩＯＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９４；Ｂｅｖａｎら、「ＰＣＲ増幅ＤＮＡの配列決定」ＰＣＲ Ｍｅｔｈ． Ａｐｐ． ４：２２２ （１９９２））、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）（Ｆ． Ｂａｒａｎｙ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８、１８９−９３（１９９１）、鎖転位増幅（ＳＤＡ）（Ｇ．Ｔｅｒｒａｎｃｅ Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｕｓ Ｒｅｓ． ２２、２６７０−７７（１９９４））およびＲＴ−ＰＣＲや（Ａｒｅｎｓ、Ｍ． Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ、１２（４）：６１２−２６ （１９９９））、対立遺伝子特定増幅（ＡＳＡ（Ｎｉｃｈｏｌｓ、Ｗ．Ｃ．ら、ゲノム研究。１０月；５（３）：５３５−４０（１９８９）；Ｇｉｆｆａｒｄ、Ｐ．Ｍ．らＡｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、；２９２（２）：２０７−１５（２００１））のような変形を含む多様な手順で増幅される。
【００７１】
注釈
本発明の一つの局面では、生物分子配列情報の保管および操作、遺伝子情報の保管および表示用の関連したデータベースの使用を公開するものであり、データベースには、複数の種類の生体のゲノムライブラリー、複数ゲノム配列を有するライブラリーを含み、少なくともそのうちのいくつかは、複数生体のそれぞれのゲノム上の隣接する配列にそって位置しているオープンリーディングフレームを表示するものであり、また比較結果の比較および表示用に２つ以上のゲノムライブラリーの選択をユーザインターフェース行える。データベースに関連してソフトウェアシステムで、ゲノム内の選択された遺伝子配列の関連する位置をユーザが判定することができる。このシステムで生物分子配列の遺伝子の座を表示する方法が実行できる。この方法は、複数の生物分子配列を含むデータベースを提供することに関わり、少なくとも幾つかは生体のゲノム上の隣接する配列にそって位置するオープンリーディングフレームを表示する。このシステムはまた、そのようなプローブオープンリーディングフレームおよびゲノムライブラリーのオープンリーディングフレーム間の相同的一致を決定するのに使われる１つ以上のプローブオープンリーディングフレームの選択を受け取ることができ、決定の結果を表示するユーザインターフェースを備えている。配列のオープンリーディングフレームは、選択され、隣接する配列上で起こる、関連する位置の上流または下流に位置する隣接するオープンリーディングフレームと一緒に表示される。
【００７２】
１．２．１．３．２． 注釈 例
本発明の注釈方法には、ＰＣＴ特許出願番号９８／２６４０７、９８／２６４０８、および９９／４９４０３および米国特許番号６，０２３，６５９および５，９５３，７２７に記述されているものが、含まれ、これらの参考文献は、個別の特許または特許出願書が全文参考として具体的に個別に記述されているのと同じ範囲において、すべて参考として本文に含まれるものとする。
１．３． トランスクリプトーム解析またはＲＮＡプロファイリング
ＲＮＡ発現および転写個体群の特徴は（トランスクリプトーム）ＲＮＡ特異的表示およびＤＮＡマイクロアレイのような高スループット技術を利用したＲＮＡプロファイルおよび／または発現プロファイルである。遺伝子発現を特定する潜在的方法の一つは、ＳＡＧＥ（遺伝子発現連続解析）であり、化学技術の組合せおよび化合物ライブラリーのスクリーニング内の単配列タグを利用するものである。詳しい情報は、以下の参考文献を参照のこと：Ｂｕｒｇｅ、Ｃ．Ｂ． ２００１．トランスクリプトームにおけるチッピング。Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ、２７（３）：２３２−４；Ｈｕｇｈｅｓ、Ｔ．Ｒ．およびＳｈｏｅｍａｋｅｒ、Ｄ．Ｄ．、２００１。表示プロファイル用ＤＮＡマイクロアレイ。Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ、５（１）：２１−５；Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｍ．ら２００１。遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）の利用技術。Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５０（１−２）：４５−６６。
１．３．１ タンパク質結合用ヌクレオチドのスクリーニングおよび選択
本発明の一実施例では、組換えのユーザおよび生体内化学合成方法のスクリーニング方法を含む。これらのハイブリッド方法においては、ライブラリーメンバーの生体内合成を達成するために無細胞酵素機器が使用されている（例、ペプチドまたはポリヌクレオチド）。ある種の方法では、予め決められたタンパク質と結合できるＲＮＡ分子または予め決められた染色分子が選択およびＰＣＲ増幅の繰り返しにより選択される。（ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ、１９９０；ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ、１９９０）予め決められたヒト転写因子を結合するＤＮＡ配列の特定にも同様な技術が使用される。（ＴｈｉｅｓｅｎおよびＢａｃｈ、１９９０；ＢｅａｕｄｒｙおよびＪｏｙｃｅ、１９９２；ＰＣＴ特許出願ＷＯ ９２／０５２５８およびＷＯ ９２／１４８４３）
【００７３】
１．４． プロテオミクス
本発明の他の実施例においては、本発明は、プロテオミクスの新たな分野に関わり、プロテオミクスは、メッセンジャーＲＮＡレベルではなくてタンパク質レベルにおいて発現を検出し定量することにより遺伝子の働きを質的および定量的に測定することに関わる。プロテオミクスはまた、非ゲノム暗号イベントに関わり、それには、タンパク質の翻訳後改変（グリコシル化またはその他の改変を含む）、タンパク質同士の相互作用、および細胞内のタンパク質の位置が含まれている。細胞に表示されたタンパク質の構造、機能および／または活性レベルも対象となる。本質的に、プロテオミクスは、細胞内に含まれたまたは隠れたすべてのタンパクの部分的または全体の状態を研究するものである。プロテオミクスには、混合物内のタンパク質を分離し、高および低数度の種を療法特定する手段を必要とする。現在使われている、複合タンパク混合物を溶解する強力な方法の例には２Ｄジェル電気泳動、逆位相ＨＰＬＣ、毛細管電気泳動、等電フォーカスおよび関連する雑種混合技術があげられる。通常使用されるタンパク質特定技術はＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｅｄｍａｎ法と質量分析法（エレクトロスプレー［ＥＳＩ］またはマトリックス補助レーザー脱着イオン化［ＭＡＬＤＩ］ＭＳ）および、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂタンパク質および核酸データベース内でそのペプチドのＭＳＭＳスペクトルからタンパク質を特定する、ＳＥＱＵＥＳＴのような洗練されたデータベース検索プログラムが含まれる。コンピュータを使用し、質量分析法の出力が分析され、暗号の遺伝子および特定のタンパク質がリンクされる。この全体的なプロセスは、しばしば「機能的ゲノム研究」と呼ばれる。
プロテオミクス研究の一般的な情報は、例えば以下の文献を参照のこと：Ｊ．Ｓ． Ｆｒｕｔｏｎ、１９９９、タンパク質、酵素、遺伝子：化学と生物学の相互作用、Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖ．Ｐｒ．；Ｗｉｌｋｉｎｓら、１９９７、プロテオミクス研究：機能的ゲノム研究の新領域（原理と実践）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ；Ａ．Ｊ．Ｌｉｎｋ、１９９９、２Ｄプロテオミクス分析プロトコル（分子生物学の方法、１１２、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ．）；およびＫａｍｐら、１９９９、プロテオミクスおよびタンパク質分析、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ． Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ。また、以下も参照のこと：Ｊａｍｅｓ、Ｐｅｔｅｒ、”ポストゲノム時代のタンパク質特定：プロテオミクスの急速な進歩」、Ｑ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、Ｖｏｌ．３０、Ｎｏ．４、ｐｐ．２７９−３３１（１９９７）、これらは、参考として本文に組み入れられるものである。
【００７４】
１．４．１ ペプチドのスクリーニング：ペプチド表示方法
本発明はまた、選択した突然変異ポリヌクレオチド配列（または選択したポリヌクレオチド配列の個体群）を生成する方法を導くもので、典型的には増幅および／またはクローン化ポリヌクレオチドの形を取り、それには選択できる少なくとも１つの望ましい表現型特徴（例えば、ポリペプチドの暗号化、リンクされたポリヌクレオチドの転写の促進、タンパク質の結合等）を有する、選択されたポリヌクレオチド配列を有する。例えば、予め決定された生物分子（例えば受容体）に結合するような、望ましい構造または機能的特性を有するハイブリッドポリペプチドを特定する方法の一つは、望ましい構造または機能的特性を有する個別のライブラリーメンバー用に、ポリペプチドのアミノ酸配列により大量のポリペプチドライブラリーをスクリーニングすることである。
ペプチドスクリーニングの１方法
一つの型はバクテリオファージ粒子又は細胞の表面にペプチド配列、抗体、又は他のタンパク質を提示することを含んでいる。一般的にこれらの方法において、それぞれのバクテリオファージ粒子又は細胞は、天然のバクテリオファージ粒子又は細胞タンパク質の配列に加えて提示された、ペプチドの単一の種類を提示する個々のライブラリーのメンバーとしてはたらく。それぞれのバクテリオファージ粒子、又は細胞は、特定の提示されたペプチド配列をコードするヌクレオチド配列情報を含んでいる。すなわち、提示されたペプチド配列は、単離されたライブラリーのメンバーのヌクレオチド配列の決定によって確認することができる。
【００７５】
公知のペプチドディスプレイ法は、典型的にはバクテリオファージのコートタンパク質との融合体として、糸状のバクテリオファージの表面にペプチド配列を示すことを含んでいる。バクテリオファージライブラリーは、固定化されたあらかじめ決められた巨大分子又は小分子（例えば受容体）とインキュベートされうり、それによって、固定化された巨大分子と結合するペプチド配列を示しているバクテリオファージ粒子は、そのあらかじめ決められた巨大分子と結合するペプチド配列を示していない粒子から別々に分割されうる。固定化された巨大分子に結合したそのバクテリオファージ粒子（すなわち、ライブラリーのメンバー）を次に、続く、親和性の増強及びファージ複製の回のための選択されたバクテリオファージの亜集団を増幅するために、回収し、複製する。数回の親和性の増強及びファージ複製のあと、続いて選択されたバクテリオファージライブラリーのメンバーを単離し、そして、提示されたペプチド配列をコードしているヌクレオチド配列を決定し、それによりあらかじめ決められた巨大分子（たとえば、受容体）と結合するペプチドの配列を同定する。このような方法は、国際公開公報第９１／１７２７１号、国際公開公報第９１／１８９８０号、国際公開公報第９１／１９８１８号、及び国際公開公報第９３／０８２７８号にさらに詳しく記載されている。
後者のＰＣＴ出版物は、あらかじめ決められた巨大分子に強く結合するために利用される、典型的には可変配列からなる最初のポリペプチド部分及び、それぞれの融合タンパク質をコードしているＤＮＡベクターのようなＤＮＡに結合する第二のポリペプチド部分からなる、それぞれの融合タンパク質をもつ融合タンパク質ライブラリーの作製を含むような、ペプチドリガンドの提示のための組換えＤＮＡ法を記載している。形質転換された宿主細胞が融合タンパク質を発現させる条件下で培養されるとき、融合タンパク質は、それをコードしているＤＮＡベクターと結合する。宿主細胞を溶解させることで、融合タンパク質／ベクターＤＮＡ複合体は、バクテリオファージ粒子がファージに基づいた提示システムにおいてスクリニーングされるのと全く同様な手法で選択されたライブラリーのペプチド配列の同定の基礎としてはたらく選択された融合タンパク質／ベクターＤＮＡ複合体におけるＤＮＡベクターの複製及び配列決定により、あらかじめ決められた巨大分子に対してスクリーニングされうる。
【００７６】
ペプチド及び類似の重合体ライブラリーを作製する他のシステムは、組換え及びインビトロ化学合成の方法という両方の局面を持っている。これらのハイブリッド法では、ライブラリーのメンバー（すなわち、ペプチド又はポリヌクレオチド）のインビトロ合成を行うために、細胞を含まない酵素的な機構が用いられる。ある方法の一つの型では、あらかじめ決められたタンパク質又はあらかじめ決められた色素分子と結合する能力のあるＲＮＡ分子が、選択及びＰＣＲ増幅を交互に繰り返すことで選択された（Ｔｕｅｒｋ及びＧｏｌｄ、１９９１、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ及びＳｚｏｓｔａｋ、１９９０）。同様の技術が、あらかじめ決められたヒト転写因子と結合するＤＮＡ配列を同定するために用いられた（Ｔｈｉｅｓｅｎ及びＢａｃｈ、１９９０、Ｂｅａｕｄｒｙ及びＪｏｙｃｅ、１９９２、国際公開公報第９２／０５２５８号、及び国際公開公報第９２／１４８４３号）。同様の方法により、インビトロ翻訳の技術が、関心対象のタンパク質の合成に使われており、大きなペプチドのライブラリーを作製する方法として提案されている。一般的には安定化されたポリソーム複合体を含む、インビトロ翻訳を元にしたこれらの方法は、国際公開公報第８８／０８４５３号、国際公開公報第９０／０５７８５号、国際公開公報第９０／０７００３号、国際公開公報第９１／０２０７６号、国際公開公報第９１／０５０５８号、及び国際公開公報第９２／０２５３６号にさらに記述されている。本出願者は、ライブラリーのメンバーがＤＮＡ結合活性を持つ第一のポリペプチド部分及びライブラリーのメンバーである独特のペプチド配列を持つ第二のポリペプチド部分からなる融合タンパク質を含む方法を記述している。このような方法は、他の方法の中で、細胞を含まないインビトロ選択の形式における使用に適している。
提示されたペプチドの配列の長さは変化されうり、典型的には、３アミノ酸長から５０００アミノ酸長、又はそれ以上、しばしば５アミノ酸長から１００アミノ酸長、そして、たいていは８アミノ酸長から１５アミノ酸長である。ライブラリーは、異なった長さの提示されたペプチド配列をもつライブラリーメンバーを含むことができ、又は、固定された長さの提示されたペプチド配列をもつライブラリーメンバーを含みうる。提示されたペプチド配列の一部又は全部は、ランダム、疑似ランダム、明確な一連のカーネルであったり、固定されているなどであることができる。本明細書に示されたディスプレイ法は、ポリソーム上の発生期のｓｃＦｖ又はファージ上に示されたｓｃｆｖのような一本鎖の抗体のインビボ提示及びインビトロ提示のための方法を含んでおり、これは可変領域配列及び結合特性の幅広い多様性を持つｓｃｆｖライブラリーの大規模なスクリーニングを可能にする。
【００７７】
本発明はまた、ランダム配列、偽ランダムな配列、および定義された配列のフレームワークペプチドライブラリーを提供し、かつそれらのライブラリーを作製し、スクリーニングし、所望のやり方でペプチドまたはＲＮＡを改変する、受容体分子または関心対象のエピトープまたは遺伝子産物に結合する有用な組成物（例えば、一本鎖抗体を含むペプチド）を同定するための方法を提供する。ランダム配列、偽ランダムな配列、および限定配列のフレームワークペプチドを、ペプチドライブラリーメンバーのライブラリーから作製し、このライブラリーは、ディスプレイされるペプチドまたはディスプレイされるペプチドが合成されるポリヌクレオチド鋳型に接着する、ディスプレイされる一本鎖抗体を含む。接着方法は、選択される本発明の特定の態様に係って変えてもよく、ファージ粒子への封入または細胞への組み込みを含むことができる。
１．４．２． 試験管内翻訳システムを利用したスクリーニング
本発明の一実施例では、スクリーニングのステップ中に試験管内翻訳を利用している。試験管内翻訳は、対象のタンパク質の合成に利用されてきており、ペプチドの大量ライブラリを生成する方法として提案されている。これらの方法は、一般的に安定ポリゾーム化合物からなるもので、詳細はＰＣＴ特許出願ＷＯ ８８／０８４５３、ＷＯ９０／０５７８５、ＷＯ９０／０７００３、ＷＯ９１／０２０７６、ＷＯ９１／０５０５８、およびＷＯ９２／０２５３６に記載されている。出願者らは、最初のポリペプチド部にＤＮＡ結合活性があり、２つめのポリペプチド部にライブラリーメンバーに特有のペプチド配列のある融合タンパク質からなるライブラリーメンバーを説明している。このような方法は、中でも無細胞試験管内選択形式に適している。
１．４．３． 親和力強化
本発明の１局面は、親和力強化を使用しているため、非常に大きなペプチドおよび単鎖抗体をスクリーニングし、望ましいペプチドまたは単鎖抗体を選択できる。選択されたペプチド（またはその予め決定された部分）のアミノ配列または単鎖抗体（またはそのＶＨＩ、ＶＬＩまたはＣＤＲ部分のみ）が連結して組み合せられるように、ポリヌクレオチドは、その後分離、シャッフルされる。これらの方法を使用して、分子に対して望ましい結合親和性を有するペプチドまたは単鎖抗体を特定し、望ましい高い親和性を持つペプチドまたはｓｃｆｖに急速に収斂するようシャッフリングのプロセスを行うことができる。ペプチドまたは抗体は、その後従来の手段により、適切な用途用にまとめて合成される（治療または診断剤として）。
本発明の際立った長所は対象のペプチド配位子または抗体を分離するのに予想される配位子の構造に関する先行した情報が必要ないことである。特定されたペプチドは、少なくとも選択された受容体分子の特定の結合親和性である生物活性を持ち、また、場合によってはその他の化合物の結合を妨害する、代謝経路を刺激または抑制する、信号またはメッセンジャーとして作用する、細胞活性を刺激または抑制する等の能力を含む。
【００７８】
本発明は、ライブラリーメンバーのために発生期のペプチド（単鎖抗体を含む）を表示するポリゾームのライブラリーを親和スクリーニングすることによって、また選択したポリヌクレオチド配列のプールをシャッフルする方法を提供するものである。ライブラリーメンバーは、予め決定された受容体に結合するか（例えば、哺乳類タンパク質性受容体、例えば、ペプチドホルモン受容体、細胞表面受容体、他のタンパク質と結合してヘテロダイマーなどの細胞内タンパク質混合物を作り出す、細胞内タンパク質等）またはエピト−プする（例えば、固定タンパク質、グリコプロテイン、オリゴ糖、等）。
本発明はまた、本発明の複数の個別ライブラリーメンバーからなるペプチドライブラリーを提供するものであり、（１）前述の複数のそれぞれの個別のライブラリーメンバーは、選択された配列のプールをシャッフルすることによって生成された配列からなり（２）それぞれ個別のライブラリーメンバーは、可変ペプチドセグメント配列、または単鎖抗体セグメント配列からなり、該単鎖抗体セグメントは、可変ペプチドセグメント配列または他の複数の個別ライブラリメンバーの単鎖抗体セグメント配列から異なっている（しかしライブラリーメンバーによっては、均質でない増幅、確率論等のためにライブラリーにつき一つ以上の複写が存在することもある）。
【００７９】
抗体表示
本方式は、公開されたすべての方法による生体内および／または試験管内の組換えによって、抗体表示方法によって選択されたポリヌクレオチド配列を、どのような組合せでもシャッフルできるもので、関連するポリヌクレオチドは、フェノタイプのためにスクリーニングされた表示抗体を暗号化する。（例えば、予め決定された抗原を親和結合する（配位子））。
特定の抗原に高い親和性を持つ抗体をスクリーニングして、組換え抗体ライブラリーを生成するよう操作できる多様な原核発現システムが開発されてきた。大腸菌内の抗原の発現およびバクテリオファージシステムは（”代替ペプチド 表示方法”、以下参照）特徴づけたハイブリドーマから抗体遺伝子をクローンすることにより、または抗体遺伝子ライブラリー利用したデノボ選択により、事実上どんな特性でも得られる可能性をもたらした（例えば、Ｉｇ ｃＤＮＡから）。
抗体の組合せライブラリーは、バクテリオファージプラークまたは溶菌ファージコロニーとしてスクリーニングされるバクテリオファージλ発現システム内で生成される（Ｈｕｓｅら、１９８９）；ＣａｔｏｎおよびＫｏｐｒｏｗｓｋｉ、１９９０；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、１９９０；Ｐｅｒｓｓｏｎら、１９９１）。バクテリオファージ抗体表示ライブラリーおよびλファージ表示ライブラリーの多様な実施例が説明された。（Ｋａｎｇら、１９９１；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０；Ｂｕｒｔｏｎら、１９９１；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１；Ｃｈａｎｇら、１９９１；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、１９９１；Ｍａｒｋｓら、１９９１、ｐ． ５８１；Ｂａｒｂａｓら、１９９２；Ｈａｗｋｉｎｓ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ、１９９２；Ｍａｒｋｓら、１９９２、ｐ． ７７９；Ｍａｒｋｓら、１９９２、ｐ． １６００７；およびＬｏｗｍａｎら、１９９１；Ｌｅｒｎｅｒら、１９９２；すべては本書に参考文献として組み入れられるものとする）。典型的に、バクテリオファージ抗体表示ライブラリーは、受容体でスクリーンされ（例えば、ポリペプチド、炭水化物、グリコプロテイン、核酸）固定され、（例えば、親和クロマトグラフィにより、クロマトグラフィ樹脂に共有結合し、反応ファージをを強化する）および／または標識化する（例えば、プラークまたはコロニーリフトをスクリーニングする）。
【００８０】
特に有益な方法として所謂、単鎖断片変数（ｓｃｆｖ）ライブラリーが使用されてきた。（Ｍａｒｋｓら、１９９２、ｐ． ７７９；ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９９１；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１；Ｍａｒｋｓら、１９９１、ｐ．５８１；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９９０；Ｃｈｉｓｗｅｌｌら、１９９２；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０；およびＨｕｓｔｏｎら、１９８８）。バクテリオファージコートタンパク質上に表示されたｓｃｆｃライブラリーの多様な実施例が説明された。ｓｃｆｃのバクテリオファージ表示はすでに、多様な有益な抗体や抗体融合タンパクを産出している。二重特異単鎖抗体が、効果的に腫瘍細胞溶解を媒介することが知られている（Ｇｒｕｂｅｒら、１９９４）。抗Ｒｅｖ ｓｃｆｖの細胞内表示は、ＨＩＶ１ウィルスの複写を試験管内で抑制することが知られている（Ｄｕａｎら、１９９４）、またａｎｔｉｐ２ｌｒａｒ細胞内表示、ｓｃｆｖはＸｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓの減数分裂成熟を抑制することがわかっている（Ｂｉｏｃｃａら、１９９３）。ＨＩＶ感染の診断に使われる組換えｓｃｆｖも、報告されておりｓｃｆｖの診断的有用性を示している（Ｌｉｌｌｅｙら、１９９４）。毒、または繊維素溶解活性タンパク質などの、ｓｃＦｖが２番目のポリペプチドに結合した融合タンパクもまは報告されている（Ｈｏｌｖｏｓｔら、１９９２；Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、１９９３）。
ｓｃｆｖライブラリーの組合せの多様性を高め、種の結合レパートリーを広げる多くの方法が報告されている（イディオタイプスペクトル）。酵素逆転ＰＣＲ突然変異発生は、エラーを起こしやすいＰＣＲおよび化学突然変異（Ｄｅｎｇら、１９９４）に比べて、大きなｓｃｆｖ特定部位のハイブリッドライブラリーを構築する簡単で信頼性のある方法であることが知られている。（Ｓｔｅｍｍｅｒら、１９９３） Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９９３）は、変性オリゴヌクレオチドＰＣＲおよび反応生成物であるｓｃｆｖハイブリッドの二次的なファージ表示による特定位置ランダム化を利用して抗体ｓｃｆｖ断片を半合理的にデザインした。Ｂａｒｂａｓ（Ｂａｒｂａｓら、１９９２）は、ヒト破傷風類毒素結合Ｆａｂの人工ＣＤＲ区域の配列をランダム化することにより、偏向した可変区域の配列に起因するレパートリーの大きさに関する問題を迂回する試みを行っている。
【００８１】
１．４．５ ツーハイブリットｓクリーニングアッセイ
予め決められたポリペプチド配列に結合するポリペプチド配列を同定するアプローチは、その予め決められたポリペプチド配列が融合タンパク質中に存在するいわゆる“２ハイブリッド”系に用いられている（Ｃｈｉｅｎら （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ８８： ９５７８）。このアプローチは、転写アクチベーター、酵母Ｇａｌ４転写タンパク質の再構築によりｉｎ ｖｉｖｏにおけるタンパク質−タンパク質相互作用を同定する（Ｆｉｅｌｄｓ Ｓ及びＳｏｎｇ Ｏ （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５）。
典型的には、この方法は酵母Ｇａｌ４タンパク質の特性に基づいており、これはＤＮＡ結合及び転写活性の原因となる分離可能なドメインからなる。２つのハイブリッドタンパク質をコードし、その一方が既知タンパク質のポリペプチド配列に融合した酵母Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインからなり、かつ他方が第２のタンパク質のポリペプチド配列に融合したＧａｌ４活性化ドメインからなるポリヌクレオチドを構築し、酵母宿主細胞に導入する。これらの２つの融合タンパク質の間の分子間結合はＧａｌ４活性化ドメインを有するＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインを再構成し、これはＧａｌ４結合部位に作動可能に連結するレポーター遺伝子（例えば、ｌａｃｚ、ＨＩＳ３）の転写活性化を導く。典型的には、この２ハイブリッド法は既知タンパク質と相互作用する新規ポリペプチド配列の同定に用いられる（Ｓｉｌｖｅｒ ＳＣ及びＨｕｎｔ ＳＷ （１９９３） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐ． １７： １５５；Ｄｕｒｆｅｅら （１９９３） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ． ７： ５５５；Ｙａｎｇら （１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７： ６８０；Ｌｕｂａｎら （１９９３） Ｃｅｌｌ ７３： １０６７；Ｈａｒｄｙら （１９９２） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ． ６： ８０１；Ｂａｒｔｅｌら （１９９３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４： ９２０；及びＶｏｊｔｅｋら （１９９３） Ｃｅｌｌ ７４： ２０５）。しかしながら、この２ハイブリッド法の変形が、第２の既知タンパク質への結合を自ら生じる既知タンパク質の突然変異の同定に用いられている（Ｌｉ Ｂ及びＦｉｅｌｄｓ Ｓ （１９９３） ＦＡＳＥＢ Ｊ． ７： ９５７；Ｌａｌｏら （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ９０： ５５２４；Ｊａｃｋｓｏｎら （１９９３） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １３： ２８９９；及びＭａｄｕｒａら （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１２０４６）。また、２ハイブリッド系は２つの既知タンパク質の相互作用する構造ドメイン（Ｂａｒｄｗｅｌｌら （１９９３） ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． ８： １１７７；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙら （１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： １７４９８；Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒら （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８： ４６０８；及びＭｉｌｎｅ ＧＴ．及びＷｅａｖｅｒ ＤＴ （１９９３） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ．， ７：１７５５）又は単一のタンパク質のオリゴマー化の原因であるドメイン（Ｉｗａｂｕｃｈｉら （１９９３） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８： １６９３；Ｂｏｇｅｒｄら （１９９３） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７： ５０３０）の同定にも用いられている。２ハイブリッド系の変形が原核生物の酵素のｉｎ ｖｉｖｏ活性の研究に用いられている（Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ８９： ４１５９）。その代わりに、大腸菌／ＢＣＣＰ相互作用スクリーニング系（Ｇｅｒｍｉｎｏら （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ９０： ９３３；Ｇｕａｒｅｎｔｅ Ｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ９０： １６３９）を、相互作用するタンパク質配列（すなわち、ヘテロダイマー化、もしくはより高次のヘテロマルチマーを形成するタンパク質配列）の同定に用いることができる。２ハイブリッド系によって選択された配列をプールしてシャッフルし、引き続き１回以上スクリーニングして予め決められた結合配列を含むハイブリッドに結合するポリペプチド配列を同定するために２ハイブリッド系に導入することができる。このようにして同定された配列を比較し、コンセンサス配列（１つもしくは複数）及びコンセンサス配列核を同定することができる。
【００８２】
細胞エンジニアリング、タンパク発現プロファイル、ペプチドの標識化及び関連新規試薬のための改良法
診断および治療、また、多様な病変および疾患の性質は、しばしば、異なった細胞種および細胞状態間のポリペプチド発現変形の特定および定量測定によって達成することができる。生物化学経路および代謝ネットワークもまた、多様な細胞種および細胞状態間のタンパク質発現を包括的に定量的に、測定することによって分析できる。（例えば、Ｉｄｅｋｅｒ（２００１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：９２９−９３４参照）。
例えば液体クロマトグラフィ−エレクトロスプレー−イオン化タンデム質量分析法等の最新技術は、データベース検索コンピュータアルゴリズムと供に、複合生物混合物の生物化学種の分析に大変革をもたらした。これらの技術により、現在では、生物分子の複合物から、ピコモルからサブピコモルレベルで高スループットタンパク質特定を行えるようになった。（例えば、Ｄｏｎｇｒｅ （１９９７） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：４１８−４２５参照）
そのような方法の１つとしては、アイソトープ暗号化親和タグ（ＩＣＡＴｓ）およびタンデム質量分析法と呼ばれる化学試薬の種類に基づくものである。この方法は、複数のシステニル残留物を識別し、また安定したアイソトープ希釈液技術を使用しており（例えば、Ｇｙｇｉ （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０：９９４−９９９）エタノールまたはガラクトースを炭素源として、酵母菌内のタンパク質の発現を比較している。タンパク質の発現における測定された差異は、グルコース抑制状態下で知られている酵母菌の代謝機能と関連付けられている。
【００８３】
その他の技術として、定量比較用の２つの異なったタンパク質混合物がペプチド混合物に吸収され、ペプチド混合物は、ｄ０−またはｄ３−メタノールを使用して別々にメチレン化され、メチレン化ペプチドの混合物は混ぜ合わせられ、ミクロキャピラリーＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにかけられる（例えば以下を参照のこと、Ｇｏｏｄｌｅｔｔ、Ｄ．Ｒ．ら（２０００）「定量化およびデノボ配列誘導用ペプチドの特異安定アイソトープ識別」 ４９ｔｈ ＡＳＭＳ；Ｚｈｏｕ、Ｈ；Ｗａｔｔｓ、ＪＤ；Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ、Ｒ． タンパク質リン酸化の分析の系統的取り組み；Ｃｏｍｍｅｎｔ Ｉｎ：Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００１ Ａｐｒ；１９（４）：３１７−８；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００１ Ａｐｒ、１９（４）：３７５ ８）メチル化ペプチド親タンパク質は、コンピュータプログラムによる実例またはｄ０−およびｄ３−メチル化ペプチドイオンすべてのタンデム質量スペクトルを比較する自動デノボ配列決定を利用して、断片イオンスペクトルを検索する関連データベースにより特定される。（前述のＧｏｏｄｌｅｔｔ（２０００））、２つの異なる混合物中タンパク質の比率は、ｄ０−またはｄ３−メチレン化ペプチドのペアで計算される。しかし、この方法には、いくつかの制限がある。それには以下が含まれる：特異的識別試薬の使用は、高価な安定的アイソトープに依存するもので、２つ以上のペプチド混合物の特異的識別をする柔軟性がない；メチル化識別法は、カルボキシ末端のメチル化のみに限定されている；タンパク質発現プロファイルが二重鎖比較に限定されている；１次元毛細ＨＰＬＣクロマトグラフィがペプチドを分離するのに使われており、これは処理能力とペプチドの複合物を還元するパワーが十分ではない。
【００８４】
本発明の一実施例では、ペプチドの特異的識別によってタンパク質を特定する方法を提供するもので、この方法は以下のステップからなる：（ａ）ポリペプチドからなるサンプルを提供する；（ｂ）クロマトグラフィ保持特性に差異がなく、イオン化および質量分光写真分析における検出特性に差異のない特異的識別ペプチドを精製できる異なった分子質量を有する複数の識別試薬を提供し、分子質量の差異は、質量分光写真分析により区別される；（ｃ）酵素吸収または非酵素断片化により、ポリペプチドをペプチドの断片に分断する；（ｄ）ステップ（ｃ）のペプチド断片によりステップ（ｂ）の識別試薬に接触し、特異的識別試薬によりペプチドを識別化する；（ｅ）クロマトグラフィーによりペプチドを分離し、溶離液を生成する； （ｆ）ステップ（ｅ）の溶離液を質量分析計に送りそれぞれのペプチドの量を測定し質量分析計を使用してそれぞれのペプチドの配列を発生させる；（ｇ）コンピュータプログラム製品に配列を入力し、入力した配列をデータベースのポリペプチド配列と比較し、配列決定されたペプチドがどのポリペプチドに由来しているのかを特定する。
一面としては、ステップ（ａ）のサンプルは、細胞または細胞抽出物からなる。本方法は、またはポリペプチドからなる２つ以上のサンプルからなることもある。１つ以上のサンプルは、野生種の細胞に由来してもよく、１つのサンプルは、異常または改変細胞から由来していてもよい。異常細胞は癌細胞でもよい。改変細胞は、以下の細胞でもよい：突然変異および／または化学処理、物理的要因またはその他の生体が存在するもの（例えば、真核生物、原核生体、ウィルス、ベクトル、プリオン、または部分的にそれらのものを、含む）、および／または環境要因、変化、または物理的な力にさらされたもの（例えば、音、光、熱、超音波、および放射能）。改変は、遺伝学的変化でも（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列または含量の変化を含む）そうでなくてもよい。
一面として、本方法は、ステップ（ｃ）の断片化の前にポリペプチドを精製または分別することからなる。本方法はまた、ステップ（ｄ）の識別化の前にポリペプチドを精製または分別することからなってもよい。更に本方法は、ステップ（ｅ）のクロマトグラフィの前に識別化されたペプチドを精製または分別することからなってもよい。他の局面において、精製または分別は、粒径排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣおよび親和精製からなる、グループから選択した方法からなる。また一面として、本方法は、ステップ（ｃ）の断片化の前にステップ（ｂ）の識別化試薬でポリペプチドを接触することからなる。
【００８５】
ペプチド／タンパク分離及び検出方法
本発明の方法は、タグ付きポリペプチドおよびペプチドを分離するクロマトグラフィ技術を使用する。一例では、例えば、多次元液体クロマトグラフィのような液体クロマトグラフィが使用される。クロマトグラム溶離液は、タンデム質量分析機器（例えば、「ＬＣ／ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ」システム）のような質量分析計と組合わされる。どのような変形およびそれに相当するものでも、ペプチドの分離と検出に使用することができる。ＬＣ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、例えば、（Ｌｉｎｋ （１９９９） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：６７６−６８２；Ｌｉｎｋ （２０００） 電気泳動 １８、１３１４−１３３４に記述されているように最初Ｌｉｎｋ Ａ．およびＹａｔｅｓ Ｊ．Ｒ．によって開発された。一例として、ＬＣ／ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ技術を使用している；これは複合ペプチド分離に効果があり、簡単に自動化できる。ＬＣ／ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、「多次元タンパク質特定技術」といい、通常略して「ＭｕｄＰＩＴ」として知られている。
本発明の方法で使用されたＬＣ／ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの変形およびそれに相当するものには、逆相カラムに関する方法を含み、それにはカチオン交換カラム（前述のように、例えば、Ｏｐｉｔｅｃｋによる（１９９７） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６９：１５１８−１５２４；または、粒径排除カラム（前述のように、例えば、Ｏｐｉｔｅｃｋによる（１９９７） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５８：３４９−３６１）が組合わされる。一面として、ＬＣ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ技術は、強度のカチオン交換（ＳＣＸ）および逆相（ＲＰＣ）樹脂を含む混合ベッドミクロキャピラリーカラムを使用する。その他の代替的な例には、一次元ＬＣ−ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳと組み合せたタンパク質分別またはＭＡＬＤＩ ＭＳ／ＭＳと組み合せたペプチド分別があげられる。
タンパク質サンプルの特性の複雑さによっては、粒径排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィまたは可能なすべての親和精製を含むタンパク質分別方法を識別およびタンパク質分解の前に導入することができる。場合によっては、サンプル中のすべてのタンパク質または特定のタンパク質を特定するのにいくつかの異なった方法を使用する必要がある。
【００８６】
配列分析および定量
改変ペプチドに由来するタンパク質の定量的および配列の両方が「多段式質量分析法」（ＭＳ）のような質量分析機器で行える。これは、質量分析計のデュアルモードで達成することができる。デュアルモードでは、毛細カラムから溶出したペプチドの総体的な量を連続してスキャンすることと、選択したペプチドの配列情報の記録が交互に起こる。ペプチドは、ＭＳモードで、異なったタグがついているペアまたは連続したペプチドイオンの総体的信号強度を測定することにより、定量化され、そのため、特異的識別試薬内で暗号化された質量差とは、質量が異なる。
ペプチド配列情報は、タンデムＭＳモードで操作されている質量分析計で、衝突誘起解離の特定の質量電荷費（ｍ／ｚ）のペプチドイオンを選択することにより、自動的に生成される。このことは、例えば、以下に記述されている：Ｌｉｎｋ （１９９７） 電気泳動 １８：１３１４−１３３４；Ｇｙｇｉ （１９９９） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：９９４−９９９；Ｇｙｇｉ （１９９９） Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９：１７２０−１７３０。
結果として生じるタンデム質量スペクトルは、配列ペプチド由来のタンパク質を特定するため、配列データベースと関連づけることができる。市販のソフトウェアの例には、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡのＴＵＲＢＯ ＳＥＱＵＥＳＴＴＭ；ｂｙ Ｍａｔｒｉｘ ＳｃｉｅｎｃｅのＭＡＳＳＳＣＯＴＴＭ 、およびＰｒｏｔｅｏｍｅｔｒｉｃｓのＳＯＮＡＲ ＭＳ／ＭＳＴＭが挙げられる。自動総体的定量化には、定期的なソフトウェアの変更が必要なことがある。
【００８７】
質量分析機器
本発明の方式では特異に識別されたペプチドおよびポリペプチドを特定し定量化するのに質量分析法を使用している。どの質量分析法システムを用いてもよい。本発明の一面では、ペプチド混合物は多次元液体クロマトグラフィとタンデム質量分析法または「ＬＣ／ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ」を組合せて、分離が行われる。例えば、Ｌｉｎｋ （１９９９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：６７６−６８２；Ｌｉｎｋ （１９９９） 電気泳動 １８：１３１４−１３３４を参照。質量分析機器の例には、マトリックス支援レーザ脱着イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法があげられる（例えば、Ｉｓｏｌａ （２００１） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７３：２１２６−２１３１；Ｖａｎ ｄｅ Ｗａｔｅｒ （２０００） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １４６：４５３−４５９；Ｇｒｉｆｆｉｎ （２０００） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８：７７−８４；Ｒｏｓｓ （２０００） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９：６２０−６２６、６２８−６２９参照）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの固有の高分子量は、高度な特定性および良好なＳＮ比を示し、正確な定量を行うことができる。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを含む質量分析法の使用、および核酸雑種交配および核酸配列決定におけるその利用は、当業者の間では知られており、例えば、米国特許第６，２５８，５３８；６，２３８，８７１；６，２３８，８６９；６，２３５，４７８；６，２３２，０６６；６，２２８，６５４；６，２２５，４５０；６，０５１，３７８；６，０４３，０３１が参照できる。
【００８８】
断片化およびタンパク質分解消化
本発明の方法の実施では、ポリペプチドは断片化され、例えば、酵素、消化および／またはその他の酵素反応または物理的断片化方法によって、タンパク質分解が行われる。断片化は、本発明の方法で使用された識別用試薬によるペプチド／ポリペプチドの反応前および／または後に行ってもよい。
ポリペプチドのタンパク質分解方法は、当業者内では知られており、例えば、トリプシン（例えば、米国特許Ｎｏ．６，１７７，２６８；４，９７３，５５４参照）、キモトリプシン（例えば、米国特許Ｎｏ．４，６９５，４５８；５，２５２，４６３参照）、エラスターゼ（例えば、米国特許 Ｎｏ． ４，０７１，４１０参照）；サブチリシン（例えば、米国特許 Ｎｏ． ５，８３７，５１６参照）を含む酵素等。
一面として、本発明のキメラ識別試薬には、分裂結合子が含まれる。分裂結合子配列の例には、例えば、因子Ｘａ、またはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）が含まれる。金属キレート化ペプチド等の他の精製容易化領域の使用も可能であり、例えば、固定した金属の精製ができるポリヒスチジン系およびヒスチジンートリプトファンモジュール、固定化したイミュノグロブリンの精製ができるタンパク質Ａ領域、およびＦＬＡＧＳ拡張／親和精製システムで利用された領域などが挙げられる。（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ、Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）．
生物学的サンプル
本方法は、２つ以上のタンパク質サンプルの比較に基づいており、そのうちの一つは標準サンプルとして考えられ、その他すべては、研究のサンプルと考えられる。例えば、本発明の一面においては、少なくとも２つの細胞状態間におけるタンパク質表示の変化を定量する方法が提供される。細胞状態の例は、活性細胞と休止細胞、通常細胞と癌細胞、幹細胞と識別細胞、負傷または感染した細胞と負傷または感染していない細胞であり、また、ある一定の細胞状態に関連した発現したタンパク質の定義する方法が提供される。
サンプルは、例えば、細菌、昆虫、酵母、哺乳類等の細胞を含む、すべての生物学的供与源に由来するものでもよい。細胞は体液や組織から回収してもよいし、または試験管内の細胞系や細胞培養物でもよい。
検出機器および方法
本発明の機器および方法はまた、全体的または部分的に、例えば、米国特許第６，１９７，５０３；６，１９７，４９８；６，１５０，１４７；６，０８３，７６３；６，０６６，４４８；６，０４５，９９６；６，０２５，６０１；５，５９９，６９５；５，９８１，９５６；５，６９８，０８９；５，５７８，８３２；５，６３２，９５７に記述されている検出機器に組み込んでもよい。
本発明の実施例がいくつも説明されてきた。しかし、本発明の主旨や範囲を超えずに多様な修正が加えられることは、言うまでもない。
【００８９】
参考文献
特に明記しない限り、ここに引用した参考文献はすべて（以上および以下）は、全体として組み入れられるものとする。
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【００９０】
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【０１０５】
ＷＯ ００／０９７５５；１９９９年８月１２日出願、 ２０００年２月２４日公開。 Ｚａｒｌｉｎｇ Ｄ， Ｒｅｄｄｙ Ｇ， Ｐａｔｉ Ｓ： Ｄｏｍａｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．
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ＷＯ ９０／０５７８５；１９８９年１１月１５日出願、 １９９０年５月３１日公開。 Ｓｃｈｕｌｔｚ Ｐ：非自然アミノ酸をサイト特有にタンパク質に組み入れる方法。
ＷＯ ９０／０７００３；１９８９年１月２７日出願、 １９９０年６月２８日公開。 Ｂａｒａｎｏｖ ＶＩ， Ｍｏｒｏｚｏｖ ＩＪ， Ｓｐｉｒｉｎ ＡＳ： 複合型転写／翻訳システム内の予備発現の方法。
ＷＯ ９１／０２０７６；１９９０年６月１４日出願、 １９９１年２月２１日公開。 Ｂａｒａｎｏｖ ＶＩ， Ｒｙａｂｏｖａ ＬＡ， Ｙａｒｃｈｕｋ ＯＢ， Ｓｐｉｒｉｎ ＡＳ：無細胞システム中のポリペプチドを得る方法。ＷＯ ９１／０５０５８；１９８９年１０月５日出願、 １９９１年４月１８日公開 Ｋａｗａｓａｋｉ Ｇ： 無細胞合成および新規の遺伝子およびポリペプチドの分離。
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【０１０７】
ＷＯ ９８／２６４０８；１９９７年１２月１１日出願、 １９９８年６月１８日公開。 Ｓａｂａｔｉｎｉ， Ｃａｔｈｒｙｎ， Ｅ． ；Ｈｅａｔｈ， Ｊｏｅ， Ｄｏｎ ；Ｃｏｖｉｔｚ， Ｐｅｔｅｒ， Ａ． ；Ｋｌｉｎｇｌｅｒ， Ｔｏｄ， Ｍ． ；Ｒｕｓｓｏ， Ｆｒａｎｋ， Ｄ． ；Ｂｅｒｒｙ， Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ， Ｆ．：遺伝子配座情報の判定、保管および表示用データベースおよびシステム。
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ＷＯ ９９／３７７５５；１９９８年１２月１１日出願、 １９９９年７月２９日公開。 Ｐａｔｉ Ｓ， Ｚａｒｌｉｎｇ Ｄａｖｉｄ， Ｌｅｈｍａｎ ＣＷ， Ｚｅｎｇ Ｈ： 遺伝子ファミリー内の対象相同遺伝子分離および組換えにおけるコンセンサス配列の使用。
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【０１０８】
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ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅｗｅｂ．ｃｏｍ
Ｄａｖｉｄ Ｇｏｏｄｌｅｔｔがゲノムの最新情報を語る ＩＣＡＴ試薬
著者： Ｍａｒｉａｎ Ｍｏｓｅｒ Ｊｏｎｅｓ
２０００年１２月２０日。
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ＵＳ６１３６１７３；１９９６年６月２４日出願、 ２０００年１０月２４日交付。 Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＮＬ， Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＮＧ， Ｇｏｏｄｍａｎ Ｊ：２次元電気泳動の自動システム。
ＵＳ６１２７１３４；１９９５年４月２０日出願、 ２０００年１０月３日交付。 Ｍｉｎｄｅｎ Ｊ， Ｗａｇｇｏｎｅｒ Ａ： 複数染色標本を利用した分化ジェル電気泳動。
ＵＳ６０６４７５４；１９９７年１２月１日、２０００年５月１６日交付。 Ｐａｒｅｋｈ ＲＢ， Ａｍｅｓｓ Ｒ， Ｂｒｕｃｅ ＪＡ， Ｐｒｉｍｅ ＳＢ， Ｐｌａｔｔ ＡＥ， Ｓｔｏｎｅｙ ＲＭ： 生物学的サンプル内の生分子の特定および特徴づけのコンピュータを使った方法および機器。
ＵＳ６０１３１６５；１９９８年５月２２日出願、 ２０００年１月１１日交付。 Ｗｉｋｔｏｒｏｗｉｃｚ ＪＥ， Ｒａｙｓｂｅｒｇ Ｙ： 電気泳動機器および方法。
【０１１０】
Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ， Ｂｒｅｎｔ Ｒ， Ｋｉｎｇｓｔｏｎ ＲＥ， Ｍｏｏｒｅ ＤＤ， Ｓｅｉｄｍａｎ ＪＧ， Ｓｍｉｔｈ ＪＡ， Ｓｔｒｕｈｌ Ｋ 編集．分子生物学における最新のプロトコル， Ｖｏｌ ２． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ， （コピーライト） ２００１， １０．２１．４−１０．２１．６， １０．２２．５−１０．２２．１０， １０．２２．１４， １０．２２．１５−１０．２２．２０．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ， Ｒｕｓｓｅｌｌ ＤＷ 編集． 分子クローニング実験室マニュアル第３版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （コピーライト） ２００１， １８．３， １８．６２， １８．６６．
【０１１１】
１．４．８． 差異解析のその他の方法
１．４．８．１． 選択的差異識別法を利用したタンパク質発現プロファイル
その配列がＤＮＡまたはタンパク質データベースに存在するタンパク質の特定への質量分析法の使用は、かなり確立されており、プロテオミクスの分野には不可欠である。いくつかの質量分析技術により、タンパク質およびペプチドの質が高精度で特定できる。ペプチドはその後、タンデムまたはイオンとラップ質量分析計により断片化でき、ペプチドの配列情報を産出できる。両方のタイプの質量情報が配列データベースでタンパク質の特定に使用することができる。プロテオミクスの目的の一つは、特定の細胞状態に関連した発現タンパク質の定義をすることであり、もう一つは、細胞状態間のタンパク質発現の変化を定量化することである。プロテオーム研究に大きなインパクトを与えた新しい方法の一つは、アイソトープ暗号化親和性タグ（ＩＣＡＴ）ペプチド識別法（１７）である。この方法は、化学試薬（ＩＣＡＴ）の新規の合成分類に基づいたもので、タンデム質量分析法と組合せて使われる。ＩＣＡＴ試薬は、ビオチン親和性タグおよびチオール特有反応基が含まれており、以下の２つの形−−通常および同位元素的に重く、８つの重水素を含む−−で手に入る、スペーサードメインが加えられる。最初に、ある細胞状態を代表する還元タンパク質混合物が、同位元素的に軽いタイプのＩＣＡＴ試薬によって誘導され、二つ目の細胞状態を代表する還元タンパク質混合物が、同位元素的に重いタイプのＩＣＡＴ試薬によって誘導される。次に、識別されたサンプルが混ぜ合わせられタンパク質加水分解で消化され、ペプチド断片を生成する。３番目に、ペプチド断片を含むタグ付きシステインがアビディン親和性クロマトグラフィによって分離される。最後に、分離されたタグ付きペプチドが分離され、ミクロキャピラルタンデム質量分析法によって分析される。
【０１１２】
１．５． メタボロミクスおよびリピドミクス
その他の全体的モニター方法として、代謝産物プール、炭水化物、脂質、グリコプロテイン、および糖脂質のプロファイリングを含むメタボロミクスおよびリピドミクスがある。多様なクロマトグラフィ方法およびその他の質的および／または定量的方法が脂質のプロファイルを特徴づけるのに使用される。メタボロミクスの分野では、代謝産物／小分子の濃度を比較する方法を使用することができ、それには例えば、質量分析、ＮＭＲ、その他の分光器技術、バイオセンサーなどの多くの化学分析ツールを使用することができる。
詳細な方法の例として、以下の参考文献を参照のこと： Ｊ． Ｃ． Ｌｉｎｄｏｎら、Ｐｒｏｇ． ＮＭＲ Ｓｐｅａｒ．、２９、１ （１９９６）ｌ− Ｊ． Ｃ． Ｌｉｎｄｏｎら、Ｄｒｕｇ． Ｍｅｔ． Ｒｅｖ．、２９、７０５ （１９９７）；Ｂ． Ｖｏｇｌｅｒら、Ｊ Ｎａｔ． Ｐｒｏｄ．、６１、１７５ （１９９８）；ａｎｄ ＪＡ． Ｗｏｌｆｅｎｄｅｒら、Ｃｕｒｒ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２、５７５ （１９９８）；Ｊ． Ｋ． Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ、２９、１１８１（１９９９）。
【０１１３】
１．６． スクリーニングツール
１．６．１． ＦＡＣＳ
蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）方法は、また選択／スクリーニングの強力なツールである。場合によっては、蛍光分子が細胞内に作られる（例えば、緑蛍光タンパク質）。タンパク質を生成する細胞は、簡単にＦＡＣＳによって分類される。ジェルマイクロドロップ技術で、寒天培養マイクロドロップに内包された細胞のスクリーニングを行うことができる（Ｗｅａｖｅｒら方法２：２３４−２４７（１９９１））。細胞（例えば抗体または抗原）によって分泌されたこの技術の生成物はそれを生成した細胞によって固定される。望ましい生成物を含むドロップの分類および収集はまた、その生成物を作った細胞も収集し、望ましい機能を暗号化する遺伝子のクローニングの便利な供給源となる。望ましい生成物は、蛍光抗体で内包細胞を培養することによって検出することができる（ＰｏｗｅｌｌらＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：３３３−３３７（１９９０））。ＦＡＣＳ分類はまた、複数の細胞を含有するドロップレットを選択することによって、毒化合物や抗生物質に対する耐性を調べるこの技術に使用することができる（例えば、細胞毒性化合物内における連続分割の生成物；ＧｏｇｕｅｎらＮａｔｕｒｅ ３６３：１８９−１９０（１９９５））。この方法は、寒天培養ドロップレット内に固定できる基質の蛍光度を変化させられる酵素ならどれでも選択することができる。
１．６．２． レポーター分子
本発明の実施例によっては、スクリーニングは、レポーター分子を、望ましい機能、例えば遺伝生成物で反応させて、反応性を分析することにより達成できる。つまり、抗原性ドメインのような特定の機能が、決定因子に特有の抗体によってスクリーニングされる。
【０１１４】
１．６．３． 細胞−細胞インジケータ
本発明のその他の実施例では、スクリーニングは、細胞−細胞インジケータ分析でなされることが望ましい。この分析の形態では、独立したライブラリー細胞（細胞Ａ、分析される細胞）およびリポーター細胞（細胞Ｂ、分析細胞）が使用される。
システムの中の要素の１つのみ、ライブラリー細胞のみが進化できる。スクリーニングは、一般的に２次元固定形式で、プレート等の上で行われる。これらの遺伝子に暗号化された代謝経路の生成物（この場合、通常、抗生物質、ポリケチド、カロテノイドのような二次的代謝産物）がライブラリー細胞からレポーター細胞に拡散する。ライブラリー細胞の生成物は、多くのうちの１つの形でレポーター細胞に影響を与える。
分析システム（インジケータ細胞）は、ライブラリー細胞生成物に誘発されるがライブラリー細胞には影響を及ぼさない、単純な読み出し（例えば、緑蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ）を行う。これらの例においては、望ましい生成物は、ライブラリー細胞に隣接したレポーター細胞内の比色変化によって検出できる。
１．６．４． フィードバック機構
その他の実施例において、インジケータ細胞は、交代に、フィードバック機構によってライブラリー細胞の成長率を改変する何かを生成する。成長率フィードバックは、非常に小さな差異を検出し蓄積することができる。例えば、ライブラリーおよびレポーター細胞が栄養素で競い合っていると、レポーター細胞の成長を抑制する化合物を生成するライブラリー細胞が、より多くの栄養素を取ることとなり、そのため、より多くの成長の機会を持つことになる。これは、抗生物質またはライブラリー細胞のそれぞれが異なるポリケチド遺伝子生成物を発現および搬出し、ポリケチド合成遺伝子クラスターのスクリーニングに役立つ。
１．６．５． スクリーニング分泌分子
本テーマのもう一つの変形は、抗生物質選択のレポーター細胞そのものがライブラリー細胞の成長を抑制する毒素または抗生物質を分泌できることにある。レポーター細胞の成長を抑制することのできるライブラリー細胞による抗生物質の生成により、ライブラリー細胞は抑制なく成長することができる。
反対に、レポーター細胞の成長を刺激する化合物の生成でライブラリーがスクリーニングされると（例えば、化学的合成の改良において、ライブラリー細胞が、栄養要求性レポーターにアミノ酸などの栄養素を供給してもよいし、または、成長要因を成長要因依存レポーターに供給してもよい。レポーター細胞は、同様にライブラリー細胞の成長を刺激する化合物を生成するはずである。インターロイキン、成長要因および栄養素などが可能である。他の可能性としては、周りの細胞を殺す能力に基づく競争力、進化した細胞に作られた望ましい生成物がインジケータ細胞を刺激して、細胞Ａに正の成長要因を生成し、間接的に生産物の生成増加を選択する正のフィードバックループが含まれる。
【０１１５】
本発明の実施例によっては、スクリーニングに、最終生成物に使用されるものではなく、異なった生体（または遺伝的背景）を使用することが有益である。例えば、改良プロセス中、微生物が構成物に依存するようにする再帰的配列組換えに使われるＤＮＡ構成物にＤＮＡマーカーが追加される。
同様に、ある実施例では、最終生成物に使用されるものではなく、異なった基質を進化した酵素のスクリーニングに使用することが有益である。例えば、Ｅｖｎｉｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６６５９−６６６３（１９９０））は、アルギニンβ−ナフチルアミドを分割させることによって可変トリプシンがアルギニン栄養要求体のために必須アミノ酸を生成するのを課すことにより、改変基質特異性を持つ選択したトリプシン変形体を選択している。
スクリーニングおよび／または選択を生き残った細胞のプールは、望ましいフェノタイプを与える組換え遺伝子に改良される（例えば、改変基質特性、改変バイオ合成能力等）。希望する場合は、２回目のスクリーニングおよび／または選択を新たな多様性を発生させずに行うことによって、更なる改良をすることができる。
組換え遺伝子または１回目のスクリーニング／選択を生き残ったそのような遺伝子は、２回目の組換えのために１つ以上の基質を形成する。また、前述のどの再帰的配列組換え形式でも、生体内または試験管内でも組換えを行うことができる。
再帰的配列が試験管内で行われた場合には、基質を形成する組換え単独遺伝子または複数の遺伝子は、スクリーニング／選択が行われた細胞から抽出されるべきである。任意に、そのような単独遺伝子または複数遺伝子の部分列はより部分列の焦点を絞るために切除されてもよい。もし組換え遺伝子がエピゾームに含まれている場合には、その分離は難しいものではない。もし、組換え遺伝子が染色体に組み込まれている場合には、組換えが起こった領域に位置する知られた配列から特発した増幅によって分離することができる。また全体ゲノムＤＮＡは分離、また任意で増幅し、組換えの基質として使用することができる。ゲノムＤＮＡの小サンプルは、変性プライマーで全体ゲノム増幅することによって増幅することができる（ＢａｒｒｅｔｔらＮｅｕｃｌｅｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３：３４８８−３４９２（１９９５））。これらのプライマーは、大量のランダム３′末端部を生じ、細胞に再導入されるときに相同的組換えを行うことができる。
【０１１６】
多くの場合がそうなのだが、２回目の組換えが生体内で行われた場合には、スクリーニング／選択を生き残った細胞内で行われるか、または組換え遺伝子を他の細胞種に移入することもできる（例えば、突然変異および／または組換えの高頻度を持つ種の細胞）。この状況では、組換えは、新たなＤＮＡ切片を組換え遺伝子を持っている細胞に導入することによって影響される。他の方法においては、細胞は、例えば、エレクトロポレーションによって互いの遺伝情報の交換を誘発することができる。方法によっては、１回目のスクリーニング／１選択を生き残った細胞のプールを２つの副個体群に分割することによって２回目の組換えが行われる。一方の副個体群のＤＮＡが分離され、２つの副個体群からの組換え遺伝子が組換え遺伝子の更なるライブラリーを形成する、もう一つの個体群に移転される。これらの方法においては、最初の副個体群から特定の遺伝子を分離する必要や、抽出中にＤＮＡのランダム共有を回避するステップを行う必要は必ずしもない。むしろ、共有された、または管理しやすいサイズの断片に分割されたＤＮＡの前ゲノムが２個目の副個体群に移転されるのである。このアプローチは、いくつかの遺伝子が同時に進化した場合および／またはそのような染色体の場所や正体がわかっていないときに特に便利である。
２回目の組換えは、特に選択を生き残った組換え分子で排他的に行われることがある。しかし、他の実施例においては、追加の基質を導入することができる。追加の基質は、１回目の組換えに使われた基質と同じ形式、つまり、１回目の基質を形成した、追加の自然または突然変異誘発遺伝子または遺伝子クラスターであってもよい。また、２回目の組換えにおける新規の基質は、１回目の複製と全く同一の基質であってもよい。
２回目の組換えの後、望ましいフェノタイプが与えられた組換え遺伝子が再度選択される。選択プロセスは本質的に前記と同様に進む。選択マーカーを持つ自殺ベクトルが１回目の選択で使用された場合には、同じベクトルが再度使われてもよい。ここでも、選択を生き残った単独細胞、または細胞のプールが選択される。細胞のプールの場合には更なる向上の対象にしてもよい。
【０１１７】
１．４ 多様な潜在的応用のスクリーニング
１．４．１． 新規のドラッグ：目標の特定
本発明は、結合先の化合物の特定に関するもので、機能が知られている、または知られていない細胞の対象成分の機能、他のスクリーニング方法には容易に供することができない細胞の成分を改変する化合物を特定する手順に関連する。本発明は、結合先の化合物の生成および／または特定に関するもので、また細胞の成分機能の改変（抑制または強化）を行い、その結果、細胞内に表現効果をもたらす。そのようなスクリーニングは、以下の生体分子の特定に関わることもある：１）試験管内で細胞のその他の構成要素から分離された細胞成分に結合する２）生体内で、生体分子の細胞内発現の分析に見られるように、通常対象となる細胞成分のプロデューサーおよびホストである細胞内に表現効果を起こさせる。前述の特徴２）を実証する分析において、細胞内の生体分子の生成は、培地で成長する細胞でもよいし、動物に導入された細胞でもよい。これらの手順の範囲のまた他の方法は、生体分子の細胞内生成における細胞内の表現効果の分析からなり、それは培地内の細胞でもよく、１匹以上の動物に導入された細胞でもよい。また、分析中に目標細胞成分に結合される生体分子の競争相手として振舞う１つ以上の化合物を特定する分析からなる。この実施例およびその他の実施例における目標細胞の成分は、病原体に限られるものではないが、哺乳類の細胞内で存在するものでもよく、とりわけ病変または病変の症状を起こすまたはそれに貢献する種類の細胞がよい（例えば、腫瘍細胞またはその他のタイプの超増殖的疾患等）。
【０１１８】
１．７．１． 細胞内に表現効果を生成する１つ以上の成分の特定プロセス
本発明が構想する手順の一つは、細胞内に表現効果を生成する一つ以上の化合物を特定するプロセスである。このプロセスは、また同時に目的の確認の方法でもある。このプロセスは、以下について特徴づけられる：分離された対象細胞成分に結合する生体分子の特定する；対象細胞成分からなる細胞の構築および生体分子バインダーを生成するよう発現できる生体分子バインダーを暗号化する遺伝子からなる対象細胞成分からなる細胞を構築する；構築した細胞の、生体分子バインダーを暗号化する遺伝子の発現時の、細胞内の表現効果（例えば、成長抑制）の生成能力をテストする、ここで、構築した細胞のテストは、培地内の細胞のテストでも、またはホスト動物に導入された後の細胞のテストでも、その両方でもよい；更に、表現効果を起こした生体分子バインダーで、対象細胞成分に結合する生体分子バインダーと競合する１つ以上の化合物を特定する。
ホスト動物に導入された後の構築細胞のテストは、特に、生体分子バインダーが、生体分子バインダーを暗号化する遺伝子の表現（研究者によって規制されうる）によって、生体分子バインダーが特定のフェノタイプを生成できるかどうかの評価に非常に適している。本方法においては、細胞は、生体分子結合を暗号化する遺伝子を有する遺伝子が構築され、そこでは、遺伝子の発現の規制によって生体分子バインダーが生成されることができる。構築された細胞は、動物群に導入される。生体分子バインダーを暗号化する遺伝子の発現は、生体分子バインダーが生成された１動物群（テスト動物）によって規制される。他の動物群では、生体分子バインダーが生成されない（対照動物）等のように遺伝子の生体分子バインダーの暗号化は規制されている。２つの動物群は、表現型の変化をモニターされる（例えば、成長率の変化）。テスト動物の細胞内で表現型の変化が観察され、対照動物の細胞では観察されなかった場合、または対照動物では範囲が低かった場合には、生体分子バインダーは、生体内の状況において、その対象細胞成分に結合する効果があることが証明されたことになる。
【０１１９】
また本発明の他の実施例においては、特定の細胞種（「第１の細胞」）の対象細胞成分が第１の細胞に表現効果を生成するのに必須であるかないかを決定する方法であり、以下のステップを含む：
第１の細胞の対象成分を分離する；分離された第１の細胞の対象成分の生体分子バインダーを特定する；対象成分および、生体分子バインダーを暗号化する規制が可能で、外因性の遺伝子からなる２つめのタイプの細胞を構築する（「第２の細胞」）；第２の細胞内の生体分子バインダーの生成時に改変された表現効果のテストを培地内の細胞で行う；従って、第２の細胞が改変された発現効果を生体分子バインダーの生成時に実証すれば、第１の細胞の対象成分は第１の細胞の表現効果の生成に必須であることになる。この実施例およびその他の実施例における目標細胞の成分は、病原体に限られるものではないが、哺乳類の細胞内で存在するものでもよく、とりわけ病変または病変の症状を起こすまたはそれに貢献する種類の細胞がよい（例えば、腫瘍細胞またはその他のタイプの超増殖的疾患等）。
１．７．３． 病原細胞の成長を抑制する生体分子の特定
本発明の実施例の一つは、細胞培養技術を利用して病原細胞の成長の生体分子抑制物質を特定する方法であり、以下からなる：１つ以上のタイプの生体分子を分離した病原体の対象細胞成分に接触させ、生体分子および対象細胞成分の結合混合物を検出する手段に応用し、その結果もし結合混合物が検出されれば、１つ以上のタイプの生体分子が対象細胞成分の生体分子バインダーとして特定し、生体分子バインダーを暗号化する規制可能な遺伝子を有する病原体種を構築し、遺伝子を発現させる生体分子結合剤を暗号化する遺伝子の発現が規制でき；そして培地内の病原細胞の成長をモニターし、もし病原細胞の成長が適切な対照群の細胞に比べ減少した場合には、生体分子は、病原細胞の成長の生体分子抑制物質であることになる。
【０１２０】
１．７．４． 病原体の哺乳類への感染を抑制する化合物の特定
本発明のその他の実施例は、動物テストを実施する方法であり、対象細胞成分に結合することにより病原体の哺乳類への感染を抑制する１つ以上の化合物を特定するもので、以下からなる：対象細胞成分に結合する生体分子を暗号化する規制可能な遺伝子からなる病原体を構築し、病原体でテスト動物を感染させ、生体分子を生成する規制可能な遺伝子の発現を規制し、テスト動物と適切な対照動物の感染の徴候を観察し、テスト動物に適切な対照動物より少ない感染の徴候が観察された場合には、その生体分子は、感染の生体分子抑制物質であり、また、対象細胞成分に結合するため、成長の生体分子抑制物質と競争する１つ以上の化合物を特定し（競争的結合分析を使用して）、そして、対象物に結合することによって、化合物は病原体による哺乳類への感染を抑制する。
細胞内結合テストにおいて、対象物との結合が実証されている生体分子バインダーの結合アナログを特定する競争的結合分析は、生体分子バインダーが特定されたどのような対象物にも応用ができ、それには、機能が知られていない対象物または他のタイプの分析が容易に開発、実行されない対象物が含まれる。そのため、本発明の方法は、知られている機能を持つ遺伝子生成物を対象細胞成分として使用する時に、分析開発時間を減少させる利点、および知られている機能を持つ遺伝子生成物を対象細胞成分として使用する時に、大きな障害である遺伝子機能の特定を避けることができる利点を提供するものである。
本発明のその他の実施例は、生体分子および対象細胞成分からなる細胞であり、生体分子は規制可能な遺伝子の発現によって生成され、また生体分子は、対象細胞成分を改変し、それによって細胞内に表現効果を起こす。またその他の実施例は、生体分子および対象細胞成分からなる細胞であり、生体分子は、対象細胞成分の生体分子バインダーであり、そしてそれは規制可能な遺伝子によって暗号化されたものである。これらの細胞には、哺乳類細胞または、例えば病原細胞を含むことができ、また表現型の変化は、成長率の変化でもよい。
病原体は、例えば細菌、酵母菌、真菌、または寄生虫の種でもよい。
【０１２１】
１．７．５． 生体分子の細胞内確認
本書に記述されているのは、細胞内に表現効果を起こす化合物の特定をもたらす方法である。薬剤開発用の化合物を発見する本書に説明される一般的なステップは以下の通りである：（１）試験管内で分離された対象細胞成分に結合する生体分子を特定する、（２）対象細胞成分を有する細胞内で生成されたときには、その生体分子が望ましい表現効果を起こすことができるかを確認し（３）試験管内スクリーニング方法によって、例えば、対象細胞成分に結合する生体分子と競争する化合物を特定する。これらの方法の中心となるのは、前述の一般的なステップ（２）であり、その生体分子が細胞内の遺伝子の発現（規制可能なこともある）によって生成された場合に、生体分子が細胞内で表現効果を起こすかどうかを決定する１つ以上のステップからなる生体分子の細胞内確認である。一般ステップ（２）で使用されたように、生体分子は、外因性の遺伝子の遺伝子生成物（例えば、ポリペプチド、ＲＮＡ、ペプチドまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド）である。外因性の遺伝子とは、細胞の構築中に導入された遺伝子のことを言う。
候補対象物の機能に結合し、その機能を改変する生体分子は、多様な試験管方法により特定される。試験管内またはアニマルモデルシステム内の細胞に生体分子が生成されると、生体分子は、対象物の特定のサイトに結合し、その細胞内機能を改変し、そして、表現型の変化をもたらす（例えば、成長の停止、細胞死）。感染した動物モデル内の操作された病原細胞内で生体分子が生成されると、操作された病原細胞の成長が停止され、または死滅し、感染状態が解除され、動物が生き残ることになり、つまり感染中の対象の重要性および対象の確認が重要であることが示される。
本発明の他の実施例は、細胞に表現効果を生み出す生体分子の特定を提供するものであり（ここで細胞は、例えば病原細胞または哺乳類の細胞である）また（２）同時細胞内対象物確認（参考文献参照：特許？？）。
【０１２２】
１．７．６． 対象細胞成分を有する細胞の成長を抑制する化合物の特定方法
本発明には、対象細胞成分を有する細胞の成長を抑制する化合物の特定方法が含まれる。対象細胞成分は、最初に培地内および／または細胞の成長が抑制される望ましい状況下において細胞の成長に必須であることを特定される。これらの方法は、例えば、当業者に知られているように、多様な異なった細胞種から由来する新生物の細胞（良性または悪性の腫瘍または腫れ）の細胞を含む、異常または好ましくない増殖をする多種の細胞に応用することができる。そのような細胞は例えば、腺腫、癌腫、リンパ腫または白血病からのものである。本方法はまた、リューマチ、乾癬、または自己免疫病などのある種の他の病変において異常に増殖をする細胞にも応用することができる。
生体分子バインダーの細胞内発現が（恐らく生物学的に相応するサイトで対象に結合することによって）成長に必須である対象物の機能を抑制すると、ステップ（２）で観察された細胞ではフェノタイプの成長が遅く、または成長しない。これらの方法によって成長に必須であることがわかった対象物は薬剤発見の有効なスターティングポイントであり、生体分子として対象物上の同じサイトに結合するより安定した化合物を特定するために、分析に組み入れることができる。細胞が病原細胞であり、観察すべき望ましい表現型の変化が成長の抑制であるときには、本発明は、動物感染モデル内の対象（病原体）細胞成分の行動を調査する手順を提供する。
【０１２３】
１．７．７． 特定の細胞タイプの遺伝子生成物の対象細胞成分としての研究
本方法の途中で、特定の細胞タイプの遺伝子生成物の対象細胞成分としての研究（例えば、病原細菌の種類）がなされること、ここで対象細胞成分は、特定されるべき修飾物質の潜在的対象として、特徴付けられた遺伝子によって暗号化されていることがわかっている。この場合、適切な培養方法があり、十分な数の細胞が育てられると仮定して、分離される細胞成分の種類に適切な方法（例えば、示唆沈殿、イオン交換クロマトグラフィ、ゲルクロマトグラフィ、親和クロマトグラフィ、ＨＰＬＣなどのタンパク質精製方法）を使用して、対象細胞成分を、直接対象となる細胞タイプから分離してもよい。
１．７．８． 対象細胞成分は組換えによって生成されてもよい
または、対象細胞成分組換えによって生成されてもよく、それには対象細胞成分を暗号化する遺伝子が対象となる細胞タイプから分離される必要がある。これはいくつの方法で行ってもよく、例えば、ＰＣＲのような知られている方法で、病原体から分離されたテンプレートＤＮＡまたは病原体ＤＮＡから生成されたＤＮＡライブラリーを使うことや、また、知られている配列、選択した遺伝子内または外部の知られているまたは知られていない配列に基づいたプライマーを使うことができる。例えば、「ポリメラーゼ連鎖反応」分子生物学の最新プロトコル第１５章、（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、ｅｄｓ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９８に記述された方法を参照。その他の方法には、ＤＮＡライブラリー（例えば、真核生物の病原体のｃＤＮＡライブラリー）からの遺伝子をクローニングしてベクター（例えば、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウィルス等）とし、選択またはスクリーニングの手段を、ベクターの形質転換から得られたクローンに応用して（挿入された遺伝子を有するベクターの個体群を含む）適切なホスト細胞にすることが含まれる。スクリーニング方法は、挿入した選択された遺伝子（例えば、それに向けられた抗体による遺伝子生成物の検出、遺伝子生成物の酵素活性の検出）の発現により与えられたホスト細胞の特性を利用してもよく、また、遺伝子そのものの存在を検出することもできる（例えば、核酸雑種形成を利用する方法により）。大腸菌内の遺伝子をクローンする方法は、その他の細菌種内のクローニングにも適応でき、例えば、「大腸菌、プラスミドおよびバクテリオファージ」分子生物学の最新プロトコル第Ｉ章、（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら編集）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９８を参照するとよい。真核生物由来遺伝子のクローニングに応用できる方法は、第５章（「組換えＤＮＡライブラリーの構築」）、第９章（「哺乳類細胞へのＤＮＡの導入」）および第６章（”組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニング”）、分子生物学の最新プロトコール、（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、ｅｄｓ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９８を参照するとよい。
【０１２４】
対象タンパク質は、大腸菌または原核遺伝子発現システム、または真核生物遺伝子発現システム内で発現されることができる。多くの真核生物タンパク質は、その活性に必要とされる、例えば、グリコシル化またはメチル化のような特殊な変形を伴っているため、タンパク質発現は、そのような改変を行える酵母菌、昆虫または哺乳類細胞内で行ったことがよい場合もある。そのような発現システムは、以下の文献で検討されている：酵素学の方法、Ｖｏｌｕｍｅ １８５、編集Ｄ．Ｖ． Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９０；Ｇｅｉｓｓｅら、タンパク質発現と精製８：２７１−２８２、１９９６；ＳｉｍｏｎｓｅｎおよびＭｃＧｒｏｇａｎ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ２２：８５−９４；Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｍｏｒｉｋａｗａ、バイオテクノロジーの最新の見解７：５１２−５１６、１９９６；Ｐｏｓｓｅｅ、バイオテクノロジーの最新の見解８：５６９−５７２。
選択された対象細胞成分を暗号化する遺伝子が先に分離されていないが、遺伝子生成物の相同性が他の種内で知られているために、存在すると考えられている場合には、以下の文献に記述されている方法で遺伝子を特定し、クローニングすることができる：Ｓｈｉｂａら、ＵＳ ５，７５９，８３３、Ｓｈｉｂａら、ＵＳ ５，６２９，１８８、Ｍａｒｔｉｎｉｓら、ＵＳ ５，６５６，４７０およびＳａｓｓａｎｆａｒら、ＵＳ ５，７５６，３２７。これら４つの特許の内容はその全体を参考として本書に含むものとする。
１．７．９． 先に分離または特徴化されておらず、その機能が知られていない対象細胞成分に使用されるべき方法
対象確認方法は、先に分離または特徴化されておらず、その機能が知られていない対象細胞成分に使用できることで有利である。この場合、薬剤活性の対象である種の細胞（例えば、腫瘍細胞、病原体細胞）から分離された、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ；真核生物細胞に適切なものとしてｃＤＮＡを使用することができる）を有するＤＮＡの切片がベクターにクローニングされ、ＯＲＦの対象遺伝子生成物はベクターに宿るホスト細胞内で生成されることができる。遺伝子生成物は、前もって分離され、特徴づけられた遺伝子生成物に類似の方法で、精製および更に研究される。
場合によっては、オープンリーディングフレーム（場合によってはｃＤＮＡ）は対象細胞のＤＮＡ源から分離され（場合によってゲノムＤＮＡまたはライブラリー）、融合タンパク質または融合ポリペプチド構成体に挿入されてもよい。この構成体は以下の領域を提供する核酸配列からなるベクターであってもよい：対照領域（例えば、プロモーター、リボゾーム結合サイト）および融合ポリペプチドのペプチドまたはポリペプチド部分を暗号化する領域、ここで、融合ベクターに暗号化されたポリペプチドは、融合ポリペプチドの精製が行える１つ以上の特性を有する融合ポリペプチドを与える。例えば、ベクターはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼを生成するようにデザインされたプラスミドのｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のものであってもよい。
【０１２５】
１．７．１０． ホスト細胞
オープンリーディングフレームを有する分離されたＤＮＡは、知られているもの、または特定されていない遺伝子生成物として暗号化するのであれ、発現構成体に挿入されると、ホスト細胞内の対象細胞成分を生成するように発現させることができる。ホスト細胞は、例えば、それぞれグラム陰性またはグラム陽性細菌である、大腸菌または枯草菌、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母菌でもよい。対象確認調査で使用した対象細胞成分は、遺伝子が暗号化している病原体に遺伝学的に関連した、分離されたホスト内で生成されるのが好ましい。例えば、グラム陰性細菌病原体では、大腸菌ホストが、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓホストよりも好ましい。生成された対象細胞成分は、その後ホスト細胞から分離される。多くのタンパク質精製方法は、タンパク質を、例えば結合相手（例えば、酵素の場合は結合相手は、基質または基質類似体）のサイズ、仕込量または親和性を元にして分離することで知られており、これらの方法は、当業者によって連続したステップに組み入れ、効果的な精製体系を作りあげることができる。ＲＮＡ操作の方法については、例えば、分子生物学の最新プロトコル第４章（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、ｅｄｓ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９８を参照するとよい。
分離された細胞成分または細胞成分からなる融合タンパク質をテストで使用し、分離された生成物の１つ以上の生体分子バインダーを特定してもよい（生成ステップ（１））。対象細胞成分の生体分子バインダーは、非共有的に互いに結合している対象の混合物および生物分子バインダーの生成を試す試験管内分析によって特定することができる。例えば、分離された対象物は、結合を促進する環境下において１種以上の生物分子に接触させられ、非結合の生体分子が対象物から除かれ、生体分子および対象物の結合複合体の検出手段が適用される。結合複合体の検出は、潜在的生体分子バインダーまたは検出または分離をする付加物で識別またはタグ付けされた対象物があることで容易になる（例えば、放射性アイソトープまたは蛍光識別；ソトレプトアビジン、アビジンまたはビオチン」親和識別）。
また、生体分子バインダーおよび対象の双方は、示差的に識別することができる。そのような方法の例は例えば、ＷＯ ９８／１９１６２を参照するとよい。
【０１２６】
１．７．１１． テストを行う生体分子および検出手段
対象物への結合のテストを行う生体分子は、候補生体分子バインダーのライブラリー（例えば、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドライブラリー）からのものでもよい。例えば、ペプチドライブラリーは、コートタンパク質またはファージ上に表示されることができる（ファージ表示ライブラリーのような遺伝子パッケージの使用例は、Ｋｏｉｖｕｎｅｎ、Ｅ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：２０２０５−２０２１０ （１９９３）を参照するとよい）。生体分子は、結合特性のスクリーニングをする前に生体分子に付属または組合わされた化学タグまたは識別の方法によって検出できる。例えば、識別はラジオアイソトープ、ビオチンタグ、または蛍光識別でもよい。対象分子に結合すると確認された分子のことを生体分子バインダーと呼ぶ。
１．７．１２． 融合タンパク質
分離された対象細胞成分、その抗原的に類似した部分、そして対象物を全体的または部分的にまたはすべて含有する適切な融合タンパク質を、対象物に限定して結合する生体分子を選択し特定する方法に使用することができる。対象細胞成分がタンパク質からなる場合、自然には対象物の中に生じない２番目の部分にリンクされる対象物の全体的または部分的に含む融合タンパク質を用意し、本方法のその他の実施例に使用してもよい。この目的における適切な融合タンパク質には、その２番目の部分に親和配位子（例えば、酵素、抗原、エピトープ）を含有するものが含まれる。融合タンパク質は、対象物を暗号化する遺伝子の挿入またはそのような遺伝子の適切な部分を、親和配位子（例えば、グルタチオンＳ−トランスフェナーゼおよびＨｉｓ−Ｔａｇ親和配位子をそれぞれ暗号化するｐＧＥＸ−４Ｔ−２およびｐＥＴ１５ｂ）を暗号化する適切な発現ベクターに挿入することで生成することができる。発現ベクターは、適切なホスト細胞に導入され、発現する。ホストセルは、溶解され、融合タンパク質の親和配位子部分を親和マトリクスに結合するのに十分な状態下で溶菌液を親和マトリクスに接触させることによって、融合タンパク質を含む溶菌液が、適切な親和マトリクスに結合される。
【０１２７】
１．７．１２．１． 融合タンパク質は固定することができる
一実施例において、融合タンパク質は、溶解され、融合タンパク質の親和配位子部分を親和マトリクスに結合するのに十分な状態下で、適切な親和マトリクス上に固定することができ、また、生体分子を結合融合タンパク質の対象部分に結合させるのに適切な条件下で、１つ以上の候補生体分子（例えば、ペプチド混合物）との接触により生体分子バインダーとしてテストされる。次に結合融合タンパク質を有する親和マトリクスは、適切な洗浄緩衝液で洗浄され、非結合の生体分子と非特定結合生体分子が除かれる。結合されたままの生体分子は、親和マトリクスをそれに結合した融合タンパク質に、適切な溶出緩衝液で接触させることによって遊離させることができる。洗浄緩衝液は、特定的結合生体分子の結合を著しく崩壊させずに、融合タンパク質の結合ができるように調整することができる。この点において、溶出緩衝液は、親和マトリクスにより融合タンパク質の保持ができるように調整してもよいが、生体分子の融合タンパク質の対象部への結合と干渉するように調整してもよい。例えば、溶出緩衝液のイオン強度またはｐＨの変化は、生体分子を遊離に導くことができる、または、溶出緩衝液は、遊離化合物または生体分子の融合タンパク質の対象部分への結合を崩壊させるようにデザインされた化合物を構成することができる。
固定化は、融合タンパク質の生体分子への接触の前、同時または後に、場合に応じて行うことができる。この方法はテストされる生体分子、選択された親和マトリクス−配位子のペア、また溶出緩衝液の処方のような因子に応じて、多様な変形が可能である。例えば、洗浄ステップの後に、生体分子が結合した融合タンパク質は、適切な溶出緩衝液（ＧＳＴ融合のグルタチオンなどのマトリクス溶出緩衝液）を使用して親和マトリクスから溶出することができる。融合タンパク質が、トロンビン分割サイト等の分割リンカーをなしている場合には、親和配位子は、生体分子と結合している融合の一部を遊離させることができる。結合生体分子は、その後、抽出のような適切な方法によって融合タンパク質またはその分割生成物から遊離させることができる。
【０１２８】
１．７．１２． 生体分子バインダーを特定する多様な方法
１つ以上の候補生体分子バインダーを同時にテストすることができる。生体分子の混合物がテストされると、前述のプロセスによって選択された生体分子 が分離され（場合に応じて）適切な方法で特定される（例えば、ＰＣＲ、配列決定、クロマトグラフィ）。組み合せ化学合成またはその他の方法によって生成された、大きな生体分子ライブラリーは（例えば、ペプチド、ＲＮＡ オリゴヌクレオチド）テストされる（ｅ． ａ．、Ｏｈｌｍｅｙｅｒ、Ｍ．Ｈ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１０９２２−１０９２６ （１９９３）およびＤｅＷｉｔｔ、Ｓ．Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６９０９−６９１３（１９９３）参照、タグ付き化合物に関しては；Ｒｕｔｔｅｒ、Ｗ．Ｊ．ら米国特許Ｎｏ．５，０１０，１７５；Ｈｕｅｂｎｅｒ、Ｖ．Ｄ．ら、米国特許Ｎｏ．５，１８２，３６６；ａｎｄ Ｇｅｙｓｅｎ、Ｈ．Ｍ．、米国特許Ｎｏ．４，８３３，０９２も参照のこと）。ランダム配列ＲＮＡライブラリー（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ、Ａ．Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４６：８１８−８２２（１９９０）；Ｂｏｃｋ、Ｌ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５５：５８４−５６６ （１９９２）；およびＳｚｏｓｔａｋ、Ｊ．Ｗ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １７：８９−９３（Ｍａｒｃｈ、１９９２）参照のこと）は本方法によってスクリーニングされ、対象物に結合するＲＮＡ分子を選択する。本方法による組合せライブラリーから選択された生体分子が特有のタグを持つとき、クロマトグラフィー法による個々の生体分子の特定が可能である。生体分子がタグを持たないとき、例えばクロマトグラフィー分離の後に、構造を確認する質量分析法を行い、本方法によって選択された個々の生体分子を特定することができる。
対象細胞成分の個々の生体分子バインダーを特定する他の方法も使用できる。例えば、２ハイブリッドシステムまたは相互作用トラップは生体内システムであり、対象タンパク質に結合するポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質（生体分子バインダー候補）の特定に使用することができる。このシステムでは、生体分子バインダーおよび対象細胞成分タンパク質の両方の候補は、融合タンパク質として生成される。２ハイブリッドシステムおよびその変形は、以下に説明されている（ＵＳ ５，２８３，１７３およびＵＳ ５，４６８，６１４；Ｇｏｌｅｍｉｓ、Ｅ．Ａ．ら、ｐａｇｅｓ ２０．１．１−２０．１．３５ Ｉｎ 分子生物学の最新プロトコル、Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、別冊４０号まで別冊を含む、１９９７；２ハイブリッドシステムはＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から入手可能。）。
【０１２９】
細胞成分の１つ以上の生体分子バインダーが一旦特定されると、それ以後のステップは、生体分子バインダーを特定するものと一緒に組合せ、細胞に表現効果を生み出す生体分子バインダーを特定する（ここで「細胞」は、細胞種のまたは細胞系の細胞を指す）。
つまり、第１の細胞に表現効果を生み出す生体分子を特定する方法は、以下のステップからなる：第１の細胞の分離された対象細胞成分の生体分子バインダーを特定する；対象細胞成分および、生体分子バインダーを暗号化する規定可能な外因的な遺伝子からなる第２の細胞を構築する；第２の細胞内で生体分子バインダーが生成されたら、第２の細胞の表現効果をテストする。ここで、第２の細胞は、培地中で保持しても、テスト動物に導入されてもよい。第２の細胞が生体分子の細胞内生成で表現効果を表せば、第１の細胞で表現効果を生成する生体分子が特定されたことになる。３つの一般的な方法が上記に説明されているが、第２の細胞のテストは、本発名の一般ステップ（２）にあたる。
１．７．１３． 発現管理用に設計されたホスト細胞
対象物が分離された（または、対象物が組換え法によって生成された場合には、対象物を暗号化する遺伝子が最初に分離された）細胞種（例えば病原細菌の種）ホスト細胞（上記の用語では「第２の細胞」とも言う）は、生体分子バインダーを規定的に発現する遺伝子を内包するように設計することができる。（例えば、誘発または抑制プロモーターの下に）。生体分子バインダーの発現を規定する能力は、生体分子バインダーの規定可能な発現は、細胞にとって致命的となり得るので、望ましい。
そのため、誘発可能または規定された発現により、研究者が、生体分子バインダーをどのように、いつ、発現させるか管理することができるようになる。生体分子バインダーを発現する遺伝子は、単一または複数コピーのプラスミド、またはホスト細胞ゲノム内に組み入れられて、追加染色体構造上に、１つ以上のコピーとして存在することができる。病原体生体内で誘発遺伝子発現システムを提供するプラスミドも使用してよい。例えば、ブドウ球菌内でテトラサイクリン誘発発現の遺伝子を持つプラスミドが開発されている。
【０１３０】
１．７．１４． 発現遺伝子
真核生物細胞（例えば、哺乳類細胞）内で、表現効果のためにテストされた生体分子の細胞内発現においては、発現遺伝子は、プラスミドベースまたはウィルスベースのベクター上、またはＤＮＡまたはＲＮＡの線形部分上に担持できる。
１．７．１５． 融合生体分子バインダー
状態として、細胞内システム内の生体分子バインダーは、担体タンパク質（生体分子バインダーがペプチドの場合）内に、Ｎ末端として、Ｃ末端としてまたは内包して融合されることができ、また担体ＲＮＡまたはＤＮＡ分子（生体分子バインダーが核酸の場合）内に融合（５’、３’ または内包）することができる。生体分子バインダーは、タンパク質または核酸構造懸垂足場とともに、存在できる。特定のリンク（例えば、ペプチドの４−グリシンリンカーまたはＲＮＡのＡの範囲が生体分子バインダーおよび担体タンパク質の間、または核酸に挿入される。
１．７．１６． 細胞種の設計
その他のテストにはまた、対象細胞成分および、対象細胞成分の生体分子バインダーとなる、テストされた生体分子を暗号化する１つ以上の遺伝子を使用することができる。細胞種の細胞は、設計された細胞内の生体分子バインダーの規定可能発現が細胞の表現型において測定可能またはテスト可能な変化を生成したかについて、動物内でテストされる。生体分子バインダーの細胞内発現効果の「培地内」テスト、および生体分子バインダーの細胞内発現効果の「動物内」テスト（以下参照）の両方が、抗菌剤および抗癌剤の範囲における製剤開発のみではなく、また、例えば炎症性疾患、心臓血管疾患、代謝経路に関連する疾患および中枢神経系に関連する疾患の治療剤開発に向けて適用されることができる。
組換え細胞種が、病原細胞または腫瘍細胞であるとき、テストの目的は組換え種内で生成された生体分子バインダーが、組換え病原体によって動物内に導入された後に、それらの細胞の成長を抑制するかどうかを見ることにある。そのようなテストは、どの生体分子バインダーが細胞の成長の抑制子であるのかを決定するだけではなく、同時に、細胞内の対象物がホスト哺乳動物内で細胞の成長を保持するのに必須であるかどうかを評価することもできる（病原生体の場合には、感染）。そのような実験に適している動物は、例えば、マイス、ラット、ラビット、モルモット、イヌ、ブタのような哺乳動物である。便宜上、小型哺乳動物が好ましい。
組換え細胞は、組換え細胞の系統的または局所的成長を起こす適切な方法によって、１匹以上の動物（「実験」動物）および、１匹以上の別の群の動物（「対照」動物）に導入される。
【０１３１】
導入経路は、望ましい結果に適合するように、例えば、経口投与、吸入、また皮下、筋肉、静脈または腹膜内注射がとられる。
実験および対照動物に該細胞種が導入された後、生体分子バインダーを暗号化する遺伝子の発現が規定され、生体分子バインダーが組換え病原細胞内に生成される。これは、例えば、テスト動物に、細胞内の規定システム構築に適切な治療剤が投与され、生体分子バインダーを暗号化している遺伝子が発現されるようにすることで達成することができる。同様な治療剤は、対照動物には投与されないが、それ以外は、保管状態はテスト動物のものと同一である。生体分子バインダーを暗号化する遺伝子を発現する治療は、誘発物質（生体分子バインダーまたは遺伝子の発現は、誘発可能プロモータの管理下にある）または抑制物質の機能除去（生体分子バインダー遺伝子の発現は、抑制プロモータの管理下にある）の投与でもよい。
そのような治療の後、実験および対照動物は、導入細胞内の表現効果 がモニターされる。導入細胞が組換え病原細胞である場合には、動物は、感染の徴候をモニターされる（一番完結な終端点としては、動物の死であるが、また例えば、昏睡、毛づくろい行動の欠如、うずくまり、非摂食、下痢またはその他の分泌物；血液またはその他の培養体液および組織サンプル内の細菌タイター）。組換え腫瘍細胞のテストの場合には、テストおよび対照動物は、腫瘍の発育またはその他の導入組換え細胞の増殖の徴候がモニターされる。テスト動物は、対照動物に比べて導入細胞の成長が少ないことが観察され、また、生体分子は、場合によって生体分子成長抑制子または生体分子感染抑制子とも呼ばれ、生体分子抑制子の生体内発現は、テスト動物内の導入細胞の成長の相対的な減少を起こしていると結論づけられる。
１．７．１７． 試験管内分析
本手順の他のステップは成長抑制のような表現効果を持つことが確認されている生体分子のそれに類似する結合、および活性または抑制特性を持つ１つ以上の化合物を特定する試験管内分析に関するものである。つまり、生体分子と対象細胞成分に対する結合に関して競争する化合物が、生体分子の構造的類似物である。そのような化合物を特定する分析は、結合分析中で競争分子を特定する周知の方法を利用することができる。これらのステップは、方法の一般ステップ（３）からなる。
そのような化合物を特定する方法では、生体分子抑制子（または活性剤）は、分離された対象細胞成分と接触して結合し、細胞成分と生体分子抑制子間の相互作用および結合ができる状況下において、１つ以上の化合物が生体分子抑制子と細胞成分からなる環境に加えられ、細胞成分から遊離された生体分子抑制子はすべて検出される。
【０１３２】
１．７．１８． 蛍光
遊離された生体分子抑制子（または活性剤）を検出するのに適したシステムは、環境中の分子の蛍光分極化が測定できるものである。生体分子抑制子は、フルオレセインまたは、リンカーに付属するフルオレセインのような蛍光タグまたはラベルに結合することができる。
１．７．１９． 放射性アイソトープ
対象細胞成分上の結合サイトを求めて生体分子抑制子（または活性剤）と競争する１つ以上の化合物を特定する、他の方法では、対象細胞成分は、担体に付与し、１つ以上の化合物に接触し、生体分子抑制子と接触されうる。１つ以上の洗浄ステップを、細胞成分に結合していない生体分子抑制子および化合物を取り除くために、使用することができる。対象細胞成分に結合した生体分子抑制子または対象細胞成分に結合した化合物のどちらも測定できる。細胞成分に結合した生体分子抑制子または化合物の検出は、両方の分子種上の識別を使用することによって容易化される。ここでラベルは、例えば、分子そのものに組み入れられた、または付属物として付与されている放射性アイソトープ、またはストレプトアビジンまたはビオチン、蛍光ラベル、またはその基質から色つきのまたは蛍光の生成物を作ることができる酵素の基質等である。。識別された生体分子抑制子または生体分子抑制子−細胞成分混合物または化合物−細胞成分混合物の化合物部分検出の適切な手段を適用することができる。
１．７．２０． 組合せステップ
生体分子の表現効果をテストする組合せステップは、細胞内テストで作られるのと同様に、対象細胞成分上のサイトを求めて生体分子と競争する化合物を特定するステップと共に、細胞上に表現効果を作り出す生体分子の機能的類似物である化合物を特定する方法を生み出す。これらのステップでは、培地内でもアニマルモデル内でも、また両方で、表現効果に関し、細胞内の外因性遺伝子の規定可能発現により生体分子を生成する細胞をテストすることができ、該生体分子が表現効果を起こした場合には、対象細胞成分に結合する生体分子と競争する１つ以上の化合物が特定される。ある化合物が、対象細胞成分と結合する生体分子と競争することが確認された場合には、その化合物は、細胞上で表現効果を生成する生体分子の機能的類似物である。そのような機能的類似物は、細胞上に質的に類似した効果をもたらすことができるが、効果の程度は、該生体分子と類似していたり、またより少なかったり多かったりすることがある。
【０１３３】
１．７．２１． 細胞の対象成分が細胞上に表現効果を生成するのに必須かどうかを決定する方法
本発明の他の実施例においては、組合せ一般ステップ（１）および（２）は、細胞の対象成分が細胞上に表現効果を生成するのに必須かどうかを決定する方法であり、以下からなる：細胞から対象成分を分離し；細胞から分離した対象成分の生体分子バインダーを特定し；対象成分および生体分子バインダーを暗号化する規定可能な外因性遺伝子からなる第の細胞を構築し；第２の細胞内における生体分子バインダーの生成時に、培地内の第２の細胞に改変された表現効果のテストを行う。ここで、第２の細胞が生体分子の生成時に改変した表現効果を示している場合には、第１の細胞の対象成分は、第１の細胞の表現効果生成に必須である。
１．７．２２． 細胞増殖の抑制
ここに記述される方法は、細菌や真菌等の感染因子を有する細胞の増殖を抑制することのできる化合物の特定に非常に適している。また、以下に大要を述べるような手順は、癌細胞の増殖を抑制する化合物の特定にも利用することができる。以下に説明される２つの手順は、さらに、ここに説明される方法の利用方法を説明するもので、抗癌治療の周知の対象物を伴い、これらの方法の原則を立証するであろう。
１．７．２３． 疾患標的
本発明の方法は、一般に以下によって引き起こされた哺乳動物の疾患に適用される：（１）タンパク機能の損失または増加、（２）タンパク活性調節の過発現または減失。いずれの場合も、疾患に関連する推定されるタンパク標的または代謝経路の特定が出発点となる。プロトコルは、疾患の徴候によって変わることがあり、それは、疾患を研究するための細胞培養物や動物モデルシステムの入手可能性による。すべてのケースにおいて、このプロセスは、薬剤発見の開始を支える有効な標的と分析の組合せをもたらすものである。
適切な疾患の徴候には以下が含まれるが、これに限定されるものでない：アルツハイマー病、リュウマチ、癌、心臓血管疾患、中枢神経系障害、糖尿病、うつ病、高血圧、炎症、肥満および痛み。
適切なタンパク標的は、推定的に以下の疾患の徴候に関連付けられるが、これに限定されるものではない：（１）レプチンタンパク、これは肥満および糖尿病に関連していると推定；（２）マイトジェン活性タンパクキナーゼ、これはリュウマチ、骨粗鬆症およびアテローム性動脈硬化に関連していると推定；（３）インターロイキン１β転換タンパク、これはリューマチ、喘息および炎症に関連していると推定；（４）カスパーゼタンパク、これはアルツハイマー病、パーキンソン病および脳卒中等の神経変性疾患に関連していると推定（５）腫瘍壊死要因タンパク、これは肥満および糖尿病に関連していると推定。適切なタンパク質標的には、以下の反応を引き起こす酵素が更に含まれるが、これに限定されるものではない：（１）オキシドレダクターゼ、（２）トランスフェラーゼ、（３）ハイドロラーゼ、（４）リアーゼ、（５）イソメラーゼ、および（６）リガーゼ。
【０１３４】
１．５． 定義
標的：（また、「細胞の対象成分」または「対象細胞成分」）確認された細胞の表現型の生成または維持に貢献または必要である細胞の構成要素。標的は単独の分子でも分子の複合体でもよい。標的は１個の遺伝子の生成物でもよいが、１つ以上の遺伝子生成物（例えば、αおよびβサブユニットからなる酵素、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボゾームＲＮＡまたはｎＲＮＰのようなリボ核タンパク質粒子）からなる複合物でもよい。標的は特徴づけられた遺伝子（機能が知られている遺伝子）の生成物でもよいし特徴づけられていない遺伝子生成物（機能が知られていない位電子）の生成物でもよい。
標的確認：標的が通常起こる細胞タイプの表現型の維持に標的が必須であるかどうかを決めるプロセス。例えば、病原細菌に対して、抗菌剤を開発する研究者が知りたいのは、特に細菌が感染を生じているような条件下−−つまり抗菌剤が感染した動物またはヒトにおいて細菌の成長を抑制するように働く必要のある条件下で、潜在的に抗菌剤である化合物が、標的に試験管内で結合するだけではなく、生体内の細菌の標的にも結合し、その機能を調節するかどうかである。試験管内の標的にそのような化合物が結合することが確認でき、細胞内の標的の機能が改変され、改変された表現型が生じ、培地中の細胞にテストして確認されたおよび／または動物中の細胞にテストして確認された場合は、その標的は有効ということになる。
表現効果：細胞の観察可能な特徴の変化で、例えば、細胞により生成された酵素の成長率、レベルおよび活性、多様な因子への感受性、抗原特徴、および細胞の多様な代謝産物レベルを含む。表現効果は、例えば、野生種（通常）の表現型からの変化でも、また野生種の表現型への変化でもよい。
表現効果は、特に本書に引用される哺乳動物細胞の疾病状態の原因であっても治癒であってもよい。病原細胞または腫瘍細胞はについては特に、表現効果は、成長率の遅延または成長の中断でもよい。
生体分子：細胞内で遺伝子生成物として生成される分子で、生体分子を暗号化する１つ以上の遺伝子からなるように、適切に構築されたものである。生体分子の生成は、希望するときに誘発プロモーターを使って開始できるのが望ましい。生体分子は、ペプチド、ポリペプチドまたは、ＲＮＡやＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＤＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチド、であるが、好ましくはペプチドである。同じ生体分子を合成して作ることもできる。ペプチドに関しては、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５：２１４０−２１５４（１９６３）を参照のこと。例えば応用バイオシステム４３１ペプチド合成器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）をペプチドの合成に使用することができる。細胞内で遺伝子生成物として生成された生体分子は、ここに説明されたステップで細胞内の標的との相互作用をテストされる（培地内の細胞で行われたテストおよび動物内に導入された細胞で行われたテスト）。合成的に生成された同じ生体分子は本書で説明される最初の試験管内方法により個別の標的に結合するかをテストされる。
合成的に生成された生体分子は、標的の競争バインダーである化合物を確認する方法の採集ステップにも使用される。
【０１３５】
（標的の）生体分子バインダー：試験管内で個別の対象細胞成分に結合する能力がテストされ、標的に結合することが確認された生体分子。
生体分子成長抑制子：細胞の成長を抑制する能力をテストされた生体分子であり、その生体分子の細胞の成長への影響を見るテストは、「培地」内で生体分子を生成するよう構築されており、培地内のテストで細胞の成長が実際に抑制されることが確認されているもの。
生体分子感染抑制子：感染効果を改善する能力をテストされ、その作用が確認されている生体分子。テストでは、規定的に生体分子を発現するように構築された病原細胞が、１匹以上の動物に導入され、生体分子を暗号化する遺伝子が規定され、細胞内の生体分子生成ができるようになり、１匹以上の適切な対象動物において、感染動物内で生体分子の生成効果が観察される。
分離：ここで使われる用語は、問題の物質が自然に起こるものと異なる物理的環境に存在することを指す。例えば、本発明の分離対象細胞成分は、自然に起こる複合細胞環境から実質的に分離されうる。完全なレベルの純度は必須ではなく、当業者であれば、入れる物質の使用に基づいて、適切なレベルの純度を容易に決めることができる。
多くの場合には、分離物質は、混合物（例えば、その他の物質を含む幾分未精製の抽出物）、緩衝システムまたは試薬混合物の一部をなす。その他の場合には、物質は本質的に、例えば、ＰＡＧＥまたはカラムクロマトグラフィ（例えばＨＰＬＣ）に決定される程度に同等になるまで精製される。
病原体または病原生体：疾病を起こす能力のある生体であり、疾病に特徴的な感染の徴候または症状によって検出可能である病原体には、以下が含まれる：原核生物（医学的に重要な、例えば、肺炎球菌、乳酸産生菌および黄色ブドウ球菌等のグラム陽性菌、大腸菌、緑膿菌および肺炎桿菌等のグラム陰性菌、およびマイコバクテリア、特に結核菌等の「抗酸性」菌）、酵母菌や真菌等の真核生物（例えば、カンジダ菌およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）および寄生虫を含む。生体が、異常増殖または通常生体が培養できないようなサイトにおける成長によって、ヒトまたはその他の哺乳動物でコロニーを作り、感染徴候の原因となる場合、土壌生物のような生体、皮膚、腸およびオリフィスの「正常細菌叢」も病原体に含まれることは理解されるべきである。
【０１３６】
セクション２． リアルタイム代謝フラックス分析を使用した細胞工学
産業の分野
一実施例において、本発明は、細胞工学、細胞生物学および分子生物学の方法を提供するものである。特に、本発明は、「オンライン」または「リアルタイム」代謝フラックス分析を使用して、新規および改良表現型の細胞工学の方法を導くものである。
背景
本発明の一実施例において、細胞代謝フラックス分析は、生体の代謝または「メタボローム」研究の「水平」で「全体的」な取組みである。全細胞「水平」メタボロームは、生体のすべての遺伝子の発現および機能を同時に研究するものである。細胞の代謝を研究するこの全細胞アプローチを使い、全細胞のトランスクリプトーム （発現転写産物または、ｍＲＮＡメッセージ）の完全スナップ写真、およびプロテオーム（発現ポリペプチド）を得ることができる。しかし、そのようなスナップ写真は、細胞の生理学および代謝の一面の静止画像でしかない。新規のまたは改変細胞表現型を検出するにあたり、細胞培養において多くの異なった要因を動的にモニターできる手段の開発がより効果的であろう。
要約
本発明の一実施例は、新規または改変表現型の全細胞工学の方法を提供するもので、リアルタイム代謝フラックス分析を利用し、方法は、以下のステップからなる：（ａ）細胞の遺伝構成を改変することにより、改変細胞を作る；（ｂ）改変細胞を培養し、複数の改変細胞を生成する；（ｃ）リアルタイムでステップ（ｂ）の細胞培養をモニターすることにより、細胞の少なくとも１つの代謝要因を測定する；また（ｄ）ステップ（ｃ）のデータを分析し、類似する状況下における非改変細胞の比較測定から測定要素が異なっているか確認し、それによってリアルタイム代謝フラックス分析を使用して細胞内の組換え表現型を特定する。
一面では、核酸を細胞に加えることを含む方法により、細胞の遺伝構成が改変される。同時にまたは連続して１つ以上の核酸が加えられてもよい。細胞の遺伝構成は、非相同核酸の細胞への追加、または相同核酸の細胞への追加によって改変される。相同核酸は、改変相同遺伝子のような、改変相同核酸を構成する。遺伝子の暗号配列または転写規定配列を改変することができる。また、細胞の遺伝構成は、細胞内の配列の削除または配列の改変からなる方法によって改変することができる。細胞の遺伝子構成は、遺伝子発現を改変またはノックアウトすることによって改変することができる。
【０１３７】
本方法は、新規に設計された表現型からなる細胞を選択することからなる。選択された細胞は、分離することができる。本方法は、また選択されたまたは分離された細胞を培養することからなり、それにより新規に設計された表現型からなる細胞種または、細胞系統を生成することになる。本方法はまた、新規に設計された表現型からなる細胞を分離することからなる。
表現型ならなんでも追加または改変することができる。例えば、ある表現型は、改変または追加のために特別に標的にすることができる。つまり、特定の非相同遺伝子が挿入され、または特定の相同遺伝子が確率的に、または、非確率的に改変されるのである。例えば、新規に設計された表現型は、例えば、ポリペプチドの発現または量の増加または減少、ｍＲＮＡ転写産物の量の増加または減少、遺伝子発現の増加または減少、毒に対する耐性または感受性の増加または減少、代謝産物の耐性使用または生成物の増加または減少、細胞による化合物の取り込みの増加または減少、代謝率の増加または減少そして、成長率の増加または減少である。
新規に設計された表現型は、安定表現型でもよい。またそれは一次的または誘導性の表現型でもよい。一面として、細胞の遺伝構成の改変は、細胞への構築物の挿入からなり、ここで構築物は、構造的に活性なプロモーターに操作可能にリンクされた核酸からなる。また、細胞の遺伝構成の改変は、構築物の細胞への挿入からなり、ここで構築物は、誘導性のプロモーターに操作可能にリンクされた核酸からなる。細胞に加えられた核酸は、安定的に細胞のゲノムに挿入される。また、細胞に加えられた核酸は、細胞内でエピゾームとして増殖することができる。
一面として、細胞に加えられた核酸はペプチドまたはポリペプチドを暗号化することができる。ポリペプチドは、改変相同ポリペプチドのような相同ポリペプチドからなる。また、ポリペプチドは、非相同ポリペプチドからなることもできる。細胞に加えられた核酸は、相同転写物へアンチセンスされた配列からなる転写物を暗号化することができる。一面として、細胞の遺伝構成の改変は、ｍＲＮＡ転写物の発現の増加または減少からなる。細胞の遺伝構成の改変は、ポリペプチド、脂質、単または多糖類、または核酸の発現の増加または減少からなる。
一面として、相同遺伝子の改変は、相同遺伝子の発現のノックアウトからなってもよい。相同遺伝子の改変は、相同遺伝子の増加または減少からなる。遺伝子改変は、ランダムでも、確率的でも、非ランダムでも目標を設定しても、つまり非確率的でもよい。
【０１３８】
非確率的な遺伝子改変の例において、表現型を改変するために細胞に挿入される遺伝子は、非相同遺伝子でも配列改変相同遺伝子でもよく、ここで配列改変は、以下のステップからなる方法によって行われる：（ａ）テンプレートポリヌクレオチドを提供する、ここでテンプレートポリヌクレオチドは、細胞の相同遺伝子からなる（改変を行いたい非相同遺伝子であってもよい）；（ｂ）複数のオリゴヌクレオチドを提供する、ここでそれぞれのオリゴヌクレオチドは、テンプレートポリヌクレオチドに相同する配列からなり、それにより、テンプレートポリヌクレオチドの特定配列および、相同遺伝子の変形である配列に標的をあてる；（ｃ）ステップ（ａ）のテンプレートポリヌクレオチドおよび、ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを反復することにより、非確率配列変形からなる子孫ポリヌクレオチドを生成し、これにより相同遺伝配列変形からなるポリヌクレオチドを生成する。この方法の変形の１つは、「遺伝子サイト−飽和突然変異」、「サイト−飽和突然変異」、「飽和突然変異」と呼ばれ、略して「ＧＳＳＭ」であり、詳細を以下に説明する。これはその他の突然変異プロセスと合わせてもよい。例えば、米国特許第６，１７１，８２０；６，２３８，８８４を参照のこと。
また他の非確率遺伝改変プロセスの例には、２つ以上の関連するポリヌクレオチドの適切なホスト細胞への導入、例えばハイブリッドポリヌクレオチドは、組換えおよび還元再組合せにより生成される。例えば、改変される遺伝子の配列改変は（例えば、非相同遺伝子または相同遺伝子）以下のステップからなる方法によって行われる：（ａ）テンプレートポリヌクレオチドを提供する、ここでテンプレートポリヌクレオチドは、相同遺伝子を暗号化する配列からなる；（ｂ）複数の細胞構築物ポリヌクレオチドを提供する、ここで細胞構築物ポリヌクレオチドは、予め定めた配列においてテンプレートポリヌクレオチドを乗り換え再組立するように設計され、細胞構築物ポリヌクレオチドは、相同遺伝子の変形である配列および異なる配列に位置するテンプレートポリヌクレオチドに相同する配列からなる；（ｃ）テンプレートポリヌクレオチド細胞構築物ポリヌクレオチドを組合せ、細胞構築物ポリヌクレオチドがテンプレートポリヌクレオチドと乗り換え再組立てして相同遺伝子配列変形からなるポリヌクレオチドを生成する。本方法の変形の１つは、「合成連結再組立て」または略して「ＳＬＲ，」と呼ばれており、以下に詳細を説明する。これはその他の突然変異プロセスと組合せて使用してもよい。例えば、米国特許第６，１７１，８２０参照。
【０１３９】
本発明の方法によってどのような細胞も組換えすることができ、例えば、原核生物細胞および真核生物細胞が含まれる。細菌、古細菌、真菌、酵母菌、植物細胞、昆虫細胞、ヒト細胞を含む哺乳類細胞は、制限なく、本発明の方法で組換えすることができる。また細胞内寄生生物、細菌、ウィルスは、「間接的に」本発明の方法により真核生物細胞を培養およびモニターすることにより組換えることができ、例えば以下を含む：免疫不全ウィルス、例えば、ＨＩＶ、オンコウィルス、マイコバクテリア、プロトゾア生体（例えば、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｒａｎｇｅｌｉのようなｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅｓ）、ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ（例えば、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、等。
本発明の実施において、どんな代謝要因でも測定することができる。一面として、いくつかの異なった代謝要因を細胞培養内で評価する。代謝要因は、同時または連続して測定することができる。代謝要因の一例は細胞の成長率であり、例えば、細胞培養の光濃度の変化によって測定することができる。代謝要因のもう一つの例は、ポリペプチドの発現の変化である。ポリペプチドの発現の変化は、どのような方法でも測定でき、例えば、一次元ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動、タンデム質量分析、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫沈澱およびウェスタンブロット等である。
一面として、測定した代謝要因は、少なくとも１つの転写物、または新規に導入した遺伝子の転写物の発現の変化からなる。転写物の発現の変化は、以下の方法から選択して測定することができる：雑種形成、定量増幅およびノーザンブロット。転写発現は、雑種形成をして核酸を配列上に固定することにより、細胞または核酸が代表する転写物からなる雑種形成、または細胞の転写物に相補的に、測定することができる。
一面として、測定した代謝要因は、一次的および二次的な代謝産物を含む代謝産物の測定からなる。例えば、測定した代謝要因は、一次的および二次的な代謝産物の増加または減少からなる。二次的代謝産物は、グリセロールおよびメタノールを含むグループから選択できる。測定した代謝要因は、酢酸、酪酸、琥珀酸およびオキサロ酢酸等の有機酸の増加または減少からなってもよい。
一面として、測定した代謝要因は、細胞内ｐＨまたは細胞媒体内細胞外ｐＨの増加または減少からなる。細胞内ｐＨの増加または減少は、細胞内に染料を使用することによって測定することができる；染料の蛍光の変化が経時的に測定される。一面として、測定した代謝要因は、ガス交換率測定からなってもよい。
【０１４０】
一面として、測定した代謝要因は、経時的なＤＮＡまたはＲＮＡ合成の増加または減少からなる。経時間的なＤＮＡまたはＲＮＡの合成、蓄積または減衰の増加または減少は、細胞内に染料を使用することによって測定することができる。染料の蛍光の変化が経時的に測定される。
一面として、測定した代謝要因は、成分の取り込みの増加または減少からなってもよい。成分は、単糖類、ニ糖類、多糖類、脂質、核酸、アミノ酸およびポリペプチドのような代謝産物である。糖類、ニ糖類または多糖類は、グルコースまたはサッカロースからなっていてもよい。成分は、また抗生物質、金属、ステロイドまたは抗体からなっていてもよい。
一面として、測定した代謝要因は、細胞の副産物の分泌または成分の分泌の増加または減少からなっていてもよい。副産物または成分の分泌は、毒素、リンフォカイン、多糖類、脂質、核酸、アミノ酸、ポリペプチドおよび抗体があげられる。
本方法の一面では、リアルタイムモニターが、複数の代謝要因を同時に測定する。複数の代謝要因のリアルタイムモニターは、細胞成長モニター機器の使用からなっていてもよい。細胞成長モニター機器は、ＷｅｄｇｅｗｏｏｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．の細胞成長モニター、モデル６５２、または類似したモデルや、その変形があげられる。一面として、リアルタイム同時モニターは、基質の取り込み、細胞内有機酸のレベルおよび細胞内アミノ酸のレベルを測定するものである。リアルタイム同時モニターは、以下を測定することができる：グルコースの取り込み；酢酸、酪酸、琥珀酸またはオキサロ酢酸のレベル；および、自然アミノ酸の細胞内レベル。
【０１４１】
一面として、本方法は、コンピュータで実行するプログラムを使用し経時的な代謝要因の変化をリアルタイムモニターすることからなる。コンピュータで実行するプログラムには、図２８に説明されるようなコンピュータの方法からなっていてもよい。コンピュータによる方法には、代謝ネットワーク均等化からなってもよい。これらのコンピュータによる方法はまた、経路分析、加重最小２乗法による解法のようなエラー分析、およびフラックス評価からなってもよい。コンピュータによる方法はまたユニットの再プロセスを行い、代謝フラックス分析の前に測定のエラーを取り除くことからなる。
本発明の１つ以上の局面の詳細を図と説明と供に、以下に述べる。本発明のその他の機能、目的および利点は、説明と図および請求項から明白である。
ここに引用したすべての出版物、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ参考資料（配列）、ＡＴＣＣ Ｄｅｐｏｓｉｔｓ、特許および特許出願書は、すべての目的において本書に参考文献として明示的に組み入れるものとする。
【０１４２】
詳細な説明
一実施例において、本発明は、「オンライン」または「リアルタイム」代謝フラックス分析により新規、および改変表現型の全細胞組換えの新規の方法を提供するものである。本発明の方法の実施において、最初のステップとして、細胞の遺伝成分の変更により細胞が改変される。改変は、本書に記述の通り、ランダムつまり確率的でも、または非確率的な方法でもよい。特定の遺伝子または、特定の代謝経路が改変の標的となってもよい。
一面として、本発明の方法の２つ目のステップは、改変細胞を培養し複数の改変細胞を発生することからなる。細胞は、どのような手段で培養してもよく例えば、組織培養のような細胞培養、発酵または組織培養リアクター、または細胞成長モニター機器の中でもよい。
一面として、本方法の次のステップは、リアルタイムで細胞の１つ以上の代謝要因の測定からなる。一面として、複数のメタボローム要因が同時に測定される。つまり、１つまたは複数の機器を使用して、代謝要因をモニターおよび測定してもよい。例えば、細胞成長モニター機器は、リアルタイムで培地内の細胞の複数の代謝要因を測定することができる。一例としては、以下に説明されたＷｅｄｇｅｗｏｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）、細胞成長モニターモデル６５２ＴＭである。
【０１４３】
最後に、一実施例によれば、本方法は、これらのデータを分析して、類似する状況下の非改変細胞との、または経時的な比較測定と、測定した要因が異なっているかどうかを決定することからなり、それによってリアルタイム代謝フラックス分析を利用して設計された表現型を特定することからなる。例えば、要因は、野生型の細胞または細胞培養よりも、高い、低い、または異なる率で変化することがある。細胞の遺伝成分の改変から、表現型の改変が起こったのか、および／または何が起こったのかを決定するために、非改変細胞または細胞培養を同時にモニターする必要はない。すでに周知のデータおよび情報を参考として使用してもよい。
本発明の一面において、本方法は、測定した代謝要因の変化を経時的にリアルタイムモニターし、得られた処理データを分析、表示するコンピュータ実行プログラムからなる。コンピュータ実行プログラムの一例には、図１に示すコンピュータ実行プログラムを含む。この、そして他の使用可能コンピュータ実行方法では、要因は、代謝ネットワーク均等化の使用、代謝経路分析、加重最小２乗法による解法のようなエラー分析、およびフラックス評価からなってもよい。
本発明の一面においては、改変表現型の原因となる、ある核酸（または、その核酸）が特定され、再分離され、改変され（例えば、確率的に、または非確率的に）、細胞に再挿入され、リアルタイム代謝フラックス分析のプロセスが反復的に繰り返される。このプロセスは所望の表現型が作られるまで反復的に繰り返されてもよい。例えば、植物細胞または植物細胞培養は、例えば、強化された成長、栄養価値または昆虫や乾燥耐性、また、すべてのまたは部分的なこれらの特徴等、所望の新しい表現型を持つ細胞が作られるまで、本発明の方法の反復的繰り返しの対象となる。病原微生物は、非病原性になるまで本発明の方法の反復的繰り返しの対象となる。微生物は、昆虫などの他の生体に致命的になるよう、また多様な抗生物質やその他の成分を生成するように設計することができる。微生物に対し、例えば、所望の生成物の生産量の増加、要らない副代謝産物の除去、安価な炭素や窒素源の利用の改良および発酵槽／生物反応基成長条件への適応、主要代謝産物の生産増加、二次的代謝産物の生産増加、酸性状態の耐性増加、基礎状態の耐性増加、有機溶媒への耐性増加、高塩分状態への耐性増加、および高温または低温への耐性増加等の設計ために本発明の方法を反復的に繰り返すことができる。
【０１４４】
完全な生合成経路を、細胞に挿入することができる。限定なく、どの細胞表現型も改変することができ、または、どの表現型も本発明の方法を使って細胞に加えることができる。本発明は、代謝経路の他の挿入およびスクリーニング方法と組合せて実施することができる。例えば、多量体タンパク質の組合せ代謝ライブラリーの生産およびスクリーニングを説明する米国特許番号６，２６８，１４０、または、多様なポリケチドの生成を引き起こすポリケチドシンターゼを暗号化するベクターを説明する、米国特許番号５，７１２，１４６を参照のこと。
【０１４５】
定義
特に定義されない限り、ここに使われるすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に通常に理解される意味を有する。本文で使われているように、特に規定されない限り、以下の用語は、それに由来する意味を有するものとする。
ここで使われる用語「アレイ」、「マイクロアレイ」、「バイオチップ」または「チップ」は、以下に詳細を説明される基質表面の特定の領域に固定された、特定の量の１つ以上のポリペプチドまたは核酸からなる複数の対象要素である。ここで使われる用語「コンピュータ」および「プロセッサ」は、その最大限一般的な文脈で使われており、以下に詳細を説明するようにそのようなすべての機器に取り入れられるものとする。
用語「飽和突然変異」または「ＧＳＳＭ」は、以下に詳細を説明するように、オリゴヌクレオチドプライマーを変質させ、点突然変異をポリヌクレオチドに導入させる方法を含む。
用語「最適化指向的進化システム」または「最適化指向的進化」は、以下に詳細を説明するように、例えば、関連する遺伝子のような関連する核酸配列の断片を再組換えする方法を含む。
用語「合成連結再組換え」または「ＳＬＲ」には、以下に詳細を説明するように、オリゴヌクレオチド断片を非確率的な形で連結する方法を含む。
【０１４６】
用語「抗体」は、特に抗原またはエピトープを結合する能力のある単独イミュノグロブリン遺伝子、複数のイミュノグロブリン遺伝子またはその断片から得られた、またはそれらをモデルとした、またはそれらに暗号化されたペプチドまたはポリペプチドを含む。例えば、基礎免疫学、第３版、Ｗ．Ｅ． Ｐａｕｌ、編集、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ． （１９９３）；Ｗｉｌｓｏｎ （１９９４） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １７５：２６７−７３；Ｙａｒｍｕｓｈ （１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：８５９７を参照のこと。用語、抗体には、抗体結合部分、つまり抗原を結合する能力を保持する「抗原結合サイト」（例えば、断片、部分列、相補的決定区域（ＣＤＲ））が含まれ、それには以下が含まれる：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる単価の断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ区域で二硫化物架橋によって連結されているＦａｂ断片２つからなる２価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；および（ｖｉ）分離した相補的決定区域（ＣＤＲ）。単鎖抗体もまた、「抗体」の用語に参考として含まれる。
【０１４７】
核酸の生成と操作
本発明の方法は、非相同核酸を細胞に加える、または細胞内の相同遺伝子の改変によって、細胞の遺伝成分を改変することを含む。核酸は、細胞から分離、組換えで生成、または合成することができる。配列は、例えば、ｃＤＮＡライブラリーの発現をクローニング、またはゲノムＤＮＡのメッセージをＰＣＲで増幅すること等によって分離することができる。本発明の方法の実施において、相同遺伝子は、ここに説明されるように、テンプレート核酸を操作することで改変することができる。本発明は、科学および特許文献に記載されている周知の方法、プロトコル、または機器と組合せて実施することができる。
一般技術
本発明を実施する核酸は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、ウィルスまたはそれらのハイブリッドであれ、多様な供給源から分離され、遺伝子組換えがなされ、増幅されおよび／または、組換え個体として発現、生成される。これらの核酸から生成された組換えポリペプチドは、個別に分離、または、クローニングされ、所望の活性のテストがなされる。細菌、哺乳動物、酵母菌、昆虫または植物細胞発現システムを含む、どの組換え発現システムでも利用できる。
また、これらの核酸は、周知の化学合成技術によって試験管内で合成することができ、それは、例えば以下に説明されている：Ａｄａｍｓ （１９８３） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０５：６６１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ（１９９７）核酸 Ｒｅｓ． ２５：３４４０−３４４４；Ｆｒｅｎｋｅｌ （１９９５） Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １９：３７３−３８０；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ （１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：７８８６−７８９６；Ｎａｒａｎｇ （１９７９） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：９０；Ｂｒｏｗｎ （１９７９） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：１０９；Ｂｅａｕｃａｇｅ （１９８１） Ｔｅｔｒａ． Ｌｅｔｔ． ２２：１８５９；米国特許番号４，４５８，０６６。
【０１４８】
例えば、サブクローニング、識別プローブ（例えば、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを使ったランダムプライマー識別、切れ目翻訳、増幅）、配列決定、雑種形成等の核酸の操作技術は、科学および特許文献に記載されており、例えば以下を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｄ．、分子クローニング：実験室マニュアル（第２版）、Ｖｏｌｓ． １−３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（１９８９）；分子生物学の最新プロトコル、Ａｕｓｕｂｅｌ編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９７）；生物化学および分子生物学における実験技術：核酸プローブによる雑種形成、Ｐａｒｔ Ｉ． 理論および核酸形成、Ｔｉｊｓｓｅｎ、ｅｄ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ． （１９９３）。
核酸、ベクター、カプシド、ポリペプチド等は、当業者に知られている一般的な方法をどれでも、またいくつも使って分析または定量することができる。これには、例えば以下が含まれる：ＮＭＲ、分光測定法、Ｘ腺写真、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）、および高拡散クロマトグラフィのような分析生化学的方法、多様な免疫学的方法、例えば、液体またはゲル沈降素反応、免疫拡散、免疫電気泳動、放射免疫検定法（ＲＩＡｓ）、酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡｓ）、免疫蛍光検定法、サウザン分析、ノーザン分析、ドットブロット分析、ゲル電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、核酸、標的または信号増幅法、放射能標識、シンチレーション計数、および親和クロマトグラフィ。
本発明の方法の実施に使用される核酸を獲得し操作するその他の有益な手段は、ゲノムサンプルからのクローニング、そして、所望すれば、例えばゲノムクローンまたはｃＤＮＡクローンから分離または増幅された挿入物をスクリーンまたは再クローニングすることである。本発明の方法に使用された核酸の供給源には、例えば哺乳動物人工染色体（ＭＡＣ）に含まれるゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーが含まれ、例えば、米国特許第５，７２１，１１８；６，０２５，１５５；ヒト人工染色体を参照、例えば、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９７）Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３３３−３３５；酵母菌人工染色体（ＹＡＣ）；細菌人工染色体（ＢＡＣ）；Ｐ１人工染色体を参照、例えば、Ｗｏｏｎ （１９９８） ゲノム研究 ５０：３０６−３１６；Ｐ１由来ベクター（ＰＡＣｓ）を参照、例えば、Ｋｅｒｎ （１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１２０−１２４；コスミド、組換えウィルス、ファージまたはプラスミドを参照。
【０１４９】
核酸の増幅
本発明の方法の実施において、核酸を暗号化する非相同または相同、または改変核酸は、例えば増幅によって複製することができる。増幅反応はまた、サンプル内の核酸の量を定量に使用（例えば、細胞サンプル内のメッセージの量）、核酸の識別（例えば、アレイまたはブロットに割り当てる）、核酸の検出、またはサンプル内の特定の拡散の量を定量するのに使用することができる。本発明の一面においては、細胞またはｃＤＮＡライブラリーから分離されたメッセージは増幅される。当業者であれば適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択し設計することができる。増幅方法は、当分野においては周知であり、例えば以下を含む：ポリマラーゼ連鎖、ＰＣＲ（例えば以下を参照のこと：ＰＣＲプロトコル、方法および応用ガイド、編集Ｉｎｎｉｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９０）およびＰＣＲ方法（１９９５）、編集Ｉｎｎｉｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．、リガーゼ連鎖（ＬＣＲ）（例えば以下を参照のこと：Ｗｕ（１９８９）ゲノム研究 ４：５６０；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ（１９９０）Ｇｅｎｅ ８９：１１７）；転写増幅（例えば、以下を参照のこと：Ｋｗｏｈ （１９８９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１１７３）；および、自立運転配列複写（例えば以下を参照のこと：Ｇｕａｔｅｌｌｉ （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：１８７４）；Ｑβレプリカーゼ増幅（例えば、以下を参照のこと：Ｓｍｉｔｈ （１９９７） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３５：１４７７−１４９１）、自動Ｑ−βレプリカーゼ増幅分析（例えば以下を参照のこと：Ｂｕｒｇ （１９９６） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ １０：２５７−２７１）およびその他のＲＮＡポリマラーゼを媒介とした技術（例えば、ＮＡＳＢＡ、Ｃａｎｇｅｎｅ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）；以下も参照のこと：Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １５２：３０７−３１６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ；米国特許第４，６８３，１９５および４，６８３，２０２；Ｓｏｏｋｎａｎａｎ （１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５６３−５６４。
【０１５０】
核酸の改変
本発明の方法の実施において、例えば、相同遺伝子の生体外改変に続いて、細胞にそれを再導入することによって細胞の遺伝子成分は改変される。相同、非相同または本発明の方法で選択された遺伝子は、どの手段でも改変することができ、それには例えば、ランダムまたは確率的方法、または非確率的方法や「指向的進化」方法が含まれる。
遺伝子のランダム突然変異方法は、当分野では周知であり、例えば以下を参照のこと：米国特許Ｎｏ．５，８３０，６９６。例えば、突然変異原を使ってランダムに遺伝子を突然変異させることができる。突然変異原には、例えば以下が含まれる：紫外線またはγ線放射、または化学突然変異原、例えば、ミトマイシン、亜硝酸、光活性ソラレン。これらを単独または組合せで使用し、組換えによる修復ができるようにＤＮＡの破壊を誘発する。他の化学突然変異原には、以下が含まれる：例えば、亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシアミン、ヒドラジンまたはギ酸。その他の突然変異原は、ヌクレオチド先駆物質の類似物質であり、例えば、ニトロソグアニジン、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、またはアクリジンなどがある。これらの物質は、ヌクレオチド先駆物質の代わりにＰＣＲ反応に加えることができ、それにより、配列に突然変異が起こる。プロフラヴィン、アクリフラビン、キナクリンなどのような層間物質も使用することができる。
例えばランダムＰＣＲ突然変異などの分子生物学の技術も使用できる。例えば以下を参照のこと：Ｒｉｃｅ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５４６７−５４７１；または、組合せ複数カセット突然変異は、例えば以下を参照のこと：Ｃｒａｍｅｒｉ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８：１９４−１９６。また、核酸、例えば、遺伝子は、ランダムまたは「確率的」断片化の後に再組換えすることができ、例えば以下を参照のこと：米国特許第６，２９１，２４２；６，２８７，８６２；６，２８７，８６１；５，９５５，３５８；５，８３０，７２１；５，８２４，５１４；５，８１１，２３８；５，６０５，７９３。
非確率的、または「指向的進化」の方法には、例えば、飽和突然変異 （ＧＳＳＭ）、合成連結組換え（ＳＬＲ）、またはそれらの組合せが含まれる。本発明の一面においては、核酸は、リアルタイム代謝フラックス分析を利用して選択され、細胞上の新規のまたは改変された表現型を与えるために、分離され、改変され、そしてまた細胞に再挿入され、本発明の方法のステップが繰り返される。分離されたおよび／または改変された核酸に暗号化されたポリペプチドは、例えば毛細アレイプラットフォームを使用して、細胞に再挿入される前に、その活性をスクリーニングされる。例えば以下を参照のこと：米国特許第６，２８０，９２６；５，９３９，２５０。
【０１５１】
飽和突然変異またはＧＳＳＭ
本発明の一面においては、非確率的遺伝子改変、「指向的進化プロセス」は、遺伝子を改変するのに使われ、表現型を付け加えたり改変するために細胞に挿入される。この方法の変形は、「遺伝子サイト−飽和突然変異」、「サイト−飽和突然変異」、「飽和突然変異」または単に「ＧＳＳＭ」と呼ばれている。これは、その他の突然変異プロセスと組合せて使用することができる。例えば以下を参照のこと：米国特許第６，１７１，８２０；６，２３８，８８４。一面として、ＧＳＳＭは、テンプレートポリヌクレオチドおよび複数のオリゴヌクレオチドを提供することからなり、ここで、それぞれのオリゴヌクレオチドは、テンプレートポリヌクレオチドに相同する配列からなり、そのため、テンプレートポリヌクレオチドの特定の配列および相同遺伝子の変形である配列に、標的を当てる；オリゴヌクレオチドと共にテンプレートポリヌクレオチドを複製することによって非確率的配列の変形からなる子孫ポリヌクレオチドが生成され、それにより相同遺伝子配列変形からなるポリヌクレオチドが 生成される。
ある局面において本発明は、各アミノ酸部位において単一のアミノ酸置換の全範囲が表されるような、新しく作製した一連の子孫ポリペプチドを作製するために、特許権のあるコドンプライマー（縮重Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列を含む）の使用を提供し、点変異をポリヌクレオチドに導入する。使用されるオリゴは、第一の相同的な配列、縮重Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列、および好ましくは、しかし必ずしも必要ではない、第二の相同的な配列を、連続的に含む。Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列の縮重は全ての２０アミノ酸のコドンを含むため、そのようなオリゴの使用による下流側の子孫翻訳産物は、ポリペプチドに沿ったそれぞれのアミノ酸の部位でのすべての可能なアミノ酸変化を含む。
ある局面において、このような縮重オリゴ（一つの縮重Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔカセットからなる）の一つは、親ポリヌクレオチド鋳型の中のそれぞれの本来のコドンを、全範囲のコドン置換に供するために使用される。別の局面において、親ポリヌクレオチドの鋳型における少なくとも二個の本来のコドンを、全領域のコドン置換に供するために、同一のオリゴ又はそれ以外のどちらかの、少なくとも二個の縮重Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔカセットが使用される。したがって、一つ以上の部位でアミノ酸変異を導入するために、一個以上のＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列が、一個のオリゴの中に含まれうる。この複数のＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列は、直接的に連続している又は、一つもしくは複数の付加的なヌクレオチド配列によって分けられうる。別の局面において、アミノ酸の付加、欠損、および／もしくは置換の任意の組み合わせ又は順列を導入するため、付加や欠損を導入するために使用可能なオリゴは、単独でも又はＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列を含むコドンと組み合わせて使用されうる。
【０１５２】
特別な例証において、連続的なＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔトリプレット、すなわち縮重（Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ）ｎ配列を含むオリゴを使用して、二つ又はそれ以上の連続したアミノ酸部位を同時に突然変異誘発させることが可能である。
別の局面において、本発明はＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列未満の縮重度をもつ縮重カセットの使用を提供する。例えば、Ｎがトリプレットの最初の、二番目の又は三番目の部位にあることができるような、たった一つのＮから成る縮重トリプレットを使用（例えばオリゴにおいて）することが、場合によっては望ましいであろう。その任意の組み合わせ及び順列も含む、任意の他の塩基を、トリプレットの残りの二つの位置で用いることができる。または、場合によっては縮重Ｎ，Ｎ，Ｎトリプレット、又はＮ，Ｎ，Ｇ／Ｃトリプレットを使用（例えば、オリゴにおいて）することが望ましいであろう。
しかしながら、本発明において開示された、縮重トリプレット（Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ、又はＮ，Ｎ，Ｇ／Ｃトリプレット配列のような）の使用は、いくつかの理由で有利であると評価される。ある局面においては、本発明は、ポリペプチドにおけるそれぞれおよび全てのアミノ酸部位に、可能なアミノ酸（２０アミノ酸の合計に対して）の全ての範囲の置換を、系統的に、かつ、かなり容易に作製するための手段を提供する。したがって、１００アミノ酸のポリペプチドにとって、本発明は、系統的に、かつ、かなり容易に２０００の異なる種（すなわち、部位あたり２０の可能なアミノ酸×１００アミノ酸部位）を作製するための方法を提供する。縮重Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ又はＮ，Ｎ，Ｇ／Ｃトリプレット配列を含むオリゴの使用を通じて、２０の可能なアミノ酸をコードする３２の個々の配列が提供されることは評価される。したがって、親ポリヌクレオチド配列が、このようなオリゴを使った飽和変異法に供されるような反応容器において、２０の異なるポリペプチドをコードする３２の異なる子孫ポリヌクレオチドが作製される。対照的に、部位特異的突然変異誘発における非縮重オリゴの使用は、反応容器あたり一つの子孫ポリペプチド産物のみをもたらす。
【０１５３】
本発明はまた、開示された縮重したプライマーとの組み合わせにおいて、随意的に使用うる非縮重オリゴの使用を提供する。いくつかの状況においては、作用ポリヌクレオチドに特定の点変異を作製するため、非縮重オリゴを使用することが有利であるとが評価される。これは、アミノ酸置換につながらない特異的なサイレント点変異、対応するアミノ酸変化をもたらす点変異、及び停止コドンの作製やポリペプチド断片の対応する発現を引き起こす点変異を作製するための手段を提供する。
したがって、本発明の好ましい態様において、全ての２０アミノ酸が、親ポリヌクレオチドにおいて変異されたコドン部位に対応する一つの特定のアミノ酸部位で現われるように、それぞれの飽和突然変異誘発反応の容器は、少なくとも２０の子孫ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドを含む。それぞれの飽和突然変異誘発反応容器から作製された３２重縮重子孫ポリペプチドは、クローン増幅（例えば発現ベクターを使って適切な大腸菌宿主にクローニングされる）に供され、発現スクリーニングに供されることが可能である。特性における好適な変化（親ポリペプチドと比較したとき）を提示するためのスクリーニングによって、個々の子孫ポリペプチドが同定される場合、その中に含まれる対応する好適なアミノ酸置換を同定するために配列決定されうる。
本明細書に開示されたように飽和突然変異誘発法を用いて、親ポリペプチドにおける、それぞれのおよび全てのアミノ酸部位を変異させる場合、好ましいアミノ酸の変化が、一つ以上のアミノ酸部位で同定されうることが評価される。これらの好ましいアミノ酸置換の全てまたはその一部の組み合わせを含む、一つ又は複数の新しい子孫分子を作製することが可能である。例えば、もし２個の特定の好ましいアミノ酸の変化が、ポリペプチドの３アミノ酸部位のそれぞれにおいて同定されるならば、順列はそれぞれの部位で三つの可能性（本来のアミノ酸が変化しない場合及び、二つの好ましい変化それぞれの場合）および３つの部位を含んでいる。したがって、既に検討された７つの可能性、つまり、６個の単一の点変異（すなわち三つの部位のそれぞれにおける２つ）及び、どの位置でも変化のない場合を含む、３×３×３、又は２７の全可能性がある。
【０１５４】
更に別の局面において、部位飽和突然変異誘発法は、スクリーニングを通じて、シャッフリング、キメラ化、組換え、および他の変異方法と一緒に使用されることが可能である。本発明は、飽和突然変異誘発法を含む、反復方法における任意の変異方法の使用を提供する。ある例示においては、任意の変異方法の反復的な使用が、スクリーニングと組み合わせて使用される。
したがって、非制限的例示において、本発明は、ハイブリットポリヌクレオチドが組換え及び還元的再組み合わせ（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）によって作製されるように、二つ又はそれ以上の関連するポリヌクレオチドが適切な宿主細胞に導入されるような方法などの、追加的な変異方法と組み合わせた、飽和突然変異誘発法の使用を提供する。
【０１５５】
合成連結再組換え （ＳＬＲ）
その他の非確率的遺伝子改変方法であり、本発明の方法に使用され、表現型を追加または改変するために細胞に挿入される遺伝子を改変する「指向的進化プロセス」は、「合成連結再組換え」または単に「ＳＬＲ」と呼ばれる。ＳＬＲは、オリゴヌクレオチド断片を非確率的に連結させる方法である。この方法は、確率的なオリゴヌクレオチドシャッフリングとは異なり、核酸細胞構築物はシャッフルされたり連結やランダムなキメラ化が起こらず、むしろ、非確率的に組合せられる。例えば以下を参照のこと：「指向的進化における合成連結再組換え」と題された米国特許出願番号（ＵＳＳＮ）０９／３３２，８３５、１９９９年６月１４日出願（「ＵＳＳＮ ０９／３３２，８３５」）。一面として、ＳＬＲは、以下のステップからなる：（ａ）テンプレートポリヌクレオチドの提供、ここでテンプレートポリヌクレオチドは、相同遺伝子を暗号化する配列からなる；（ｂ）複数の細胞構築物ポリヌクレオチドの提供、ここで細胞構築物 ポリヌクレオチドは、予め決定された配列において、テンプレートポリヌクレオチドと乗り換え再組合せをするように設計される。また、細胞構築物ポリヌクレオチドは、相同遺伝子の変異体である配列、および多様な配列に位置するテンプレートポリヌクレオチドに相同な配列からなる。；（ｃ）テンプレートポリヌクレオチドを伴う細胞構築物ポリヌクレオチドの組合せ。それはテンプレートポリヌクレオチドを伴って細胞構築物ポリヌクレオチドが乗り換え再組合せを行い、相同遺伝子配列の変異体からなるポリヌクレオチドを生成する。
ＳＬＲは、再組合せがなされるポリヌクレオチド間の高い相同性の存在には依存しない。つまり、本方法は、１０１００ 以上の異なるキメラからなる子孫分子のライブラリーを非確率的に生成するのに使うことができる。ＳＬＲは、１０１０００以上の異なった子孫キメラからなるライブラリーを生成するのに使うことができる。
したがって、ある局面において、本発明は、非確率的で、設計により選択された全集合の順序を有する最終的なキメラ核酸分子のセットを作製する方法を提供し、この方法は、設計により利用可能な相互適合性連結可能（ｍｕｔｕａｌｌｙ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｌｉｇａｔａｂｌｅ）末端を有する多数の特定の核酸構築ブロックを作製する段階及び、設計された全集合の順序が達成されるように、これらの核酸構築ブロックを集合させる段階からなる。
【０１５６】
構築ブロックをあらかじめ決定された順序で結合させることができるなら、集合されるべき核酸構築ブロックの相互適合性連結可能末端は、この型の集合された順序のために「利用可能」であると考えられる。したがって、ある局面において、核酸構築ブロックが結合されうる全集合の順序は、連結可能末端の設計により特定され、複数の集合段階が使用されるならば、その後核酸構築ブロックが結合されうる全集合の順序は集合段階の連続的な順序によっても特定される。図４のパネルＣは、５個の核酸構築ブロックに関する設計された（非確率的な）全集合の順序を達成するための２つの連続した段階からなる例示的集合方法を図示している。本発明の好ましい態様においては、アニーリングされた構築部分はリガーゼ（例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ）等の酵素で処理され、構築部分の共有結合を達成する。
好ましい態様においては、最終的なキメラ核酸分子の子孫セットを作製する基礎としてはたらく祖先核酸鋳型セットの配列解析において核酸構築ブロックの設計が得られる。それゆえ、これらの祖先核酸鋳型は変異誘発される、すなわちキメラ化またはシャッフリングされる、核酸構築ブロックの設計を助ける配列情報の供給源としてはたらく。
したがって本発明の一つの局面によれば、多数の祖先核酸鋳型配列が一つ又は複数の境界点（ｄｅｍａｒｃａｔｉｏｎ ｐｏｉｎｔ）を選択するために整列化され、境界点は相同的領域に位置することができ、一つ又は複数の核酸からなり、境界点は少なくとも２つの祖先鋳型により共有される。境界点を、作製されるべき核酸構築ブロックの境界を記述するために使用することができる。したがって祖先分子内で同定および選択された境界点は子孫分子の集合における潜在的なキメラ化点としてはたらく。
【０１５７】
好ましくは、利用可能な境界点は少なくとも２つの祖先鋳型により共有された（少なくとも１つの相同核酸塩基からなる）相同的領域である。より好ましくは、利用可能な境界点は少なくとも半分の祖先鋳型により共有された相同的領域である。なおより好ましくは、利用可能な境界点は少なくとも３分の２の祖先鋳型により共有された相同的領域である。更により好ましくは、利用可能な境界点は少なくとも４分の３の祖先鋳型により共有された相同的領域である。更に一層より好ましくは、利用可能な境界点はほとんど全ての祖先鋳型により共有された相同的領域である。なお一層より好ましくは、利用可能な境界点は全ての祖先鋳型により共有された相同的領域である。
好ましい態様において本発明は、徹底的なライブラリーを作製するために、ライゲーション再集合過程が徹底的に実施されることを提供する。別の言い方をすれば、核酸構築ブロックの全ての可能な順序の組み合わせが、最終キメラ核酸分子のセット中に示される。同時に、特に好ましい態様においては、各組み合わせにおける集合順序（すなわち各最終キメラ核酸の５’から３’配列における各構築ブロックの集合の順序）は設計による（又は非確率的である）。本発明の非確率的性質のために、望ましくない副産物の可能性は大きく減少する。
別の好ましい態様においては、たとえば体系的に区分されたライブラリーを作製するために、例えば一つずつ、体系的にスクリーニングされうる区分を用いてライゲーション再集合過程が体系的に実施されることを本発明は提供する。別の言い方をすれば、連続的段階的集合反応の選択的で適切な使用と組み合わせた、特定の核酸構築ブロックの選択的で適切な使用を通じて、特定のセットの子孫産物が数個の反応容器各々の中で作製される実験的設計が達成されうることを、本発明は提供する。これは体系的な実験およびスクリーニング方法の実施を可能にする。したがって、潜在的な非常に多数の子孫分子がより少ない群で体系的に試験されることを可能にする。
【０１５８】
非常に柔軟で更に同時に徹底的ならびに体系的でもある方法でキメラ化を実施する能力があるので、特に祖先分子間に低いレベルの相同性がある場合、本発明は多数の子孫分子からなるライブラリー（またはセット）の作製を提供する。本ライゲーション再集合発明の非確率的性質のために、作製される子孫分子は、好ましくは設計により選抜される全集合の順序を有する最終キメラ核酸分子のライブラリーからなる。
飽和突然変異および最適化指向的進化方法はまた、これらの異なった子孫分子種を生成するのにも使うことができる。
境界点の選択、核酸構築ブロックの大きさおよび数、ならびに結合の大きさおよび設計に関して選択と制御の大きな自由があるので、本発明の力は並はずれていることが認識される。さらに、分子間相同性の必要性が本発明の運用性に対しては非常に緩和されていることが認識される。実際、ほとんどまたは全く分子間相同性を有さない領域においても境界点は選択されることさえできる。たとえば、コドンゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）、すなわちコドンの縮重のために、対応する祖先鋳型に本来コードされるアミノ酸を変更することなく核酸構築ブロックにヌクレオチド置換を導入することができる。または本来のアミノ酸に関するコードが変更されるようにコドンを変更することができる。分子間相同的な境界点の頻度を増加させ、したがって構築ブロック間での結合数の増加が達成され、その結果より多数の子孫キメラ分子が作製されるようになるように、そのような置換が核酸構築ブロックに導入されうることを本発明は提供する。
【０１５９】
別の例示においては、構築ブロックが作製される段階における合成的性質は、後にインビトロ過程（例えば変異誘発による）またはインビボ過程（例えば宿主生物の遺伝子スプライシング能を利用することによる）において任意に除去されうるヌクレオチド（例えば、コドンもしくはイントロンまたは調節配列であってもよい、例えば一つ又は複数のヌクレオチド）の設計および導入を可能にする。利用可能な境界点を作製するという潜在的な恩典に加えて他の多くの理由により、これらの核酸の導入もまた多くの場合望ましくありうることが認識される。
それゆえ、別の態様によると、核酸構築ブロックはイントロンを導入するために使用されうることを本発明は提供する。したがって、機能的イントロンが本発明の人工遺伝子に導入されうることを本発明は提供する。機能的イントロンが本発明の人工遺伝子経路に導入されうることもまた本発明は提供する。したがって、１つ（または複数）の人工的に導入されたイントロンを含む人工遺伝子であるキメラポリヌクレオチドの作製を本発明は提供する。
【０１６０】
最適化指向的進化システム
本発明の方法の実施において、核酸は最適化指向的進化システムからなる方法によって改変することができる。最適化指向的進化は、組換えを通した核酸の指向的分子進化を行うことができる、還元再組合せ、組換えおよび選択の反復サイクルを使用するよう導くものである。最適化指向的進化は、進化したキメラ配列の大量な個体群を生成するもので、ここで、生成された個体群は、予め決められた数の乗り換えイベントを有する配列のために強化されている。
乗り換えイベントは、キメラ配列の１点であり、親変異体からその他の親変異体に配列のシフトが起こる所である。そのような点は、通常２つの親からのオリゴヌクレオチドが互いに連結して単一の配列を形成する交差点である。この方法により、オリゴヌクレオチド配列の正しい濃度計算ができ、最終的な配列のキメラ個体群が、選択された回数の乗り換えイベント用に強化される。これにより、予め決められた回数の乗り換えイベントを有するキメラ変異体選択の管理がより高められることになる。
また、この方法は、他のシステムに比べ、壮大な量の可能なタンパク質の変異体スペースを調査する手段として便利である。以前は、例えば反応中に１０１３のキメラ分子が生成されると、特定の活性につきそのような多大な量のキメラ変異体をテストするのは非常に困難であった。また、子孫個体群の多くの部分では、特定の活性のレベルを高める可能性の少ないタンパク質を生み出す、大量の乗り換えイベントが起こり得る。これらの方法を使用して、キメラ分子の個体群は、特定の数の乗り換えイベントを有する変異体のために強化されることができる。つまり、反応中に１０１３のキメラ分子を生成できるが、更に分析を行うために選択したそれぞれの分子は、例えば、わずか３つの乗り換えイベントを有している可能性が高い。子孫個体群は、予め決められた数の乗り換えイベントを有するように変えられるので、キメラ分子間の機能的多様性の限度が縮小されるのである。これにより、 始原の親ポリヌクレオチドからのどのオリゴヌクレオチドが特定の特質に影響を与えているのかを判断する時に、変異体の数がより管理しやすいものとなる。
【０１６１】
キメラ子孫ポリヌクレオチド配列を生成する１つの方法として、それぞれの親配列の断片または部分に対応するオリゴヌクレオチドの生成がある。それぞれのオリゴヌクレオチドは、特異的な重複区域を含むのが好ましく、それによりオリゴヌクレオチドの混合で、正しい順序でそれぞれのオリゴヌクレオチド断片を有する新しい変異体が生まれることになる。詳細は、ＵＳＳＮ０９／３３２，８３５に記載されている。それぞれの親変異体に生成されたオリゴヌクレオチドの数は、最終的に生成されたキメラ分子内の乗り換えの起因となる合計数と関連がある。例えば、３つの親ヌクレオチド配列の変異体に、例えば、高温下で高活性であるキメラ変種を探す連結反応を起こす。一例として、それぞれの親変異体のそれぞれの部分に対応してオリゴヌクレオチド配列が５０生成される。したがって、連結組換えプロセス中にはそれぞれのキメラ配列の中に最高で５０回の乗り換えイベントがあることになる。生成されたそれぞれのキメラポリヌクレオチドが、交互に親変種からのオリゴヌクレオチドを含有している確率は、非常に少ない。それぞれのオリゴヌクレオチド断片が同一の分子量の連結反応で存在している場合には、ある位置で同じ親ポリヌクレオチドからのオリゴヌクレオチドが互いに連結している可能性が高く、そのため、乗り換えイベントは起こらない。それぞれの親からのそれぞれのオリゴヌクレオチドの濃度が、本例のどの連結ステップ中にも一定であった場合には、同じ親変異体からのオリゴヌクレオチドが、キメラ配列内で連携し乗り換えを起こさない確立は（親は３体と仮定した場合）１／３である。
したがって、それぞれの連結反応ステップ中に、決められた親変異体数、それぞれの変異体に対応するオリゴヌクレオチドの数、およびそれぞれの変異体の濃度における連結反応のそれぞれのステップにおいて、乗り換えイベントが起きる個体群を予想するために、特定確率濃度機能（ＰＤＦ）を特定することができる。ＰＤＦ特定の背景となる統計および数学を以下に説明する。これらの方法を利用して、そのような確率濃度機能を推定することができ、その結果、特定の連結反応から生じた予め決められた回数の乗り換えイベントのためにキメラ子孫個体群を強化することができる。また、対象となる乗り換えイベント回数を予め決定することができ、その後、システムは、連結反応時のそれぞれのステップ中のそれぞれの親オリゴヌクレオチドの開始時の数量を計算するようにプログラムされ、それによって、予め決められた回数の乗り換えイベントを中心とする確率濃度機能が生じる。
【０１６２】
これらの方法は、組換えを通じてポリペプチドを暗号化する拡散の分子的進化を可能にする還元再組合せ、組換えおよび選択の反復サイクルを使用するよう導くものである。このシステムは、進化したキメラ配列の大量な個体群を生成するもので、ここで、生成された個体群は、予め決められた数の乗り換えイベントを有する配列のために強化されている。乗り換えイベントは、キメラ配列の１点であり、親変異体からその他の親変異体に配列のシフトが起こる所である。そのような点は、通常２つの親からのオリゴヌクレオチドが互いに連結して単一の配列を形成する交差点である。この方法により、オリゴヌクレオチド配列の正しい濃度計算ができ、最終的な配列のキメラ個体群が、選択された回数の乗り換えイベント用に強化される。これにより、予め決められた回数の乗り換えイベントを有するキメラ変異体選択の管理がより高められることになる。
また、この方法は、他のシステムに比べ、壮大な量の可能なタンパク質の変異体スペースを調査する手段として便利である。ここに説明される方法を利用してキメラ分子の個体群は、特定の数の乗り換えイベントを有する変異体のために強化されることができる。つまり、反応中に１０１３のキメラ分子を生成できるが、更に分析を行うために選択したそれぞれの分子は、例えばわずか３つの乗り換えイベントを有している可能性が高い。子孫個体群は、予め決められた数の乗り換えイベントを有するように変えられるので、キメラ分子間の機能的多様性の限度が縮小されるのである。これにより、 始原の親ポリヌクレオチドからのどのオリゴヌクレオチドが特定の特質に影響を与えているのかを判断する時に、変異体の数がより管理しやすいものとなる。
【０１６３】
一面として、キメラ子孫ポリヌクレオチド配列を生成する１つの方法として、それぞれの親配列の断片または部分に対応するオリゴヌクレオチドの生成がある。それぞれのオリゴヌクレオチドは、特異的な重複区域を含むのが好ましく、それによりオリゴヌクレオチドの混合で、正しい順序でそれぞれのオリゴヌクレオチド断片を有する新しい変異体が生まれることになる。詳細は、ＵＳＳＮ ０９／３３２，８３５に記載されている。
それぞれの親変異体に生成されたオリゴヌクレオチドの数は、最終的に生成されたキメラ分子内の乗り換えの起因となる合計数と関連がある。例えば、３つの親ヌクレオチド配列の変異体に、例えば、高温下で高活性であるキメラ変種を探す連結反応を起こす。一例として、それぞれの親変異体のそれぞれの部分に対応してオリゴヌクレオチド配列が５０生成される。したがって、連結組換えプロセス中にはそれぞれのキメラ配列の中に最高で５０回の乗り換えイベントがあることになる。生成されたそれぞれのキメラポリヌクレオチドが、交互に親変種からのオリゴヌクレオチドを含有している確率は、非常に少ない。それぞれのオリゴヌクレオチド断片が同一の分子量の連結反応で存在している場合には、ある位置で同じ親ポリヌクレオチドからのオリゴヌクレオチドが互いに連結している可能性が高く、そのため、乗り換えイベントは起こらない。それぞれの親からのそれぞれのオリゴヌクレオチドの濃度が、本例のどの連結ステップ中にも一定であった場合には、同じ親変異体からのオリゴヌクレオチドが、キメラ配列内で連携し乗り換えを起こさない確立は（親は３体と仮定した場合）１／３である。
したがって、それぞれの連結反応ステップ中に、決められた親変異体数、それぞれの変異体に対応するオリゴヌクレオチドの数、およびそれぞれの変異体の濃度における連結反応のそれぞれのステップにおいて、乗り換えイベントが起きる個体群を予想するために、特定確率濃度機能（ＰＤＦ）を特定することができる。ＰＤＦ特定の背景となる統計および数学を以下に説明する。これらの方法を利用して、そのような確率濃度機能を推定することができ、その結果、特定の連結反応から生じた予め決められた回数の乗り換えイベントのためにキメラ子孫個体群を強化することができる。また、対象となる乗り換えイベント回数を予め決定することができ、その後、システムは、連結反応時のそれぞれのステップ中のそれぞれの親オリゴヌクレオチドの開始時の数量を計算するようにプログラムされ、それによって、予め決められた回数の乗り換えイベントを中心とする確率濃度機能が生じる。
【０１６４】
クロスオーバーイベントの決定
本発明の実施例には所望する乗り換え確率濃度機能（ＰＤＦ）を受け取るシステムおよびソフトウェア、再組合せされる親遺伝子の数、および再組換え中に投入される断片の数が含まれる。このプログラムの出力は「断片ＰＤＦ」であり、再組合せ遺伝子の処方およびそれらの遺伝子の推定される乗り換えＰＤＦを決定するのに使用できる。ここで説明されるプロセスは、プログラミング言語であり、また技術的なコンピュータの利用における環境開発をするＭＡＴＬＡＢＴＭ （マスワークス、Ｎａｔｉｃｋ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で行われるのが好ましい。
反復プロセス
本発明の方法の実施において、改変表現型の原因となる、ある核酸（または、その核酸）が特定され、再分離され、改変され、細胞に再挿入され、リアルタイム代謝フラックス分析のプロセスが反復的に繰り返される。このプロセスは所望の表現型が作られるまで反復的に繰り返されてもよい。例えば、生化学経路をすべて細胞中に組み入れることが可能である。限定なく、どの細胞表現型も改変することができ、または、どの表現型も本発明の方法を使って細胞に加えることができる。
核酸は、確率的または非確率的方法のどちらを使ってでも改変することができる。多くの場合、キメラ核酸およびタンパク分子を生成する方法に続いて、望ましい表現型の変更または追加等の特定の機能のために、リアルタイム代謝フラックス分析を使用し、細胞への挿入、培養、およびスクリーニングが行われる。本発明は、単回スクリーニングに限定されるものではない。この決定に基づいて所望する特性を有する、または、所望する表現型を起こす子孫の強化が起こる、２回目の再組合せが行われる。
同様に、ある特定のオリゴヌクレオチドが望ましい特質（例えば、新規の表現型）に全く影響を与えないと確認されると、排除したい配列を含むより大きな親オリゴヌクレオチドを合成することにより、それを排除することができる。大型配列内に配列を組み入れると乗り換えイベントが妨げられるため、子孫ポリヌクレオチド内でこの配列の変異種が存在しないことになる。どのオリゴヌクレオチドが所望する特質により関連しているか、またどれが関連していないかを決定する反復操作によって、特定の特質または活性を提供するタンパク変異型のすべての候補をより効果的に調査できるようになる。
【０１６５】
反応の自動管理
本発明の方法による反応を起こすプロセスは、すべて自動機器およびロボット機器によって自動化することができる。例えば、一例として、Ｗｅｄｇｅｗｏｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．の細胞成長モニターモデル６５２等の細胞成長モニター機器は、リアルタイム代謝フラックス分析に使用できる。他の機器の例は、Ｔｅｃａｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によるＴＥＣＡＮ ＧＥＮＥＳＩＳＴＭプログラム可能ロボットで、コンピュータとのインタフェースを持ち、それぞれのオリゴヌクレオチド断片の量を決定し、その結果ＰＤＦを生産する。それぞれのオリゴヌクレオチドの適切な量を決定するコンピュータと、自動ロボットを連結することにより、完全な連結組換えシステムが提供されることになる。シリアルまたはその他のインタフェースによりリンクするデータにより、連結組換え計算から生じたデータファイルは、適切な形式で転送され、ロボットシステムが自動的にそれぞれ適切な量のオリゴヌクレオチド断片の反応試験管への分配を始める。
自 動システムには、一連の核酸配列変異子に由来する複数のオリゴヌクレオチド断片を含んでもよい。前述の断片は、特有のオーバーハングで次々に配列に参加する。また、システムはそれぞれの変異子配列における乗り換えイベントの目標数を保管するようにデータ入力が構成されている。システム内で、予測モジュールが、それぞれの断片が混合する量を決定するように設定され、そのため、断片の混合により、目標数に対応する乗り換えイベントのために子孫個体群の分子が強化される。このシステムはまた、ロボットの腕を、通信インタフェースを介して予想モジュールに連結し、決められた量の断片が自動的に混合されるようになっている。
【０１６６】
突然変異オリゴヌクレオチド
最適化指向的進化の方法では、親ポリヌクレオチド配列に１００％適合するオリゴヌクレオチドを利用することができるが、そこまでのレベルの適合は、必要とされていない。例えば、３つの関連する親ポリヌクレオチドが選択され、例えば、新規の表現型を生成するために、連結組換えが行われた場合には、特異的な重複領域を持つオリゴヌクレオチドは、通常の方法によって合成されてもよい。しかし、突然変異オリゴヌクレオチドもまた合成されうる。これらの突然変異オリゴヌクレオチドは、サイレント、保存または非保存アミノ酸を暗号化するように設計されるのが望ましい。
サイレント突然変異開始の選択は、例えば、断片に相同である領域であるが、最終的に翻訳タンパクに影響を与えないヌクレオチドを加えることによって行う。非保存または保存置換は、そのような変化が生じたポリペプチドの機能をどのように改変したかを決定するものである。例えば、ある特定のオリゴヌクレオチド断片における突然変異が、ペプチドの活性を増加させる原因であると決定された場合に、これを行うことができる。突然変異オリゴヌクレオチド（例、親とは異なるヌクレオチド配列を有するもの）を合成することにより、制御された形で、ペプチドまたはタンパク質配列への改変がペプチドまたはポリペプチドの活性に影響を与えるかを調査することができる。
突然変異断片を利用した核酸配列の変異子のその他の方法は、殆どの該変異子に保管されているが、すべての該変異子には保管されていない、変異子内の境界画定サイトを決定するために、複数の核酸配列を最初に整列させる過程を含む。保管核酸配列の第１の配列断片は、その後生成されるが、ここで、断片は、境界画定サイトにおいて互いに結合する。その後、非保管核酸配列の２番目の断片が例えば核酸合成器等により生成される。しかし、保管されていないため、配列は生成されると、境界画定サイトにおいて突然変異を起こし、２番目の断片は、境界画定サイトにおいて、該第１の断片と同一のヌクレオチド配列を有することになる。これにより、親配列への連結反応中でも、非保管配列が雑種形成を行えるようになる。一旦断片が生成されると、それぞれの変異子に対し所望の回数の乗り換えイベントを選択することができる。その後第１および第２の断片それぞれの量が計算され、第１および第２の断片の計算された量の間の連結／培養反応により、子孫が所望する回数の乗り換えイベントを有することになる。
【０１６７】
Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏまたは、コンピュータ、モデル
Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏと呼ばれるコンピュータプログラムによるパラダイムが本発明の方法の実施において、改変または新規の核酸が新規の表現型の生成のために細胞を改変するのに使用されうる。新規の表現型の生産用に人工ポリヌクレオチド配列を生成する本発明の方法の実施に利用できるｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方式の一例は、複数のテンプレートポリヌクレオチド間で共有されたドメインを検出する。それは、テンプレートポリヌクレオチド整列させ特定の相同性の割合、例えば、すべてのテンプレートポリヌクレオチド間で共有される約７５％〜９５％の配列ＩＤを持つすべての配列系を特定することによって行われる。これによりテンプレートポリヌクレオチド間の共有ドメインが検出されることになる。次にドメイン配列は、対応するドメインの配列を有する１つのテンプレートポリヌクレオチドから切り換えられる。これは、すべてのドメインがもう一つのテンプレートポリヌクレオチド上の対応するドメインと切り換えられるまで繰り返され、それにより、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ、つまりテンプレートポリヌクレオチドからの人工ポリヌクレオチド配列のライブラリーが生成される。
Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ、またはコンピュータプログラムによる方法は、本発明の方法の実施において、代謝フラックスデータの分析に利用できる；例えば以下を参照のこと：Ｃｏｖｅｒｔ （２００１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２６（３）：１７９−１８６；Ｊａｍｓｈｉｄｉ （２００１）生物情報学１７（３）：２８６−２８７。例えば、主要炭素源（例えば、細菌の場合には、酢酸または琥珀酸）取り込み率、酸素取り込み率、および最大限細胞成長率の量的関係のモデルが、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで作成され、本発明の「リアルタイム」または「オンライン」モニターに補完的に利用される。例えば以下を参照のこと：Ｅｄｗａｒｄｓ （２００１） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １９（２）：１２５−１３０。中枢代謝経路における遺伝子決失の影響のモデルも、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで作成し本発明の「リアルタイム」または「オンライン」モニターに補完的に利用される。例えば以下を参照のこと：Ｅｄｗａｒｄｓ （２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７（１０）：５５２８−５５３３．
【０１６８】
代謝要因の測定
本発明の方法は、全細胞進化または全細胞工学に関連し、新規の表現型を有する新しい細胞種の開発をするものである。新規の表現型を検出するためには、改変細胞上の少なくとも１つの代謝因子を細胞内で「リアルタイム」または「オンライン」の状況でモニターする必要がある。一面として、細胞培養等の複数の細胞が「リアルタイム」または「オンライン」でモニターされる。また一面として、複数の代謝因子が「リアルタイム」または「オンライン」でモニターされる。
代謝フラックス分析（ＭＦＡ）は、周知の生物化学構成に基づくものである。線状に独立した代謝マトリクスは、質量保存の法則、および細胞内代謝産物の偽安定相前提（ＰＳＳＨ）に基づいて構築されている。本発明の方法の実施においての方法の実施で、以下を含む代謝ネットワークが構築されている：
すべての経路基質、生成物および中間代謝物の特定、
互いに経路代謝産物を取り換えるすべての化学反応、経路反応の化学量論を特定、
反応を引き起こす全ての酵素、酵素反応動態の特定、
経路成分間の規定相互作用、例えば、アロステリック相互作用、酵素−酵素相互作用等、
酵素の細胞内区分化またはその他すべての酵素の超分子構成、および
代謝産物、酵素またはエフェクター分子、またはその動きに対する拡散障害に関して存在するすべての濃度勾配。
一旦特定の種の代謝ネットワークが構築されると、マトリクス概念の数理表示が導入され、オンラインメタボロームデータが入手可能であれば、細胞内代謝フラックスを評価する。
【０１６９】
代謝表現型は、細胞内の全代謝ネットワークの変化に依存する。代謝表現型は、環境状況、遺伝規定、発達状態および遺伝子型等に関する経路の変化に依存する。本発明の一面においては、オンラインＭＦＡ計算の後、細胞の動的性質、その表現型およびその他の特性が、経路の利用を調査することにより分析される。例えば、酵母菌の発酵中にブドウ糖の供給が増加し、酸素が減少すれば、呼吸経路の利用が減少および／または中止され、発酵経路の利用が独占的になる。細胞培養の生理学的状態の管理は、経路分析で可能となる。本発明の方法は、どのように基質の供給、温度、誘発子の使用等を決定することで発酵を操作し、細胞の生理学的状態を好ましい方向に持って行くかということに有効である。本発明の方法の実施において、ＭＦＡ結果は、代謝工学または遺伝子シャッフリング等の分野で実験やプロトコルのデザインをするために、トランスクリプトームおよびプロテオームデータと比較される。
本発明の方法の実施において、細胞における新規のまたは改良された特徴を含むすべての改変された、または新規の表現型は協議され検出されることができる。代謝または成長に関するすべての局面はモニターが可能である。
【０１７０】
ｍＲＮＡ転写発現のモニター
本発明の一面においては、設計された表現型は、ｍＲＮＡ転写発現の増加または減少、または細胞内の新しい転写の発生からなる。ｍＲＮＡ転写、またはメッセージは、例えば、ノーザンブロット、定量増幅反応、アレイ雑種形成等の当分野において周知の方法で検出および定量化される。定量増幅反応には、例えば定量逆転写ポリマラーゼ連鎖またはＲＴ−ＰＣＲのような定量ＰＣＲ、定量リアルタイム ＲＴ−ＰＣＲ、または「リアルタイム動態ＲＴ−ＰＣＲ」が含まれる。（例えば以下を参照のこと：Ｋｒｅｕｚｅｒ （２００１） Ｂｒ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ．， １１４：３１３−３１８；Ｘｉａ （２００１）移植７２：９０７−９１４）。
本発明の一面においては、設計された表現型は、相同遺伝子の発現をノックアウトすることで生成される。遺伝子の暗号化配列または１つ以上の転写管理要因、例えばプロモーターエンハンサーをノックアウトすることができる。つまり、転写の発現は、完全に除去されるかまたは減少するのみとなる。
本発明の一面においては、設計された表現型は、相同遺伝子の発現の増加からなる。これは、シスーまたはトランスーの形で作用する転写規定要因を含む否定的管理要因のノックアウト、または肯定的管理要因の突然変異により影響を受ける。
以下に詳細を説明するように、アレイ上に固定された核酸の雑種形成により、細胞の転写、または転写を代表する、または補完関係にある核酸からなるサンプルの雑種形成により、細胞の１つ以上またはすべての転写が測定される。
【０１７１】
ポリペプチド、ペプチドおよびアミノ酸の発現のモニター
本発明の一例においては、設計された表現型は細胞内のポリペプチドの発現または新規のポリペプチド生成の増加または減少である。ポリペプチド、ペプチドおよびアミノ酸は、当分野で周知のすべての方法によって検出されまた定量化することができ、そのような方法には、以下が含まれる：磁器共鳴分光器（ＮＭＲ）、分光測定法、Ｘ腺写真（タンパク放射能標識）、電気泳動、毛細電気泳動、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）、高拡散クロマトグラフィ、また、例えば、免疫沈澱、免疫拡散、免疫電気泳動、放射免疫検定法（ＲＩＡｓ）、酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡｓ）、免疫蛍光検定法、ゲル電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、抗体による染色、蛍光活性細胞分類（ＦＡＣＳ）、熱分解質量分析法、フーリエ変換赤外線分光計、ラマン分光計、ＧＣ−ＭＳ、およびＬＣ−エレクトロスプレーおよびキャップ−ＬＣ−タンデム−エレクトロスプレー質量分析法等の多様な免疫学的方法。新規の生物活性もまた米国特許番号６，０５７，１０３に記述された方法またはその変形によってスクリーニングされる。また以下に詳細を説明するように、細胞の、１つ以上またはすべてのポリペプチドは、タンパクアレイを使用して測定することができる。
生合成的に導かれた、タンパク質構成アミノ酸の分別１３Ｃ識別は、均一に１３Ｃで識別された混合物および、非識別炭素源化合物を生物反応ネットワークに供給することによってモニターすることができる。生じた識別パターンの分析により、ネットワークの位相の総合的特徴づけおよびアミノ酸の代謝フラックス比決定ができる。；例えば以下を参照のこと：Ｓｚｙｐｅｒｓｋｉ （１９９９） Ｍｅｔａｂ． Ｅｎｇ． １：１８９−１９７．
【０１７２】
代謝産物および生合成経路の発現のモニター
一面として、一次的および二次的代謝産物は測定した代謝要因である。関連した一次的および二次的代謝産物はすべてリアルタイムでモニターすることができる。例えば、測定した代謝要因は、一次的および二次的代謝産物の増加または減少からなる。二次的代謝産物は、例えば、グリセロールまたはメタノールである。測定した代謝要因は、酢酸、酪酸、琥珀酸およびオキサロ酢酸のような有機酸の増加または減少からなり得る。一面として、測定した代謝要因は、酢酸、酪酸、琥珀酸およびオキサロ酢酸のような有機酸の増加または減少からなる。
どの代謝産物、または代謝または生合成経路を「オンライン」または「リアルタイム」でモニターするかの選択は、どの表現型が追加または改変されたいかに依存する。例えば、リモネンおよびピロリン酸ゲラニルのその他の下流代謝産物は「オンライン」または「リアルタイム」で米国特許番号６，２９１，７４５にあるようにモニターすることができ、ここでは植物内の昆虫駆除の手段を生成するのにモニターされている。例えば、枯草菌の浮遊物内の代謝産物／抗生物質を、効果的な昆虫、抗菌性および抗生物質因子についてモニターすることができる。例えば以下を参照のこと：米国特許番号６，２９１，４２６。本発明の方法はまた、トリカルボン酸および糖分解の代謝産物をモニターするのにも利用できる。Ｓａｕｅｒは以下の文献で枯草菌種に利用している：（１９９７） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：４４８−４５２（彼はまた分別１３Ｃ識別および二次元核磁器共鳴分光器も利用している）。ペニシリン生合成経路も、例えば、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍにリアルタイムでモニターすることができる；例えば以下を参照のこと：Ｎｉｅｌｓｅｎ （１９９５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． １１（３）：２９９−３０５；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ （１９９５） Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４３（１）：１２３−１３０． アスパラギン結合（Ｎ−結合）糖分解化がリアルタイムで研究できる；例えば以下を参照のこと：Ｎｙｂｅｒｇ （１９９９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ６２（３）：３３６−３４７。加水分解物補充媒体下で成長させた細胞培養内のペプチドから遊離されたアミノ酸の量をリアルタイムで研究できる。；例えば、Ｎｙｂｅｒｇ （１９９９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ６２（３）：３２４−３３５参照、彼はまた混合媒体（加水分解物を含む）の中で成長したチャイニーズハムスターの卵巣細胞の経路フラックスを研究した。本発明の方法は、またブドウ糖、乳酸、およびパルミチン酸に対するＡＴＰ収率を含むミトコンドリア内の最大限ＡＴＰ生産のフラックス分布をモニターするのに利用することができる。；例えば以下を参照のこと：Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ （２００１） Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｇｕｌ． Ｉｎｔｅｇｒ． Ｃｏｍｐ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２８０（３）：Ｒ６９５−７０４。細菌のブドウ糖媒体内、例えば、最低限のブドウ糖媒体における成長について、本発明の方法は中枢代謝経路、糖分解、ペントースリン酸経路、およびトリカルボン酸サイクルのうちの７つの必須反応のモニターにも利用することができる。
【０１７３】
遺伝子改変においては、これらの酵素を暗号化する７つの遺伝子を３つのカテゴリーに分けることができる：（１）ペントースリン酸経路遺伝子、（２）三炭素糖分解遺伝子、および（３）トリカルボン酸サイクル遺伝子。例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ （２０００） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． １６（６）：９２７−９３９参照。
細胞内 ｐＨのモニター
一面として、測定した代謝要因は、細胞内ｐＨまたは細胞媒体内細胞外ｐＨの増加または減少からなる。細胞内ｐＨの増加または減少は、細胞内に染料を使用することによって測定することができる。染料の蛍光の変化が経時的に測定されてもよい。
細胞内ｐＨを決定する方法であれば、どのシステムを使用することもできる。染料が使用された場合には、１つの方法例としては、全域時間ドメイン蛍光寿命イメージング（ＦＬＩＭ）を使用することができる。ＦＬＩＭは、混合発蛍光団の濃度比の定量イメージング、および発蛍光団環境に摂動を定量イメージングするのに使用される；ＦＬＩＭでは、画像のコントラストは、２次元画像のそれぞれの点において蛍光寿命から引き出される（例えば、Ｃｏｌｅ （２００１）Ｊ． Ｍｉｃｒｏｓｃ． ２０３（Ｐｔ ３）：２４６−２５７参照）。近距離場走査光学顕微鏡（ＮＳＯＭ）は、高解像度の走査プローブ技術で、同時に光学および局所画像を数十ナノメートルの空間的解像度で得ることに使われる（例えば、Ｋｗａｋ （２００１） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７３（１４）：３２５７−３２６２参照）。周波数ドメイン蛍光寿命イメージング顕微鏡（ＦＬＩＭ）では、３次元ナノセカンド蛍光寿命画像の測定と再生が可能である。（例えば、Ｓｑｕｉｒｅ （１９９９） Ｊ． Ｍｉｃｒｏｓｃ． １９３（ Ｐｔ １）：３６−４９参照）．
【０１７４】
ガスの発現のモニター
一面として、測定した代謝要因は、ガス交換率測定からなる。ガスならば、例えば、酸素、一酸化炭素、二酸化炭素、窒素等すべてモニターできる。例えばＦｏｌｌｓｔａｄ （１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ６３（６）：６７５−６８３を参照のこと。
スクリーニング法と「オンライン」モニタリング装置
本発明法の実施において、リアルタイムの代謝流束分布解析で細胞内の人工表現型を特定するために、「リアルタイム」または「オンライン」細胞モニタリング装置を使用する。これらの装置はどんなスクリーニング法とでも合わせて使用することができる。
細胞成長モニター装置
ある面では、多数の代謝パラメータのリアルタイムでのモニタリングは細胞成長モニター装置で処理されている。そのような装置の一例としては、Ｗｅｄｇｅｗｏｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（カリフォルニア州サンカルロス市）製の６５２型Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｏｎｉｔｏｒ がある。この装置はブドウ糖などの培地の摂取量、有機酸（例：酢酸塩、酪酸、コハク酸、オキサロ酢酸）などの細胞内の中間体のレベル、アミノ酸のレベルを含む様々な代謝パラメータを「リアルタイム」または「オンライン」でモニターすることができる。どんな細胞成長モニター装置でも使用することができ、限界なく、どんなパラメータの組合せでも測定できるように変更可能である。細胞成長モニター装置はどんな測定装置やモニタリング装置とでも合わせて使用できる。熱分解質量分析法や、フーリエ変換赤外線スペクトル分光法、ラマンスペクトル分光法、ＧＣ−ＭＳ、液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレー、およびキャップ／液体クロマトグラフィー／タンデム型エレクトロスプレー質量分析法などを使用した、全細胞レベルでの代謝の高速分析方法が存在している。
【０１７５】
キャピラリーアレイ解析
ポリペプチド、核酸、代謝物、副産物、抗生物質、金属などを含む様々な構成物を制限なくスクリーニングしたりモニターするのに、「バイオチップ」アレイ解析（以下参照）に加え、カリフォルニア州サンディエゴ市のＤｉｖｅｒｓａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製のＧＩＧＡＭＡＴＲＩＸＴＭなどのキャピラリーアレイ解析が使用される。キャピラリーアレイ解析は、試料を維持したりスクリーニングするためのもう一つのシステムで、例えば試料スクリーニング機器には、試料維持のために、管腔を明確にする各毛細管が少なくとも一つの壁を構成するように配列された複数の毛細管を包含したり、さらに、隣接した毛細管の配列の間に間質物質を置き、またその間質物質の中に一つ以上の参考用のしるしを構成したものなどを含むことができる。試料をスクリーニングするための毛細管の配列に結束された毛細管には、試料を維持するための管腔を明確にする一つの壁と、試料を刺激するために管腔に伝えられた刺激力をフィルターするためのフィルター物質からなるもう一つの壁を含むことができる。
例えばリガンドなどのポリペプチドや核酸は、最初の構成物の少なくともキャピラリーアレイ解析の毛細管の一部に導入することができる。各キャピラリーアレイ解析の毛細管は、最初の構成物を維持するための管腔を明確にする壁を少なくとも一つ含み、最初の構成物背後の毛細管に空泡を導入している。二つ目の構成物は、最初の構成物と空泡で分離されるように毛細管に導入することができる。関心のある試料は、探知可能な分子でラベル付けをした最初の液体としてキャピラリーアレイ解析の毛細管に導入することができ、そのキャピラリーアレイ解析の毛細管は最初の液体と探知可能な分子を維持するための管腔を明確にする壁を少なくとも一つ含み、またその少なくとも一つの壁は、探知可能な分子を少なくとも一つの壁に拘束するための結束物質でコーティングされている。さらにこの手法では、探知可能な分子を毛細管に結束させたままで、最初の液体を毛細管より除去し、二つ目の液体を毛細管に導入する過程を含むことも可能である。
キャピラリーアレイ解析には、管腔を明確にする外壁を少なくとも一つ包含する個別の毛細管を多数含むことができる。その毛細管の外壁は、一つ以上の壁が融合されたものでも構わない。またその壁は、液体や試料を維持できるようになっているなら、円柱、正方形、六角形、あるいは他のどんな幾何学的な形をしている管腔でも形成できる。キャピラリーアレイ解析の毛細管は、密接に結束して平面構造を形成することもできる。毛細管の結束は、融合（例：ガラスでできた毛細管）、接着剤での接合、結合、または並列して締め金で締めるのでもよく、キャピラリーアレイはいくつの毛細管からでも形成することができる（例：１００から４００万個の毛細管）。一つのキャピラリーアレイは、１０万個以上の個別の毛細管の結束から成るマイクロタイタープレートで形成されているのでも構わない。
【０１７６】
アレイまたは「バイオチップ」
本発明のある局面においてモニターされているパラメータは、転写産物である。細胞の一個以上、あるいはすべての転写産物は、その細胞の転写産物を形成する試料、転写産物の代表／補足的な核酸の交雑、またはアレイ／「バイオチップ」上の不動核酸の交雑により計測される。マイクロチップ上の核酸「アレイ」を使用することで、細胞のいくつか、あるいはすべての転写産物を同時に定量できる。ゲノム核酸よりなるアレイも、本発明法により製造される新しい人工的素質の遺伝子型を確定するのに使用でき、「ポリペプチドアレイ」も同時に複数のタンパク質を定量するのに使用できる。
本発明は、すべての既知の「アレイ」（「マイクロアレイ」、「核酸アレイ」、「ポリペプチドアレイ」、「抗体アレイ」、「バイオチップ」、その他多種）を用いて実施できる。アレイは、一般に複数の「箇所」または「目的要素」で、各目的要素は一定量の一つ以上のオリゴ核酸のような生物学的分子からなり、ｍＲＮＡ転写産物などのサンプル分子への特定の結束のため、培地表面の決められた位置に固定される。
本発明法を実施するにあたり、既知のアレイやアレイの製造／使用法は、全体的、部分的、あるいはその他様々な、例えば次の特許や文献に描写された方法で、組合わせることができる：米国特許６，２７７，６２８、６，２７７，４８９、６，２６１，７７６、６，２５８，６０６、６，０５４，２７０、６，０４８，６９５、６，０４５，９９６、６，０２２，９６３、６，０１３，４４０、５，９６５，４５２、５，９５９，０９８、５，８５６，１７４、５，８３０，６４５、５，７７０，４５６、５，６３２，９５７、５，５５６，７５２、５，１４３，８５４、５，８０７，５２２、５，８００，９９２、５，７４４，３０５、５，７００，６３７、５，５５６，７５２、５，４３４，０４９号； また例えば、ＷＯ９９／５１７７３、ＷＯ９９／０９２１７、ＷＯ９７／４６３１３、ＷＯ ９６／１７９５８；また例えば、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ の論文（『Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ』１９９８年８号Ｒ１７１−Ｒ１７４ページ）、Ｓｃｈｕｍｍｅｒの論文（『Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ』１９９７年２３号１０８７−１０９２ページ）、Ｋｅｒｎの論文（『Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ』１９９７年２３号１２０−１２４ページ）、Ｓｏｌｉｎａｓ−Ｔｏｌｄｏの論文（『Ｇｅｎｅｓ， Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ＆ Ｃａｎｃｅｒ』１９９７年２０号３９９−４０７ページ）、Ｂｏｗｔｅｌｌの論文（『Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ』１９９９年追加号 ２１号２５−３２ページ）；また、米国公開特許２００１００１８６４２、２００１００１９８２７、２００１００１６３２２、２００１００１４４４９、２００１００１４４４８、２００１００１２５３７、２００１０００８７６５号。本発明は、カリフォルニア州サンタクララ市Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ 社製のＧｅｎｅＣｈｉｐｓＴＭ やテキサス州ヒューストン市Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社製のＳｐｅｃｔｒａｌＣｈｉｐＴＭ Ｈｕｍａｎ ＢＡＣ Ａｒｒａｙｓ などのすべての既知のアレイとその取扱説明書を使用することができる。
【０１７７】
抗体と免疫ブロット
本発明法を実施するにあたり、特定のポリペプチドや多糖類を分離、特定、定量するのに抗体が使用できる。抗体は、免疫沈降反応、染色（例：ＦＡＣＳ）、免疫親和性カラムなどに使用でき、希望する場合は特定の抗原用に配列された核酸を免疫により生成し、続けてポリペプチドや核酸の隔離、ポリペプチドの増幅／単離や本発明のアレイ上への固定を行う。他に、本発明法は変更される細胞により産出される抗体構造を修正するのに使用することもでき（例：抗体の親和力の増加や減少）、さらに、抗体を産出、あるいは修正できる能力は表現型として、本発明法で人工的に細胞に組み込むことができる。
抗体（ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体）の免疫法、産出法、および分離法は当業者間で知られており、科学系文献や特許などに記載されている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ編『ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ』 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ， Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ社出版（１９９１年）、Ｓｔｉｔｅｓ（編者）『ＢＡＳＩＣ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ』（第７版）カリフォルニア州ロスアルトス市Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社出版（「Ｓｔｉｔｅｓ」）、Ｇｏｄｉｎｇ編『ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ』（第２版）Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ， ＮＹ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社出版 （１９８６年）、Ｋｏｈｌｅｒの論文（『Ｎａｔｕｒｅ』１９７５年２５６号４９５ページ）、Ｈａｒｌｏｗ著『ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ』Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社出版， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８年）参照）。実験動物を用いた従来の生体内方法に加え、抗体は例えばファージライブラリーを表示する組換え抗体の結束部を使用して試験管内で生成することもできる（例えばＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍの論文（『Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ』１９９７年１５号６２−７０ページ）、Ｋａｔｚの論文（『Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ』１９９７年２６号２７−４５ページ）参照）。
【０１７８】
細胞源と細胞培養
本発明は、リアルタイム代謝流束分布解析を用いて、新しい表現型からなる全細胞を工学的に設計する方法を提供している。細菌、始原細菌、哺乳類、酵母、真菌類、昆虫、および植物の細胞などを含む、すべての細胞は工学的に設計することができる。本発明のある局面において、細胞は異種核酸を細胞に加えることによって修正される。異種核酸は、細菌、哺乳類、酵母、昆虫、および植物細胞などを含む様々な細胞の核酸より分離、単離、再生できる。
概して細胞は、患者などの個人より採取した組織や体液から取ることもできる。細胞は一人の患者から採取したヒト細胞などのような同種細胞でも、一人のヒトの胃腸管から採取した細菌や酵母細胞などの異種細胞でもよく、またリンパ系・リンパ節、血清、血液、腱血、コロニー刺激因子や骨髄採取見本、便、唾液、涙、組織、外科生検材料、針・穿孔生検材料などから採取したものでも構わない。
細胞の成長および維持のための機器、例えばバイオリアクターや発酵タンクなどは何でも使用できる（例：米国特許６，２４２，２４８、６，２２８，６０７、６，２１８，１８２、６，１７４，７２０、６，１６８，９４９、６，１３３，０２２、６，１３３，０２１、６，０４８，７２１、５，６６０，９７７、５，０７５，２３４号）。
【０１７９】
リアルタイム代謝流束分布解析
本発明法において、細胞の少なくとも一つの代謝パラメータがリアルタイムで、つまりリアルタイム、または「オンライン」流束分布解析でモニターされる。他には、培地内の細胞の多数のパラメータが同時にリアルタイムでモニターされる。通常の分析方法では、代替代謝経路間におけるリアルタイムでの培地、中間体、生産物の分布にはアクセス不可能であるため、本発明は「オンライン」か「リアルタイム」のメタボローム・データを伴う代謝流束分布解析法（ＭＦＡ）を組み込んでいる。したがって、計算により、発酵中の代謝流束分布が定量できる。この流束定量と遺伝子表現分析や他の洗練された実験的技術は、生理学的、ゲノム学／プロテオーム学的データの情報内容を、細胞機能や規制の解明に向けてアップグレードするために組合わせられる。それにより、有機体の行動を理解するのに非常に好ましくかつ必要な、代謝経路への看破が可能になる。
代謝流束分布解析法（ＭＦＡ）とは、代謝工学の分析技術のことで、培地からバイオマスや生産物へできるだけ多くの炭素を送り込むことを目的とした細胞代謝研究と関連して使用されてきた。以下の例１は、本発明法において使用できる代謝流束分布解析法（ＭＦＡ）の例を総合的に記述している。
「メタボローム」とは比較的研究の浅い分野で、全細胞代謝の分析を包含している。メタボロームは機能的生物学への見識を得るための強力な新しい手段を提供し、細胞内の数多くの小分子レベルのスナップ写真、またこれらのレベルが異なる状況下でどのように変化するかを提示してきた。これらの研究は、伝染病、生産、モデル有機体、ヒト細胞や植物の研究に積極的に応用されている遺伝子やポリペプチド表現研究（ゲノム学とプロテオーム学）に対し非常に相補的である。本発明は、リアルタイム代謝流束分布解析法を利用して新規・修正表現型からなる全細胞を工学的に設計する方法を提供することで、「メタボローム」を研究するための改善された方法論を提供している。
【０１８０】
本発明法の実施において、細胞制御は、ゲノムのレベル、トランスクリプトームのレベル、プロテオームのレベル、またメタボロームのレベルなど様々な階層的レベルで研究できる。表現（「トランスクリプトーム」明確化）と翻訳レベル（「プロテオーム」明確化）での細胞のゲノムの幅広い分析が現在多くの興味を集めている一方で、第三レベルの分析、つまり「メタボローム」の分析は不思議なことに現在まで未研究のままである。「メタボローム」という用語は、興味の対象となる浮遊細胞（あるいは他のサンプル）内にあるすべての小分子量代謝物の全補体のことを指している。様々な生理学的状態にあるメタボロームの測定、特に本発明法を使用した測定は、機能ゲノム学という目的の下には、かなり差別的になってしまう傾向にあると思われる。
ゲノム（細胞内の総遺伝子物質）は、有機体の反応のレパートリーをすべて特定する。複数の有機体のゲノムは既に完全に配列済みで、その他多くはほぼ完成、あるいは完成にかなり近づいている（多くの寄生動植物を含む）。系統的ゲノム配列プログラムによって現在までに配列された遺伝子の中で、その機能が信頼できる根拠を持って知られているものは半数以下となっている。技術の進歩により、現在では、どの発展段階にある遺伝子表現でも、どのような生理学的状態にある遺伝子表現でも分析できる。このような分析は、転写の段階で行い、ノーザン法やより効果的な交雑アレイ技術を使用することで、様々な組合せの条件、つまり「トランスクリプトーム」の下で、どの遺伝子が表現されているか確認できる。似通った分析は、翻訳の段階で「プロテオーム」、つまり細胞のすべての補体タンパク質を明確にするために行うことができる。高度な画像分析のための二次元電気泳動やコンピュータ・ソフトウェアの進歩により、１−２ ｘ １０３ タンパク質の分解が２０ｃｍ ｘ ２０ｃｍプレート上で可能になり、また、データベース検索と連結した質量分析法は高速でのタンパク質同定法を提供している。トランスクリプトームにおける変化は細胞の変化に対する最初の反応を表しており、一方プロテオームにおける変化は、高分子レベルでの最終反応を示している。本発明法で分析されたレベルの一つである第三レベルの分析は「メタボローム」の分析であり、特定の生理学的、あるいは発展的状態にある細胞に存在する、すべての低分子量分子の定量補体を含んでいる。
【０１８１】
したがって、発明の他の局面でモニターされている代謝物レベルは、細胞機能の定量分析において計測する最適な変数になる。代謝物は、トランスクリプトームやプロテオームにおける変化の下流における増幅を表しており、さらに代謝物は表現を操縦し、ゲノムと代謝間の繋がりとして働くことで、フィードバック経路のネットワークを通して遺伝子表現を規制している。メタボローム中の代謝物の数も、およそ絶対値の次数ほど、トランスクリプトームやプロテオーム中の遺伝子産物の数より少なくなっている（典型的な真核生物細胞は、およそ１０５の遺伝子と、１０４の表現型の異なるタンパク質とを含んでいるが、既知の異なる代謝物はおよそ１０３しか持っていない）。したがって、中間代謝を理解しその知識を探求するために、メタボロームの変化の方が、トランスクリプトームやプロテオームの変化より意味があり、その探知および探究もはるかに容易である。
生来の科学的興味に加え、メタボロームを経て特定の代謝病変部を同定することで、本発明法は、全細胞における潜在的に新奇な調合薬や農薬の対象物を探知することに繋がるであろう。本発明法は、機能試験法の設計にも用いることができ、これらの結果より、対象となる代謝物のみが特定の高度な処理能力や機械学的試験のために研究されるよりシンプルな試験を設計することができるであろう。
本発明のメタボローム分析には、オンラインで非侵略的技術という利点がある。静的メタボローム分析は、トランスクリプトームやプロテオーム分析と比較して、多くの有機体においては代謝物の数の方が遺伝子やタンパク質の数よりも著しく低いという理由で、いくつかの利点がある一方で、この分析方法には本質的に不利な点もあった。すなわち、生化学により代謝経路に関する情報を生成できる一方で、代謝物と遺伝子の間には直接的な繋がりがないのである。さらに、濃縮物や、ある代謝物の存在そのものの分析にも問題があった。既存の赤外線スペクトル分光法、質量分析法、核磁気共鳴分光法などの同定技術はいくらかの情報を産出したが、その使用は限られており、生細胞を適切に分析することはできなかった。本発明法は、「オンライン」または「リアルタイム」の非侵略的技術を提供することで、この問題を解決した。本発明法における、この「オンライン」または「リアルタイム」という古い技術に欠けていた時間的次元が、この方法における生細胞分析能力の重要な要素となっている。
【０１８２】
代謝流束分布解析法（ＭＦＡ）は強力な分析ツールで、吸収／排泄率、成長率、生産物やバイオマス収率などの観察された細胞外現象を、細胞内炭素流束とエネルギー分布に連結することができる。本発明の「オンライン」または「リアルタイム」ＭＦＡは、大腸菌、出芽酵母、ハイブリドーマ（参照例：Ｋｅａｓｌｉｎｇ の論文（『Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ』１９９８年５号、５８（２−３）号２３１−２３９ページ）、Ｐｒａｍａｎｉｋ の論文（『Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ』１９９８年６０（２）号２３０−２３８ページ）、Ｎｉｓｓｅｎ ら著（１９９７年）、Ｓｃｈｕｌｚｅ ら著（１９９６年）、Ｆｏｌｌｓｔａｄ ら著（１９９９））、リジン生産とコリネバクテリウム・グルタミクムにおける変異の効果（参照例：Ｖａｌｌｉｎｏの論文（『Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ』２０００年６７（６）号８７２−８８５ページ）、Ｖａｌｌｉｎｏ ＆ Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ著（１９９３年、１９９４年）、Ｐａｒｋ ら著（１９９７年）、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ の論文（『Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ』１９９８年２５４（１）号９６−１０２ページ））、枯草菌におけるリボフラビンの生産（参照例：Ｓａｕｅｒら著（１９９６年、１９９８年）、Ｓａｕｅｒ の論文（『Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ』１９９７年１５号４４８−４５２ページ））、ペニシリウム・クリソゲナムにおけるペニシリンの生産（Ｎｉｅｌｓｅｎの論文（『Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ』 １９９５年１１（３）号２９９−３０５ページ）、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎの論文（『Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ』１９９５年４３（１）号１２３−１３０ページ））、およびチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるペプチドアミノ酸の代謝（参照例：Ｎｙｂｅｒｇ の論文（『Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ』１９９９年６２（３）号３２４−３３５ページ）、Ｎｙｂｅｒｇ の論文（『Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ』１９９９年６２（３）号３３６−３４７ページ））などの生理学探究に利用できる。
【０１８３】
さらに、本発明の「オンライン」または「リアルタイム」ＭＦＡは、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、質量分析法（ＭＳ）やガスクロマトグラフィー・質量分析法（ＧＣＭＳ）などと組合わせて無益回路、反応可逆性の度合、活性経路に関する入手困難な情報の産出に使用できる（参照例：Ｓｚｙｐｅｒｓｋｉ の論文（『Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ』１９９９年１号１８９−１９７ページ）、Ｓｚｙｐｅｒｓｋｉ の論文（『Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ』１９９８年３１号４１−１０６ページ）、Ｓｚｙｐｅｒｓｋｉの論文（『Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ』１９９５年２３２（２）号４３３−４４８ページ）、Ｓｚｙｐｅｒｓｋｉ ら著（１９９７年）、Ｓｃｈｍｉｄｔ ら著（１９９８年）、Ｋｌａｐａ の論文（『Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ』１９９９年６２（４）号３７５−３９１ページ）、Ｍｏｌｌｎｅｙ ら著（１９９９年）、Ｐａｒｋ ら著（１９９９年）、Ｗｉｅｃｈｅｒｔ ら著（１９９９年）、Ｗｉｔｔｍａｎｎ ＆ Ｈｅｉｎｚｌｅ著（１９９９年））。シリング、エドワーズ、パルソンはゲノムデータの分析と細胞ネットワークの構造的特性を含み（参照例：Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇの論文（『Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ』２０００−２００１年７１（４）号２８６−３０６ページ）、Ｅｄｗａｒｄｓ ＆ Ｐａｌｓｓｏｎ著（１９９８年）、Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ ら著（１９９９年ａ，ｂ））、多くの微生物の詰込節におけるＣ（３）からＣ（４）代謝物の相互変換をモニターするために（参照例：Ｐｅｔｅｒｓｅｎの論文（『Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ』２０００年２７５（４６）号３５９３２−３５９４１ページ））、さらにＭＦＡの利用を拡張した。
ＭＦＡにおいて、すべての主要な細胞内反応の細胞内流束は、化学量論的モデルを用いて、細胞内代謝付近の質量収支を応用することによって計算される。計算の入力として、一式の測定済みの流束、概して培地の吸収率と代謝物の排泄率が用いられる。
本発明の斬新な「リアルタイム」または「オンライン」代謝流束分布解析法は、一定の環境状況下、あるいは遺伝子規制と共に、生物学的システムで合成された一組の完全な代謝物に関するデータを提供することができる。本発明の「リアルタイム」または「オンライン」ＭＦＡ法は、非常に複雑な一式のメタボローム・データも提供することができる。本発明のＭＦＡ法は、複雑な生物学的システムの体系的反応を記述するために、取得したデータの取扱い、保存、正常化、評価に適したツールとなりうる。図１は、実際の組織培養、発酵時期における、研究されている種族の新しい表現型、経路利用、組織反応を確認するための、本発明によるＭＦＡの新しい適用法を図示しており、その結果は、発酵後分析にも、代謝の即時的制御にも使用できる。
【０１８４】
本発明の「オンライン」または「リアルタイム」法は、実験的手法の代謝ネットワーク（我々の生化学的知識とゲノム／プロテオーム情報データベースより構成）の流束分布を概算するために、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）やガスクロマトグラフィー・質量分析法（ＧＣＭＳ）などのような他の分析手段を組み込むことができる。これらの手段により、研究中の生物学的システムの「スナップ写真」が定期的（例：研究されている代謝パラメータ数や使用されている機器数に応じて、およそ１分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分あるいは３０分毎）に取得できる。
代謝データのベクトル ｒ
本発明の「オンライン」ＭＦＡ法は、「変化率」データ、すなわち現在の代謝計測値と前回の計測値の差を使用する。この差は使用前にエラー分析のために計算され、「未処理計測値」ベクトルに保存される。つまり、ある意味で、使用するデータの質を確認するために、計測値のエラーを除く目的で、ＭＦＡの前に「前処理装置」が使用される。下記の例１参照。
コンピュータシステム
一面で、本発明法はコンピュータを使用した方法／プログラムを使って、計測された代謝パラメータの時間の経過に伴う変化をリアルタイムでモニターする。本発明法は、どんなプログラム言語やコンピュータ／プロセッサでも使用でき、実在のどんなソフトや方法論とも組合わせて実施できる。例えば、マスマティカ （イリノイ州シャンペン市Ｗｏｌｆｒａｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）と呼ばれるプログラムのマスマティカ ４．１や他のバージョンなどが使用できる。以下の例１参照。（参照例：Ｊａｍｓｈｉｄｉ の論文（『Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ』２００１年１７（３）号２８６−２８７ページ）、 Ｗｉｌｓｏｎの論文（『Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ』２００１年９１（３）号２８１−３０４ページ）、Ｔｏｒｒｅｃｉｌｌａの論文（『Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ』２００１年７６（５）号１２９１−１３０７ページ））。
本発明法を実施するために使用するコンピュータ／プロセッサは、従来の汎用デジタルコンピュータでもよく、例えば、マイクロプロセッサやデータ転送バスなどの従来の要素を含む、個人用「ワークステーション」型コンピュータも使用できる。このコンピュータ／プロセッサには、さらにダイナミックＲＡＭやフラッシュメモリーなどのメモリー要素や、磁気ディスク任意記憶装置のような大容量記憶装置も含まれる。
例えば、インテルのマイクロプロセッサをベースに、ウィンドーズ・オペレーティングシステムを使用している従来のパソコンなどが利用できる。本発明法の実施にあたっては、どんなハードやソフトのコンフィギュレーションでも使用できる。例えば、他のよく知られたマイクロプロセッサをベースに、ユニックス、リナックス、マックなどのオペレーティングシステムを使用したコンピュータも考えられる。
【０１８５】
例
下記の例は、本発明の請求内容を制限するものではなく、説明するために提示されている。
例 １ ：代謝流束分布解析法（ ＭＦＡ ）
下記の例は、本発明法で細胞培養のリアルタイム分析に適応される、典型的な代謝流束分布解析法（ＭＦＡ）の実施例を記述している。図１
代謝流束分布解析法（ＭＦＡ）は代謝工学における重要な分析技術である。流束収支は、様々な代謝物を相互連結するダイナミック物質収支方程式を得るために代謝システム内の各代謝物（ｙｉ）ごとに記録できる。一般に、化合物ｍと代謝流束ｎを含む代謝ネットワークでは、すべての一時的な物質収支は単一の行列方程式により表示できる：
ｄＹ／ｄｔ ＝ Ａ Ｘ（ｔ） −ｒ（ｔ）
Ｙ： 細胞毎の代謝物数のｍ 次元ベクトル
Ｘ： 代謝流束ｎ
Ａ：化学量論的ｍ ｘ ｎ マトリックス
ｒ：計測値からの特定率のベクトル
細胞成長と過程動力の時間定数と比較して、一時的代謝を特徴づける時間定数は通常非常に高速なので、物質収支は安定状態での行動のみ考慮するように簡易化される。派生物の産出除去：Ａ Ｘ（ｔ） ＝ ｒ（ｔ） 。
ｍ ≧ ｎ で、Ａ の列がフルランクであるとすると、上記方程式の重み付き最小二乗解はＸ ＝ （ＡＴＡ）−１ＡＴ ｒ となる。
この解の感性はマトリックスで探索することができる：
ｄＸ／ｄｒ ＝ （ＡＴＡ）−１ＡＴ
【０１８６】
上記マトリックスの要素は、計測値のエラーや摂動に関連した、個々の流束の変化を確認するのに有用である。
インプット
化学量論的方程式
化学量論的マトリックスは、分析に用いるため化学方程式より派生した。このマトリックスは反応に携わる化学種の係数より構成しており、横列は種を、縦列は方程式を表している。例えば、細胞におけるエネルギー生産の方程式を考えた場合、次のようになる：
２ ＮＡＤＨ ＋ Ｏ２ ＋ ６ ＡＤＰ → ２ ＮＡＤ ＋ ２ Ｈ２Ｏ ＋ ６ ＡＴＰ
２ ＦＡＤＨ ＋ Ｏ２ ＋ ４ ＡＤＰ → ２ ＦＡＤ ＋ ２ Ｈ２Ｏ ＋ ４ ＡＴＰ
ＡＴＰ → ＡＤＰ
このシステムは、３本の縦列と、全システムで対象となる種の数に匹敵する数の横列を持つ化学量論的マトリックスを産出する。この場合、８種が対象となっているので、マトリックスは３ｘ８となる。
Figure 2004536553
これらのテンプレートを使用すると、化学量論的マトリックスは３５ ｘ ３３となる（これはエクセル９７のファイル「ｓｔｏｉｃｈｉｅｘ．ｘｌｓ」に入っている）。これが上述のマトリックス「Ａ」で、下記の３３個の化学方程式より派生している。
【０１８７】
１． 中間代謝経路
１） ＧＬＣ ＋ ＡＴＰ ＋ ＮＡＤ → ２ ＰＹＲ ＋ ＡＤＰ ＋ ＮＡＤＨ ＋ Ｈ２Ｏ
２） ＰＹＲ ＋ ＮＡＤＨ → ＬＡＣ ＋ ＮＡＤ
３） ＰＹＲ ＋ ＮＡＤ → ＡＣＣＯＡ ＋ ＣＯ２ ＋ ＮＡＤＨ
４） ＡＣＣＯＡ ＋ ＯＡＡ ＋ ＮＡＤ ＋ Ｈ２Ｏ → ＡＫＧ ＋ ＣＯ２ ＋ ＮＡＤＨ
５） ＡＫＧ ＋ ＮＡＤ → ＳＵＣＣＯＡ ＋ ＣＯ２ ＋ ＮＡＤＨ
６） ＳＵＣＣＯＡ ＋ ＡＤＰ ＋ Ｈ２Ｏ ＋ ＦＡＤ → ＦＵＭ ＋ ＡＴＰ ＋ ＦＡＤＨ
７） ＦＵＭ ＋ Ｈ２Ｏ → ＭＡＬ
８） ＭＡＬ ＋ ＮＡＤ → ＯＡＡ ＋ ＮＡＤＨ
９） ＧＬＮ ＋ ＡＤＰ → ＧＬＵ ＋ ＮＨ３ ＋ ＡＴＰ
１０） ＧＬＵ ＋ ＮＡＤ → ＡＫＧ ＋ ＮＨ３ ＋ ＮＡＤＨ
１１） ＭＡＬ → ＰＹＲ ＋ ＣＯ２
２． バイオマス合成： Ｃ５０．５％ Ｈ８．３１％ Ｏ３２．９３％ Ｎ８．２６％
１２） ０．１０１６ ＧＬＣ ＋ ０．０３１ ＧＬＮ ＋ ０．００８ ＡＲＧ ＋ ０．０００３ ＡＳＮ ＋ ０．００１ ＧＬＵ ＋ ０．００３８ ＧＬＹ ＋ ０．００２８ ＨＩＳ ＋ ０．００７１ ＩＬＥ ＋ ）．００８ ＬＥＵ ＋ ）．００４３ ＬＹＳ ＋ ０．００１ ＭＥＴ ＋ ０．０１５２ ＴＨＲ ＋ ）．００５１ ＶＡＬ → バイオマス
３． アミノ酸代謝
１３） ＰＹＲ ＋ ＧＬＵ → ＡＬＡ ＋ ＡＫＧ
１４） ＳＥＲ → ＰＹＲ ＋ ＮＨ３
１５） ＧＬＹ → ＳＥＲ
１６） ＣＹＳ → ＰＹＲ ＋ ＮＨ３
１７） ＡＳＰ ＋ ＡＫＧ → ＯＡＡ ＋ ＧＬＵ
１８） ＡＳＮ → ＡＳＰ ＋ ＮＨ３
１９） ＨＩＳ → ＧＬＵ ＋ ＮＨ３
２０） ＡＲＧ ＋ ＡＫＧ → ２ ＧＬＵ
２１） ＰＲＯ → ＧＬＵ
２２） ＩＬＥ ＋ ＡＫＧ → ＳＵＣＣＯＡ ＋ ＡＣＣＯＡ ＋ ＧＬＵ
２３） ＶＡＬ ＋ ＡＫＧ → ＧＬＵ ＋ ＣＯ２ ＋ ＳＵＣＣＯＡ
２４） ＭＥＴ → ＳＵＣＣＯＡ
２５） ＴＨＲ → ＳＵＣＣＯＡ ＋ ＮＨ３
２６） ＰＨＥ → ＴＹＲ
２７） ＴＹＲ ＋ ＡＫＧ → ＧＬＵ ＋ ＦＵＭ ＋ ２ ＡＣＣＯＡ
２８） ＬＹＳ ＋ ２ ＡＫＧ → ２ ＧＬＵ ＋ ２ ＣＯ２ ＋ ２ ＡＣＣＯＡ
２９） ＬＥＵ ＋ ＡＫＧ → ＧＬＵ ＋ ３ ＡＣＣＯＡ
【０１８８】
４． 抗体形成：
３０） １．０５ ＡＲＧ ＋１．９８ ＡＳＮ ＋ １．９６ ＡＳＰ ＋ １．４２ ＧＬＵ ＋１．３１ ＧＬＹ ＋１．５９ ＩＬＥ ＋ ３．７９ ＬＥＵ ＋ １．９７ ＬＹＳ ＋０．６７ ＭＥＴ ＋ ０．９５ ＰＨＥ ＋ ５．７２ ＳＥＲ １．３２ ＴＨＲ ５．０５ ＴＹＲ ＋２．６８ ＶＡＬ → 抗体
５． エネルギー生産：
３１） ２ ＮＡＤＨ ＋ Ｏ２ ＋ ６ ＡＤＰ → ２ ＮＡＤ ＋ ２ Ｈ２Ｏ ＋ ６ ＡＴＰ
３２） ２ ＦＡＤＨ ＋ Ｏ２ ＋ ４ ＡＤＰ → ２ ＦＡＤ ＋ ２ Ｈ２Ｏ ＋ ４ ＡＴＰ
３３） ＡＴＰ → ＡＤＰ
このマトリックスを他の数学ソフトで使用するためには、テキストファイルに転換する必要がある。数字を含む欄のみハイライトし、「編集」メニューより「コピー」を選択し、マイクロソフト・ウィンドウズ（登録商標）３．１１／９５／ＮＴなどに付いてくるテキストエディタプログラム「ノートパッド」のようなメモ（または単純なテキストエディタ）文書にペーストし、このファイルをメモ文書にテキストファイル（＊．ｔｘｔ）として保存する。
特定の摂取率
特定の摂取率は細胞培養リアクターのデータより計算し、このデータは適切な化学種に相当した割合のベクトルｒ、つまり上記の化学量論的マトリックスの横列として、テキストファイル形式で保存する必要がある。提供されているテンプレート中、特定の摂取率は、エクセル９７ファイル「ｒａｔｅｘ．ｘｌｓ」およびテキストファイル（エクセルからエクスポート）「ｒａｔｅ．ｔｘｔ」にリストされている。
【０１８９】
計算
好ましい形式でインプットが準備できたら、次は数学ソフトのパッケージを使って内部流束の概算を計算する。使用するソフトはマトリックス計算と微分方程式の扱いが可能なものにする。一つのテンプレートはマスマティカ ３．０で作成され、「ｍｆａｍａｔｈ．ｎｂ」と命名されている。以下の節では、計算はマスマティカ ３．０で行われたものと仮定しますが、一般的な手続きは適当なパッケージならどれを使っても適用できる。
データ読み込み
まず、ＳｅｔＤｉｒｅｃｔｏｒｙ コマンドを使ってディフォルトディレクトリーを設定する：
例：ＳｅｔＤｉｒｅｃｔｏｒｙ［”ａ：＼ｍｆａ＼”］
それからデータが読み込まれ、マトリックスＡ（化学量論的マトリックス用）とベクトルｒ （特定の摂取率用）に保存される。
例：Ａ＝ＲｅａｄＬｉｓｔ［”ｓｔｏｉｃｈｉ．ｔｘｔ， Ｎｕｍｂｅｒ， ＲｅｃｏｒｄＬｉｓｔｓ −−＞ Ｔｒｕｅ］
ｒ ＝ ＲｅａｄＬｉｓｔ［”ｒａｔｅ．ｔｘｔ， Ｎｕｍｂｅｒ， ＲｅｃｏｒｄＬｉｓｔｓ −−＞ Ｔｒｕｅ］
感性分析
次に、感性マトリックス（ｄＸ／ｄｒ）が（ＡＴＡ）−１ＡＴ で計算される。
例：ｓｅｎｓ ＝ Ｉｎｖｅｒｓｅ［Ｔｒａｎｓｐｏｓｅ［Ａ］．Ａ］．Ｔｒａｎｓｐｏｓｅ［Ａ］
解答とエラー分析
流束分布の最小二乗の概算ｘ とエラー ｅ が、方程式の優決定システムのために計算される。
例：ｘ ＝ ｓｅｎｓ．ｒ
ｅ ＝ ｒ Ａ．ｘ
【０１９０】
結果の出力
流束概算の算出後、結果を提示するにはテキストファイルに書き込まなければならない。提供されているテンプレ−トには３つの結果がテキストファイル形式で含まれており、「ｆｌｕｘ．ｔｘｔ 」にはベクトル ｘ、「ｅｒｒｏｒ．ｔｘｔ 」にはエラーベクトル、「ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．ｔｘｔ 」には感性マトリックスが保存されている。マスマティカで上記のようなテキストファイルを作成するには、次の手順に従う。
例：ａ１ ＝ ＯｐｅｎＷｒｉｔｅ［”ｆｌｕｘ．ｔｘｔ”． ＦｏｒｍａｔＴｙｐｅ −＞ ＯｕｔｐｕｔＦｏｒｍ］；
Ｗｒｉｔｅ［ａ１， ＴａｂｌｅＦｏｒｍ［ｘ， ＴａｂｌｅＳｐａｃｉｎｇ −＞ ｛０，１｝］］； Ｃｌｏｓｅ［ａ１］
結果の提示
この分析の重要な点は、多大な数の流束の概算を効率的、かつ明確に提示することである。マスマティカ から出力されるテキストファイルは、エクセルにインポートし、内容を棒グラフとして作図することができる。
Figure 2004536553
【０１９１】
エクセル９７ファイルの「ｍｆａｅｘｃ．ｘｌｓ」は、各流束のデータ表と棒グラフを示すテンプレートで、流束をまとめて図示し、代謝経路を集めた合成棒グラフも含んでいる（以下参照）。
他のデータ提示方法としては、適切な代謝経路の図表上のすべての内部流束を示す方法がある。パワーポイントのテンプレートファイル「ｍｆａ．ｐｐｔ」は、流束の絶対値を示すために棒グラフで代謝図表（エクセルファイル「ｍｆａｅｘｃ．ｘｌｓ」とリンクしているので、「ｍｆａ．ｐｐｔ」ファイルを開く前にこのファイルを開く必要あり）を表している。エクセルファイルとパワーポイントのプレゼンテーションの間にはリンクがあるので、エクセル上のデータをアップデートする場合はプレゼンテーション内のリンクもアップデートする必要がある。
有機酸とアミノ酸をモニターするデバイス
有機酸とアミノ酸をモニターするオンラインデバイスは、本発明法の実施にあたっても使用できる。例えば、ある面でＢＩＯ＋ＯＮ−ＬＩＮＥＴＭ（ウィスコンシン州ミルウォーキー市Ｌａｃｈａｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）は、ほぼリアルタイムで発酵と哺乳類細胞の培養過程のモニターができ、製品産出を最大限にするための決定的な情報を提供する。カートに固定されたこのデバイスは、発酵貯蔵所まで運んでいき、ストリームセクターのバルブを通して接続できる。そこから、イオン排除クロマトグラフィーを用い、有機酸を水準として、自動的にアンモニア、ブトウ糖、グルタミン酸、グルタミン、グリセロール、乳酸塩、リン酸塩の化学構成物を個別にモニターする。ＢＩＯ＋ＯＮ−ＬＩＮＥＴＭとは統合標本抽出システムで、後述の利点を示すＦＬＯＷＮＡＭＩＣＳＴＭフィルタープローブと組合わせたポンプシステムを用いて、この難問に対する真の解決策を提供する。すなわち、その場で殺菌可能、物質を容器に再循環するバイパスフィルターを排除したことによる危険のない標本抽出、無菌で細胞のいらない標本抽出、すべての容器のサイズに適応すること、最小限のデッドボリュームで、一貫し適確な標本抽出保証／洗浄時間短縮、バイオプロセス環境に伴う温度、圧力、粘度、せん断力、化学構成物に持ち応える丈夫なデザインと構造である。
【０１９２】
ＢＩＯ＋ＯＮ−ＬＩＮＥは、フローインジェクション分析を用いて、最高４つのアナライトを同時に確認できる。反応モジュールを除去し、他のモジュールと置き換えることができるので、ユーザーは異なる発酵／バイオプロセスの必要条件に合わせて装置をカスタマイズすることができる。また、イオンクロマトグラフィーの導管は他の液体クロマトグラフィー（ＬＣ）のニーズに合わせてカスタマイズすることもできる。検出器は伝導性検出がデフォルトとなっているが、ユーザーは紫外線検出器、屈折率検出器、その他の検出器や自前のカラムを装置に接続し、カスタマイズされたＬＣ分離条件に合わせることができる。このシステムや、他の様々なシステムは、好気性菌、嫌気性菌、ならびに酵母、真菌類、藻類、昆虫類、哺乳類の細胞培養に適用できる。
本発明の実施にあたって使用できる他の関連デバイスには、ｓｕｂ−ｐｐｂから百分率濃縮まで、様々な試料マトリックスにおけるイオン種の確定力を最大限にするため、高度な試料処理能力とシンプルで敏速な手法転換を可能にするＱＵＩＫＣＨＥＭＴＭ８０００（ウィスコンシン州ミルウォーキー市Ｌａｃｈａｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）が含まれている。
当業者なら、本発明が目的を遂行し、上述の結果や利点、さらに生来持っている結果や利点を得るのに適していることを即座に理解するであろう。ここで記述されている手法は、現時点で典型的な局面を代表しているもので、発明の範囲を限定するものではない。当業者間では、発明の範囲内での変化や他の用法は将来起きてくるもので、これは本発明の精神に包含され、請求項目の範囲で定義されるものである。
【０１９３】
３． 変更：指令進化法
本明細書に記した発明は、組換えを通じて、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質のような高度に複雑な線状配列の方向付けられた分子進化を可能にするような、縮小的再組合せ（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）、組換えおよび選択への反復サイクルの使用に関する。
分子のインビボシャッフリングは、組換え多量体に対する細胞の天然の特性を用いて行うことができる。インビボにおける組換えは、分子多様性への主要な自然経路を提供するが、遺伝的組換えは、以下の点に関連して、依然比較的複雑な方法である：１）相同性の認識；２）組換えキアズマ形成に繋がる、鎖の切断、鎖の侵入（ｉｎｖａｓｉｏｎ）、および代謝の過程；並びに最後に、３）個別の組換え分子へのキアズマの解離（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）。キアズマの形成は、相同配列の認識を必要とする。 好ましい態様において、本発明は、少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドからハイブリッドポリヌクレオチドを作出する方法に関する。本発明は、適当な宿主細胞へ、部分的配列相同性の少なくとも１領域を共有する少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドを導入することによる、ハイブリッドポリヌクレオチドの作出に使用することができる。この部分的配列相同領域は、ハイブリッドポリヌクレオチドを作出する配列の再組織化を生じるような方法を促進する。本明細書において使用される用語「ハイブリッドポリヌクレオチド」とは、本発明の方法により生じかつ少なくとも２種の本来のポリヌクレオチド配列由来の配列を含むようなヌクレオチド配列のいずれかを意味する。このようなハイブリッドポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子間の配列組込みを促進する分子間組換え事象により生じ得る。加えてこのようなハイブリッドポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子内のヌクレオチド配列を変更するために反復配列を利用する、分子内縮小的再組合せ法により作成することができる。
【０１９４】
本発明は、生物学的活性のあるハイブリッドポリペプチドをコードし得るハイブリッドポリヌクレオチドを作出する手段を提供する。ある局面において、本来のポリヌクレオチドは、生物学的活性のあるポリペプチドをコードしている。本発明の方法は、得られるハイブリッドポリヌクレオチドが本来の生物学的活性のあるポリペプチドに由来した活性を示すポリペプチドをコードしているように、本来のポリヌクレオチドの配列を組込むような細胞処理を用いて、新規ハイブリッドポリペプチドを作出する。例えば本来のポリヌクレオチドは、様々な微生物由来の特定の酵素をコードすることができる。ある生物由来の第一のポリヌクレオチドによりコードされた酵素は、例えば、高塩分のような特定の環境条件下で効果的に機能することができる。異なる生物の第二のポリヌクレオチドによりコードされた酵素は、極端な高温のような様々な環境条件下で効果的に機能することができる。第一および第二の本来のポリヌクレオチド由来の配列を含むハイブリッドポリヌクレオチドは、本来のポリヌクレオチドでコードされた両方の酵素の特徴を発揮する酵素をコードすることができる。従って、ハイブリッドポリヌクレオチドによりコードされた酵素は、第一および第二のポリヌクレオチドでコードされた各々の酵素により共有された環境条件下、例えば高塩分および極端な温度で、効果的に機能することができる。
本発明の本来のポリヌクレオチドによりコードされた酵素は、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、異性化酵素、およびリガーゼを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の方法から得られるハイブリッドポリペプチドは、本来の酵素においてはディスプレイされない特定化された酵素活性を示すことができる。例えば加水分解酵素活性をコードしているポリヌクレオチドの組換えおよび／または縮小的再組合せの後、得られるハイブリッドポリヌクレオチドでコードされたハイブリッドポリペプチドは、各々の本来の酵素から得られた特定化された加水分解酵素活性、すなわち加水分解酵素が作用する結合の種類および加水分解酵素が機能する温度についてスクリーニングすることができる。従って、例えば加水分解酵素は、本来の加水分解酵素（ｈｙｄｒｏｌｙａｓｅｓ）からハイブリッド加水分解酵素を識別するそれらの化学的機能性について確かめるためにスクリーニングすることができ、これは下記のようなものである：（ａ）アミド（ペプチド結合）、すなわちプロテアーゼ；（ｂ）エステル結合、すなわちエステラーゼおよびリパーゼ；（ｃ）アセタール、すなわちグリコシダーゼ、並びに例えばハイブリッドポリペプチドが機能する温度、ｐＨまたは塩濃度についてである。
【０１９５】
本来のポリヌクレオチドの供給源は、個別の生物（「単離体」）、制限培地中で増殖された生物の収集（「富化培養」）、または最も好ましくは未培養の生物から（「環境試料」）単離されうる。環境試料由来の新規生体活性をコードしているポリヌクレオチドを誘導する培養とは無関係の方法の使用が、生体多様性の利用されない給源に接近することができるので最も好ましい。
「環境ライブラリー」とは、環境試料から作成され、かつ適当な原核生物宿主において増殖することができるクローニングベクターにおいて実現される天然の生物の集合的ゲノムを表している。クローニングしたＤＮＡは最初に環境試料から直接抽出されるので、これらのライブラリーは、純粋な培養物において増殖することができる原核細胞の小さい画分に限定されない。加えてこれらの試料中に存在する環境ＤＮＡの標準化は、本来の試料中に存在する全ての種からのＤＮＡのより同等の提示を可能にする。これは、ドミナント種と比較して大きさが数桁下回って提示されることがある試料の少量の成分から関心対象の遺伝子を発見する効率を劇的に増加することができる。
例えば、１種以上の培養していない微生物から作成された遺伝子ライブラリーは、関心対象の活性についてスクリーニングされる。関心対象の生体活性分子をコードしている可能性のある経路は、最初に遺伝子発現ライブラリーの形で原核細胞において捕捉される。関心対象の活性をコードしているポリヌクレオチドは、このようなライブラリーから単離されかつ宿主細胞に導入される。この宿主細胞は、新規または増強された活性を伴う可能性のある活性を有する生体分子を作出する組換えおよび／または縮小的再組合せを促進する条件下で増殖される。
【０１９６】
ポリヌクレオチドが調製される微生物は、真正細菌および古細菌のような原核微生物、ならびに真菌、一部の藻類および原生動物のような比較的低等な真核微生物を含む。ポリヌクレオチドは、核酸が微生物の培養をせずに回収されるかまたは１種以上の培養された生物から回収される場合のように、環境試料から単離することができる。ある局面において、このような微生物は、極端を好む菌（ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｕｌｅｓ）、例えば超高熱菌、好冷菌、低温菌（ｐｓｙｃｈｒｏｔｒｏｐｈｓ）、好高塩菌、好高圧菌、および好酸菌である。極端を好む微生物から単離された酵素をコードしているポリヌクレオチドが特に好ましい。このような酵素は、陸上の温泉および深海熱水口の１００℃以上の温度、極地水の０℃以下の温度、死海の飽和塩環境、石炭堆積層および地熱イオウ分が豊富な温泉のような０近傍のｐＨ値、または下水スラッジの１１を超えるｐＨ値で機能することができる。例えば、極端を好む生物からクローングされかつ発現されたエステラーゼおよびリパーゼのいくつかは、広範な温度およびｐＨを通じて高い活性を発揮する。
前述のように選択および単離されたポリヌクレオチドは、適当な宿主細胞に導入される。適当な宿主細胞は、組換えおよび／または縮小的再組合せを促進することが可能な細胞のいずれかである。選択されたポリヌクレオチドは、好ましくは既に適当な調節配列を含むベクター内にある。この宿主細胞は、例えば哺乳類細胞のような高等真核細胞、または酵母細胞のような比較的低等な真核細胞であることができ、もしくは好ましくは宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であることができる。構築体の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン媒介型トランスフェクション法、または電気穿孔法により行うことができる（Ｄａｖｉｓら、１９８６）。
適当な宿主細胞の代表例としては、大腸菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓメラノーマのような動物細胞；アデノウイルス；ならびに植物細胞を挙げることができる。適当な宿主の選択は、本明細書の内容から当業者の範囲内であると思われる。
【０１９７】
特に組換えタンパク質を発現するために使用することができる様々な哺乳類細胞培養システムに関する哺乳類発現システムの例は、「ＳＶ４０形質転換されたシミアン細胞は、初期ＳＶ４０変異体の複製を支持する」（Ｇｌｕｚｍａｎ， １９８１）に記された、サル腎繊維芽細胞のＣＯＳ−７系、および共存性のあるベクターの発現が可能な他の細胞系、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株である。哺乳類発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにいずれか必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位および受容部位、転写終結配列、ならびに５’隣接する非転写配列を含むであろう。ＳＶ４０スプライシングおよびポリアデニル化部位由来のＤＮＡ配列は、必要な転写されない遺伝子エレメントを提供するように使用することができる。
関心対象のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択または遺伝子増幅に適するように変更された常用の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現について選択された宿主細胞でこれまでに使用されたものであり、かつ当業者には明らかであろう。特定の酵素活性を有することが確定されたクローンは、その後増強された活性を有する酵素をコードしているポリヌクレオチド配列を確定するために、配列決定される。
別の局面において本発明の方法は、１種以上のオペロン由来の生化学的経路をコードしている新規ポリヌクレオチド、またはそれらの遺伝子クラスターもしくは一部を作成するために使用することができるように構想されている。例えば、細菌および多くの真核生物は、その産物が関連したプロセスに関与しているような遺伝子を調節するための調和された機構を有する。これらの遺伝子は、クラスター化され、構造から単独の染色体上の「遺伝子クラスター」と称されており、かつクラスター全体の転写を開始する単独のプロモーターを含む単独の調節配列の制御下で一緒に転写される。従って遺伝子クラスターとは、通常はそれらの機能に関して同じまたは関連のある隣接遺伝子の群である。遺伝子クラスターによりコードされた生化学経路の例は、ポリケチドである。ポリケチドとは、生体活性の極端に豊富な給源分子であり、抗生物質（テトラサイクリンおよびエリロマイシンなど）、抗癌剤（ダウノマイシン）、免疫抑制剤（ＦＫ５０６およびラパマイシン）、ならびに獣医学的産物（モネンシン）を含んでいる。多くのポリケチド（ポリケチドシンターゼにより形成される）は治療物質として価値がある。ポリケチドシンターゼは、長さならびに官能性および環化のパターンが異なる多種多様な炭素鎖の生合成を触媒する多機能酵素である。ポリケチドシンターゼ遺伝子は、遺伝子クラスターに分類され、およびポリケチドシンターゼの少なくとも１種（タイプＩと称される）は、大きいサイズの遺伝子および酵素を有し、このことがこれらの遺伝子／タンパク質の遺伝的操作およびインビトロ試験を複雑化する。
【０１９８】
ポリケチドまたはそれらの断片のライブラリーから所望の成分を選択しかつ組合わせる能力、ならびに試験のための新規ポリケチド作成のためのポストポリケチド生合成遺伝子が明らかになっている。本発明の方法は、分子間組換えを通じての新規ポリケチドシンターゼ作出を促進することを可能にしている。
好ましくは、遺伝子クラスターＤＮＡは、様々な生物から単離することができ、かつベクターにライゲーションする、特にライゲーションした遺伝子クラスターからの検出可能なタンパク質の作出またはタンパク質関連アレイ活性を制御および調節することができる発現調節配列を含むベクターにライゲーションすることができる。内在性ＤＮＡ導入のための例外的に大きい容量を有するベクターの使用は、このような遺伝子クラスターでの使用に特に適しており、かつ大腸菌のｆ因子（稔性因子）を含むことが例として本明細書に記されている。この大腸菌のｆ因子は、接合時にそれ自身の高頻度の移行に作用するプラスミドであり、かつ混合微生物試料からの遺伝子クラスターのような、巨大なＤＮＡ断片を実現しかつ安定に増殖するのに理想的である。一旦適当なベクターにライゲーションされると、様々なポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターを含む２種以上のベクターを、適当な宿主細胞に導入することができる。これらの遺伝子クラスターと相同性を共有している部分配列の領域は、ハイブリッド遺伝子クラスターを生じる配列再構成を生じるプロセスを促進するであろう。その後この新規ハイブリッド遺伝子クラスターは、本来の遺伝子クラスターにおいては認められない増強された活性についてスクリーニングすることができる。
【０１９９】
従って、好ましい態様において本発明は、下記段階による、生物学的に活性のあるハイブリッドポリペプチドを作出し、かつこのようなポリペプチドを増強された活性についてスクリーニングする方法に関連している：
１）適当な宿主細胞へ、動作可能的にライゲーションされた少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび動作可能的に連結された第二のポリヌクレオチドを導入する段階であり、これらの少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドが部分配列相同性を少なくとも１領域共有しているような段階；
２）配列再構成を促進する条件下で宿主細胞を増殖し、動作可能的に連結されたハイブリッドポリヌクレオチドを生じる段階；
３）ハイブリッドポリヌクレオチドでコードされたハイブリッドポリペプチドを発現する段階；
４）増強された生物学的活性の同定を促進する条件下でハイブリッドポリペプチドをスクリーニングする段階；および
５）ハイブリッドポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離する段階。
様々な酵素活性をスクリーニングする方法が、当業者に公知であり、かつ本明細書において論じられている。このような方法は、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを単離する際に利用することができる。
本明細書において使用することができる発現ベクターの代表例は、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌の人工染色体、ウイルスＤＮＡ（例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病、およびＳＶ４０誘導体）、Ｐ１に基づいた人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、および関心対象の具体的な宿主に特異的ないずれか他のベクター（バシラス、アスペルギルスおよび酵母など）を挙げることができる。従って、例えばＤＮＡは、ポリペプチドを発現するための様々な発現ベクターのいずれかひとつに含むことができる。このようなベクターは、染色体性、非染色体性および合成ＤＮＡ配列を含む。適当なベクターの多数が、当業者に公知であり、かつ市販されている。下記のベクターを例として挙げることができる；細菌性：ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド、ｐＮＨベクター、ＺＡＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）；真核性：ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）がある。しかし、いずれか他のプラスミドまたは他のベクターを、宿主において複製および生存可能な限り使用することができる。低いコピー数または高いコピー数のベクターを、本発明において使用することができる。
【０２００】
本発明において使用するのに好ましい種類のベクターは、ｆ因子複製起点を含む。大腸菌におけるｆ因子（または稔性因子）は、接合時にそれ自身の高頻度の移行および細菌性染色体それ自身のより少ない頻度の移行に作用するプラスミドである。特に好ましい態様において、「フォスミド」または細菌性人工染色体（ＢＡＣ）ベクターと称されるクローニングベクターを使用する。これらは、ゲノムＤＮＡの大きいセグメントの安定した組込みが可能であるような大腸菌ｆ因子に由来している。混合未培養の環境試料由来のＤＮＡを組込む場合、これは安定した「環境ＤＮＡライブラリー」の形の巨大なゲノム断片を実現することを可能にする。
本発明において使用するのに好ましい別の種類のベクターは、コスミドベクターである。コスミドベクターは、最初にゲノムＤＮＡの巨大なセグメントをクローニングしかつ増殖するように設計された。コスミドベクターへのクローニングは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら、１９８９）において詳細に説明されている。
発現ベクター内のＤＮＡ配列は、ＲＮＡ合成を指示するのに適当な発現制御配列（複数）（プロモーター）に動作可能的に連結されている。特に言及された細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐを含む。真核プロモーターは、極初期ＣＭＶ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネインーＩを含む。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者には周知である。発現ベクターは同じく、翻訳開始および転写終結のためのリボソーム結合部位を含む。このベクターも、発現を増幅するための適当な配列から選択することができる。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを伴う他のベクターを用い、いずれか所望の遺伝子から選択することができる。
加えて、この発現ベクターは、真核細胞培養物についてのジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、または大腸菌におけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性のような、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性を提供する１種以上の選択マーカー遺伝子を含むことが好ましい。
【０２０１】
一般に組換え発現ベクターは、複製起点、例えば大腸菌およびＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＲＰｌ遺伝子のアンピシリン耐性遺伝子のような宿主細胞の形質転換をもたらす選択マーカー、ならびに下流の構造配列の転写を指示する高度に発現された遺伝子由来のプロモーターを含むであろう。このようなプロモーターは、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）のような解糖酵素、因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などをコードするオペロンに由来することができる。異種構造配列は、翻訳開始および終結配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外媒質への分泌を指示することが可能であるリーダー配列の適当な相において集成される。
クローニング戦略は、ベクター起動および内在性プロモーターの両方による発現を可能にし；ベクターの促進は、内在性プロモーターが大腸菌において機能しないような遺伝子発現において重要であろう。
微生物から単離されるかまたはそれに由来したＤＮＡは、選択されたＤＮＡについてプロービングする前に、ベクターまたはプラスミドに挿入することが好ましい。このようなベクターまたはプラスミドは、プロモーター、エンハンサーなどを含む、発現調節配列を含むものが好ましい。このようなポリヌクレオチドは、ベクターおよび／または組成物の一部であることができ、かつこのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではないように依然単離されている。特に好ましいファージまたはプラスミドおよびそれらへの導入およびパッケージングのための方法は、本明細書において言及されたプロトコールにおいて詳述されている。
【０２０２】
クローニングベクターの選択は採用された方法によって決まり、例えばベクターは、配列の反復コピーを増すか、または宿主細胞においてうまく形質転換および選択することができる配列を倍加するのに適当な容量を伴ういずれかのクローニングベクターであることができる。このようなベクターの一例は、「Ｐｏｌｙｃｏｓベクター：λファージパッケージング抽出物を用いる繊維状ファージおよびファージミドベクターのパケージングシステム」（Ａｌｔｉｎｇ−ＭｅｃｓおよびＳｈｏｒｔ， １９９３）に記されている。増殖／維持は、クローニングベクターにより保持された抗生物質耐性によるものであることができる。増殖期以降に、天然に短縮化された分子は、ゲルまたはカラム上のサイズ分画により回収されかつ同定されるか、もしくは直接増幅される。利用されたクローニングベクターは、長い構築体の挿入により破壊される選択可能な遺伝子を含むことができる。縮小的再組合せの進行に伴い、反復ユニット数が縮小され、かつ妨害された遺伝子は再度発現され、これによりプロセッシングされた構築体の選択が行われる。このベクターは、所望の生物学的特性を有する発現された産物の選択を可能にする発現／選択ベクターであることができる。挿入は、機能的プロモーターの下流に位置し、および所望の特性を適当な手段でスクリーニングすることができる。
インビボ再組合せは、細菌内で、一般に「ＲｅｃＡ依存」現象として見られるような、集合的に「組換え」と称される「分子間」のプロセスに焦点が当てられている。本発明は、配列を組換えおよび再組合せするための宿主細胞の組換え法、または欠失により細胞の準反復配列の複雑度を低下する縮小的方法を媒介する細胞の能力に頼ることができる。この「縮小的再組合せ」の方法は、「分子内」ＲｅｃＡ依存法により生じる。
従って、本発明の別の局面において、新規ポリヌクレオチドを、縮小的再組合せ法により作成することができる。この方法は、連続配列（本来のコード配列）を含む構築体を作成、それらの適当なベクターへの挿入、およびその後の適当な宿主細胞への導入に関する。個々の分子同定物の再組合せは、相同領域を有する構築体中の連続配列間、または準反復ユニット間において、コンビナトリアル法により行われる。再組合せ法は、反復配列の複雑度および程度を再度組合せおよび／または縮小し、かつ新規分子種の作成をもたらす。様々な処理を、再組合せ率を増すために適用することができる。これらは、紫外線処理、またはＤＮＡを損傷する化学物質、および／または「遺伝子不安定性」の増強されたレベルをディスプレイする宿主細胞系の使用を含むことができる。従ってこの再組合せ法は、相同的組換えまたはそれら自身の進化を示す準反復配列の天然の特性に関する。
【０２０３】
反復配列または「準反復」配列は、遺伝的不安定性において役割を果たす。本発明において、「準反復物」とは、それらの本来のユニット構造に対して制限されない反復物である。準反復ユニットは、構築体の配列アレイ；類似の配列の連続ユニットとして示すことができる。一旦ライゲーションされたならば、連続配列間の接合は、本質的に不可視となり、かつ得られる構築体の準反復性の性質は、ここでは分子レベルで連続している。この細胞の欠失法は、準反復配列間で得られる構築体の操作の複雑度の低下をもたらす。準反復ユニットは、ずれ事象が生じ得るような鋳型の実践上の制限のないレパートリーを提供する。従って、準反復物を含む構築体は、準反復ユニット内で欠失（おそらく挿入）事象が実際に生じ得る十分な分子弾性を効果的に提供する。
準反復配列が同じ方向、例えば頭から尾またはその逆でにライゲーションされる場合には、この細胞は個々のユニットを識別することはできない。結果的に、この縮小的プロセスは、この配列全体に発生し得る。対照的に、例えばこれらのユニットが、頭から尾よりもむしろ頭から頭へ示される場合には、この逆転は、隣接ユニットの終点（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）を線引きすることができ、その結果欠失の形成は、個別のユニットの喪失に有利となる。従って、本発明の方法にとって、これらの配列が同方向であることが好ましい。準反復配列の無作為な方向は、再組合せ効率の低下を招く一方で、これらの配列の一貫した方向は高効率を提供する。しかし、同方向の連続配列が減ることは効率を低下する一方で、新規分子の効果的回収に十分な弾性が提供されもする。構築体は、より高い効率をもたらすよう同方向の準反復配列で作成することができる。
【０２０４】
配列は、下記を含む様々な方法のいずれかを用いて、頭から尾へ構築することができる：
ａ）一本鎖で作成された場合に方向を提供するような、ポリＡ頭およびポリＴ尾を含むプライマーを利用することができる。これは、ＲＮＡから作成され、その後容易にＲＮＡｓｅＨで除去される、プライマーの最初の数塩基を有することによって実現される；
ｂ）独自の制限酵素部位を含むプライマーを利用することができる。複数の部位、一連の独自の配列、ならびに反復合成およびライゲーション段階が必要であると考えられる；
ｃ）プライマーの内側の２、３の塩基はチオール化され、かつエキソヌクレアーゼを使用して、適当に尾側の分子を作成する。
【０２０５】
再集合された配列の回収は、縮小されたＲＩを伴うクローニングベクターの同定に頼っている。その後再組合せされたコード配列は、増幅により回収することができる。これらの産物は再クローニングされ、かつ発現される。縮小されたＲＩを伴うクローニングベクターの回収は、下記により実現することができる：
１）該構築体の複雑度が低下した場合にのみ安定して維持される、ベクターの使用；
２）物理的方法による短縮化されたベクターの物理的回収
この場合、クローニングベクターは、標準のプラスミド単離法および標準の手法を利用するアガロースゲルまたは低分子量カットオフのカラムのいずれかを用いるサイズ分画を用いて、回収される；
３）挿入サイズが減少する場合に選択することができる切断された遺伝子を含むベクターの回収；
４）発現ベクターおよび適当な選択による直接の選択技術の使用。
関連生物に由来するコード配列（例えば遺伝子）は、高度の相同性を示し、かつ極めて多様なタンパク質産物をコードしている。これらの配列の種類は、本発明において準反復物として特に有用である。しかし、下記に説明された例はほぼ同じ本来のコード配列（準反復物）の再組合せを明らかにする一方で、この方法はこのようなほぼ同じ反復物に限定されるものではない。
以下の実施例は、本発明の方法を明らかにしている。３種の独自の種に由来したコード核酸配列（準反復物）について言及している。各配列は、個別の特性セットを伴うタンパク質をコードしている。各配列は、「Ａ」、「Ｂ」および「Ｃ」と称される配列内の独自の位置において１個または数個の塩基対が異なる。この準反復配列は、個別にまたは集合的に増幅されかつランダム集成体へとライゲーションされ、その結果全ての可能性のある順列および組合わせがライゲーションされた分子集団において利用可能になる。準反復ユニットの数は、集成条件により制御することができる。構築体内の準反復ユニットの平均数は、反復指数（ＲＩ）と定義される。
【０２０６】
一旦構築物が形成されると、該構築体は公表されたプロトコールに従うアガロースゲル上のサイズ分画、クローニングベクターへの挿入、および適当な宿主細胞へのトランスフェクションを行うことも行わないこともできる。その後これらの細胞は増殖され、かつ「縮小的再組合せ」が実施される。望ましいならば、縮小的再組合せ法の率は、ＤＮＡ損傷の導入により刺激することができる。ＲＩの縮小が、「分子内」機構による反復配列間の欠失の形成により媒介されるか、もしくは「分子間」機構による組換え様事象により媒介されるかのいずれであるかは、重要ではない。最終結果は、全ての可能性のある組み合わせへの分子の再組合せである。
任意に、本方法は、例えばタンパク質受容体、ペプチドオリゴ糖、ビリオンのようなあらかじめ定められた巨大分子、または他のあらかじめ定められた化合物または構造と結合さもなければ相互作用する能力を有する個々のシャッフリングされたライブラリーメンバー（例えば触媒抗体など）を同定するために、シャッフリングされたプールのライブラリーメンバーをスクリーニングする追加段階を含む。
このようなライブラリーから同定された、ディスプレイされたポリペプチド、抗体、偽ペプチド抗体、および変異領域の配列を、治療、診断、研究および関連目的（例えば触媒、水溶液の浸透圧を増大する溶質など）に使用することができ、および／または１種以上のシャッフリングおよび／または親和性選択の追加サイクルを施すことができる。この方法は、表現型の特性についての選択段階があらかじめ定められた分子への結合親和性以外（例えば触媒活性、安定性、酸化抵抗性、薬物耐性、または宿主細胞に付与された検出可能な表現型など）であるように変更することができる。
【０２０７】
本発明は、親和性相互作用スクリーニングに適したディスプレイされた抗体のライブラリーを作成する方法を提供することができる。この方法は、（１）ディスプレイされた抗体および該ディスプレイされた抗体をコードしている会合したポリヌクレオチドを含む第一の複数の選択されたライブラリーメンバーを得、かつ該ディスプレイされた抗体をコードしている会合したポリヌクレオチドを得、かつ得た会合したポリヌクレオチドまたはそのコピーを得る段階であり、ここで該会合したポリヌクレオチドと実質的に同じ変異領域フレームワーク配列領域を含んでいる段階、ならびに（２）該ポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、かつ組換えおよび縮小的再組合せを促進する条件下で細胞を増殖し、その結果シャッフリングされたポリヌクレオチドを生じる段階。シャッフリングされたプールにより構成されたＣＤＲ組合せは、第一の複数の選択されたライブラリーメンバー中に存在せず、該シャッフリングされたプールはＣＤＲ順列を含みかつ親和性相互作用スクリーニングに適したディスプレイされた抗体のライブラリーを構成する。任意にシャッフリングされたプールは、あらかじめ決定されたエピトープ（抗原）に結合するシャッフリングされたライブラリーメンバーの選択のために親和性スクリーニングが、およびそれによる複数の選択されたシャッフリングされたメンバーの選択が施される。さらに、複数の選択的にシャッフリングされたライブラリーメンバーがシャッフリングされ、かつ１〜約１０００サイクルまたは望ましいならば所望の結合親和性を持つライブラリーメンバーが得られるまで、反復スクリーニングされる。
【０２０８】
別の本発明の局面において、組換えまたは再組合せの前またはその期間に、本発明の方法により作成されたポリヌクレオチドは、本来のポリヌクレオチドへの変異の導入を促進する物質または方法にさらすことが構想されている。このような変異の導入は、得られるハイブリッドポリヌクレオチドおよびそれらによりコードされたポリペプチドの多様性を増大するであろう。変異を促進する物質または方法は、以下を含むことができるが、これらに限定されるものではない：（＋）−ＣＣ−１０６５、または（＋）−ＣＣ−１０６５−（Ｎ３−アデニン）のような合成アナログ（ＳｕｎおよびＨｕｒｌｅｙ， １９９２参照）；ＤＮＡ合成を阻害することが可能なＮ−アセチル化または脱アセチル化された４’−フルオロ−４−アミノビフェニル付加物（例えば、ｖａｎ ｄｅ Ｐｏｌｌら、１９９２参照）；または、ＤＮＡ合成を阻害することが可能なＮ−アセチル化または脱アセチル化された４−アミノビフェニル付加物（同じくｖａｎ ｄｅ Ｐｏｌｌら、１９９２， ｐｐ．７５１−７５８参照）；ＤＮＡ複製を阻害することが可能な三価クロム、三価クロム塩、多環式芳香族炭化水素（「ＰＡＨ」）ＤＮＡ付加物、例えば７ブロモメチルーベンズ［α］アントラセン（「ＢＭＡ」）、リン酸トリス（２，３−ジブロモプロピル）（「Ｔｒｉｓ−ＢＰ」）、１，２−ジブロモ−３−クロロプロパン（「ＤＢＣＰ」）、２−ブロモアクロレイン（２ＢＡ）、ベンゾ［α］ピラン−７，８−ジヒドロジオール−９−１０−エポキシド（「ＢＰＤＥ」）、ハロゲン化プラチナ（ＩＩ）塩、Ｎ−ヒドロキシ−２−アミノ−３−メチルイミダゾ−［４，５−ｆ］−キノリン（「Ｎ−ヒドロキシ−ＩＱ」）、およびＮ−ヒドロキシ−２−アミノ−１−メチル−６−フェニルイミダゾ［４，５ｆ］−ピリジン（「Ｎ−ヒドロキシーＰｈＩＰ」）。特に好ましいＰＣＲ増幅を遅延または停止する手段は、ＵＶ光（＋）−ＣＣ−１０６５および（＋）−ＣＣ−１０６５−（Ｎ３−アデニン）からなる。特に包含された手段は、ＤＮＡ付加物またはポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドプールに由来したＤＮＡ付加物を含有するポリヌクレオチドであり、これはさらにプロセッシングする前にポリヌクレオチドを含有する溶液を加熱することを含む方法により放出または除去することができる。
【０２０９】
飽和突然変異誘発
ある局面において本発明は、各アミノ酸部位において単一のアミノ酸置換の全範囲が表されるような、新しく作製した一連の子孫ポリペプチドを作製するために、特許権のあるコドンプライマー（縮重Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列を含む）の使用を提供し、点変異をポリヌクレオチドに導入する。使用されるオリゴは、第一の相同的な配列、縮重Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列、および好ましくは、しかし必ずしも必要ではない、第二の相同的な配列を、連続的に含む。Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列の縮重は全ての２０アミノ酸のコドンを含むため、そのようなオリゴの使用による下流側の子孫翻訳産物は、ポリペプチドに沿ったそれぞれのアミノ酸の部位でのすべての可能なアミノ酸変化を含む。
ある局面において、このような縮重オリゴ（一つの縮重Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔカセットからなる）の一つは、親ポリヌクレオチド鋳型の中のそれぞれの本来のコドンを、全範囲のコドン置換に供するために使用される。別の局面において、親ポリヌクレオチドの鋳型における少なくとも二個の本来のコドンを、全領域のコドン置換に供するために、同一のオリゴ又はそれ以外のどちらかの、少なくとも二個の縮重Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔカセットが使用される。したがって、一つ以上の部位でアミノ酸変異を導入するために、一個以上のＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列が、一個のオリゴの中に含まれうる。この複数のＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列は、直接的に連続している又は、一つもしくは複数の付加的なヌクレオチド配列によって分けられうる。別の局面において、アミノ酸の付加、欠損、および／もしくは置換の任意の組み合わせ又は順列を導入するため、付加や欠損を導入するために使用可能なオリゴは、単独でも又はＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列を含むコドンと組み合わせて使用されうる。
特別な例証において、連続的なＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔトリプレット、すなわち縮重（Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ）ｎ配列を含むオリゴを使用して、二つ又はそれ以上の連続したアミノ酸部位を同時に突然変異誘発させることが可能である。
別の局面において、本発明はＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列未満の縮重度をもつ縮重カセットの使用を提供する。例えば、Ｎがトリプレットの最初の、二番目の又は三番目の部位にあることができるような、たった一つのＮから成る縮重トリプレットを使用（例えばオリゴにおいて）することが、場合によっては望ましいであろう。その任意の組み合わせ及び順列も含む、任意の他の塩基を、トリプレットの残りの二つの位置で用いることができる。または、場合によっては縮重Ｎ，Ｎ，Ｎトリプレット、又はＮ，Ｎ，Ｇ／Ｃトリプレットを使用（例えば、オリゴにおいて）することが望ましいであろう。
【０２１０】
しかしながら、本発明において開示された、縮重トリプレット（Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ、又はＮ，Ｎ，Ｇ／Ｃトリプレット配列のような）の使用は、いくつかの理由で有利であると評価される。ある局面においては、本発明は、ポリペプチドにおけるそれぞれおよび全てのアミノ酸部位に、可能なアミノ酸（２０アミノ酸の合計に対して）の全ての範囲の置換を、系統的に、かつ、かなり容易に作製するための手段を提供する。したがって、１００アミノ酸のポリペプチドにとって、本発明は、系統的に、かつ、かなり容易に２０００の異なる種（すなわち、部位あたり２０の可能なアミノ酸×１００アミノ酸部位）を作製するための方法を提供する。縮重Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ又はＮ，Ｎ，Ｇ／Ｃトリプレット配列を含むオリゴの使用を通じて、２０の可能なアミノ酸をコードする３２の個々の配列が提供されることは評価される。したがって、親ポリヌクレオチド配列が、このようなオリゴを使った飽和変異法に供されるような反応容器において、２０の異なるポリペプチドをコードする３２の異なる子孫ポリヌクレオチドが作製される。対照的に、部位特異的突然変異誘発における非縮重オリゴの使用は、反応容器あたり一つの子孫ポリペプチド産物のみをもたらす。
本発明はまた、開示された縮重したプライマーとの組み合わせにおいて、随意的に使用うる非縮重オリゴの使用を提供する。いくつかの状況においては、作用ポリヌクレオチドに特定の点変異を作製するため、非縮重オリゴを使用することが有利であるとが評価される。これは、アミノ酸置換につながらない特異的なサイレント点変異、対応するアミノ酸変化をもたらす点変異、及び停止コドンの作製やポリペプチド断片の対応する発現を引き起こす点変異を作製するための手段を提供する。
したがって、本発明の好ましい態様において、全ての２０アミノ酸が、親ポリヌクレオチドにおいて変異されたコドン部位に対応する一つの特定のアミノ酸部位で現われるように、それぞれの飽和突然変異誘発反応の容器は、少なくとも２０の子孫ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドを含む。それぞれの飽和突然変異誘発反応容器から作製された３２重縮重子孫ポリペプチドは、クローン増幅（例えば発現ベクターを使って適切な大腸菌宿主にクローニングされる）に供され、発現スクリーニングに供されることが可能である。特性における好適な変化（親ポリペプチドと比較したとき）を提示するためのスクリーニングによって、個々の子孫ポリペプチドが同定される場合、その中に含まれる対応する好適なアミノ酸置換を同定するために配列決定されうる。
【０２１１】
本明細書に開示されたように飽和突然変異誘発法を用いて、親ポリペプチドにおける、それぞれのおよび全てのアミノ酸部位を変異させる場合、好ましいアミノ酸の変化が、一つ以上のアミノ酸部位で同定されうることが評価される。これらの好ましいアミノ酸置換の全てまたはその一部の組み合わせを含む、一つ又は複数の新しい子孫分子を作製することが可能である。例えば、もし２個の特定の好ましいアミノ酸の変化が、ポリペプチドの３アミノ酸部位のそれぞれにおいて同定されるならば、順列はそれぞれの部位で三つの可能性（本来のアミノ酸が変化しない場合及び、二つの好ましい変化それぞれの場合）および３つの部位を含んでいる。したがって、既に検討された７つの可能性、つまり、６個の単一の点変異（すなわち三つの部位のそれぞれにおける２つ）及び、どの位置でも変化のない場合を含む、３×３×３、又は２７の全可能性がある。
更に別の局面において、部位飽和突然変異誘発法は、スクリーニングを通じて、シャッフリング、キメラ化、組換え、および他の変異方法と一緒に使用されることが可能である。本発明は、飽和突然変異誘発法を含む、反復方法における任意の変異方法の使用を提供する。ある例示においては、任意の変異方法の反復的な使用が、スクリーニングと組み合わせて使用される。
したがって、非制限的例示において、本発明は、ハイブリットポリヌクレオチドが組換え及び還元的再組み合わせ（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）によって作製されるように、二つ又はそれ以上の関連するポリヌクレオチドが適切な宿主細胞に導入されるような方法などの、追加的な変異方法と組み合わせた、飽和突然変異誘発法の使用を提供する。
【０２１２】
遺伝子の全配列に沿って突然変異を行うと共に、当発明は、ポリヌクレオチド配列におけるかなり多数の塩基のそれぞれを突然変異で置換できる（突然変異させる塩基の数は、できれば１５から１００，０００までの全整数）と規定している。したがって、分子に沿った全位置を突然変異させるのではなく、独立した数の塩基（できれば１５から１００，０００からなる部分集合）をすべて突然変異させることができる。可能であれば、各位置、あるいは位置の集合を突然変異させるために、ポリヌクレオチド配列と共に、別のヌクレオチドを使用する。突然変異させる３ つの位置の集合はコドンである可能性があり、その突然変異は可能であれば非相同カセット（突然変異カセットとも言う）を含む、変異導入プライマーを使用して行う。好ましいカセットは１つの塩基から５００の塩基を持っており、上記の非相同カセット内の各ヌクレオチド位置は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ／Ｃ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｔ、Ｃ／Ｇ、Ｃ／Ｔ、Ｇ／Ｔ、Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ａ／Ｇ／Ｔ、Ａ／Ｃ／Ｔ、Ａ／Ｃ／Ｇ、Ｅで、このＥはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ以外の一つの塩基を指している（Ｅはデザイナー・オリゴとも言う）。以下の表は典型的なトリヌクレオチドカセット（Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ、Ｎ，Ｎ，Ｎ、Ｎ，Ｎ，Ａ／Ｃ以外に３０００以上の可能な組合せがある）を表している。
ある意味で、飽和突然変異は、突然変異させることが決まったポリヌクレオチド配列（突然変異させる配列はできれば長さ１５から１００，０００の塩基）内の完全な一式の突然変異カセット（各カセットはできれば長さ１から５００の塩基）を突然変異させることからなっているため、変種集団（１から１００の変種）が突然変異させる各カセットに導入される。一回の飽和突然変異中に、あるカセットに導入される変種集団は、２つ目のカセットに導入される２つ目の変種集団と異なっていても同じでも構わない。上記の集団の例としては、特定のコドンの削除、追加、集団化でできたもの、また特定のヌクレオチドカセットの集団化でできたものがある。
【０２１３】
突然変異させることが決まった配列（図２０参照）は、好ましくは一個の完全な遺伝子、経路、ｃＤＮＡ、一個の完全なオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）、完全なプロモーター、エンハンサー、リプレッサー／トランスアクティベーター、再生起源、イントロン、オペレーター、ポリヌクレオチド機能グループを含んでいる。一般に、この目的のための好ましい「決まった配列」は、ポリヌクレオチドは、１５塩基配列を持つポリヌクレオチドや長さ１５塩基から１５，０００塩基（本発明はこの間の全整数を明確に指定）のポリヌクレオチド配列ならどれでも構わない。コドンの集団を選択する際には、縮退突然変異カセットによりエンコードされるアミノ酸のタイプへの考慮が含まれている。
突然変異カセット（表１−８５参照）へ導入される変種集団の特に好ましい実例の中で、本発明は各位置にある２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０アミノ酸と、そこでエンコードされるポリペプチドのライブラリを規定する縮退コドン置換（縮退オリゴ使用）について規定を設けている。
【０２１４】
３．２． キメラ化
３．２．１ ”シャッフリング”
核酸シャッフリングは、１個または複数個のポリヌクレオチドを作成するための、より短いかまたはより小さいポリヌクレオチドのプールのインビトロまたはインビボ相同的組換え法である。関連した核酸配列またはポリヌクレオチドの混合物に、ランダムポリヌクレオチドを作成するようにセクシュアル（ｓｅｘｕａｌ）ＰＣＲを施し、かつ組換えハイブリッド核酸分子またはポリヌクレオチドのライブラリーまたは混合集団を得るように再集成された。
カセット突然変異とは対照的に、シャッフリングおよびエラープローンＰＣＲのみが、盲検的（プライマー以外の配列情報はない）配列プールの突然変異を可能にするものである。
反復選択に関するエラープローンＰＣＲ単独に勝る本発明の変異原性シャッフリングの利点は、抗体の遺伝子操作の例について最も良く説明することができる。ＤＮＡシャッフリングをエラープローンＰＣＲ（セクシュアルＰＣＲでない）と比べてみる。選択されプールされた配列の最初のライブラリーは、単独の抗体遺伝子の多様な起源（すなわち本来のｍＲＮＡ由来の抗体）の関連配列からなるか、またはいずれかの種類の変異に由来することができる（シャッフリングを含む）。選択された相補性決定領域（「ＣＤＲ」）の集合が、第一回の親和性選択後に得られる。該略図において、濃厚な（ｔｈｉｃｋ）ＣＤＲは、抗体分子に増大した抗原親和性を付与する。シャッフリングは、例えば、ＣＤＲｌの全てとＣＤＲ２の全てとＣＤＲ３の全ての自在なコンビナトリアル会合を可能にする。
【０２１５】
本方法は、エラープローンＰＣＲとは、逆連鎖反応である点で異なる。エラープローンＰＣＲにおいて、ポリメラーゼ開始部位の数および分子の数は、指数関数的に増大する。しかし、ポリメラーゼ開始部位の配列および該分子の配列は本質的に同じである。対照的に、ランダムポリヌクレオチドの再集成またはシャッフリングする核酸において、開始部位の数およびランダムポリヌクレオチドの数（サイズではない）は、経時的に減少する。全プラスミドに由来したポリヌクレオチドについて、理論的エンドポイントは、１本の巨大なコンカテマー分子である。
相同領域でクロスオーバーが生じるので、組換えは、同じ配列ファミリーのメンバーの間で初めに生じる。これは、総体的に共存性のないＣＤＲの組合せを邪魔する（例えば、同じ抗原の異なるエピトープに対して）。配列の複数のファミリーを同じ反応においてシャッフリングすることができることが考案されている。さらに、シャッフリングは一般に、相対的順番を維持し、その結果例えばＣＤＲ１は、ＣＤＲ２の位置には認められないであろう。
稀なシャッフラント（ｓｈｕｆｆｌａｎｔ）は、非常に多数の最良（例えば最高親和性）のＣＤＲを含み、かつこれらの稀なシャッフラントは、それらの優れた親和性を基に選択することができる。
１００種の異なる選択された抗体配列のプールからのＣＤＲは、最大１００６種の異なる方法で並べ替えることができる。この非常に多数の並べ替えは、ＤＮＡ配列の単独のライブラリーにおいては表すことができない。従って、ＤＮＡシャッフリングおよび選択の複数のサイクルが、所望の配列長さおよび配列の多様性に応じて必要であると考えられている。
対照的にエラープローンＰＣＲは、同じ相対的配列において全ての選択されたＣＤＲを維持し、非常に小さい変異体クラウド（ｃｌｏｕｄ）を形成している。
本発明の方法で使用することができる鋳型ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであることができる。これは、遺伝子のサイズまたは再結合もしくは再集成される短いもしくは小さいポリヌクレオチドに応じて、様々な長さであることができる。好ましい鋳型ポリヌクレオチドは５０ｂｐ〜５０ｋｂである。関心対象のタンパク質をコードしている核酸を含むベクター全体を、本発明の方法において使用することができることが考案されており、かつ実際にうまく使用されている。
【０２１６】
鋳型ポリヌクレオチドは、ＰＣＲ反応を用いる増幅（米国特許第４，６８３，２０２号および第４，６８３，１９５号）、または他の増幅もしくはクローニング法により得ることができる。しかしＰＣＲ産物のプールおよびセクシュアルＰＣＲを施す前に、ＰＣＲ産物から自在なプライマーを除去することは、より効率的結果をもたらす。セクシュアルＰＣＲ前の本来のプールからのこのようなプライマーの適切な除去の失敗は、低頻度のクロスオーバークローンに繋がり得る。
鋳型ポリヌクレオチドはしばしば、二本鎖である。二本鎖核酸分子は、得られる一本鎖ポリヌクレオチド領域が互いに相補的であり、その結果ハイブリダイズし、二本鎖分子を形成することができることを確実にすることが推奨されている。
この段階では、鋳型ポリヌクレオチドと同じ領域および鋳型ポリヌクレオチドと異なる領域を有する一本鎖または二本鎖核酸ポリヌクレオチドが、鋳型ポリヌクレオチドに添加されることが考案されている。さらに２種の異なるが関連したポリヌクレオチド鋳型をこの段階で混合することができると考えられている。
二本鎖ポリヌクレオチド鋳型およびいずれか添加された二本鎖または一本鎖ポリヌクレオチドに、遅延または停止を含むセクシュアルＰＣＲが施され、５ｂｐ〜５ｋｂまたはそれ以上の混合物が提供される。好ましくは、ランダムポリヌクレオチドのサイズは、約１０ｂｐ〜１０００ｂｐであり、より好ましくはこのポリヌクレオチドのサイズは、約２０ｂｐ〜５００ｂｐである。
あるいは、同じく複数のニックを有する二本鎖核酸を、本発明の方法において使用することが考察されている。ニックは、二本鎖核酸の１本の鎖中の切れ目である。このようなニック間の距離は、好ましくは５ｂｐ〜５ｋｂであり、より好ましくは１０ｂｐ〜１０００ｂｐである。これは、例えばランダムプライマーから生じるポリヌクレオチドと共に含まれる、より短いかまたはより小さいポリヌクレオチドを作成するための自己プライミング域（ａｒｅａ）を提供する。
いずれか１種の特異的ポリヌクレオチドの濃度は、総ポリヌクレオチドの１質量％よりも大きくはなく、より好ましくはいずれか１種の特異的核酸配列は、総核酸の０．１質量％よりも大きいことはない。
このような混合物中の様々な特異的ポリヌクレオチドの数は、少なくとも約１００個であり、好ましくは少なくとも約５００個であり、より好ましくは少なくとも約１０００個である。
【０２１７】
この段階で、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドは、合成または天然にかかわらず、ポリヌクレオチド混合物の不均一性を増大するために、ランダム二本鎖のより短いかまたは小さいポリヌクレオチドに添加することができる。
さらに二本鎖のランダムに破壊されたポリヌクレオチドの集団を、この段階でセクシュアルＰＣＲ法由来のポリヌクレオチドと混合または一緒にすることができ、かつ任意に１種以上の追加のセクシュアルＰＣＲサイクルを施すことが考案されている。
鋳型ポリヌクレオチドへの変異の挿入が望ましい場合、鋳型ポリヌクレオチドと同じ領域および鋳型ポリヌクレオチドと異なる領域を有する一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドを、総核酸に対して質量で２０倍過剰に添加することができ、より好ましくは総核酸に対して質量で１０倍過剰に添加することができる。
異種であるが関連した鋳型ポリヌクレオチドの混合物が望ましい場合には、各鋳型由来のポリヌクレオチドの集団は、約１：１００未満の比で、より好ましくは約１：４０未満の比で一緒にすることができる。例えば、変異されたポリヌクレオチド集団による野生型ポリヌクレオチドの戻し交配（ｂａｃｋｃｒｏｓｓ）は、中立突然変異（例えば、選択される表現型特性における非現実的変更を生じる変異）を排除するために望ましい。このような例において、ランダムに提供されたセクシュアルＰＣＲサイクルハイブリッドポリヌクレオチドに対する、添加することができるランダムに提供された野生型ポリヌクレオチドの比は、およそ１：１〜約１００：１であり、より好ましくは１：１〜４０：１である。
ランダムポリヌクレオチドの混合された集団は、一本鎖のポリヌクレオチドを形成するために変性され、次いで再アニーリングされる。他の一本鎖ポリヌクレオチドと相同性のある領域をもつ一本鎖ポリヌクレオチドだけが、再アニーリングされると考えられる。
ランダムポリヌクレオチドを加熱によって変性させることができる。当業者は、二本鎖の核酸を完全に変性させるのに必要な条件を決定することができる。好ましくは８０℃から１００℃、より好ましくは、温度は９０℃から９６℃の温度である。ポリヌクレオチドを変性させるために使われうる他の方法は、圧力（３６）ならびにｐＨを含む。
【０２１８】
ポリヌクレオチドを冷却によって再アニーリングすることができる。好ましくは温度は２０℃から７５℃の間、より好ましくは、温度は４０℃から６５℃の間である。平均わずか４個の連続する塩基の相同性に基づいて高頻度のクロスオーバー（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）を必要とするならば、方法はより困難になるが、低いアニーリング温度を用いて組換えを強制することができる。産生される立体構造の再生は、一本鎖ポリヌクレオチドの集団間の相同性の程度に依存するであろう。
再生は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）あるいは塩の添加によって加速されうる。塩濃度は、好ましくは０ｍＭから２００ｍＭまで、より好ましくは塩濃度は１０ｍＭから１００ｍＭまでである。塩はＫＣｌあるいはＮａＣｌでありうる。ＰＥＧの濃度は、好ましくは０ ％から２０ ％まで、より好ましくは５ ％から１０％までである。
アニーリングされたポリヌクレオチドは次に、核酸ポリメラーゼ及びｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）の存在下でインキュベートされる。核酸ポリメラーゼはクレノー断片、Ｔａｑポリメラーゼ、あるいは当技術分野で既知の任意の他のＤＮＡポリメラーゼでありうる。
集合のために用いられうるアプローチは、クロスオーバーが得られる最小程度の相同性に依存している。もし、同一な領域が大きいときは、Ｔａｑポリメラーゼを４５℃から６５℃の間のアニーリング温度で使うことができる。もし、同一な領域が小さいときは、クレノーポリメラーゼを２０℃から３０℃の間のアニーリング温度で使うことができる。当業者は、クロスオーバーが達成された数を増加させるために温度を変化させることができる。
アニーリングに先立って、アニーリングと同時に、またはアニーリングの後に、ポリメラーゼをランダムポリペプチドに添加することができる。
ポリメラーゼ存在下での変性、再生及びインキュベーションのサイクルとは、本明細書において核酸のシャッフリング又は集合を指す。このサイクルは所望の回数繰り返される。好ましくは、サイクルは２回から５０回繰り返され、より好ましくは、シークエンスは１０回から４０回繰り返される。
その結果得られた核酸は、約５０ｂｐから約１００ｋｂｐまでの、より大きな二本鎖ポリヌクレオチドであり、好ましくは、より大きな該ポリヌクレオチドは５００ｂｐから５０ ｋｂｐまでである。
【０２１９】
このより大きなポリヌクレオチドは、鋳型ポリヌクレオチドと同じ大きさをもつポリヌクレオチドの数多くのコピーを直列に含みうる。この鎖状体状（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｃ）のポリヌクレオチドは次に、鋳型ポリヌクレオチドの単一コピーへと変性する。この結果、鋳型ポリヌクレオチドとほぼ同じ大きさをもつポリヌクレオチドの集団ができると考えられる。集団は混合された集団であると考えられ、同一の領域及び異種の領域をもつ一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドが、シャッフリングの前に、鋳型ポリヌクレオチドに加えられる。
これらのポリヌクレオチドは、次に適当なベクター及び細菌の形質転換に用いるライゲーション混合物へクローニングされる。
鎖状体の消化よりはむしろＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号及び米国特許第４，６８３，２０２号）を含む種々の方法によって、クローニングの前に単一のポリヌクレオチドを増幅することにより、単一のポリヌクレオチドがより大きな鎖状体状のポリペプチドから得られうることが予測される。
クローニングのために使用されるベクターは、所望の大きさのポリヌクレオチドが受容されるならば、それほど重要ではない。もし、特定のポリヌクレオチドの発現が望ましいのであれば、宿主細胞中でポリヌクレオチドを発現させるために、クローニングの媒体は、ポリヌクレオチドの挿入部位の隣に転写シグナル及び翻訳シグナルをさらに含むべきである。好ましいベクターには、ｐＵＣシリーズやｐＢＲシリーズのプラスミドが含まれる。
その結果得られた細菌集団は、ランダム変異を有する多くの組換えポリヌクレオチドを含むと考えられる。この混合集団は、所望の組換えポリヌクレオチドを同定するために、試験されうる。選択の方法は、所望のポリヌクレオチドに依存すると考えられる。
【０２２０】
例えばもし、リガンドへの増大された結合効率をもつタンパク質をコードするポリヌクレオチドが望ましいならば、集団又はライブラリーにおいてポリヌクレオチドそれぞれの部分により発現されたタンパク質は、当技術分野で既知の方法（すなわち、パニングやアフィニティクロマトグラフィ）によって、リガンドへの結合能について試験されうる。もし、増大された薬剤耐性をもつタンパク質をコードするポリヌクレオチドが望ましいならば、集団又はライブラリーにおけるそれぞれのポリヌクレオチドによって発現されたタンパク質は、宿主生物に薬剤耐を付与する性能について試験されうる。所望のタンパク質の知識をもつ当業者は、集団を容易に試験して、所望の特性をタンパク質に付与するポリヌクレオチドを同定することができる。
当業者が、タンパク質の断片を融合タンパク質としてファージ表面に発現させる、ファージディスプレイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ ＷＩ）を使えることが予測される。組換えＤＮＡ分子は、ある部位でファージＤＮＡにクローニングされ、その結果、その一部が組換えＤＮＡによってコードされた融合タンパク質の転写が起こる。組換え核酸分子を含むファージは細胞の中で複製及び転写をうける。融合タンパク質のリーダー配列は、融合タンパク質の輸送をファージ粒子の先端に向ける。したがって、組換えＤＮＡ分子によって部分的にコードされた融合タンパク質は、上記の方法による検出及び選択のためにファージ粒子の上に提示される。
さらに、核酸シャッフリングの多数のサイクルは、亜集団が所望の組換えタンパク質をコードするＤＮＡを含むような、最初の集団の亜集団由来のポリヌクレオチドと共に行われることが予測される。このようにして、より高い結合親和性又は酵素的活性を有するタンパク質が達成される。
亜集団から、アミノ酸変異につながらない核酸の全ての変異体を除くために、核酸シャッフリングの多数のサイクルが、野生型ポリヌクレオチド及び、最初又はその後の回の核酸シャッフリング由来の核酸の亜集団の混合物と共に行われることが更に予測される。
【０２２１】
精製された形態における核酸の任意の供給源が、開始核酸として使用されうる。したがって過程は、ＤＮＡ又はＲＮＡが一本鎖又は二本鎖でありうる、ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを含むＲＮＡを利用することができる。加えて、それぞれの一本鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドも使用することができる。核酸の配列は、変異される核酸配列の大きさに依存して、さまざまな長さでありうる。好ましくは、特異的な核酸の配列は５０塩基対から５００００塩基対である。関心対象のタンパク質をコードする核酸を含むベクター全体が、本発明の方法において使用されうることが予測される。
核酸は、任意の供給源、たとえばｐＢＲ３２２のようなプラスミド、クローニングされたＤＮＡもしくはＲＮＡ、又は細菌、酵母、ウイルス、及び植物もしくは動物のような高等生物を含む、任意の供給源由来の天然のＤＮＡもしくはＲＮＡから得られうる。ＤＮＡ又はＲＮＡを、血液又は組織材料から抽出することもできる。鋳型ポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチド連鎖反応（ＰＣＲ、米国特許第４，６８３，２０２号及び米国特許第４，６８３，１９５号）を用いて増幅することにより得ることができる。又はポリヌクレオチドは、細胞中に存在するベクター中に存在しうり、十分な核酸は、当技術分野で既知の方法による細胞の培養及び細胞からの核酸の抽出によって得られうる。
本方法によって、任意の特異的な核酸配列を、ハイブリッド集団を作製するために用いることができる。特定の核酸配列のハイブリッド配列の小さな集団が存在している又は、本方法の前に作製されることだけが必要である。
変異をもつ特定の核酸配列の最初の小さな集団は、多くの異なった方法で作製される。変異はエラープローンＰＣＲで作製されうる。エラープローンＰＣＲは、長い配列にわたって低いレベルでの点変異をランダムに導入するために、低忠実度の重合条件を用いる。または、オリゴヌクレオチドによる突然変異誘発によって、鋳型ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。オリゴヌクレオチドによる突然変異誘発において、ポリヌクレオチドの短い配列が制限酵素消化を用いてポリヌクレオチドから除去され、様々な塩基が本来の配列から変化している合成ポリヌクレオチドで置き換えられる。ポリヌクレオチド配列はまた化学的突然変異誘発によっても変化されうる。化学的突然変異誘発は、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシアミン、ヒドラジン、又はギ酸を含む。ヌクレオチド前駆体の類似体である他の薬剤は、ニトロソグアニジン、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、又はアクリジンを含む。一般的にこれらの薬剤は、それにより配列が変異されるヌクレオチド前駆体の代わりに、ＰＣＲ反応に加えられる。プロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなどのようなインターカレーション試薬もまた使用されうる。ポリヌクレオチド配列のランダム突然変異誘発はまた、Ｘ線又はＵＶ光の照射によって達成されうる。一般的に、このように突然変異誘発されたプラスミドポリヌクレオチドを大腸菌に導入し、ハイブリッドプラスミドのプール又はライブラリーとして増殖させる。
【０２２２】
または、同一の遺伝子の異なった対立遺伝子、又は異なった関連する種由来の同一遺伝子（すなわち同族遺伝子）からなるという点で、特定の核酸の小さな混合集団は天然にも見出だされうる。またはそれらは、一つの種の中に見られる関連した遺伝子、例えば免疫グロブリン遺伝子でありうる。
ひとたび特定の核酸配列の混合された集団が作製されると、又は当技術分野でよく知られた技術を用いて、ポリヌクレオチドを直接用いるか、適当なクローニングベクターに挿入することができる。
ベクターの選択は、本発明の方法において使用されるポリヌクレオチド配列の大きさや宿主細胞に依存している。本発明における鋳型はプラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ウイルス（例えばレトロウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、レオウイルス、パラミクソウイルスなど）、又はその中の選ばれた一部分（例えば、コートタンパク質、スパイクグリコタンパク質、キャプシドタンパク質）でありうる。例えば、変異される特定の核酸配列がより大きい場合には、大きなポリヌクレオチドを安定に保持することのできるベクターであるために、コスミド及びファージミドが好ましい。
もし、特定の核酸配列の混合された集団をベクターにクローニングした場合、各ベクターを一つの宿主細胞に挿入し、その宿主細胞にベクターを増幅させることにより、クローンとして増幅することができる。核酸配列の絶対数が増大してもハイブリッドの数は増大しないので、これは、クローン的な（ｃｌｏｎａｌ）増幅とよばれる。有用性を、発現されたポリペプチドをスクリーニングすることで容易に決定することができる。
本発明のＤＮＡシャッフリング法を、未知の配列のプールにおいて盲目的に行うことができる。オリゴヌクレオチドの再集合混合物（再集合される配列に対して相同的な末端を有する）を添加することで、任意の配列混合物を、任意の特定の部位において、別の配列混合物のなかに組み込むことができる。したがって、合成オリゴヌクレオチド、ＰＣＲポリヌクレオチド又はたとえ遺伝子全体の混合物でも、規定の部位において別の配列ライブラリーの中に混合することができると予想される。一つの配列（混合物）の挿入は、鋳型の他の部位での配列の挿入に依存しない。それゆえ、組換えの程度、必要な相同性、及びライブラリーの多様性は、再集合されたＤＮＡの長さに沿って独立してかつ同時に変化することができる。
【０２２３】
２つの遺伝子を混合するこのアプローチは、ネズミのハイブリドーマ由来の抗体をヒト化するために有用でありうる。２つの遺伝子の混合、又は代替的な配列の遺伝子への挿入のアプローチは、たとえば、インターロイキンＩ、抗体、ｔＰＡ、及び成長ホルモンなど、治療的に使用される任意のタンパク質に対して有用でありうる。アプローチはまた、タンパク質の発現を増加させるために、又は発現の特異性を変化させるために、任意の核酸、たとえば、遺伝子上のプロモーターもしくはイントロン、又は３１非翻訳領域もしくは５１非翻訳領域に対して有用でありうる。
シャッフリングには、多様性の領域を分けている相同的な領域の存在が必要である。骨格様タンパク質構造は、特にシャッフリングには適しうる。保存された骨格は、特異的結合を媒介する比較的制限されないループを示す一方で、自己会合による全体の折り畳み構造を決定する。このような骨格の例としては、当技術分野で公知の免疫グロブリンβバレル構造及び４ヘリックスバンドルがあげられる。このシャッフリングは、結合のための変異配列の種々の組み合わせをもつ、骨格様タンパク質を作製するのに使用されうる。
３．２．２． ”インビトロシャッフリング”
いくつかの標準的遺伝子交配と同等のことがインビトロシャッフリングによってもまた実施されうる。例えば「分子戻し交配」を、関心対象の変異に関する選択の際ハイブリッド核酸を野生型核酸と繰り返し混合させることにより実施することができる。伝統的育種と同様に本アプローチを、異なる供給源由来の表現型を、選択したバックグラウンドと組み合わせるために使用することができる。これは例えば選択されていない特性（すなわち免疫原性）に影響を与える中立の変異を除去するために有用である。したがって、これはタンパク質の変異が増大された生物学的活性に関与するかどうかを判定するために有用であることができ、これはエラープローン変異誘発法またはカセット変異誘発法によっては達成することができない利点である。
【０２２４】
大型機能的遺伝子を、小型ランダムポリヌクレオチドの混合物から正確に集合させることができる。本反応は化石の高度に断片化されたＤＮＡから遺伝子を再集合させるために有用でありうる。更に、化石由来のランダムな核酸断片は関連する種由来の類似遺伝子由来のポリヌクレオチドと組み合わされうる。
本発明の方法が、様々な研究および診断応用のために必要とされるような１つの細胞からの全ゲノムのインビトロ増幅のために使用されうることもまた考えられる。ＰＣＲによるＤＮＡ増幅は、現実的には約４０ｋｂの長さに限定される。たとえば大腸菌のゲノム（５，０００ｋｂ）などの全ゲノムのＰＣＲ増幅は、１２５個の４０ｋｂポリヌクレオチドを生じる約２５０個のプライマーを必要とすると考えられる。このアプローチは、十分な配列データが得られないために現実的ではない。一方、セクシュアルＰＣＲを用いたゲノムのポリヌクレオチドのランダム作製およびその後の小さなポリヌクレオチドのゲル精製は、多数の潜在的プライマーを提供すると考えられる。このランダムな小さいポリヌクレオチド混合物をＰＣＲ反応においてプライマーとして単独でまたは鋳型として全ゲノムＤＮＡをともに用いる使用は、ゲノムの多くのコピーを含む単一のコンカテマーの理論的終了点をもつ、逆連鎖反応をもたらすはずである。
コピー数の１００倍の増幅および５０ｋｂ超のポリヌクレオチドの平均の大きさは、ランダムポリヌクレオチドのみが使用された場合に得られうる。多数のより小さなポリヌクレオチドの重複による、より大きなコンカテマーが作製されると考えられる。合成プライマーを用いて得られた特異的ＰＣＲ産物の質は、非増幅ＤＮＡから得られた産物と区別できないと考えられる。本アプローチががゲノムマッピングにおいても有用であることが期待される。
【０２２５】
実施者の判断で、シャッフリングされるべきポリヌクレオチドは、ランダムまたは非ランダムなポリヌクレオチドとして作製されうる。さらに本発明は、より大きなポリヌクレオチドの再集合において構築ブロックとして使用されるポリヌクレオチドモノマーを産生する段階を含む、広範囲のポリヌクレオチドのサイズおよび型に適用可能なシャッフリング法を提供する。例えば、構築ブロックは遺伝子の断片であることができ、または遺伝子全体もしくは遺伝子経路またはそれらの任意の組み合わせからなることもできる。
３．２．３． ”インビボシャッフリング”
インビボシャッフリングの態様においては、少なくとも２つの異なる核酸配列が各宿主細胞内に存在するような条件下で、特定の核酸配列の混合集団が細菌性または真核性の細胞内に導入される。ポリヌクレオチドを、様々な異なる方法で宿主細胞に導入することができる。宿主細胞を、当技術分野において既知である方法、たとえば塩化カルシウム処理を用いて、より小型のポリヌクレオチドで形質転換することが可能である。ポリヌクレオチドがファージゲノムに挿入されているならば、宿主細胞は特定の核酸配列を有する組換えファージゲノムを用いてトランスフェクトされうる。または、エレクトロポレーション、トランスフェクション、リポフェクション、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、接合などを用いて、核酸配列を宿主細胞に導入することができる。
【０２２６】
一般的には本態様において、宿主細胞内で安定に配列を複製する能力を有するベクター内に特異的核酸配列が存在すると考えられる。さらに、ベクターはベクターを有する宿主細胞が選択されうるためのマーカー遺伝子をコードするであろうことが考えられる。これは変異した特異的核酸配列が宿主細胞への導入後に回収されうることを確実にする。しかしながら、特異的核酸配列の全混合集団がベクター配列上に存在する必要がないことが考えられる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入後に各宿主細胞がその中に少なくとも１つの特異的核酸配列を有する１つのベクターを含むことを確実にするために、むしろ十分な数の配列だけがベクターにクローニングされる必要がある。ベクターにクローニングされた特異的核酸配列の集団のサブセットを有するよりもむしろ、このサブセットがが既に安定に宿主細胞に組み込まれうることもまた考えられる。
同一領域を有する２つのポリヌクレオチドが宿主細胞に挿入される場合、相同組換えが２つのポリヌクレオチド間で生じることが見出された。２つの変異型特異的核酸配列間でのそのような組換えは、ある状況では二重または三重ハイブリッドの作製をもたらすと考えられる。
いくつかの変異型特異的核酸配列が直鎖状核酸分子上に存在するならば、組換え頻度が増加することもまた見出された。それゆえ好ましい態様においては、いくつかの特異的核酸配列が直鎖上ポリヌクレオチド上に存在する。
形質転換後、宿主細胞形質転換体は、所望の品質を有する変異型特異的核酸配列を含む宿主細胞形質転換体を同定するための選択下に置かれる。例えばある特定の薬剤への耐性の増加が望ましいならば、形質転換された宿主細胞が特定の薬剤の増加濃度に供されうり、薬剤耐性の増加を賦与することができる変異型タンパク質を作製する形質転換体が選択されるであろう。ある特定のタンパク質が受容体に結合する能力の増強が望ましいならば、その後形質転換体からタンパク質発現を誘導することが可能であり、結果生じるタンパク質は、リガンドに対する結合の増強を示す変異型亜集団を同定するために当技術分野において既知である方法によりリガンド結合アッセイにより評価される。またはタンパク質は適切なプロセシングを確実にするために別の系で発現することができる。
【０２２７】
目的の特性を有する最初の組換え型特異的核酸配列（娘配列）の亜集団が同定されると、それらは続いて別の回の組換えに供される。
２サイクル目の組換えでは、組換え型特異的核酸配列は本来の変異型の特異的核酸配列（親配列）とシャッフリングされてもよく、サイクルは上述の通り繰り返される。このようにして、増強された特性を有するまたは増強された特性を有するタンパク質をコードする第二の組換え型特異的核酸配列のセットが同定されうる。このサイクルは望ましいならば多数回繰り返されうる。
２番目または引き続く組換えサイクルにおいて戻し交配が実施されうることもまた考えられる。少なくとも１つの野生型核酸配列および変異型核酸配列が形質転換後の同一の宿主細胞内に存在するような分子戻し交配は目的の特異的核酸配列を多数の野生型配列とシャッフリングすることにより実施されうる。野生型特異的核酸配列との組換えは免疫原性等の選択されていない特性に影響を与えうるそれらの中立変異を除去し、選択された特性は除去しない。
本発明の別の態様においては、第１回において特異的核酸配列の亜集団は、宿主細胞への導入前にそのＰＣＲ増幅を遅くまたは停止することにより、より小さなポリヌクレオチドとして作製することができる。他の配列と相同組換えを起こすようにポリヌクレオチドの大きさはいくつかの他の配列と同一である領域を含む程度には大きくなくてはならない。ポリヌクレオチドの大きさは０．０３ｋｂから１００ｋｂの範囲であり、より好ましくは０．２ｋｂから１０ｋｂの範囲であると考えられる。引き続く回において以前の回から選択された配列以外の全ての特異的核酸配列は、宿主細胞への導入前にそのＰＣＲポリヌクレオチドを作製するために使用されてもよい。
より短いポリヌクレオチド配列は一本鎖または二本鎖であることができる。配列が本来一本鎖でありそれが二本鎖になったならば、それらは、宿主細胞への導入前に、熱、化学物質、または酵素を用いて変性することができる。核酸の鎖を分離するのに適した反応条件は当技術分野においてよく知られている。
【０２２８】
本過程の段階を無限に繰り返すことができ、達成可能なありうるハイブリッドの数によってのみ制限されている。ある回数のサイクルの後、全ての潜在的なハイブリッドは達成されてしまい、そしてさらなるサイクルは冗長である。
ある態様において、同一の変異型鋳型核酸配列が繰り返し組換えられ、結果としての組換え体は目的に対して選択される。
したがって、変異型鋳型核酸配列の初期のプールまたは集団は、大腸菌等の微生物にて複製可能なベクターにクローニングされる。大腸菌で自律的複製が可能である限りは特定のベクターが必須であるわけではない。好ましい態様においては、ベクターは、ベクターに連結された変異型特異的核酸配列によりコードされるタンパク質の発現および作製を可能にするように設計されている。ベクターが選択標識をコードする遺伝子を含むこともまた好ましい。
変異型核酸配列のプールを含むベクター集団が大腸菌宿主細胞に導入される。ベクター核酸配列は、トランスフォーメーション、トランスフェクション、またはファージの場合は感染により導入されてもよい。微生物をトランスフォームするために用いられるベクターの濃度は、多数のベクターが各細胞に導入される程度のものである。細胞の中に存在する場合、相同組換えの効率は、相同組換えが様々なベクター間でおこる程度のものである。これは、本来の親変異型配列と異なる変異の組み合わせを有する（娘）ハイブリッドの作製につながる。
その後宿主細胞はクローン状態で複製され、そしてベクターに存在する標識遺伝子により選択される。プラスミドを有するそれらの細胞のみが選択下で増殖すると考えられる。
ベクターを含む宿主細胞は、続いて好ましい変異が存在するかを試験される。そのような試験は、例えば選択される遺伝子が改良型薬剤耐性遺伝子であるならば、細胞を選択圧下に置くことからなってもよい。もしベクターが変異型核酸配列によりコードされるタンパク質の発現を可能にするならば、そのときはそのような選択は、そのようにコードされるタンパク質を発現させてタンパク質を単離し、および、例えば、より効率的に目的のリガンドに結合するかを決定するためにタンパク質を試験することを含んでもよい。
目的の特性を与えるある特定の娘変異型核酸配列が同定されると、既にベクターに結合された核酸配列またはベクターから分離された核酸配列が単離される。この核酸はそれから最初のすなわち親核酸集団とシャッフリングされ、サイクルが繰り返される。
【０２２９】
本方法により増強された目的特性を有する核酸配列が選択されうることが示されている。
別の態様においては、第１世代のハイブリッドは細胞内に維持され、親変異型配列が再び細胞に添加される。したがって、態様Ｉの最初のサイクルは上述されたように実施される。しかしながら、娘核酸配列が同定された後は、これらの配列を有する宿主細胞は保持される。
変異型特異的核酸配列の親集団は、ポリヌクレオチドまたは同一のベクターにクローニングされた形で、すでに娘核酸を含む宿主細胞に導入される。細胞内で組換えが生じることは可能であり、次世代の組換え体すなわち孫娘が上述された方法により選択される。
このサイクルは目的とする特性を有する核酸またはペプチドが得られるまで多数回にわたり繰り返すことが可能である。引き続くサイクルでは、好ましいハイブリッドに添加される変異型配列の集団は親ハイブリッドまたは他のいかなる引き続く世代に由来してもよい。
別の態様において、本発明はいかなる中立変異も除去するために、得られた組換え特異的核酸の「分子」戻し交配を実施する方法を提供する。中立変異は核酸またはペプチドに目的とする特性を付与しない変異である。しかしながらそのような変異は核酸またはペプチドに望ましくない特性を与えてもよい。したがって、そのような中立変異を除去することが望ましい。本発明の方法はそれを実施する方法を提供する。
【０２３０】
本態様において、目的とする特性を有するハイブリッド核酸が実施態様の方法で得られた後、核酸、その核酸を有するベクター、またはそのベクターと核酸を含む宿主細胞が単離される。
核酸またはベクターはそれから大過剰の野生型核酸とともに宿主細胞に導入される。ハイブリッドの核酸および野生型配列の核酸は組換えを行うことが可能である。結果として生じる組換え体は、ハイブリッド核酸と同じ選択下に置かれる。目的とする特性を保持した組換え体のみが選択されるであろう。目的とする特性を与えないいかなるサイレント変異も野生型ＤＮＡとの組換えを通して失われるであろう。このサイクルは全てのサイレント変異が除去されるまで多数回繰り返すことができる。
したがって本発明の方法は不必要なまたはサイレントな変異を除去するために分子戻し交配において使用することができる。
エキソヌクレアーゼ媒介性シャッフリング
特定の態様において、本発明は少なくとも２つのポリヌクレオチドをシャッフリング、集合、再集合、組換え、および／またはライゲーションさせ１つの子孫ポリヌクレオチド（例えばポリペプチドまたは遺伝子経路を作製するために発現されうるキメラ子孫ポリヌクレオチド）を形成する方法を提供する。ある特定の態様において、二本鎖ポリヌクレオチド末端（例えばハイブリダイゼーション相手として相互にハイブリダイズされた２つの一本鎖配列）がエキソヌクレアーゼにより処理され、２本の鎖の１本からヌクレオチドを遊離させ、望ましいならば、残りの鎖が別の相手へのハイブリダイゼーションを達成するために使用されうるように、残りの鎖を本来の相手から分離させる。
ある特定の局面において、二本鎖ポリヌクレオチド末端（ポリヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド配列の一部であるかそれに接続されていてもよい）がエキソヌクレアーゼ活性供給源に供される。利用可能なエキソヌクレアーゼ活性供給源は３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、３’エキソヌクレアーゼ活性および５’エキソヌクレアーゼ活性両方を有する酵素、およびそれらの任意の組み合わせであってもよい。エキソヌクレアーゼを、直鎖状二本鎖ポリヌクレオチドの片側または両側の末端から、及び２つを上回る末端を有する分鎖状ポリヌクレオチドの１つ〜全ての末端から、ヌクレオチドを遊離させるために用いることができる。この遊離作用の機構は末端ヌクレオチドの酵素触媒性加水分解からなると考えられており、時間依存的様式で進行させることが可能であり、酵素過程の進行の実験的制御を可能にする。
【０２３１】
対照的に、二本鎖ポリヌクレオチドの作用対を一本鎖ポリヌクレオチドに融解できるように、（例えば温度、ｐＨ、および／または塩濃度条件を変えることにより）作用試料を変性（又は「融解」）条件に供する段階からなる非酵素的段階が、ポリヌクレオチド構築ブロックをシャッフリング、集合、再集合、組換え、および／またはライゲーションさせるために使用されうる。シャッフリングに関しては、一本鎖ポリヌクレオチドが、異なるハイブリダイゼーション相手とのアニーリングにある程度関与することが望ましい（すなわち、かつ変性段階前の以前の相手との排他的再アニーリングに復帰するだけでなく）。しかしながら反応器の中に以前のハイブリダイゼーション相手が存在することは、一本鎖ポリヌクレオチドが以前の相手と再アニーリングし本来の二本鎖ポリヌクレオチドを再形成することを妨害せず、むしろ時には促進しうる。
二本鎖ポリヌクレオチド構築ブロックを変性に供し、続いてアニーリングする段階からなるこの非酵素的シャッフリング段階と対照的に、本発明は変性を必要としないエキソヌクレアーゼに基づくアプローチをさらに提供し、むしろアニーリング（すなわち非変性）状態における変性条件の回避および二本鎖ポリヌクレオチド基質の維持が、エキソヌクレアーゼ（例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩおよびレッドα（ｒｅｄ ａｌｐｈａ）遺伝子産物）の作用に必要な条件である。更に対照的に、他の一本鎖ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な一本鎖ポリヌクレオチド配列の作製は、ハイブリダイゼーション相手の一方における共有結合開裂の、およびそれ故の配列破壊の結果である。例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素は（ポリヌクレオチド鎖の共有結合加水分解を達成するために）１つのハイブリダイゼーション鎖における３’末端ヌクレオチドの酵素的遊離に用いられうる。これは、残りの一本鎖が新しい相手にハイブリダイゼーションするために有利である（その以前の相手は共有結合開裂に供されているため）。
【０２３２】
更なる例示のために、特定のエキソヌクレアーゼ、すなわちエキソヌクレアーゼＩＩＩが３’エキソヌクレアーゼの一例として本明細書において提供されている。しかしながら、５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素及び３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を含み、また未発見の酵素および未開発の酵素を含む他のエキソヌクレアーゼもまた使用されうる。より最適な割合および／またはより高度に特異的な活性を有し、および／または望ましくない活性をより多く欠如した酵素が、特に開示された本アプローチに関して、同定され、最適化され（例えば定方向進化により操作され）、または同定および最適化されることができることが特に評価される。事実、本発明はこのようなデザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）酵素の発見および／または開発を促進しうると期待される。総合すると本発明は現在利用可能な種々のエキソヌクレアーゼ酵素と同様に未発見の酵素および未開発の酵素を用いて実施されうる。
エキソヌクレアーゼＩＩＩのエキソヌクレアーゼ作用は、平滑または５’突出型のいずれかの作用二本鎖ポリヌクレオチド末端を必要とし、エキソヌクレアーゼ作用は、３’末端ヌクレオチドの酵素的遊離からなり、エキソヌクレアーゼ作用が進行するにつれますます長くなる一本鎖５’末端を残す（図１を参照されたい）。本アプローチにより作製された任意の５’突出は、ハイブリダイゼーションさせるのに十分な相同性を有する別の一本鎖ポリヌクレオチド配列（また一本鎖ポリヌクレオチドまたは部分的二本鎖ポリヌクレオチド突出末端であってもよい）とハイブリダイズさせるために使用されてもよい。他の一本鎖配列にハイブリダイズさせるこれらのエキソヌクレアーゼＩＩＩ作製一本鎖配列（例えば５’突出における）の能力が、２またはそれ以上のポリヌクレオチドのシャッフリング、集合、再集合、および／またはライゲーションを可能にする。
さらに、二本鎖ポリヌクレオチド末端を保護でき、または必要に応じて利用可能なエキソヌクレアーゼの所望の酵素作用感受性にできることが認識される。たとえば、３’突出を有する二本鎖ポリヌクレオチド末端は、エキソヌクレアーゼＩＩＩのエキソヌクレアーゼ作用感受性ではない。しかしながら以下の様々な方法により、エキソヌクレアーゼＩＩＩのエキソヌクレアーゼ作用感受性にされうる。例えばそれはポリメラーゼ処理により平滑化されうり、平滑末端または５’突出を作製するために切断されうり、平滑末端または５’突出を作製するために別の二本鎖ポリヌクレオチドと連結（ライゲーションまたはハイブリダイゼーション）されうり、平滑末端または５’突出を作製するために一本鎖ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションされうり、又は、任意の種々の方法により修飾されうる。
【０２３３】
ある局面において、エキソヌクレアーゼは直鎖状二本鎖ポリヌクレオチドの一方または両方の末端に作用し、完了、ほぼ完了、または部分的な完了まで進行することが可能であってもよい。エキソヌクレアーゼ作用が完了まで進むことができる場合、「ランデブー点（ｒｅｎｄｅｚｖｏｕｓ ｐｏｉｎｔ）」（ポリヌクレオチドの中間点付近のどこかでありうる）と考えられる方向へポリヌクレオチドの中間領域にずっと沿って各５’突出の長さが伸長すると考えられる。最終的には、本来の二本鎖ポリヌクレオチドの各々約半分の長さの（分離されうる）一本鎖ポリヌクレオチドの作製がもたらされうる（図１を参照されたい）。またはエキソヌクレアーゼ媒介性反応は完了まで進行する前に終了されうる。
したがって、本エキソヌクレアーゼ媒介性アプローチはポリヌクレオチド構築ブロックのシャッフリング、集合および／または再集合、組換えならびにライゲーションのために利用可能であり、ポリヌクレオチド構築ブロックは１０塩基の長さまたは数十塩基の長さ、または数百塩基の長さ、または数千塩基の長さ、または数万塩基の長さ、または数十万塩基の長さ、または数百万塩基の長さ、またはそれ以上でさえあってもよい。
本エキソヌクレアーゼ媒介性アプローチは大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩの二本鎖ＤＮＡ特異的エキソデオキシリボヌクレアーゼ活性の作用に基づく。エキソヌクレアーゼＩＩＩの基質は二本鎖ポリヌクレオチドを断片化させることにより作製されうる。断片化は、機械的手段（例えばせん断、超音波処理等）、（例えば制限酵素を用いた）酵素的手段、およびそれらの任意の組み合わせによって達成されうる。より大きなポリヌクレオチド断片はまた、ポリメラーゼ媒介性合成によっても作製されうる。
【０２３４】
エキソヌクレアーゼＩＩＩは、４種の既知の活性、エキソデオキシリボヌクレアーゼ（本明細書では代替的にエキソヌクレアーゼと呼ぶ）、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡ−３’ホスファターゼ、およびＡＰエンドヌクレアーゼを有する大腸菌ｘｔｈＡ遺伝子産物である、２８Ｋの単量体酵素である。エキソデオキシリボヌクレアーゼ活性は二本鎖ＤＮＡに特異的である。作用機構には、ヌクレオシド５’リン酸および残存一本鎖の形成を伴う、３’末端から連続的に５’方向に向かってのＤＮＡの酵素的加水分解が関与すると考えられている。酵素は、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、または二本鎖ＲＮＡに対して効率的な加水分解は示さないが、ＤＮＡＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡを分解し、ヌクレオシド５’リン酸を放出する。本酵素はまたＤＮＡ上の３’ホスホモノエステル基から特異的に無機リン酸を放出するが、ＲＮＡまたは短いオリゴ核酸からは放出しない。これらの基の除去により末端はＤＮＡポリメラーゼ作用のためのプライマーに変換される。
合成ライゲーション再集合
ある局面において、本発明は合成ライゲーション再集合（ＳＬＲ）と呼ばれる非確率的方法を提供し、これは、核酸構築ブロックがランダムにシャッフリング、またはライゲーション、またはキメラ化されずむしろ非確率的に集合されるという点を除けば、確率的シャッフリングにある程度関連している。
特に目立つ差異は本ＳＬＲ法はシャッフリングされるポリヌクレオチド間の高レベルの相同性の存在に依存しないことである。対照的に、以前の方法、特に以前の確率的シャッフリング法は、シャッフリングされるポリヌクレオチド間の、とくに結合部位間における、高レベルの相同性の存在を必要とする。したがってこれらの以前の方法は、本来の祖先分子の再作製を有利にし、多数の新規子孫キメラの作製、特に全長子孫の作製にはやや最適である。一方本発明は、１０１００以上の異なるキメラからなる子孫分子のライブラリー（またはセット）を非確率的に作製するために使用することができる。おそらくＳＬＲは１０１０００を上回る（上限の見こみはなく）の異なる子孫キメラからなるライブラリーを作製するために使用することさえできる。
したがって、ある局面において、本発明は、非確率的で、設計により選択された全集合の順序を有する最終的なキメラ核酸分子のセットを作製する方法を提供し、この方法は、設計により利用可能な互いに互換的にライゲーションされうる（ｍｕｔｕａｌｌｙ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｌｉｇａｔａｂｌｅ）末端を有する多数の特定の核酸構築ブロックを作製する段階及び、設計された全集合の順序が達成されるように、これらの核酸構築ブロックを集合させる段階からなる。
【０２３５】
構築ブロックをあらかじめ決定された順序で結合させることができるなら、集合されるべき核酸構築ブロックの互いに互換的にライゲーションされうる末端は、この型の集合された順序のために「利用可能」であると考えられる。したがって、ある局面において、核酸構築ブロックが結合されうる全集合の順序は、ライゲーション可能末端の設計により特定され、複数の集合段階が使用されるならば、その後核酸構築ブロックが結合されうる全集合の順序は集合段階の連続的な順序によっても特定される。図４のパネルＣは、５個の核酸構築ブロックに関する設計された（非確率的な）全集合の順序を達成するための２つの連続した段階からなる例示的集合方法を図示している。本発明の好ましい態様においては、アニーリングされた構築部分はリガーゼ（例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ）等の酵素で処理され、構築部分の共有結合を達成する。
好ましい態様においては、最終的なキメラ核酸分子の子孫セットを作製する基礎としてはたらく祖先核酸鋳型セットの配列解析において核酸構築ブロックの設計が得られる。それゆえ、これらの祖先核酸鋳型は変異誘発される、すなわちキメラ化またはシャッフリングされる、核酸構築ブロックの設計を助ける配列情報の供給源としてはたらく。
ひとつの例示において、本発明は関連遺伝子ファミリーおよびそれらがコードする関連産物ファミリーをキメラ化することを提供する。ある特定の例示において、コードされた産物は酵素である。本発明の局面と一致して変異誘発されうる酵素ファミリーの代表的な一覧として、以下の酵素およびその機能が言及されうる。
【０２３６】
１． 脂肪分解酵素／エステル分解酵素
ａ．エステル（脂質）／チオエステルのエナンチオ選択的（ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）加水分解
１）ラセミ混合物の分割
２）メソジエステルからの光学活性を有する酸またはアルコールの合成
ｂ．選択的合成
１）炭水化物エステル部位特異的加水分解
２）環状２級アルコールの選択的加水分解
ｃ．光学活性を有するエステル、ラクトン、酸、アルコールの合成
１）活性型／非活性型エステルのトランスエステル化
２）相互エステル化
３）ヒドロキシエステルからの光学活性ラクトン
４）無水化合物の部位選択的及びエナンチオ選択的な開環
ｄ．界面活性剤
ｅ．固形脂肪／液体脂肪変換
ｆ．チーズ熟成
２． タンパク質分解酵素
ａ．エステル／アミド合成
ｂ．ペプチド合成
ｃ．アミノ酸エステルラセミ混合物の分離
ｄ．非天然アミノ酸合成
ｅ．界面活性剤／タンパク質加水分解
３． グリコシダーゼ／グリコシル転移酵素
ａ．糖／重合体合成
ｂ．単糖類、二糖類および多糖類形成のためのグリコシド結合の切断
ｃ．複合多糖類合成
ｄ．ＵＤＰ−ガラクトシル転移酵素を用いたグリコシド合成
ｅ．二糖類、グリコシルフルオリド、アリールガラクトシドのトランスグリコシル化
ｆ．多糖類合成におけるグリコシル転移
ｇ．β−グルコシルスルホキシドのジアステレオ選択的切断
ｈ．不斉グリコシル化
ｉ．食物加工
ｊ．紙加工
【０２３７】
４． 脱リン酸化酵素／リン酸化酵素
ａ．リン酸エステルの合成／加水分解
１）部位選択的、エナンチオ選択的なリン酸化
２）リン酸エステル導入
３）リン脂質前駆体合成
４）制御されたポリヌクレオチド合成
ｂ．生物的分子活性化
ｃ．保護基なしの選択的リン酸結合形成
５． モノ／ジオキシゲナーゼ
ａ．非活性型有機基質の直接的酸化機能付与（ｏｘｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）
ｂ．アルカン、芳香族、ステロイドのヒドロキシル化
ｃ．アルケンのエポキシ化
ｄ．エナンチオ選択的スルホ酸化（ｓｕｌｐｈｏｘｉｄａｔｉｏｎ）
ｅ．部位選択的および立体選択的バイエル−ビリジャー（Ｂａｙｅｒ−Ｖｉｌｌｉｇｅｒ）酸化
６． ハロペルオキシダーゼ
ａ．ハロゲンイオンの求核性部位への酸化的付加
ｂ．次亜ハロゲン酸（ｈｙｐｏｈａｌｏｕｓ ａｃｉｄ）のオレフィン結合への付加
ｃ．シクロプロパンの環開裂
ｄ．活性型芳香族基質のオルト誘導体およびパラ誘導体への変換
ｅ．１．３ジケトンの２−ハロ誘導体への変換
ｆ．硫黄および窒素を含有する基質の異原子酸化
ｇ．エノールアセタート、アルキン、および活性型芳香環の酸化
【０２３８】
７． リグニンペルオキシダーゼ／ジアリールプロパンペルオキシダーゼ
ａ．Ｃ−Ｃ結合の酸化的切断
ｂ．ベンジルアルコールのアルデヒドへの酸化
ｃ．ベンジル炭素のヒドロキシル化
ｄ．フェノール二量体化
ｅ．ジオール形成のための二重結合のヒドロキシル化
ｆ．リグニンアルデヒドの切断
８． エポキシド加水分解酵素
ａ．エナンチオ的に純粋な生理活性化合物の合成
ｂ．エポキシドの部位選択的およびエナンチオ選択的な加水分解
ｃ．エポキシド形成のための、モノオキシゲナーゼによる芳香族およびオレフィン族のエポキシ化
ｄ．ラセミエポキシドの分離
ｅ．ステロイドエポキシドの加水分解
９． ニトリルヒドラターゼ／ニトリラーゼ
ａ．脂肪族ニトリルの、カルボキサミドへの加水分解
ｂ．芳香族、ヘテロ環族、不飽和脂肪族ニトリルの、対応する酸への加水分解
ｃ．アクリロニトリルの加水分解
ｄ．芳香族酸、カルボアミド酸、炭素環酸の作製（ニコチンアミド、ピコリンアミド、イソニコチンアミド）
ｅ．アクリルジニトリルの部位選択的加水分解
ｆ．α−ヒドロキシニトリル由来のα−アミノ酸
１０． アミノ転移酵素
ａ．アミノ基のオキソ酸への転移
１１． アミダーゼ／アシラーゼ
ａ．アミド、アミジン、およびその他のＣ−Ｎ結合の加水分解
ｂ．非天然アミノ酸の分離および合成
【０２３９】
これらの例示は、本発明のある特定の局面を説明するが、制限を描出するものではなく、また開示された発明の範囲を限定するものではない。
したがって本発明の一つの局面によると、多数の祖先核酸鋳型配列が一つ又は複数の境界点（ｄｅｍａｒｃａｔｉｏｎ ｐｏｉｎｔ）を選択するために整列化され、境界点は相同的領域に位置することができ、一つ又は複数の核酸からなり、境界点は少なくとも２つの祖先鋳型により共有される。境界点を、作製されるべき核酸構築ブロックの境界を記述するために使用することができる。したがって祖先分子内で同定および選択された境界点は子孫分子の集合における潜在的なキメラ化点としてはたらく。
好ましくは、利用可能な境界点は少なくとも２つの祖先鋳型により共有された（少なくとも１つの相同核酸塩基からなる）相同的領域である。より好ましくは、利用可能な境界点は少なくとも半分の祖先鋳型により共有された相同的領域である。なおより好ましくは、利用可能な境界点は少なくとも３分の２の祖先鋳型により共有された相同的領域である。更により好ましくは、利用可能な境界点は少なくとも４分の３の祖先鋳型により共有された相同的領域である。更に一層より好ましくは、利用可能な境界点はほとんど全ての祖先鋳型により共有された相同的領域である。なお一層より好ましくは、利用可能な境界点は全ての祖先鋳型により共有された相同的領域である。
核酸構築ブロック設計および集合されるべき核酸構築ブロックの互いに互換的にライゲーションされうる末端の設計過程は、図６および図７に図示される。示されたように、祖先鋳型セットのアラインメントはいくつかの天然の境界点を明らかにし、これらの鋳型により共有される境界点の同定は、作製され子孫キメラ分子の作製のために使用されるべき構築ブロックを非確率的に決定することのに役立つ。
【０２４０】
好ましい態様において本発明は、徹底的なライブラリーを作製するために、ライゲーション再集合過程が徹底的に実施されることを提供する。別の言い方をすれば、核酸構築ブロックの全ての可能な順序の組み合わせが、最終キメラ核酸分子のセット中に示される。同時に、特に好ましい態様においては、各組み合わせにおける集合順序（すなわち各最終キメラ核酸の５’から３’配列における各構築ブロックの集合の順序）は設計による（又は非確率的である）。本発明の非確率的性質のために、望ましくない副産物の可能性は大きく減少する。
別の好ましい態様において、たとえば体系的に区分されたライブラリーを作製するために、例えば一つずつ、体系的にスクリーニングされうる区分を用いてライゲーション再集合過程が体系的に実施されることを本発明は提供する。別の言い方をすれば、連続的段階的集合反応の選択的で適切な使用と組み合わせた、特定の核酸構築ブロックの選択的で適切な使用を通じて、特定のセットの子孫産物が数個の反応容器各々の中で作製される実験的設計が達成されうることを、本発明は提供する。これは体系的な実験およびスクリーニング方法の実施を可能にする。したがって、潜在的な非常に多数の子孫分子がより少ない群で体系的に試験されることを可能にする。
非常に柔軟で更に同時に徹底的ならびに体系的でもある方法でキメラ化を実施する能力があるので、特に祖先分子間に低いレベルの相同性がある場合、本発明は多数の子孫分子からなるライブラリー（またはセット）の作製を提供する。本ライゲーション再集合発明の非確率的性質のために、作製される子孫分子は、好ましくは設計により選抜される全集合の順序を有する最終キメラ核酸分子のライブラリーからなる。本発明の特に好ましい態様では、そのような作製ライブラリーは、好ましくは１０３超の異なる子孫分子種、より好ましくは１０５超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは１０１０超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは１０１５超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは１０２０超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは１０３０超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは１０４０超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは１０５０超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは１０６０超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは１０７０超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは１０８０超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは１０１００超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは１０１１０超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは１０１２０超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは１０１３０超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは１０１４０超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは１０１５０超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは１０１７５超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは１０２００超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは１０３００超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは１０４００超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは１０５００超の異なる子孫分子種、さらにより好ましくは１０１０００超の異なる子孫分子種からなる。
【０２４１】
ある局面において、記載されたとおり作製された最終的なキメラ核酸分子のセットはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる。ある好ましい態様によると、このポリヌクレオチドは遺伝子であり、人工遺伝子であってもよい。別の好ましい態様によると、このポリヌクレオチドは、人工遺伝子経路でありうる遺伝子経路である。本発明により作製された一つ及び複数の人工遺伝子は、真核生物（植物を含む）内で実施可能な経路等の、人工遺伝子経路に組み込まれうることを本発明は提供する。
境界点の選択、核酸構築ブロックの大きさおよび数、ならびに結合の大きさおよび設計に関して選択と制御の大きな自由があるので、本発明の力は並はずれていることが認識される。さらに、分子間相同性の必要性が本発明の運用性に対しては非常に緩和されていることが認識される。実際、ほとんどまたは全く分子間相同性を有さない領域においても境界点は選択されることさえできる。たとえば、コドンゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）、すなわちコドンの縮重のために、対応する祖先鋳型に本来コードされるアミノ酸を変更することなく核酸構築ブロックにヌクレオチド置換を導入することができる。または本来のアミノ酸に関するコードが変更されるようにコドンを変更することができる。分子間相同的な境界点の頻度を増加させ、したがって構築ブロック間での結合数の増加が達成され、その結果より多数の子孫キメラ分子が作製されるようになるように、そのような置換が核酸構築ブロックに導入されうることを本発明は提供する。
別の例示においては、構築ブロックが作製される段階における合成的性質は、後にインビトロ過程（例えば変異誘発による）またはインビボ過程（例えば宿主生物の遺伝子スプライシング能を利用することによる）において任意に除去されうるヌクレオチド（例えば、コドンもしくはイントロンまたは調節配列であってもよい、例えば一つ又は複数のヌクレオチド）の設計および導入を可能にする。利用可能な境界点を作製するという潜在的な恩典に加えて他の多くの理由により、これらの核酸の導入もまた多くの場合望ましくありうることが認識される。
【０２４２】
それゆえ、別の態様によると、核酸構築ブロックはイントロンを導入するために使用されうることを本発明は提供する。したがって、機能的イントロンが本発明の人工遺伝子に導入されうることを本発明は提供する。機能的イントロンが本発明の人工遺伝子経路に導入されうることもまた本発明は提供する。したがって、１つ（または複数）の人工的に導入されたイントロンを含む人工遺伝子であるキメラポリヌクレオチドの作製を本発明は提供する。
したがって、１つ（または複数）の人工的に導入されたイントロンを含む人工遺伝子経路であるキメラポリヌクレオチドの作製もまた本発明は提供する。好ましくは、天然のイントロンが遺伝子スプライシングにおいて機能的にはたらくのとほぼ同様に、人工的に導入されたイントロンが一つ又は複数の宿主細胞において遺伝子スプライシングに関して機能的である。本発明は、組換えおよび／またはスプライシングのために宿主生物に導入されるべき人工イントロン含有ポリヌクレオチドを作製する過程を提供する。
本明細書に記載された結合を用いて、祖先分子の中でほとんどまたは全く相同性を有さない領域においてキメラ化を達成する能力は特に有用であり、新規遺伝子経路の集合のためには実際必須である。それゆえ本発明は合成ライゲーション再集合を用いて新規人工遺伝子経路を作製することを提供する。特定の局面においては、意図された宿主に導入された場合新規遺伝子経路に運用性を附与するために、意図された宿主で実施可能なプロモータ等の調節配列を導入することによりこれは達成される。特定の例示において、本発明は意図された多数の宿主において（例えば植物細胞と同様に微生物において）実施可能な新規人工遺伝子経路を作製することを提供する。これは例えば、最初に意図された宿主で実施可能な調節配列および別の意図された宿主で実施されうる調節配列からなる多数の調節配列を導入することにより達成される。３番目に意図された宿主種等での遺伝子経路の運用性を達成するために同様の過程が実施されうる。意図された宿主種の数は１から１０の間の各整数であることができ、または代替的に１０を超えることができる。または、例えば、多数の意図された宿主での遺伝子経路の運用性は、多数の意図された宿主における本質的な運用性を有する１つの調節配列の導入により達成されうる。
【０２４３】
したがって特定の態様によると、本発明は、核酸構築ブロックが調節配列、特に遺伝子発現の調節配列を導入するために用いられうることを提供する。好ましい調節配列は、人工のもの、ならびに古細菌性、細菌性、真核性（ミトコンドリア性を含む）、ウイルス性、プリオン性及びプリオン様の生物で発見されるものを含むが、これらに限定されない。好ましい調節配列は、プロモーター、オペレーター、及び活性化因子結合部位を含むが、これらに限定されない。したがって本発明は、本発明の人工遺伝子に機能的調節配列を導入してもよいことを提供する。本発明はまた、本発明の人工遺伝子経路に機能的調節配列を導入してもよいことを提供する。
したがって、本発明は一つ（又は複数）の人工的に導入された調節配列を含む人工遺伝子であるキメラポリヌクレオチドの作製を提供する。したがって本発明はまた一つ（又は複数）の人工的に導入された調節配列を含む人工遺伝子経路であるキメラポリヌクレオチドの作製を提供する。好ましくは人工的に導入された調節配列は人工ポリヌクレオチドにおいて動作可能に一つ又は複数の遺伝子に連結され、一つ又は複数の宿主細胞において機能的である。
本発明のために利用可能な好ましい細菌性プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐを含む。利用可能な真核性プロモーターは最初期ＣＭＶ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、早期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来ＬＴＲ、およびマウスメタロチオネインーＩを含む。特定の植物調節配列は、植物またはその部分の用途に依存して、構成的なまたはステージおよび／もしくは組織特異的な、植物における転写の指示において活性なプロモーターを含む。これらのプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター（Ｇｕｉｌｌｅｙら、１９８２）等の構成的発現を示すプロモーター、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子のプロモーター（Ｃｏｒｕｚｚｉら、１９８４）等の葉特異的発現のためのプロモーター、グルタミン合成酵素遺伝子由来のプロモーター（Ｔｉｎｇｅｙら、１９８７）等の根特異的発現のためのプロモーター、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）由来のクルシフェリン（ｃｒｕｃｉｆｅｒｉｎ）Ａプロモーター（Ｒｙａｎら、１９８９）等の種子特異的発現のためのプロモーター、ジャガイモ由来クラス１パタチン（Ｐａｔａｔｉｎ）プロモーター（Ｒｏｃｈａ−Ｓａｓａら、１９８９、Ｗｅｎｚｌｅｒら、１９８９）等の塊茎特異的発現のためのプロモーター、またはトマト由来ポリガラクツロナーゼ（ＰＧ）プロモーター（Ｂｉｒｄら、１９８９）等の果実特異的発現のためのプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【０２４４】
本発明のために好ましい他の調節配列は、ターミネーター配列およびポリアデニル化シグナルならびに植物内でそのように機能する任意の配列を含み、その選択は当業者のレベル内である。そのような配列の例はアグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノパリン合成酵素（ｎｏｓ）遺伝子の３’隣接領域である（Ｂｅｖａｎ、１９８４）。調節配列はまた、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーター内に見られるようなエンハンサー配列、およびアルファルファモザイクウイルス（Ａ１ＭＶ）ＲＮＡ４のリーダー配列のようなｍＲＮＡ安定化配列（Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅら、１９８０）または類似の様式で機能するその他の任意の配列も含みうる。
本発明を使用して作製された人工遺伝子はまた、他の核酸との組換えのための基質としてもはたらくことができる。同様に、本発明を使用して作製された人工遺伝子経路もまた他の核酸との組換えのための基質としてもはたらくことができる。好ましい例では、人工イントロン含有遺伝子および組換え相手としてはたらく核酸との間の相同的領域により組換えが促進され、またはそこで組換えがおこる。ある特に好ましい例では、組換え相手は、人工遺伝子または人工遺伝子経路を含む、本発明により作製された核酸であってもよい。人工遺伝子に人為的に導入された一つ（又は複数）のイントロンに存在する相同的領域により組換えが促進されてもよく、またはそこで組換えがおこってもよい。
本発明の合成ライゲーション再集合法は多数の核酸構築ブロックを利用し、その各々は好ましくは２つのライゲーション可能末端を有する。各核酸構築ブロック上の２つのライゲーション可能末端は、２つの平滑末端（すなわち各々が０個の核酸の突出を有する）または好ましくは１つの平滑末端および１つの突出、またはなおより好ましくは２つの突出であってもよい。
この目的のために利用可能な突出は、３’突出または５’突出であってもよい。したがって核酸構築ブロックは１つの３’突出もしくは代替的な１つの５’突出を、もしくは代替的に２つの３’突出を有する、または別に２つの５’突出を有してもよい。核酸構築ブロックが最終キメラ核酸分子を形成するために集合される全体の順序は、意図的な実験的設計により決定され、ランダムではない。
【０２４５】
ある好ましい態様によると、核酸構築ブロックは、２つの一本鎖核酸の化学合成（一本鎖オリゴとも呼ばれる）および、二本鎖核酸構築ブロックを形成するようにそれらをアニーリングさせるために接触させることにより、作製される。
二本鎖核酸構築ブロックは様々な大きさであることができる。これらの構築ブロックの大きさは実験者の選択により小さくても大きくてもよい。好ましい構築ブロックの大きさは１塩基対（突出は全く含まない）から１００，０００塩基対（突出は全く含まない）の範囲内である。また他の好ましい大きさの範囲は、１塩基対から１０，０００塩基対の下限（その間の全整数を含む）および２塩基対から１００，０００塩基対の上限（その間の全整数を含む）を有するものとしても与えられる。
ポリメラーゼに基づく増幅の現在の方法は、数万塩基対ではないとしても数千塩基対長までの二本鎖核酸を高忠実度で作製するために使用することができることが認識される。化学合成（例えばホスホラミダイトに基づく）を、数百塩基対長までの核酸を高忠実度で形成するために使用することができる。しかしながら望ましいならば数万塩基対ではないとしても、例えば突出または粘着末端を用いて、数千塩基対長までの二本鎖核酸を形成させるためにこれらを集合させることができる。
本発明によれば方法の組み合わせもまた使用することができる（例えばホスホラミダイトに基づく化学合成およびＰＣＲ）。したがって異なる方法で作製された核酸構築ブロックもまた、本発明の子孫分子を作製するために組み合わせて使用されうる。
核酸構築ブロックを作製するための化学合成の使用は本発明において特に好ましく、そして、手順上の安全性および容易性を含むその他の理由においても同様に有利である。クローニングまたは収集もしくは任意の生物学的試料の実際の操作は必要とされない。核酸構築ブロックの設計を紙上で達成することができる。したがって本発明は組換え技術における手順の安全性の進展を教示する。
【０２４６】
それにもかかわらずある好ましい態様においては、本発明による二本鎖核酸構築ブロックはポリヌクレオチド鋳型のポリメラーゼに基づく増幅により作製されうる。非制限的な例示においては、図２に図示するように、プライマー、Ｆ２およびＲ１の最初のセットを用いたポリメラーゼに基づく最初の増幅反応が、本質的に産物Ａと同一の平滑末端産物（反応１、産物１と標識）を作製するために使用される。プライマー、Ｆ１およびＲ２の第二のセットを用いたポリメラーゼに基づく第二の増幅反応が、本質的に産物Ｂと同一の平滑末端産物（反応２、産物２と標識）を作製するために使用される。これらの２つの産物が混合ならびに融解およびアニーリングされ、２つの突出を有する潜在的に有用な二本鎖核酸構築ブロックを作製する。図２の実施例において、３’突出を有する産物（産物Ｃ）が、例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩ等の３’作用性エキソヌクレアーゼを用いたその他の３種の産物をヌクレアーゼに基づく破壊を行うことにより選択される。例えば代わりに産物Ｄを選択するために、５’作用性エキソヌクレアーゼ（例えばレッドα）もまた使用されうることが認識される。ハイブリダイゼーションに基づく手段を含む他の選択手段もまた使用されうること、及び所望の産物の分離を容易にするために磁性ビーズに基づく手段などのさらなる手段をこれらの手段に組み入れてもよいこともまた認識される。
本発明で利用可能な二本鎖核酸構築ブロックがそれにより作製されうるような、他の多くの方法が存在する。これらは当技術分野において既知であり当業者によって容易に実施されうる。
本発明の特に好ましい態様によると、最初に２本の一本鎖核酸を作製し、それらをアニーリングさせて、二本鎖核酸構築ブロックを形成させることにより、本発明で利用可能な二本鎖核酸構築ブロックが作製される。二本鎖核酸構築ブロックの２本の鎖は突出を形成する任意のヌクレオチド以外の全てのヌクレオチドにおいて相補的であってもよく、したがって突出以外にはミスマッチを含まない。別の態様によると、二本鎖核酸構築ブロックの２本鎖は突出を形成する任意のヌクレオチド以外の全ヌクレオチドより少ない数において相補的である。したがって本態様によると、二本鎖核酸構築ブロックを、コドン縮重を導入するために使用することができる。好ましくは一つ又は複数のＮ、Ｎ、Ｇ／Ｔカセットを用いてまたは代替的な一つ又は複数のＮ、Ｎ、Ｎカセットを用いて、本明細書に開示された部位飽和性変異誘発を用いて、コドン縮重が導入される。
【０２４７】
本発明による順序集合を達成するための例示的実験的設計のなかには、
１）特定の核酸構築ブロックの設計；
２）各核酸構築ブロックにおける特定のライゲーション可能末端の設計；
３）核酸構築ブロックの特定の集合順序の設計
が含まれる。
突出は３’突出または５’突出であってもよい。また突出は末端リン酸基を有してもよく、または末端リン酸基を有さなくてもよい（すなわちたとえば代わりに水酸基を有する）。突出は任意の数のヌクレオチドからなってもよい。好ましくは突出は０ヌクレオチド（平滑末端におけるように）から１０，０００ヌクレオチドからなる。したがって幅広い領域の大きさの突出が利用可能であってもよい。したがって下限は１−２００の間の各整数であってもよく、上限は２〜１０，０００の間の各整数であってもよい。ある特定の例示によると、突出は（その間の全ての整数値を含む）１ヌクレオチドから２００ヌクレオチドの間のいずれからなってもよい。
全ての設計構築ブロックが集合されるまで、順次２つまたはそれ以上の構築ブロックを一度に集合させることにより、最終キメラ核酸分子は作製されうる。作用試料は、２つの集合段階の実施の間の、大きさ選択もしくは精製または他の選択もしくは濃縮過程のための方法に任意に供されうる。または最終的なキメラ核酸分子は、全ての設計された構築ブロックが一つの段階において同時に集合することにより作製されうる。
【０２４８】
有用性
本発明のインビボ組換えを、特定のポリヌクレオチド、又は配列が未知のハイブリッドまたは対立遺伝子のプールにおいて盲目的に行うことができる。しかしながら、特定のポリヌクレオチドの実際のＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列を知る必要はない。
混合された遺伝子集団の中での組換えを使うことのアプローチは、任意の有用なタンパク質、たとえばインターロイキンＩ、抗体、ｔＰＡ及び成長ホルモンの作製に有用でありうる。このアプローチは、変化した特異性又は活性を持つタンパク質の作製に使われうる。アプローチはまた、ハイブリッド核酸配列、たとえば、遺伝子のプロモーター領域、イントロン、エキソン、エンハンサー配列、３１非翻訳領域、又は５１非翻訳領域の作製に有用でありうる。したがってこのアプローチは、発現において増大した速度を持つ遺伝子の作製に使われうる。このアプローチはまた、繰り返しＤＮＡ配列の研究においても、有用でありうる。最後にこのアプローチは、リボザイム又はアプタマーを変異させるためにも有用でありうる。
タンパク質において多様性の領域を分けている骨格様領域は特に、本発明の方法に適しうる。保存骨格は、特定の結合を媒介する比較的制限されないループ構造を示す一方で、自己会合による全体の折り畳み構造を決定する。このような骨格の例としては、免疫グロブリンβバレル構造や４−ヘリックスバンドルがあげられる。本発明の方法は、結合のための変異配列のさまざまな組み合わせを持つ骨格様タンパク質を作製するのに用いられうる。
いくつかの標準的な遺伝子交配と同等なものもまた、本発明の方法によって行われうる。例えば、「分子」戻し交配を、関心対象の変異の選択の一方で、ハイブリッドの核酸と野生型の核酸との繰り返し混合によって行うことができる。伝統的な品種改良においてみられるように、このアプローチを、異なった供給源からの表現型を結合させ選択のバックグラウンドにするために使用することができる。それは、たとえば、選択されない特徴（すなわち免疫原性）に影響を与える中立の変異の除去のためにも有用である。したがって、タンパク質におけるどの変異が増強された生物学的活性に含まれるのかどうかを判定することは有用でありうる。
【０２４９】
末端選択
本発明は、出発物質のセットであるポリヌクレオチドからポリヌクレオチドのサブセットを選択する方法を提供し、その方法は、それぞれの選択可能なポリヌクレオチドとしての選択（陽性選択）及び／またはそれぞれの選択可能なポリヌクレオチドに対抗する選択（陰性選択）を行うことが可能になるように、作用しているポリヌクレオチドのどこかに存在している一個またはそれ以上の選択可能な特徴（即ち選択マーカー）を識別できる能力に基づいている。好ましい局面において末端選択法といわれる方法が提供され、その方法は、選択可能なポリヌクレオチドの末端領域に部分的、または完全に局在した選択マーカーを使用することに基づいており、そしてそのような選択マーカーは「末端選択マーカー」と命名することができる。
末端選択法は、天然に産生される配列の検出に基づいていてもよいし、もしくは実験的に導入された配列（この明細書で述べられているどれかの突然変異誘導性方法による配列やこの明細書に記載されていない何らかの突然変異誘導性方法による配列を含む）の検出に基づいていてもよく、また同じポリヌクレオチド内にあるならばその両方に基づいていてもよい。末端選択マーカーは構造的な選択マーカーであってもよいし、また機能的選択マーカーであってもよいし、あるいは構造的と機能的の両方の選択マーカーであってもよい。末端選択マーカーは、ポリヌクレオチド配列を含んでいたり、またポリペプチド配列を含んでいたり、また何らかの化学的構造を含んでいたり、また何らかの生物学的もしくは生化学的標識を含んでいたりでき、それには放射活性、酵素活性、蛍光、何らかの光学的特徴、磁気的性質（例えば磁気ビーズを用いる）、免疫応答性、及びハイブリダイゼーションの検出に基づく方法を用いて選択されうるマーカーが含まれる。
【０２５０】
末端選択法は、突然変異誘発を起こすのに役立つ何らかの方法と組み合わせて適用することができる。このような突然変異誘発法には、限定するわけではないが、ここに記載された（上記及び下記）方法が含まれる。このような方法には、限定的でない例示の様式でここに記載されている方法、または次の用語のどれかでこの技術分野の他の人による方法が含まれる。即ち、「飽和突然変異誘発」、「シャッフリング」、「組換え」、「再集成法」、「エラープローンＰＣＲ」、「アセンブリＰＣＲ」、「セクシュアルＰＣＲ」、「クロスオーバーＰＣＲ」、「オリゴヌクレオチドプライマー誘導性突然変異誘発」、「帰納的（及び／または指数関数的）調和の突然変異誘発（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｖａｎ、１９９２参照）」「カセット突然変異誘発」「インビボでの突然変異誘発」、及び「インビトロでの突然変異誘発」である。さらに末端選択法は、何らかの突然変異誘発及び／または増幅法によって生成した分子で行うとよい（例えば、Ａｒｎｏｌｄ、１９９３、Ｃａｌｄｗｅｌｌ及びＪｏｙｃｅ、１９９２、Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４参照、その方法の後で、望ましい子孫分子を選択する（存在についてのスクリーニングを含む）ことが望ましい。
さらに末端選択法を、突然変異誘発法とは別のポリヌクレオチドに対して適用することもできる。好ましい態様ではここに記載したような末端選択法は、例えば別のポリヌクレオチドにライゲーションする（ベクターへのライゲーションを含む）段階のような、クローニング段階を容易化する目的で使用することが可能である。こうして本発明は、望ましいポリヌクレオチドのライブラリーの構築、選択及び／または富化を、概して言うとクローニングを容易にするのに役立つ手段としての末端選択法を提供する。
特に好ましい態様では、末端選択法はポリヌクレオチドとしての（ポジティブ）選択に基づくであろうし、別法の末端選択法はポリヌクレオチドに対抗する（ネガティブ）選択に基づくであろうし、さらに別法では末端選択法はポリヌクレオチドとしての（ポジティブ）選択とポリヌクレオチドに対抗する（ネガティブ）選択との両方に基づくであろう。末端選択法は他の選択及び／またはスクリーニング法と平行して、似ていたり、似ていなかったりする選択及び／またはスクリーニング法と便利な突然変異誘発法との組み合わせとともに反復方式で実行することができ、そのすべては反復方式で、そして何らかの順番で、組み合わせて、また入れ替えて行うことができる。
【０２５１】
本発明のある態様による末端選択法はまた、少なくとも部分的に環状（例えば、プラスミドもしくは何らかの他の環状ベクター、または部分的に環状である他のポリヌクレオチド）、及び／または分枝状、及び／または何らかの化学的置換基もしくは部分で修飾されていたり置換されていたりするポリヌクレオチドを選択するために利用できる点も高く評価される。この態様によるとポリヌクレオチドは中間体または中心領域を含む環状分子であってもよく、その領域は５’隣接領域（末端選択法の目的で、非環状ポリヌクレオチドの５’末端領域に類似の方式で役立つ領域）の脇の５’側に隣接し、また３’末端領域（末端選択法の目的で、非環状ポリヌクレオチドの３’末端領域に類似の方式で役立つ領域）の脇の３’側に隣接している。この非限定的な例示で用いられるように、どれか二つの領域の間で重複する配列があるかもしれないし、また３つの領域すべてが同等であるかもしれない。
本発明のある非限定的な局面における線状ポリヌクレオチドについての末端選択法は、ポリヌクレオチド末端即ち末端部（５’末端または３’末端のいずれであってもよい）に、もしくはその近くに位置する少なくとも一つの末端選択マーカーが存在することに基づいた一般的なアプローチを用いて行われる。ある特定の非限定的な例では末端選択法は、末端にあるか末端近くにある特定の配列、例えば限定するわけではないがポリヌクレオチド配列を認識する酵素によって認識される配列に対する選択に基づいている。ポリヌクレオチドの化学的修飾を認識し、触媒する酵素は、この明細書ではポリヌクレオチド作用性酵素といわれている。好ましい態様では役立つポリヌクレオチド作用性酵素は、ポリヌクレオチド開裂活性を持つ酵素、ポリヌクレオチドメチル化作用を持つ酵素、ポリヌクレオチドライゲーション作用を持つ酵素、及び複数の識別可能な酵素作用を持つ酵素（排他的ではなく、例えばポリヌクレオチド開裂作用とポリヌクレオチドライゲーション作用の両方を含む）によって非排他的に例示されている。
【０２５２】
したがって関連するポリヌクレオチド作用性酵素には、何らかの商業的に入手可能か、非商業的に入手可能なポリヌクレオチドエンドヌクレアーゼ、及びそれらの仲間のメチラーゼが含まれ、ウェブ部位ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｒｅｂａｓｅでカタログが掲載されているものや次に引用した参照文献（Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＭａｃｅｌｉｓ、１９９６）で述べられているものが含まれる。好ましいポリヌクレオチドエンドヌクレアーゼには、限定するわけではないがタイプＩＩ制限酵素（タイプＩＩＳを含む）が含まれ、また二本鎖のポリヌクレオチドの両方の鎖を開裂する酵素（例えば、ＮｏｔＩ、これは両方の配列を５’．．．ＧＣ／ＧＧＣＣＧＣ．．．３’で開裂する）と、二本鎖のポリヌクレオチドの一方の鎖のみを開裂する酵素、即ち、ポリヌクレオチドニック形成作用を持つ酵素（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ、これは５’．．．ＧＡＧＴＣＮＮＮＮ／Ｎ．．．３’で一方の鎖のみを開裂する）も含まれる。また関連するポリヌクレオチド作用性酵素には、タイプＩＩＩの制限酵素も含まれる。
関連するポリヌクレオチド作用性酵素にはまた、現在は入手できないが将来的に開発されるであろう酵素、すなわちポリヌクレオチドのライゲーションに適合する末端、好ましくは接着末端を生じるのに役立つ酵素も含まれることが評価される。
ある好ましい例示において役立つ選択マーカーは、対応するタイプＩＩ（またはタイプＩＩＳ）制限酵素が、ライゲーション可能な末端（平滑末端または少なくとも一個の塩基の突出を持つ接着末端を含む）、即ちポリヌクレオチドの望ましい内部配列を破壊する様式で内的にポリヌクレオチドを開裂することなく望ましいライゲーション反応を行うことに役立つライゲーション可能な末端を形成するようにポリヌクレオチドの末端を開裂するのを可能にするポリヌクレオチドにおける制限酵素部位である。こうして関連する制限酵素部位に含まれる、特定の作用を行うポリヌクレオチドの内部に産生されない（即ち、末端から離れて産生されない）それらの部位が、対応する制限酵素の使用が作用しているポリヌクレオチドを内的に切断することを意図していない場合に好ましいと規定される。これによって制限的な消化反応を完成物に対して、またはほとんど完成物に対して、作用しているポリヌクレオチドの望ましくない内部開裂を伴うことなく行うことが可能になる。
好ましい局面によるとしたがって、末端選択法にかけられるポリヌクレオチドの内部に含まれないか、また別の場合は含まれることが期待されないか、また別の場合は含まれる見込みがない（例えば、作用しているポリヌクレオチドに関する配列情報が不完全である場合）制限酵素部位を使用することが好ましい。この局面によるとかなり低い頻度でしか産生されない制限酵素部位が、より頻度が高く産生される制限酵素部位よりも通常好ましいと認識される。これに対して例えば末端選択法とともに組換え法や他の突然変異誘発性の方法を達成できるようにポリペプチドの内部の開裂が望まれる機会があることも認識される。
【０２５３】
本発明によると、望ましくない内部制限酵素部位を除去するのに用いることができる方法（例えば突然変異誘発法）であることも認識される。また、ポリヌクレオチドの内部に産生されたり、同じ酵素によって認識されたりする感受性の高い制限酵素部位が不足しているのに対し、部分的消化反応（即ち部分的な完成物に進行させる消化反応）は末端領域にある認識部位で消化を達成するために用いることができる点も認識される。ある局面において部分的消化が有用であるが、それは、認識配列が産生される位置及び環境に応じてある酵素が同じ認識配列の選択的な開列を示す点に価値があるためである。例えば、ラムダＤＮＡが５ ＥｃｏＲＩ部位を持っているのに対し、正しい末端に最も近い部位の開裂が分子の中間にある部位よりも１０倍も早く起こると報告されていることも認識されている。また、例えばＳａｃＩＩがラムダＤＮＡに４個の部位を持っているのに対して、ラムダの中心に密集している３個は末端近くの残っている部位（４０ヌクレオチド、３８６ヌクレオチドで）よりも５０倍も早く開裂する。まとめると部位好適性は、多くの研究によってさまざまな酵素に対して報告されている（例えば、Ｔｈｏｍａｓ及びＤａｖｉｓ、１９７５、Ｆｏｒｓｂｌｕｍら、１９７６、Ｎａｔｈ及びＡｚｚｏｌｉｎａ、１９８１、Ｂｒｏｗｎ及びＳｍｉｔｈ、１９７７、Ｇｉｎｇｅｒａｓ及びＢｒｏｏｋｓ、１９８３、Ｋｒｕｇｅｒら、１９８８、Ｃｏｎｒａｄ及びＴｏｐａｌ、１９８９、Ｏｌｌｅｒら、１９９１、Ｔｏｐａｌ、１９９１、及びＰｅｉｎ、１９９１、ほんの少数以外を名付けるため）。現在入手可能であるか、将来には入手できるかそのいずれかである何らかの役立つポリヌクレオチド作用酵素による部位選択性について、機構的に解釈するだけでなく経験に基づいて観察することも本発明による末端選択法で役立つ可能性があることが認識される。
また、酵素は特定の制限酵素部位の存在に応答して実行中のポリペプチドを切断してしまうが、保護方法を用いることで、その酵素による望ましくない消化に対して特定の制限酵素部位（例えば内部部位）を保護できる点、またそのような保護方法には、望ましくない酵素活性を阻害するメチル化や塩基の置換（例えばＴに代わってＵになる）といった修飾法が含まれる点も注目される。大きな（例えばメガベースの長さ）制限断片を生成するのに充分なほどまれ（例えば、非常に長い認識配列を持つ）である入手可能な制限酵素の数が限られていること、また保護的アプローチ（例えばメチル化による）が酵素の開裂部位の少なさを増強するのに役立つことが認識される。ＮｏｔＩの出現の稀少度を約２倍に増加させるためにＭ．ＦｎｕＩＩ（ｍＣＧＣＧ）を利用することは、たくさんの例のうち、一例にすぎない（Ｑｉａｎｇら、１９９０、Ｎｅｌｓｏｎら、１９８４、Ｍａｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔ、１９８０、Ｒａｌｅｉｇｈ及びＷｉｌｓｏｎ、１９８６）。
【０２５４】
本発明の好ましい局面によると概して、稀少な制限酵素部位の利用が好ましいことが提供される。一般に制限酵素部位の産生頻度は、そこに含まれる塩基の必要条件が曖昧であることによってだけではなく、そこに含まれるヌクレオチドの数によっても決まってくることが正しく認識される。したがって非限定的な例では、一般に例えば８個の特定のヌクレオチド（例えばＮｏｔＩ部位、即ちＧＣ／ＧＧＣＣＧＣであって、それは４８分の１、即ち６５，５３６分の１の相対的産生頻度、ランダム８−ｍｅｒｓと見積もられている）からなる制限酵素部位は例えば６個のヌクレオチド（例えばＳｍａＩ部位、即ちＣＣＣ／ＧＧＧであって、それは４６分の１、即ち４，０９６分の１、ランダム６−ｍｅｒｓと見積もられた相対的産生頻度を持っている）からなる制限酵素部位よりも相対的に頻度が小さく、それは順次、例えば４個のヌクレオチド（例えばＭｓｐＩ部位、即ちＣ／ＣＧＧであって、それは４４分の１、即ち２５６分の１、ランダム４−ｍｅｒｓと見積もられた相対的産生頻度を持っている）からなる制限酵素部位よりは相対的に頻度が小さいことが認められる。さらに別の非限定的な例示では一般に、曖昧な（特異性だけは除いて）塩基の必要条件（例えばＦｉｎ Ｉ部位、即ちＧＴＣＣＣであって、それは４５分の１、即ち１０２４分の１、ランダム５−ｍｅｒｓと見積もられた相対的産生頻度を持っている）をもたない制限酵素部位が、曖昧なＷ（ここでＷ＝ＡまたはＴ）の塩基必要条件（例えばＡｖａＩＩ部位、即ちＧ／ＧＷＣＣであって、４×４×２×４×４分の１−即ち５１２分の１−ランダム５ｍｅｒｓと見積もられた相対的産生頻度を持っている）を持つ制限酵素部位よりも比較的に産生頻度が小さく、それは次に、曖昧なＮ（ここでＮ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ）の塩基必要条件（例えばＡｓｕＩ部位、即ちＧ／ＧＮＣＣであって、４×４×１×４×４分の１−即ち２５６分の１＝ランダム５ｍｅｒｓと見積もられた相対的産生頻度を持っている）を持つ制限酵素部位よりも比較的に産生頻度が小さいことが認められる。これらの相対的産生は、特定のヌクレオチド塩基（特定のヌクレオチド配列を挙げるためでない）が特定のポリヌクレオチドにおいて、また微生物の特定の種において、また微生物の特定の群においては異なる頻度で産生されるため、実際のポリヌクレオチドに対する一般的な見積もりと考えられる。例えば微生物のうちの異なる種のＧ＋Ｃ含有量％が非常に異なることが多く、範囲が広い。
【０２５５】
相対的に頻度の小さい制限酵素部位を選択マーカーとして使用する場合には、非限定的な記載であるが、好ましくは少なくとも４個のヌクレオチド配列を含む制限酵素部位、より好ましくは少なくとも５個のヌクレオチド配列を含む制限酵素部位、さらにもっと好ましくは６個のヌクレオチド配列（例えば、ＢａｍＨ Ｉ部即ちＧ／ＧＡＴＣＣ、ＢｇｌＩＩ部位即ちＡ／ＧＡＴＣＴ、ＰｓｔＩ部位即ちＣＴＧＣＡ／Ｇ、及びＸｂａＩ部位即ちＴ／ＣＴＡＧＡ）を含む制限酵素部位、さらにもっと好ましくは７個のヌクレオチド配列を含む制限酵素部位、さらにより好ましくは８個のヌクレオチド配列（例えば、Ａｓｃ Ｉ部位即ちＧＧ／ＣＧＣＧＣＣ、ＮｏｔＩ部位即ちＧＣ／ＧＧＣＣＧＣ、Ｐａｃ Ｉ部位即ちＴＴＡＡＴ／ＴＡＡ、ＰｍｅＩ部位即ちＧＴＴＴ／ＡＡＡＣ、ＳｒｆＩ部位即ちＧＤＤＤ／ＧＧＧＣ、Ｓｓｅ８３８Ｉ部位即ちＣＣＴＧＣＡ／ＧＣ、及びＳｗａＩ部位即ちＡＴＴＴ／ＡＡＡＴ）を含む制限酵素部位、さらにより好ましくは９個のヌクレオチド配列を含む制限酵素部位、そしてさらに好ましくは１０個のヌクレオチド配列（例えば、ＢｓｐＧＩ部位即ちＣＧ／ＣＧＣＴＧＧＡＣ）を含む制限酵素部位が含まれる。いくつかの制限酵素部位（例えば、クラスＩＩＳ酵素に対する）が、相対的に特異性が高い部分（制限酵素部位の産生頻度についての原理的決定因子を含む部分）を含んでいるとともに、相対的に特異性が低い部分も含んでいること、また開裂部位が相対的に特異性の低い部分に含まれていてもよいし、含まれていなくてもよいことがさらに認識される。例えばＥｃｏ５７Ｉ部位、即ちＣＴＧＡＡＧ（１６／１４）には、比較的特異性の高い部分（即ち、ＣＴＧＡＡＧ部分）と、開裂部位を含む比較的特異性の低い部分（即ち、Ｎ１６配列）とがある。
本発明の別の好ましい態様において、役立つ末端選択マーカーは、特異的なポリヌクレオチド配列を認識するポリヌクレオチド作用性酵素によって認識される末端配列である。この発明の好ましい局面において用いることのできるポリヌクレオチド作用性酵素には、従来よりあるタイプＩＩ制限酵素に加えて、他の酵素も含まれる。本発明のこの好ましい局面によると、役立つポリヌクレオチド作用性酵素にはジャイレース、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、リラキサーゼ、及びそれらに関連する何らかの酵素も含まれる。
【０２５６】
好ましい例の中には、トポイソメラーゼ類（ジャイレースの部分集合として何かでカテゴリー分類されている）と、ポリヌクレオチド開裂作用（好ましくはポリヌクレオチドニック形成作用を含む）及び／またはポリヌクレオチドライゲーション作用を持つ何らかの他の酵素がある。好ましいトポイソメラーゼ酵素にはトポイソメラーゼＩ酵素があり、それは多くの商業的供給元（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｔｈｅｓｂｕｒｇ， ＭＤ）から入手可能で、考えられるところではよりプライベートな供給元と同等である。ここで提供されるような末端選択法にとって役立つ同様の酵素が将来開発されるであろうことが認識される。特に好ましいトポイソメラーゼＩ酵素はワクチンウイルス起源のトポイソメラーゼＩ酵素であり、それは特異的認識配列（例えば、５’．．．ＡＡＧＧＧ．．．３’）を持っているとともに、ポリヌクレオチドニック形成作用とポリヌクレオチドライゲーション作用の両方を備えている。この酵素に特定のニック形成作用（一本の鎖の開裂）があるため、内部の認識部位はニックが形成された末端部位の変性を引き起こす温度でニック形成作用に起因するポリヌクレオチドの破壊を起こしそうにない（幾分アニーリングが残っているだけ）。したがって末端選択法で使用するに際して、トポイソメラーゼに基づく末端選択法についてのニック形成部位は、末端から１００個以下のヌクレオチドであることが好ましく、より好ましくは末端から５０個以下のヌクレオチドであり、さらにより好ましくは末端から２５個以下のヌクレオチドであり、さらにより好ましくは末端から２０個以下のヌクレオチドであり、さらにより好ましくは末端から１５個以下のヌクレオチドであり、さらにより好ましくは末端から１０個以下のヌクレオチドであり、さらにより好ましくは末端から８個以下のヌクレオチドであり、さらにより好ましくは末端から６個以下のヌクレオチドであり、そしてさらにより好ましくは末端から４個以下のヌクレオチドである。
【０２５７】
非限定的でしかも明らかに例示であるような特定の好ましい例示においては、トポイソメラーゼに基づく末端選択法に対するニック形成部位が末端から４個のヌクレオチドである場合、末端選択可能なポリヌクレオチドにおいて相補的な配列から変性する可能性のある４個の塩基（末端領域にある）からなる一本鎖のオリゴヌクレオチドを産生すること、これによってライゲーション反応を確実にするために役立つポリヌクレオチドの接着末端（４個の塩基からなる）が提供されることが認識される。クローニングベクター（好ましくは発現ベクター）へのライゲーション反応を達成するために、適合する接着末端を何らかの手段によって、例えば制限酵素に基づく手段によってクローニングベクターに受け継がせることができる。こうして末端選択可能なポリヌクレオチド末端にある末端ヌクレオチド（この特定の例においては４個の末端塩基からなる）は、ポリヌクレオチドがライゲーションされるべきクローニングベクターで産生させた接着末端との適合性を提供するように広く選択される。
一方、例えば末端から５００個の塩基からなる末端選択可能なポリヌクレオチドの内部ニックの形成は、修復に役立つ（例えばニックを形成する同じトポイソメラーゼ酵素によって）のではなく、相補的配列から容易に変化しない５００個の塩基からなる一本鎖のオリゴヌクレオチドを形成する。
こうして本発明は、例えばワクシニアトポイソメラーゼに基づく、及び／またはタイプＩＩ（もしくはＩＩＳ）制限エンドヌクレアーゼに基づく、及び／またはタイプＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼに基づく、及び／またはニック形成酵素に基づく（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩを用いる）、実行中のポリヌクレオチドの接着末端を形成するための方法であって、その末端がライゲーション反応に適合し、またその末端が少なくとも１個の塩基の突出部を含んでいてもよいような方法を提供する。好ましくはこのような接着末端は少なくとも２塩基の突出を含み、より好ましくはこのような接着末端は少なくとも３塩基の突出を含み、更により好ましくはこのような接着末端は少なくとも４塩基の突出を含み、更により好ましくはこのような接着末端は少なくとも５塩基の突出を含み、更により好ましくはこのような接着末端は少なくとも６塩基の突出を含む。このような接着末端はまた、少なくとも７塩基の突出を含んでいてもよいし、また少なくとも８塩基の突出を、また少なくとも９塩基の突出を、また少なくとも１０塩基の突出を、また少なくとも１５塩基の突出を、また少なくとも２０塩基の突出を、また少なくとも２５塩基の突出を、また少なくとも３０塩基の突出を含んでいてもよい。これらの突出は、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴを含むどれかの塩基を含んでいるとよい。
【０２５８】
トポイソメラーゼまたはニック形成酵素（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ）を用いて導入した接着末端の突出は、自己二量化反応や他の望ましくないコンカテマー形成反応のような、望ましくない断片シャッフリングを抑制するために、ライゲーション反応の環境に独特になるよう設計されるとよい点が認識される。
本発明のある局面によると、複数の配列（ただし必ずしも重複でないかもしれない）が、ポリメラーゼに基づく反応でオリゴヌクレオチドを使用することによって、末端選択可能なポリヌクレオチドの末端領域に導入されうる。関連する場合、ただし限定的な例を意味するのではないが、このようなオリゴヌクレオチドはトポイソメラーゼＩに基づく末端選択法で有用な好ましい５’末端領域を提供するために用いることが可能で、そのオリゴヌクレオチドは、接着末端に変換可能な１−１０個の塩基配列（好ましくはワクシニアトポイソメラーゼＩによって）、リボソーム結合部位（即ち、「ＲＢＳ」であり、それは発現クローニングの際に好適に役立てる）、及びＡＴＧ開始部位と０−１００個の塩基からなる鋳型特異性の配列（ポリメラーゼに基づく反応で鋳型へのアニーリングを容易にするための）が続く任意のリンカー配列を含む。このようにこの例によると、利用可能なオリゴヌクレオチド（フォワードプライマーと言うことができる）は配列、即ち５’［末端配列＝（Ｎ）１１０］［トポイソメラーゼＩ部位及びＲＢＳ＝ＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧ］［リンカー＝（Ｎ）１−１００］［開始コドン及び鋳型特異性配列＝ＡＴＧ（Ｎ）０−１００］３’を持っているとよい。
類似性を備えて関連する場合、ただし限定的な例を意味するのではないが、あるオリゴヌクレオチドはトポイソメラーゼＩに基づく末端選択法で有用な好ましい３’末端領域を提供するために用いることが可能で、そのオリゴヌクレオチドは、接着末端に変換可能な１−１０個の塩基配列（好ましくはワクシニアトポイソメラーゼＩによって）、及び０−１００個の塩基からなる鋳型特異性の配列（ポリメラーゼに基づく反応で鋳型へのアニーリングを容易にするための）が続く任意のリンカー配列とを含む。このようにこの例によると、利用可能なオリゴヌクレオチド（リバースプライマーと言うことができる）は配列、即ち５’［末端配列＝（Ｎ）１−１０］［トポイソメラーゼＩ部位＝ＡＡＧＧＧ］［リンカー＝（Ｎ）１−１００］［鋳型特異性配列＝（Ｎ）０−１００］３’を持っているとよい。
【０２５９】
末端選択法は、親の鋳型分子（たとえば突然変異誘発を起こさせるための）を子孫の分子（例えば突然変異誘発によって生じた）と区別しかつ分離するために用いることができることが認められる。例えばプライマーの第１セットはトポイソメラーゼＩ認識部位を欠いていて、親の分子の末端領域を修飾するために用いることができる（例えばポリメラーゼに基づく増幅で）。異なる第２のセットのプライマー（例えば、トポイソメラーゼＩ認識部位を持つ）はその場合、増幅された鋳型分子由来の突然変異した子孫の分子の末端領域を産生させるために用いることができる（例えば、切断合成法、鋳型スイッチングポリメラーゼに基づく増幅法、もしくは切断合成法のようなどれかのポリヌクレオチドキメラ形成法を用いて、または飽和突然変異誘発法を用いて、またはここに開示されているようなトポイソメラーゼＩの認識部位を突然変異された子孫分子に導入するための何らかの他の方法を用いて）。トポイソメラーゼＩに基づく末端選択法を用いることは、識別を容易化するだけでなく、望ましい子孫分子の選択的トポイソメラーゼＩに基づくライゲーション反応を容易にできる。
このように増幅された親分子に第２セットのプライマーをアニーリングすることは、トポイソメラーゼＩの認識部位に似ているが、機能的なトポイソメラーゼＩ酵素の認識を阻害するのに充分なほど異なっている第１セットのプライマー（即ち、一セットの親分子を増幅するために用いられるプライマー）の配列を含むことによって容易化できる。例えば、どこかの１個の塩基から５個すべての塩基までにＡＡＧＧＧ部位とは異なる配列を、第１セットのプライマー（突然変異誘発にかける前に親の鋳型を増幅させるために用いられる）に導入することができる。特定すると、ただし非限定的な局面であるが、こうして親分子は次の例示的なーただし限定を意味していないがフォワードプライマー及びリバースプライマーからなるセットを用いて増幅できるようになった。
【０２６０】
第１セットのプライマーからなるこの特定の例による（Ｎ１０１００は、好ましくは１０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの長さの鋳型特異性配列、より好ましくは１０ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドの長さの鋳型特異性配列、さらにより好ましくは１０ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドの長さの鋳型特異性配列、及び更により好ましくは１０ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの長さの鋳型特異性配列を表す。
特異的で、しかし限定的でない局面によると、この増幅法（正当なトポイソメラーゼＩの認識部位に欠如のある開示された第１セットのプライマーを用いている）の後で増幅された親分子は、続いて正当なトポイソメラーゼＩの認識部位を持つ一セットまたはそれ以上のセットのフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて突然変異誘発にかけることができる。特定の、しかし限定的でない局面において、こうして親分子が、次の例として挙げたーただし限定的な意味はないーフォワードプライマー及びリバースプライマーからなる第２セットを用いて、突然変異した子孫分子の産生に対する鋳型として用いることができるようになっている。
特定して述べられていないかなりの数の異なるプライマーセットが、本発明と一致する末端選択法のための第１セットのプライマー、第２セットのプライマー、または続くセットのプライマーとして用いることができる。タイプＩＩの制限酵素部位を導入してもよいことに注目されたい（例えば上記の例ではＡｓｃＩ部位）。述べた他の配列に加えて、実験主義では一個またはそれ以上のＮ、Ｎ、Ｇ／Ｔトリプレットを、飽和突然変異誘発に実行中のポリヌクレオチドをかけるために役立つプライマーに導入できるようにされる。まとめると、第２セット及び／または続くセットのプライマーを用いることで、トポイソメラーゼＩ部位を導入することと、子孫のポリヌクレオチドで突然変異を産生させることからなる二つの目的を達成できる。
【０２６１】
したがって、提供されたある使用法において役立つ末端選択マーカーは、産生された一本鎖のオリゴヌクレオチドを変性することでライゲーション互換的な末端を生成するために、酵素が特定部位でポリヌクレオチドを開裂させるのを可能にする酵素認識部位である。生成したポリヌクレオチド末端のライゲーション反応は、同じ酵素（例えば、ワクシニアウイルストポイソメラーゼＩの場合）によって完成させることができるし、また別法では異なる酵素を利用して完成させることもできる。本発明の一局面によると、何らかの役立つ末端先端マーカーが、似ていようと（例えば、二つのワクシニアウイルストポイソメラーゼＩの認識部位）、似ていまいと（例えば、クラスＩＩ制限酵素の認識部位とワクシニアウイルスのトポイソメラーゼＩの認識部位）いずれにせよ、ポリヌクレオチドを選択するために組み合わせて用いることができる。それぞれの選択可能なポリヌクレオチドはこのように、一つまたはそれ以上の末端選択マーカーを持っていてもよく、そして末端選択マーカーと似ていてもよいし、またにていなくてもよい。特定の局面において複数の末端選択マーカーはポリヌクレオチドの一方の末端に位置していてもよいし、また互いに重複する配列を持っていてもよい。
かなりたくさんの酵素が、現在存在するもの又は開発されるべきもののいずれであっても、この発明による末端選択法において役立つことができる点を強調することが重要である。例えばこの発明の特定の局面においては、ニック形成酵素（例えばＮ．ＢｓｔＮＢＩ、これは５’．．．ＧＡＧＴＣＮＮＮＮ／Ｎ．．．３’）は末端選択法を達成するためにポリヌクレオチドライゲーション作用の供給源と連結して用いることができる。この態様によるとＮ．ＢｓｔＮＢＩに対する認識部位トポイソメラーゼＩに対する認識部位の代わりが末端選択可能なポリヌクレオチドに組み入れられるはずである（末端選択法が突然変異した子孫の選択のために用いられるのであろうと、また末端選択法が突然変異誘発段階とは別に用いられるのであろうと）。
【０２６２】
トポイソメラーゼに基づくニック形成法及びライゲーション反応を用いるここで開示された末端選択アプローチは、以前に適用可能な選択方法を越えるいくつかの利点をもつことが認められる。まとめるとこのアプローチによれば、指示クローニング（発現クローニングを含む）を達成できる。特定するとこのアプローチは、直接的ライゲーション反応（即ち、伝統的な制限分解−精製−ライゲーション反応にかけない）、本来の鋳型分子から子孫分子の分離（例えば、本来の鋳型分子がトポイソメラーゼＩ部位を欠如し、それが突然変異誘発後まで導入されない）、サイズ分離段階に対する必要性の回避（例えば、ゲルクロマトグラフィーによって、また他の電気泳動手段によって、またサイズー排除膜を使用することによって）、内部の配列の保存（トポイソメラーゼＩ部位が存在する場合であっても）、及びうまくゆかなかったライゲーション反応についての懸念の排除（例えば、特に望ましくない残基の制限酵素活性が存在する際のＴ４ＤＮＡリガーゼの使用に依存する）、及び容易化された発現クローニング（フレームシフト関連の排除を含む）を達成するために用いることができる。特に作用しているポリヌクレオチドにおける内部の制限酵素部位で（または、望ましくないスター活性のしばしばある予期できない部位でと同じく）作用しているポリヌクレオチドの破壊の潜在的な部位でー起こる望ましくない制限酵素に基づく開裂に対する懸念は、トポイソメラーゼに基づくニック形成反応とライゲーション反応を用いるここで開示した末端選択アプローチによって回避できる。
【０２６３】
３．３ 整調
３．４トランスポゾン
３．４．１． 一般的適用
ある面で、本発明は転移可能な核酸の分野と、核酸に遺伝子の変化を導入する分野に一般的に関連しており、ある実施例では、本発明は、トウモロコシより単離した転移因子や、その転移因子を使って遺伝子を確認／単離し、望ましい遺伝子配列を遺伝し得る方法で植物に挿入するためのプロセスに関連している。また、他の実施例では、本発明はトランスポゾンを高分子量クローニングシステムとして使用することを提案している。
３．４．２． 特定の方法論
３．４．２．１． 転移因子の説明
転移遺伝因子は、非常に広範な原核生物や真核生物に存在するＤＮＡ配列で、ゲノムのある位置から他の位置へ移動、あるいは転移できる。生体内では、染色体内転移、および染色体遺伝要素と非染色体遺伝要素間での転移が知られている。複数のシステム内では、転移は概して転移因子によりエンコードされる転移酵素により制御されていることが知られている。様々な転移因子の遺伝構造や転移メカニズムは、例えば『Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｋｅｎｄｒｅｗ ａｎｄ Ｌａｗｒｅｎｃｅ編集、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ社出版、オックスフォード（１９９４年）（参考のためここに編入））の「Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ」に要約されている。
科学者達は、遺伝子表現の研究のため、レポーター遺伝子を転移させるためにトランスポゾンを利用してきた。これには転写（タイプＩ）融合と翻訳（タイプＩＩ）融合が含まれており、翻訳融合と違い、転写融合はレポーター遺伝子を他のプロモーターの制御下に置く代わりに、２つのタンパク質ドメインを翻訳的に融合しない。翻訳融合は、遺伝子規制を研究するために、興味の対象となる遺伝子の転写シグナルと翻訳シグナルの直接制御下でレポーター遺伝子が表現されるように、一般にトランスポゾン内のレポーター遺伝子とターゲット遺伝子の翻訳枠をリンクするために行われてきた。これには、内部レポータータンパク質と外部翻訳配列を結びつけるために、オープン・リーディング・フレームが転移因子の終わりまで拡張する必要があり、通常、ターゲット遺伝子の完全な不活性化をもたらす。
【０２６４】
３．４．２．２． 体外転移システム
バクテリオファージＭｕと細菌トランスポゾンＴｎ１０の特定の転移因子を使用した体外転移システムは、各々水内潔やＮａｎｃｙ Ｋｌｅｃｋｎｅｒの研究グループにより記述されてきた。
バクテリオファージＭｕシステムは、水内潔氏の論文「Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｐｈａｇｅ Ｍｕ： Ａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（『Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ』７８５−７９４ページ、１９８３年）とＲ． Ｃｒａｉｇｉｅらの論文「Ａ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ＤＮＡ Ｓｔｒａｎｄ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｍｕ Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ： Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ＤＮＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ」（『Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＰＮＡＳ）』ＵＳ， １９８５年８２号７５７０−７５７４ページ）により初めて記述された。ＭｕのＤＮＡドナー培地（ミニＭｕ）の体外反応には、普通６つのＭｕ転移酵素結合サイト（各端で約３０ｂｐの内３つ）と左端から約１ｋｂにあるエンハンサー配列が必要となり、ドナープラスミドはスーパーコイル状でなければならない。必要なタンパク質は、ＭｕによりエンコードされたＡタンパク質とＢタンパク質、およびホストにエンコードされたＨＵタンパク質とＩＨＦタンパク質である。（Ｂ． Ｄ． ＬａｖｏｉｅとＧ． Ｃｈａｃｏｎａｓの論文「Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈａｇｅ Ｍｕ ＤＮＡ」（『Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１９９５年２０４号８３−９９ページ））。体外転移システムの適用において、Ｍｕベースのシステムは、Ｍｕの末端が複雑かつ精巧で、転移には転移酵素に加えてタンパク質を追加する必要があるので、好まれない。
Ｔｎ１０システムは、Ｄ． ＭｏｒｉｓａｔｏとＮ． Ｋｌｅｃｋｎｅｒの論文「Ｔｎ１０ Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｉｒｃｌｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ」（『Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ』１９８７年５１号１０１−１１１ページ）とＨ． Ｗ． ＢｅｎｊａｍｉｎとＮ． Ｋｌｅｃｋｎｅｒの論文「Ｅｘｃｉｓｉｏｎ Ｏｆ Ｔｎ１０ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｄｏｎｏｒ Ｓｉｔｅ Ｄｕｒｉｎｇ Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｏｃｃｕｒｓ Ｂｙ Ｆｌｕｓｈ Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ Ｃｌｅａｖａｇｅｓ ａｔ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｉ」（『ＰＮＡＳ』ＵＳ， １９９２年８９号４６４８−４６５２ページ）で記述された。Ｔｎ１０システムは、転移因子を持つ超らせん円形ＤＮＡ分子（あるいは、線状ＤＮＡ分子＋大腸菌ＩＨＦタンパク質）を伴い、この転移因子は、逆位反復配列に隣接したＩＨＦ結合サイトを持つ、複雑な４２ ｂｐ末端配列により確定されており、実際に、さらに長い（８１ｂｐ）Ｔｎ１０の末端が報告された実験で使用されている。（Ｊ． Ｓａｋａｉらの論文「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｅ−Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｈａｔ ｉｓ ａｎ Ｅａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｉｎ Ｔｎ１０ ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ」（『Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｊｏｕｒｎａｌ』１９９５年１４号４３７４−４３８３ページ））。Ｔｎ１０システムにおいて積極的な転移を支持するためには、転移酵素タンパク質の化学処理は不可欠である。またＴｎ１０因子の末端は総合的体外転移システムにおける有用性を制限している。
【０２６５】
Ｍｕベースの体外転移システムとＴｎ１０ベースの体外転移システムには、どちらも二重鎖の超らせんＤＮＡターゲット上でのみ活動するという制限もある。望ましい体外転移システムと言えば、より短く、より明確に規定された末端を使用し、どんなＤＮＡ構造（線状、多形性 の円形、超らせん円形ＤＮＡ）上でも活動できる、より広く適用可能なものである。
本発明の実施例の代替案によると、複数の特徴を導入したり、突然変異させた一式の有機体を生成する段階には、クローニングのステップが含まれている可能性がある。好ましい実施例によると、本発明はクローニングのステップがＧＰＳ−１のような（しかし、これに限らない）Ｔｎ７トランスポゾンベースのシステムの使用より構成していると規定している。ＧＰＳ−１は、「体外」システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．社製、カタログ番号Ｅ７１００Ｓ）で、ＴｎｓＡＢＣ＊ Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅを使ってＤＮＡターゲットにトランスポゾン（ＴｒａｎｓｐｒｉｍｅｒＴＭ）をランダムに挿入する（Ｎ． Ｌ． Ｃｒａｉｇの論文（『Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１９９６年２０４号２７−４８ページ）、Ａ． Ｅ． Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ ＆ Ｎ． Ｌ． Ｃｒａｉｇの論文（『Ｇｅｎｅｔｉｃｓ』１９９７年１４５号５７３−８５ページ）、 Ｍ． Ｃ． Ｂｉｅｒｙ、Ｆ． Ｊ． Ｓｔｅｗａｒｔ、Ａ． Ｅ． Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ、Ｅ． Ａ． Ｒａｌｅｉｇｈ ＆ Ｎ． Ｌ． Ｃｒａｉｇの論文（『Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ』２０００年２８号１０６７−１０７７ページ）参照）。トランスポゾン挿入配列を利用する上記のようなシステムや、このシステムへの今後の修正は、高分子量ＤＮＡのクローニングの補助に使用でき、またこのようなクローニング法は、細胞スクリーニングの一環として本発明により提供できる。
３．４．２．３．１． アグロバクテリウムのＴｉプラスミドへのトランスポゾンの使用
高等有機体において、トランスポゾンは昔から、あるいは現在でも様々な方法で使われている。例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドにおいては、トランスポゾンは突然変異誘発要因として使われている。つまり、細菌トランスポゾンを使用して、アグロバクテリウムのＴｉプラスミド（双子葉植物におけるクラウンゴール病の原因因子）に、挿入突然変異を引き起こす方法が開発されてきたということである。（Ｐ． Ｚａｍｂｒｉｓｋｉ、Ｈ． Ｇｏｏｄｍａｎ、Ｍ． Ｖａｎ Ｍｏｎｔａｇｕ、Ｊ． Ｓｃｈｅｌｌ著、Ｊ． Ｓｈａｐｉｒｏ編集『Ｍｏｂｉｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ』１９８３年， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社出版、５０６−５３５ページ参照。）この技術によって、猛毒や、Ｔｉプラスミドに起因する植物細胞の腫瘍による形質転換の原因となるプラスミドにより運ばれる遺伝子を見分けることが可能になった。さらに、Ｔｉプラスミドの一部が植物ゲノムに結合可能であり、また実質上どんな有機体からでも、アグロバクテリウムの影響を受け易い双子葉植物へ遺伝子を移転する媒介手段として作用し得ることを、転移因子を使って証明できるようになった。
【０２６６】
３．４．２．３．２． トウモロコシにおけるトランスポゾンの使用
単子葉植物であるトウモロコシにおいて、１９４０年半ばに初めて遺伝子学的に転移因子が確認され、広範囲に渡って研究され、その遺伝子行動は広く検討された（Ｂ． ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋの論文（『Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ』１９５１年１６号１３−４７ ページ）、Ｂ． ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋの論文（『Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ』１９５６年２１号１９７−２１６ページ）、Ｂ． ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋの論文（『Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ』１９６５年１８号１６２−１８４ ページ）、Ｊ． Ｒ． Ｓ． Ｆｉｎｃｈａｍ ＆ Ｇ． Ｒ． Ｋ． Ｓａｓｔｒｙの論文（『Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ』１９７４年８号１５−５０ ページ）、およびＮ． Ｆｅｄｏｒｏｆｆの論文（『Ｍｏｂｉｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ』Ｊ． Ｓｈａｐｉｒｏ編１９８３年， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社出版、１−６３ページ）参照）。
欠失と挿入時代の相同組換え
本発明は、核酸単繊維のライブラリと、ポリペプチドやペプチドのリコンビナーゼを使用した、急速に進化する特定のタンパク質ドメインの構成や方法、また、強化された相同組換え技術を使って同族遺伝子の一つ以上の遺伝子の配列を変更することを目的とした構成や方法に関連している。また本発明は、相同配列族の新しいメンバーを単離し、確認する構成や方法にも関連している。上記の技術は、病気の動物モデルや植物モデルの作成、また薬物や病原菌のスクリーニングの新しいターゲットの特定にも使用できる。
３．５．１．１．２． 相同組換え（ＨＲ）
相同組換え（ＨＲ）は、２つのＤＮＡ分子間における同族、あるいは類似ＤＮＡ配列の交換のことで、ＨＲの不可欠な特徴としては、組換えの原因となる酵素がどんな同族配列でもペアにして培地にできることが挙げられる。ＤＮＡ分子間で遺伝子情報を転送できるＨＲの能力は、遺伝子工学と遺伝子操作において、ターゲットとなる相同組換えを非常に強力な手段にする。遺伝子学研究と細胞学研究のどちらも、高等有機体の減数分裂中に、一組の相同染色体間で、上述の組換えプロセスが起こると指摘してきた。
【０２６７】
３．５．１．１．３． 部位特異的組換え
一方、部位特異的組換えにおいては、大腸菌染色体へのファージＡの組み入れと、大腸菌染色体からのラムダＤＮＡの切り取りに見られるように、特定の位置での組換えが起こる。部位特異的組換えには特定の逆位反復配列が含まれている（例：Ｃｒｅ−ｌｏｘＰとＦＬＰ−ＦＲＴシステム）。これらの配列内には、組換えに必要な相同が、短い距離だけ存在するが、組換えに十分ではない。組換えに関係した酵素は、一般的に他の一組の相同（非相同）配列を組換えることはできないが、特定の行動を取る。
３．５．１．１．４． 部位特異的組換えに対する相同組換えの利点
ＤＮＡ配列の遺伝子工学において、部位特異的組換えも、相同組換えも、どちらも有用なメカニズムではあるが、目標が設定された相同組換えは、例えば他の配列により置換する染色体のＤＮＡ配列を標的とする、二重ＤＮＡ分子における本質的に望ましいどのような配列でも標的にしたり変形したりする基礎となる。部位特異的組換えは、特定の認知部位を持つ染色体の位置にトランスフェクトされたＤＮＡを組み入れる方法として提案されてきた（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎらの論文（『Ｓｃｉｅｎｃｅ』１９９１年２５１号１３５１ページ）、Ｏｎｏｕｃｈｉらの論文（『Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ』１９９１年１９号６３７３ページ））。残念ながら、このアプローチは特定のターゲット配列と組換え酵素の存在を必要とするので、ある特定の染色体位置に組換えの目標を設定する有用性は、目標が設定された普遍的組換えと比較して、極度に限られている。
３．５．１．１．５． ＨＲを利用したトランスジェニック植物や動物、また有機体の造成
相同組換えは、トランスジェニック植物や動物を創造するのにも利用されてきた。トランスジェニック有機体には、安定して組み入れられた、トランスジェニック有機体の染色体中にある他種より派生した遺伝子や遺伝子の構成部のコピーが含まれている。また、標的組換え動物は、相同組換えを含む様々な方法で、異質な遺伝子のＤＮＡ構成部のクローンを分化全能性細胞へ導入することで造成できる。例えば、遺伝子学的に変更された分化全能性細胞より育成された動物は、全体腔細胞、および生殖系細胞中に異質な遺伝子を含んでいる可能性がある。
【０２６８】
３．５．１．１．５．１． 胚性幹細胞を使用した現在の方法
トランスジェニック動物と標的動物を造成する現在の方法は、分化全能性胚性幹細胞（ＥＳ）上で、あるいは受精接合子を用いて行われてきた。ＥＳ細胞は、標的動物を造成する前に、相同組換えによって多数の細胞を体外で簡単に操作できるという利点がある。しかし、現在、マウスの胚性幹細胞のみが生殖細胞系に貢献すると証明されている。一方、前核へＤＮＡをマイクロ挿入し、それを擬似妊娠している受容動物の子宮へ転移し、出産まで育成することで、ＤＮＡは受精卵母細胞にも導入できる。哺乳類細胞とヒト細胞が、染色体に内在する遺伝子に外因性の遺伝子物質を組み入れられる能力は、これらの細胞に固有の配列と導入された配列の間に必要な相同組換えを実行する普遍的酵素機構を所持していることを証明した。これらの標的組換えは、既知の部位で突然変異を修正したり、遺伝子や遺伝子分節を欠陥物と置換したり、また細胞に異質の遺伝子を導入するのに利用できる。
３．５．１．１．５．２． ＨＲの頻度と能率
ＨＲは既知の部位に僅かな突然変異を加えたり、野生型遺伝子や遺伝子分節を置換したり、全く異質な遺伝子を細胞に導入したりするのに利用できるが、ＨＲの能率は生細胞では非常に低く、ＤＮＡ伝達方法、包装方法、サイズと形状、ＤＮＡの長さと標的に相同な配列の位置、および染色体部位における交雑と組換えの能率などを含む、複数のパラメータに依存している。上記の変動するパラメータは、細胞ベースのシステムにおける遺伝子進化への従来のＨＲ法の利用を極度に制限する。（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ らの論文（『ＰＮＡＳ』ＵＳＡ， １９８４年８１号３１５３−３１５７ページ）、Ｓｍｉｔｈｉｅｓらの論文（『Ｎａｔｕｒｅ』１９８５年３１７号２３０−２３４ページ）、Ｓｏｎｇ らの論文（『ＰＮＡＳ』ＵＳＡ， １９８７年８４号６８２０−６８２４ページ）、Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ らの論文（『Ｎａｔｕｒｅ』１９８７年３３０号５７６−５７８ページ）、Ｋｉｍ ＆ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ の論文（『Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ』１９８８年１６号８８８７−８９０３ページ）、Ｋｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈｉｅｓの論文（『ＰＮＡＳ』ＵＳＡ， １９８９年８６号８９３２−８９３５ページ）、Ｓｈｅｓｅｌｙ らの論文（『ＰＮＡＳ』ＵＳＡ， １９９１年８８号４２９４−４２９８ページ）、Ｋｉｍ らの論文（『Ｇｅｎｅ』１９９１年１０３号２２７−２３３ページ））。
【０２６９】
３．５．１．１．５．２．１． リコンビナーゼ活動の存在による強化
ＨＲの頻度は、細胞組織と無細胞組織内のリコンビナーゼの存在により、著しく強化される。ＨＲ（すなわち、リコンビナーゼ活動）を促進する複数のタンパク質や精製抽出物が、原核生物と真核生物に発見されている（Ｃｏｘ ＆ Ｌｅｈｍａｎの論文（『Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ』１９８７年５６号２２９−２６２ページ）、Ｒａｄｄｉｎｇの論文（『Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ』１９８２年１６号４０５−５４７ページ）、ＭｃＣａｒｔｈｙ らの論文（『ＰＮＡＳ』ＵＳＡ， １９８８年８５号５８５４−５８５８ページ））。これらのリコンビナーゼは、相同的に組合わされた中間体の形成や、鎖交換や、他のステップにおける一つ以上のステップを促進する。
近年の進歩は、ｒｅｃＡとＲａｄ５ｌのようなリコンビナーゼや、異種配列を持つ単鎖核酸を使った強化相同組換え（ＥＨＲ）を可能にする技術に繋がった。これにより、配列変更が、事実上どのゲノム部位でも明確に標的にできるようになった。例として、特許協定条約ＵＳ９３／０３８６８とＵＳ９８／０５２２３参照（どちらも参考のため、ここに編入）。
３．５．１．１．５．３． 機能ゲノム学：遺伝子型と表現型の相互関係
生物学において、熱心な興味を集めている分野は「機能ゲノム学」、つまり遺伝子型と表現型の相互関係の分野に関するものである。表現型の変化は生体内で評価する必要があるので、動物組織が必要となる。同様に、この観念に関連しているのは、遺伝子族、つまり構造的に同種の（種族間で配列相同性を持つ）遺伝子やタンパク質の解明と特徴づけである。大多数でないにしても、多くの病状は複数の遺伝子の相互作用に起因しているため、表現型レベルでの遺伝子間、特に遺伝子族内や遺伝子族間の相互作用を評価する能力は非常に価値がある。
しかし、動物や細胞における遺伝子族のメンバーを、簡単に同定し設計できる機能的なゲノム学的ツールはまだない。遺伝子族のメンバー間で共有されるアミノ酸配列モチーフは同じかもしれないが、ＤＮＡコードにおける退化のために、ＤＮＡ配列の識別情報はかなり少ない可能性がある。そのため、遺伝子族のメンバーの遺伝子学的修正に必要な１つの基準は、配列の識別情報をほとんど共有しない、類似したＤＮＡ配列をクローンしたり修正するのに利用できる相同組換え技術を発展させることである。細胞における相同組換えが効果的に作動するには、通常かなりの配列識別情報が必要であるため、これは特に重要である。相同組換えに必要な配列の識別情報量を軽減することで、遺伝子族における一致した配列に修正が加えられたトランスジェニック動物や細胞を造成するために同族遺伝子を標的にする際に、より高い柔軟性を可能にし、また高速クローニング、遺伝子族特異的ライブラリの生成、さらに遺伝子族のメンバーの進化を可能にする。したがって、本発明の目的は、最大限の多様性を生み出しつつ、興味の対象である遺伝子を同定する可能性を高める領域特異的遺伝子進化の効率的な方法を提供することにある。
【０２７０】
３．５．２． 部位特異的遺伝子進化
３．５．２．１． 部位特異的遺伝子進化 − 関心のあるアミノ酸配列、リコンビナーゼ、多数の標的ポリヌクレオチドをエンコードする標的核酸を含む、多数の組換え中間体を形成することを含む
本発明は、関心のあるアミノ酸配列、リコンビナーゼ、多数の標的ポリヌクレオチドをエンコードする標的核酸を含む、多数の組換え中間体を形成することを含む部位特異的遺伝子進化法を提供する。標的ポリヌクレオチドは、お互いに大体において相補的で、標的核酸の予め決められた配列に実体上符号するか相補的であり、ランダム配列か退化配列を包含する相同クランプをそれぞれ含む。予め決められた配列はアミノ酸配列のドメインをエンコードする。また、さらに本手法は、変形された標的核酸のライブラリが生産される、組換えの堪能な細胞で、中間体に接触することを含む。変形された標的核酸は、多様なアミノ酸配列の層を生成するために細胞内に表現される。さらに本手法は、望ましい活動をする様々なアミノ酸を表現する、変形された標的核酸を含む細胞を選択したり単離することを含む。
３．５．２．２． 関心のあるアミノ酸配列、リコンビナーゼ、一組の標的ポリヌクレオチドをエンコードする標的核酸を含む、一つの組換え中間体を形成することを含む
本発明のもう一つの側面において、ある部位特異的遺伝子進化の方法は、関心のあるアミノ酸配列、リコンビナーゼ、一組の標的ポリヌクレオチドをエンコードする標的核酸を含む、一つの組換え中間体を形成することを含む。
標的ポリヌクレオチドは、大体において相補的で、標的核酸の予め決められた配列に実体上符号するか補足的である相同クランプをそれぞれ含む。予め決められた配列はアミノ酸配列のドメインをエンコードする。さらに本手法は、相性がよく制限のない標的核酸を形成するために、単鎖特異的ヌクレアーゼや接合部特異的ヌクレアーゼで中間体に接触することを含む。交雑域や交雑連接域に隣接した領域は、ヌクレアーゼの影響を受け易く、標的核酸は変形された標的核酸のライブラリを作るために再集、再組換えされる。標的核酸は多様なアミノ酸配列の層を生成するために表現され、その多様なアミノ酸配列は、関心のある多様なアミノ酸配列をエンコードする、変形された標的核酸を同定するために、選択され特徴づけられる。
また他の面では、望ましい活動をする多様なアミノ酸配列をさらに進化させるために、各手法は、一度以上繰り返され、さらに他の面では、一つ以上のドメインかタンパク質が同時に進化させられる。
【０２７１】
３．５．３．２０． 標的配列を同定、クローン、改造するために原核生物細胞を使用
好ましい実施例において、原核生物細胞は標的配列、できればタンパク質ドメインを同定、クローン、改造するために使用され、改造には、予め選択された標的ＤＮＡ配列が選ばれている。予め選択された標的ＤＮＡ配列は、できれば染色体外配列に含まれたものを選択する。ここでの「染色体外配列」とは、染色体配列やゲノム配列から分離された配列のことを意味する。好適な染色体外配列には、プラスミド（特に細菌プラスミドのような原核生物プラスミド）、ｐｌベクトル、ウィルス性ゲノム、酵母・細菌類・哺乳類の人工染色体（ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＭＡＣ）、そして必要ではないが、他の独立した自己複製配列が含まれる。ここで説明されたように、染色体配列に含有される標的配列に相同クランプを持つリコンビナーゼと、少なくとも２つの大体において相補的な単鎖標的ポリヌクレオチドが染色体配列に、できれば体外で付加される。２つの単鎖標的ポリヌクレオチドは、できればリコンビナーゼで被覆されており、少なくとも一つの標的ポリヌクレオチドは、少なくとも一つの代替、挿入、あるいは欠失ヌクレオチドを含んでいる。それから、標的ポリヌクレオチドは、相同組換えを達成し、代替、挿入、あるいは欠失を含む変形染色体配列を形成するために、染色体配列内の標的配列に結合する。その後、変形染色体配列は、当業者間で知られている技術を使用して、原核生物細胞に導入され、リコンビナーゼは、当業者間で知られている技術を使用して、できれば標的細胞への導入前に除去される。除去は、例えば、プロテア−ゼＫのようなタンパク質分解酵素、ＳＤＳのような洗浄剤、フェノール抽出液（フェノール／クロロフォルム／イソアミル・アルコール抽出液を含む）などで実施する。上記の方法は真核生物細胞にも使用することができ、その細胞はその後、特にドメインが改造された様々なタンパク質を形成するために、多様な核酸の表現を可能にする条件下で育成される。
【０２７２】
３．５．３．２０．１． 希望する表現型を持つタンパク質の選択と単離
好ましい実施例において、希望する表現型を持つタンパク質は選択、単離され、希望する活動に影響する配列を同定するために変形核酸は配列され、このプロセスは、希望する活動か特性をもつタンパク質を生成するために、必要に応じて反復的に繰り返される。したがって、好ましい実施例において、本発明の方法は、目的のタンパク質か表現型が見られるまで、繰り返される。
また、予め選択された標的ＤＮＡ配列は染色体配列であり、この実施例において、リコンビナーゼを持つ標的ポリヌクレオチドは、標的細胞、できれば真核生物の標的細胞へ導入される。この実施例において、核内の錯体の局在化を容易にするために、標的ポリヌクレオチドへ核局在化シグナルを（一般に非共有的に）結合するのが望ましいかもしれない（Ｋｉｄｏらの論文（『Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ』１９９２年１９８号１０７−１１４ページ）参照（参考のため特別にここに編入））。標的ポリヌクレオチドとリコンビナーゼは、相同組換えを実行するために機能し、結果として変形した染色体配列、あるいはゲノム配列を生じる。
３．５．４．１．１ 特定の遺伝子背景を持つ特別な細菌類の構成
多くの適用法には、特定の遺伝子背景を持つ特別な細菌類の構成が必要とされ、これらの遺伝子背景は、特定の組換えＤＮＡブラスミド構成が、細菌類の背景に欠けている機能を補えるかどうかを決定するためにテストされる枠組みとなっている。もしこのような機能が組換えブラスミドにより提供されているなら、それは特定の一つの遺伝子座や複数の遺伝子座がブラスミドによりエンコードされていることの明確な証明となる。したがって、遺伝子背景の構成は、特定の遺伝子の次のクローニングと探究における不可欠なステップとなっている。
【０２７３】
３．５．４．１．２． 問題の遺伝子除去により、突然変異タンパク質の生産が一切停止し、分析の曖昧性が著しく低減
最も一般的な背景としては、単一の突然変異が細菌類の染色体内の特定の遺伝子に存在していることで、これは結果として、その遺伝子によりエンコードされるタンパク質の不完全版を合成することになることがあり、特定の細胞機能障害を引き起こす。特定の組換えプラスミドの導入によりこの細胞機能障害を修正することは、関連する遺伝子がその特定のプラスミドにクローンを作ったという証明である。しかし、突然変異タンパク質はじっとしておらず、他の構成物と相互作用し合う可能性があるので、結果としてプラスミド遺伝子が、活動的なタンパク質すべてをエンコードした（実際はしていないのに）という見せかけを呈することになり、分析を著しく混乱させることになる。曖昧性がより低く、したがってより望ましいアプローチとしては、問題の遺伝子を除去するという方法があり、その状況下では突然変異タンパク質は一切生産されない。
３．５．４．１．３ 細菌がタンパク質の遺伝子操作のために使用される場合、同一の細菌によって生成される汚染タンパク質を製造する遺伝子を削除することにより、精製ステップを減少させることができる
細菌の染色体から遺伝子を完全に除去することが望ましい、もう一つの状況は、その細菌が遺伝子操作されたタンパク質の生産に使用されている場合である。これらのケースの一例には、インスリン、成長ホルモン、タンパク質Ａ、および大腸菌に挿入された組換え済みの遺伝子に由来するさまざまなワクチンが含まれる。往々にして、大腸菌は遺伝子操作により生成された純化生産物を汚染するタンパク質を生成する。この汚染物質を除去するためにさらなる純化プロセスを追加することも可能だが、汚染質のタンパク質を暗号化する遺伝子を除去することにより、その問題を完全に回避する方がより好ましい。現在遺伝子を変性させるために使用されている方法としては、確率的突然変異、または、遺伝子の一部の突然変異、挿入または除去により遺伝子配列を不活性化することが含まれる。しかし、それでも、不活性なタンパク質の断片を生じさせたり、必要なあるいは希望する以上の染色体を除去してしまうことになる。
【０２７４】
したがって、細菌から特定の遺伝子を除去する方法と手段を提供することが本発明の目的である。
また、本発明のもう一つの目的は、さまざまな細菌におけるｒｅｃＡ遺伝子を挿入そしてまたは不活性化または除去する方法と手段を提供することである。
３．５．４．２． その他の応用
３．５．４．２．１ 細菌染色体内で定義された標的に欠失を生成する
超えなければならない障害は２つある。１つは、細菌染色体内で定義された標的に欠失を生成することである。
３．５．４．２．２ 必須遺伝子でさえ欠失されうる方法を生み出す
２つめは、必須遺伝子でさえ欠失されうる方法を生み出すことである。これは、多くの対象遺伝子が必須だからである。通常必須遺伝子の欠失は、細胞を死に至らしめる。
必須タンパク質には、糖分解酵素、アミノ酸または糖の生合成に関連する酵素、タンパク質および核酸の生合成に関する酵素と要因（ＲＮＡおよびＤＮＡを含む）、酸化、還元、メチル化およびアミノ基転移プロセスのために共同因子の合成に必要な酵素、そして、必須脂質および多糖類または、トランスファーまたはリボゾーマＲＮＡなどの多様な核酸、遺伝子規定要因などの核酸の断片等のその他の必須分子の合成に必要な酵素が含まれる。
そのため、本発明の目的は、生体内でクローニングまたは発現する分子を暗号化する遺伝物質を持たない生体を生成する方法を提供することにある。
本発明のその他の目的は、必須遺伝子をクローニングするのに使用される欠失生体が、限定された状態下においても存続可能である方法を提供することにある。
【０２７５】
３．５．４．３ 特定の応用
３．５．４．３．１． クローニングされたすべての遺伝子に応用できるシングルステップの手順を使った、細菌から遺伝子を欠失させる方法
ここに開示されるのは、クローニングされたすべての遺伝子に応用できるシングルステップの手順を使った、細菌から遺伝子を欠失させる方法である。
この手順は、染色体上の配列を有する線的ＤＮＡ断片の特定部位組換えに依存しており、また二次的なｒｅｃＡ遺伝子の不活性化または欠失と供に、ｒｅｃＡに基づく。この方法は、相同組換えを特定のプラスミド遺伝子に挿入する手順に類似するものである。
３．５．４．３．１．１． 染色体欠失構築の方法
染色体欠失構築の基本的方法は、
線形ＤＮＡ断片を有する細菌の形質変換である。この断片には、抗生物質耐性またはその他の表現型的に認められる遺伝子部分（「マーカー」）を含む。この遺伝子部分は欠失をさせる遺伝子を含む細胞染色体上に狭い間隔で置かれた領域に相同する配列によって位置が決められている。遺伝子全体を効果的に欠失させる、相同配列内の二重乗り換えイベントは、抗生物質耐性表現型のスクリーニングによって選択される。
線形断片は、ｒｅｃＡ遺伝子に発現された酵素が不在の場合、染色体に統合されない。同様に、その遺伝子が不在または不活性の場合には、ｒｅｃＡ遺伝子は、線形組換えイベントの前にその細胞に挿入されている必要があり、その後、不活性化または除去されて、その他の非染色体配列の染色体への二次的な組み入れを防ぐ。細菌がホストとして使われ、プラスミドまたはその他の染色体外要素を続行する配列からの遺伝子操作をされたタンパク質を発現する場合には、これは特に重要である。ｒｅｃＡ遺伝子は、プラスミドのような染色体外要素の形、または染色体への遺伝子の組み入れの形のどちらかで提供される。ｒｅｃＡ遺伝子は、染色体内のｒｅｃＡ遺伝子のどちらか側に位置する配列に相同する配列を含む線形配列を利用して二重相互組換えイベントを使い、不活性化または欠失化されることが望ましい。これは、前述のように相同組換えにより染色体に遺伝子を欠失または挿入させるのに使われる方法と本質的には同じである。
【０２７６】
本発明は、染色体から遺伝子を欠失させる方法での使用のため、およびｒｅｃＡ遺伝子の挿入または欠失のために構築された、分離した線形ＤＮＡ断片を含む。
本方法および配列は、多様な細菌に応用することができ、それには以下を含む：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ， Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ， Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ， Ｐｒｏｔｅｕｓ， Ｅｒｗｉｎｉａ， Ｓｈｉｇｅｌｌａ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ， Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ， Ｖｉｂｒｉｏ， Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ， ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ。
温度感受性レプリコンと、望ましい遺伝子の野生種対立遺伝子を有するプラスミドが、欠失遺伝子によって生成された表現型の回復または維持に使用される。プラスミドは、所望する遺伝子の染色体コピーが欠失された場合、暗号化されたタンパク質が細胞の成長に必須であったときに、所望するタンパク質の生成、および細胞の存続を維持する。しかし、生じた細胞は、温度感受性表現型を有するため、プラスミド遺伝子の発現は、高温でホスト種を培養することで容易に防ぐことができる。その結果生じた欠失ホスト種は、それから、望ましいタンパク質を生成する能力のためにその他の突然変異またはクローン遺伝子のスクリーニングに利用される。
３．５．５． その他の考察
３．５．５．１． 細菌の存続性の維持
本発明は、遺伝子が必須分子を暗号化し、必須遺伝子の欠失が発現型に致命的である場合に、細菌の存続性を維持しながら、細菌種からどのような遺伝子でも欠損させる方法である。欠失させる遺伝子は、プラスミド上に温度感受性レプリコンとともに提供される。細胞は、これで温度感受性表現型を有することになる。これらの細胞が高温で育てられると、所望の分子の不在が素早く検出され、安定プラスミドに融合されるＤＮＡ断片の導入によりこの表現型は完成し、これは、染色体から欠失された遺伝子のクローニングである確かな証拠である。
３．５．５．２． 相同組換え
本発明は、染色体上の欠失すべき遺伝子の位置にある配列に相同な配列を組み入れる線形ＤＮＡ断片と、多様な細菌のｒｅｃＡの挿入または削除／不活性化を可能にする配列を利用し、細菌種からどのような遺伝子でも欠損させる方法である。
【０２７７】
３．６． 人工染色体
３．６．１ 人工染色体、その利用、および人工染色体の調整方法
人工染色体を含む細胞系を調整する方法、人工染色体を調整する方法、人工染色体の分離方法、人工染色体の精製方法、人工染色体に非相同ＤＮＡを標的挿入する方法、選択した細胞および組織に染色体を到達させる方法、および染色体の分離および大型生産方法が提供される。また、本方法で使用される細胞系および本方法で生産される細胞系および染色体も提供される。特に、挿入された非相同ＤＮＡを除いて、衛星人工染色体は、実質的に異質染色質であることが提供される。遺伝子治療、遺伝子生成物の生産および形質転換植物および動物の生産を含む、人工染色体の使用に関する細胞ベースの方法も提供される。
３．６．２ 現存の遺伝子到達技術の限界
遺伝子治療および、非相同核酸の組換え発現において、いくつかのウィルスベクター、非ウィルス、物理的到達システムが開発されてきた。［例えばＭｉｔａｎｉら（１９９３） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １１：１６２−１６６参照。］
哺乳動物人工染色体の生産には、その他の方法が必要であるが、その幾つかが開発されてきた。たとえば米国特許第５，２８８，６２５には、ミニ染色体と呼ばれる２０〜３０メガベースの、人工染色体を含む細胞系が提供されている。これらの染色体の分離方法が提供されているが、これでは１０〜２０％の純度しか提供できない。そのため、本技術の潜在性を実現するためには、代替的な人工染色体の開発、分離および精製方法の完成、また、より万能の染色体およびミニ染色体の更なる特徴づけが必要である。
ここで使われる核酸プローブは、同一かまたは近似する核酸の配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを特に雑種形成させるのに十分な数の核酸を含むＤＮＡまたはＲＮＡ断片である。プローブに含まれる核酸は、いくつでもよく、最低では約１０個、最高では、何十万個の核酸となる。そのような雑種形成反応の条件およびプロトコルである、プローブのサイズ、温度、不整合の程度、塩濃度およびその他の雑種形成反応の要因は、当業者には周知である。例えば、雑種形成反応が行われる温度が低ければ低いほど塩濃度は高くなり、ハイブリッド分子内に不整合存在の割合が高くなる。
【０２７８】
雑種形成プローブとして使用される核酸は通常、検出可能な部分または、．ｓｕｐ．３２ ｐ、．ｓｕｐ．３ Ｈおよび．ｓｕｐ．１４ Ｃのような識別子によって識別されること、また、ウラシル部の５’位置において、ビオチニル化されたデオキシウリジル酸の存在下で切れ目翻訳などによる化学的識別を含むその他の手段によって、識別がなされる。結果として生じるプローブには、チミジレート残基の代わりにビオチニル化されたウリジル酸が含まれており、それは、［ビオチン部分を介して］ストレプトアビジンのビオチンへの結合に基づいた市販の検出システムであれば、いくつでも使用して検出することができる。そのような市販の検出システムは、例えばＥｎｚｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ［Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．］から入手できる。当業者に知られている、非放射能識別を含むその他の識別子は、分析法の感受性機能であるプローブが十分に検出可能で、［細胞の培養、ＤＮＡの抽出、および雑種形成分析法のための］時間があり、プローブの供給源としてＤＮＡまたはＲＮＡが利用でき、識別子を検出するのに使われる特定の識別子と手段がありさえすれば、使用することができる。
一旦プローブに対して十分に高い相同性を持つ配列が特定されると、例えば以下に記述される標準技術によって容易に分離することができる：Ｍａｎｉａｔｉｓら（（１９８２）分子クローニング：実験室マニュアル， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）．
ここで使われる、ＤＮＡ分子が安定してハイブリッドを形成する条件で、実質的に相同であると考えられるものは、少なくとも約６０％補完性のあるＤＮＡ分子で安定したハイブリッドを形成するものである。そのようなＤＮＡ断片はここでは、「実質的に相同である」と考えられる。例えば、ＤＮＡが安定したハイブリッドを形成し、その断片の配列が少なくとも約９０％相関的であり、またＤＮＡに暗号化されたタンパク質がその活性を保っている場合には、特定のタンパク質を暗号化するＤＮＡは、実質的にその他のＤＮＡ断片に相同である。
本書の便宜上、下記の厳格条件は以下のように定義される：
１） 高い厳格さ：０．１．Ｘ．ＳＳＰＥ， ０．１％ ＳＤＳ， ６５℃．
２） 中程度の厳格さ：０．２．Ｘ．ＳＳＰＥ， ０．１％ ＳＤＳ， ５０℃．
３） 低い厳格さ：１．０ ｘ ＳＳＰＥ， ０．１％ ＳＤＳ， ５０℃．
または、同程度の不整合または整合の選択となる、塩または温度およびその他の試薬のすべての組合せ。
【０２７９】
４． 工学的アプローチ
４．１．１ 一般的考察
一面として本発明は、分子遺伝学の技術分野に応用されるものであり、細胞および生体のゲノムを進化させ、新規のまたは改良された特性を獲得するものである。分子生物学において細胞はいくつもの確立された利用法を有している。例えば、細胞は、形質転換または組換えのようなプロセスにおいてＤＮＡを操作するためのホストとしてよく利用されている。細胞はまた、細胞内に形質変換されたＤＮＡによって暗号化された組換えタンパク質の発現にも利用される。種類によっては、細胞はまた形質転換動物や植物の世代の原種としても利用される。これらすべてのプロセスは新規の手順であるが、一般に、これらのプロセスに使用される細胞のゲノムは、特に、前述のプロセスに使用される新規または改良された特質の達成に向かっては、自然細胞のゲノムから殆ど進化していない。
人工的または強制的分子進化の伝統的なアプローチは、非連関で選択可能な個別の表現型最適化に焦点を合わせていた。その方法は、遺伝子をクローニングし、その遺伝子の非連関な機能を特定し、それが選択できる検査を行い、遺伝子内の選択部分の突然変異を行い（例えば起こりやすいＰＣＲまたはカセット突然変異）、および遺伝子の周知の機能の改良のために変異体を選択するものである。改良された機能を有する変異体は、好ましい細胞タイプで発現される。このアプローチには、いくつもの限界がある。最初に、すでに分離されて機能が特徴づけられている遺伝子にしか適用できないことである。次に、このアプローチは、非連関な機能を持つ遺伝子にしか適用できない。つまり、共同して一つの発現型をもたらす複数の遺伝子は、通常この方法では最適化できない。多分、殆どの遺伝子は共同機能を有している。最後に、このアプローチは、単一の遺伝子であっても全変形数のうち非常に限られた数しか調査することができない。例えば、１個のタンパク質内で１０個位置を変えた時、可能なすべてのアミノ酸は２０１０変異体を精製し、それは、現存するトランスフェクションおよびスクリーニングの方法で順応できる範囲を超えるものである。
【０２８０】
人工的に遺伝子を進化させる能力は、根本的に重要である。例えば、細胞は、分子生物学、医学および工業プロセスの分野で多くの確立された利用法を有している。例えば、細胞は、通常形質転換および組換えのようなプロセスの中でＤＮＡの操作のためにホストとしてよく使われている。細胞は、形質転換／トランスフェクトされた、または細胞の中に導入されたＤＮＡに暗号化された組換えタンパクの発現に使用されている。種類によっては、細胞はまた形質転換動物や植物の世代の原種としても利用される。これらすべてのプロセスは新規の手順であるが、一般に、これらのプロセスに使用される細胞のゲノムは、特に、前述のプロセスに使用される新規または改良された特質の達成に向かっては、自然細胞のゲノムから殆ど進化していない。
核酸の生体内反復的組換え、およびその結果生じた組換え体の選択であるその他の方法も使用できる。本発明は、多くの新しく重要な方法および全体的および部分的ゲノム進化の複合物を提供するものである。
代謝工学は、古典的な遺伝学および遺伝工学技術を通して中間代謝を操作するものである。細胞工学は、一般により包括的な用語で細胞特質の改変を指している。Ｃａｍｅｒｏｎら（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ３８：１０５−１４０ （１９９３））は同意義の用語のまとめを提供し、このタイプの工学を説明しており、これには「代謝工学」が含まれる。これは、工業的微生物およびバイオプロセス工学の文脈でよく使われるもので「試験管内進化」または「指向的進化」は、よく日本の研究者に使用される。「細胞工学」は細菌、動物および植物細胞の改変を説明するのに使用され、「正常種開発」および「代謝経路進化」もある。本出願では用語「代謝工学」および「細胞工学」は、差別的に明確にするために使われており、用語「進化した」遺伝子は以下に説明するように使われている。
【０２８１】
代謝工学は２つの基本的なカテゴリーに分けられる：代謝フラックスを改変するためにホスト生体の内因性遺伝子の改変および異質遺伝子の生体への導入。そのような導入は新規の代謝経路を作成して、改変細胞特性を生じ、これには限定されないものの、通常ホスト細胞では作られない、周知の化合物の合成（例えばポリマーや抗生物質等）および新しい栄養源を利用する能力等を含む。代謝工学の特定の応用には、抗生物質、成長および生成物形成に使われる基質の範囲拡大、毒性化学物質の分解のための生体内の新規な分解代謝作用の精製、および塩およびその他の環境因子に耐性があるような細胞特性の改変等の、特殊で新規な化学物質の生成を含む。
Ｂａｉｌｅｙ （Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６６８−１６７４ （１９９１））は、種の改良のために非相同遺伝子を使う代謝工学の応用を説明している。そこで、彼はそのような導入は、二次的に更なる反応を起こしうる新規の化合物を生じうる原因となり、または非相同タンパク質の発現は、タンパク質分解、不適切なフォールディング、不適切な改変、または不適当なタンパク質の細胞内位置、または必要とされる基質へのアクセスの欠如につながると、警告している。Ｂａｉｌｅｙは、望ましい遺伝学的変化の慎重な設定および最低限のホストへの摂動を推奨している。Ｌｉａｏ（Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ４：２１１−２１６ （１９９３））は、代謝経路の数学的モデルおよび分析を検討しており、多くの場合、酵素の動態因子が利用できない、または不正確であることを指摘している。
Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓら（Ｔｒｅｎｄｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １１：３９２−３９６ （１９９３））は、主に代謝経路による細胞システムの生産性の改良またはフラックスの徹底的な改変に影響を与える試みを説明しているが、主要な分岐点における対照構造が、フラックスの変化に耐性を持つように進化するという問題を抱えている。彼らは、これらの代謝節の特定および特徴づけが合理的な代謝工学に必要前提条件であると結論づけている。同様に、Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ （Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ５：１９６−２００ （１９９４））は、代謝工学内で「限られた度合のステップ」を改変するよりも、生物反応ネットワークの対照構造を系統的に解明する必要があると結論付けている。本発明は、一般に、ここに反復配列組換えと呼ばれるプロセスを通して、新規の代謝経路の進化およびバイオプロセスの強化を導くものである。反復配列組換えは、個別の遺伝子、プラスミドまたはウィルス全体、多重遺伝子クラスターまたはゲノム全体でさえも「進化」するように、組換えやスクリーニングまたは選択の反復サイクルを行うことを課するものである（Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ １３：５４９−５５３ （１９９５））。そのような技術は、従来の代謝工学の方法に必要とされる徹底的な分析や計算を必要としない。反復配列組換えによって、従来のペア組換えイベントと違い、最小の選択サイクル内で大量の突然変異の組換えが起こる。
【０２８２】
そのため、代謝および細胞工学は、多くの遺伝子生産物の相互作用や規定機能の特定の問題となるため、反復配列組換え（ＲＳＲ）技術は特に有利である。それはすべての突然変異間で組換えを提供するもので、その結果が、代謝の増加、触媒作用の改変または酵素に特有の基質、全代謝経路または環境への細胞反応の改変等何であれ、異なった突然変異の組合せが、所望する結果に影響を与えることができるという非常に高速の調査を提供するものである。
長年にわたる植物および動物の交配は、特別な課題に向かって複雑なゲノムの急速な進化に影響を及ぼす性的組換えの力を実証してきた。この一般的な原理は、試験管内で確率的および／または非確率的突然変異によりＤＮＡ分子を組換えて、指向的分子進化の速度を高めることによって実証された。発酵業界の種改良努力は、配列ランダム突然変異による微生物の指向的進化に依存している。組換えをこの反復的なプロセスに組み入れることにより、種改良プロセスの速度が高まり、現在の発酵プロセスの収益率が高まり、また新製品の開発が容易になる。
４．１．２．１ ＤＮＡ確率的および／または非確率的突然変異、対、自然組換え
ＤＮＡ確率的および／または非確率的突然変異には、ＤＮＡ配列の反復組換えが含まれる。ＤＮＡ確率的および／または非確率的突然変異と自然性的組換えの著しい違いは、確率的および／または非確率的突然変異は、複数の親配列に由来するＤＮＡ配列を生成できるのに対し、性的組換えは、２つのみの親配列からしかＤＮＡ配列を生成できないことである。
４．１．２．２ ＤＮＡ確率的および／または非確率的突然変異は、反復的ペア組換えを提供する
試験管内ＤＮＡ確率的および／または非確率的突然変異は、複数のＤＮＡ配列組換えを引き起こすことにより、組合せ遺伝子ライブラリーを効果的に作り出す。ＤＮＡ確率的および／または非確率的突然変異の結果は、複数配列のプール状の組換えを代表する個体群であるが、プロセスは、複数ＤＮＡ配列の組換えに同時に依存せず、むしろ、その反復的ペア組換えに依存する。少量の遺伝子断片の混合プールからの完全な遺伝子の集合には、複数アニールおよび、無プライムのｐｃｒ反応の熱サイクルである延長サイクルが必要である。それぞれの熱サイクル中、多くの断片のペアは、アニールされ、延長され、より大きなキメラＤＮＡ断片の組合せ個体群を形成する。最初の確率的および／または非確率的突然変異サイクルの後、キメラ断片は、理論上代表される可能なすべての「親」配列のペアを有する２つの異なった親遺伝子に主に由来する配列を有することになる。これは、個体群の中での単一性的サイクルの結果と類似している。２度目のサイクルの間は、これらのキメラ断片は、お互いに、または他の小さな断片とアニールし、その結果、最大４つの異なった出発配列に由来するキメラを生じ、それは、また、理論上代表される可能なすべての「親」配列のペアを有する。この２度目のサイクルは、親と子孫両方の同系交配の単一の性的交雑から生じる全個体種と類似するものである。
【０２８３】
８、１６、３２等の親配列に由来するキメラから生ずるそれ以上のサイクルは、先行する個体群の更なる同系交配と類似する。これは、ある島に隔離され、何代にも渡って互いに交配をしている小さな個体群のトリから生ずる多様性と類似していると考えられる。結果は、「プールの場合の」結果に類似するものであるが、その経路は、反復ペア組換えを経たものである。この理由から試験管内ＤＮＡ確率的および／または非確率的突然変異によって生成されたＤＮＡ分子は、出発「親」配列の「子孫」ではなく、むしろ、出発「先祖」分子の曾、曾、曾、曾ｎ（ｎ＝熱サイクルの数）孫である。配列比較では、一般に１つの配列が基準配列の役目をし、それに対してテスト配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する際、テスト配列および基準配列がコンピュータに入力され、必要に応じて部分列座標が指定され、また配列アルゴリズム プログラム パラメータが指定される。次に、配列比較アルゴリズムによって、指定したプログラム パラメータをもとに基準配列に対するテスト配列の配列同一性パーセント値が計算される。
比較のための最適な配列のアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ による局所相同性アルゴリズム （Ａｄｖ． Ａｐｐｌ Ｍａｔｈ． ２：４８２ （１９８１ 年））、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ による相同性アラインメント アルゴリズム （Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｔ ４８：４４３ （１９７０））、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ による類似方法の探索 （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４ （１９８８年））、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０ （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ） にあるコンピュータ管理のアルゴリズム ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、および ＴＦＡＳＴＡ の実行などによって実施できる。
【０２８４】
有用なアラインメント アルゴリズムの別の例としては、ＰＩＬＥＵＰ がある。ＰＩＬＥＵＰでは、連続的なペアをなすアラインメントを用いて関連した配列グループから複数の配列アラインメントが生成され、関連性および配列同一性パーセント値が示される。これによって、アラインメントの生成に使用されるクラスタリングの関係を示すツリーまたは系統図が描画される。ＰＩＬＥＵＰ では、Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ による連続的アラインメント法 （Ｊ Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３５：３５１−３６０ （１９８７）） を単純化したものが使用される。使用されている方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ の記述した方法（ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３ （１９８９）） と類似している。このプログラムは、それぞれ最大長が ５，０００ 個のヌクレオチドまたはアミノ酸からなる最高 ３００ の配列を整列することができる。複数アラインメント手順は、最も類似した ２個の配列のペアをなすアラインメントから始まり、整列した配列のクラスタが生成される。次に、このクラスタがその次に最も関連性の高い配列または整列した配列のクラスタに整列される。２つの配列のクラスターは、２つの個別の配列からなるペアをなすアラインメントの単純な延長により整列される。最終的なアラインメントは、一連の連続的なペアをなすアラインメントにより実現される。このプログラムは、配列比較の領域について特定の配列およびそのアミノ酸座標またはヌクレオチド座標を指定することによって、またプログラム パラメータを指定することにより実行される。例えば、基準配列を他のテスト配列と比較して、デフォルトのギャップの重さ （３．００）、デフォルトのギャップの長さ・重さ （０．１０）、荷重エンド ギャップといったパラメータを使用し、配列同一性関係パーセント値を決定することもできる。
【０２８５】
配列同一性パーセント値および配列同一性の決定に適したアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０ （１９９０年） に説明のある ＢＬＡＳＴ アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ 分析を実行するソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／） で公に入手可能である。このアルゴリズムでは、まず、問合せ配列にある長さ Ｗ の短い単語を特定することで高得点の配列ペア（ＨＳＰ）の特定を行うが、これはデータベース配列にある同じ長さの単語と整列させた時に、何らかのプラスの値のしきい値スコアＴと一致するかそれを満たすものである。Ｔは、近隣の単語スコアしきい値（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）のことである。これらの初期の近隣単語ヒット数は、それらを含む長めのＨＳＰを探し出すための探索を開始するための種の役目を果たす。次に、蓄積性のアラインメントスコアを増大しうる限り、単語ヒット数が各配列に沿って両方向に延長される。蓄積性のスコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータ Ｍ （対応する残基のペアについてのリワード スコア、常に ＞ ０） およびパラメータ Ｎ （ミスマッチの残基についてのペナルティ スコア、常に ＜ ０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、蓄積性のスコアの計算にスコアリング マトリックスが使用される。単語ヒット数の両方向への延長は、蓄積性のアラインメント スコアが最大達成値から量Ｘだけ減少したとき、１つ以上のマイナスのスコアリング残余アラインメントの蓄積により、蓄積性のスコアがゼロ以下になったとき、またはいずれかの配列の終端に到達したときなどに中断される。ＢＬＡＳＴ アルゴリズム パラメータＷ、Ｔ、およびＸにより、アラインメントの感度および速度が決定される。ＢＬＡＳＴＮ プログラム（ヌクレオチド配列の場合） では、デフォルトとして、単語長 （Ｗ）が１１、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方のストランドの比較値が使用される。アミノ酸配列の場合は、ＢＬＡＳＴＰ プログラムでは、デフォルトとして、単語長 （Ｗ） が ３、期待値 （Ｅ） が １０、および ＢＬＯＳＵＭ６２ スコアリング マトリックス （Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５ （１９８９ 年）を参照） が使用される。
【０２８６】
「ミスマッチ修正の不十分な菌株」には、ミスマッチ修復機能が損なわれた任意の生物体の任意の突然変異体が含まれうる。これらには、ｍｕｔＳ、ｍｕｔＴ、ｍｕｔＨ、ｍｕｔＬ、ｏｖｒＤ、ｄｃｍ、ｖｓｒ、ｕｍｕＣ、ｕｍｕＤ、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＪ などの突然変異遺伝子生成物が含まれる。損傷は、遺伝子突然変異、対立形質の置換、小規模な化合物または発現したアンチセンス ＲＮＡ などの付加試薬による選択的抑制、もしくは他の技法で実現される。損傷としては、言及された遺伝子の損傷、または任意の生物体での相同遺伝子の損傷が考えられる。
４．２． 方策
４．２．１． 希望の機能を得るための細胞の進化
４．２．１．１． 希望の機能がタンパク質の分泌である場合
任意で、希望の機能がタンパク質の分泌で、またさらに複数個の細胞がタンパク質を符号化する構成物で構成する。タンパク質は、分泌されていない限り任意に不活性であり、さらにタンパク質機能のために任意に変性細胞が選択される。 任意で、タンパク質は分泌されていない限り複数個の細胞に対して毒性がある。この場合、希望の機能を得る方向に向かって進化する変性細胞または追加変性細胞が、細胞の増殖および生存細胞の回復によりスクリーニングされる。
４．２．１．２． 希望する機能が組換えの強化である場合
一部の方法において、希望する機能は組換えの強化である。こういった方法では、時には、断片ライブラリが集合的に組換え能力を与えてくれる遺伝子群で構成されることがある。スクリーニングは、組換えにより除去可能な突然変異によってその発現を阻止できるマーカーの符号化用の遺伝子を保有する細胞を使用して達成できる。この細胞は、組換えによる突然変異の除去の結果としてのマーカーの発現によりスクリーニングされる。
【０２８７】
４．２．１３． 希望する機能が植物細胞の抵抗性の改善である場合
一部の方法では、複数個の細胞が植物細胞で、その希望する性質は化学薬品や微生物に対する抵抗性の改善である。変性細胞または追加変性細胞 （または植物全体）は、化学薬品または微生物に対して露出され、その希望する機能を得る方向に向かって進化した変性細胞または追加変性細胞は、その露出に耐える能力に応じて選択される。
４．２．１．４． 希望する機能が薬物の効力の予測である場合
４．２．１．４．１． ウイルス感染を治療する薬物
この発明により、さらにウイルス感染を治療する薬物の効力を予測する方法が提供される。これらの方法では、組換え核酸セグメントのライブラリを生成するために、その感染が薬物により抑制されたウイルスからの核酸セグメントを少なくともそのウイルスからの第２の核酸セグメントで組換えることが必要であり、第２の核酸セグメントは最初の核酸セグメントとは少なくとも２つのヌクレオチドが異なる。次に、薬物を含む培養液内で、ホスト細胞に組換え核酸セグメントが含まれるゲノムのあるウイルスを集めたものを接触させると、ホスト細胞の感染により生じた子孫ウイルスが回収される。
最初の子孫ウイルスからの組換え ＤＮＡ セグメントが、少なくとも１つの２番目の子孫ウイルスからの組換えＤＮＡセグメントで組換えされ、組換え核酸セグメントの追加ライブラリが生成される。薬物を含む培養液内で、ホスト細胞に追加ライブラリまたは組換え核酸セグメントを含むウイルスを集めたものを接触させると、ホスト細胞によりさらに子孫ウイルスが生成される。希望に応じて、結果としてできる子孫ウイルスが薬物に対する希望の抵抗度を持つようになるまで、組換えステップおよび選択ステップが繰り返され、それによって、得られた抵抗度およびそれを得るために必要とされた反復回数から、ウイルスを治療する薬物の効力が測定される。任意で、ウイルスは特定の株細胞に適応させて培養される。
【０２８８】
４．２．１．４．２． 病原微生物による感染を治療する薬物
この発明により、さらに病原微生物による感染を治療する薬物の効力を予測する方法が提供される。これらの方法では、変性微生物細胞を生成するために、ＤＮＡ 断片ライブラリを複数個の微生物細胞に運び、少なくともその一部は細胞のゲノムのセグメントで組換えを起こす必要がある。変性微生物は、薬物を含む培養液内で増殖し、生存微生物が回収される。生存微生物からのＤＮＡは、ＤＮＡ断片の追加ライブラリと組換えされ、少なくともその一部が生存微生物からの ＤＮＡ にある同属のセグメントで組換えされ、追加変性した微生物の細胞が生成される。追加変性した微生物は、薬物を含む培養液内で増殖し、追加生存微生物が回収される。必要に応じて、追加生存する微生物が薬物に対する希望の抵抗力を持つようになるまで、組換えステップおよび選択ステップが反復される。得られた抵抗度およびそれを得るために必要とされた反復回数から、病原微生物を死滅させる薬物の効力が測定される。
４．２．１．３． 方法
４．２．１．３．１ 細胞の変性または組換え
一面において、発明では、希望の機能を獲得するために細胞を進化させる方法が提供されている。このような方法では、例えば、ＤＮＡ断片ライブラリを複数個の細胞に導入することが必要で、それによって少なくとも断片の一つで、ゲノムのセグメントまたは細胞のエピソームとの組換えが起こり、変性細胞が生成される。任意で、これらの変性細胞を繁殖させ、結果としての組換え済み細胞集団の多様性を増大させる。次に、変性細胞または組換え済み細胞集団は、希望の機能を持つように進化した変性細胞または組換え細胞があるかどうかのスクリーニングを受ける。次に任意で、希望の機能を持つように進化した変性細胞のＤＮＡは、ＤＮＡ断片の追加ライブラリと組換えがなされ、少なくともその一つでゲノムのセグメントまたは変性細胞のエピソームとの組換えが起こり、追加変性細胞が生成される。次に、追加変性細胞は、希望の機能を持つようにさらに進化した追加変性細胞のためのスクリーニングを受ける。必要に応じて、組換えおよびスクリーニング／選択のステップは、追加変性細胞が希望の機能を持つようになるまで反復される。一つの望ましい実施例において、変性細胞は、結果としての任意の細胞に対して任意の選択ステップを実施する前に、繰り返し組換えを行い細胞の多様性を増大させる。
【０２８９】
４．２．１．３．３ 生体内での組換えの実施
この発明では、さらに生体内での組換えを実施する方法が提供されている。少なくとも１つの遺伝子からの少なくとも最初および第２のセグメントが細胞に導入され、セグメントは、お互いに少なくとも２つのヌクレオチドが異なり、それにより、セグメントが組換えられ、キメラ遺伝子ライブラリが生成される。キメラ遺伝子は、希望の機能が得られたライブラリから選択される。
この発明では、さらに希望の機能を得るために、細胞を進化させる方法が提供されている。これらの方法では、異なった細胞を植付ける必要がある。細胞は、そうすることで細胞間でＤＮＡが交換され、混成ゲノムのある細胞を形成するような状態下で培養される。次に細胞は、希望の性質が得られるように進化した細胞についてスクリーニングまたは選択がなされる。必要に応じて、ＤＮＡ交換およびスクリーニング／選択ステップは、細胞が希望の性質を得るようになるまで、スクリーニング／選択済みの細胞で、異なった細胞の集団を形成する１つのサイクルから次のサイクルへと反復される。
ＤＮＡ交換のメカニズムには、接合、ファージ仲介の形質導入、リポソームのデリバリー、原形質融合、有性による細胞の組換えなどがある。任意で、ＤＮＡ 断片ライブラリは、細胞内に形質転換または電気穿孔することもできる。
４．２．１．３．４ 高等生物の反復的なプールおよび繁殖
また、この方法では、高等生物を反復的にプーリングおよび繁殖する方法が提供されている。この方法では、多様な多細胞生物（植物、動物など）のライブラリが生成される。雄性配偶子のプールが、雌性配偶子のプールと共に用意される。少なくとも１つの雄性のプールまたは雌性のプールは、一つの種の異なった菌株または異なった種に由来する多数の異なった配偶子で構成される。雄性配偶子は、雌性配偶子の受精に使用される。結果としてできる受精した配偶子の少なくとも一部が生殖能力のある生物体に成長する。これらの生殖能力のある生物体を交雑し（既に述べたとおり、雄性および雌性の配偶子をペアとしてプーリングし結合させるなど）、多様な生物体のライブラリを生成する。次に、希望の特性または性質についてライブラリが選択される。
【０２９０】
４．５． 微生物の発酵
天然産物を生産するための微生物の発酵は、最も古く最も洗練された生体触媒の応用である。工業用微生物は、単一の反応器で再生可能な供給原料を価値の高い化学製品に複数ステップで変換する効果があり、それにより、数十億ドル産業の仲介役となっている。発酵生成物には、エタノール、乳酸、アミノ酸、ビタミンなどの精製化学薬品や必需化学薬品から、高値低分子医薬品、タンパク質医薬品、および工業用酵素などまである。（生体触媒の導入については、ＭｃＣｏｙ （１９９８） Ｃ＆ＥＮ １３−１９ などを参照）。
本書の方法によって、生体触媒が従来の方法よりも速いペースで改善されうる。全ゲノムの確率的／非確率的変異誘発では、発酵に使用されている微生物について、従来の方法に比較して、菌株の改善を少なくとも２倍の速さにできる。これによって、発酵プロセスのコストが相対的に減少する。新製品はより短期間で市場に参入でき、生産者は利益および市場占有率を伸ばすことができ、消費者は、高品質・低価格でより多くの製品を利用できるようになる。さらに、生産プロセスの効率が改善されることは、生産の廃棄物が少なくなり、資源をより節約して利用できることを意味する。全ゲノムの確率的／非確率的変異誘発により、サイクル当たり複数の有益な突然変異を蓄積する手段が提供され、こうして、現行の菌株改善プログラム （ＳＩＰ） にある固有の限界が除去される。
ＳＩＰの一つのキーは、生成量にわずかな増大のあった数千のうち数個の突然変異体を特定するために信頼して使用できる検定法があることである。数多くの検定方式での限定要因は、細胞増殖の均一性である。この変動は、その後の分析検定の基線変動性の原因となる。種菌のサイズと培養環境 （温度／湿度） が、細胞増殖の変動の原因である。初期的な培養液の確立のあらゆる面を自動化すること、および最新技術を駆使した温度および湿度が管理されたインキュベータは、変動性を減少させるために有用である。
【０２９１】
突然変異細胞または胞子は、固体培地に分離し、個別の胞子形成コロニーを生成する。自動化された集落ピッカー（Ｑ−ｂｏｔ、Ｇｅｎｅｆｉｘ、Ｕ．Ｋ．）を使用し、コロニーが特定され、採取され、くぼみ当たり ３ ｍｍ のガラス玉 ２個を含む ９６ のくぼみのあるマイクロタイター皿に１０，０００の異なる突然変異体が植付けられる。Ｑ−ｂｏｔでは、コロニー全体は採取されず、ピンをコロニーの中央部に挿入し、細胞（または菌糸）および胞子の小標本を取り出す。ピンをコロニーに挿入した時間、培地に植付けるために浸した回数、およびピンが培地にあった時間が、それぞれ植付けのサイズに影響し、それぞれが管理・最適化されうる。Ｑ−ｂｏｔの均一なプロセスによって、人為ミスが減少し、培養菌の確立する速度が増大する （ほぼ１０，０００／４時間）。次に、これらの培養菌は、温度および湿度が管理されたインキュベータ内で振動が与えられる。ガラス玉は、発酵槽のブレードと同様な細胞の均一な通気と菌糸体の断片の分散を促進する役目をする。
１． プレスクリーン
親株の性能に対する突然変異体の性能のわずかな増大を検出する能力は、検定法の感度に依存する。改善された生物体を見つける確率は、この検定法でスクリーニングできる個別突然変異体の数により増大する。十分なサイズのプールを識別する確率を増大させるために、処理される突然変異体の数を１０倍に増大するプレスクリーンを使用することができる。一次スクリーンの目的は、生成物の滴定濃度が親株と同じかそれに優る突然変異体をすばやく識別し、それらの突然変異体のみを細胞培養液に送ることである。一次スクリーンは寒天プレート スクリーンで、Ｑ−ｂｏｔ集落ピッカーにより分析される。検定法は本質的に異なりうるにせよ、多くが例えば集落ハローの生産につながる。例えば、抗生物質の生産は、プレート上でＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどの敏感な指示菌を上塗りすることで検定される。抗生物質の生産は、一般に生産する生物体の周囲のクリアリングゾーン（指標生物体の抑制された成長）として検定される。同様に、酵素の生産は、酵素基質を含むプレート上で、生産するコロニーの周囲の基質変化ゾーンとして検出される活動によって検定できる。生成物の滴定濃度は、ハロー領域のコロニー領域に対する比率と相関関係がある。
【０２９２】
Ｑ−ｂｏｔ またはその他の自動化されたシステムは、集団の上位 １０％ （すなわち、プレートプレスクリーンに入る１００，０００のうち１０，０００の突然変異体）のハローの比率を持つコロニーのみを採取するように指令される。これにより、二次的な検定で改善されたクローン数が増加し、失格者および低生産者をスクリーニングする無駄な努力が省かれる。これにより、二次的な検定の「ヒット率」が向上する。
４．６． 実験的な応用
４．６．１ 確率的／非確率的変異誘発
４．６．１．１ 一般的な技法
４．６．１．１．１ 出発物質
このように、ここにおける実施例のための再帰的配列組換えの一般的な方法は、酵素または酵素サブユニットの符号化をする遺伝子から出発し、新しい基質としての役目を果たす能力のため、もしくは古い基質の触媒の性質を向上させるための遺伝子を、複数ステップの経路で個別にまたは他の遺伝子と組合せて、進化させることである。ここで使用される「遺伝子」という用語は、生物学的機能に関連した ＤＮＡ の任意のセグメントまたは配列を広く意味する。遺伝子は、関連した出所からのクローニングや既知または予測される配列情報の合成などを含め、様々な出所から獲得でき、希望のパラメータを有するように設計された配列を含むことができる。新しい基質を使用する能力は、一部の事例では、栄養源としての基質上で培養する能力によって検定できる。他の状況では、こうした能力はホストの細胞に対する基質の毒性の減少によって検定でき、それゆえに、ホストはその基質の存在する中で培養しうる。抗生物質などの新しい化合物の生合成は、ホストの存在する中で進化した遺伝子を発現する指標生物体の増殖により、同様に検定できる。例えば、指標生物体が進化した遺伝子を発現するホストの上塗りに使用されるとき、ここで指標生物体は、希望の抗生物質に対して感度が高いか感度が高いことが期待されるものとするが、進化した遺伝子を発現するホスト細胞またはコロニーの周囲のゾーンでは、指標生物体の増殖は抑制されることになる。
【０２９３】
新しい化合物を識別する別の方法は、質量分析、核磁気共鳴、高速液体クロマトグラフィーなどの標準的な分析法の使用である。組換え微生物をプールし、そのプールからの抽出物または培養液上澄みを検定することができる。次に、陽性のプールがあれば細分され、単一の陽性が識別されるまでこの手順を繰り返すことができる（「同胞選択」とする）。
一部の例では、再帰的配列組換えのための出発物質は、特定クラスの基質の代謝が知られているか関連があると考えられている離散的な遺伝子、遺伝子群、または遺伝子の系統群である。本発明の利点の一つは、機能的な混成酵素を生成するために、配列のどの部分を突然変異させるべきかを推測するための構造情報を必要としないことである。
この発明の一部の実施例では、特定の検定法での酵素活動の初期的なスクリーニングが、出発物質としての酵素の候補の特定に役立つことがある。例えば、高速大量処理スクリーニングは、基質として芳香族酸類を使用したジオキシゲナーゼ型の活動の酵素のスクリーニングに使用できる。ジオキシゲナーゼは、一般に、インドール ２ カルボン酸塩およびインドール ３ カルボン酸塩を、インジゴ（藍色） （Ｅａｔｏｎ ら、 Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７：６９８３−６９８８（１９９５年））を含めた着色生成物に形質転換する。次に、初期的な検定でなんらかの活動を与えてくれた酵素を符号化するＤＮＡは、本発明の再帰的な技法により組換えし、再スクリーニングできる。酵素の候補を見つけるために、希望の目標の分子または目標の分子の類似体に対して、そうした初期的なスクリーニングを利用することは、人工の汚染物質の異化作用など、当該の反応の触媒となる酵素の生成に特に有用でありうる。
このタイプの高速大量処理スクリーニングは、最も高いレベルの希望の活動をしている突然変異を識別するために、毎回の再帰的配列組換え中にも使用できる。例えば、ペニシリンＧアシラーゼは、ペニシリンＧ類似性のフェニルアセチルーＬロイシンを加水分解できるようにするロイシン栄養要求体のクローンを探すことで分離されたが、これにより、ロイシンが生成され、細胞増殖が許容された （Ｍａｒｔｉｎ， Ｌ．ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔ． １２５：２８７−２９２ （１９９５年））。次に、この選択による陽性体は、ペニシリンＧの加水分解能力について、より手間のかかる方法でスクリーニングされる。
【０２９４】
一般に、任意のタイプの細胞が進化した遺伝子の受容体として使用できる。特にこれに該当する細胞には、数多くのバクテリアの細胞タイプ、ロドコッカス属、ストレプトマイセス属、放線菌類、コリネバクテリア、アオカビ属、バシラス属、大腸菌、シュードモナス属、サルモネラ属、およびエルウィニア属などのグラム陰性およびグラム陽性の両方が含まれる。当該の細胞には、真核細胞、特に哺乳類の細胞（マウス、ハムスター、霊長類、ヒトなど）の株細胞および初代培養物の両方も含まれる。このような細胞には、胚性幹細胞、接合体、繊維芽細胞、リンパ球、チャイニーズハムスターの卵巣 （ＣＨＯ）、マウスの繊維芽細胞 （ＮＩＨＭ）、腎臓、肝臓、筋肉、および皮膚細胞などの幹細胞が含まれる。その他の当該の真核細胞には、トウモロコシ、イネ、コムギ、ワタ、ダイズ豆、サトウキビ、タバコ、およびアラビドプシス（シロイヌナズナ）などの植物細胞、魚類、藻類、菌類（アオカビ属、フザリウム属、アスペルギルス属、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、パンカビ属）、昆虫、酵母 （ピキアおよび酵母菌属） などが含まれる。
ホストの選択は、意図される人工ホストの用途に応じて数多くの要因に依存し、これには、病原性、基質の範囲、環境耐久力、重要な中間体の存在、遺伝子操作のしやすさ、遺伝情報の他の生物体への乱交雑転移の可能性などがある。特に有利なホストは、大腸菌、乳酸菌、ストレプトマイセス属、放線菌類、糸状菌である。
増殖の手順は、一般にお互いに相当な配列の同一性（すなわち、少なくとも約５０％、７０％、８０％、または９０％の配列同一性）があるが一定の位置において異なる少なくとも２つの基質から開始される。この差異は、置換、挿入、欠失などの任意のタイプの突然変異でありうる。異なったセグメントは、多くの場合、お互いにおそらく５〜２０の位置で異なっている。組換えをして出発物質に比較して多様性を増大させるためには、出発物質は、少なくとも２つのヌクレオチド位置でお互いに異なっている必要がある。つまり、２つの基質しかない場合には、少なくとも２つの相違した位置があるべきである。３つの基質がある場合には、例えば、１つの基質は、第２の基質と一か所で異なり、第２の基質は第３の基質と一か所で異なっていることが考えられる。出発ＤＮＡセグメントは、お互いの天然の変異体、例えば、対立遺伝子の変異体または種の変異体などが考えれらる。セグメントは、構造上の同程度の関連性があり、一般に機能上の関連性（免疫グロブリン超分子群などの同じ上科に属する異なった遺伝子など）がある非対立性遺伝子からのものが考えられる。出発ＤＮＡセグメントは、お互いの誘発変異体も考えられる。例えば、一方のＤＮＡセグメントは、他方の変異性のＰＣＲ複製により、または変異原性カセットの置換により生成されたものでもありうる。誘発突然変異体は、一方 （または両方）のセグメントを変異原性の菌株に増殖させることによっても用意できる。この状況では、厳密に言えば、第２のＤＮＡセグメントは、単一のセグメントではなく、関連するセグメントの大規模な群である。出発物質を形成する異なったセグメントは、同じ長さまたは実質的に同じ長さであることがよくある。ところが、そうである必要はなく、例えば、一方のセグメントは、他方の部分列でありうる。セグメントは、ベクターなどのより大きな分子の一部として存在するか、または孤立した形状でありうる。開始ＤＮＡセグメントは、上記に説明した任意の再帰的配列組換え形式により組換えされ、組換えＤＮＡセグメントの多様なライブラリが生成される。
【０２９５】
こうしたライブラリは、構成部分数が１０５、１０７、または１０９前後とサイズが大幅に異なりうる。一般に、出発セグメントおよび生成された組換え体ライブラリには、符号化された配列全長と、発現に必要なプロモーターやポリアデニル化配列などの任意の不可欠な制御配列が含まれる。ただし、これに該当しない場合には、ライブラリ内の組換えＤＮＡセグメントを共通のベクターに挿入して、スクリーニング／選択を実施する前に、不足分の配列を提供することができる。
採用した再帰的配列組換え形式が生体内での形式である場合には、生成された組換えＤＮＡセグメントのライブラリは既に細胞内に存在し、これは一般に基質の特異性の変化した酵素の発現が希望される細胞タイプである。再帰的配列組換えが生体外で実施される場合には、組換え体ライブラリは、スクリーニング／選択の前に希望の細胞タイプに導入されることが望ましい。組換え体ライブラリの構成部分は、導入前にエピソームまたはウイルスにリンクするか、直に導入することができる。本発明の一部の実施例では、このライブラリは最初のホストで増幅された後、そのホストから回収され、第２のホストに導入され、発現、選択、スクリーニング、または他の望ましいパラメータに対してより敏感に反応する。ライブラリを細胞タイプに導入する方法は、ウイルス受容体を有するか、接合の能力があるか、または自然の状態でコンピテントであるかなど、細胞タイプのＤＮＡ取込み特性に依存する。細胞タイプが、天然および化学薬品誘導の応答能には影響されにくいが、エレクトロポーレーションの影響を受けやすい場合には、一般にエレクトロポーレーションが採用される。細胞タイプがエレクトロポーレーションにも影響されにくい場合には、微粒子銃を採用することができる。微粒子銃ＰＤＳ−１０００ Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ （Ｂｉｏｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）では、ＤＮＡで覆われた金またはタングステンのマイクロキャリアを目標の細胞に向けて加速するために、ヘリウム圧が使用されている。
【０２９６】
このプロセスは、植物、バクテリア、菌類、藻類、損傷のない動物の組織、組織培養細胞、動物の胎児など、幅広い範囲の組織に応用できる。動物や患者の生きた組織に対しては、基本的に軽度のエレクトロポーレーション形式である電子パルス デリバリーを採用できる （Ｚｈａｏ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １７：２５７−２６２ （１９９５年））。組換えＤＮＡ遺伝子のライブラリの導入後、任意で細胞を増殖させ、遺伝子の発現を起こさせることができる。
４．６．１．２ 一 般的な方法
４．６．１．２．１ 生体外
生体外の形式
生体外の再帰的配列組換えの形式が本書に一つ説明されている。組換えのための初期的な基質は、関連した配列のプールである。Ｘは、配列の異なる位置を示している。配列はＤＮＡまたはＲＮＡであり、組換えまたは確率的／非確率的変異誘発する遺伝子またはＤＮＡ断片のサイズに応じて、長さを変えることができる。配列は ５０ｂｐ〜１００ｋｂであることが望ましい。
関連した基質のプールは、本書で示すとおり、例えば約５ｂｐ〜 ５ｋｂ以上の重複する断片に変換される。多くの場合、断片のサイズは約１０ ｂｐ〜１０００ｂｐであり、ＤＮＡ断片のサイズが約１００ｂｐ〜５００ｂｐであることも時にはある。この変換は、ＤＮａｓｅｌまたはＲＮａｓｅ消化、無作為の剪断、または部分的に制限した酵素の消化などの数多くの異なった方法により達成されうる。
別の方法として、基質の断片への変換は、基質の不完全なＰＣＲ増幅または単一のプライマーからのＰＣＲ初回刺激により達成されうる。別の方法として、該当する一本鎖の断片は、核酸合成機で生成されうる。特定の長さおよび配列の核酸断片の濃度は、多くの場合、核酸全体のうちの０．１％（重量で１％）未満である。混合物内の特定の核酸断片の種類の数は、一般に少なくとも約 １００、５００、または １０００ である。
【０２９７】
混合した核酸断片の集合は、少なくとも部分的に一本鎖の形態に変換される。変換は、約８０℃〜１００℃に、さらに望ましくは９０℃〜９６℃に加熱して一本鎖の核酸断片を形成した後、リアニーリングすることで達成されうる。また、変換は、タンパク質またはｒｅｃＡタンパク質と結合した一本鎖のＤＮＡを処理することでも達成されうる。他の一本鎖の核酸断片との配列が同一な部分を有する一本鎖の核酸断片は、４℃〜７５℃に、さらに望ましくは４０℃〜６５℃に冷却することでリアニーリングできる。再生は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、その他の体積排除試薬または塩類を添加することで促進されうる。塩濃度は、０ ｍＭ 〜 ２００ ｍＭであることが望ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭであることがさらに望ましい。塩類は、ＫＣ１またはＮａＣｌでもよい。ＰＥＧの濃度は、０％〜２０％であることが望ましく、５％〜１０％であることがさらに望ましい。リアニーリングを施す断片は、ここに示したとおり、異なった基質からのものでもよい。アニーリングを施した核酸断片は、ＴａｑまたはＫｌｅｎｏｗなどの核酸ポリメラーゼ、もしくはｐｆｕまたはｐｗｏなどの校正ポリメラーゼ、およびｄＮＴＰ類（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰなど）の存在する中で培養される。配列の同一な領域が大きい場合には、Ｔａｑポリメラーゼを、４５〜６５℃のアニーリング温度で使用しうる。同一な領域が小さい場合には、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを、２０〜３０Ｔのアニーリング温度で使用しうる（Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９４年）、前出）。ポリメラーゼは、アニーリングの前に、アニーリングと同時進行的に、またはアニーリングの後で、無作為の核酸断片に添加しうる。
重複する断片のポリメラーゼの存在する中で、異なった断片の置換えを含むポリヌクレオチドのまとまりを生成する変性、再生および培養のプロセスは、生体外の核酸の確率的／非確率的変異誘発と呼ばれることがある。このサイクルが希望回数だけ反復される。サイクルは２〜１００回反復されることが望ましく、手順が１０〜４０回反復されることがさらに望ましい。結果としての核酸は、本書に示すとおり、約５０ｂｐ〜１００ｋｂの、望ましくは５００ｂｐ〜５０ｋｂの二本鎖のポリヌクレオチドの系統である。集合体は、開始基質の変異体を表し、開始基質に対する実質的な配列の同一性とともに、数か所の位置での違いが示されている。集合体には、開始基質に比べ、多くの構成部分がある。確率的／非確率的変異誘発によってできる断片の集合は、任意でベクターへのクローン化の後で、ホスト細胞の形質転換に使用される。
【０２９８】
４．６．１．２．１．１ 配列全長
生体外の確率的／非確率的変異誘発の変形として、不完全に延長された増幅生成物の相当な部分、一般に少なくとも２０パーセント以上を生成する条件下で、配列全長を増幅することで、組換え基質の部分列を生成できる。不完全に延長された増幅生成物を含めた増幅生成物は、変性され、少なくとも１回のリアニーリングおよび増幅の追加サイクルの対象となる。少なくとも１サイクルのリアニーリングおよび増幅によって不完全に延長された生成物の相当な部分が得られるこの変形は「スタッタリング」と呼ばれる。その後の回の増幅で、不完全に延長された生成物がアニーリングされて別の配列に関連したテンプレート種になり、延長部分に初回刺激が与えられる。
４．６．１．２．１．２ 重複した一本鎖の ＤＮＡ 断片
別の変形においては、長さの違う関連した配列の重複した一本鎖の ＤＮＡ 断片を使用して、少なくとも１サイクルの増幅が実行できる。各断片は、収集物からの第２の断片と交雑し、そのポリヌクレオチド鎖の延長部分に初回刺激を与えることができ、こうして配列を組換えたポリヌクレオチドが形成される。別の変形では、最初のＤＮＡテンプレートのＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼにより、可変長の一本鎖のＤＮＡ断片を単一のプライマーから生成できる。一本鎖のＤＮＡ断片が、ウラシルを含有する環状の一本鎖のＤＮＡで構成される第２のＫｕｎｋｅｌタイプのテンプレートに対するプライマーとして使用される。これにより、最初のテンプレートから第 ２ のテンプレートへの複数の置換が起こる （Ｌｅｖｉｃｈｋｉｎら、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌｏｇｙ ２９：５７２−５７７ （１９９５ 年） を参照）。
【０２９９】
４．６．１．２．１．３ 遺伝子群
ポリケチド合成（または実際に触媒作用が類似性の代謝反応である任意の多酵素の経路） に関与するものなどの遺伝子群は、ＤＮＡ配列相同性がない場合でさえも、再帰的配列組換えにより組換えすることができる。相同性は、合成のオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用して導入することが可能である。増幅する遺伝子の特定の配列に加え、１つのタイプの酵素を増幅するために使用される全てのプライマー（例えば、ポリケチド合成におけるアシルキャリア蛋白）が、遺伝子への追加配列である ２０〜４０ 塩基 ５１ （配列 Ａ） および遺伝子への別の ２０〜４０塩基配列 ３１（配列Ｂ）を含むように合成される。隣接する遺伝子（この場合、ケトシンターゼ） は、配列 Ｂ の相補鎖 （配列Ｂ’） を含む ５１ プライマーおよび別の ２０−４０ 塩基配列 （Ｃ） を含む ３１ プライマーを使用して増幅される。同様に、次に隣接する遺伝子 （ケト還元酵素（レダクターゼ）） 用のプライマーには、配列Ｃ’ （Ｃの相補） および Ｄが含まれる。異なった５個のポリケチド遺伝子群が確率的／非確率的変異誘発される場合には、５個のアシル キャリア蛋白はすべて、ＰＣＲ 増幅の後で、配列 Ａ およびＢに隣接する。このように、相同性の小さな領域が導入され、遺伝子群が部位特異的な組換えカセットに入れられる。個別の遺伝子の初期的な増幅の後で、増幅された遺伝子は、混合され、プライマーのないＰＣＲ の対象となりうる。５ 個全てのアシルキャリア蛋白遺伝子の終端３’での配列Ｂは、５個全てのケトリダクターゼ遺伝子の終端５’での配列 ＢＩとともにアニーリングして、その ＤＮＡ 合成を初回刺激することができる。このようにして、クラスタ内での可能な全ての遺伝子の組合せが獲得できる。上記説明の再帰的配列組換えについて、十分な配列相同性がない場合に、オリゴヌクレオチドによりこのような組換えを達成できる。機能的な遺伝子群を生成するには、機能の相同性のみが必要となる。
４．６．１．２．１．４ 複数サブユニットの酵素
この方法は、その他の複数サブユニット酵素の置換えを探索する際にも有用である。サブユニットが斬新な方法で組合わされているとき、斬新な機能を示す複数のポリペプチドで構成される酵素の一例は、ジオキシゲナーゼである。ビフェニルおよびトルエンジオキシゲナーゼの４つのタンパク質サブユニット間での定方向の組換えにより、トリクロロエチレンに対する活動が増大した機能的なジオキシゲナーゼが生成された （Ｆｕｒｕｋａｗａ ら、 Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７６： ２１２１−２１２３ （１９９４年））。２つのジオキシゲナーゼのサブユニットのこの組合せは、上述のとおりに、ジオキシゲナーゼのカセット−確率的／非確率的変異誘発の後、トリクロロエチレンの分解（劣化）について選択することでも生成することができた。
【０３００】
一部のポリケチド合成酵素では、アシルキャリア蛋白、ケト合成酵素、ケト還元酵素などの別個の機能が、単一のポリペプチド内に存在する。これらの場合、単一のポリペプチド内の領域は、十分な相同性が天然の状態で存在しない場合でも、相同性の領域を上記のとおり遺伝子全体について導入することで、確率的／非確率的変異誘発されている可能性がある。この場合、連続的な読取り枠を維持するという制約のために、隣接する追加配列をその領域に導入することはできない可能性がある。
その代わりに、遺伝子の一つにより確率的／非確率的変異誘発されるように符号化された最初の領域の終端３’に、またその他すべての遺伝子によりまとめて確率的／非確率的変異誘発されるように符号化された第２の領域の終端５’に相同的な、オリゴヌクレオチドのグループが合成される。これが、すべての領域について繰り返され、よってタンパク質領域間での組換えが可能で、その順序が維持されるような配列が得られる。
４．６．１．２．１．６ 生体外の全ゲノムの確率的／非確率的変異誘発
真核生物の染色体などの大規模な ＤＮＡ
配列の確率的／非確率的変異誘発は、従来技術の生体外の確率的／非確率的変異誘発方法では困難である。この制限を克服する方法が、本書に説明されている。
関連した真核生物の種の細胞を徐々に溶解して、損傷のない染色体を遊離する。次に、遊離した染色体は、ＦＡＣＳまたは類似した方法（パルスフィールド電気泳動法など）により、まとめて隔離される同じようなサイズの染色体とともに分類される。一般に、分類された染色体の各サイズの部分は、関連する哺乳動物の Ｙ染色体など、類似性の染色体のプールを意味する。目標は、取り返しのつかないほどの損傷を受けていない、損傷のない染色体を分離することである。
ＤＮＡポリメラーゼを採用したそうした大規模で複雑なＤＮＡの部分の断片化（分裂）および確率的／非確率的変異誘発は困難で、容認されないほど高いレベルの無作為な突然変異が起こる可能性が高い。制限酵素およびＤＮＡリガーゼを採用した他のアプローチでは、実現可能な破壊性のより低いソリューションが提供されている。染色体の一部分は、イントロンおよびインテインで符号化されたエンドヌクレアーゼ （Ｉ−Ｐｐｏ １， Ｉ−Ｃｅｕ Ｉ， ＰＩ−Ｐｓｐ １， ＰＩ− Ｔｌｉ １， ＰＩ−Ｓｃｅ Ｉ （ＶＤＥ）） など、長い ＤＮＡ配列（約１５〜２０ｂｐ）を認識する１つ以上の制限酵素で消化される。
これらの酵素は、それぞれ多くても各染色体内で数回切断し、大きな断片の組合せ混合物ができ、それぞれが同じ酵素により切断された他の部位の相補となるような張り出した一本鎖の終端を持っている。
【０３０１】
この消化物は、一本鎖のエキソヌクレアーゼとともに非常に短時間培養することで、さらに変性される。選択したヌクレアーゼの極性は、選択した制限酵素によって生じる一本鎖のオーバーハングに依存する。３’オーバーハングについては、５’−３’ エキソヌクレアーゼで、５’ オーバーハングについては、３’−５’− エキソヌクレアーゼである。この消化によって、各 ｄｓＤＮＡ （二本鎖 ＤＮＡ） 終端上に、極めて長い領域のｓｓＤＮＡオーバーハングが生じる。この培養の目的は、組換えが起こりうるＤＮＡの特定の領域を定義するＤＮＡの領域を生成することである。次に、断片の終端が相同的なｓｓＤＮＡ終端を有する他の断片とともにアニーリングされる条件下で、断片が培養される。多くの場合、２つの断片のアニーリングは、異なった染色体から始まり、ＤＮＡリガーゼの存在する中で共有結合的に結合され、キメラ染色体を形成する。これにより、相同染色体の交差を模倣する遺伝的多様性が生成される。完全な連結反応には、相同的な張り出し終端を有する断片の考えられる全ての連結による組合せ混合物が含まれる。この集合の一つの部分集合が完全なキメラ染色体となる。
確率的／非確率的変異誘発されたライブラリのスクリーニングをするには、染色体全体の取込みおよび発現が可能となる方法で染色体が適したホストに送られる。例えば、ＹＡＣ （酵母人工染色体） は、原形質融合により真核細胞に送ることができる。
こうして、再組立てのライブラリは、リポソームでカプセル化され、該当するホスト細胞の原形質体と融合しうる。結果としての形質転換体は増殖され、希望する細胞の改善についてスクリーニングが行われる。改善された集合が識別されると、染色体は再帰的に分離、確率的／非確率的変異誘発、スクリーニングが行われる。
【０３０２】
４．６．１．２．１．７ 天然の状態でコンピテントな微生物の全ゲノムの確率的／非確率的変異誘発
天然の状態での適応性は、一部の微生物の種で見られる現象であり、それによって個別の細胞が ＤＮＡ を環境から取込み、相同的な組換えによってその ＤＮＡ を自らのゲノムに組込むものである。枯草菌およびアセチネトバクター （Ａｃｅｔｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）Ｓｐｐ．は、このプロセスで特に効率的であることが知られている。これらおよび類似した生物体の全ゲノムの確率的／非確率的変異誘発の方法は、このプロセスを採用して説明されている。
全ゲノムの確率的／非確率的変異誘発の一つの目標は、個別の系統の集合からの有用な突然変異を一つの上位の系統に急速に蓄積することである。進化させる生物体が天然の状態でコンピテントである場合には、天然の状態でコンピテントな細胞の再帰的な形質転換を、そのプールからのＤＮＡ由来のものと分離してプールする方策によって、このプロセスが達成される。手順の一例は下記のとおりである。
様々な有用な形質（タンパク質分泌の増大など）を示す天然の状態でコンピテントな生物体の集合が識別される。菌株がプールされ、プールが分割される。片方のプールはｇＤＮＡの出所として使用され、もう片方は、天然の状態でコンピテントな細胞のプールの生成に使用される。
コンピテントな細胞はプールされたｇＤＮＡ の存在する中で増殖し、ＤＮＡ の取込みおよび組換えが可能となる。１つの遺伝形質の細胞が別のタイプの細胞からのｇＤＮＡを取込み、組込み、キメラゲノムを持つ細胞が生成される。その結果、元のプールに由来する遺伝的変異の組合せ混合物を表す細胞の集合ができる。これらの細胞が、もう一度プールされ、同じ出所のＤＮＡによって再び形質転換される。このプロセスは、繰り返し実行され、形質転換により生じる細胞のゲノムの多様性が増大する。十分な多様性が創り出されると、細胞の集合は、希望の改善が示される新しいキメラ生物体についてスクリーニングされる。
このプロセスは、ホスト生物体の天然の状態での適応性を増大させることで、改善される。ＣＯＭＳは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓで発現されるとき、天然の状態での適応性を仲介とする形質転換の効率を １０ 倍以上に改善するタンパク質である。
【０３０３】
プラスミド ｐＣＯＭＳ 内にあるほぼ １００％ の細胞で、ゲノムの ＤＮＡ 断片がそれ自体のゲノムに取込まれ組換えされることが示された。一般に、約 １０％のゲノムが任意の形質転換された細胞に組換えされる。この観察は下記のとおり示された。 ２つの栄養のマーカーについてのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｐＣＯＭＳ栄養要求性菌株が、同一の生物体の原栄養菌株から分離されたゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）により形質転換された。ＤＮＡに晒された細胞の１０％が、２つの栄養マーカーのうち一方について原栄養性であった。Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ により取込まれた ＤＮＡ 鎖の平均サイズは、約 ５０ｋｂ つまりゲノムの約 ２％ である。こうして、１０個に１個の細胞で、取込まれた ｇＤＮＡの５０個の分子のうち１個を表すマーカーが組換えされた。こうして、ほとんどの細胞は、約５個の５０ｋｂ分子つまりゲノムの１０％を取込み組換えがなされる。この方法は、微生物の全ゲノムを急速・効率的に組換えするための強力なツールである。
ｐＣＯＭＳの存在しない状態では、天然の状態での適応のために用意された細胞のうちわずか０．３％が、特定のマーカーを取込み、組込んだ。これは、実際には約１５％の細胞で、単一のゲノム断片との組換えが起こったことを示している。こうして、上記に記載した再帰的な形質転換の方策により、ｐＣＯＭＳが存在しない状態でさえも、全ゲノムの確率的／非確率的変異誘発によるライブラリが生成される。ただし、ｐＣＯＭＳが存在しない状態では、複雑なゲノムは小規模であるが、それでも形質転換または確率的／非確率的変異誘発による集合のうち、スクリーニング可能な割合である。
【０３０４】
４．６．１．２．１．１０ 染色体に対する遺伝子および遺伝子ライブラリの目標設定
遺伝子または遺伝子ライブラリを、細胞の染色体の特定の場所に直かに効率よく運ぶことができることは有用である。上記のとおり、目標の細胞は、染色体に対する相同的な組換えを目標とする配列に隣接するポジティブ選択マーカーで形質転換される。マーカーを含んでいる選択した細胞は、天然の状態でコンピテント （ｐＣＯＭＳ は存在してもしなくてもよいが、存在することが望ましい） となり、２組みのＤＮＡ断片の混合体で形質転換される。最初の組には、それぞれ配列に隣接する遺伝子または確率的／非確率的変異誘発された遺伝子ライブラリが含まれ、特定の染色体座への組込みを目標としている。第２の組には、配列に隣接したポジティブ選択マーカー （細胞に最初に組込まれたものとは異なる） が含まれ、最初のポジティブ選択マーカーの組込みおよび置換を目標とする。
最適条件下で、この混合体は、その遺伝子または遺伝子ライブラリがポジティブ選択マーカーに対してモル濃度過剰の状態となる。次に、新しいポジティブマーカーを含む細胞のために形質転換体が選択される。これらの細胞は、集結効果により、希望の遺伝子または遺伝子ライブラリの複製が組込まれた細胞用に濃縮され、遺伝子または当該の遺伝子変異体を含む細胞について、直接スクリーニングができる。このプロセスは、１０ｋｂ未満のＰＣＲ断片を用いて実行されたが、集結効果を採用することで、集合を細胞の５０％が集結するほどに濃縮することができることが判った。こうして、２つに１つの細胞は、遺伝子または遺伝子変異体を含んでいた。
別の方法では、発現ホストは、最初のポジティブ選択マーカーの存在しないもので、コンピテントな細胞を目標の遺伝子および制限された量の最初のポジティブ選択マーカー断片の混合体で形質転換させることができる。ポジティブ マーカーとして選択された細胞は、目標の遺伝子の希望する特性についてスクリーニングされる。改善された遺伝子は、ＰＣＲにより増幅され、再び確率的／非確率的変異誘発された後、最初のポジティブ選択マーカーと共に元のホストに再び戻る。このプロセスは、遺伝子の希望の機能が得られるまで、繰り返し実行される。このプロセスでは、一次的なホスト菌株を構成する必要性と２つのポジティブ マーカーの必要性がなくなる。
【０３０５】
４．６．１．２．１．１７ 過剰発現した遺伝子の希望の表現型についての改善
細胞の性質または表現型の改善は、その特性の発現に関連している遺伝子の発現の複製数を増大させることで向上されることがよくある。希望の性質に対してそのような効果を有する遺伝子も、ＤＮＡ確率的／非確率的変異誘発により同様な効果を持つように改善されうる。ゲノムＤＮＡライブラリが、過剰発現したベクターにクローニングされ、目標の細胞の集合に形質転換され、過剰発現のベクターの存在用に選択された細胞で、ゲノム断片が大いに発現される。次に、選択した細胞は、希望の性質の改善についてスクリーニングされる。改善された細胞からの過剰発現のベクターが分離され、確率的／非確率的変異誘発されたゲノム断片のクローニングがなされる。改善された分離からのベクターにあるゲノム断片は、別個に、または確認された相同遺伝子と共に、確率的／非確率的変異誘発される（系統の確率的／非確率的変異誘発）。次に、確率的／非確率的変異誘発されたライブラリは、細胞の集合に運び戻され、希望の性質の追加改善について、選択された形質転換体が再度スクリーニングされる。この確率的／非確率的変異誘発／スクリーニングのプロセスサイクルは、希望の性質が希望のレベルまで最適化されるまで繰り返し実行される。上述のとおり、遺伝子の量によって、希望の細胞の性質を大いに向上させることができる。
４．６．１．２．１．１９ 未知の相互作用を最適化するための確率的／非確率的変異誘発
観測特性の多くは同義遺伝子あるいは遺伝子生成物の複合体相互作用の結果である。このような相互作用の大半はまだ特徴づけされていない。したがって、特色の一因となる遺伝子のいくつかが判明していても、望ましい特色を獲得するためにどの遺伝子を最適化する必要があるのかは、不明瞭な場合がある。
選択されたものをすべて最適化する解決策を生み出すＤＮＡの確率的／非確率的変異誘発において、この特徴づけの欠如は問題でない。この問題だけではなく、さらに予想される将来の律速因子も解決する可能性を持つ代替のアプローチは、未知のゲノム配列の過発現による補足性である。
ゲノムＤＮＡのライブラリはまず、上記に説明されるように生成される。これは最適化されるために細胞に転換され、そして形質転換体は必要な特性の増加の有無について選別される。改善された特性をもたらすゲノム断片が ＤＮＡ の確率的／非確率的変異誘発によって進化し、それらの有益な効果をさらに増長する。このアプローチは配列情報を必要とせず、また、タンパク質の性質や系路相互作用に関する、あるいはどれが律速段階でさえあるかという知識あるいは仮定のいずれも必要とせず、望ましい表現型の検出だけに依存する。明確に相互作用しているゲノム配列のＤＮＡの確率的／非確率的変異誘発によるこの種類の無作為のクローン化およびその後の進化は、極めて強力で一般的である。同質遺伝子系統の菌株から、潜在的に望ましい特性を有する遠縁種まで、ゲノム ＤＮＡ のさまざまな母集団が使用される。さらに、転換とクローニングベクターの分子生物学基礎が利用可能ないかなる細胞、および分析可能ないかなる特性にも、技術は利用可能である（高スループット形式が望ましい）。代わりに、一旦最適化されると、進化したＤＮＡは相同的組換え、あるいはファージ調整された部位特異的組換えによってランダムに染色体に戻すことが可能である。
【０３０６】
４．６．１．２．１．２１ 再帰的配列組換えのための方法
ここに示されるように、ＤＮＡの確率的／非確率的変異誘発は最も急速な技術を複雑な新機能の進化に提供する。ここに示されるように、ＤＮＡの確率的／非確率的変異誘発における組換えはいくつかのサイクルで多重良性変異の蓄積を達成する。対照的に、有益な変異体と比較すると有害な変異体の頻度が高いので、反復点における突然変異は、良性変異を一つずつ組み込む必要があり、結果、同じポイントに達するために何サイクルも必要とする。ここに示されるように、ＤＮＡの確率的／非確率的変異誘発は変異蓄積の単純な直線配列というより、むしろ複数の問題が独自に解決された後に結合される可能性のある並列プロセスである。
４．６．１．２．２．１２ 遺伝子の高スループット系統群の確率的／非確率的変異誘発のための方法
大腸菌の場合、１０ ｋｂ 断片におけるゲノムのクローン化には、およそ ３００ のクローンを必要とする。相同断片は例えば、サルモネラから隔離されている。これはおよそ３００組の相同断片を与えることになる。各組は、系統群の確率的／非確率的変異誘発されており、確率的／非確率的変異誘発された断片は対立遺伝子置換ベクターにクローン化される。挿入物は上記の通り大腸菌ゲノムと統合される。グローバルな選別は、改良された表現型で変形を識別するために実施される。これは、望ましい菌株を発育するための確率的／非確率的変異誘発された改良の基本コレクションとなる。１つの超菌株へのこれらの独自に特定された変異株の確率的／非確率的変異誘発は上記のとおりに行われる。
４．７．１ 対象とされる確率的／非確率的変異誘発ホットスポット
１つの局面では、対象とされる相同遺伝子は組換え「ホットスポット」 （すなわち、全ゲノムにわたって観測される組換えの平均レベルと比較して、高水準の組換えを示す領域）であることが判明している、あるいはこのようなホットスポットに近位であることが判明しているゲノム（例えば、相同的組換えあるいは他の標的手順による）の特定領域にクローン化される。その結果生じる組換え株は再帰的に結合する。減数分裂性組換えの間、相同組換え遺伝子が組換えられ、その結果遺伝子の多様性を増加させる。交配の繰り返しによる数回のサイクルの組換えの後に、結果として生じる細胞は選別される。
【０３０７】
４．７．２ 酵母を使用した確率的／非確率的変異誘発
酵母は単細胞として成長する菌類の副成分である。酵母は、発酵飲料とパン種の生産、燃料としてのエタノールの生産、低分子量化合物、さらに、タンパク質と酵素の非相同生産のために使用されている（酵母株とそれらの用途の付随リストを参照）。一般的に使用される酵母菌は、出芽酵母菌、ピキアｓｐ、カンジダｓｐ、および分裂酵母ポンベを含んでいる。
酵母の中でのクローン化において利用できるベクターには数種類あり、それには組込みプラスミド （ＹＩｐ）、酵母複製プラスミド （真円度２μのベクターなどの ＹＲｐ）、酵母遺伝子副体プラスミド（ＹＥｐ）、酵母動原体プラスミド（ＹＣｐ）、あるいは酵母人工染色体 （ＹＡＣ） が含まれる。各ベクターは ＬＵＥ２、ＵＲＡ３ さらに Ｈ１Ｓ３などのプラスミドの存在、あるいはＵＲＡ３などのプラスミド不在のために選択するのに役立つ特徴マーカーを運搬することが可能である（５フルオロオロチン酸の存在下で成長する細胞にとって有毒な遺伝子）。
酵母の多くが性周期と無性（植物）周期を有する。細胞が成熟分裂を経るたびに性周期は有機体の全ゲノムの組換えに影響を及ぼす。例えば、出芽酵母菌の二倍体細胞が窒素と炭素制限条件に晒される場合、二倍体細胞には子嚢を形成するために成熟分裂が起こる。各子嚢は四つの半数体胞子を保持しており、二つは交配型「ａ」、もう二つは交配型「 」である。栄養分のある媒体に戻されると、反対の交配型の半数体胞子が二倍体細胞を形成するために再度交配する。反対の交配型のアジオスポア（Ａｓｉｏｓｐｏｒｅｓ）が子嚢の中で交配可能であるか、または例えば、子嚢がザイモリエースで劣化される場合、細胞の半数は遊離し、他の子嚢からの胞子との交配が可能である。この性周期は、酵母や酵母ベクターに挿入された外生断片ライブラリの内因性のゲノムを組み立て直すための形式を提供する。このプロセスは、交配細胞によって共有される相同の系列の確率的／非確率的変異誘発のための、混成遺伝子の交換あるいは蓄積をもたらす。
【０３０８】
判明している数個の遺伝子で突然変異体を有する酵母株は、確率的／非確率的変異誘発に役立つ特性を有している。これらの特性には、組換えの頻度を増加させて、細胞中で自然突然変異の頻度を増加させることが含まれている。これらの特性は暗号配列の変異か、野生型暗号配列の発現変化（通常過発現）の結果である可能性がある。ＨＯ 核酸分解酵素は、ＨＭＬａ／ とＨＭＲａ／ の ＭＡＴ 座への転位に影響し、交配型の転換という結果につながる。この酵素を暗号化する遺伝子中の突然変異体は、それらの交配型を転換せず、例えばライブラリを有する、あるいは望ましい表現型を有する変異体などの定義された遺伝子型の菌株間の交差を強制するために、また、出発菌株の繁殖を防ぐために使用されている場合がある。ＰＭＳ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６は不適当な組合せ修復に関係している。これらの遺伝因子の突然変異はすべて、突然変異誘発遺伝子表現型を有している （Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １６， ６１１０−６１２０ （１９９６ 年））。ＴＯＰ３ ＤＮＡ トポイソメラーゼ中の突然変異体には、染色体間の相同的組換えの６重増進がある（Ｂａｉｌｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２， ４９８８−４９９３ （１９９２年））。ＲＡＤ５０５７遺伝子は放射に対する耐性を与える。Ｒａｄ３はピリミジン二量体の切除において機能する。ＲＡＤ５２は遺伝子転換で機能する。ＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１、ＸＲＳ２は相同的組換えと非正統的組換えの両方で機能する。ＨＯＰ１、ＲＥＤ１ は初期の減数分裂性組換えで機能する （Ｍａｏ−Ｄｒａａｙｅｒ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４４， ７１−８６）。ＨＯＰ１、ＲＥＤ１のどちらにおいても、突然変異体は、ＨＩＳ２組換えのホットスポットで二重鎖切断を減少する。これらの遺伝子に欠如している菌胞株はＹＡＣｓの上に載せた前後に並んだライブラリなどの超遺伝子組換え構造物で安定性を維持することに役立つ。ＨＰＲ１の突然変異体は超遺伝子組換えである。ＨＤＦ１はＤＮＡ末端結合活性を有しており、二重鎖切断の修復とＶ（Ｄ）Ｊ組換えに関わる。
【０３０９】
この突然変異体に耐える菌株は無作為のゲノム断片で原形質体融合あるいは電気穿孔法のどちらかによって形質転換に役立つ。Ｋａｒ−１はカリオガミーを防ぐ優性突然変異である。Ｋａｒ−１突然変異体は、供与株から受容株までの、単一染色体の方向付けられた転送に役立つ。この手法は菌株間におけるＹＡＣｓの転送でこれまで広く使用されており、また他の生体への進化した遺伝因子／染色体の転送でも有用である （Ｍａｒｋｉｅ， ＹＡ Ｃ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， １９９６年））。ＨＯＴ１はリボソームＤＮＡ繰返し配列のプロモーターとエンハンサ領域の中のＳ出芽酵母菌組換えのホットスポットである。この場所はおそらくその高水準転写による隣接している系列で有糸分裂組換えを引き起こす。この場所の転写制御の下で挿入された遺伝因子や系路が増加した有糸分裂組換えを経験する。Ａｒｇ４を取り巻く範囲とその４つの遺伝因子は同じく組換えのホットスポットであり、またこれらの範囲でクローン化された遺伝因子は成熟分裂中に組換えを経験する可能性が高くなる。
相同遺伝子は、組換え株を繰り返し交配することによって、これらの領域でクローン化し、生体内で確率的／非確率的変異誘発させる可能性がある。ＣＤＣ２はポリメラーゼを暗号化し、それは有糸分裂遺伝子転換に必要である。この遺伝子の過発現は、再アセンブリあるいは突然変異誘発遺伝子菌株で使用することができる。ＣＤＣ４ の温度感受性突然変異は、制限している温度で細胞周期を Ｇ１ に止めて、最適化された溶融とその後の組換えのための原形質体を連動させるのに使用することが可能である。
【０３１０】
糸状菌のように、確率的／非確率的変異誘発酵母の一般的な目標は遺伝子操作のためのホスト有機体として様々な化合物への生産装置としての酵母における改良を含む。１つの望ましい特性は、どちらの場合にも、異種タンパク質を発現して、分泌する酵母菌の能力を改善することである。以下の例では、ＲＮａｓｅ Ａの増加量を発現して、分泌する酵母菌を進化させるために、確率的／非確率的変異誘発の使用について説明する。
ＲＮａｓｅ Ａ は特にピリミジン・ヌクレオチドの後に ＲＮＡ の Ｐ−０５’ 結合の分割を促進する。酸素は基本的な １２４ のアミノ酸ポリペプチドで、８ つのハーフシスチン残基を有しており、それぞれが触媒作用に必要とされる。ＹｅｐＷＬ−ＲＮａｓｅＡは酵母Ｓ．セレビシエからＲＮａｓｅＡの発現と分泌に作用するベクターで、このベクターを有する酵母は、培養基 １ リットル当たり、組換え型の ＲＮａｓｅＡ を １〜２ ｍｇ 分泌する （ｄｅｌ Ｃａｒｄａｙｒｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８（３）：２６， １−２７３ （１９９５年））。この全体的な産出は、酵母で非相同に発現されるタンパク質に乏しく、また、確率的／非確率的変異誘発によって少なくとも １０〜１００倍での改善が可能である。ＲＮａｓｅＡの発現は、いくつかのプレートとマイクロタイタープレート分析評価によって容易に検出される （ｄｅｌ Ｃａｒｄａｙｒｅ ＆ Ｒａｉｎｅｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３， ６０３１−６０３７ （１９９４ 年））。ＹｅｐＷＬ− ＲＮａｓｅ Ａ を有する Ｓ．セレビシエの菌株の再アセンブリに全ゲノムの確率的／非確率的変異誘発のためのそれぞれの説明された形式を使用することが可能で、さらに、ＲＮａｓｅ Ａ の増加する分泌のために媒体中に結果として生じる細胞を選別することが可能である。新しい菌株は、十分高いレベルのＲＮａｓｅＡの分泌が観測されるまで、確率的／非確率的変異誘発形式を通して繰り返し循環する。ＲＮａｓｅＡの使用は適切なフォールドとジスルフィド結合生成だけではなく、適切なグリコシレーションも必要とするので、特に役に立つ。したがって、発現、フォールド、および分泌系の多数の成分類を最適化することが可能である。また、結果として生じる菌株は他の異種タンパク質の分泌を改善するために進化される。
【０３１１】
４．７．３ 酵母菌のエタノールに対する耐性増加のための再アセンブリ
確率的／非確率的変異誘発酵母の別の目標はエタノールに対する酵母の耐性を増加させることである。それは、エタノールの商業生産、および、アルコール度の高いビールとワインの生産に役立つ。確率的／非確率的変異誘発される酵母株は、酵母のその他の菌株との交換または転換により遺伝物質を取得するが、それはエタノールに対する優れた耐性を持っている場合といない場合がある。進化する菌株は、確率的／非確率的変異誘発され、またｓｈｕｆｆｌａｎｔｓはエタノールへの露出に耐える能力のために選択される。確率的／非確率的変異誘発の一連の範囲でエタノールの濃度増を使用することができる。耐浸透圧性の改善のためにベーキング酵母の再アセンブリに同じ原則を使用することができる。４．７．４ 望ましい栄養条件の下で成長する能力
確率的／非確率的変異誘発酵母のもう一つの望ましい特性は望ましい栄養条件の下で成長する能力である。例えば、メタノール、デンプン、糖蜜、セルロース、セロビオース、またはキシロースなど入手可能状況に応じて安価な炭素源で成長するのは酵母にとって有益である。確率的／非確率的変異誘発と選択の原則は糸状菌で説明されたものと同様である。
４．７．５ 二次代謝物を生産するために
もう一つの望ましい特性は、糸状菌かバクテリアによって自然に生産された二次代謝物を生産する能力である。このような二次代謝物の例は、サイクロスポリンＡ、タキソール、セファロスポリン類である。進化されるべき酵母は、遺伝子交換を受けるか、または二次代謝物を生産する有機体からのＤＮＡによって転換される。例えば、タキソールを生産する菌類はタクソマイシズ アンドレアネ （Ｔａｘｏｍｙｃｅｓ ａｎｄｒｅａｎａｅ） とペスタロトピス（Ｐｅｓｔａｌｏｔｏｐｉｓ）微胞子虫を含んでいる （Ｓｔｉｅｒｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０， ２１４−２１６ （１９９３ 年）； Ｓｔｒｏｂｅｌら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４２， ４３５４４０ （１９９６年））。また、セイヨウイチイなど、タキソールを自然に生産する木から ＤＮＡ を得ることができる。
【０３１２】
タキソール系路で１つの酵素をＤＮＡ暗号化することにより、タキソール生合成で遂行された段階を促進すると信じられており、総合的なタキソール生産が律速である可能性があるタキサジエンシンターゼがクローン化された（Ｗｉｌｄｕｎｇ ＆ Ｃｒｏｔｅａｕ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７１， ９２０１−４（１９９６年）。ＤＮＡはその後、確率的／非確率的変異誘発され、ｓｈｕｆｆｌａｎｔｓが二次代謝産物の生産のために検査・選択される。例えばタキソール生産は、大量の分光学あるいはＵＶ分光測光によって、タキソールに免疫抗体を使用して監視することが可能である。代わりに、タキソール合成あるいはタキソール合成系路における酵素において、中間介在物の生産を監視することが可能である。Ｃｏｎｃｅｔｔｉ ＆ Ｒｉｐａｎｉ， Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ ３７５， ４１９−２３ （１９９４年）。二次代謝産物の他の例は、ポリオール、アミノ酸、ポリケチド、非リボソーム性ポリペプチド、エルゴステロール、カロチノイド、テルペノイド、ステロール、ビタミン Ｅ などである。
４．７．６ エタノールにおける分離能力の増加
もう一つの望ましい特性は、エタノールの準備における分離を容易にするため酵母の柔毛性を増加させることである。酵母は、確率的／非確率的変異誘発された酵母で、最も大きい塊を形成しているものを選択することによって、上述の手順のどれかによって確率的／非確率的変異誘発されることが可能である。
４．７．８ 生物学的浄化のための遺伝子の確率的／非確率的変異誘発
近代産業は、環境をもはや無限の流し台と考えることができない多くの汚染物質を発生させる。自然発生の微生物類は、自然界で見つけられない多くのもの （例えば生体内異物） を含む何千もの有機化合物を代謝することができる。人工廃棄物の生物分解のために微生物類を計画的に利用する生物学的浄化は、従来の処分方法と比較してコスト的にも実用性においても有利な新しい技術である。生物学的浄化が成功するかどうかは汚染物質を解毒できる、あるいは無機物化できる有機体があるかどうかによる。
【０３１３】
特定の汚染物質を分解することができる微生物類は遺伝子工学と再帰的配列組換えによって発生させることが可能である。生物学的浄化は公害制御の一面であるが、長期的により役立つアプローチは、産業廃棄物が環境に注ぎ込まれる前の防止策の一つである。廃水流が環境に注ぎ込まれる前にそれらが含む汚染物質の分解が可能な再帰的配列組換えによって、発生した微生物類へ産業廃棄物を流し込むことにより、これらの汚染物質の無機化の解毒作用をもたらすであろう。産業廃水パイプに取り付けられたバイオリアクターの中にそれらを含むことによって、組換え型の有機体の放出問題を回避することができる。このアプローチではさらに、使用される微生物の混合物を、生成される特定の廃棄物を最もよく分解するように調整することができる。最終的に、この方法は外の世界に順応する問題、さらに、多くの研究室微生物が直面する競争の問題を回避するであろう。
再帰的配列組換えアプローチは自然発生微生物の生物学的浄化能力における多くの限界を克服する。発明の方法によって、酵素活性度と特異性の両方を同時あるいは順次に修正することができる。例えば、それらが基質に影響する速度を増加させるように異化酵素を進化することが可能である。発明の実践に、代謝系路の律速段階に関する知識は必要でないが、発現や活動を増加するように、系路における律速タンパク質は進化することができ、誘導物質のための要件の排除が可能で、さらに新しい反応を促進する酵素は進化することができる。
生物学的浄化のための化学物質標的の一例として、ベンゼン、ザイレン、トルエン、樟脳、ナフタリン、ハロゲン化炭化水素、ポリ塩化ビフェニル （ＰＣＢ）、トリクロレチレン、ペンタクロロフェノール（ＰＣＰ）などの殺虫剤、およびアトラジンのような除草剤を含むが、これに制限されるものではない。
【０３１４】
４．７．８．１ 芳香族炭化水素
望ましくは、酵素が新しい触媒作用の機能を有するために「進化された」とき、その機能は構成的あるいは新しい基質に対応して発現される。再帰的配列組換えにより、タンパク質の構造的要素および調節要素（調節タンパク質の構造を含む）の両方は遺伝子組換え上の突然変異誘発が同時に起こりやすくなる。栄養物供給源として新しい基質を効率的に使用することができる変異体の選択は、酵素とその調節の両方がタンパク質構造あるいはオペロン制御のどちらかの詳細解析なしで最適化されるのを確実にするのに十分になるであろう。
芳香族炭化水素の例として、ベンゼン、ザイレン、トルエン、ビフェニル、およびピレンやナフタリンなどの多環芳香族炭化水素を含むがこれに制限されない。これらの化合物はカテコール中間介在物を通して代謝される。シュードモナス・プチダによるカテコールの分解は ｃｉｓ、ＣａｔＲ 調節タンパク質に影響する ｃｉｓ ムコン酸で異化オペロンの誘発を必要とする。アクティベータ （ＣａｔＲ はそのメンバーである） の ＬｙｓＲ 種類のための最適配列は Ｔ−Ｎ１１−Ａ であるが、ＣａｔＲ タンパク質のための結合部位は Ｇ−Ｎ１１−Ａ である。ＣａｔＲ 結合部位における Ｔ への Ｇ の変異はカテコール代謝遺伝子の発現を向上する （Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｎｅｗｓ ６２：１３０−１３７ （１９９６年））。これは、既存の異化系路のコントロールが特定の生体内異物の新陳代謝のために最適化されないことを示す。それはまた、標的化合物をより分解することができるバクテリアの選択前に起こる、オペロンの再帰的配列組換えから予想される突然変異体の一種の例である。
４．７．８．２ ハロゲン化炭化水素
大量のハロゲン化炭化水素が溶剤と殺生物剤の用途のために毎年生産されている。これらには、ポリ塩化ビニルの生産に使用される、合衆国だけで ５００ 万トン以上の１、２−ジクロロエタンと塩化ビニルの両方が含まれる。化合物は主に、単一の有機体中におけるプロセスによって生物分解できないが、原則として、異なった微生物類からの遺伝因子を結合することにより、塩素化芳香族の異化系路を構成することができる。酵素は、その基質特異性を変更するよう操作が可能である。再帰的配列組換えは、酵素の詳細な構造分析の必要なしに、酵素特異性を調整する可能性を新しい基質に提供する。
【０３１５】
４．７．８．３ ポリ塩素化ビフェニルと縮合多環芳香族炭化水素
ポリ塩素化ビフェニル （ＰＣＢ）、多環式芳香族炭化水素 （ＰＡＨ） ＰＣＢ と ＰＡＨ類は構造的関連を有する化合物群であり、スーパーファンド用地の多くにおける主要汚染物質である。プラスミドがより広範な基質特異性で酵素を暗号化している状態で転換されるバクテリアは商業的に利用されている。自然界では、いかなる既知の系路も、より大型のＰＡＨあるいは、さらに濃密に塩素処理が施されているＰＣＢを分解する一つのホストで発生しなかった。実際に、嫌気性と好気菌の協働は、完全な新陳代謝に必要となることが多い。
したがって、再帰的配列組換えの出発物質のための見込みのある供給源には、大型（２０−１０ＯＫＢ）プラスミド上で芳香族縮合炭化水素を分解する異化系路を暗号化する特定された遺伝子が含まれる （Ｓａｎｓｅｖｅｒｉｎｏら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏ． ５９：１９３１−１９３７ （１９９３年）； Ｓｉｍｏｎら、Ｇｅｎｅ １２７：３１−３７ （１９９３年）； Ｚｙｌｓｔｒａら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７２１：３８６−３９８ （１９９４年））。その一方で、ビフェニルとＰＣＢ−代謝酵素は、染色体遺伝子クラスタによって暗号化され、多くの場合、プラスミド上でクローン化されてきた （Ｈａｙａｓｅら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７２：１１６０−１１６４ （１９９０年）； Ｆｕｒｕｋａｗａら、Ｇｅｎｅ ９８：２１−２８ （１９９２年）； Ｈｏｆｅｒら、Ｇｅｎｅ １４４：９−１６ （１９９４年））。この物質は、単一の有機体中において生物分解系路を進化させることができるように、説明された手法の対象になることがある。
【０３１６】
４．７．８．４ 除草剤
不溶性の除草剤の異化作用のための遺伝子を進化させる一般的方法は、アトラジンのために以下の通り例証される。アトラジン［２−クロロ−４−（エチルアミノ）−６（イソプロピルアミノ）−１、３、５−トリアジン］は、ＥＰＡが設定した３ｐｐｂの健康助言濃度を超す、地面と表面水において頻繁に検出される、やや難分解性の除草剤である。アトラジンは、シュードモナス属種によるゆっくりとした代謝が可能である（Ｍａｎｄｅｌｂａｕｍら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏ． ６１：１４５１−１４５７ （１９９５年））。シュードモナスによるアトラジン新陳代謝における最初の２つのステップを促進する酵素は遺伝子 ＡｔｚＡ と ＡｔｚＢ によって暗号化される （ｄｅ Ｓｏｕｚａら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏ． ６１：３３７３−３３７８ （１９９５年））。これらの遺伝子は ６．８ ｋｂ 断片で ｐＵＣ１８（ＡｔｚＡＢ−ｐＵＣ）にクローン化された。このプラスミドを有する大腸菌は、アトラジンを可溶性の一層高い代謝産物に転換する。したがって、アトラジンを含むプレート上でバクテリアを育成することにより、酵素活性度を選別することが可能である。除草剤はプレートで不透明な沈殿を形成するが、ＡｔｚＡＢ−ｐＵ１８を含む細胞がアトラジン分解酵素を分泌し、それらの細胞あるいは集落の周辺で透明な光輪を引き起こす。通常、活動水準を評価するのに、光輪のサイズとその形成の速度を使用することができるので、最も大きい光輪がある集落を選ぶと、より活動的である、あるいは生産性の高いアトラジン分解酵素の選択が可能となる。
【０３１７】
４．７．８．５ 重金属解毒作用
バクテリアは、硫ヒ鉄鉱金鉱石の採掘で発生するヒ酸廃棄物を解毒するのに商業利用される。鉱山廃水と同様に、工場廃水は重金属類（例えば、電子部品とプラスチックの製造で使用されるもの）で汚染されていることが多い。したがって、微生物が単に他の生物治療的機能を実行するには、水銀量、ヒ酸、クロム酸塩、カドミウム、銀などを含む、存在する重金属類の度合いに耐性を有する必要がある。
強い淘汰圧力とは、毒性化合物を毒性の弱いものに代謝する能力である。重金属類は主に、タンパク質を変性するそれらの能力によって有毒である （Ｆｏｒｄら、Ｂｉｏｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔａｌｓ， ｐ．１−２３）。重金属汚染の解毒作用は多くの方法でもたらすことが可能であるが、それには、金属の溶解度あるいは生物学的利用能の変更、そのレドックス状態（例えば毒性の塩化第二水銀は揮発性のはるかに高い元素水銀への還元によって解毒される） の変更、さらに、固定されたバクテリアあるいは植物による金属の生体内蓄積さえも含まれる。金属が十分に高い濃度に蓄積されると、金属の再生が可能になる。溶融製錬において、有機体の有機的部分が焼き尽くされ、再利用可能な蓄積された金属が後に残る。多くの重金属類（ヒ酸、カドミウム、コバルト、クロム、銅、水銀量、ニッケル、鉛、銀、および亜鉛）への耐性は、ブドウ球菌属とシュードモナス属を含む多くの種において、暗号化されたプラスミドである（Ｓｉｌｖｅｒら、Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ． １０２：１０７−１１３ （１９９４年）； Ｊｉら、Ｊ． Ｉｎｄ． Ｍｉｃｒｏ． １４：６１−７５ （１９９５年）。また、これらの遺伝子は重金属耐性を他の種 （例えば大腸菌） にも同様に与える。細胞が重金属を蓄積する範囲を増加させるのと同様に、微生物の重金属耐性を増加させるのに、本発明（ＲＳＲ）の再帰的配列組換えの手法を使用することができる。例えば、大腸菌がヒ酸を解毒する能力は、ＲＳＲによって少なくとも １００ 倍で改善することが可能である。
【０３１８】
４．７．８．６ 微生物採鉱
「バイオリーチング」とは微生物が不溶性金属堆積物（通常、金属硫化物あるいは酸化物）を可溶性金属硫酸に転換するプロセスである。バイオリーチングは、硫ヒ鉄鉱の採掘で商業的に重要であるが、廃棄場からの金属と酸の解毒作用と回収においてさらなる可能性を有する。ＲａｗｌｉｎｇｓとＳｉｌｖｅｒによってバイオリーチングができる自然発生バクテリアが検討されている （Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：７７３−７７８ （１９９５年））。
これらのバクテリアは一般的に、成長するため、それらが好む温度によってグループに分割される。より重要な中温菌は、チオバチルス属とレプトスピラ属である。中等の好熱菌はスルホンバシラス属を含んでいる。過度の好熱菌はスルフォロバス属を含んでいる。これらの有機体の多くは商業用生産の環境において培養するのが難しく、それらの異化能力を、シュードモナス属、ロドコッカス、鉄酸化細菌あるいは大腸菌などのその他の有機体への転送、あるいはその中における最適化のための魅力的な候補としている。遺伝系は鉄酸化細菌の少なくとも１つの菌株に利用可能であり、プラスミドにおけるその遺伝物質の操作を許す。
上記で説明された再帰的配列組換え方法は、例えば、金属を不溶性から可溶性塩に転換する能力など、進化したバイオリーチング遺伝子あるいは系路のため、天然ホストあるいは非相同ホストの触媒能力を最適化するのに使用することができる。さらに、特定の鉱石の浸出レートは、例えば、鉱石濃縮における毒性化合物への耐性増加、特定の基質の特異性の増加、さらに、異なる基質を栄養素として利用する能力の結果として改善されることが可能である。
【０３１９】
４．７．８．７ 油の脱硫
化石燃料中の硫黄の存在は、パイプライン、ポンプ、精製設備の腐食、さらに燃焼エンジンの時期尚早な故障と関連づけられてきた。また、硫黄は化石燃料の熔錬で使用される多くを汚染する。大気中への硫黄の燃焼生成物の放出は酸性雨として知られている。
微生物脱硫は魅力的な生物学的浄化の応用である。バクテリアのいくつかは、化石燃料において見られる硫黄化合物の種類の代表化合物であるジベンゾチオフェン （ＤＢＴ） が分解できると報告されている。米国特許 Ｎｏ． ５，３５６，８０１ では、油の脱硫を生体触媒することが可能なロドコッカス・ロドキュラスからの ＤＮＡ 分子のクローン化が公表された。Ｄｅｎｏｍｅ 他 （Ｇｅｎｅ １７５：６８９０−６９０１ （１９９５年））はさらに、ジベンゾチオフェンを分解する上側のナフタリン異化系路を暗号化するシュードモナスから９．８ｋｂＤＮＡ断片のクローン化を公表している。同様の機能を実行する他の遺伝子が特定されている （米国特許 ５，３５６，８０１ で公表済）。
これらの酵素の活動は現在、商業利用が可能ではないほど低いが、系路は、発明の再帰的配列組換えの手法を使用することで効率性を増加することができる。当該の遺伝子の望ましい特性はジベンゾチオフェンあるいはそのアルキル、もしくはアリールが置換したアナログを脱硫するそれらの能力である。発明のいくつかの実施例では、選択は望ましくは、栄養物をバクテリアに供給するある系路に結合することによって実行される。したがって、例えば、ジベンゾチオフェンの脱硫はヒドロキシビフェニルの形成をもたらす。
これは炭素とエネルギーを供給するビフェニル異化系路の基質である。選択は、したがって、「確率的・非確率的突然変異誘発」のジベンゾチオフェン遺伝子によってなされ、それらをビフェニル異化系路を含むホストに転換するであろう。ジベンゾチオフェン脱硫の増加は、栄養素の可用性の増加および成長率の増加となる。遺伝子類がひとたび進化されると、それらはビフェニル分解遺伝子から容易に分離される。後者は、油のエネルギー含量を減少しないで脱硫することが目的であるので、完成品においては望ましくない。アルキルあるいはアリールで置換したジベンゾチオフェンの検出は、蛍光の変化によって （Ｋｒａｗｉｅｃ， Ｓ．， Ｄｅｖｅｌ． Ｉｎｄｕｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３１：１０３−１１４ （１９９０年）） あるいは脱硫の結果形成したフェノール群の検出 （Ｄａｃｒｅ， Ｊ．Ｃ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ４３：５８９−５９１ （１９７１年）） によって可能である。
【０３２０】
４．７．８．８ オルガノ−ニトロ化合物
オルガノーニトロ化合物は、爆薬、染料、医薬品、重合体、および抗微生物薬として使用される。これらの化合物の生物分解は通常、広範な特定酵素の系統群であるニトロレダクターゼによって促進される硝酸態グループの還元によって生じる。オルガノーニトロ化合物の部分還元は、原型よりも毒性の高い化合物を形成することが多い （Ｈａｓｓａｎら、１９７９ Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈ Ｂｉｏｐ． １９６：３８５−３９５）。ニトロレダクターゼの再帰的配列組換えは、それらの標的化合物 （例えば、ニトロトルエンとニトロベンゼンを含むがそれに制限されない） をより特異的に、また、より完全に還元することができる酵素を生産することができる（ゆえに、解毒することとなる）。ニトロレダクターゼは、爆発物による汚染土壌から分離している、モルガン菌やエンテロバクター・クロアカのようなバクテリアから分離することができる （Ｂｒｙａｎｔら、１９９１ 年、Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２６６：４１２６−４１３０）。
望ましい選別方法は当該のオルガノニトロ化合物への耐性増加を探索することである。その理由は、酵素がさらに原型化合物のいかなる毒性の部分還元製品も還元させることが可能であることを示すからである。
４．７．８．９ 化学合成のための代替基質
代謝工学は、産業上有用な化学物質を生成する微生物を改造するのに使用することができる。それによって微生物は、人工的に生産された産業廃棄物を含めて、代替の一層豊富な栄養素を利用して成長するであろう。これは通常、代替基質を組換え細胞の中に入れるための輸送システムと、組換え細胞への自然ホスト有機体からの異化酵素の両方を提供することを必要とする。
いくつかの場合には、組換え細胞が代替基質をより容易に取り込むことができる形態に分解するために、組換え細胞による媒体の中への酵素の分泌が可能である。他の場合においては、加水分解物を利用するために、同じ人工ホストの第二接種菌あるいは第二ホストが加えらる一方で、組み換え細胞の一群を１つの望ましい基板で生育してから、代替基質のために加水分解酵素を媒体の中に解放するために溶解することが可能である。
【０３２１】
再帰的配列組換えのための出発物質は、通常、基質あるいはその輸送の利用のために遺伝子になる。当該栄養素の例には、乳糖、ホエー、ガラクトース、マンニトール、キシラン、セロビオース、セルロース、およびスクロースが含まれるがこれには制限されず、したがって、エタノール、トリプトファン、ラムノリピド界面活性物質、キサンタンガム、およびポリヒドロキシアルカノエイトを含むがこれに制限されない化合物のより低コストの生産を可能にする。望ましい標的物質としてのかかる基質の検討に関しては、キャメロン他を参照すること （Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３８：１０５−１４０ （１９９３年））。上記で説明された再帰的配列組換え方法は、当該の基質を利用するため、より効率的な輸送システムを展開するため、あるいは特定の基質の特異性を増加したり、変更するためなど、天然ホストあるいは異種ホストの能力を最適化するのに利用することができる。
４．７．８．１０ 細胞特性の修正
厳密には、中間代謝の操作に関する例ではないが、成長率から、特定の必要な化合物を分泌する能力、上昇温度あるいはその他の環境的ストレスを許容する能力まで、細胞特性の他の局面を改良あるいは修正するために再帰的配列組換えの手法を使用することが可能である。伝統的方法によって組み換えられた特色に関するいくつかの例には、バクテリア、酵母、その他の真核生物細胞、抗生物質抵抗性、およびファージ抵抗性における異種タンパク質の発現が含まれる。これらの特色のいずれも、本発明の再帰的配列組換えの手法によって有利に進化される。例として、Ｃａｍｅｒｏｎ ら、 Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ３８：１０５−１４０ （１９９３） で検討された、一つの栄養吸収系 （例えば、メチロフィラス メチロトロファス （Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ） 中のアンモニア） と別のさらにエネルギー効率の高いシステムとの置換、限界酸素の条件の下で成長を改善するヘモグロビンの発現、毒性代謝の最終生成物のより弱い毒性化合物への方向転換、塩、渇水、毒性化合物への耐性、および、病原体、抗生物質、およびバクテリオファージに対する抵抗性に関与する遺伝子の発現が含まれる。
【０３２２】
これらの機能を暗号化する非相同遺伝子はすべて、それの新しいホストに既存の再帰的配列組換え手法によってさらなる最適化のための可能性を有している。これらの機能が望ましい増殖条件の下で細胞成長率を増加させるので、進化による遺伝子の最適化は単に、ＤＮＡ を再帰的に再結合すること、限界酸素を制限することで速く成長する組換え型を選択すること、高濃度の毒性化合物、あるいは、改良されるパラメータのためのいかなる適切な増殖条件を必要とする。
これらの機能が望ましい増殖条件の下で細胞成長率を増加させるので、「進化」による遺伝子の最適化は単に、ＤＮＡを「確率的／非確率的変異誘発」し、限界酸素を制限することで速く成長する組換え型を選択すること、高濃度の毒性化合物、あるいは、克服されるいかなる制限的な条件を必要とする。培養哺乳細胞もまた、必須アミノ酸が増殖培地に存在することを必要とする。この要件は、これらのアミノ酸類を合成する異種代謝系路の発現によって回避されることが可能である（Ｒｅｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：６２９−６３３ （１９９０年）。再帰的配列組換えは哺乳動物細胞のこれらの遺伝子の発現を最適化するのにメカニズムを提供するであろう。またしても、望ましい選択は付加アミノ酸の欠如において成長可能な細胞である。
本発明の技術によって改善されるさらなる別の候補は共生窒素固定である。根粒着生（ｎｏｄ、ｎｄｖ）、窒素還元（ｎｉｆ、ｆｉｘ）、ホスト域決定（ｎｏｄ、ｈｓｐ）、バクテリオシン生産 （ｔｆｘ）、表面多糖合成 （ｅｘｏ）、およびエネルギー利用 （ｄｃｔ、ｈｕｐ） にかかわる遺伝子は特定された（Ｐａａｕ， Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ａｄｖ． ９：１７３−１８４ （１９９１年））。この場合における再帰的配列組換えの主な役割は、より良い窒素固定であることが既に知られている菌株の生存を改善することである。これらの菌株は、窒素固定では優れていても、環境にすでに存在している菌株との競争においては、あまり優秀ではない傾向がある。再帰的配列組換えの標的である根粒着生とホスト域決定遺伝子などは、新しいホストで成長するそれらの能力を修正し、選択することができる。
【０３２３】
同様に、菌株の競争力を改善するいかなるバクテリオシンあるいはエネルギー利用性の遺伝子も、より大きい成長率をもたらすであろう。標的遺伝子を再帰的配列組換えし、接種物を野生型窒素固定細菌と競争させるだけで、選択を実行することができる。新しいホストにおける窒素固定バクテリアの成長が良いほど、次回の組換えにおいて、より多くのそれらの組換え遺伝子の複製が存在するであろう。この成長率識別選択は上記に詳細に説明されている。
４．７．８．１１ バイオディテクター／バイオセンサー
生物発光または蛍光性遺伝子は特定の調節遺伝子 （Ｃａｍｅｒｏｎ ら、 Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ３８：１０５−１４０ （１９９３年））にそれらを融合させることにより、リポーターとして使用することができる。特殊な例では、ルシフェラーゼ遺伝子Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ の ｌｕｘＣＤＡＢＥ が、シュードモナス・プチダ ＲＥ２０４ からのイソプロピルベンゼン異化オペロンの調節部分へ融合された。
再帰的配列組換えもまた、バイオセンサーの特異性を変更するために使用することができる。転写を引き起こす調整部分や化学薬品と相互に作用する調整部分や転写活性体もまた、確率的／非確率的突然変異を起こすことがある。これにより、正常な誘導物質の類似化合物によって転写が活性化される調節システムが生成されるべきである。その結果、異なる化学薬品のバイオディテクターを開発することができる。
【０３２４】
４．９ 繊維状菌類を使用したＳＨＵＦＦＩＮＧ
繊維状菌類は、上記の確率的／非確率的突然変異誘発方法の実行に特に適している。繊維状菌類は、有性生殖の構造に基づいた、次の４つの主な分類に分けられる：藻菌類、子嚢菌、担子菌および不全菌類。藻菌類 （例えば、クモノスカビ、ケカビ） は、胞子嚢の有性胞子を形式する。
胞子は単一あるいは多核の場合があり、しばしば隔膜のある菌糸（多核細胞）がない場合がある。子嚢菌（例えばアルペルギウス、パンカビ属、アオカビ属）は、減数分裂の結果として子嚢内に有性胞子を生成する。子嚢には典型的に４つの減数分裂生成物が含まれるが、付加的な減数分裂分類の結果として８つの生成物を含むものもある。担子菌にはマッシュルームと黒穂菌が含まれており、担子器の表面に有性胞子を形成する。マッシュルームのようなホロバシディオマイセタス（ｈｏｌｏｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）では、担子器は分裂しない。Ｒｕｔｓ（サビキン目）や煤菌類（Ｕｓｔｉｌａｇｉｎａｌｅｓ）のようなホロバシディオマイセタスでは、担子器は分裂している。ヒトの病原体を最も含む不全菌類には、既知の有性段階がない。
菌類は、無性生殖、有性生殖あるいは擬似有性的な手段によって繁殖することができる。無性生殖には、菌糸体の無性成長、生殖体を伴わないあるいは核分裂のない細胞核分裂や細胞分裂が含まれる。細胞分裂は、菌糸の胞子形成、出芽あるいは分裂によって生じることがある。
４．９．１ 無関係な遺伝子の遺伝子工学に有効なホストとなる確率的／非確率的突然変異誘発からの菌類の進化
４．９．２ 菌類の特定合成物の生成能力の改善
確率的／非確率的突然変異誘発の一般的な目標の１つは、遺伝子工学にとって有効なホストとなる、特に無関係な遺伝子の確率的／非確率的突然変異誘発に菌類を進化させることである。こうじカビおよびパンカビ属は一般的に、それらの性サイクルや伝統的に分子遺伝学で確立されている使用のために、そのような操作のためのホストとして欲求を満たすよう選択される菌類有機体である。もう一つの一般的な他の目標は、特定の合成物（例えば抗菌性の（ペニシリン、セファロスポリン）、抗真菌性（例えばエチノキャンディン（ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎｓ）、オーレオバシディン（ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎｓ）および木質解体酵素）を生成する菌類の能力を改善することである。これらの一般的な目標の間には部分的に重複する部分があり、したがって、望ましい特性のいくつかは、両方の目標を達成するのに役立つ。
【０３２５】
４．９．７ 生合成の経路でコード化する遺伝子の取得あるいは改善、運送タンパク質、そして代謝流動
もう一つの望ましい性質は、生合成経路の酵素をコード化する遺伝子、運送タンパク質をコード化する遺伝子、および代謝流動コントロールに関与するタンパク質をコード化する遺伝子の取得および／または改善である。この状況において、経路を所有する菌類とは別の菌株で遺伝子を交換、あるいは経路を所有する有機体の断片ライブラリを導入するいずれかの方法によって、経路の遺伝子を進化する菌類へ導入することができる。これらの菌類の遺伝物質はその後、この応用法で議論された様々な手続きによって、さらに確率的／非確率的突然変異誘発、またスクリーニング／選択を促進する対象となることがある。菌類のＳｈｕｆｆｌａｎｔ菌株は、代謝経路あるいはその先駆物質によって生成された合成物の生成のために選択／スクリーニングされる。
４．９．１２ 第 ２ コンポーネントを使用する変更トランスポーター
もう一つの望ましい性質は、変更されたトランスポーター （例えば、ＭＤＲ） で菌類を生成することである。そのような変更されたトランスポーターは、例えば、新しい第２の代謝物質を生成する、細胞へ新しい第２の代謝物質の合成に必要とされる先駆物質のエントリーを許可する、あるいは細胞からの第２の代謝物質の流動を可能にするために進化した菌類に有効である。トランスポーターは、菌細胞へトランスポーター異変体のライブラリを導入することによって進化させることができ、細胞が有性生殖あるいは性擬似有性的な組換えによって再結合することを可能にする。細胞へ先駆物質を輸送する能力のあるトランスポーターを進化させるために、細胞は先駆物質のもとで増殖し、その後細胞は代謝物質の生成のためにスクリーニングされる。代謝物質を運び出す能力のあるトランスポーターを進化させるために、細胞は代謝物質の生成を支援する条件の下で増殖され、培地へ代謝物質を運び出すためにスクリーニングされる。
【０３２６】
菌による確率的／非確率的突然変異誘発の一般的な方法が次に示される。冷凍のストック、凍結乾燥のストック、あるいは寒天培養基のプレートから取り出されたばかりの胞子が、適切な液体の媒質に接種するために使用される （１）。胞子は菌糸の成長に伴って発芽される （２）。菌糸体が収穫され、濾過および／または遠心分離によって洗浄される。任意で、サンプルを原型質体の構成を増強するために、 ＤＴＴ で予め処理する （３）。プロトプラストは浸透性の安定した媒体 （例えば １ ｍ ＮａＣＩ／２ＯｍＭ ＭｇＳ０４、ｐＨ ５．８） で、酵素を解体する細胞壁 （例えば Ｎｏｖｏｚｙｍｅ ２３４） を追加して実行される （４）。酵素を解体する細胞壁は、浸透性のある安定した媒体で繰り返し洗浄されることにより取り除かれる （５）。ミラクロス による濾過および密度遠心分離によりプロトプラストを菌糸体、残存物および胞子から分けることができる （６）。プロトプラストは遠心分離によって収穫され、適切な濃度に再び懸濁される。このステップが原型質体の融合に結びつく場合がある （７）。ＰＥＧ （例えば ＰＥＧ ３３５０）を追加することで、そして（あるいは）ＰＥＧとあるいはＰＥＧなしで繰り返し遠心分離と再懸濁を行うことで、融合を刺激することができる。また電子融合も実行することができる（８）。融合した原形質体は、蔗糖勾配堆積作用（あるいは上記の他のスクリーニング方法）によって任意で、融解していない原形質体から強化することが出来る。融合した原形質体は任意で、組換えを刺激するように紫外線の照射で取扱うことができる（９）。プロトプラストは、細胞壁を形成し菌糸体を再生成する浸透性の安定した寒天培養基のプレートで培養される（１０）。菌糸体は胞子を生成するために使用され（１１）、それらは、確率的／非確率的突然変異誘発の次の実験の出発物質として使用される（１２）。望ましい性質のための選択は、再生成された菌糸体あるいはそこから派生した胞子のいずれかで実行することができる。
【０３２７】
代替方法では、細胞壁の合成に必要な１つ以上の酵素を抑制することによって、プロトプラストが形成される。抑制体は、使用の条件下で殺菌性ではなく静真菌性でなくてはならない。抑制体の例には、（例えば Ｇｅｏｒｇｏｐａｐａｄａｋｏｕ ＆ Ｗａｌｓｈ， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇ． Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４０， ２７９−２９１ （１９９６年）； Ｌｙｍａｎ ＆ Ｗａｌｓｈ， Ｄｒｕｇｓ ４４， ９−３５ （１９９２年））に記述される抗真菌性の合成物が含まれる。他の例には、キチン質シンターゼ抑制体（ポリオキチン（ｐｏｌｙｏｘｉｎ）またはニッコーマイシン合成物）および／またはグルカンシンターゼ抑制体（例えばエチノキャンディン（ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎｓ）、パプロキャンディン（ｐａｐｕｌｏｃａｎｄｉｎｓ）、ニューモキャンディン（ｐｎｅｕｍｏｃａｎｄｉｎｓ））が含まれる。抑制体は浸透性の安定した媒体に適用されなければならない。細胞壁をはぎ取られた細胞は融合するか、あるいは融合しない場合は、遺伝形質転換／変形開発計画のドナーあるいはホストとして使用することができる。
さらなる変化では、プロトプラストは、遺伝学的に不十分か、完全な細胞壁を合成するその能力において妥協して処理する菌類の菌株を使用して準備される。そのような突然変異体は一般にもろく、浸透性の治療、あるいはより細胞壁の少ないものとして言及され、菌株保管所から入手が可能である。そのような菌株の例にはアカパンカビ突然変異体 （Ｓｅｌｉｔｒｅｎｎｉｋｏｆｆ， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ． Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ２３， ７５７−７６５ （１９８３年））が含まれる。そのような突然変異のいくつかは、温度に敏感である。温度に敏感な菌株は、選択および増幅の目的には複製を許容する温度で、またプロトプラスト構成および融合目的には複製を阻害する温度で増殖させることができる。温度に敏感な菌株アカパンカビ菌株は、複製を阻害する温度でソルボースとポリオキチンを含む浸透性の安定した媒体において成長する時にプロトプラストとして繁殖するが、複製を許容する温度でソルビトールを含む媒体への転移で細胞全体を生成する、と記述されている。ＵＳ ４，８７３，１９６ を参照。
【０３２８】
その他の適切な菌株は、キチン質合成、グルカン合成、および細胞壁に関連する他のプロセスに関与する遺伝子の目標の突然変異誘発によって生成される。そのような遺伝子の例には、出芽型酵母菌およびカンジダの一種（Ｇｅｏｒｇｏｐａｐａｄａｋｏｕ ＆ Ｗａｌｓｈ １９９６ 年） のＣＨＴＩ、ＣＨＴ２ および ＣＡＬＩ （あるいは ＣＳＤ２）、また ＥＴＧＩ／ＦＫＳＩ／ＣＮＤＩ／ＣＷＨ５３／ＰＢＲＩ、および出芽酵母菌の同族、シロカンジダ、クリプトコックス・ネオフォルマンス、アスペルギルス・フミガーツス、ＣｈｖＡＩＮｄｖＡアグロバクテリウムおよびリゾビウムの中の同族体が含まれる。その他の例は、Ｍ４、ｏｒｌＢ、ｏｒｌＣ、ＭＤ、ｔｓＥ およびアスペルギルス ニダランスのｂｉｍＧ である （Ｂｏｒｇｉａ， Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７４， ３ ７７−３ ８９ （１９９２年））。
ＯｒｌＡ１またはｔｓｅ１の突然変異を含むこうじカビの菌株は、限定的な温度で溶解する。これらの菌株の溶解は、浸透の安定化によって防止できる場合があり、また突然変異はＮ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓｉｍｉｎｅ（ＧｌｃＮａｃ）を追加することによって補足される場合がある。ＢｉｍＧ１１ 突然変異は、タイプ １ タンパク質ホスファターゼの ｔｓ である （この突然変異をもたらす菌株の生殖細胞には、キチン質、ｃｏｎｄｉａ ｓｗｅｌｌ および溶解がない）。他の適切な遺伝子は、アスペルギルス フミガータスの ｃｈｓＡ、ｃｈｓＢ、ｃｈｓＣ、ｃｈｓＤおよびｃｈｓＥ、アカパンカビのｃｈｓ１およびｃｈｓ２、藻菌ヒゲカビ （ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎｕｓ） ＭＭ、出芽酵母菌の ｃｈｓ １、２ および ３ がある。Ｃｈｓ １ は本質的でない修理酵素である。ｃｈｓ２ は隔壁構成に関係する。また、ｃｈｓ３ は細胞壁の成熟および芽状突起環帯状郡系に関係する。
その他の有効な菌株には、ｔｓ 菌株のような出芽酵母菌 ＣＬＹ （細胞溶解） 突然変異体 （Ｐａｒａｖｉｃｉｎｉら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２， ４８９６−４９０５ （１９９２年））、および ＰＫＣ１遺伝子欠失を保護するＣＬＹ１５菌株が含まれる。その他の有効な菌株には、ｓｒｂ に ｔｓ 突然変異を含む菌株ＶＹ１１６０（アクチンを記号に変える）（Ｓｃｈａｄｅら、Ａｃｔａ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｓｕｐｐｌ． ４１， １９３−２００ （１９９１年））、またカタツムリの腸から分離された細胞壁溶解酵素への増加した感度に伴いｓｅｓ突然変異をする菌株が含まれる （Ｍｅｔｈａ ＆ Ｇｒｅｇｏｒｙ， ＡｐｐＬ Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４１， ９９２−９９９ （１９８１年））。カンジダ・アルビカンス（Ｃａｌｂｉｃａｎｓ）の有効な菌株には次が含まれる。Ｐａｙｔｏｎ ＆ ｄｅ Ｔｉａｎｉ， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． １７， ２９３−２９６ （１９９０年）によって記述された浸透性の矯正条件付きの致死的な突然変異体のような、ｃｈｓｌ、ｃｈｓ２ あるいはｃｈｓ３（キチン質シンターゼ記号付け）における突然変異のあるもの。カタツムリの腸から分離された細胞壁を溶解する酵素の感度の高まった Ｃ． ｕｔｉｌｉｓ 突然変異体 （Ｍｅｔｈａ ＆ Ｇｒｅｇｏｒｙ， １９８１、前出）。および Ｘ ｃｒａｓｓａ 突然変異体 ｏｓ−１、ｏｓ−２、ｏｓ−３、ｏｓ−４、ｏｓ−５ および ｏｓ−６。Ｓｅｌｉｔｒｅｎｎｉｋｏｆｆ， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ２３， ７５７−７６５ （１９８３年） を参照。そのような突然変異体は ３７℃で細胞壁なしで成長、分裂するが、２２℃で細胞壁を生成する。
【０３２９】
目標の突然変異誘発は、目標のセグメントの側面を守る相同部位を含む肯定否定的な選択ベクター、相同部位外部の相同部位と否定的選択マーカーの間の肯定的な選択マーカーで細胞を変形することによって達成されることができる （Ｃａｐｅｃｃｈｉ， ＵＳ５，６２７，０５９を参照）。変化において、否定的な選択マーカーが肯定的な選択マーカーのアンチセンスの写しである場合がある （ＵＳ ５，５２７，６７４ を参照）。
ランダムな突然変異誘発あるいは選択と組合せた確率的／非確率的突然変異誘発された手続きによって、その他の適切な細胞を選択することができる。例えば、細胞の最初の特定生物型群に突然変異が起こり、突然変異誘発から回復することが可能になり、細胞壁の不完全な解体の対象となり、次に、細胞の第 ２ の特定生物型群のプロトプラストに接触する。両方の特定生物型群からのマーカーを運ぶ混成細胞が識別され（上記の通り）、その後の一連の確率的／非確率的変異誘発における出発物質として使用される。この選択計画により、自発的なプロトプラスト構成に対する能力のある細胞および増強された再組換え遺伝子性 （ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ） のある細胞の両方が選択される。
さらなる変化で、自発的なプロトプラスト構成能力を持つ細胞を、発案の他の方法を使用して進化、増強された再組換え遺伝子性がある細胞と交雑させることができる。混成細胞は全ゲノム確率的／非確率的突然変異誘発に特に適切なホストである。
細胞壁合成あるいはメンテナンスに関与する酵素中の突然変異細胞は、自発的なプロトプラスト構成により浸透性の保護された培養で細胞を増殖することの単なる結果として、融合を経験することができる。突然変異が条件付きの場合、細胞は複製を阻害する条件へと移される。ＰＥＧあるいは電場のような促進作用因を追加することで、プロトプラスト構成および融合が加速される （Ｐｈｉｌｉｐｏｖａ ＆ Ｖｅｎｋｏｖ， Ｙｅａｓｔ ６， ２０５−２１２ （１９９０年）； Ｔｓｏｎｅｖａら、ＦＦＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ． ５１， ６１−６５ （１９８９年） を参照）。
【０３３０】
４．１１ 進化
４．１１．１ 確率的／非確率的突然変異誘発によって新しいあるいは改善された性質を取得するための人為的な細胞の進化
発案により、再帰的配列組換えの技術によって代謝およびバイオプロセスの経路を進化させるための多くの戦略が提供される。戦略の１つは、その種の基質のより効率的な使用、あるいは第２の種の基質の比較可能あるいはより効率的な使用のいずれかを与えるために、１つの種で栄養になる供給源として重要な特定の基質を使用する能力を与える遺伝子の進化を論理的必然として意味する。別の戦略では、有機体の１つ以上の種の重要な合成物を解毒する能力を与える細胞の進化を論理的必然として意味する。別の戦略では、最初のホストあるいは新しいホストのいずれかで、合成物 Ｂ を生合成するか解体する能力のために合成物 Ｂ と関係する合成物Ａの生合成あるいは解体のための酵素あるいは代謝経路を進化させることにより、新しい代謝経路の進化を論理的必然として意味する。さらなる戦略では、特定の代謝物質あるいは遺伝生成物のより効率的なあるいは最適化された発現のための遺伝子または代謝経路の進化を論理的必然として意味する。さらなる戦略では、望ましい異質組織生成物の発現に対するホスト／ベクターシステムの進化を論理的必然として意味する。これらの戦略は、多重ステップ経路の遺伝子、１つあるいはいくつかの遺伝子、異なる有機体からの遺伝子、あるいは遺伝子の１つ以上の断片をすべて使用することを含む場合がある。
戦略は一般的に、異質組織細胞の機能維持、相同細胞あるいは異質組織細胞の機能の改善を可能にする、それについての細胞あるいはセグメントの進化を論理的必然として意味する。進化は、再帰的配列組換えと名付けられたプロセスによって一般に達成される。下記に詳細されるように、再帰的配列組換えは、様々なフォーマットでそしてフォーマットの置換により達成することができる。これらのフォーマットにはいくつかの共通する法則がある。再帰的配列組換えは、分子の多様性を生成する（つまり互いに本質的な配列同一性を見せるが、突然変異がある状態において異なる、核酸分子の分類の生成）ために、組換えの連続サイクルを必要とする。各組換えサイクルの後には、望ましい特性がある分子のスクリーニングあるいは選択の少なくとも１つのサイクルが続く。１つのラウンドで選択された分子は、次のラウンドで多様性を生成するための出発物質を形式する。所定のサイクルでは、組換えが生体内かつ生体外で生じることができる。更に、組換えに起因する多様性は、基質あるいは組替えの生成物のいずれか一方に対する突然変異誘発の先の方法を適用することにより、任意のサイクルで増大させることができる（例えば、起こりやすいＰＣＲ（遺伝子変異導入技術）、カセット突然変異誘発、バクテリア突然変異誘発遺伝子菌株の通路、化学の突然変異原での処理）。
【０３３１】
４．１２．４ よりよい効率のための分泌経路の進化
４．１２．５ 薬または化学薬品を製造するための進化
バクテリアや真核細胞のタンパク質 （あるいは代謝物質） 分泌経路は、タンパク質調合薬、小分子薬あるいは専門化学薬品の製造のためのように、望ましい分子をより効率的に運び出すように進化させることができる。効率上の改善は、多重サブユニットの集合を要求するタンパク質 （抗体のような） あるいは分泌の前に広範囲な翻訳前修正を要求するタンパク質に特に望ましい。
分泌の効率は、配列をコード化するシグナルペプチド、コード化する配列を結合するまたはそうでなければ認識するタンパク質をコード化する配列、および分泌されているタンパク質のコード化する配列を含む多数の遺伝配列に左右される場合がある。後者は、タンパク質の折り重り、そしてそれが膜組織へ統合あるいは浸透することができるかに影響を与える場合がある。大腸菌中のバクテリア分泌経路には、ＳｅｃＡ、ＳｅｃＢ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＤおよびＳｅｃＦ遺伝子が含まれる。枯草菌では、主な遺伝子が５つのシグナルペプチダーゼ遺伝子を伴うｓｅｃＡ、ｓｅｃＤ、ｓｅｃＥ、ｓｅｃＦ、ｓｅｃＹ、ｆｆｈ、ｆｔｓＹ （ｓｉｐＳ、ｓｉｐＴ、ｓｉｐＵ、ｓｉｐＶおよびｓｉｐＷ）（Ｋｕｎｓｔら、前出）である。翻訳後修正を要求するタンパク質については、そのような修正に影響する遺伝子の進化が、改善された分泌に貢献する場合がある。同様に、多重サブユニットタンパク質（例えばチャペロニン（ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎｓ））の集合における役割を持つ発現生成物のある遺伝子は、さらに分泌の改善に貢献する場合がある。
組換えのための基質の選択は、上記に述べられた一般的な法則に従う。この場合、上記に言及された集中ライブラリは、既知の分泌遺伝子の変形を含む。原核細胞の進化が真核生物のタンパク質を発現するために、組換えのための初期の基質は、分真核生物の供給源から少なくとも一部分がしばしば得られる。
入って来る断片は、受容細胞の染色体ＤＮＡおよびそのような細胞に存在するスクリーニングマーカー構造物の両方で、組換えを経験することができる （以下参照）。組換えの後の形式は、スクリーニングマーカー構造物に組み込まれた配列をコード化するシグナルの進化にとって重要である。進化された細胞にマーカー構造物を包含することで、改善された分泌をスクリーニングすることができる。マーカー構築物はマーカー遺伝子をコード化し、発現配列に操作が可能なようにリンクされ、そして通常配列をコード化するシグナルペプチドに操作が可能なようにリンクされる。マーカー遺伝子は、重要な再結合タンパク質で融合タンパク質として、時々発現される。分泌遺伝子と共に配列をコード化する再結合タンパク質を進化させたい場合に、このアプローチは有用である。
【０３３２】
４．１２．６ 分泌されなければ生成物が細胞に対して有毒なように進化させる
ある１つの変形においては、マーカー遺伝子は、生成物が分泌されない場合に、構造物を含んでいる細胞に対して有毒な生成物をコード化する。適切な毒素タンパク質には、ジフテリア毒素およびリシン毒素が含まれる。そのような構造物を運ぶ修正済細胞の増殖は、毒素の分泌を改善するよう細胞が進化するよう選択する。二者択一的に、マーカー遺伝子は、既知の受容器への配位子をコード化することができ、ラベルが付けられた受容器を使用するＦＡＣＳによって、配位子を運ぶ細胞を検知することができる。任意で、そのような配位子は、分泌に続く細胞膜表面に配位子を結び付けるリン脂質固定配列に操作が可能なようにリンクすることができる。また別の変形、分泌されたマーカータンパク質は、寒天培養基の滴下へ個々の細胞を分配することにより、それを分泌する細胞に近接して維持することができる。これは、例えば、細胞懸濁液の小滴構成によって行われる。分泌されたタンパク質は寒天培養基母体内に制限され、例えば ＦＡＣＳ により検知することができる。また別の変形では、重要なタンパク質がベータラクタミーゼまたはアルカリフォスファターゼと共に融合タンパク質として発現される。これらの酵素は、市販の色原体の基質（例えばＸ−ｇａｌ）を新陳代謝させるが、ペリプラズムへの分泌の後にだけそれを行う。細胞のコロニーにおける有色基質の外観は、したがって融合タンパク質を分泌する能力を示し、また色の強度は分泌効率に関係がある。
これらのスクリーニングおよび選択方法によって識別された細胞は、増加した量のタンパク質を分泌する能力を持っている。この能力は、増加した分泌および増加した発現、あるいは増加した分泌のみに起因する場合がある。
【０３３３】
４．１２．８ 抵抗を得るための植物細胞の進化
再帰的配列組換えのさらなる適用は、病原性疾病（菌類、ウイルスおよびバクテリア）に対する抵抗力を得るために、植物細胞、そして同じものから由来する遺伝子組換え植物、昆虫、例えばアトラジンやグリホサート、あるいは化学成分を修正、産出する、または同種のものを含む化学薬品（塩、セレン、汚染物質、殺虫剤、除草剤あるいはその他同種のもののような）の進化である。組換えのための基質は再び、全ゲノムのライブラリ、その断片、あるいは既知の遺伝子の変形を含んでいるか上記の作用因の対抗力の１つを与えると測定される集中ライブラリである場合がある。ライブラリ断片は頻繁に、異なる種から進化した植物で取得される。
ＤＮＡ断片は、エレクトロポーレーション、カリフラワーモザイクウィルスのようなウイルスのベクターによる感染 （ＣａＭＶ） （Ｈｏｈｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｔｕｍｏｒｓ， （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８２年） ｐｐ． ５４９−５６０；Ｈｏｗｅｌｌ， ＵＳ４，４０７，９５６）、小さな溶球あるいは粒子のどちらかの母体内、あるいは表面に核酸のある小さな粒子による高速弾道の浸透 （Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２７， ７０−７３ （１９８７年））、ベクターとしての花粉使用（ＷＯ８５／０１８５６）、あるいは根頭がんしゅ病菌あるいはＤＮＡ断片のクローンが作られるＴＤＮＡプラスミドを運ぶ毛根病菌の使用を含む標準の方法によって植物組織、培養された植物細胞、植物小胞子、あるいは植物プロトプラストへ導入される （Ｆｒｏｍら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２， ５８２４ （１９８５年）。Ｔ−ＤＮＡプラスミドは根頭がんしゅ病菌によって感染した植物細胞に遺伝され、一部分は植物ゲノムへ安定して融和させられる （Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３， ４９６−４９８ （１９８４年）； Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０， ４８０３ （１９８３年））。
菌によるプロトプラストのために下記に述べられる同じ法則に従って、植物プロトプラスト間の遺伝交換によって多様性が生じる場合もある。植物プロトプラストの構成および融合の手続きは、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、ＵＳ ４，６７７，０６６； Ａｋａｇｉら、ＵＳ ５，３６０，７２５； Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら、Ｕｓ ５，２５０，４３３； Ｃｈｅｎｅｙら、ＵＳ ５，４２６，０４０ によって記述されている。
【０３３４】
４．１２．９ 植物ゲノムの確率的／非確率的突然変異誘発
植物ゲノムの確率的／非確率的突然変異誘発により、望ましい植物類へ改善された特性を与える遺伝子あるいは経路の導入および組換えのための再帰的なサイクルの使用が可能となる。除草剤に対する抵抗力、塩分許容限界量、害虫に対する抵抗力あるいは温度差への耐性のような望ましい特性を示す、雑草および野生の栽培品種を含む植物類は、作物あるいは園芸のホスト植物類へ導入される ＤＮＡ の供給源として使用することができる。
供給源植物から準備されたゲノムのＤＮＡは、断片になり（例えば、ＤＮａｓｅｌ、制限酵素によって、あるいは機械的に）、ｐＧＡ４８２のような植物ゲノムのライブラリにするのにふさわしいベクターにクローンを作られる （Ａｎ． Ｇ．， １９９５ 年， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．４４：４７−５８）。このベクターには、大腸菌、アグロバクテリウムおよび植物細胞における選択に植物細胞および抗生物質マーカーを転移させる遺伝子に必要な根頭がんしゅ病菌の左右境界が含まれる。多重クローニングサイトはゲノム、断片の挿入に供給される。Ｃｏｓ配列は、大腸菌への主要なライブラリのトランスフェクションのためのバクテリオファージラムダの末端へ ＤＮＡ の効率的なパッケージングのために存在する。ベクターは、２５−４０ ｋｂ の ＤＮＡ 断片を受理する。
主要なライブラリもまた、直接ホスト植物細胞を感染あるいは変形させるために使用される根頭がんしゅ病菌あるいは毛根病菌株へエレクトロポーレーションすることができる （Ｍａｉｎ， ＧＤら、１９９５年， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４４：４０５−４１２）。二者択一的に、受容植物種のプロトプラストへエレクトロポーレーションあるいは ＰＥＧ を媒介として取込む （Ｂｉｌａｎｇら、（１９９４年） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ Ｍａｎｕａｌ， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｌ：１−１６）、あるいは細胞あるいは組織の粒子衝撃（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ， 前掲ページ、Ａ２：１−１５）によって、ＤＮＡを導入することができる。必要な場合で、特性のための選択が可能な限りは、Ｔ−ＤＮＡ 部分の抗生物質マーカーを除去することができる。その結果、最終的な植物性生物には抗生物質遺伝子が全く含まれない。
【０３３５】
特性を取得する安定した変形細胞全体は、導入された ＤＮＡ が抵抗力や耐性を与える作用因を含む固体あるいは液体の媒体で選択される。問題の特性を直接選択することができない場合、変形細胞は抗生物質で選択しカルスを形成することが可能になるか、あるいは全体の植物に再生成することができ、次に、望ましい性質のためにスクリーニングされる。
第２のさらなるサイクルは、個々の遺伝子組換えのラインからゲノムの ＤＮＡを分離し、他の形質転換微紛の１つ以上へそれを導入することによって成立する。各ラウンドでは、変形細胞が増殖の改善に選択あるいはスクリーニングされる。変形の多数のサイクルを使用する過程を促進するために、植物再生を最後のラウンドまで延期することができる。プロトプラストから生成されたカルス組織あるいは変形組織を、ゲノムのＤＮＡおよび新しいホスト細胞の供給源として使用することができる。最終ラウンドの後に、繁殖力のある植物は再生成され、そしてその子孫が挿入されたＤＮＡの同型接合に選択される。最終的に、高いレベルの望ましい特性を与えるために付加的にあるいは共同的に結合する多重挿入を運ぶ新しい植物が生成される。二者択一的に、小胞子を自発的なディプロイドから生成された同型接合体として分離させることができる。
さらに、その側面がベクターで既知の配列によって守られるため、望ましい特性を与える導入されたＤＮＡが追跡される。ＰＣＲあるいはプラスミド救援のいずれかが、配列を分離し、またそれらをより詳細に特徴づけるために使用される。完全 ２５−４０ｋｂ 挿入の長い ＰＣＲ （Ｆｏｏｒｄ， ＯＳ ａｎｄ Ｒｏｓｅ， ＥＡ， １９９５年， ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ， ＣＳＢＬ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ ６３−７７） が、プライマー Ｔ−ＤＮＡ境界配列として適切な試薬および技術で達成される。ベクターが複製の大腸菌供給源およびＴ−ＤＮＡ境界間の抗生物質マーカーを含むように修正される場合、ＮｏｔＩまたはＳｆｉＩのような挿入されたＤＮＡの末端のみを切断する、まれな切断制限酵素が、それらがプラスミドとして複製される大腸菌にその後自己結紮、変形される供給源植物ＤＮＡを含んでいる断片を生成するために使用される。変形された特性の原因であるその合計 ＤＮＡ あるいはサブ断片は、ＤＮＡ の確率的／非確率的突然変異誘発による生体外の進化の対象となることがある。確率的／非確率的に突然変異が起ったライブラリは、この点で任意の方法で繰り返し再結合し、次に、ホスト植物細胞へ導入され、特性改善のためにスクリーニングされる。このように、単一および多重遺伝子の特性はある種から別の種まで変化し、全体の有機体改善に結びつくより高い発現あるいは活動のために最適化することができる。この全プロセスは反復して繰り返されることができる。二者択一的に、細胞は、下記に注意のあるような改善された特性のために直接スクリーニングされている、再生成された染色体が半数の植物で変形された小胞子である場合がある。
【０３３６】
４．１３ 形質転換動物の進化
４．１３．１ 形質転換の最適化
形質転換の目標の１つは、ミルク内の再結合タンパク質を分泌して、ハツカネズミ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウシのような形質転換動物を生成することである。この目的のための形質転換は典型的に操作可能な連鎖に、ミルクタンパク質遺伝子（例えばアルファ、ベータ、あるいはガンマカゼイン、ベータラクトグロブリン、酸性乳漿タンパク質あるいはアルファラクトアルブミン）、シグナル配列、配列をコード化する再結合タンパク質および転写終了サイトからのプロモーターおよびエンハンサを含んでいる。
随意で、形質転換は、免疫グロブリンのような複合連鎖タンパク質の多数連鎖をコード化することができ、その場合には、２つの連鎖が、操作が可能な調整配列のセットに通常個々にリンクされる。再帰的配列組換えによって、形質転換を発現および分泌のために最適化することができる。組換えのための適切な基質には、異なる種や個々の動物からのミルクタンパク質遺伝子からのプロモーターおよびエンハンサのような調整配列が含まれる。組換えのサイクルは、議論されたフォーマットのいずれかで生体外あるいは生体内で実行されることができる。スクリーニングは、ＨＣ１１あるいはＭａｃＴのような、形質転換で感染し、上記に議論されたようなリポーター構造物細胞から誘導された乳腺の培養で生体内で実行される。組換えおよびスクリーニングのいくつかのサイクルの後、発現および分泌の最も高いレベルに帰着する形質転換は、乳腺組織培養細胞から抽出され、形質転換動物で成熟する接合体や胚性幹細胞のような、胚細胞の感染に使用される。
【０３３７】
４．１３．５ 植物
植物の植物Ａ個体数、例えば商用種子／生殖質収集における異なるトウモロコシの菌株のすべてが育てられ、また全個体数からの花粉が収穫され共同で利用される。この混合花粉の個体数はその後、同じ個体数を「自己」増殖するのに使用される。自己受粉は防がれ、その結果受精は結合である。個体数内で可能なすべてのペアが結果として交配し、生じる種子は、これらのペアの交雑の各々の可能な結果となる。受精植物からの種子はその後収穫、共同で利用され、植えらる。また、その花粉は再び収穫、共同で利用され、個体数の「自己」受精に使用される。たった数世代の後で、生じる個体数はトウモロコシの非常に種々の組合せのライブラリとなる。このライブラリからの種子は、望ましい特性（例えば塩分許容限界量、成長率、生産力、産出、疾病に対する抵抗力など）のために収穫、スクリーニングされる。本質的に、このアプローチによってどんな植物収集も修正することができる。重要な商用作物には、単子葉植物および双子葉植物の両方が含まれる。単子葉植物には、イネ科、アワガエリ属、カモガヤ属、ソルガム、エノコログサ属、トウモロコシ属（例えばトウモロコシ）、コメ科（例えば米）、コムギ属（例えば小麦）、ライムギ属（例えばライ麦）、カラスムギ属（例えばオートミール）、オオムギ属（例えば大麦）、サトウキビ属、イチゴツナギ類、ウシノケグサ属、イヌシバ属、シノドン属、ハトムギ、Ｏｌｙｒｅａｅ、Ｐｈａｒｅａｅ、他多数の属の植物を含む数百種類の属を共に含む、ＦｅｔｕｃｏｉｄｅａｅやＰｏａｃｏｉｄｅａｅ亜科の植物のような、イネ科植物が含まれる。イネ科の植物は、発案の方法に対して特に好ましい目標の植物である。
追加の好ましい目標には、他の商業的に重要な作物、例えば、キク科 （ヒマワリのような重要な商用作物を含む少なくとも１，０００種類を含む維管束植物の科）、エンドウ、豆、ヒラマメ、ピーナッツ、ヤムイモ豆、大角豆、ハッショウマメ、ダイズ豆、クローバ、アルファルファ、ルピナス、カラスノエンドウ、ハス、シナガワハギ、フジおよびスイートピーのような多くの商業上価値のある作物を含む、数百種類の属を含むＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ、いわゆる「マメ科」、が含まれる。発案の方法に適用が可能で共通する作物には、Ｚｅａ ｍａｙｓ、米、ダイズ豆、モロコシ、小麦、オートミール、大麦、雑穀、ヒマワリおよびキャノーラが含まれる。
【０３３８】
このプロセスはまた、異なる種あるいはより互いに異なる菌株 （例えば、トウモロコシと古代の草を交雑させる）の花粉を使用して行うこともできる。異なる植物類を無理に交雑させることができる。プロセスを実行可能にするために初期の交雑から少数の植物が得られる。これらの少数の種族、例えば、ダイズ豆とトウモロコシ間の交雑からの種族は、花粉および卵を生成し、その各々は２つのゲノムの組換えとは異なる減数分裂の結果を表わす。花粉は収穫され、オリジナルの種族に「自己」授粉するために使用される。このプロセスはその後、再帰的に行なわれる。これは、続いてスクリーニングされる２つ以上の種の大きな科の確率的／非確率的突然変異原が起きたライブラリを生成する。
４．１３．６ 魚類
体の外部にその卵を産み、オスの精液でそれらの卵を覆う魚の自然な傾向により、分離して共同で利用された繁殖戦略のための別の機会が提供される。様々な魚からの卵、例えば、世界中の異なる漁場からのサケは、同様に収集され共同で利用されたサケの精液で収穫、共同で利用し、次に、受精させることができる。出発個体数の可能なペアの組合せのすべての結果、受精となる。その後、生じる子孫は育てられ、再び、精液と卵が収穫され、異なる交配の異なる減数分裂の結果を表わすそれぞれの卵と精液で共同で利用される。共同で利用された精液はその後、共同で利用された卵を受精するために使用され、そのプロセスが再帰的に実行される。数世代の後に生じる子孫はその後、サイズ、疾病による抵抗力などのような望ましい特性のための選択およびスクリーニングの対象となる。
【０３３９】
４．１３．７ 動物
体外受精および代理母の到来、動物により、哺乳動物のような動物における全ゲノム確率的／非確率的突然変異誘発の手段が提供される。魚と同様に、例えばすべての屠殺用牛から、個体数の卵と精液が収集され、共同で利用された。共同で利用された卵をその後、生体外で共同で利用された精液で受精させた。その結果できる胎児はその後、発育のために代理母に返される。上記のように、このプロセスは、望ましい特性のためにスクリーニングできる多数種々の個体数が生成されるまで、再帰的に繰り返される。
技術的に実現可能なアプローチは、植物に使用されたものに類似している。この場合、出発個体数のオスの精液が収集、共同で利用され、そしてその後、この共同で利用されたサンプルが、各出発個体数の複数のメスに人為的に精液を注入するために使用される。１つ（あるいは少数）の精液だけが各動物に受精されるが、これらは各受精によって異なるべきである。プロセスは、オスの子孫のすべてから精液を収集し、それを共同で利用し、メスの子孫をすべて受精させるためにそれを使用することにより、繰り返される。その後スクリーニングされる有機体ライブラリを生成するために、そのプロセスは、いくつかの世代間で再帰的に行なわれる。
４．１４ 薬物を探す際の予測ツール
再帰的配列組換えは、テストで薬物への接触に応じて病原体の微生物の自然な進化を模擬実験するために使用することができる。再帰的配列組換えを使用することで、進化は、自然な進化よりも高い速度で進められる。進化の割合の基準の１つは、組換えサイクルの数、そして微生物が薬物に対する抵抗の定義レベルを得るまで必要とされるスクリーニングの数である。この分析からの情報は、異なる薬物の相対的な長所の比較、また特に、繰返し投与された場合のその長期的な効能の予測において価値がある。
【０３４０】
この分析で使用される病原性微生物には、クラミジア、リケッチア属バクテリア、ミコバクテリウム、ブドウ球菌、ｓｔｒｅｐｌｏｃｃｉ、ｐｎｅｕｍｏｎｏｃｏｃｃｉ、ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉやｃｏｎｏｃｏｃｃｉ、クレブシェラ、プロテウス、セラシア属、シュードモナス属、レジオネラ菌、ジフテリア、サルモネラ菌、病原菌、コレラ、破傷風、ボツリヌス中毒、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ症、およびライム病バクテリアのようなヒト伝染病に共通する供給源であるバクテリアが含まれる。
進化は、ＤＮＡ断片のライブラリでの試験に使用される薬物に敏感な、バクテリアの隔離集団を変形させることにより達成される。断片は、進化しているバクテリアのゲノムの突然変異させられたバージョンである場合がある。薬物の目標が既知のタンパク質か核酸である場合、対応する遺伝子の変形を含んでいる集中ライブラリを使用することができる。二者択一的に、ライブラリは、その結果組換えに利用可能な供給源材料を生体内でシミュレートして、他の種のバクテリア、特にヒトの組織に居住することが典型的に発見されているバクテリアから来る場合がある。ライブラリは、さらに薬物に耐性力のあると知られるバクテリアから来ることがある。適切な期間、組換えが生じ、組換え遺伝子が発現することを可能にするバクテリアを変形、増殖させた後、バクテリアは、試験で薬物に露出、次に、生存バクテリアを収集することにより、スクリーニングされる。生存するバクテリアは、組換えのさらなるラウンドの対象となる。次のラウンドは、生存バクテリアの部分集合からのＤＮＡがバクテリアの第２の部分集合へ導入される分離したプールアプローチによって、達成することができる。二者択一的に、ＤＮＡ断片の新しいライブラリを生存バクテリアへ導入することができる。選択の次のラウンドは、薬物の濃度を高くし、その結果選択の厳重さを増して、実行することができる。
【０３４１】
４．１４．１ 生合成
代謝工学技術は、抗生物質、ビタミン、フェニルアラニンや芳香属アミノ酸のようなアミノ酸、エタノール、ブタノール、キサンタンガムやバクテリアセルローズのようなポリマー、ペプチドおよび脂質を含む実際的な全ての代謝中間生成物の生産を最適化するために有機体を変化させるために使用することができる。そのような合成物がホストによって既に生産されている場合は、上記に述べられる再帰的配列組換え技術を、酵素基質の特異性や反転数の増加、有毒基質あるいは中間生成物の濃度を減少させる代謝流動の変化、そのような有毒合成物へのホストの抵抗力増加、遺伝子の誘導因子が発現／活動する必要の除去、縮小あるいは変更、新陳代謝に必要な酵素の生産量の増加などの特徴を含む、望ましい代謝中間生成物の生産を最適化するために使用することができる。
酵素もまた、水以外の溶剤で活動を改善させるために進化させることができる。化学合成の中間生成物が水溶剤の合成物の可溶性に劇的に影響する遮断グループによりしばしば保護されるため、これが有用となる。純粋な化学薬品と酵素で触媒作用を及ぼされた反応のコンビネーションにより、多くの合成物を生産することができる。ほとんど不溶解性の基質上で酵素の反応を実行するのは明らかに極めて非能率的である。したがって、他の溶剤において活動性のある酵素の有効性が、非常に役に立つことになる。そのような計画の例の１つが、保護グループをロカルバセフェム合成の中間生成物から取り除く ｐａｒａ− ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ エステラーゼの進化である（Ｍｏｏｒｅ， Ｊ．Ｃ． ａｎｄ Ａｒｎｏｌｄ， Ｆ．Ｈ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：４５８−４６７ （１９９６年））。この場合、基質アナログから蛍光性リポーターの生産のための、エラーの起こりやすいＰＣＲおよび群体スクリーニングの交代ラウンドが、３０％のジメチルホルムアミドで親分子より１６倍活動的な変異体エステラーゼを生成するために使用された。個々の突然変異に、活動において２倍の増加を越えるものはなかったが、多数の突然変異の組合せが、全面的な増加に結びついた。
【０３４２】
変異体タンパク質の構造分析により、合理的に予測することができなかった方法でタンパク質の全長中にアミノ酸の変更が分配されたことが示された。エラーの起こりやすいＰＣＲ の一連のラウンドには問題があり、各ラウンドの後１つ以外の全ての突然変異体以外が廃棄され、他のすべての有益な変異体に含まれていた情報が損失した。再帰的配列組換えによってこの問題が回避され、塩分濃度あるいはｐＨがオリジナルの最適酵素とは異なっていた状態と同様に、他の溶剤での触媒作用のための酵素を進化させることに、このように理想的に適合する。
さらに、ホスト有機体に対して完全に細胞膜内で成長する遺伝子あるいはすべてまたは部分的に異質組織の遺伝子から成る場合も、ほとんどの代謝経路の生産量を増加させることができる。経路の酵素の発現レベルの最適化は、単に発現を最大限にするよりも複雑である。ある場合には、酵素の構成する発現よりも調節が、フェニルアラニン（Ｂａｃｋｍａｎら、Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５８９：１６−２４ （１９９０年））および２−ケトン−Ｌ−グルコン酸（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｕ．Ｓ．５，０３２，５１４）の生産に見られるように、細胞の成長や従って生産量にとって有利となる場合がある。さらに、そのオリジナルのホスト以外の有機体におけるタンパク質を発現する産業目的に対してそれが多くの場合に有利である。新しいホスト菌株は、クローニングや変形の容易さ、病原性、特別な環境で生存する能力、そして有機体の生理機能や遺伝的性質に関する知識を含む、様々な理由のために望ましい場合がある。しかしながら、異質組織の有機体で発現されたタンパク質はしばしば、新しいホストで適切に折り重なる能力の欠如を含む様々な理由のために、著しく低減された活動性を示す （Ｓａｒｔｈｙら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏ． ５３：１９９６−２０００ （１９８７年））。新発案の再帰的配列組換え戦略によって、そのような障害が確実に克服される。
【０３４３】
４．１４．２ 抗生物質
天然の小分子抗生物質の範囲には、ペプチド、ｐｅｐｔｉｄｏｌａｃｔｏｎｅｓ、ｔｈｉｏｐｅｐｔｉｄｅｓ、ベータラクタム、糖タンパク質、ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、ｍｉｃｒｏｃｉｎｓ、ポリケチド 誘導抗生物質（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｓ、テトラサイクリン、マクロライド、アバメクチン、ポリエーテルおよびアンサマイシン）、クロラムフェニコール、ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ、ａｍｉｎｏｃｙｃｌｉｔｏｌｓ、ｐｏｌｙｏｘｉｎｓ、ａｇｒｏｃｉｎｓおよびイソプレノイドが含まれるが、この限りではない。新薬の合成を促進する、あるいは既存の抗生物質の生合成を改善するために、少なくとも３つの方法に、新発案の再帰的配列組換え技術を使用することができる。
最初に、抗生物質合成酵素は、機能変化人工側鎖先駆者摂取および結合を改善するために、抗生物質先駆物質として使用される合成物のエントリー許可する運輸システムと共に「進化」させることができる。例えば、ペニシリン Ｖ は、ペニシリウムに人工側鎖先駆物質フェノキシ酢酸を与えることで、またストレプトマイシーズｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓカプリン酸を与えることで ＬＹ１４６０３２ が生産される （Ｈｏｐｗｏｏｄ， Ｐｈｉｌ． Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄ． Ｂ ３２４：５４９−５６２ （１９８９年））。合成酵素による、不十分な先駆物質の摂取や結合は、しばしば望ましい生成物の非能率的な構成に結びつく。これらの２つのシステムの再帰的配列組換えにより、望ましい生成物の生産量を増加させることができる。
さらに、組合せのアプローチが、新しい触媒作用活動／基質認識のために確率的／非確率的突然変異原が起った酵素に取り入れることができる （おそらく活性部位のような主要な位置に無作為化するオリゴヌクレオチドを含んでいる）。多数の異なる基質 （例えば、抗生物質に通常結合される側鎖のアナログ） はその後、すべての異なる酵素と組合せてテストし、生物学上の活性度をテストすることができる。この組み込みでは、プレートが、異なる潜在的な抗生物質先駆物質（側鎖アナログのような）を含んで作られる。確率的／非確率的突然変異が起ったライブラリを含む微生物（菌株ライブラリ）は、反応能のある、抗生物質に対して敏感な微生物（菌株指示薬）と共に、そのプレート上に複製される。有効な抗生物質を生産するために新しい側鎖を組込むことができるライブラリ細胞は、このように菌株指示薬と反応能があり、そのために選択される。
【０３４４】
次に、有機体を合成する１つの抗生物質から別の抗生物質へ転移された形質転換遺伝子の発現を最適化することができる。新しく導入された酵素は、それらを新しい特性で新しい合成物に変形して、ホスト細胞内の第２代謝物質に作用する。従来の方法を使用して、ホストを合成する抗生物質への異質の遺伝子を導入することにより、すでに新しい混成抗生物質が生産されている。例には、ｍｅｄｅｒｒｈｏｄｉｎ、ｄｉｈｙｄｒｏｇｒａｎａｔｉｒｈｏｄｉｎ、６−ｄｅｏｘｙｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎＡ、ｉｓｏｖａｌｅｒｙｌｓｐｉｒａｍｙｃｉｎおよび他の混成マクロライドが含まれる（Ｃａｍｅｒｏｎら、 Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３８：１０５−１４０ （１９９３年））。新発案の再帰的配列組換え技術は、異質遺伝子の発現を最適化し、新しいホスト細胞中の酵素を安定させて、新しいホスト細胞のその新しい基質に対して導入された酵素の活性度を増加させるために使用することができる。発案のいくつかの実施例では、ホストゲノムもそのように最適化される場合がある。
第三に、第２の新陳代謝に含まれる酵素の基質の特異性が変更され、その結果、新しい合成物に作用、修正し、あるいはその活性度が変更され、またその正常な基質の位置の異なる部分集合で作用する。再帰的配列組換えは酵素の基質特異性を変更するために使用することができる。更に、新しい抗生物質を生成する戦略である個々の酵素の再帰的配列組換えに加えて、酵素比率を変更することによって、全経路の再帰的配列組換えが代謝物質流動を変更し、抗生物質合成を増加させるだけでなく、異なる抗生物質を合成する場合がある。これは異質ホスト内の同じクラスタからの異なる遺伝子の発現が、形成されている異なる生成物に結びつくという観察から推定することができる （ｐ． ８０， Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ６４６：７８−９３ （１９９１年） 参照）。
導入された遺伝子クラスタの再帰的配列組換えは、クラスタ内の異なるタンパク質の様々な発現レベルに帰着する場合がある（この場合、調整、突然変異の異なる組合せを生産するため）。これにより、様々な異なる最終生成物に結びつく場合もある。したがって、割合の修正あるいはその経路の酵素の基質特異性のどちらかにより、新しい抗生物質を生成するために、経路を合成する既存の抗生物質の「進化」を使用することができる可能性がある。
【０３４５】
さらに、先駆物質の浄化された酵素の活動により、抗生物質を生体外で生産することができる。例えば、ｉｓｏｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｎ ｓｙｎｔｈａｓｅは、その正常な基質 （ｄ−（Ｌ−ａ−ａｍｉｎｏａｄｉｐｙｌ）−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ−Ｄ−ｖａｌｉｎｅ）の多くのアナログの環化に触媒作用を及ぼす（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ， Ｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｒｅｖ． ８：５５７−５６７（１９８８年））。これらの生成物の多くは抗生物質のように活発である。反応の初期効率に対する懸念のない酵素を合成する第２の代謝物質により、種々様々な基質アナログの結合に関してテストすることができる。再帰的配列組換えを、結果を約束する新しい基質の反応割合を増加させるために、続いて使用することができる。
したがって、望ましい抗生物質を既に生産する有機体を、その抗生物質の生産を最大限にするために上述の再帰的配列組換え技術で進化させることができる。さらに、上述の再帰的配列組換え技術によるホストからの遺伝物質を操作することによって、新しい抗生物質を進化させることができる。抗生物質生成物のための遺伝子は、再帰的配列組換えのサイクルの後に好ましいホストへ転移することができるか、あるいは上述のような好ましいホスト内で進化させることができる。
抗生物質遺伝子は一般にクラスタに分けられ、新発案の再帰的配列組換え技術に対して特に魅力的な候補として、しばしば積極的に調整される。さらに、関連する経路のいくつかの遺伝子は、発案の再帰的配列組換え技術により、新しい抗生物質のための新しい経路の生成に対する好ましい候補として、異種間交雑を示す。
更に、再帰的配列組換えにより、適切な遺伝子クラスタの発現を管理する調整メカニズムを徹底的に分析することなしに、基質流動（酵素を制限する割合の割合増加、否定コントロール要素の抑制あるいは活性剤の発現、または調整された酵素の変化によるフィードバックに反応しない調整を解除したタンパク質への経路の調整緩和による）の増強を含む第２の代謝物質生産量の増加を達成することができる。
【０３４６】
４．１４．３ 抗生物質の化学的組成を置き換えるための生合成
抗生物質のいくつかは、現在、生物学的に生成された出発化合物の化学変化によって作られる。望まれる分子の完全な生合成は、必要な酵素活動を行う酵素および基質特異性がないため、現時点では実際的ではないかもしれない。たとえば、７−アミノデスアセトキシセファロスポラン酸（７−ＡＤＣＡ）は、半人工的に生成されたセファロスポリンに対する先駆物質である。７−ＡＤＣＡ は、ペニシリン Ｖからの化学環拡張の後にフェノキシアセタルグループの酵素による脱アシル化によって作られる。セファロスポリンは原則的に、ペニシリン Ｎ ｅｘｐａｎｄａｓｅを使うことで、対応するペニシリン（例えば、ペニシリン Ｖ あるいは ＧからはセファロスポリンＶあるいはＧ）から生物学的に生成されることができるが、他のペニシリン（ペニシリン Ｖ あるいは Ｇ のような）は既知の ｅｘｐａｎｄａｓｅ によって基質として使われることはない。発明の再帰的配列組換え技術は、酵素が基質としてペニシリンＶを使用するよう酵素を変えるために使用され得る。同様に、ペニシリンのアシル化転移は、セファロスポリンあるいはセファミシンを基質として受け入れるよう修正されうる。
しかし、他の例では、大腸菌において発現されたペニシリンアミターゼは、ペニシリンＧ派生物質の生成における主要酵素である。酵素は先駆物質のペプチドから生成され、新陳代謝されない糖分が媒体に存在しない限り、ペリプラズム中の不溶性の集塊のように蓄積する傾向がある （Ｓｃｈｅｒｒｅｒら、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４２：８５−９１（１９９４））。本発明の手法を通じた酵素の進化は、よりうまく折り重なる酵素を生成するために使用することができ、より高レベルの活性酵素発現へとつながる。
【０３４７】
４．１４．４ ポリケチド
ポリケチドには、テトラサイクリンおよびエリトロマイシンのような抗生物質、ダウノマイシンのような抗癌薬品、ＦＫ５０６およびラパマイシンのような免疫抑制剤、モネシンおよびアバメクチンのような家畜製品が含まれる。ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）は、網の長さ、網構築体の選択および、自然発生のポリケチドにおける膨大な変度を生み出す還元サイクルを制御する複合機能性のある酵素である。ポリケチドは、「増量剤」（脂肪性アシル ＣｏＡ グループ） の、適切な起動剤（例：アセタイト、クマレイト、プロピオン塩酸およびマロナマイドなど）への連続的転移によって構築される。ＰＫＳは、縮合反応の数および、添加される増量剤グループの種類を決定し、また、ポリケチド基質を折り重ね、環化することもある。ＰＫＳによって特定のケトグループが減少し、二重結合を形成するために結果として生じたβ水酸基を乾燥することもある。使用されている構築ブロックの性質あるいは数の変化、βケトグループの減少が起こる位置、減少の程度および起こりうる環化の位置の違いにより、最終的な生成物の形成が異なってくる。現在のポリケチド研究は、新しいポリケチド製品につながる酵素の合理的変化の基本原理を構築するため、変化および抑圧遺伝子の研究、サイト主導での突然変異誘発、および立体構造解明に集中している。
近年、ＭｃＤａｎｉｅｌら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１５４６−１５５０ （１９９５年）） は、組換え ＰＫＳ の効果的な構築および発現のためのストレプトマイセスホストベクター系を開発した。Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ （Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ １２：３７５−３０８ （１９９４年））は特定の生合成遺伝子の対象となる突然変異を再検査し、微生物隔離は、新しい代謝産物あるいはすでに生成された代謝産物量の増加を提供するように、既知の薬理学的活性成分に関連する遺伝子がＤＮＡ生成によってスクリーニングされうると提言した。特に、その再検査では、ポリケチドシンターゼおよびアミノグリコシドおよびオリゴペプチド抗生物質への経路に焦点が当てられた。
本発明の再帰的配列組換え技術は、そのような詳細な分析努力なしに、新しいポリケチドを生成する変性酵素を作り出すために使用され得る。プラスミド上にあるＰＫＳ遺伝子と、大腸菌ストレプトマイセスシャトルベクター（Ｗｅｈｍｅｉｅｒ Ｇｅｎｅ １６５：１４９−１５０ （１９９５年））の存在の利用可能性は、上記の技術によって、再帰的配列組換えのプロセスを特に興味深いものにする。抗生物質を生産する有機体の選定技術は上記に記載されるように使用されることができ、加えて、具体化においては、望まれる特定のポリケチド活動あるいは化合物のためのスクリーニングが望ましい。
【０３４８】
４．１４．５ イソプレノイド
イソプレノイドは、セスキテルペンシンターゼによるファルネシルピロ燐酸塩の環化の結果として生じた。イソプレノイドの多様性は、基幹によってではなく、環化の制御によって作られる。イソプレノイド合成遺伝子のクローン例には、フザリウム属スポロトリコ構造からのトリコディンシンターゼ、スプレプトミセス属からのペンタレンシンターゼ、ペニシリンロクフォーティからのアリストロケンシンターゼ、およびＮ．タバクムからのアリストロケンエピ異性体シンターゼ（Ｃａｎｅ， Ｄ．Ｅ． （１９９５年）がある。Ｖｉｎｉｎｇ， Ｌ．Ｃ． ＆ Ｓｔｕｔｔａｒｄ，Ｃ． 編集、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ 出版の ”Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（抗生物質生成の遺伝子学および生物化学）”６３３〜６５５ページ、”Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ”（イソプレン構造の抗生物質））が含まれる。セスキテルペンシンターゼの再帰的配列組換え技術は、異種ホスト（植物や個々の微生物株のような）におけるこれら酵素の発現の促進および環化生成物を変えるための酵素の変化の両方において使用される。多数のイソプレノイドは、抗ウィルス薬、抗菌薬、抗真菌薬、除草薬、殺虫薬、増殖抑止薬と同様に活性である。したがって、抗菌性および抗真菌性イソプレノイドは、栄養素をめぐって細菌や真菌と競う生成細胞とともに、上記に記載された指標細胞タイプを使用しスクリーニングすることが望ましい。抗ウィルス性イソプレノイドは、できれば生成細胞に対するウイルス攻撃への耐性を与える能力によりスクリーニングすることが望ましい。
【０３４９】
４．１４．６ 生体に影響するペプチド派生物質
生体に影響する非リボソーム性の合成ペプチドの例には、抗生物質シクロプロパン、ペプスタチン、アクチノマイシン、グラミシジン、デプシペプチド、バンコマイシン等がある。これらのペプチド派生物質は、リボソームよりも複合酵素によって合成される。そのような非リボソーム性の合成ペプチド抗生物質の採取量を増やすことは、これまでのところ、生合成の「狭い通路（ボトルネック）」の遺伝子識別および特定酵素の発現に対して行われている （例として、Ｖｉｎｉｎｇ， Ｌ．Ｃ． ＆ Ｓｔｕｔｔａｒｄ， Ｃ 編集、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ 出版の、”Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（抗生物質生成の遺伝子学および生物化学）”１３３〜１３５ページを参照）。酵素クラスタの再帰的配列組換えは、自然および異種ホストの両方における、既存の生物活性な非リボソーム性で生成されたペプチドの採取量を改善するために使用することができる。
ポリケチド合成物のように、ペプチド合成物は、活性化された構築ブロック（この場合ではアミノ酸）の間の凝縮反応に触媒作用を及ぼすモジュールと複数機能性を持つ酵素で、これらの構築ブロックはその後変性する （Ｋｌｅｉｎｋａｕｆ， Ｈ． およびｖｏｎ Ｄｏｈｒｅｎ， Ｈ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３６：３３５−３５１ （１９９６年）を参照）。従って、ポリケチド合成物に関する限り、再帰的配列組換えも、ペプチド合成物の変性、つまり、各結合サイトによって酵素に認識されるアミノ酸の特異性を変性、および、抗生物質活動を持つ新しい化合物を生成するようにこれらアミノ酸を変化させるサイトの活動特異性あるいは基質特異性の変性に使用することができる。他のペプチド抗生物質はリボソーム性で作られ、その後、翻訳後に変性する。このタイプの抗生物質の例にはｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（スタフィロココス、ストレプトマイセス、バチルスおよびアクチノプラネスのようなグラム陽性細菌により生成）および、ｍｉｃｒｏｃｉｎｓ（腸内細菌により生成）がある。原型ペプチドの変化には、（ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓにおいては）セリンおよびトレオニンの乾燥、システインを含む脱水アミノ酸の凝縮、あるいは単純な Ｎ− および Ｃ−ターミナルブロッキング （ｍｉｃｒｏｃｉｎｓ）が含まれる。リボソーム性に作られた抗生物質では、ペプチド暗号化配列および変性酵素の両方が、再帰的配列組換えにより変性した発現レベルを有していることもある。繰り返しになるが、これは抗生物質化合物のレベルならびに変性酵素レベル （およびリボソーム性の化合ペプチド自身のシーケンス） のモジュール化による新抗生物質の両方のレベルの向上につながるものである。
敏感な（あるいは元来は敏感ではなかった）微生物種との競合を含めて、上記に記載の他の抗生物質に対するスクリーニングを行うこともできる。生成される抗生物質への耐性を持つ競合細菌の使用は、必ず、その抗生物質の非常に高度化されたレベルのものか（耐性メカニズムを打破できるように）、あるいは耐性メカニズムによって中和されることのない、当該抗生物質の新派生物質が必要となる。
【０３５０】
４．１４．７ ポリマー
生物分解性のプラスチックプロヒドロキンブチレート（ＰＨＢ）の生成および多糖類キサンタンガムを含めて、生物ポリマーを生成するための代謝工学の事例が数例報告されている。検討用としては、Ｃａｍｅｒｏｎら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ３８：１０５−１４０ （１９９３年）を参照されたい。これら経路のための遺伝子はクローン化されており、上記に記載の再帰的配列組換え技術の優れた候補となっている。大腸菌のように商業的能力の高いホストにおけるこのような進化した遺伝子の発現は、当技術の魅力的な応用である。
再帰的配列組換えのための始動物質の例には、ポリヒドロキンブチレート （ＰＨＢ）のようなポリヒドロキシアルカノエイト（ＰＨＡ）を生成する、アルカリゲネス属、寒天状の物質に包まれた細菌集団、リゾビウム属の細菌、バチルスおよびアゾバクター細菌などの細菌からの遺伝子が付加への反応におけるエネルギー逆転物質として細胞内に含まれるが、これに制限されない。アセトアセタール ＣｏＡ から ＰＨＢ への変換に触媒作用を及ぼす酵素を暗号化するアルカリゲネス ユートロファスからの遺伝子は、大腸菌および植物シロイヌナズナ（Ｐｏｉｒｉｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：５２０−５２３ （１９９２年））への両方に転移されている。これら遺伝子のうち二つ （ｐｈｂＢ および ｐｈｂＣ、それぞれ暗号化アセトアセタール−ＣｏＡ 還元酵素およびＰＨＢシンターゼ）は、アラビドプシスにおけるＰＨＥの生成を可能にする。プラスチックを生成する植物は発育を妨げられているが、その理由は恐らく新しい代謝経路と植物の本来の代謝機能との間の敵対的な相互作用のためである（例：メバロン酸経路からの基質の消耗）。植物におけるＰＨＢの生成の改良は、プラスチドのような細胞小器官への経路酵素のローカリゼーションによって試みられた。組織特異性の調整、発現タイミングおよび細胞ローカリゼーションといった他の方法が、植物におけるＰＨＢ発現の有害作用を解決するために提案された。発明の再帰的配列組換え技術は、特定のクローン化された相互作用経路と同様、そのような異種構造遺伝子を変性するため、および産業微生物系において ＰＨＢ 合成物を最適化するため、例えば成長状況における付加に対する要求条件 （窒素制限など） を排除するために使用される。
【０３５１】
４．１４．８ カロチノイド
カロチノイドは、細菌、真菌および植物による一般的なイソプレノイドの合成経路において生成される６００以上のテルぺノイドの集まりである（検討用としては、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ， Ｊ． Ｂａｃｔ． １７６：４７９５−４８０２ （１９９４年）を参照されたい）。これらの色素は、抗腫瘍薬、フリーラジカルを除去する抗オキシダント、および免疫反応促進剤として機能するとともに、光酸化ダメージから有機体を保護する。加えて、それらは培養魚および熱帯魚の着色用に商業的に使用される。カロチノイドの例には、ミクソバクトン、スフェロイデン、スフェロイデナン、ルテイン、アスタクザンチン、ヴィオラクザンチン、４−ケトルン、ｍｙｘｏｘａｎｔｈｒｏｐｈｙｌｌ、イカイネオーネ、リコピン、および、そのモノグルコサイドおよびデグルコサイド、アルファカロチン、データカロチン、ガンマカロチンおよびシグマカロチン、ベータークリプトキサンチン モノグルコサイドおよびネオグザンチンが含まれるが、これに限定されない。
新しい化合物を特定する他の方法としては、大量分光器、原子力磁気共鳴、高性能の液体色層分析等のような標準的な分析技術を使用することがある。組換え微生物はプールされ、これらのプールから抽出物あるいは媒体上清を検定することができる。そしてすべての陽性プールは再分割され、単一の陽性が識別されるまでこの処理が繰り返される（「同胞選択」）。
４．１４．９ インジゴ生合成
色素を出す薬品などの多くの染料は、大きな市場を持つ専門化学薬品である。例えば、インジゴは、現在、化学的に生成されている。しかし、９つの遺伝子が、トリプトファン／インドール経路経由でのグルコースからのインジゴ合成物を可能にするために、大腸菌において組合わされた（Ｍｕｒｄｏｃｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：３８１−３８６ （１９９３年））。インジゴ合成物を最適化するための多数の操作、９つの遺伝子のクローン化、発酵媒体の変化、およびいくつかの酵素の反応率と触媒活動を上昇させるために ２ つのオペロンにおける指示変更が行われた。
それでもやはり、細菌で生成されたインジゴは、現在、コスト上有利とは言えない。本発明の再帰的配列組換え技術は、インジゴ合成酵素の発現レベルおよび触媒活動を最適化し、インジゴ生成の増加をもたらし、それゆえプロセスの商業的能力を高め、インジゴ製造の環境的影響を減少するために使用することができる。インジゴ生成の増加に対するスクリーニングは、マイクロタイター皿における培養物の色彩分析評価によって行われる。
【０３５２】
４．１４．１０ アミノ酸
商業的にとりわけ重要なアミノ酸には、フェニルアラニン、グルタミン酸ソーダ、グリシン、ライシン、スレオミン、トリプトファンおよびメチオミンが含まれるが、これらに限定されない。Ｂａｃｋｍａｎら（Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５８９：１６−２４ （１９９０年））は、微生物の選定、生合成許容量の最適化、および発酵と回復プロセスの開発を含む、組織的で流れに沿った手法を介した大腸菌におけるフェニルアミンの促進生成を公開した。Ｓｉｍｐｓｏｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ， ２３：３８１−３８７ （１９９５年））において記述されているように、アミノ酸生成分野での現在の研究は、重要な分子詳細におけるこれら経路の規則を理解することに集中している。
本発明の再帰的配列組換え技術は、まだほとんど知られていないアミノ酸採取量を持った細菌系を入手するために、この分析に対する必要性を明らかにするものである。アミノ酸生成は、規制ホスホエノールピルビン塩酸分岐点での酵素と同様、アミノ合成物および遺伝子分泌物の再帰的配列組換えを使うことによって、セラチア枯凋科、バチルスおよびコリネバクテリアーブレビバクテリア属のような微生物から、発現のための最適化が行われる。発明の具体化における促進生成のためのスクリーニングは、技術的によく知られた希望するアミノ酸専用テストを使用して、マイクロタイターのくぼみにおいて行われるのが望ましい。アミノ酸合成物のためのスクリーニング／選定は、それ自身では対象のアミノ酸を合成できない栄養要求性のレポーター細胞を使用して行うことができる。これらのレポーターが、アミノ酸生成物の成長を刺激する化合物を生成する場合は （これは成長要因または異なるアミノ酸の可能性がある）、より多くのアミノ酸を生成するライブラリ細胞は、順番により多くの成長刺激を受けることになり、その結果より速く成長することになる。
【０３５３】
４．１４．１１ ビタミンＣ 合成物
Ｌ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）は、１９８４年では３５，０００トン以上の世界的生産量を持つ商業的に重要なビタミンである。近年グルコースを ２，５−ケトン−グルコース酸に、その物質を ２− ケトン−Ｌ−イドニン酸に、先駆物質を Ｌ−アスコルビン酸に変形させることのできる細菌が作られたが、大多数のビタミン Ｃは現在、ライヒステイン（Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ）プロセスによって化学的に製造されている （Ｂｏｕｄｒａｎｔ， Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． １２：３２２−３２９ （１９９０年））。
細菌におけるこれらの酵素ステップの有効性は現在は低いものである。本発明の再帰的配列組換え技術を使い、一つまたは複数以上のオペロンを創出し、その後結果として商業的に実行可能な微生物ビタミンＣ生合成が生じるようにかかる混種Ｌアスコルビン酸の経路の発現最適化を行って遺伝子を作ることができる。いくつかの具体化においては、強化Ｌアスコルビン酸生成のためのスクリーニングは、技術的によく知られた分析評価を使用して、マイクロタイター皿において行われるのが望ましい。
【０３５４】
４．１５ 薬剤に対する耐性テスト
４．１５．９ ホストＳＳＦ 有機体の選定
本発明のひとつの使用例は、リグノセルロースの生物資源からエタノール生成のための改善された酵母菌を作り出すことである。特に、改善されたエタノール耐性および熱安定性／耐熱性を持つ酵母菌が望ましい。同時糖化および発酵 （ＳＳＦ： Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）プロセスにおいて実績が良いと知られている親酵母菌株が特定される。これらの菌株は、エタノール耐性および／あるいは熱安定性を持つと知られている他のものと組合わされる。
出芽酵母菌は、最適化されたＳＳＦプロセスの開発を受け入れやすい。それは本質的に、この利用のための、スクロース、グルコース、ガラクトース、マルトースおよびマルトロースなどの多種の糖分を取り入れて発酵させる能力を含む、いくつかの特性を持っている。また、酵母菌は、発酵サイクルの最後で酵母菌の生物資源の回復を可能にし、第二次生物プロセスにおける再利用を可能にしながら、凝集する能力を持っている。これは、成長媒体における栄養素の使用を最適化するという点において重要な特性である。出芽酵母菌もまた研究所での操作が非常に行いやすく、非常に特性のある遺伝子、および生殖サイクルを有している。出芽酵母菌は、他の潜在的ＳＳＦ有機体が厳密に無気性であり（例：クロストリディウム属細菌ｓｐｐ．）、それにより研究所内での取扱いが困難なのと正反対に、有気性あるいは無気性の状況下で成長できる。出芽酵母菌はまた、「一般的に安全とみなされ」（”ＧＲＡＳ”）、重要な食料品の生産用に一般大衆に広く普及している用途（例；ビール、ワイン、パンなど）により、一般的によく知られている。出芽酵母菌は、通常、発酵プロセスにおいて使用され、発酵の専門家によるその取扱いにおける手軽さが、新しく改善された酵母菌株の産業導入を容易にしている。優れた ＳＳＦ 有機体として前述された出芽酵母菌株、例えば、出芽酵母菌 Ｄ５Ａ （ＡＴＣＣ２０００６２） （Ｓｏｕｔｈ ＣＲ および Ｌｙｎｄ ＬＲ． （１９９４年） Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４５／４６： ４６７−４８１； Ｒａｎａｔｕｎｇａ ＴＤら（１９９７年） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １９：１１２５１１２７）は、物質を始動させるために使用することができる。加えて、他の工業的に使用されている出芽酵母菌株、特に、大量発酵のために望ましい特性を持っていると示された出芽酵母菌 Ｙ５６７ （ＡＴＣＣ２４８５８） （Ｓｉｔｔｏｎ ＯＣら（１９７９年） Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １４（９）： ７−１０； Ｓｉｔｔｏｎ ＯＣら（１９８１年） Ａｄｖ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２： ２３１−２３７； ＭｃＭｕｒｒｏｕｇｈ Ｉら（１９７１年） Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １６： ３４６−３４９） および出芽酵母菌 ＡＣＡ １７４ （ＡＴＣＣ ６０８６８） （Ｂｅｎｉｔｅｚ Ｔら（１９８３年） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４５： １４２９−１４３６； Ｃｈｅｍ． Ｅｎｇ． Ｊ． ５０： Ｂ Ｉ ７−Ｂ２２， １９９２） のように望ましい発酵特性を示しているものは、ホスト菌株として随意に使用される。
【０３５５】
４．１５．１０ エタノール耐性菌株の選定
出芽酵母菌のうち多くの菌株が、高エタノール環境から分離されてきており、順応性の進化によってエタノールが豊富な環境の中で生存してきた。例えば、シェリーワイン熟成からの菌株（「花」菌株）は、高エタノール環境で生存できるように機能的ミトコンドリアを大きく進化させてきた。これらのワイン酵母ミトコンドリアの他菌株への移送は、受ける側の耐熱性や高エタノール濃縮への耐性も増加させることが示されている （Ｊｉｍｅｎｅｚ， Ｊ． および Ｂｅｎｉｔｅｚ， Ｔ （１９８８年） Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． １３：４６１−４６９）。ＡＴＣＣの中に沈積している数種の「花」菌株、例えば、出芽酵母菌 ＭＹ９１ （ＡＴＣＣ ２０１３０１）、ＭＹ１３８ （ＡＴＣＣ ２０１３０２）、Ｃ５ （ＡＴＣＣ ２０１２９８）、ＥＴ７ （ＡＴＣＣ ２０１２９９）、ＬＡ６ （ＡＴＣＣ ２０１３００）、ＯＳＢ２１ （ＡＴＣＣ ２０１３０３）、Ｆ２３（Ｓ．グロボサスＡＴＣＣ９０９２０）などがある。また、Ｓ．ウバルムおよびトルラスポラｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓの花菌株の数種も沈積されている。他のエタノール耐性ワイン菌株には、ワイン含有１８％ （ｖ／ｖ） エタノール、およびＮＲＣＣ ２０２０３６ （ＡＴＣＣ ４６５３４） から分離された、出芽酵母菌 ＡＣＡ １７４ （ＡＴＣＣ ６０８６８）、１５％ エタノール、および出芽酵母菌Ａ５４（ＡＴＣＣ９０９２１）、およびワイン酵母菌が含まれる。促進されたエタノール耐性をさらに示す他の出芽酵母菌エタノロゲンには、ＡＴＣＣ ２４８５８、ＡＴＣＣ ２４８５８、Ｇ ３７０６ （ＡＴＣＣ ４２５９４）、ＮＲＲＬ Ｙ−２６５ （ＡＴＣＣ ６０５９３）およびＡＴＣＣ２４８４５−ＡＴＣＣ２４８６０が含まれる。発酵酵母菌（Ｓ．スベルゲンシスＡＴＣＣ２３４５）の菌株は、高いエタノール耐性（１３％ｖ／ｖ）を持っている。糖蜜から高レベルのアルコールを生成する、ジャマイカ製のサトウキビジュースのサンプルからの出芽酵母菌Ｓａ２８（ＡＴＣＣ２６６０３）は糖耐性であり、木酢ハイドロリゼイトからエタノールを生成する。追加の菌株と同様に、ここに挙げた菌株のうちいくつかは、エタノール耐性を生み出す出発物質として使用することができる。
【０３５６】
４．１５．１１ 熱耐性菌株の選択
温度の上昇でエタノールを生成する、高度に凝集した発酵酵母菌 ＳＡ ２３ （Ｓ．スベルゲンシスＡＴＣＣ２６６０２）菌株、および、短時間の熱と酸化負荷への耐性を持つ酒酵母菌である出芽酵母菌Ｋｙｏｋａｉ７（Ｓ．ｓａｋｅ，ＡＴＣＣ２６４２２）を含む、いくつかの熱耐性菌株が報告されている。Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓら（（１９９１） Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８／２９：３０７−３１５）は、３２−４５℃の温度範囲でグルコースを成長および発酵させる能力について、サッカロミケス、酵母（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）およびカンジダｓｐｐを含む、酵母菌２７菌株を試験している。これらのうち、最良の熱耐性クローンは、乳糖発酵性酵母 （Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ） ＬＧおよび馬乳酒 （Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ） ２６７１ （Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓら（１９９３年） Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３９／４０： ２０１−２１１）であった。出芽酵母菌 −ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ ＦＤＨＩ はある程度熱耐性であったが、エタノール耐性は乏しかった。この菌株のエタノール耐性を示す他の菌株との再帰的組換えは、同様にエタノール耐性を示す所産物におけるその菌株の熱耐性特性を得るために使用できる。カンジダ酸高温菌 （Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｌａａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、ＡＴＣＣ ２０３ ８ １） は、出芽酵母菌 Ｄ５Ａ （Ｋａｄａｍ， ＫＬ， Ｓｃｈｍｉｄｔ， ＳＬ （１９９７） Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４８： ７０９−７１３）よりも高い ＳＳＦ 温度でのリグノセルロース生物資源からのエタノール生成において、作用の改良を示す優れたＳＳＦ系列である。この菌株は、また、ＳＳＦ菌株の改善に遺伝子的にも貢献できる。
【０３５７】
４．１５．１３ 改善された菌株の選定
突然変異誘発および再組合せによって多くの新しい菌株のライブラリを生成した後の最初の課題は、希望する表現型における改良点を持っているこれらの菌株を分離させることである。希望する主要な特性が選択可能な表現型である場合、有機体ライブラリの特定が促進される。例えば、エタノールは、酵母菌母集団の成長率、生存力、発酵率に対して異なる影響力を持っている。細胞成長および生存力の抑制は、エタノール濃度と共に増加するが、高い発酵能力は、より高いエタノール濃度において抑制される。したがって、エタノールにおける成長細胞は、エタノール耐性菌株を分離させるための効果的な手法である。続いて、選定された菌株は、エタノールを生成するためのその発酵能力について分析されることもある。成長と媒体の状態がすべての菌株（親および子）で同じであるならば、エタノール耐性のヒエラルキーが構築される。
熱耐性およびエタノール耐性菌株の特定のための簡単な選定計画は利用可能であり、この場合、それは、潜在的に利用性のあるＳＳＦ菌株を特定するために過去に作られたものに基づいている。エタノール耐性の選定は、エタノールに母集団を接触させ、その後母集団を植え付け、成長を見ることで行われる。エタノールに接触後成長することができる集団は、より濃度の高いエタノールに再接触させられ、そのサイクルはほとんどの耐性菌株が選定されるまで繰り返される。一時的に得られた適応性を持つものから、遺伝性のエタノール耐性を持っている菌株を識別するためには、これらのサイクルは、選定を行わない場合の成長サイクル （例：エタノールなし） によって中断されることもある。
【０３５８】
その他の方法としては、混合母集団を増加したエタノール濃度にて直接的に成長させ、もっとも耐性のある菌株が豊かになる （Ａｇｕｉｌｅｒａ および Ｂｅｎｉｔｅｚ， １９８６年， Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４：３３７−４４）。例えば、この豊かな成長は、ケモスタットあるいはタービドスタットの中で起こりうる。類似の選定は、熱処理後の成長能力によって菌株が特定される耐熱性に対しても行うことができ、あるいは直接的に高温度における成長に対しても行うことができる （Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓら、１９９１ 年， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ， ２８：３０７−３１５）。これらの選定によって特定される最良の菌株は、エタノール耐性、耐熱性あるいはその他の希望する特定に対する二次スクリーニングを通じて完全に分析評価される。
ひとつの観点では、エタノール耐性を増やしてきた有機体が選定される。自然の出芽酵母菌分離の集団が突然変異誘発される。そして、この母集団は、低い初期エタノール濃度での発酵櫓状態の下で成長する。一旦、培養体が飽和に達したら、培養体はやや高いエタノール濃度を持つ新鮮な媒体に希釈される。増分的に増加されたエタノール濃度の媒体への継続的な希釈プロセスは、エタノール耐性の限界に到達するまで続けられる。最も高いエタノール耐性を持って生き残っている突然変異母集団は、その後、プールされ、それらのゲノムはここに記されたいずれかの手法によって再度組合わされる。豊かな成長は、また、温度あるいはエタノール濃度が徐々に上昇させられるケモスタットあるいはタービドスタットの中での継続的な培養により達成される。確率論的に、および／あるいは非確率論的に突然変異した母集団は、その後もう一度、豊かな成長を促す手法に、より高い始動媒体のエタノール濃度に晒される。この手法は、耐熱性細胞の豊かな成長のため、および耐熱性とエタノール耐性との組合せを持つ細胞の豊かな成長のために随意に適用される。
【０３５９】
４．１５．１４ 改善された菌株のためのスクリーニング
初期選定において生存能力を示している菌株は、確率論的に、および／あるいは非確率論的に他の菌株によって突然変異が発生する前に、希望する特性における改善についてより数量的に評価分析される。
菌株の突然変異誘発に由来する所産物、あるいはエタノール耐性および／あるいは耐熱性について事前に選定されたものは、非淘汰の寒天培地に置かれる。集団は、機械的にマイクロタイター皿に採取、培養される。培養物は、新しいマイクロタイター皿に複製され、複製は適切な負荷状態の下で培養される。個々の集合の成長あるいは新陳代謝活動は観察され、順位付けされる。生存能力の指標は、安定媒体上での成長集団のサイズ、成長培養物の密度、あるいは液体媒体に対して加えられた新陳代謝活動の指標物の色の変化から分類される。最も高い生存能力を示した菌株は、その後、混合され、確率論的に、および／あるいは非確率論的に突然変異誘発される。そしてその結果の諸産物は、より厳しい条件下で再スクリーニングされる。
４．１５．１５ セルロースを単量体糖分転換することのできる酵母菌株の開発
耐熱性とエタノール耐性を持つ酵母菌の菌株が一旦開発されれば、効率的なセルラーゼ退化の経路をホスト菌株へ含ませることによって、セルロースの単量体糖分への退化が行われる。
追加の希望特性が、ホストによるエタノールの生成の促進に役立つ。例えば、基質の糖分範囲を広くする異種構造酵素と経路を含めることもできる。菌株の「調節」は、多種の他の特性を追加したり、再組合せ処理中に失われてしまったものの望ましい内因的特性を回復することによって達成される。
【０３６０】
４．１５．１６ セルラーゼ活動の付与
多数のセルラーゼとセルラーゼ退化システムが、真菌、細菌および酵母菌から特徴として挙げられている （Ｂｅｇｕｉｎ， Ｐ および Ａｕｂｅｒｔ， Ｊ−Ｐ （１９９４） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． Ｒｅｖ． １３： ２５−５８； Ｏｈｉｍａ， Ｋ．ら（１９９７ 年） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． Ｅｎｇ． Ｒｅｖ． １４：３６５４１４を参照）。セルロースの効果的な糖化のために必要とされる酵素経路は、エンドグルカン消化酵素 （エンド−１，４−β−Ｄ−グルカン消化酵素， ＥＣ ３． ２．１．４）、ｅｘｏｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ （エキソー１，４−ベーター−Ｄ−グルカン消化酵素， ＥＣ３．２．１．９１）、およびベーターグルコシダーゼ （セロビアーゼ， ベーター−１，４−Ｄ−グルカン消化酵素ＥＣ３．２．１．２１）との相互的な活動と関連している。エタノロゲンにおけるセルラーゼ酵素の異種間生成は、エタノール生成のための有機物によって使用されることもある単量体糖分を生成しながら、セルロースの糖化を可能にさせるはずである。エタノロゲンにおける機能的なセルラーゼ経路の異種間発現にはいくつかの利点がある。例えば、ＳＳＦプロセスは、糖化のための別々の生物プロセス段階の必要性をなくすことができ、累積した媒介および生成糖分によって、セルラーゼ酵素の最終的生成物質の抑制を改善できる。
自然発生のセルラーゼ経路はエタノロゲン内に入れることができ、あるいは、高温菌を含む異なる自然供給源から派生したセルラーゼの調整活動を取り入れながら、改善された「混種」セルラーゼ経路を作って使用することもできる。
【０３６１】
４．１５．１７ ペントース糖分使用の付与
ペントース糖分使用経路を含めることは、利用可能性のある ＳＳＦ 有機体にとっては重要な様相である。エタノール生成のためのキシロース糖分使用経路の発現の成功は、サッカロミケスにおいて報告されている （例：Ｃｈｅｎ， ＺＤ および Ｈｏ， ＮＷＹ （１９９３年） Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３９／４０ １３５−１４７）。
また、サッカロミケスホストにおけるエタノール生成のための Ｌ−アラビノーズ基質使用を達成することも役に立つであろう。Ｌ−アラビノーズを使用する酵母菌の菌株には、いくつかのカンジダおよびピキア ｓｐｐ． （ＭｃＭｉｌｌａｎ ＪＤ および Ｂｏｙｎｔｏｎ ＢＬ （１９９４年） Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４５−４６： ５６９−５８４； Ｄｉｅｎ ＢＳら（１９９６年） Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５７−５８： ２３３−２４２）が含まれる。大腸菌におけるアラビノーズ発酵のために必要な遺伝子は、統計的な手段によって取り入れることもできる（例：以前にＺ．モビリスにおいて実行されたように （Ｄｅａｎｄａ Ｋ．ら （１９９６年） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． ６２： ４４６５−４４７０））。
４．１５．１８ 他の有益な活動の付与
ＳＳＦ菌株の最適化にとって重要である他のいくつかの特性は、出芽酵母菌への移送が可能であるということがわかっている。耐熱性、セルラーゼ活動およびペントース糖分使用と同様に、これらの特性は、サッカロミケス（あるいは、ホストとして使用されるサッカロミケスの特定菌株）によって通常は示されない場合があり、遺伝子的な手段で加えてもよい。
【０３６２】
４．１６ 生体内および生体外での ＤＮＡ 組換え手法
４．１６．１ アプリケーション
開示されているのは、組換えおよび減少再分類によって混種ポリヌクレオチドが生成されるように、二つ以上の相互関連するポリヌクレオチドを適切なホスト細胞の中に入れることによって無作為ポリヌクレオチドを生成する手法である。また、提供されているのは、混種ポリヌクレオチドおよび混種ポリヌクレオチドのためのスクリーニング手法によって発現されたようなポリヌクレオチド、ポリペプチドを含む、ベクターおよび発現媒体である。
４．１６．２ 実験的なアプリケーション
この発明は一般的に再組換えに関連し、さらに特定するならば、部分的な相同領域を含み、少なくとも一つのポリヌクレオチドを形成するためにポリヌクレオチドを集め、そして、有益な特性を持つポリペプチドの生成のためにポリヌクレオチドをスクリーニングするポリヌクレオチド配列の生体内再分類の手法によってポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドを準備するための手法に関連するものである。
有用なハイブリッドタンパク質及びこれらのハイブリッドタンパク質をコードする対応する生物学的分子、即ちＤＮＡ、ＲＮＡを作製するための、タンパク質内のアミノ酸の意図的及びランダムな組み合わせには、極めて多数の可能性が存在する。従って、そのような極めて多様なハイブリッドタンパク質、特に、多様性の大きいランダムタンパク質を作製し、所望の有用性に関してそれらをスクリーニングする必要が存在する。
【０３６３】
生物学的高分子（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及びポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列の両方を含む分子）の活性配列の複雑度は、情報含有量（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ）（「ＩＣ」）と呼ばれている。ＩＣとは、活性タンパク質のアミノ酸配列変動に対する抵抗性（同一機能を有する関連配列のファミリーを記載するために必要な不変アミノ酸の最小数（ビット）から計算される）と定義されている。ランダム突然変異誘発に対する感受性が比較的高いタンパク質は、高い情報含有量を有する。
分子ライブラリーのような分子生物学の発達は、極めて多数の可変塩基の同定を可能にし、さらに、ランダムライブラリーから機能的配列を選択するための方法をも提供した。そのようなライブラリーにおいて、大部分の残基が、状況における補正変化に依存して変動しうる（ただし、典型的には、全て同時ではない）。従って、１００アミノ酸のタンパク質は、異なる突然変異を２，０００個しか含有できないが、２０１００個の配列組み合わせが可能である。
情報密度（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｄｅｎｓｉｔｙ）とは、配列の単位長さ当たりのＩＣである。酵素の活性部位は、高い情報密度を有する傾向がある。対照的に、酵素内の情報のフレキシブルリンカーは、低い情報密度を有する傾向がある。
ライブラリー形式で別タンパク質を作製するために広範に使用されている現在の方法は、エラープローン（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ポリメラーゼ連鎖反応、及び最適化すべき特異的領域を合成的に突然変異誘発されたオリゴヌクレオチドと交換するカセット突然変異誘発である。いずれの場合においても、最初の配列内のいくつかの部位の周辺に、実質的な数の変異部位が生成する。
【０３６４】
４．１６．３．１． エラープローンＰＣＲ
エラープローンＰＣＲは、低レベルの点突然変異を長い配列へとランダムに導入するための忠実度の低い重合条件を使用する。未知の配列を有する断片の混合物においては、エラープローンＰＣＲが、混合物を突然変異誘発するために使用されうる。発表されているエラープローンＰＣＲプロトコルにおいては、ポリメラーゼの低い進行度（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）が問題となる。従って、そのプロトコルは、平均的なサイズの遺伝子のランダム突然変異誘発をもたらすことができない。そのため、エラープローンＰＣＲの実際の適用は制限されている。点突然変異のみでは、あまりに逐次的であるため、継続的かつ劇的な配列進化に必要な大規模なブロック変化を可能にし得ない場合が多いことが、いくつかのコンピュータシミュレーションにより示唆されている。さらに、発表されているエラープローンＰＣＲプロトコルでは、０．５から１．０ｋｂより大きいＤＮＡ断片を増幅することができず、実際の適用は制限されている。さらに、エラープローンＰＣＲのサイクルを繰り返すことにより、結合親和性ではなくタンパク質の免疫原性に影響を与えるような望ましくない結果を有する中性的な突然変異が蓄積しうる。
オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発においては、短い配列が、合成的に突然変異誘発されたオリゴヌクレオチドと交換される。この手法は、離れた突然変異の組み合わせを生成させず、従ってコンビナトリアルではない。膨大な配列長と比較すると限定されているライブラリーサイズは、タンパク質を最適化するために多くの選択ラウンドが不可欠であることを意味する。合成オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発には、各選択ラウンドの後、個々のクローンを配列決定し、続いてそれらをファミリーに分類し、単一のファミリーを任意に選択し、コンセンサスモチーフへと縮小することが必要である。そのようなモチーフが、再合成され、単一遺伝子へと再挿入され、続いてさらなる選択を行われる。この段階は、統計的な障害物を構成し、大きな労力を要し、多くの突然変異誘発ラウンドにとっては実用的でない。
【０３６５】
従って、エラープローンＰＣＲ及びオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発は、配列微調整の単一サイクルにとっては有用であるが、複数のサイクルに適用する場合には急速に限定されたものとなる。
エラープローンＰＣＲのもう一つの限界は、ダウンミューテーション（ｄｏｗｎ−ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）の速度が、配列の情報含有量と共に増大するという点である。情報含有量、ライブラリーサイズ、及び突然変異誘発速度が増大するにつれ、ダウンミューテーションとアップミューテーション（ｕｐ−ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）との均衡が、さらなる改良の選択を統計的に妨害するであろう（統計的上限）。
カセット突然変異誘発においては、単一鋳型の配列ブロックが典型的には（部分的に）ランダム化された配列と交換される。従って、入手されうる最大情報含有量が、ランダム配列の数（即ち、ライブラリーサイズ）によって統計的に制限される。これは、現在は最良でないが、長期的には大きな潜在能力を有するかもしれない、その他の配列ファミリーを除去する。
また、合成オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発は、各選択ラウンド後の個々のクローンの配列決定を必要とする。従って、そのような手法は、面倒であり、多くの突然変異誘発ラウンドにとっては実用的でない。
従って、エラープローンＰＣＲ及びカセット突然変異誘発は、比較的低い情報含有量の区間を微調整するためには最も適しており、広範に使用されている。一つの明らかな例外は、エラープローンＰＣＲ及び選択による多くの増幅ラウンドを使用した、ランダムライブラリーからのＲＮＡリガーゼリボザイムの選択である。
天然において、大部分の生物の進化は、天然の選択及び有性生殖により起こる。有性生殖は、選択された個体の子孫における遺伝子の混合及び組み合わせを確実にする。減数分裂においては、親からの相同染色体が、長さに沿って互いに整列し、一部を交差することによって、遺伝材料をランダムにスワッピングする。そのようなＤＮＡのスワッピング又はシャッフリングは、生物がより迅速に進化することを可能にする。
組み換えにおいては、挿入配列が相同な環境において有用性を有することが立証されたため、挿入配列は、新たな配列に挿入された後も、実質的な情報量を有している可能性が高い。
【０３６６】
４．１６．３．４． 応用分子進化（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）（「ＡＭＥ」）
応用分子進化（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）（「ＡＭＥ」）という用語は、進化設計アルゴリズムの、特定の有用な目標への適用を意味する。ＡＭＥのための多くの異なるライブラリー形式がポリヌクレオチド、ペプチド、及びタンパク質（ファージ、ｌａｃＩ、及びポリソーム）に関して報告されているが、これらの形式はいずれも、コンビナトリアルライブラリーを計画的に作製するためのランダム交差による組み合わせを提供していない。
理論的には、１００アミノ酸のタンパク質には２，０００個の異なる単一変異体が存在する。しかしながら、１００アミノ酸のタンパク質は２０１００個の可能な配列組み合わせを有し、この数は、従来の方法により徹底的に検索するには大きすぎる。これらの可能な組み合わせ突然変異の全てを生成させ、スクリーニングすることを可能にするであろう系を開発することは、有利であると考えられる。
４．１６．３．５ 報告されているインビボ相同組み換えシステム
当技術分野における数人の研究者は、ファージ系における発現のため、軽鎖抗体遺伝子と重鎖抗体遺伝子とを組み合わせたハイブリッドを生成させるため、インビボ部位特異的組み換え系を利用している。しかしながら、それらの系は、特定の組み換え部位に依存しており、従って限定されている。オーバーラッピング伸長及びＰＣＲによる、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）における抗体ＣＤＲ領域の同時突然変異誘発が、報告されている。
ランダムインビボ組み換えを使用して、複合ハイブリッドの大集団を生成させるための方法も記載されている。この方法は、それぞれが異なる選択可能マーカーを有する２つの異なるプラスミドライブラリーの組み換えを必要とする。その方法は、存在する選択可能マーカーの数と等しい有限の組み換え数に限定されており、選択された（一つ又は複数の）配列と連結したマーカー遺伝子の数を同時に直線的に増加させる。
【０３６７】
２つの相同であるが短縮されているプラスミド上の昆虫毒素遺伝子間のインビボ組み換えが、ハイブリッド遺伝子を作製する方法として報告されている。ハイブリッド分子形成をもたらす、欠陥ミスマッチ修復酵素を有する宿主細胞における、実質的にミスマッチのＤＮＡ配列のインビボ組み換えが、報告されている。
４．１６．４ 戦略
もう一つの局面において、本発明の方法は、分子を組み換え、かつ／又は配列の複雑度、及び相同領域を保持する反復的もしくは連続的な配列の程度を減少させる減少過程を媒介する細胞の天然の特性を利用する。
本発明の目的は、増強された活性を有する生物学的活性ハイブリッドポリペプチドをコードするハイブリッドポリヌクレオチドを生成させるための方法である。これら及びその他の目的を達成するため、本発明の一つの面に従い、ポリヌクレオチドを適当な宿主細胞へと導入し、ハイブリッドポリペプチドを産生する条件下で宿主細胞を増殖させる方法が提供された。
本発明のもう一つの局面において、本発明は、ハイブリッドポリヌクレオチドによりコードされた生物学的活性ハイブリッドポリペプチドをスクリーニングするための方法を提供する。本発明は、増強された生物学的活性を有する、生物学的活性ハイブリッドポリペプチドの同定を可能にする。
本発明のその他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかとなろう。しかしながら、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示すものであり、例示のためだけに与えられていることを理解されたい。なぜなら、本発明の本旨及び範囲の範囲内で様々な変化及び修飾が、この詳細な説明から当業者には明らかとなろう。
【０３６８】
４．１６．５ 可能な使途
本明細書に記した発明は、組換えを通じて、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質のような高度に複雑な線状配列の方向付けられた分子進化を可能にするような、縮小的再組合せ（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）、組換えおよび選択への反復サイクルの使用に関する。
分子のインビボシャッフリングは、組換え多量体に対する細胞の天然の特性を用いて行うことができる。インビボにおける組換えは、分子多様性への主要な自然経路を提供するが、遺伝的組換えは、以下の点に関連して、依然比較的複雑な方法である：１）相同性の認識；２）組換えキアズマ形成に繋がる、鎖の切断、鎖の侵入（ｉｎｖａｓｉｏｎ）、および代謝の過程；並びに最後に、３）個別の組換え分子へのキアズマの解離（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）。キアズマの形成は、相同配列の認識を必要とする。
４．１６．５．１ ハイブリッドポリヌクレオチドの産生
好ましい態様において、本発明は、少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドからハイブリッドポリヌクレオチドを作出する方法に関する。本発明は、適当な宿主細胞へ、部分的配列相同性の少なくとも１領域を共有する少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドを導入することによる、ハイブリッドポリヌクレオチドの作出に使用することができる。この部分的配列相同領域は、ハイブリッドポリヌクレオチドを作出する配列の再組織化を生じるような方法を促進する。本明細書において使用される用語「ハイブリッドポリヌクレオチド」とは、本発明の方法により生じかつ少なくとも２種の本来のポリヌクレオチド配列由来の配列を含むようなヌクレオチド配列のいずれかを意味する。このようなハイブリッドポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子間の配列組込みを促進する分子間組換え事象により生じ得る。加えてこのようなハイブリッドポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子内のヌクレオチド配列を変更するために反復配列を利用する、分子内縮小的再組合せ法により作成することができる。
【０３６９】
本発明は、生物学的活性のあるハイブリッドポリペプチドをコードし得るハイブリッドポリヌクレオチドを作出する手段を提供する。ある局面において、本来のポリヌクレオチドは、生物学的活性のあるポリペプチドをコードしている。本発明の方法は、得られるハイブリッドポリヌクレオチドが本来の生物学的活性のあるポリペプチドに由来した活性を示すポリペプチドをコードしているように、本来のポリヌクレオチドの配列を組込むような細胞処理を用いて、新規ハイブリッドポリペプチドを作出する。例えば本来のポリヌクレオチドは、様々な微生物由来の特定の酵素をコードすることができる。ある生物由来の第一のポリヌクレオチドによりコードされた酵素は、例えば、高塩分のような特定の環境条件下で効果的に機能することができる。異なる生物の第二のポリヌクレオチドによりコードされた酵素は、極端な高温のような様々な環境条件下で効果的に機能することができる。第一および第二の本来のポリヌクレオチド由来の配列を含むハイブリッドポリヌクレオチドは、本来のポリヌクレオチドでコードされた両方の酵素の特徴を発揮する酵素をコードすることができる。従って、ハイブリッドポリヌクレオチドによりコードされた酵素は、第一および第二のポリヌクレオチドでコードされた各々の酵素により共有された環境条件下、例えば高塩分および極端な温度で、効果的に機能することができる。
【０３７０】
４．１６．５．１．１ コードされる酵素
本発明の本来のポリヌクレオチドによりコードされた酵素は、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、異性化酵素、およびリガーゼを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の方法から得られるハイブリッドポリペプチドは、本来の酵素においてはディスプレイされない特定化された酵素活性を示すことができる。例えば加水分解酵素活性をコードしているポリヌクレオチドの組換えおよび／または縮小的再組合せの後、得られるハイブリッドポリヌクレオチドでコードされたハイブリッドポリペプチドは、各々の本来の酵素から得られた特定化された加水分解酵素活性、すなわち加水分解酵素が作用する結合の種類および加水分解酵素が機能する温度についてスクリーニングすることができる。従って、例えば加水分解酵素は、本来の加水分解酵素（ｈｙｄｒｏｌｙａｓｅｓ）からハイブリッド加水分解酵素を識別するそれらの化学的機能性について確かめるためにスクリーニングすることができ、これは下記のようなものである：（ａ）アミド（ペプチド結合）、すなわちプロテアーゼ；（ｂ）エステル結合、すなわちエステラーゼおよびリパーゼ；（ｃ）アセタール、すなわちグリコシダーゼ、並びに例えばハイブリッドポリペプチドが機能する温度、ｐＨまたは塩濃度についてである。
【０３７１】
４．１６．５．１．２ オリジナルポリヌクレオチドの起源
本来のポリヌクレオチドの供給源は、個別の生物（「単離体」）、制限培地中で増殖された生物の収集（「富化培養」）、または最も好ましくは未培養の生物から（「環境試料」）単離されうる。環境試料由来の新規生体活性をコードしているポリヌクレオチドを誘導する培養とは無関係の方法の使用が、生体多様性の利用されない給源に接近することができるので最も好ましい。
「環境ライブラリー」とは、環境試料から作成され、かつ適当な原核生物宿主において増殖することができるクローニングベクターにおいて実現される天然の生物の集合的ゲノムを表している。クローニングしたＤＮＡは最初に環境試料から直接抽出されるので、これらのライブラリーは、純粋な培養物において増殖することができる原核細胞の小さい画分に限定されない。加えてこれらの試料中に存在する環境ＤＮＡの標準化は、本来の試料中に存在する全ての種からのＤＮＡのより同等の提示を可能にする。これは、ドミナント種と比較して大きさが数桁下回って提示されることがある試料の少量の成分から関心対象の遺伝子を発見する効率を劇的に増加することができる。
例えば、１種以上の培養していない微生物から作成された遺伝子ライブラリーは、関心対象の活性についてスクリーニングされる。関心対象の生体活性分子をコードしている可能性のある経路は、最初に遺伝子発現ライブラリーの形で原核細胞において捕捉される。関心対象の活性をコードしているポリヌクレオチドは、このようなライブラリーから単離されかつ宿主細胞に導入される。この宿主細胞は、新規または増強された活性を伴う可能性のある活性を有する生体分子を作出する組換えおよび／または縮小的再組合せを促進する条件下で増殖される。
ポリヌクレオチドが調製される微生物は、真正細菌および古細菌のような原核微生物、ならびに真菌、一部の藻類および原生動物のような比較的低等な真核微生物を含む。ポリヌクレオチドは、核酸が微生物の培養をせずに回収されるかまたは１種以上の培養された生物から回収される場合のように、環境試料から単離することができる。ある局面において、このような微生物は、極端を好む菌（ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｕｌｅｓ）、例えば超高熱菌、好冷菌、低温菌（ｐｓｙｃｈｒｏｔｒｏｐｈｓ）、好高塩菌、好高圧菌、および好酸菌である。極端を好む微生物から単離された酵素をコードしているポリヌクレオチドが特に好ましい。このような酵素は、陸上の温泉および深海熱水口の１００℃以上の温度、極地水の０℃以下の温度、死海の飽和塩環境、石炭堆積層および地熱イオウ分が豊富な温泉のような０近傍のｐＨ値、または下水スラッジの１１を超えるｐＨ値で機能することができる。例えば、極端を好む生物からクローングされかつ発現されたエステラーゼおよびリパーゼのいくつかは、広範な温度およびｐＨを通じて高い活性を発揮する。
【０３７２】
４．１６．５．１．３ 好ましい宿主細胞
前述のように選択および単離されたポリヌクレオチドは、適当な宿主細胞に導入される。適当な宿主細胞は、組換えおよび／または縮小的再組合せを促進することが可能な細胞のいずれかである。選択されたポリヌクレオチドは、好ましくは既に適当な調節配列を含むベクター内にある。この宿主細胞は、例えば哺乳類細胞のような高等真核細胞、または酵母細胞のような比較的低等な真核細胞であることができ、もしくは好ましくは宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であることができる。構築体の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン媒介型トランスフェクション法、または電気穿孔法により行うことができる（Ｄａｖｉｓら、１９８６）。
適当な宿主細胞の代表例としては、大腸菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓメラノーマのような動物細胞；アデノウイルス；ならびに植物細胞を挙げることができる。適当な宿主の選択は、本明細書の内容から当業者の範囲内であると思われる。
【０３７３】
４．１６．５．１．３．１ 高等動物細胞培養システム
特に組換えタンパク質を発現するために使用することができる様々な哺乳類細胞培養システムに関する哺乳類発現システムの例は、「ＳＶ４０形質転換されたシミアン細胞は、初期ＳＶ４０変異体の複製を支持する」（Ｇｌｕｚｍａｎ， １９８１）に記された、サル腎繊維芽細胞のＣＯＳ−７系、および共存性のあるベクターの発現が可能な他の細胞系、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株である。哺乳類発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにいずれか必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位および受容部位、転写終結配列、ならびに５’隣接する非転写配列を含むであろう。ＳＶ４０スプライシングおよびポリアデニル化部位由来のＤＮＡ配列は、必要な転写されない遺伝子エレメントを提供するように使用することができる。
関心対象のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択または遺伝子増幅に適するように変更された常用の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現について選択された宿主細胞でこれまでに使用されたものであり、かつ当業者には明らかであろう。特定の酵素活性を有することが確定されたクローンは、その後増強された活性を有する酵素をコードしているポリヌクレオチド配列を確定するために、配列決定される。
【０３７４】
４．１６．５．１．４ 生化学的な経路をコードしたポリヌクレオチドの産生
別の局面において本発明の方法は、１種以上のオペロン由来の生化学的経路をコードしている新規ポリヌクレオチド、またはそれらの遺伝子クラスターもしくは一部を作成するために使用することができるように構想されている。例えば、細菌および多くの真核生物は、その産物が関連したプロセスに関与しているような遺伝子を調節するための調和された機構を有する。これらの遺伝子は、クラスター化され、構造から単独の染色体上の「遺伝子クラスター」と称されており、かつクラスター全体の転写を開始する単独のプロモーターを含む単独の調節配列の制御下で一緒に転写される。従って遺伝子クラスターとは、通常はそれらの機能に関して同じまたは関連のある隣接遺伝子の群である。遺伝子クラスターによりコードされた生化学経路の例は、ポリケチドである。ポリケチドとは、生体活性の極端に豊富な給源分子であり、抗生物質（テトラサイクリンおよびエリロマイシンなど）、抗癌剤（ダウノマイシン）、免疫抑制剤（ＦＫ５０６およびラパマイシン）、ならびに獣医学的産物（モネンシン）を含んでいる。多くのポリケチド（ポリケチドシンターゼにより形成される）は治療物質として価値がある。ポリケチドシンターゼは、長さならびに官能性および環化のパターンが異なる多種多様な炭素鎖の生合成を触媒する多機能酵素である。ポリケチドシンターゼ遺伝子は、遺伝子クラスターに分類され、およびポリケチドシンターゼの少なくとも１種（タイプＩと称される）は、大きいサイズの遺伝子および酵素を有し、このことがこれらの遺伝子／タンパク質の遺伝的操作およびインビトロ試験を複雑化する。
ポリケチドまたはそれらの断片のライブラリーから所望の成分を選択しかつ組合わせる能力、ならびに試験のための新規ポリケチド作成のためのポストポリケチド生合成遺伝子が明らかになっている。本発明の方法は、分子間組換えを通じての新規ポリケチドシンターゼ作出を促進することを可能にしている。
【０３７５】
４．１６．５．１．５ ジーンクラスターＤＮＡ
好ましくは、遺伝子クラスターＤＮＡは、様々な生物から単離することができ、かつベクターにライゲーションする、特にライゲーションした遺伝子クラスターからの検出可能なタンパク質の作出またはタンパク質関連アレイ活性を制御および調節することができる発現調節配列を含むベクターにライゲーションすることができる。内在性ＤＮＡ導入のための例外的に大きい容量を有するベクターの使用は、このような遺伝子クラスターでの使用に特に適しており、かつ大腸菌のｆ因子（稔性因子）を含むことが例として本明細書に記されている。この大腸菌のｆ因子は、接合時にそれ自身の高頻度の移行に作用するプラスミドであり、かつ混合微生物試料からの遺伝子クラスターのような、巨大なＤＮＡ断片を実現しかつ安定に増殖するのに理想的である。一旦適当なベクターにライゲーションされると、様々なポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターを含む２種以上のベクターを、適当な宿主細胞に導入することができる。これらの遺伝子クラスターと相同性を共有している部分配列の領域は、ハイブリッド遺伝子クラスターを生じる配列再構成を生じるプロセスを促進するであろう。その後この新規ハイブリッド遺伝子クラスターは、本来の遺伝子クラスターにおいては認められない増強された活性についてスクリーニングすることができる。
【０３７６】
従って、好ましい態様において本発明は、下記段階による、生物学的に活性のあるハイブリッドポリペプチドを作出し、かつこのようなポリペプチドを増強された活性についてスクリーニングする方法に関連している：
１）適当な宿主細胞へ、機能的連結された少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび機能的連結された第二のポリヌクレオチドを導入する段階であり、これらの少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドが部分配列相同性を少なくとも１領域共有しているような段階；
２）配列再構成を促進する条件下で宿主細胞を増殖し、機能的連結されたハイブリッドポリヌクレオチドを生じる段階；
３）ハイブリッドポリヌクレオチドでコードされたハイブリッドポリペプチドを発現する段階；
４）増強された生物学的活性の同定を促進する条件下でハイブリッドポリペプチドをスクリーニングする段階；および
５）ハイブリッドポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離する段階。
様々な酵素活性をスクリーニングする方法が、当業者に公知であり、かつ本明細書において論じられている。このような方法は、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを単離する際に利用することができる。
【０３７７】
４．１５．５．１．６ 発現ベクター
本明細書において使用することができる発現ベクターの代表例は、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌の人工染色体、ウイルスＤＮＡ（例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病、およびＳＶ４０誘導体）、Ｐ１に基づいた人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、および関心対象の具体的な宿主に特異的ないずれか他のベクター（バシラス、アスペルギルスおよび酵母など）を挙げることができる。従って、例えばＤＮＡは、ポリペプチドを発現するための様々な発現ベクターのいずれかひとつに含むことができる。このようなベクターは、染色体性、非染色体性および合成ＤＮＡ配列を含む。適当なベクターの多数が、当業者に公知であり、かつ市販されている。下記のベクターを例として挙げることができる；細菌性：ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド、ｐＮＨベクター、λＺＡＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）；真核性：ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）がある。しかし、いずれか他のプラスミドまたは他のベクターを、宿主において複製および生存可能な限り使用することができる。低いコピー数または高いコピー数のベクターを、本発明において使用することができる。
本発明において使用するのに好ましい種類のベクターは、ｆ因子複製起点を含む。大腸菌におけるｆ因子（または稔性因子）は、接合時にそれ自身の高頻度の移行および細菌性染色体それ自身のより少ない頻度の移行に作用するプラスミドである。特に好ましい態様において、「フォスミド」または細菌性人工染色体（ＢＡＣ）ベクターと称されるクローニングベクターを使用する。これらは、ゲノムＤＮＡの大きいセグメントの安定した組込みが可能であるような大腸菌ｆ因子に由来している。混合未培養の環境試料由来のＤＮＡを組込む場合、これは安定した「環境ＤＮＡライブラリー」の形の巨大なゲノム断片を実現することを可能にする。
本発明において使用するのに好ましい別の種類のベクターは、コスミドベクターである。コスミドベクターは、最初にゲノムＤＮＡの巨大なセグメントをクローニングしかつ増殖するように設計された。コスミドベクターへのクローニングは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら、１９８９）において詳細に説明されている。
【０３７８】
４．１６．５．１．６．１ コントロール配列の発現
発現ベクター内のＤＮＡ配列は、ＲＮＡ合成を指示するのに適当な発現制御配列（複数）（プロモーター）に機能的に連結されている。特に言及された細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐを含む。真核プロモーターは、極初期ＣＭＶ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネインーＩを含む。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者には周知である。発現ベクターは同じく、翻訳開始および転写終結のためのリボソーム結合部位を含む。このベクターも、発現を増幅するための適当な配列から選択することができる。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを伴う他のベクターを用い、いずれか所望の遺伝子から選択することができる。
４．１６．５．１．６．２ 選択可能なマーカー遺伝子
加えて、この発現ベクターは、真核細胞培養物についてのジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、または大腸菌におけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性のような、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性を提供する１種以上の選択マーカー遺伝子を含むことが好ましい。
一般に組換え発現ベクターは、複製起点、例えば大腸菌およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＲＰｌ遺伝子のアンピシリン耐性遺伝子のような宿主細胞の形質転換をもたらす選択マーカー、ならびに下流の構造配列の転写を指示する高度に発現された遺伝子由来のプロモーターを含むであろう。このようなプロモーターは、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）のような解糖酵素、因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などをコードするオペロンに由来することができる。異種構造配列は、翻訳開始および終結配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外媒質への分泌を指示することが可能であるリーダー配列の適当な相において集成される。
クローニング戦略は、ベクター起動および内在性プロモーターの両方による発現を可能にし；ベクターの促進は、内在性プロモーターが大腸菌において機能しないような遺伝子発現において重要であろう。
【０３７９】
４．１６．５．１．７ ベクターあるいはプラスミドへの挿入
微生物から単離されるかまたはそれに由来したＤＮＡは、選択されたＤＮＡについてプロービングする前に、ベクターまたはプラスミドに挿入することが好ましい。このようなベクターまたはプラスミドは、プロモーター、エンハンサーなどを含む、発現調節配列を含むものが好ましい。このようなポリヌクレオチドは、ベクターおよび／または組成物の一部であることができ、かつこのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではないように依然単離されている。特に好ましいファージまたはプラスミドおよびそれらへの導入およびパッケージングのための方法は、本明細書において言及されたプロトコールにおいて詳述されている。
クローニングベクターの選択は採用された方法によって決まり、例えばベクターは、配列の反復コピーを増すか、または宿主細胞においてうまく形質転換および選択することができる配列を倍加するのに適当な容量を伴ういずれかのクローニングベクターであることができる。このようなベクターの一例は、「Ｐｏｌｙｃｏｓベクター：λファージパッケージング抽出物を用いる繊維状ファージおよびファージミドベクターのパケージングシステム」（Ａｌｔｉｎｇ−ＭｅｃｓおよびＳｈｏｒｔ， １９９３）に記されている。増殖／維持は、クローニングベクターにより保持された抗生物質耐性によるものであることができる。増殖期以降に、天然に短縮化された分子は、ゲルまたはカラム上のサイズ分画により回収されかつ同定されるか、もしくは直接増幅される。利用されたクローニングベクターは、長い構築体の挿入により破壊される選択可能な遺伝子を含むことができる。縮小的再組合せの進行に伴い、反復ユニット数が縮小され、かつ妨害された遺伝子は再度発現され、これによりプロセッシングされた構築体の選択が行われる。このベクターは、所望の生物学的特性を有する発現された産物の選択を可能にする発現／選択ベクターであることができる。挿入は、機能的プロモーターの下流に位置し、および所望の特性を適当な手段でスクリーニングすることができる。
【０３８０】
４．１６．５．１．８ 縮小的再組合せ
インビボ再組合せは、細菌内で、一般に「ＲｅｃＡ依存」現象として見られるような、集合的に「組換え」と称される「分子間」のプロセスに焦点が当てられている。本発明は、配列を組換えおよび再組合せするための宿主細胞の組換え法、または欠失により細胞の準反復配列の複雑度を低下する縮小的方法を媒介する細胞の能力に頼ることができる。この「縮小的再組合せ」の方法は、「分子内」ＲｅｃＡ依存法により生じる。
従って、本発明の別の局面において、新規ポリヌクレオチドを、縮小的再組合せ法により作成することができる。この方法は、連続配列（本来のコード配列）を含む構築体を作成、それらの適当なベクターへの挿入、およびその後の適当な宿主細胞への導入に関する。個々の分子同定物の再組合せは、相同領域を有する構築体中の連続配列間、または準反復ユニット間において、コンビナトリアル法により行われる。再組合せ法は、反復配列の複雑度および程度を再度組合せおよび／または縮小し、かつ新規分子種の作成をもたらす。様々な処理を、再組合せ率を増すために適用することができる。これらは、紫外線処理、またはＤＮＡを損傷する化学物質、および／または「遺伝子不安定性」の増強されたレベルをディスプレイする宿主細胞系の使用を含むことができる。従ってこの再組合せ法は、相同的組換えまたはそれら自身の進化を示す準反復配列の天然の特性に関する。
【０３８１】
４．１６．５．１．９ 反復配列または準反復配列
反復配列または「準反復」配列は、遺伝的不安定性において役割を果たす。本発明において、「準反復物」とは、それらの本来のユニット構造に対して制限されない反復物である。準反復ユニットは、構築体の配列アレイ；類似の配列の連続ユニットとして示すことができる。一旦ライゲーションされたならば、連続配列間の接合は、本質的に不可視となり、かつ得られる構築体の準反復性の性質は、ここでは分子レベルで連続している。この細胞の欠失法は、準反復配列間で得られる構築体の操作の複雑度の低下をもたらす。準反復ユニットは、ずれ事象が生じ得るような鋳型の実践上の制限のないレパートリーを提供する。従って、準反復物を含む構築体は、準反復ユニット内で欠失（おそらく挿入）事象が実際に生じ得る十分な分子弾性を効果的に提供する。
準反復配列が同じ方向、例えば頭から尾またはその逆でにライゲーションされる場合には、この細胞は個々のユニットを識別することはできない。結果的に、この縮小的プロセスは、この配列全体に発生し得る。対照的に、例えばこれらのユニットが、頭から尾よりもむしろ頭から頭へ示される場合には、この逆転は、隣接ユニットの終点（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）を線引きすることができ、その結果欠失の形成は、個別のユニットの喪失に有利となる。従って、本発明の方法にとって、これらの配列が同方向であることが好ましい。準反復配列の無作為な方向は、再組合せ効率の低下を招く一方で、これらの配列の一貫した方向は高効率を提供する。しかし、同方向の連続配列が減ることは効率を低下する一方で、新規分子の効果的回収に十分な弾性が提供されもする。構築体は、より高い効率をもたらすよう同方向の準反復配列で作成することができる。
【０３８２】
４．１６．５．１．１０ 頭から尾の方向に構築される配列
配列は、下記を含む様々な方法のいずれかを用いて、頭から尾へ構築することができる：
ａ）一本鎖で作成された場合に方向を提供するような、ポリＡ頭およびポリＴ尾を含むプライマーを利用することができる。これは、ＲＮＡから作成されたプライマーの第一の２、３の塩基を有することによって実現され、その結果容易にＲＮＡｓｅＨが除去される。
ｂ）独自の制限酵素部位を含むプライマーを利用することができる。複数の部位、一連の独自の配列、ならびに反復合成およびライゲーション段階が必要であろう。
ｃ）プライマーの内側の２、３の塩基はチオール化され、かつエキソヌクレアーゼを使用して、適当に尾側の分子を作成する。
【０３８３】
４．１６．５．１．１１ 後再組合せされた配列の回収
再集合された配列の回収は、縮小されたＲＩを伴うクローニングベクターの同定に頼っている。その後再組合せされたコード配列は、増幅により回収することができる。これらの産物は再クローニングされ、かつ発現される。縮小されたＲＩを伴うクローニングベクターの回収は、下記により実現することができる：
１）ベクターの使用は、該構築体の複雑度が低下した場合にのみ安定して維持される。
２）物理的方法による短縮化されたベクターの物理的回収。この場合、クローニングベクターは、標準のプラスミド単離法および標準の手法を利用するアガロースゲルまたは低分子量カットオフのカラムのいずれかを用いるサイズ分画を用いて、回収される。
３）挿入サイズが減少する場合に選択することができる切断された遺伝子を含むベクターの回収。
４）発現ベクターおよび適当な選択による直接の選択技術の使用。
関連生物に由来するコード配列（例えば遺伝子）は、高度の相同性を示し、かつ極めて多様なタンパク質産物をコードしている。これらの配列の種類は、本発明において準反復物として特に有用である。しかし、下記に説明された例はほぼ同じ本来のコード配列（準反復物）の再組合せを明らかにする一方で、この方法はこのようなほぼ同じ反復物に限定されるものではない。
以下の実施例は、本発明の方法を明らかにしている。３種の独自の種に由来したコード核酸配列（準反復物）について言及している。各配列は、個別の特性セットを伴うタンパク質をコードしている。各配列は、「Ａ」、「Ｂ」および「Ｃ」と称される配列内の独自の位置において１個または数個の塩基対が異なる。この準反復配列は、個別にまたは集合的に増幅されかつランダム集成体へとライゲーションされ、その結果全ての可能性のある順列および組合わせがライゲーションされた分子集団において利用可能になる。準反復ユニットの数は、集成条件により制御することができる。構築体内の準反復ユニットの平均数は、反復指数（ＲＩ）と定義される。
【０３８４】
一旦構築物が形成されると、該構築体は公表されたプロトコールに従うアガロースゲル上のサイズ分画、クローニングベクターへの挿入、および適当な宿主細胞へのトランスフェクションを行うことも行わないこともできる。その後これらの細胞は増殖され、かつ「縮小的再組合せ」が実施される。望ましいならば、縮小的再組合せ法の率は、ＤＮＡ損傷の導入により刺激することができる。ＲＩの縮小が、「分子内」機構による反復配列間の欠失の形成により媒介されるか、もしくは「分子間」機構による組換え様事象により媒介されるかのいずれであるかは、重要ではない。最終結果は、全ての可能性のある組み合わせへの分子の再組合せである。
任意に、本方法は、例えばタンパク質受容体、ペプチドオリゴ糖、ビリオンのようなあらかじめ定められた巨大分子、または他のあらかじめ定められた化合物または構造と結合さもなければ相互作用する能力を有する個々のシャッフルされたライブラリーメンバー（例えば触媒抗体など）を同定するために、シャッフルされたプールのライブラリーメンバーをスクリーニングする追加段階を含む。
このようなライブラリーから同定された、ディスプレイされたポリペプチド、抗体、偽ペプチド抗体、および変異領域の配列を、治療、診断、研究および関連目的（例えば触媒、水溶液の浸透圧を増大する溶質など）に使用することができ、および／または１種以上のシャッフルおよび／または親和性選択の追加サイクルを施すことができる。この方法は、表現型の特性についての選択段階があらかじめ定められた分子への結合親和性以外（例えば触媒活性、安定性、酸化抵抗性、薬物耐性、または宿主細胞に付与された検出可能な表現型など）であるように変更することができる。
【０３８５】
４．１６．５．１．１２ 親和性相互作用スクリーニングに適した抗体の提供
本発明は、親和性相互作用スクリーニングに適したディスプレイされた抗体のライブラリーを作成する方法を提供することができる。この方法は、（１）ディスプレイされた抗体および該ディスプレイされた抗体をコードしている会合したポリヌクレオチドを含む第一の複数の選択されたライブラリーメンバーを得、かつ該ディスプレイされた抗体をコードしている会合したポリヌクレオチドを得、かつ得た会合したポリヌクレオチドまたはそのコピーを得る段階であり、ここで該会合したポリヌクレオチドと実質的に同じ変異領域フレームワーク配列領域を含んでいる段階、ならびに（２）該ポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、かつ組換えおよび縮小的再組合せを促進する条件下で細胞を増殖し、その結果シャッフルされたポリヌクレオチドを生じる段階。シャッフルされたプールにより構成されたＣＤＲ組合せは、第一の複数の選択されたライブラリーメンバー中に存在せず、該シャッフルされたプールはＣＤＲ順列を含みかつ親和性相互作用スクリーニングに適したディスプレイされた抗体のライブラリーを構成する。任意にシャッフルされたプールは、あらかじめ決定されたエピトープ（抗原）に結合するシャッフルされたライブラリーメンバーの選択のために親和性スクリーニングが、およびそれによる複数の選択されたシャッフルされたメンバーの選択が施される。さらに、複数の選択的にシャッフルされたライブラリーメンバーがシャッフルされ、かつ１〜約１０００サイクルまたは望ましいならば所望の結合親和性を持つライブラリーメンバーが得られるまで、反復スクリーニングされる。
【０３８６】
４．１６．５．１．１３ オリジナルポリヌクレオチドへの変異の導入
別の本発明の局面において、組換えまたは再組合せの前またはその期間に、本発明の方法により作成されたポリヌクレオチドは、本来のポリヌクレオチドへの変異の導入を促進する物質または方法にさらすことが構想されている。このような変異の導入は、得られるハイブリッドポリヌクレオチドおよびそれらによりコードされたポリペプチドの多様性を増大するであろう。変異を促進する物質または方法は、以下を含むことができるが、これらに限定されるものではない：（＋）−ＣＣ−１０６５、または（＋）−ＣＣ−１０６５−（Ｎ３−アデニン）のような合成アナログ（ＳｕｎおよびＨｕｒｌｅｙ， １９９２参照）；ＤＮＡ合成を阻害することが可能なＮーアセチル化または脱アセチル化された４’−フルオロ−４−アミノビフェニル付加物（例えば、ｖａｎ ｄｅ Ｐｏｌｌら、１９９２参照）；または、ＤＮＡ合成を阻害することが可能なＮ−アセチル化または脱アセチル化された４−アミノビフェニル付加物（同じくｖａｎ ｄｅ Ｐｏｌｌら、１９９２， ｐｐ．７５１−７５８参照）；ＤＮＡ複製を阻害することが可能な三価クロム、三価クロム塩、多環式芳香族炭化水素（「ＰＡＨ」）ＤＮＡ付加物、例えば７−ブロモメチルーベンズ［α］アントラセン（「ＢＭＡ」）、リン酸トリス（２，３−ジブロモプロピル）（「Ｔｒｉｓ−ＢＰ」）、１，２−ジブロモ−３−クロロプロパン（「ＤＢＣＰ」）、２−ブロモアクロレイン（２ＢＡ）、ベンゾ［α］ピラン−７，８−ジヒドロジオール−９−１０−エポキシド（「ＢＰＤＥ」）、ハロゲン化プラチナ（ＩＩ）塩、Ｎ−ヒドロキシ−２−アミノ−３−メチルイミダゾ−［４，５−ｆ］−キノリン（「Ｎ−ヒドロキシ−ＩＱ」）、およびＮ−ヒドロキシ−２−アミノ−１−メチル−６−フェニルイミダゾ［４，５ｆ］−ピリジン（「Ｎ−ヒドロキシ−ＰｈＩＰ」）。特に好ましいＰＣＲ増幅を遅延または停止する手段は、ＵＶ光（＋）−ＣＣ−１０６５および（＋）−ＣＣ−１０６５−（Ｎ３−アデニン）からなる。特に包含された手段は、ＤＮＡ付加物またはポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドプールに由来したＤＮＡ付加物を含有するポリヌクレオチドであり、これはさらにプロセッシングする前にポリヌクレオチドを含有する溶液を加熱することを含む方法により放出または除去することができる。
【０３８７】
４．１５．５．１．１４ ハイブリッドまたは再組合せされたポリヌクレオチドの作成
別の局面において、本発明は、ハイブリッドまたは再組合せされたポリヌクレオチドの作成を提供する本発明の条件下で、野生型タンパク質をコードしている二本鎖鋳型ポリヌクレオチドを含有する試料を処理することによる、生物学的活性を有する組換えタンパク質の作出法に関する。
４．１６．５．１．１５ ウイルスゲノム遺伝子集団のシャッフル
本発明はさらに、ウイルス遺伝子（例えば、キャプシドタンパク質、スパイク糖タンパク質、ポリメラーゼ、およびプロテアーゼ）またはウイルスゲノム（例えば、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レオウイルスおよびリノウイルス）の集団をシャッフルするための、ポリヌクレオチドシャッフリングの適用を提供する。ある態様において、本発明は、エピトープに加え、組換えにより作出された新規エピトープの新規組合せを作成するための、免疫原性ウイルスタンパク質の全体または一部をコードしている配列をシャッフルする方法を提供し；このようなシャッフルされたウイルスタンパク質は、エピトープ、またはエピトープに加え組換えにより作出された新規エピトープの組合せを含むことができ；このようなシャッフルされたウイルスタンパク質は、ウイルス進化の結果として天然の環境においておそらく生じるであろうエピトープまたはエピトープの組合せを含むことができる；（例えば、インフルエンザウイルス株の組換えなど）。
４．１６．５．１．１６ 遺伝子治療ベクターおよび複製欠損した遺伝子治療構築
体の産生
本発明はさらに、ヒトの遺伝子治療に使用することができるような、遺伝子治療ベクターおよび複製欠損した遺伝子治療構築体を作出するためのポリヌクレオチド配列のシャッフルに適した方法を提供し、これはＤＮＡに基づいた予防接種用のワクチンベクターに加え、抗腫瘍遺伝子治療および他の一般的治療様式を含むが、これらに限定されるものではない。
【０３８８】
４．１６．５．３ 方法論
核酸シャッフリングは、１個または複数個のポリヌクレオチドを作成するための、より短いかまたはより小さいポリヌクレオチドのプールのインビトロまたはインビボ相同的組換え法である。関連した核酸配列またはポリヌクレオチドの混合物に、ランダムポリヌクレオチドを作成するようにセクシュアル（ｓｅｘｕａｌ）ＰＣＲを施し、かつ組換えハイブリッド核酸分子またはポリヌクレオチドのライブラリーまたは混合集団を得るように再集成された。
カセット突然変異とは対照的に、シャッフリングおよびエラープローンＰＣＲのみが、盲検的（プライマー以外の配列情報はない）配列プールの突然変異を可能にするものである。
４．１６．５．３．１ 変異原性シャッフリングの利点
反復選択に関するエラープローンＰＣＲ単独に勝る本発明の変異原性シャッフリングの利点は、抗体の遺伝子操作の例について最も良く説明することができる。
４．１６．５．３．２ 逆連鎖反応
この方法は、エラープローンＰＣＲとは、逆連鎖反応である点で異なる。エラープローンＰＣＲにおいて、ポリメラーゼ開始部位の数および分子の数は、指数関数的に増大する。しかし、ポリメラーゼ開始部位の配列および該分子の配列は本質的に同じである。対照的に、ランダムポリヌクレオチドの再集成またはシャッフリングする核酸において、開始部位の数およびランダムポリヌクレオチドの数（サイズではない）は、経時的に減少する。全プラスミドに由来したポリヌクレオチドについて、理論的エンドポイントは、１本の巨大なコンカテマー分子である。
相同領域でクロスオーバーが生じるので、組換えは、同じ配列ファミリーのメンバーの間で初めに生じる。これは、総体的に共存性のないＣＤＲの組合せを邪魔する（例えば、同じ抗原の異なるエピトープに対して）。配列の複数のファミリーを同じ反応においてシャッフルすることができることが考案されている。さらに、シャッフリングは一般に、相対的順番を維持し、その結果例えばＣＤＲ１は、ＣＤＲ２の位置には認められないであろう。
【０３８９】
稀なシャッフラントは、非常に多数の最良（例えば最高親和性）のＣＤＲを含み、かつこれらの稀なシャッフラントは、それらの優れた親和性を基に選択することができる。
１００種の異なる選択された抗体配列のプールからのＣＤＲは、最大１００６種の異なる方法で並べ替えることができる。この非常に多数の並べ替えは、ＤＮＡ配列の単独のライブラリーにおいては表すことができない。従って、ＤＮＡシャッフリングおよび選択の複数のサイクルが、所望の配列長さおよび配列の多様性に応じて必要であると考えられている。
対照的にエラープローンＰＣＲは、同じ相対的配列において全ての選択されたＣＤＲを維持し、非常に小さい変異体クラウド（ｃｌｏｕｄ）を形成している。
４．１６．５．３．３ 鋳型ポリヌクレオチド
本発明の方法で使用することができる鋳型ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであることができる。これは、遺伝子のサイズまたは再結合もしくは再集成される短いもしくは小さいポリヌクレオチドに応じて、様々な長さであることができる。好ましい鋳型ポリヌクレオチドは５０ｂｐ〜５０ｋｂである。関心対象のタンパク質をコードしている核酸を含むベクター全体を、本発明の方法において使用することができることが考案されており、かつ実際にうまく使用されている。
鋳型ポリヌクレオチドは、ＰＣＲ反応を用いる増幅（米国特許第４，６８３，２０２号および第４，６８３，１９５号）、または他の増幅もしくはクローニング法により得ることができる。しかしＰＣＲ産物のプールおよびセクシュアルＰＣＲを施す前に、ＰＣＲ産物から自在なプライマーを除去することは、より効率的結果をもたらす。セクシュアルＰＣＲ前の本来のプールからのこのようなプライマーの適切な除去の失敗は、低頻度のクロスオーバークローンに繋がり得る。
【０３９０】
鋳型ポリヌクレオチドはしばしば、二本鎖である。二本鎖核酸分子は、得られる一本鎖ポリヌクレオチド領域が互いに相補的であり、その結果ハイブリダイズし、二本鎖分子を形成することができることを確実にすることが推奨されている。
この段階では、鋳型ポリヌクレオチドと同じ領域および鋳型ポリヌクレオチドと異なる領域を有する一本鎖または二本鎖核酸ポリヌクレオチドが、鋳型ポリヌクレオチドに添加されることが考案されている。さらに２種の異なるが関連したポリヌクレオチド鋳型をこの段階で混合することができると考えられている。
二本鎖ポリヌクレオチド鋳型およびいずれか添加された二本鎖または一本鎖ポリヌクレオチドに、遅延または停止を含むセクシュアルＰＣＲが施され、５ｂｐ〜５ｋｂまたはそれ以上の混合物が提供される。好ましくは、ランダムポリヌクレオチドのサイズは、約１０ｂｐ〜１０００ｂｐであり、より好ましくはこのポリヌクレオチドのサイズは、約２０ｂｐ〜５００ｂｐである。
４．１６．５．３．４ 複数のニックを有する二本鎖核酸の使用
あるいは、同じく複数のニックを有する二本鎖核酸を、本発明の方法において使用することが考察されている。ニックは、二本鎖核酸の１本の鎖中の切れ目である。このようなニック間の距離は、好ましくは５ｂｐ〜５ｋｂであり、より好ましくは１０ｂｐ〜１０００ｂｐである。これは、例えばランダムプライマーから生じるポリヌクレオチドと共に含まれる、より短いかまたはより小さいポリヌクレオチドを作成するための自己プライミング域（ａｒｅａ）を提供する。
いずれか１種の特異的ポリヌクレオチドの濃度は、総ポリヌクレオチドの１質量％よりも大きくはなく、より好ましくはいずれか１種の特異的核酸配列は、総核酸の０．１質量％よりも大きいことはない。
このような混合物中の様々な特異的ポリヌクレオチドの数は、少なくとも約１００個であり、好ましくは少なくとも約５００個であり、より好ましくは少なくとも約１０００個である。
【０３９１】
４．１６．５．３．５ ポリヌクレオチド混合物の不均一性の増大
この段階で、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドは、合成または天然にかかわらず、ポリヌクレオチド混合物の不均一性を増大するために、ランダム二本鎖のより短いかまたは小さいポリヌクレオチドに添加することができる。
さらに二本鎖のランダムに破壊されたポリヌクレオチドの集団を、この段階でセクシュアルＰＣＲ法由来のポリヌクレオチドと混合または一緒にすることができ、かつ任意に１種以上の追加のセクシュアルＰＣＲサイクルを施すことが考案されている。
鋳型ポリヌクレオチドへの変異の挿入が望ましい場合、鋳型ポリヌクレオチドと同じ領域および鋳型ポリヌクレオチドと異なる領域を有する一本鎖または本二鎖ポリヌクレオチドを、総核酸に対して質量で２０倍過剰に添加することができ、より好ましくは総核酸に対して質量で１０倍過剰に添加することができる。
異種であるが関連した鋳型ポリヌクレオチドの混合物が望ましい場合には、各鋳型由来のポリヌクレオチドの集団は、約１：１００未満の比で、より好ましくは約１：４０未満の比で一緒にすることができる。例えば、変異されたポリヌクレオチド集団による野生型ポリヌクレオチドの戻し交配（ｂａｃｋｃｒｏｓｓ）は、中立突然変異（例えば、選択される表現型特性における非現実的変更を生じる変異）を排除するために望ましい。このような例において、ランダムに提供されたセクシュアルＰＣＲサイクルハイブリッドポリヌクレオチドに対する、添加することができるランダムに提供された野生型ポリヌクレオチドの比は、およそ１：１〜約１００：１であり、より好ましくは１：１〜４０：１である。
【０３９２】
４．１６．５．３．５．１ 変性と再アニーリング
ランダムポリヌクレオチドの混合された集団は、一本鎖のポリヌクレオチドを形成するために変性され、次いで再アニーリングされる。他の一本鎖ポリヌクレオチドと相同性のある領域をもつ一本鎖ポリヌクレオチドだけが、再アニーリングされると考えられる。
ランダムポリヌクレオチドを加熱によって変性させることができる。当業者は、二本鎖の核酸を完全に変性させるのに必要な条件を決定することができる。好ましくは８０℃から１００℃、より好ましくは、温度は９０℃から９６℃の温度である。ポリヌクレオチドを変性させるために使われうる他の方法は、圧力（３６）ならびにｐＨを含む。
ポリヌクレオチドを冷却によって再アニーリングすることができる。好ましくは温度は２０℃から７５℃の間、より好ましくは、温度は４０℃から６５℃の間である。平均わずか４個の連続する塩基の相同性に基づいて高頻度のクロスオーバー（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）を必要とするならば、方法はより困難になるが、低いアニーリング温度を用いて組換えを強制することができる。発生する立体構造の再生は、一本鎖ポリヌクレオチドの集団間の相同性の程度に依存するであろう。
再生は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）あるいは塩の添加によって加速されうる。塩濃度は、好ましくは０ｍＭから２００ｍＭまで、より好ましくは塩濃度は１０ｍＭから１００ｍＭまでである。塩はＫＣｌあるいはＮａＣｌでありうる。ＰＥＧの濃度は、好ましくは０％から２０％まで、より好ましくは５％から１０％までである。
【０３９３】
４．１６．５．３．５．２ 反応
アニーリングされたポリヌクレオチドは次に、核酸ポリメラーゼ及びｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）の存在下でインキュベートされる。核酸ポリメラーゼはクレノー断片、Ｔａｑポリメラーゼ、あるいは当技術分野で既知の任意の他のＤＮＡポリメラーゼでありうる。
集合のために用いられうるアプローチは、クロスオーバーが得られる最小程度の相同性に依存している。もし、同一な領域が大きいときは、Ｔａｑポリメラーゼを４５℃から６５℃の間のアニーリング温度で使うことができる。もし、同一な領域が小さいときは、クレノーポリメラーゼを２０℃から３０℃の間のアニーリング温度で使うことができる。当業者は、クロスオーバーが達成された数を増加させるために温度を変化させることができる。
アニーリングに先立って、アニーリングと同時に、またはアニーリングの後に、ポリメラーゼをランダムポリペプチドに添加することができる。
ポリメラーゼ存在下での変性、再生及びインキュベーションのサイクルとは、本明細書において核酸のシャッフリング又は集合を指す。このサイクルは所望の回数繰り返される。好ましくは、サイクルは２回から５０回繰り返され、より好ましくは、シークエンスは１０回から４０回繰り返される。
【０３９４】
４．１６．５．３．６ 結果として生じる核酸
その結果得られた核酸は、約５０ｂｐから約１００ｋｂｐまでの、より大きな二本鎖ポリヌクレオチドであり、好ましくは、より大きな該ポリヌクレオチドは５００ｂｐから５０ ｋｂｐまでである。
このより大きなポリヌクレオチドは、鋳型ポリヌクレオチドと同じ大きさをもつポリヌクレオチドの数多くのコピーを直列に含みうる。この鎖状体状（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｃ）のポリヌクレオチドは次に、鋳型ポリヌクレオチドの単一コピーへと変性する。この結果、鋳型ポリヌクレオチドとほぼ同じ大きさをもつポリヌクレオチドの集団ができると考えられる。集団は混合された集団であると考えられ、同一の領域及び異種の領域をもつ一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドが、シャッフリングの前に、鋳型ポリヌクレオチドに加えられる。
これらのポリヌクレオチドは、次に適当なベクター及び細菌の形質転換に用いるライゲーション混合物へクローニングされる。
鎖状体の消化よりはむしろＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号及び米国特許第４，６８３，２０２号）を含む種々の方法によって、クローニングの前に単一のポリヌクレオチドを増幅することにより、単一のポリヌクレオチドがより大きな鎖状体状のポリペプチドから得られうることが予測される。
４．１６．５．３．７ クローニングのために使用されるベクター
クローニングのために使用されるベクターは、所望の大きさのポリヌクレオチドが受容されるならば、それほど重要ではない。もし、特定のポリヌクレオチドの発現が望ましいのであれば、宿主細胞中でポリヌクレオチドを発現させるために、クローニングの媒体は、ポリヌクレオチドの挿入部位の隣に転写シグナル及び翻訳シグナルをさらに含むべきである。好ましいベクターには、ｐＵＣシリーズやｐＢＲシリーズのプラスミドが含まれる。
【０３９５】
４．１６．５．３．８ 結果として得られる細菌集団
その結果得られた細菌集団は、ランダム変異を有する多くの組換えポリヌクレオチドを含むと考えられる。この混合集団は、所望の組換えポリヌクレオチドを同定するために、試験されうる。選択の方法は、所望のポリヌクレオチドに依存すると考えられる。
例えばもし、リガンドへの増大された結合効率をもつタンパク質をコードするポリヌクレオチドが望ましいならば、集団又はライブラリーにおいてポリヌクレオチドそれぞれの部分により発現されたタンパク質は、当技術分野で既知の方法（すなわち、パニングやアフィニティクロマトグラフィ）によって、リガンドへの結合能について試験されうる。もし、増大された薬剤耐性をもつタンパク質をコードするポリヌクレオチドが望ましいならば、集団又はライブラリーにおけるそれぞれのポリヌクレオチドによって発現されたタンパク質は、宿主生物に薬剤耐を付与する性能について試験されうる。所望のタンパク質の知識をもつ当業者は、集団を容易に試験して、所望の特性をタンパク質に付与するポリヌクレオチドを同定することができる。
当業者が、タンパク質の断片を融合タンパク質としてファージ表面に発現させる、ファージディスプレイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ ＷＩ）を使えることが予測される。組換えＤＮＡ分子は、ある部位でファージＤＮＡにクローニングされ、その結果、その一部が組換えＤＮＡによってコードされた融合タンパク質の転写が起こる。組換え核酸分子を含むファージは細胞の中で複製及び転写をうける。融合タンパク質のリーダー配列は、融合タンパク質の輸送をファージ粒子の先端に向ける。したがって、組換えＤＮＡ分子によって部分的にコードされた融合タンパク質は、上記の方法による検出及び選択のためにファージ粒子の上に提示される。
【０３９６】
４．１６．５．３．９ 核酸シャッフリングの サイクル
さらに、核酸シャッフリングの多数のサイクルは、亜集団が所望の組換えタンパク質をコードするＤＮＡを含むような、最初の集団の亜集団由来のポリヌクレオチドと共に行われることが予測される。このようにして、より高い結合親和性又は酵素的活性を有するタンパク質が達成される。
さらに、核酸シャッフリングの多数のサイクルは、亜集団が所望の組換えタンパク質をコードするＤＮＡを含むような、最初の集団の亜集団由来のポリヌクレオチドと共に行われることが予測される。このようにして、より高い結合親和性又は酵素的活性を有するタンパク質が達成される。
４．１６．５．３．１０ 開始核酸
精製された形態における核酸の任意の供給源が、開始核酸として使用されうる。したがって過程は、ＤＮＡ又はＲＮＡが一本鎖又は二本鎖でありうる、ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを含むＲＮＡを利用することができる。加えて、それぞれの一本鎖を含むＤＮＡＲＮＡハイブリッドも使用することができる。核酸の配列は、変異される核酸配列の大きさに依存して、さまざまな長さでありうる。好ましくは、特異的な核酸の配列は５０塩基対から５００００塩基対である。関心対象のタンパク質をコードする核酸を含むベクター全体が、本発明の方法において使用されうることが予測される。
核酸は、任意の供給源、たとえばｐＢＲ３２２のようなプラスミド、クローニングされたＤＮＡもしくはＲＮＡ、又は細菌、酵母、ウイルス、及び植物もしくは動物のような高等生物を含む、任意の供給源由来の天然のＤＮＡもしくはＲＮＡから得られうる。ＤＮＡ又はＲＮＡを、血液又は組織材料から抽出することもできる。鋳型ポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチド連鎖反応（ＰＣＲ、米国特許第４，６８３，２０２号及び米国特許第４，６８３，１９５号）を用いて増幅することにより得ることができる。又はポリヌクレオチドは、細胞中に存在するベクター中に存在しうり、十分な核酸は、当技術分野で既知の方法による細胞の培養及び細胞からの核酸の抽出によって得られうる。
本方法によって、任意の特異的な核酸配列を、ハイブリッド集団を作製するために用いることができる。特定の核酸配列のハイブリッド配列の小さな集団が存在している又は、本方法の前に作製されることだけが必要である。
【０３９７】
４．１６．５．３．１１ 初期核酸配列集団の作製
変異をもつ特定の核酸配列の最初の小さな集団は、多くの異なった方法で作製される。変異はエラープローンＰＣＲで作製されうる。エラープローンＰＣＲは、長い配列にわたって低いレベルでの点変異をランダムに導入するために、低忠実度の重合条件を用いる。または、オリゴヌクレオチドによる突然変異誘発によって、鋳型ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。オリゴヌクレオチドによる突然変異誘発において、ポリヌクレオチドの短い配列が制限酵素消化を用いてポリヌクレオチドから除去され、様々な塩基が本来の配列から変化している合成ポリヌクレオチドで置き換えられる。ポリヌクレオチド配列はまた化学的突然変異誘発によっても変化されうる。化学的突然変異誘発は、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシアミン、ヒドラジン、又はギ酸を含む。ヌクレオチド前駆体の類似体である他の薬剤は、ニトロソグアニジン、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、又はアクリジンを含む。一般的にこれらの薬剤は、それにより配列が変異されるヌクレオチド前駆体の代わりに、ＰＣＲ反応に加えられる。プロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなどのようなインターカレーション試薬もまた使用されうる。ポリヌクレオチド配列のランダム突然変異誘発はまた、Ｘ線又はＵＶ光の照射によって達成されうる。一般的に、このように突然変異誘発されたプラスミドポリヌクレオチドを大腸菌に導入し、ハイブリッドプラスミドのプール又はライブラリーとして増殖させる。
または、同一の遺伝子の異なった対立遺伝子、又は異なった関連する種由来の同一遺伝子（すなわち同族遺伝子）からなるという点で、特定の核酸の小さな混合集団は天然にも見出だされうる。またはそれらは、一つの種の中に見られる関連した遺伝子、例えば免疫グロブリン遺伝子でありうる。
ひとたび特定の核酸配列の混合された集団が作製されると、又は当技術分野でよく知られた技術を用いて、ポリヌクレオチドを直接用いるか、適当なクローニングベクターに挿入することができる。
【０３９８】
４．１６．５．３．１１．１ ベクターの選択
ベクターの選択は、本発明の方法において使用されるポリヌクレオチド配列の大きさや宿主細胞に依存している。本発明における鋳型はプラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ウイルス（例えばレトロウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、レオウイルス、パラミクソウイルスなど）、又はその中の選ばれた一部分（例えば、コートタンパク質、スパイクグリコタンパク質、キャプシドタンパク質）でありうる。例えば、変異される特定の核酸配列がより大きい場合には、大きなポリヌクレオチドを安定に保持することのできるベクターであるために、コスミド及びファージミドが好ましい。
４．１６．５．３．１１．２ クローン的な増幅
もし、特定の核酸配列の混合された集団をベクターにクローニングした場合、各ベクターを一つの宿主細胞に挿入し、その宿主細胞にベクターを増幅させることにより、クローンとして増幅することができる。核酸配列の絶対数が増大してもハイブリッドの数は増大しないので、これは、クローン的な（ｃｌｏｎａｌ）増幅とよばれる。有用性を、発現されたポリペプチドをスクリーニングすることで容易に決定することができる。
４．１６．５．３．１２ 任意の配列混合物の任意の特定の部位への導入
本発明におけるＤＮＡシャッフリングを、未知の配列のプールにおいて盲目的に行うことができる。オリゴヌクレオチドの再集合混合物（再集合される配列に対して相同的な末端を有する）を添加することで、任意の配列混合物を、任意の特定の部位において、別の配列混合物のなかに組み込むことができる。したがって、合成オリゴヌクレオチド、ＰＣＲポリヌクレオチド又はたとえ遺伝子全体の混合物でも、規定の部位において別の配列ライブラリーの中に混合することができると予想される。一つの配列（混合物）の挿入は、鋳型の他の部位での配列の挿入に依存しない。それゆえ、組換えの程度、必要な相同性、及びライブラリーの多様性は、再集合されたＤＮＡの長さに沿って独立してかつ同時に変化することができる。
【０３９９】
２つの遺伝子を混合するこのアプローチは、ネズミのハイブリドーマ由来の抗体をヒト化するために有用でありうる。２つの遺伝子の混合、又は代替的な配列の遺伝子への挿入のアプローチは、たとえば、インターロイキンＩ、抗体、ｔＰＡ、及び成長ホルモンなど、治療的に使用される任意のタンパク質に対して有用でありうる。アプローチはまた、タンパク質の発現を増加させるために、又は発現の特異性を変化させるために、任意の核酸、たとえば、遺伝子上のプロモーターもしくはイントロン、又は３１非翻訳領域もしくは５１非翻訳領域に対して有用でありうる。
４．１６．５．３．１３ 骨格様タンパク質の作製
シャッフリングには、多様性の領域を分けている相同的な領域の存在が必要である。骨格様タンパク質構造は、特にシャッフリングには適しうる。保存された骨格は、特異的結合を媒介する比較的制限されないループを示す一方で、自己会合による全体の折り畳み構造を決定する。このような骨格の例としては、当技術分野で公知の免疫グロブリンβバレル構造及び４−ヘリックスバンドルがあげられる。このシャッフリングは、結合のための変異配列の種々の組み合わせをもつ、骨格様タンパク質を作製するのに使用されうる。
４．１６．５．４． インビトロシャッフリング
いくつかの標準的遺伝子交配と同等のことがインビトロシャッフリングによってもまた実施されうる。例えば「分子戻し交配」を、関心対象の変異に関する選択の際ハイブリッド核酸を野生型核酸と繰り返し混合させることにより実施することができる。伝統的育種と同様に本アプローチを、異なる供給源由来の表現型を、選択したバックグラウンドと組み合わせるために使用することができる。これは例えば選択されていない特性（すなわち免疫原性）に影響を与える中立の変異を除去するために有用である。したがって、これはタンパク質の変異が増大された生物学的活性に関与するかどうかを判定するために有用であることができ、これはエラープローン変異誘発法またはカセット変異誘発法によっては達成することができない利点である。
【０４００】
大型機能的遺伝子を、小型ランダムポリヌクレオチドの混合物から正確に集合させることができる。本反応は化石の高度に断片化されたＤＮＡから遺伝子を再集合させるために有用でありうる。更に、化石由来のランダムな核酸断片は関連する種由来の類似遺伝子由来のポリヌクレオチドと組み合わされうる。
４．１６．５．４．１ ゲノムのインビトロ増幅
本発明の方法が、様々な研究および診断応用のために必要とされるような１つの細胞からの全ゲノムのインビトロ増幅のために使用されうることもまた考えられる。ＰＣＲによるＤＮＡ増幅は、現実的には約４０ｋｂの長さに限定される。たとえば大腸菌のゲノム（５，０００ｋｂ）などの全ゲノムのＰＣＲ増幅は、１２５個の４０ｋｂポリヌクレオチドを生じる約２５０個のプライマーを必要とすると考えられる。このアプローチは、十分な配列データが得られないために現実的ではない。一方、セクシュアルＰＣＲを用いたゲノムのポリヌクレオチドのランダム作製およびその後の小さなポリヌクレオチドのゲル精製は、多数の潜在的プライマーを提供すると考えられる。このランダムな小さいポリヌクレオチド混合物をＰＣＲ反応においてプライマーとして単独でまたは鋳型として全ゲノムＤＮＡをともに用いる使用は、ゲノムの多くのコピーを含む単一のコンカテマーの理論的終了点をもつ、逆連鎖反応をもたらすはずである。
コピー数の１００倍の増幅および５０ｋｂ超のポリヌクレオチドの平均の大きさは、ランダムポリヌクレオチドのみが使用された場合に得られうる。多数のより小さなポリヌクレオチドの重複による、より大きなコンカテマーが作製されると考えられる。合成プライマーを用いて得られた特異的ＰＣＲ産物の質は、非増幅ＤＮＡから得られた産物と区別できないと考えられる。本アプローチががゲノムマッピングにおいても有用であることが期待される。
実施者の判断で、シャッフリングされるべきポリヌクレオチドは、ランダムまたは非ランダムなポリヌクレオチドとして作製されうる。
【０４０１】
４．１６．５．５． インビボシャッフリング
インビボシャッフリングの態様においては、少なくとも２つの異なる核酸配列が各宿主細胞内に存在するような条件下で、特定の核酸配列の混合集団が細菌性または真核性の細胞内に導入される。ポリヌクレオチドを、様々な異なる方法で宿主細胞に導入することができる。宿主細胞を、当技術分野において既知である方法、たとえば塩化カルシウム処理を用いて、より小型のポリヌクレオチドで形質転換することが可能である。ポリヌクレオチドがファージゲノムに挿入されているならば、宿主細胞は特定の核酸配列を有する組換えファージゲノムを用いてトランスフェクトされうる。または、エレクトロポレーション、トランスフェクション、リポフェクション、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、接合などを用いて、核酸配列を宿主細胞に導入することができる。
一般的には本態様において、宿主細胞内で安定に配列を複製する能力を有するベクター内に特異的核酸配列が存在すると考えられる。さらに、ベクターはベクターを有する宿主細胞が選択されうるためのマーカー遺伝子をコードするであろうことが考えられる。これは変異した特異的核酸配列が宿主細胞への導入後に回収されうることを確実にする。しかしながら、特異的核酸配列の全混合集団がベクター配列上に存在する必要がないことが考えられる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入後に各宿主細胞がその中に少なくとも１つの特異的核酸配列を有する１つのベクターを含むことを確実にするために、むしろ十分な数の配列だけがベクターにクローニングされる必要がある。ベクターにクローニングされた特異的核酸配列の集団のサブセットを有するよりもむしろ、このサブセットがが既に安定に宿主細胞に組み込まれうることもまた考えられる。
４．１６．５．５．１ 相同組換え
同一領域を有する２つのポリヌクレオチドが宿主細胞に挿入される場合、相同組換えが２つのポリヌクレオチド間で生じることが見出された。２つの変異型特異的核酸配列間でのそのような組換えは、ある状況では二重または三重ハイブリッドの作製をもたらすと考えられる。
【０４０２】
４．１６．５．５．２ 組換え頻度の増加
いくつかの変異型特異的核酸配列が直鎖状核酸分子上に存在するならば、組換え頻度が増加することもまた見出された。それゆえ好ましい態様においては、いくつかの特異的核酸配列が直鎖上ポリヌクレオチド上に存在する。
４．１６．５．５．３ 好ましい品質を有する変異型特異的核酸配列を含む宿主細胞形質転換体の同定
形質転換後、宿主細胞形質転換体は、所望の品質を有する変異型特異的核酸配列を含む宿主細胞形質転換体を同定するための選択下に置かれる。例えばある特定の薬剤への耐性の増加が望ましいならば、形質転換された宿主細胞が特定の薬剤の増加濃度に供されうり、薬剤耐性の増加を賦与することができる変異型タンパク質を作製する形質転換体が選択されるであろう。ある特定のタンパク質が受容体に結合する能力の増強が望ましいならば、その後形質転換体からタンパク質発現を誘導することが可能であり、結果生じるタンパク質は、リガンドに対する結合の増強を示す変異型亜集団を同定するために当技術分野において既知である方法によりリガンド結合アッセイにより評価される。またはタンパク質は適切なプロセシングを確実にするために別の系で発現することができる。
目的の特性を有する最初の組換え型特異的核酸配列（娘配列）の亜集団が同定されると、それらは続いて別の回の組換えに供される。
【０４０３】
４．１６．５．５．４ ２サイクル目の組換え
２サイクル目の組換えでは、組換え型特異的核酸配列は本来の変異型の特異的核酸配列（親配列）とシャッフリングされてもよく、サイクルは上述の通り繰り返される。このようにして、増強された特性を有するまたは増強された特性を有するタンパク質をコードする第二の組換え型特異的核酸配列のセットが同定されうる。このサイクルは望ましいならば多数回繰り返されうる。
２番目または引き続く組換えサイクルにおいて戻し交配が実施されうることもまた考えられる。少なくとも１つの野生型核酸配列および変異型核酸配列が形質転換後の同一の宿主細胞内に存在するような分子戻し交配は目的の特異的核酸配列を多数の野生型配列とシャッフリングすることにより実施されうる。野生型特異的核酸配列との組換えは免疫原性等の選択されていない特性に影響を与えうるそれらの中立変異を除去し、選択された特性は除去しない。
４．１６．５．５．５ 特異的核酸配列の亜集団の作製
本発明の別の態様においては、第１ラウンドにおいて特異的核酸配列の亜集団は、宿主細胞への導入前にそのＰＣＲ増幅を遅くまたは停止することにより、より小さなポリヌクレオチドとして作製することができる。他の配列と相同組換えを起こすようにポリヌクレオチドの大きさはいくつかの他の配列と同一である領域を含む程度には大きくなくてはならない。ポリヌクレオチドの大きさは０．０３ｋｂから１００ｋｂの範囲であり、より好ましくは０．２ｋｂから１０ｋｂの範囲であると考えられる。引き続くラウンドにおいて以前のラウンドから選択された配列以外の全ての特異的核酸配列は、宿主細胞への導入前にそのＰＣＲポリヌクレオチドを作製するために使用されてもよい。
短いポリヌクレオチド配列は一本鎖または二本鎖であることができる。配列が本来一本鎖でありそれが二本鎖になったならば、それらは、宿主細胞への導入前に、熱、化学物質、または酵素を用いて変性することができる。核酸の鎖を分離するのに適した反応条件は当技術分野においてよく知られている。
本過程の段階を無限に繰り返すことができ、達成可能なありうるハイブリッドの数によってのみ制限されている。ある回数のサイクルの後、全ての潜在的なハイブリッドは達成されてしまい、そしてさらなるサイクルは冗長である。
ある態様においては、同一の変異型鋳型核酸配列が繰り返し組換えられ、結果としての組換え体は目的に対して選択される。
【０４０４】
４．１６．５．５．６ バクテリアにおいて複製可能なベクターへのクローニング
したがって、変異型鋳型核酸配列の初期のプールまたは集団は、大腸菌等の微生物にて複製可能なベクターにクローニングされる。大腸菌で自律的複製が可能である限りは特定のベクターが必須であるわけではない。好ましい態様においては、ベクターは、ベクターに連結された変異型特異的核酸配列によりコードされるタンパク質の発現および作製を可能にするように設計されている。ベクターが選択標識をコードする遺伝子を含むこともまた好ましい。
変異型核酸配列のプールを含むベクター集団が大腸菌宿主細胞に導入される。ベクター核酸配列は、トランスフォーメーション、トランスフェクション、またはファージの場合は感染により導入されてもよい。微生物をトランスフォームするために用いられるベクターの濃度は、多数のベクターが各細胞に導入される程度のものである。細胞の中に存在する場合、相同組換えの効率は、相同組換えが様々なベクター間でおこる程度のものである。これは、本来の親変異型配列と異なる変異の組み合わせを有する（娘）ハイブリッドの作製につながる。
その後宿主細胞はクローン状態で複製され、そしてベクターに存在する標識遺伝子により選択される。プラスミドを有するそれらの細胞のみが選択下で増殖すると考えられる。
４．１６．５．５．７ 好ましい変異の存在確認試験
ベクターを含む宿主細胞は、続いて好ましい変異が存在するかを試験される。そのような試験は、例えば選択される遺伝子が改良型薬剤耐性遺伝子であるならば、細胞を選択圧下に置くことからなってもよい。もしベクターが変異型核酸配列によりコードされるタンパク質の発現を可能にするならば、そのときはそのような選択は、そのようにコードされるタンパク質を発現させてタンパク質を単離し、および、例えば、より効率的に目的のリガンドに結合するかを決定するためにタンパク質を試験することを含んでもよい。
【０４０５】
４．１６．５．５．８ 目的特性を有する核酸配列の単離
目的の特性を与えるある特定の娘変異型核酸配列が同定されると、既にベクターに結合された核酸配列またはベクターから分離された核酸配列が単離される。この核酸はそれから最初のすなわち親核酸集団とシャッフリングされ、サイクルが繰り返される。本方法により増強された目的特性を有する核酸配列が選択されうることが示されている。
４．１６．５．５．９ 第１世代ハイブリッドを含む細胞への親変異型配列の添加
別の態様においては、第１世代のハイブリッドは細胞内に維持され、親変異型配列が再び細胞に添加される。したがって、態様Ｉの最初のサイクルは上述されたように実施される。しかしながら、娘核酸配列が同定された後は、これらの配列を有する宿主細胞は保持される。
変異型特異的核酸配列の親集団は、ポリヌクレオチドまたは同一のベクターにクローニングされた形で、すでに娘核酸を含む宿主細胞に導入されている。細胞内で組換えが生じることは可能であり、次世代の組換え体すなわち孫娘が上述された方法により選択される。このサイクルは目的とする特性を有する核酸またはペプチドが得られるまで多数回にわたり繰り返すことが可能である。引き続くサイクルでは、好ましいハイブリッドに添加される変異型配列の集団は親ハイブリッドまたは他のいかなる引き続く世代に由来してもよい。
【０４０６】
４．１６．５．５．１０ 「分子」戻し交配による中立変異の除去
別の態様においては、本発明はいかなる中立変異も除去するために、得られた組換え特異的核酸の「分子」戻し交配を実施する方法を提供する。中立変異は核酸またはペプチドに目的とする特性を付与しない変異である。しかしながらそのような変異は核酸またはペプチドに望ましくない特性を与えてもよい。したがって、そのような中立変異を除去することが望ましい。本発明の方法はそれを実施する方法を提供する。
本態様においては、目的とする特性を有するハイブリッド核酸が実施態様の方法で得られた後、核酸、その核酸を有するベクター、またはそのベクターと核酸を含む宿主細胞が単離される。
核酸またはベクターはそれから大過剰の野生型核酸とともに宿主細胞に導入される。ハイブリッドの核酸および野生型配列の核酸は組換えを行うことが可能である。結果として生じる組換え体は、ハイブリッド核酸と同じ選択下に置かれる。目的とする特性を保持した組換え体のみが選択されるであろう。目的とする特性を与えないいかなるサイレント変異も野生型ＤＮＡとの組換えを通して失われるであろう。このサイクルは全てのサイレント変異が除去されるまで多数回繰り返すことができる。
したがって本発明の方法は不必要なまたはサイレントな変異を除去するために分子戻し交配において使用することができる。
【０４０７】
４．１６．５．６ 有用性
本発明のインビボ組換えを、特定のポリヌクレオチド、又は配列が未知のハイブリッドまたは対立遺伝子のプールにおいて盲目的に行うことができる。しかしながら、特定のポリヌクレオチドの実際のＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列を知る必要はない。
混合された遺伝子集団の中での組換えを使うことのアプローチは、任意の有用なタンパク質、たとえばインターロイキンＩ、抗体、ｔＰＡ及び成長ホルモンの作製に有用でありうる。このアプローチは、変化した特異性又は活性を持つタンパク質の作製に使われうる。アプローチはまた、ハイブリッド核酸配列、たとえば、遺伝子のプロモーター領域、イントロン、エキソン、エンハンサー配列、３１非翻訳領域、又は５１非翻訳領域の作製に有用でありうる。したがってこのアプローチは、発現において増大した速度を持つ遺伝子の作製に使われうる。このアプローチはまた、繰り返しＤＮＡ配列の研究においても、有用でありうる。最後にこのアプローチは、リボザイム又はアプタマーを変異させるためにも有用でありうる。 タンパク質において多様性の領域を分けている骨格様領域は特に、本発明の方法に適しうる。保存骨格は、特定の結合を媒介する比較的制限されないループ構造を示す一方で、自己会合による全体の折り畳み構造を決定する。このような骨格の例としては、免疫グロブリンβバレル構造や４−ヘリックスバンドルがあげられる。本発明の方法は、結合のための変異配列のさまざまな組み合わせを持つ骨格様タンパク質を作製するのに用いられうる。
いくつかの標準的な遺伝子交配と同等なものもまた、本発明の方法によって行われうる。例えば、「分子」戻し交配を、関心対象の変異の選択の一方で、ハイブリッドの核酸と野生型の核酸との繰り返し混合によって行うことができる。伝統的な品種改良においてみられるように、このアプローチを、異なった供給源からの表現型を結合させ選択のバックグラウンドにするために使用することができる。それは、たとえば、選択されない特徴（すなわち免疫原性）に影響を与える中立の変異の除去のためにも有用である。したがって、タンパク質におけるどの変異が増強された生物学的活性に含まれるのかどうかを判定することは有用でありうる。
【０４０８】
４．１６．５．７ ペプチドディスプレイ法
本方法は、任意の開示された方法によるってインビトロ及び／又はインビボでの組換えにより、ならびに任意の組合わせにおいて、結合したポリヌクレオチドが表現型に関して（たとえば、あらかじめ決められた受容体（リガンド）に対する親和性に関して）スクリーニングされた、提示されたペプチドをコードしているような、ペプチドディスプレイ法によって選択されたポリヌクレオチド配列をシャッフリングするために使うことができる。
生物薬学的薬剤の発展や分子生物学での増大する重要な局面は、ペプチドの又は、生物的巨大分子と相互作用するペプチド模倣物の、一次アミノ酸配列を含むペプチドの構造の同定である。あらかじめ決められた生物的巨大分子（例えば受容体）への結合のような、所望の構造又は機能的特性を持ったペプチドを同定する一つの方法は、ペプチドのアミノ酸配列によって与えられた所望の構造又は機能的特性を持つ個々のライブラリーのメンバーに関する、大きなライブラリー又はペプチドのスクリーニングを含む。
ペプチドライブラリーを作製するための直接的な化学合成法に加えて、いくつかの組換えＤＮＡ法もまた報告されている。一つの型はバクテリオファージ粒子又は細胞の表面にペプチド配列、抗体、又は他のタンパク質を提示することを含んでいる。一般的にこれらの方法において、それぞれのバクテリオファージ粒子又は細胞は、天然のバクテリオファージ粒子又は細胞タンパク質の配列に加えて提示された、ペプチドの単一の種類を提示する個々のライブラリーのメンバーとしてはたらく。それぞれのバクテリオファージ粒子、又は細胞は、特定の提示されたペプチド配列をコードするヌクレオチド配列情報を含んでいる。すなわち、提示されたペプチド配列は、単離されたライブラリーのメンバーのヌクレオチド配列の決定によって確認することができる。
【０４０９】
公知のペプチドディスプレイ法は、典型的にはバクテリオファージのコートタンパク質との融合体として、糸状のバクテリオファージの表面にペプチド配列を示すことを含んでいる。バクテリオファージライブラリーは、固定化されたあらかじめ決められた巨大分子又は小分子（例えば受容体）とインキュベートされうり、それによって、固定化された巨大分子と結合するペプチド配列を示しているバクテリオファージ粒子は、そのあらかじめ決められた巨大分子と結合するペプチド配列を示していない粒子から別々に分割されうる。固定化された巨大分子に結合したそのバクテリオファージ粒子（すなわち、ライブラリーのメンバー）を次に、続く、親和性の増強及びファージ複製の回のための選択されたバクテリオファージの亜集団を増幅するために、回収し、複製する。数回の親和性の増強及びファージ複製のあと、続いて選択されたバクテリオファージライブラリーのメンバーを単離し、そして、提示されたペプチド配列をコードしているヌクレオチド配列を決定し、それによりあらかじめ決められた巨大分子（たとえば、受容体）と結合するペプチドの配列を同定する。このような方法は、国際公開公報第９１／１７２７１号、国際公開公報第９１／１８９８０号、国際公開公報第９１／１９８１８号、及び国際公開公報第９３／０８２７８号にさらに詳しく記載されている。
後者のＰＣＴ出版物は、あらかじめ決められた巨大分子に強く結合するために利用される、典型的には可変配列からなる最初のポリペプチド部分及び、それぞれの融合タンパク質をコードしているＤＮＡベクターのようなＤＮＡに結合する第二のポリペプチド部分からなる、それぞれの融合タンパク質をもつ融合タンパク質ライブラリーの作製を含むような、ペプチドリガンドの提示のための組換えＤＮＡ法を記載している。形質転換された宿主細胞が融合タンパク質を発現させる条件下で培養されるとき、融合タンパク質は、それをコードしているＤＮＡベクターと結合する。宿主細胞を溶解させることで、融合タンパク質／ベクターＤＮＡ複合体は、バクテリオファージ粒子がファージに基づいた提示システムにおいてスクリニーングされるのと全く同様な手法で選択されたライブラリーのペプチド配列の同定の基礎としてはたらく選択された融合タンパク質／ベクターＤＮＡ複合体におけるＤＮＡベクターの複製及び配列決定により、あらかじめ決められた巨大分子に対してスクリーニングされうる。
【０４１０】
４．１６．５．７．１ ペプチド及びペプチド様ポリマー作製のためのハイブリット法
ペプチド及び類似の重合体ライブラリーを作製する他のシステムは、組換え及びインビトロ化学合成の方法という両方の局面を持っている。これらのハイブリッド法では、ライブラリーのメンバー（すなわち、ペプチド又はポリヌクレオチド）のインビトロ合成を行うために、細胞を含まない酵素的な機構が用いられる。ある方法の一つの型では、あらかじめ決められたタンパク質又はあらかじめ決められた色素分子と結合する能力のあるＲＮＡ分子が、選択及びＰＣＲ増幅を交互に繰り返すことで選択された（Ｔｕｅｒｋ及びＧｏｌｄ、１９９１、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ及びＳｚｏｓｔａｋ、１９９０）。同様の技術が、あらかじめ決められたヒト転写因子と結合するＤＮＡ配列を同定するために用いられた（Ｔｈｉｅｓｅｎ及びＢａｃｈ、１９９０、Ｂｅａｕｄｒｙ及びＪｏｙｃｅ、１９９２、国際公開公報第９２／０５２５８号、及び国際公開公報第９２／１４８４３号）。同様の方法により、インビトロ翻訳の技術が、関心対象のタンパク質の合成に使われており、大きなペプチドのライブラリーを作製する方法として提案されている。一般的には安定化されたポリソーム複合体を含む、インビトロ翻訳を元にしたこれらの方法は、国際公開公報第８８／０８４５３号、国際公開公報第９０／０５７８５号、国際公開公報第９０／０７００３号、国際公開公報第９１／０２０７６号、国際公開公報第９１／０５０５８号、及び国際公開公報第９２／０２５３６号にさらに記述されている。本出願者は、ライブラリーのメンバーがＤＮＡ結合活性を持つ第一のポリペプチド部分及びライブラリーのメンバーである独特のペプチド配列を持つ第二のポリペプチド部分からなる融合タンパク質を含む方法を記述している。このような方法は、他の方法の中で、細胞を含まないインビトロ選択の形式における使用に適している。
【０４１１】
４．１６．５．７．２ 提示されたペプチド配列
提示されたペプチドの配列の長さは変化されうり、典型的には、３アミノ酸長から５０００アミノ酸長、又はそれ以上、しばしば５アミノ酸長から１００アミノ酸長、そして、たいていは８アミノ酸長から１５アミノ酸長である。ライブラリーは、異なった長さの提示されたペプチド配列をもつライブラリーメンバーを含むことができ、又は、固定された長さの提示されたペプチド配列をもつライブラリーメンバーを含みうる。提示されたペプチド配列の一部又は全部は、ランダム、疑似ランダム、明確な一連のカーネルであったり、固定されているなどであることができる。本明細書に示されたディスプレイ法は、ポリソーム上の発生期のｓｃＦｖ又はファージ上に示されたｓｃｆｖのような一本鎖の抗体のインビボ提示及びインビトロ提示のための方法を含んでおり、これは可変領域配列及び結合特性の幅広い多様性を持つｓｃｆｖライブラリーの大規模なスクリーニングを可能にする。
４．１６．５．７．３ 配列フレームワークペプチドライブラリー
本発明はまた、ランダム配列、偽ランダムな配列、および定義された配列のフレームワークペプチドライブラリーを提供し、かつそれらのライブラリーを作製し、スクリーニングし、所望のやり方でペプチドまたはＲＮＡを改変する、受容体分子または関心対象のエピトープまたは遺伝子産物に結合する有用な組成物（例えば、一本鎖抗体を含むペプチド）を同定するための方法を提供する。ランダム配列、偽ランダムな配列、および限定配列のフレームワークペプチドを、ペプチドライブラリーメンバーのライブラリーから作製し、このライブラリーは、ディスプレイされるペプチドまたはディスプレイされるペプチドが合成されるポリヌクレオチド鋳型に接着する、ディスプレイされる一本鎖抗体を含む。接着方法は、選択される本発明の特定の態様に係って変えてもよく、ファージ粒子への封入または細胞への組み込みを含むことができる。
【０４１２】
４．１６．５．７．４ アフィニティーエンリッチメントを用いた目的特性を有するペプチドの選択
親和性の高い方法は、ペプチドと一本鎖抗体のかなり大きいライブラリーを選択でき、所望のペプチドまたは一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチド配列を選抜することができる。その後、ポリヌクレオチドを単離し、シャッフリングし、選抜されたペプチド（またはあらかじめ決定されたその一部）または一本鎖抗体（またはＶＨＩ、ＶＬＩまたはＣＤＲの一部分のみ）のアミノ酸配列を組み合わせて、再結合することができる。これらの方法を使用して、分子に対する所望の結合親和性を持つペプチドまたは一本鎖抗体を同定でき、シャッフリング過程を利用し、所望の高い親和性のペプチドまたはｓｃｆｖにすぐに収束することができる。その後、ペプチドまたは抗体は、任意の適当な使用（例えば、治療薬または診断薬として）のための通常の方法によって大量に合成できる。
本発明の重要な利点は、予想されるリガンド構造に関する情報が、関心対象のペプチド性リガンドまたはペプチド性抗体を単離することがあらかじめ必要でないことである。同定されるペプチドは、生物活性を持つことができ、その活性とは、選択される受容体分子に少なくとも特異的な結合親和性を含むことを意味し、かついくつかの例においては、さらに他の化合物の結合をブロックし、代謝経路を刺激または阻害し、シグナルまたはメッセンジャーとして機能し、細胞活性などを刺激または阻害できること含む。
【０４１３】
４．１６．５．７．５ アフィニティースクリーニングによるシャッフリング配列の選択
本発明は、あらかじめ決定された受容体（例えば、ペプチドホルモン受容体、細胞表面受容体、他のタンパク質に結合し、ヘテロ二量体などのような細胞内タンパク質複合体を形成する細胞内タンパク質のようなほ乳類のタンパク質受容体）、またはエピトープ（例えば、固定化タンパク質、糖タンパク質、オリゴ糖など）に結合する、ライブラリーメンバーのための新生ペプチド（一本鎖抗体を含む）をディスプレイするポリソームライブラリーをスクリーニングする親和性によって、選抜されるポリヌクレオチド配列のプールをシャッフリングするための方法もまた提供される。
任意のこれらの方法による最初の選抜（典型的には、受容体への結合物（例えば、リガンド）の親和性選抜による）で選択されるポリヌクレオチド配列は、プールされ、そのプールは、インビトロ組換えおよび／またはインビボ組換えによってシャッフリングされ、選抜された組換えポリヌクレオチド配列の集団を含むシャッフリングされたプールを作製する。選抜された組換えポリヌクレオチド配列は、その後少なくとも１回選抜される。その後の選抜で選抜されたポリヌクレオチド配列は、直接使用でき、配列決定でき、かつ／または１回またはそれ以上の追加的にシャッフリングされ、その後選抜されることができる。選択された配列は、例えば、選択される配列と実質的に同一の野生型配列または天然配列と戻し交配し、免疫原性が少なくてもよい天然型様の機能的ペプチドを作製することによって、中間的な配列（例えば、結合への実質的でない機能的な影響を持つ）をコードするポリヌクレオチド配列と戻し交配されることもできる。一般的には、戻し交配の際に、その後の選抜は、あらかじめ決定された受容体（リガンド）に結合する性質を保持するように適用される。
【０４１４】
選択された配列のシャッフリング前またはシャッフリング時に、配列を突然変異誘発することができる。１つの態様においては、選択されたライブラリーメンバーは、別個のライブラリーメンバーになる個々のコロニー（またはプラーク）のコレクションが作製される、原核生物ベクター（例えば、プラスミド、ファージミド、またはバクテリアファージ）へクローニングされる。個々の選抜されたライブラリーメンバーを、その後（例えば、部位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発、化学的突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発などによって）操作し、選抜されたライブラリーメンバーの配列に基づいて配列カーナルの相違を表すライブラリーメンバーのコレクションを作製できる。個々の選択されたライブラリーメンバーまたはプールの配列は、ランダム変異、偽ランダムな変異、限定カーナル変異（すなわち、可変残基部位と不変残基部位を含み、および／またはアミノ酸残基の限定された部分集合から選択される残基を含むことができる可変残基部位を含む）、コドンに基づいた変異などを、個々の選択されるライブラリーメンバー配列について部分的にまたは全長にわたって組み込むように操作されうる。選択された突然変異誘発ライブラリーメンバーは、その後、本明細書に記述されるインビトロおよび／またはインビボ組換えシャッフリングによってシャッフリングされる。
４．１６．５．７．６ 多数の個々のライブラリーメンバーから成るペプチドライブラリー 本発明はまた、本発明の大多数の個々のライブラリーメンバーを含むペプチドライブラリーであり、（１）前記の大多数の各々個々のライブラリーが、選択される配列のプールをシャッフリングすることによって作製され配列を含み、（２）各々個々のライブラリーメンバーが、可変ペプチド部分の配列もしくは可変ペプチド部分の配列または該大多数における別の個々のライブラリーメンバーの一本鎖抗体配列と異なる、一本鎖抗体部分の配列を含みライブラリーを提供する。
【０４１５】
４．１６．５．７．７ 生成物（ｐｒｏｄｕｃｔ−ｂｙ−ｐｒｏｃｅｓｓ）
本発明は、過程による生成物（ｐｒｏｄｕｃｔ−ｂｙ−ｐｒｏｃｅｓｓ）を提供し、あらかじめ決定された結合特異性を持つ選択されるポリヌクレオチド配列が以下の過程によって形成される：（１）あらかじめ決定された受容体（例えば、リガンド）またはエピトープ（例えば、抗原高分子）に対して、ディスプレイされるペプチドまたはディスプレイされる一本鎖抗体ライブラリーをスクリーニングし、かつあらかじめ決定された受容体またはエピトープに結合するライブラリーメンバーを同定および／または濃縮し、選択されるライブラリーメンバーのプールを作製する過程、（２）あらかじめ決定されたエピトープに結合し、それによってライブラリーから単離および／または濃縮され、シャッフリングされたライブラリーを作製する、選択される（またはそのコピーを増幅もしくはクローニングされる）ライブラリーメンバーを組換えによってシャッフリングする過程、および（３）あらかじめ決定された受容体（例えば、リガンド）またはエピトープ（例えば、抗原高分子）に対してシャッフリングされたライブラリーをスクリーニングし、あらかじめ決定された受容体またはエピトープに結合するシャッフリングされたライブラリーメンバーを同定および／または濃縮し、選択されるシャッフリングされたライブラリーメンバーのプールを作製する過程。
【０４１６】
４．１６．５．８ 抗体のディスプレイ及びスクリーニング方法
本発明は、開示した方法のいずれかによってインビトロ及び／またはインビボで組換えを再編成するため、また抗体のディスプレイ方法によって選択されたいずれかの組み合わせ、ポリヌクレオチド配列で再編成するために用いることができ、そこでは関連するポリヌクレオチドが、表現型について（例えば、予め決められた抗原（リガンド）を結合する親和性について）スクリーニングされるディスプレイ抗体をコードしている。
さまざまな遺伝分子的アプローチは、免疫グロブリン鎖に存在するであろう極めてたくさんの異なる可変領域によって表示された膨大な免疫学上のレパートリーを捕らえるように工夫されてきた。天然に発生する生殖系列の免疫グロブリンの重鎖の遺伝子座は、多様性セグメント遺伝子であるタンデムアレイの上流側に位置する可変セグメント遺伝子からなる分離タンデムアレイを含み、それ自体は連結する（ｉ）領域遺伝子のタンデムアレイの上流側に位置していて、これは定常領域遺伝子の上流側に位置している。Ｂリンパ球が発生する課程でＶ−Ｄ−Ｊ配列が生じるが、その際重鎖の可変領域遺伝子（ＶＨ）が転位して融合したＤセグメントを形成し、続いてＶセグメントとの転位が起こってＶ−Ｄ−Ｊ連関生成物遺伝子が、即ち豊富に転位が起きたのであれば重鎖の機能的な可変領域（ＶＨ）をコードするＶ−Ｄ−Ｊ連関生成遺伝子が形成される。同様に軽鎖の遺伝子座は、数個のＶセグメントの一つを数個のＪセグメントと転位することによって、軽鎖の可変領域（ＶＬ）をコードする遺伝子を形成できる。
４．１６．５．８．１ 配列多様性
免疫グロブリンでありうる可変領域の非常に多くのレパートリーは、Ｂ細胞の発生の転位課程でＶ及びｉセグメント（また、重鎖の遺伝子座の場合ではＤセグメント）を連結する非常に多くの組み合わせの可能性から部分的に誘導される。重鎖の可変領域における更なる配列多様性は、Ｖ−Ｄ−Ｊ連結する場合にＤセグメントが不均一に転位することから、またＮ領域が付加することから生じる。さらに特異的なＢ細胞クローンの抗原選択性は、重鎖と軽鎖の可変領域の一方または両方に非生殖系列の突然変異を持つより高度な親和性可変体について選択され、それは「親和的成熟化」または「親和的鋭敏化」ともいわれる現象である。通常これらの「親和的鋭敏化」突然変異は、可変領域の特定の領域に、最も一般的には相補性−決定領域（ＣＤＲ）に密集している。
【０４１７】
４．１６．５．８．２ 原核細胞による発現系
抗原刺激性のβ細胞が発生する（即ち免疫化する）ことにより親和性の高い免疫グロブリンが産生し同定する場合の多くの制限に対処するために、特定の抗原に対する高親和性の抗体をスクリーニングできる組み合わせ抗体ライブラリーを作製すべく操作できる種々の前核細胞の発現系を開発した。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）及びバクテリオファージ系における抗体発現についての最近の進歩（「ペプチドディスプレイの別法（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｍｅｔｈｏｄｓ）」下記参照）は、実質的に何らかの特異性が、特徴的なハイブリドーマ由来の抗体遺伝子をクローニングするか、または抗体遺伝子ライブラリー（例えば、Ｉｇ ｃＤＮＡから）を用いてノボ選択するかいずれかによって得ることができるという可能性を生じた。
抗体のコンビナトリアルライブラリーは、バクテリオファージプラークとして、または溶原菌のコロニーとしてスクリーニングできるバクテリオファージラムダ発現系で生じた（Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｃａｔｏｎ及びＫｏｐｒｏｗｓｋｉ、１９９０、Ｍｕｌｌｉｎａｘら、１９９０、Ｐｅｒｓｓｏｎら、１９９１）。バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリー及びラムダファージ発現ライブラリーについての種々の態様が記載されている（Ｋａｎｇら、１９９１、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｂｕｒｔｏｎら、１９９１、Ｈｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１、Ｃｈａｎｇら、１９９１、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、１９９１、Ｍａｒｋｓら、１９９１， ｐ．５８１、Ｂａｒｂａｓら、１９９２、Ｈａｗｋｉｎｓ及びＷｉｎｔｅｒ、１９９２、Ｍａｒｋｓら、１９９２、すべて参照文献としてこの明細書に組み入れられる）。一般にバクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーは、固定化された（例えば、親和性クロマトグラフィーによって反応性のファージを富化するためにクロマトグラフィー樹脂に共有結合させることによって）及び／または標識された（例えば、プラーク即ちコロニー輸送をスクリーニングするため）受容体（例えば、ポリペプチド、炭水化物、糖タンパク質、核酸）を用いてスクリーニングされる。
【０４１８】
４．１６．５．８．３ 一本鎖断片可変ライブラリー
ある特定の有利なアプローチでは、いわゆる一本鎖断片可変（ｓｃｆｖ）ライブラリーが利用されていた（Ｍａｒｋｓら、１９９２， ｐ．７７９、Ｗｉｎｔｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９９１、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、Ｍａｒｋｓら、１９９１， ｐ．５８１、Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９９０、Ｃｈｉｓｗｅｌｌら、１９９２、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、及びＨｕｓｔｏｎら、１９８８）。バクテリオファージ外殻タンパク質でディスプレイされたｓｃｆｖライブラリーについての種々の態様が記載されている。
１９８８年に初めてであるが、一本鎖のＦｖ断片アナログとその融合タンパク質が、抗体操作法によって実際に生成された。この第１段階には通常、望ましい結合特性を備えたＶＨ及びＶＬドメインをコードする遺伝子を得る段階が関与しており、即ちこれらのＶ遺伝子は、特異的なハイブリドーマ細胞系統から単離してもよいし、組み合わせＶ遺伝子ライブラリーから選択してもよいし、あるいはＶ遺伝子合成法によって作製してもよい。この一本鎖Ｆｖは構成要素のＶ遺伝子を、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３または等価のリンカーペプチドのような適当に設計されたリンカーペプチドをコードするオリゴヌクレオチドと連結することによって形成される。このリンカーは、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ’のいずれかの順番で、一つ目のＶ領域のＣ末端と、二つ目のＮ末端を橋掛けする。原理的にはｓｃｆｖブリッジ部位は、その元の抗体結合部位の親和性と特異性の両方を忠実に複製できる。
このようにｓｃｆｖ断片は、自由度の高いリンカー断片によって一本のポリペプチド鎖に連結したＶＨドメインとＶＬドメインとを含む。ｓｃｆｖ遺伝子を組み入れてからそれらをファージミドにクローニングし、バクテリオファージＰＩＩＩ（遺伝子３）外殻タンパク質を持つ融合タンパク質としてＭ１３ファージ（または同様の繊維状バクテリオファージ）の先端で発現させる。対象の抗体を発現するファージを富化することは、予め決定したエピトープ（例えば標的抗原、受容体）に結合するｓｃｆｖ群をディスプレイする組換えファージを集めることで達成できる。
【０４１９】
ライブラリーのメンバーである連結されたポリヌクレオチドは、スクリーニング段階または選択段階の後で行なわれるライブラリーメンバーの複製の際の基礎を提供するとともに、ディスプレイされたペプチド配列、またはＶＨ及びＶＬアミノ酸配列の同一性をヌクレオチド配列によって決定する基礎も提供する。ディスプレイされたペプチド即ち一本鎖の抗体（例えば、ｓｃｆｖ）及び／もしくはそのＶＨ及びＶＬドメイン、またはそれらのＣＤＲをクローニングして適当な発現系で発現させるとよい。よくあることに単離されたＶＨ及びＶＬドメインをコードするポリヌクレオチドは、定常領域（ＣＨ及びＣＬ）をコードするポリヌクレオチドに連結することによって、完全な抗体（例えば、キメラまたは全くのヒト）、抗体断片などをコードするポリヌクレオチドを形成できる。単離されたＣＤＲをコードするポリヌクレオチドが、適当な可変領域のフレームワーク（及び任意で定常領域）をコードするポリヌクレオチドに移植されることで（例えば、ヒト様の又は完全にヒトの）完全な抗体、抗体断片などをコードするポリヌクレオチドを形成できることもよくある。抗体は、免疫親和性クロマトグラフィーによって抗原の調整的量を単離するために利用できる。このような抗体のさまざまな利用法は、疾患（たとえば、新生組織形成）の診断及び／またはステージ分類すること、また例えば、新生組織形成、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、心臓血管系疾患、感染症などのような疾患を治療するための治療的応用である。
【０４２０】
４．１６．５．８．４ ＳＣＦＶライブラリーの相同的多様性の増加
結合種（イディオタイプスペクトル）のレパートリーを広げるべくｓｃｆｖライブラリーの組み合わせ多様性を大きくするためのさまざまな方法が報告されている。ＰＣＲを利用することで可変領域が、特異的なハイブリドーマ源から、または非免疫細胞を形成する遺伝子ライブラリーとしてのいずれかで迅速にクローニングされることが可能になり、組み合わせることのできるＶＨ及びＶＬカセットの分類に組み合わせ多様性が与えられる。さらにＶＩＩ及びＶＬカセットはそれ自体、例えばランダム、偽ランダム、または定方向突然変異誘発によって多様化されるのであろう。通常ＶＨ及びＶＬカセットは、相補的決定領域（ＣＤＲＳ）内、またはその近くで、多いのは第３のＣＤＲ３で多様化される。酵素的逆ＰＣＲの突然変異誘発は、ｓｃｆｖ部位指向性ハイブリッドからなる比較的大きなライブラリーを構築するための簡単で信頼性のある方法であることがわかっていて（Ｓｔｅｍｍｅｒら、１９９３）、エラープローンＰＣＲ及び化学的突然変異誘発を持つのと同様である（Ｄｅｎｇら、１９９４）。Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９９３）は、変性オリゴヌクレオチドＰＣＲにより部位指向性のランダム化法を用いた抗体ｓｃｆｖ断片の半合理的設計法と、得られたｓｃｆｖハイブリッドの続くファージディスプレイ法を示した。Ｂａｒｂａｓ（Ｂａｒｂａｓら、１９９２）は、ヒト破傷風毒素結合性Ｆａｂの合成ＣＤＲ領域において配列をランダム化することにより、偏りのある可変領域配列を利用して得られるレパートリーサイズを制限する問題を回避するよう計画した。
【０４２１】
ＣＤＲランダム化には、重鎖ＣＤＲ３のみの場合は約１×１０２０個のＣＤＲを作製する能力があり、重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２の変異体と、軽鎖のＣＤＲ１−３の変異体の数もだいたい同じである。個々に用いたりまたは一緒に用いたりする場合、重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲランダム化の組み合わせ可能性にとって、その大部分が非結合性であるようなすべてのあり得る組み合わせを表示するクローンライブラリーを作製するためには極端に多くのバクテリオファージクローンを生じさせる必要がある。このような大量の一次形質転換体を生成させることは、現在の形質転換技術とバクテリオファージディスプレイ系を用いても実行できない。例えばＢａｒｂａｓ（Ｂａｒｂｓら、１９９２）は５×１０７の形質転換体を発生させたにすぎず、それは徹底的にランダム化したＣＤＲの潜在的多様性のうちほんの少しの画分を表示しているにすぎない。
これらの実質的な限界があるにもかかわらず、ｓｃｆｖのバクテリオファージディスプレイによって、様々な有用な抗体と抗体融合タンパク質がすでに得られている。有効な腫瘍細胞の溶解を仲介することがわかっている二特異性の一本鎖抗体がある（Ｇｒｕｂｅｒら、１９９４）。抗Ｒｅｖ ｓｃｆｖが細胞内で発現すると、インビトロでのＨＩＶ１ウイルスの複製が阻害されることがわかっており（Ｄｕａｎら、１９９４）、また抗２１ｒａｒ、ｓｃｆｖが細胞内で発現すると、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞の減数分裂の出現が阻害されることがわかっている（Ｂｉｏｃｃａら、１９９３）。ＨＩＶの感染を診断するために利用できる組換えｓｃｆｖも報告されており、ｓｃｆｖの診断上の有効性を証明している（Ｌｉｌｌｅｙら、１９９４）。ｓｃｆｖが第２のポリペプチドである例えば毒素または繊維素溶解活性化タンパク質に結合している融合タンパク質も報告されている（Ｈｏｌｖｏｓｔら、１９９２、Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、１９９３）。
【０４２２】
４．１６．５．８．５ ＣＤＲを再混合するためのインビトロおよびインビボ再編成法の使用 抗体多様性が広く、かつ潜在性のある配列組み合わせからなるほんの小さな画分しかカバーできない従来のＣＤＲ突然変異誘発法とランダム化法の持つ多くの限界に対処可能なｓｃｆｖライブラリーを作製することが可能であるならば、治療用と診断用に使用するにふさわしいｓｃｆｖ抗体の量と品質が大きく改善できるであろう。このことに対応するため、本発明のインビトロとインビボにおける再編成法が、選択されたディスプレイ抗体由来で入手できる核酸から得られた（通常は、ＰＣＲ増幅またはクローニングによって得られる）ＣＤＲを組み換えるために用いられる。このようなディスプレイ抗体は、細胞上、バクテリオファージ粒子上、ポリソーム上、またはコードしている核酸と関連する適当な抗体のディスプレイ系にディスプレイされるであろう。異なる場合ではＣＤＲは、抗体産生細胞（例えば、免疫化した野生型マウス、ヒト、または国際公開公報第９２／０３９１８号、国際公開公報第９３／１２２２７号、及び国際公開公報第９４／２５５８５号に記載されているようヒト抗体を作製する能力のあるトランスジェニックマウスから得られる血漿細胞／脾臓細胞）由来のｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）からまず得られる。
これらの方法のどれかによって抗原（例えばリガンド）に結合するディスプレイ抗体について通常は親和性で選択することによる最初の選択ラウンドで選択されたポリヌクレオチド配列は、インビトロ及び／またはインビボでの組換えを行って再編成することで、特定するとＣＤＲの再編成（一般には、重鎖のＣＤＲを他の重鎖のＣＤＲと再編成し、また軽鎖のＣＤＲを他の軽鎖のＣＤＲと再編成する）を行うことで、組み換えられて選択されたポリヌクレオチド配列の集団を含む再編成されたプールを作製できる。この組換えられて選択されたポリヌクレオチド配列を、ディスプレイされた抗体として選択フォーマットに発現させ、そして続く少なくとも一回の選択ラウンドにかける。この続く選択ラウンドで選択されたポリヌクレオチド配列は、直接的に用いたり、配列を決めたり、及び／または望ましい結合親和性の抗体が得られるまで再編成と配列選択からなる少なくとも一回の更なるラウンドにかけたりすることができる。選択された配列はまた、中性抗体フレームワーク配列（即ち、抗原結合性に実質的な機能上の影響がない）をコードするポリヌクレオチド配列とともに戻し交雑することもでき、それは例えば、ヒト様配列抗体を産生するヒト可変領域のフレームワークを用いて戻し交雑することによる。一般に戻し交雑を行う課程で続いて選択を行うことにより、予め決定した抗原に結合する性質を保持できる。
【０４２３】
４．１６．５．８．６ 選択されたＳＣＦＶライブラリーの平均結合親和性の調節
別法では、即ち注目した変法と組み合わせた場合では、標的エピトープの抗原価を帰ることで選択されたｓｃｆｖライブラリーのメンバーの平均的な結合親和性をコントロールできる。標的エピトープは、競合するエピトープを含有させることによったり、希釈したり、あるいは当業者に既知の他の方法によったりしてて種々の密度で表面即ち基質に結合できる。予め決められたエピトープの密度（抗原価）が高いと、比較的低い親和性のｓｃｆｖライブラリーメンバーを富化するために利用でき、一方密度（抗原価）が低いと、高い親和性のｓｃｆｖライブラリーのメンバーが好適に富化できる
４．１６．５．８．７ 多様な可変部位の作製
種々の異なるセグメントを作製するためには、ランダム、偽ランダム、またはペプチド配列の明らかになっている配列中心部のセットをコードする合成オリゴヌクレオチドの集まりを、予め決められた部位（例えば、あるＣＤＲ）に連結することで挿入できる。同様に一本鎖抗体カセットの一つまたはそれ以上のＣＤＲの配列多様性は、部位指向性の突然変異誘発、ＣＤＲ置換などを用いてＣＤＲを突然変異させることによって広げることが可能である。得られるＤＮＡ分子は、再編成する前にクローニング及び増幅するために宿主に伝達してもよいし、また直接用いてもよく（即ち、宿主細胞にて増殖させると起こるであろう多様性の喪失を避けることができる）、選択されたライブラリーメンバーが続いて再編成される。
対象物の可変セグメントペプチド配列、または対象物の一本鎖抗体をコードするディスプレイされたペプチド／ポリヌクレオチド複合体（ライブラリーのメンバー）は、親和的富化技術によってライブラリーから選択される。これは、受容体、他の巨大分子、または他のエピトープ種のような対象物のペプチド配列に特異的な、固定化された巨大分子、即ちエピトープの手段によって達成される。親和的選択段階を繰り返すことで、望ましい配列をコードするライブラリーメンバーを富化でき、続いてそれを、配列決定のため、及び／または更なる増殖と親和的富化のためにプールし再編成すべく単離すればよい。
【０４２４】
望ましい特異性を持たないライブラリーメンバーは、洗浄して除去される。必要とされる洗浄の程度及び厳格性は、対象物のそれぞれのペプチド配列または一本鎖抗体について、また固定化された所定の巨大分子またはエピトープについて決定すればよい。確かな程度のコントロールは、結合のためのインキュベート及び続く洗浄の条件を調節することによって回復した新生ペプチド／ＤＮＡ複合体の結合特性に対して発揮できる。温度、ｐＨ、イオン強度、二価のカチオン濃度、及び洗浄の容積と期間は、固定化巨大分子に対する親和性の特定の範囲内で新生ペプチド／ＤＮＡ複合体に対して選択できる。ゆっくりとした解離速度に基づいた選択は通常親和性が高いと予測され、最も実際的な経路であることが多い。これは、飽和量の遊離の所定の巨大分子の存在でインキュベートを続けることによるか、あるいは洗浄の容量、回数、及び長さを増加することによって行うことができる。それぞれの場合において、解離した新生ペプチド／ＤＮＡまたはペプチド／ＲＮＡ複合体の再結合が抑制され、時間がたつにつれて新生ペプチド／ＤＮＡまたはペプチド／ＲＮＡ複合体のだんだん高い親和性が回復する。
結合段階と洗浄段階をさらに改変することによって、特定の特徴を備えたペプチドを発見できる。いくつかのペプチドの親和性は、イオン強度即ちカチオン濃度に依存している。これは、ペプチドからそのタンパク質を除去するために緩やかな条件が要求される場合、種々のタンパク質の親和的精製で利用できるペプチドにとって有用な特徴である。
ｓｃｆｖライブラリーを、異なる結合特性を持つｓｃｆｖの多様性について同時にスクリーニングできるように、ある変法には多重結合性標的（多エピトープ種、多受容体種）の使用が関与している。ｓｃｆｖライブラリーの大きさが潜在的なｓｃｆｖ配列の多様性を制限することが多いため、可能な限り大きいサイズのｓｃｆｖライブラリーが我々には通常望まれる。たくさんの非常に大きなポリソームｓｃＦｖディスプレイライブラリーを生じる時間と経済性を考慮すると、極端に負担が重くなる可能性がある。この実質的な問題を回避するために、多数の前もって決定したエピトープ種（受容体種）を一つのライブラリーで同時にスクリーニングしたり、あるいは多数のエピトープ種に対して連続的なスクリーニングを利用したりできる。一変法においては、それぞれが別個のビーズ（または部分的な集合のビーズ）にコードされている多数の標的エピトープ種を、適当な結合条件下でポリソームディスプレイｓｃｆｖライブラリーと混合してインキュベートしてもよい。集めたビーズは多数のエピトープ種を含んでいて、その後親和的選択によってｓｃｆｖライブラリーのメンバーを単離するために用いることができる。一般に連続的な親和性スクリーニングラウンドには、ビーズからなる同じ混合物、それらの部分集合、または一つもしくは二つの個々のエピトープ種のみを含むビーズが関与する。このアプローチは効率的なスクリーニングを提供し、実験室の自動化、バッチ処理、及び高処理量のスクリーニング法と両立できる。
【０４２５】
４．１６．５．８．８ ペプチドライブラリーまたは一本鎖抗体ライブラリーを多様化するための技術
さまざまな技術が、ペプチドライブラリーまたは一本鎖抗体ライブラリーを多様化したり、予め決められた巨大分子またはエピトープに対して十分な結合作用を持つように当てはめられた早期のラウンドで見いだされた可変セグメントのペプチドのあたりを再編成を行う前または再編成と同時に多様化したりするために本発明では用いられる。一アプローチでは、ポジティブに選択されたペプチド／ポリヌクレオチド複合体（親和的富化を行う早期のラウンドで同定された複合体）を、活性なペプチドの同定を調べるために配列決定する。続いてオリゴヌクレオチドを、それぞれの段階で組み入れられた低レベルのすべての塩基を用いてこれらの活性なペプチド配列に基づいて合成することによって、一次のオリゴヌクレオチド配列のわずかな変位を形成できる。続いて（わずかに）変性したオリゴヌクレオチドからなるこの混合物を、適当な位置で可変セグメント配列にクローニングする。この方法は出発物質のペプチド配列からなる計画的な、コントロールされた変異体を生成し、それを次に再編成することができる。しかしながら、個々の陽性発生期のペプチド／ポリヌクレオチド複合体が突然変異誘発の前に配列決定されることが必要で、したがってそれは、少数の回収された複合体の多様性を拡張する際、また高い結合親和性及び／または高い結合特異性を持つ変異体を選択する際に有用である。一変法、即ちポジティブに選択されたペプチド／ポリヌクレオチド複合体（特に可変領域配列）の突然変異誘発性のＰＣＲ増幅では、その増幅生成物がインビトロ及び／またはインビボで再編成され、そして一回またはそれ以上の追加のスクリーニングラウンドが配列決定の前に行なわれる。同様の一般的なアプローチを一本鎖の抗体を用いて行うことによって、通常は再編成の前か再編成と同時にＣＤＲ、または隣接するフレームワーク領域を多様化することによって、結合親和性／特異性を多様化し、高めることができる。望ましい場合には、再編成反応に、選択されたライブラリーのメンバーとインビトロで組み換えることのできる突然変異誘発性のオリゴヌクレオチドをスパイクすることができる。こうして合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲが生成したポリヌクレオチド（間違いが起こりやすいか忠実度の高い方法によって合成される）の混合物をインビトロで再編成混合物に添加し、得られる再編成ライブラリーメンバー（再編成物）に組み入れるとよい。
【０４２６】
４．１６．５．８．９ ＣＤＲ変異体一本鎖抗体ライブラリーの作製
シャッフリングについての本発明は、ＣＤＲ変異体一本鎖抗体からなる大きなライブラリーの生成を可能にする。このような抗体を生成するための一方法は、合成のＣＤＲを一本鎖抗体に挿入すること、及び／または再編成を行う前もしくは再編成と同時にＣＤＲランダム化を行うことである。この合成ＣＤＲカセットの配列は、ヒトＣＤＲの既知の配列データを参照することによって選択されるし、また次の指針に従って実務者の判断で選択される。合成ＣＤＲは既知のＣＤＲ配列に少なくとも４０パーセントの位置的配列同一性を持っており、好ましくは既知のＣＤＲ配列に対して少なくとも５０〜７０パーセントの位置的配列同一性を持っているであろう。例えば、合成ＣＤＲ配列の集団は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、１９９１）に列挙された天然に発生するヒトＣＤＲ配列に基づいてオリゴヌクレオチド配列の集団を合成することによって作製できる。即ち、合成ＣＤＲのプールを解釈することによって、少なくとも一つの既知の天然に発生するヒトＣＤＲ配列に対して少なくとも４０パーセントの配列同一性を備えたＣＤＲペプチド配列をコードできる。また天然に発生するＣＤＲ配列の集団は、頻繁に起こる残基の位置（即ち、既知のＣＤＲ配列の少なくとも５パーセントで）で用いられるアミノ酸が対応する位置で合成ＣＤＲに組み入れられるように、生成した共通配列と比較することができる。一般には数個（例えば３個〜約５０個）の既知のＣＤＲ配列が比較され、既知のＣＤＲの間で観察された天然の配列の変異が作表され、そして観察された天然の配列の変異のうちのすべてまたはほとんどの置換を包含するＣＤＲペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチドの集合が合成される。例えば限定するわけではないが、ヒトＶＨ ＣＤＲ配列の集団が、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、またはＡｓｐのいずれかからなるカルボキシ末端のアミノ酸を持っている場合、合成ＣＤＲオリゴヌクレオチド配列のプールは、カルボキシ末端のＣＤＲ残基がこれらのアミノ酸のどれかにうまくなれるように設計される。ある態様では、ＣＤＲ配列の集団における残基の位置に天然に発生する残基以外の残基が導入され、即ち保存的なアミノ酸の置換が頻繁に導入され、そして５個までの残基の位置が変化することによって、既知の天然に発生するＣＤＲ配列に比較できるような非保存的アミノ酸置換を組み入れることができる。このようなＣＤＲ配列は、一次ライブラリーのメンバー（最初のラウンドスクリーニングの前）で用いることもできるし、及び／または選択されたライブラリーメンバーの配列のインビトロでの再編成反応をスパイクするために用いることもできる。明らかになった配列及び／または変性した配列からなるこのようなプールを構築することは、当業者によって容易に達成されるであろう。
【０４２７】
合成ＣＤＲ配列の集団は、天然に発生するＣＤＲ配列であるとは知られていない少なくとも一つのメンバーを含んでいる。重鎖ＣＤＲにＮ領域の付加に対応するランダム配列または偽ランダム配列の一部分を含んでいるか、あるいは含んでいないかは、実務者の判断の範疇である。Ｎ領域の配列は、Ｖ−Ｄ及びＤ−Ｊ連結部に発生している１個から約４個のヌクレオチドの範囲にある。合成重鎖ＣＤＲ配列の集団は、少なくとも約１００個の特有のＣＤＲ配列、通常は少なくとも約１，０００個の特有のＣＤＲ配列、好ましくは少なくとも約１０，０００個の特有のＣＤＲ配列、より頻繁には５０，０００個以上の特有のＣＤＲ配列からなるが、しかしながら通常は、集団に含まれる特有のＣＤＲ配列は約１×１０６個以上にはならないものの、時に１×１０７から１×１０８の特有のＣＤＲ配列が存在しており、それは特に、保存的アミノ酸置換基が天然に発生するヒトＣＤＲにおけるその位置に存在しないかまれにしか存在しない（即ち０．１パーセント以下）位置で保存的アミノ酸置換が可能になった場合である。一般に、ライブラリーに含まれる特有のＣＤＲ配列の数は、ファクター１０以上でライブラリーにおける一次の形質転換体について予測された数を越えないはずである。このような一本鎖の抗体は一般に、少なくとも１×１０ｍ−１、好ましくは約５×１０７Ｍ−１の親和性を備え、より好ましくは少なくとも１×１０８Ｍ−１から１×１０９Ｍ−１もしくはそれ以上の親和性を備えており、時に１×１０１０Ｍ−１もしくはそれ以上にまで大きな親和性を備えている。よくあるのは、予め決められた抗原がヒトタンパク質、例えばヒト細胞抗原（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＬ−２受容体、ＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体）、他のヒト生物学的巨大分子（例えば、トロンボモジュリン、プロテインＣ、炭水化物抗原、シアリルルイス抗原、Ｌセレクチン）、または非ヒト疾患関連の巨大分子（例えば、細菌性ＬＰＳ、ビリオンキャプシドタンパク質もしくはエンベロープ糖タンパク質）などようなヒトタンパク質である。
【０４２８】
４．１６．５．８．１０ 発現システム
望ましい特異性の高親和性一本鎖抗体を、さまざまなシステムで操作して発現できる。例えば、ｓｃｆｖは植物で産生され（Ｆｉｒｅｋら、１９９３）、前核細胞系で容易に作製される（Ｏｗｅｎｓ及びＹｏｕｎｇ、１９９４、Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＢｉｒｄ，１９９１）。さらに一本鎖抗体は、完全抗体またはそのさまざまな断片を構築するための基礎として用いることができる（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、１９９４）。可変領域をコードする配列を単離でき（例えば、ＰＣＲ増幅またはサブクローニングによって）、そして望ましいヒト定常領域をコードする配列にスプライシングすることによって、免疫原性が小さくなることが好まれるヒトの治療的使用法のためのより好ましいヒト配列抗体をコードできる。結果物の完全にヒトをコードする配列を持つポリヌクレオチドは宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞における発現ベクターから）で発現させることが可能で、そして薬学的製剤用に生成することができる。
ＤＮＡ発現構築物には通常、自然界に関連するかまたは異型のプロモーター領域を含むコード配列に機能的に結合した発現調節ＤＮＡ配列が含まれる。好ましくはこの発現調節配列は、真核生物の宿主細胞を形質転換したりトランスフェクトしたりできるベクターに含まれる真核性のプロモーターシステムである。一旦ベクターが適当な宿主に導入されると、宿主はヌクレオチド配列を高レベルで発現させ、また突然変異体が「操作した」抗体を収集し精製するのに好ましい条件下に維持される。
前述したようにＤＮＡ配列は、その配列が発現調節配列に機能的に結合した後で宿主で発現させることができる（即ち、構造遺伝子の転写及び翻訳を確実にするように位置づけられる）。これらの発現ベクターは、宿主の染色体ＤＮＡのエピソームか内在性部分のいずれかとして宿主の微生物で通常は複製できる。一般に発現ベクターは、選択マーカーである例えばテトラサイクリンまたはネオマイシンを含むことによって望ましいＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出が可能になる（例えば、参照文献としてこの明細書に組み入れられる米国特許第４，７０４，３６２号参照）。
【０４２９】
４．１６．５．８．１１ 高等動物の組織培養
望ましい特異性の高親和性一本鎖抗体を、さまざまなシステムで操作して発現できる。例えば、ｓｃｆｖは植物で産生され（Ｆｉｒｅｋら、１９９３）、前核細胞系で容易に作製される（Ｏｗｅｎｓ及びＹｏｕｎｇ、１９９４、Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＢｉｒｄ，１９９１）。さらに一本鎖抗体は、完全抗体またはそのさまざまな断片を構築するための基礎として用いることができる（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、１９９４）。可変領域をコードする配列を単離でき（例えば、ＰＣＲ増幅またはサブクローニングによって）、そして望ましいヒト定常領域をコードする配列にスプライシングすることによって、免疫原性が小さくなることが好まれるヒトの治療的使用法のためのより好ましいヒト配列抗体をコードできる。結果物の完全にヒトをコードする配列を持つポリヌクレオチドは宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞における発現ベクターから）で発現させることが可能で、そして薬学的製剤用に生成することができる。
ＤＮＡ発現構築物には通常、自然界に関連するかまたは異型のプロモーター領域を含むコード配列に機能的に結合した発現調節ＤＮＡ配列が含まれる。好ましくはこの発現調節配列は、真核生物の宿主細胞を形質転換したりトランスフェクトしたりできるベクターに含まれる真核性のプロモーターシステムである。一旦ベクターが適当な宿主に導入されると、宿主はヌクレオチド配列を高レベルで発現させ、また突然変異体が「操作した」抗体を収集し精製するのに好ましい条件下に維持される。
前述したようにＤＮＡ配列は、その配列が発現調節配列に機能的に結合した後で宿主で発現させることができる（即ち、構造遺伝子の転写及び翻訳を確実にするように位置づけられる）。これらの発現ベクターは、宿主の染色体ＤＮＡのエピソームか内在性部分のいずれかとして宿主の微生物で通常は複製できる。一般に発現ベクターは、選択マーカーである例えばテトラサイクリンまたはネオマイシンを含むことによって望ましいＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出が可能になる（例えば、参照文献としてこの明細書に組み入れられる米国特許第４，７０４，３６２号参照）。
【０４３０】
酵母のような真核の微生物に加え、哺乳動物の組織細胞培養物も本発明のポリペプチドを産生するために用いることができる（参照文献としてこの明細書に組み入れられる、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、１９８７参照）。無傷の免疫グロブリンを分泌する能力のあるたくさんの好ましい宿主細胞系がこの技術分野において開発されているため、真核細胞が実際には好ましく、それにはＣＨＯ細胞系、種々のＣＯＳ細胞系、Ｈｅｌａ細胞、及び骨髄腫細胞系が含まれるが、好ましくは形質転換したＢ細胞またはハイブリドーマである。これらの細胞に対する発現ベクターには、例えば複製起点、プロモーター、エンハンサー（Ｑｕｅｅｎら、１９８６）、及びリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、転写終結配列といった必要な処理情報部位のような発現調節配列が含まれる。好ましい発現調節配列は、免疫グロブリン遺伝子、部位メガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、及び同様のものから誘導されたプロモーターである。
真核生物のＤＮＡ転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増大させることができる。エンハンサーは、プロモーターによる転写を増加させる１０ｂｐ〜３００ｂｐのシス作用配列である。エンハンサーは、転写ユニットに対して５１または３１のいずれかの場合に転写を効率的に増加させることが可能である。またそれらがイントロン内、またはそれ自体のコード配列内に存在していると効率的である。通常ウイルスのエンハンサーが用いられ、即ちＳＶ４０エンハンサー、部位メガロウイルスのエンハンサー、ポリオーマのエンハンサー、及びアデノウイルスのエンハンサーが含まれる。哺乳動物系から得られるエンハンサー配列も一般的に用いられ、例えばマウスの免疫グロブリン重鎖のエンハンサーである。
また哺乳動物の発現ベクター系には通常、選択可能なマーカー遺伝子が含まれる。適当なマーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）、または薬物耐性を与える前核細胞遺伝子が挙げられる。最初の二つのマーカー遺伝子は、増殖培地にチミジンを添加しないところでは増殖する能力のない突然変異細胞系を使用する場合に好まれる。形質転換された細胞はその後、補充されていない培地で増殖する能力により同定できる。マーカーとして有用な前核細胞の薬物耐性遺伝子の例には、Ｇ４１８、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンに対する耐性を提供する遺伝子が含まれる。
【０４３１】
対象のＤＮＡセグメントを含むベクターは、細胞性宿主のタイプに応じて周知の方法により宿主細胞に移すことができる。例えば塩化カルシウムトランスフェクションは前核細胞に対して一般に利用され、これに対してリン酸カルシウム処理、リポフェクション、またはエレクトロポレーションは、他の細胞性宿主に対して利用できる。哺乳動物の細胞を形質転換するために用いられる他の方法には、ポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション、及びミクロー注入法の利用が含まれる（一般的にはＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８２及び１９８９参照）。
一旦発現すると、抗体、個々の突然変異した免疫グロブリン鎖、突然変異した抗体断片、及び本発明の他の免疫グロブリンポリペプチドは、この技術分野で標準的な方法、即ち硫酸アンモニウム沈殿法、画分カラムクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法などを含む方法（一般的にはＳｃｏｐｅ、１９８２）により精製できる。上記に記載したように部分的または均質に精製されると、その後ポリペプチドは治療的に利用することもできるし、検定段階、免疫蛍光染色法などを開発したり実施したりする際に用いることもできる（一般的に、Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ及びＰｅｒｎｉｓ、１９７９及び１９８１、Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ、１９９７参照）。
本発明の方法によって産生した抗体は、診断及び治療の際に用いることができる。例示の様式であって限定しているわけではないが、それらは癌、自己免疫疾患、またはウイルス感染症を治療するために利用できる。癌の治療ではこの抗体が、例えばｅｒｂＢ−２、ＣＥＡ、ＣＤ３３のような癌細胞に好んで発現する抗原や、当業者に周知の他の多くの抗原及び結合メンバーに典型的に結合するのであろう。
４．１６．５．９ ツーハイブリッドに基づくスクリーニングアッセイ法
シャッフリングはまた、予め決められたポリペプチド配列を結合するライブラリーメンバーを同定するためのツーハイブリッドスクリーニングシステムをスクリーニングすることによって得られる選択されたライブラリーメンバーのプールを組み換えて多様化するために用いることもできる。この選択されたライブラリーメンバーはプールされて、インビトロ及び／またはインビボでの組換えにより再編成される。再編成されたプールは続いて、前記の予め決められたポリペプチド配列（例えば、ＳＨ２ドメイン）を結合するか、別の予め決められたポリペプチド配列（例えば、別のタンパク質種由来のＳＨ２ドメイン）を結合するライブラリーメンバーを選択するために酵母の二ハイブリッドシステムでスクリーニングできる。
【０４３２】
予め決められたポリペプチド配列に結合するポリペプチド配列を同定するためのアプローチは、予め決められたポリペプチド配列が融合タンパク質に存在しているいわゆる「ツーハイブリッド」システムを用いている（Ｃｈｉｅｎら、１９９１）。このアプローチは、転写アクチベーター、即ち酵母のＧａｌ４転写タンパク質を再構築する（Ｆｉｅｌｄｓ及びＳｏｎｇ、１９８９）ことで、インビボでのタンパク質−タンパク質相互作用を同定する。通常この方法は、ＤＮＡ結合作用と転写の活性化に応答する分離可能なドメインからな酵母のＧａ１４タンパク質の特徴に基づいている。二つのハイブリッドタンパク質、即ち既知のタンパク質のポリペプチド配列に融合した酵母のＧａ１４ ＤＮＡ結合性ドメインからなる一つと、第２のタンパク質のポリペプチド配列に融合したＧａｌ４活性化ドメインからなるもう一つとをコードするポリヌクレオチドが構築されて酵母の宿主細胞に導入される。二つの融合タンパク質の間の分子間結合は、Ｇａｌ４活性化ドメインを持つＧａｌ４ ＤＮＡ結合性ドメインを再構築し、それによってＧａｌ４結合性部位に機能的に結合するリポーター遺伝子（例えば、ｌａｃｚ、ＨＩＳ３）の転写活性化に至る。通常ツーハイブリッド法は、既知のタンパク質と相互作用する新規なポリペプチド配列を同定するために用いられる（Ｓｉｌｖｅｒ及びＨｕｎｔ、１９９３、Ｄｕｒｆｅｅら、１９９３、Ｙａｎｇら、１９９２、Ｌｕｂａｎら、１９９３、Ｈａｒｄｙら、１９９２、Ｂａｒｔｅｌら、１９９３、及びＶｏｊｔｅｋら、１９９３）。しかしながらツーハイブリッド法の変法は、第２の既知タンパク質への結合に影響を与える既知のタンパク質の突然変異を同定するために用いられる（Ｌｉ及びＦｉｅｌｄｓ、１９９３、Ｌａｌｏら、１９９３、Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９３、及びＭａｄｕｒａら、１９９３）。ツーハイブリッドシステムはまた、二つの既知のタンパク質の相互作用している構造的ドメインを同定するため（Ｂａｒｄｗｅｌｌら、１９９３、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙら、１９９２、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒら、１９９３、及びＭｉｌｎｅ及びＷｅａｖｅｒ、１９９３）、また一個のタンパク質のオリゴマー形成反応に応答するドメインを同定するため（Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３、Ｂｏｇｅｒｄら、１９９３）にも用いられた。ツーハイブリッドシステムの変法は、タンパク質分解酵素のインビボでの作用を研究するために用いられた（Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら、１９９２）。またＥ．ｃｏｌｉ／ＢＣＣＰ相互作用のスクリーニングシステム（Ｇｅｒｍｉｎｏら、１９９３、Ｇｕａｒｅｎｔｅ、１９９３）は、相互作用するタンパク質の配列（即ちヘテロダイマーを形成するか、より高次のヘテロマルチマーを形成するタンパク質の配列）を同定するために用いることができる。ツーハイブリッドシステムによって選択された配列をプールして、再編成してから一回またはそれ以上の続くスクリーニングラウンドを行うためにツーハイブリッドシステムに導入することによって、所定の結合配列を含むハイブリッドに結合するポリペプチド配列を同定できる。こうして同定された配列は、共通配列及び共通配列の核心部を同定するために比較することができる。
【０４３３】
一般に組換えＤＮＡ法についての標準的な技術は、いろいろな刊行物（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、及びＢｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ、１９８７）に記載されており、そのそれぞれは参照文献としてその記載全体がこの明細書に組み入れられる。ポリヌクレオチドを修飾している酵素は、製造者の推薦により用いた。オリゴヌクレオチドは、ＡＢＩ化学薬品を用いるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．Ｍｏｄｅｌ ３９４ ＤＮＡ合成装置で合成した。望むのであれば所定のＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ増幅物を、実務者の判断で選択すればよい。
４．１６．５．９．１ ダイマーの形成
１ｕｇの鋳型ＤＮＡからなるサンプルを入手してＵＶ光を照射することによりＴＴダイマーを含むダイマー、特定するとプリンのダイマーを形成させることができる。ＵＶ照射は、数個の光生成物が鋳型ＤＮＡのサンプルの遺伝子に対して発生するように制限される。多数のサンプルを照射時間を変えてＵＶ光で処理することによって、ＵＶ光から得られるダイマーの数が異なる鋳型ＤＮＡサンプルを得ることができる。
４．１６．５．９．２ ランダムプライミングキット
非プルーフリーディングポリメラーゼを用いるランダムプライミングキット（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ＳｙｓｔｅｍｓによるプライムイットＩＩランダムプライマーラベリングキット（Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ ＩＩ Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｏｍｅｒ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ））を用いることによって、ＵＶ光によって調整される鋳型（上記に記載したように）のランダム部位で初回感作し、鋳型に沿って伸張することにより異なる大きさのポリヌクレオチドを生じさせることができる。プライムイットＩＩランダムプライマーラベリングキットに記載されているようなプライミングプロトコールは、プライマーを伸張させるために利用できる。ＵＶ露光によって形成されるダイマーは、非プルーフリーディングポリメラーゼによって伸張する際の障害物として作用する。したがってランダムサイズのポリヌクレオチドのプールは、ランダムプライマーを伴う伸張が終わった後に存在する。
【０４３４】
本発明はさらに、通常は増幅され、及び／またはクローニングされているポリヌクレオチドの形態で選択された突然変異ポリヌクレオチド配列（または選択されたポリヌクレオチド配列の集団）を生成させる方法に向けられており、それによって選択されたポリヌクレオチド配列は、選択可能な少なくとも一つの望ましい表現型の特徴（例えば、ポリペプチドをコードする、結合したポリヌクレオチドの転写を促進する、タンパク質を結合する、及び類似の特徴）を持っている。所定の生物学的巨大分子（例えば受容体）に対する結合性のような望ましい構造的、または機能的な特徴を所有するハイブリッドポリペプチドを同定するための方法には、ポリペプチドのアミノ酸配列によって与えられる望ましい構造的または機能的特徴を備えた個々のライブラリーメンバーについて、ポリペプチドの大きなライブラリーをスクリーニングすることが関与する。
４．１６．５．９．４ 親和的相互作用スクリーニングまたは表現型スクリーニングに適するライブラリーの作製
ある態様においては本発明は、親和的相互作用スクリーニングまたは表現型スクリーニングに適するディスプレイポリペプチドまたはディスプレイ抗体からなるライブラリーを作製するための方法を提供する。この方法には、（１）ディスプレイしたポリペプチドまたはディスプレイした抗体、またはそのディスプレイしたポリペプチドまたはディスプレイした抗体をコードする関連したポリヌクレオチドを含む第１の複数の選択されたライブラリーメンバーを得る段階、及びその関連するポリヌクレオチドが実質的に同一の配列からなる領域を含む前記関連するポリヌクレオチドまたはその複製物を得る段階、任意であるがそのポリヌクレオチドまたは複製物に突然変異を導入する段階、（２）そのポリヌクレオチドまたは複製物をプールする段階、（３）ランダムまたは特定のプライム段階、及び合成段階または増幅段階を妨害することによって、小さい、即ち短いポリヌクレオチドを生成する段階、及び（４）新しく合成したポリヌクレオチドを均一に再結合させるために、増幅、好ましくはＰＣＲ増幅と、任意であるが突然変異誘発を行う段階が含まれる。
【０４３５】
４．１６．５．９．５ 有用なハイブリッドポリペプチドを発現するハイブリッドポリヌクレオチドの産生
本発明の特定の好ましい目的は、以下の一連の段階によって有用なハイブリッドポリペプチドを発現するハイブリッドポリヌクレオチドを生成するための方法を提供することである：
（ａ）増幅または合成段階を遮断したり妨害したりするための手段を用いてポリヌクレオチド増幅または合成段階を妨害し、それによりさまざまな完成段階にあるポリヌクレオチドを複製することで複数の小さい、即ち短いポリヌクレオチドを提供することによってポリヌクレオチドを産生する段階；
（ｂ）一個またはそれ以上の一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドからなる得られた集団に、一個またはそれ以上の一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチド、即ちその集団の一個またはそれ以上の一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドに異型の領域に対して同一の領域を含むオリゴヌクレオチドを添加する段階；
（ｃ）一本鎖のポリヌクレオチドの混合物を生成するために得られる一本鎖、または二本鎖のオリゴヌクレオチドを編成する段階、さまざまな長さを持つポリヌクレオチドのプールに短い、即ち小さなポリヌクレオチドを任意で分離する段階、さらに前記ポリヌクレオチドプールの少なくとも一つに含まれる一個またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを増幅させるためにＰＣＲ段階にそのポリヌクレオチドを任意でかける段階；
（ｄ）一本鎖のポリヌクレオチドの間の同一領域で結果的に一本鎖のポリヌクレオチドがアニーリングする条件下でポリメラーゼとともに、複数の前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドの少なくとも一つのプールをインキュベートする段階、そしてそれにより突然変異した二本鎖のポリヌクレオチド鎖を形成する段階；
（ｅ）任意で段階（ｃ）及び（ｄ）を繰り返す段階；
（ｆ）前記ポリヌクレオチド鎖の一本、または複数から得られる少なくとも一つのハイブリッドポリペプチドを発現させる段階；及び
（ｇ）有用な作用について前記少なくとも一つのハイブリッドポリペプチドをスクリーニングする段階。
【０４３６】
本発明の好ましい局面において、増幅段階または合成段階を遮断したり妨害したりする手段は、ＵＶ光、ＤＮＡ付加物、ＤＮＡ結合タンパク質を用いることによる。
本発明のある態様においては、ＤＮＡ付加物、またはそのＤＮＡ付加物を含むポリヌクレオチドが、さらに処理が進む前にＤＮＡ断片を含む溶液を加熱する処理によるような方法でポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプールから除去される。このように開示された本発明の例示的な態様を用いると、開示が例示に過ぎないこと、また種々の他の変法、適合及び修飾が本発明の範囲内でなされることが当業者に注目されるに違いない。しがたって本発明は、ここに例示されたような特定の態様に限定されるわけではない。さらに詳述しなくても、当業者は前述した記載を用いて本発明を最大の範囲で利用できると考えられる。次の実施例は例示的に考慮されるべきであって、したがってどのような様式であってもこの開示の残りを制限しない。
５． エンジニアリングのゴール
一つの態様においては、本発明は、アフィニティ相互作用スクリーニングまたは表現型スクリーニングに適した提示ポリペプチドまたは提示抗体のライブラリーを生成する方法を提供する。該方法は、（１） 提示ポリペプチドもしくは提示抗体及びこれらの提示ポリペプチドもしくは提示抗体をコードする関連するポリヌクレオチドを含む第一の複数の選択されたライブラリーのメンバーを得、前記関連するポリヌクレオチドまたはそのコピーを得、前記関連するポリヌクレオチドが実質的に同一の配列の領域を含むものとし、最適には前記ポリヌクレオチドまたはそのコピーに変異を導入し、（２） 前記ポリヌクレオチドまたはコピーをプールし、（３） ランダムなもしくは特定されたプライミング及び合成過程、または増幅過程を中断することにより、より小さいまたはより短いポリヌクレオチドを製造し、（４） 増幅、好ましくはＰＣＲ増幅、及び任意に突然変異誘発を行い、新たに合成されたポリヌクレオチドを相同的に組換えることを含む。
【０４３７】
本発明の特に好ましい目的は、以下の一連の工程により有用な変異体ポリペプチドを発現する変異体ポリヌクレオチドを製造する方法を提供することである。
上記一連の工程は、
（ａ） 増幅または合成過程をブロックまたは中断する手段を用いてポリヌクレオチド増幅または合成過程を中断することによりポリヌクレオチドを製造し、それにより完成の種々の段階にあるポリヌクレオチドの複製により、より小さいまたはより短い複数のポリヌクレオチドを与え、
（ｂ） 得られた一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドの集団に、一種以上の一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを加え、ここで添加されるオリゴヌクレオチドは前記集団の一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドの一以上に対して異種構造の部分中の同一の部分を含むものとし、
（ｃ） 得られた一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを変性させて一本鎖ポリヌクレオチドの混合物を生成し、任意により短いまたはより小さいポリヌクレオチドを種々の長さのポリヌクレオチドのプールに分離し、さらに任意に前記ポリヌクレオチドをＰＣＲ法に供して前記ポリヌクレオチドプールの少なくとも一つに含まれる一種以上のオリゴヌクレオチドを増幅し、
（ｄ） 複数の前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドの少なくとも一のプールをポリメラーゼとともに、一本鎖ポリヌクレオチド間で同一の領域において前記一本鎖ポリヌクレオチドのアニーリングが起こる条件下でインキュベートし、そのようにして突然変異が誘発された二本鎖ポリヌクレオチド鎖を形成し、
（ｅ） 任意に工程（ｃ）及び（ｄ）を反復し、
（ｆ） 前記一種以上のポリヌクレオチド鎖から少なくとも一種の変異体ポリペプチドを発現させ、
（ｇ） 前記少なくとも一種以上の変異体ポリペプチドを有用な活性についてスクリーニングする、
ことを含む。
本発明の好ましい態様においては、増幅または合成過程をブロックまたは中断する手段は、ＵＶ光、ＤＮＡ付加物、ＤＮＡ結合タンパク質を使用することによるものである。
本発明の一つの実施態様においては、ＤＮＡ付加物、またはＤＮＡ付加物を含むポリヌクレオチドは、例えば、さらに処理する前にＤＮＡ断片を含む溶液を加熱することを含む過程により、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプールから除去される。
【０４３８】
５．４ 再組換えホストにおける発現の増加
本発明のある一つの具体化において、それは、対象となる再組換えホストにおける遺伝子あるいは対象となる特性の発現の増加の準備をする。ホストは、細菌、真菌、原生動物、ウイルス、動物、昆虫および植物を含むがそれに制限されることはない。
５．５ 代謝産物の変性
本発明の具体化において、それは代謝産物の変性の準備をする。
５．６ 目的特性を持つ変性植物の作成
本発明の一面は、植物にとって異種構造である特性ＤＮＡ分子、例えば、ＤＮＡ構造物で変性された植物に対して疾病耐性を与えるＤＮＡ分子などの使用に関連する。本発明は、植物において、ウイルス、細菌、真菌、ウイロイド、植物プラズマ、線虫、昆虫を含む幅広い種類の病原体への耐性を伝えることに使用できる。本発明は、また、哺乳動物においても、遺伝子的特定を与えることに使用できる。とりわけ下記のウイルスに対する耐性は、本発明の手法によって達成される。それらのウイルスとは、トマトに付く立ち枯れ病ウイルス、ホウセンカ壊疽斑点ウイルス、塊茎植物輪紋病ウイルス、ポテトウィルス Ｙ、ポテトウィルス Ｘ、タバコモザイクウィルス、カブモザイクウィルス、タバコ腐食ウイルス、パパイア輪紋病ウイルス、トマト斑紋ウイルス、トマト黄色葉巻病ウイルス、あるいはそれらのうちの組合せである。とりわけ下記の細菌に対する耐性は、本発明に関連して植物に対して与えられる。それら細菌とは、ジュードモナスｓｏｌａｎｃｅａｒｕｍ、タバコジュードモナスハシドイ属 ｐｖ．、ガム （Ｘａｎｔｈａｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ） ｐｖぺラゴーニ、およびアグロバクテリウム腫脹である。本発明の手法の使用によって、植物は、とりわけ下記の真菌への耐性を持つことができる。それら真菌とは、サトイモ乾腐病菌および疫病菌寄生虫である。適切なＤＮＡ分子には、膜タンパク質を暗号化する ＤＮＡ 分子、レプリカーゼ、タンパク質を暗号化しない ＤＮＡ分子、遺伝子生成物を暗号化するＤＮＡ分子、あるいはそれらのうちの組合せが含まれる。
本発明は、また、疾病耐性以外の特性を植物に与えるためにも使用される。例えば、植物に遺伝的特性を与えるＤＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ特性分子として使用することができる。発明のこの観点において、適切な特性ＤＮＡ分子は、希望の色、酵素生成あるいはそれらの組合せを暗号化する。本発明の他の具体化においては、アウトプット特性（例：希望するビタミン、ミネラルあるいは抗体のように遺伝工学的に操作され導入された分子をより大量に生成すること）とインプット特性（例：乾燥および／あるいは塩度耐性）を含む、希望する特性を持つ植物を作り出すことに寄与する。
【０４３９】
５．７．１０ 植物への他の特性の付与
植物に対し複数のウイルス性の疾病への耐性を与えることに加えて、本発明は、他の特性を植物にもたらすことに使用することができる。疾病耐性以外の多数の特性を、移送遺伝子の植物へ組み込むことが望ましいことはしばしばある。例えば、色、酵素生成などは、植物に与える望ましい特性であることもある。しかし、そのような多くの特性とともに変形する植物は、疾病耐性に関して上述されたのと同様な困難に遭遇する。本発明は、疾病耐性以外の特性に関する問題解決にあたっても、同様に有益であろう。
以上により、本発明は、遺伝子工学の方法論を提供するものであり、それによって複数の特性が操作でき、また、単一遺伝子挿入として、例えば、単一メンデル座として分離する単一遺伝子としての役割をする構造として探知することができる。発明は、ウイルス耐性遺伝子を介して例示されるが、実際は、遺伝子のいかなる組合せも関連づけられることもある。したがって、変性ベクターに組み込まれた、関連のある選択可能なマーカー遺伝子あるいはレポーター遺伝子を単純に探知することによって、疾病耐性、強化された除草剤耐性、貯蔵寿命の延長等のような特性を提供する遺伝子ブロックを探知することができる。
タンパク質あるいはポリペプチドの分離あるいは純化のための手法および手順はその分野では知られている。
５．７．２０．５ Ａ４． コドン−最適化された暗号配列
発明の一つの観点との関連で、植物細胞ホストの中にある最高の周波数のコドンを含むことで異種遺伝子の本来の暗号配列を変更することによって、植物細胞培養における発現レベルの数倍の促進が達成可能であるということが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】
エキソヌクレアーゼ活性 酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩ活性を示す。これはポリヌクレオチド構築ブロックをシャッフリング、集合、再集合、再結合、および／または連結するために使用されうる代表的な酵素である。星印は、酵素がポリヌクレオチド基質の３’方向から５’方向に向かって作用することを示している。
【図２】
ポリメラーゼに基づく増幅による核酸構築ブロックの産生 ポリメラーゼに基づく増幅反応（例えばＰＣＲ）を用いて２つの突出をもつ二重鎖核酸構築ブロックを産生する方法を図示する。示されるように、最初のプライマーセット、Ｆ２およびＲ１を用いたポリメラーゼに基づく最初の増幅反応が、本質的に産物Ａと同一な平滑末端産物（反応１、産物１と標記）を産生するために使用される。第二のプライマーセット、Ｆ１およびＲ２を用いたポリメラーゼに基づく第二の増幅反応が、本質的に産物Ｂと同一な平滑末端産物（反応２、産物２と標記）を産生するために使用される。これらの２つの産物はその後混合され、融解およびアニーリングされ、２つの突出を有する潜在的に有用な二重鎖核酸構築ブロックを産生する。図１の例では３’突出を有する産物（産物Ｃ）が、例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩ等の３’作用性エキソヌクレアーゼを用いたその他の３産物のヌクレアーゼに基づく破壊により選抜される。示されているように、利用可能なプライマーが重複しうり、かつ更に利用可能なプライマーが異なる長さでありうることを図示するために、代替のプライマーが括弧内に示されている。
【図３】
独特な（ｕｎｉｑｕｅ）突出および独特な結合 各サイズの独特な突出の数（例えば１、２または３等のヌクレオチドからなる独特な突出の総数）が該サイズの独特な全突出の使用によりもたらされうる独特な結合の数を超える点を図示している。例えば単ヌクレオチドからなる４つの独特な３’突出、及び単ヌクレオチドからなる４つの独特な５’突出がある。しかし、全８個の独特な単ヌクレオチド３’突出および単ヌクレオチド５’突出を用いて作製されうる独特な結合の総数は４である。
【図４】
構築ブロックを順次結合することにより達成される独特の全体集合順序 全体で「ｎ」個の核酸構築ブロックを集合させるためには「ｎ−１」回の結合が必要とされる事実を図示している。しかし用途に利用可能な独特な結合の数は「ｎ−１」値より小さいことが時々ある。これら及び他の状況下では、厳密な非確率論的全体集合順序は、一連の段階の集合過程を実施することによってもなお達成されうる。本例においては２回の連続した段階が５個の核酸構築ブロックに対する設計された全体集合順序を達成するために使用される。この図示では、５個の核酸構築ブロックに対する設計された全体集合順序は５’−（＃１−＃２−＃３−＃４−＃５）−３’であり、式中、＃１が構築ブロック番号１を表す（以下同じ）。
【図５】
２ヌクレオチド３’突出を用いて利用可能な独特な結合 さらに、各サイズの独特な突出の数（ここでは、例えば２ヌクレオチドからなる独特な突出の総数）が該サイズの独特な全突出からもたらされうる独特な結合の数を超える点を図示する。例えば、示されているような全３２個に対しては、２ヌクレオチドからなる１６個の独特な３’突出および２ヌクレオチドからなる別の１６個の独特な５’突出がある。しかし、全３２個の独特な２ヌクレオチド３’突出および２ヌクレオチド５’突出を用いて作製されうる、独特かつ自己結合しない結合の総数は１２個である。いくつかの明らかな独特な結合は「一卵性双生児」（同じ影付けでマークされている）であり、それらはこの図示では視覚的に明らかである。さらに他の突出は、この図において示されおよび標識付けられているように回文構造性様式で自己結合できるヌクレオチド配列を含んでいる。それゆえ、それらは全体集合順序に高い厳密性を寄与しない。
【図６】
合成ライゲーション再集合によるキメラ組み合わせの網羅的なセットの産生 この例において設計された核酸構築ブロックの全ての可能な組み合わせを網羅的かつ体系的に産生する能力における本発明の力を見せている。特に大きな子孫キメラ分子セット（又はライブラリー）が産生されうる。本方法を網羅的かつ体系的に実施することが可能であるため、新規の境界点（ｄｅｍａｒｃａｔｉｏｎ ｐｏｉｎｔ）を選抜することにより、かつ対応する新規に設計された核酸構築ブロックを用いて、その方法の適用を繰り返すことが可能であり、過去に試験されたおよび拒絶された分子種を再産生および再スクリーニングする負担は回避される。境界点の頻度を増加させるためにコドンゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）を有利に使用することが可能であることは理解される。言い換えると、コドン縮重のために、祖先コドンによりコードされるアミノ酸（すなわち現在変更されたコドン）を変更することなしに、ある特定の塩基がある核酸構築ブロックにしばしば置換されうる。図示されているように、境界点は８個の祖先鋳型のアラインメントに基づいて選抜される。それらの（順序付けられた結合形成に役立つ）突出を含む核酸構築ブロックがその後設計及び合成される。この例では、全１４４個の核酸構築ブロック（又は二重鎖オリゴ）を得るために、８個の祖先鋳型それぞれの配列に基づき１８個の核酸構築ブロックが産生される。ライゲーション合成方法を実行することにより、８１８（又は１．８×１０１６超）のキメラ収量量からなる子孫分子のライブラリーが作製されると考えられる。
【図７】
オリゴからの合成遺伝子 本発明のある一つの態様によると、二重鎖核酸構築ブロックは複数の祖先核酸鋳型を整列化することにより設計される。好ましくはこれらの鋳型は、多少の類似性および多少のの異質性を含む。核酸は、その関連性が機能もしくは構造またはその両方に基づきうる、関連酵素等の関連タンパク質をコードしうる。３個のポリヌクレオチド祖先鋳型のアラインメントおよび全ての祖先分子により共有されている境界点（囲み表示）の選抜を示す。この特定の例においては、各祖先鋳型由来の核酸構築ブロックは約３０ヌクレオチド長から５０ヌクレオチド長となるように選抜された。
【図８】
合成ライゲーション遺伝子再集合のための核酸構築 ブロック 図７の例からの核酸構築ブロックを示す。本明細書において核酸構築ブロックは、５’突出および３’突出の両方を含む互換的な突出を有する、一般的な漫画の形式で示されている。３個の祖先鋳型の各々に由来する全２２個の核酸構築ブロックが存在する。したがってライゲーション合成方法により３２２（又は３．１×１０１０超）のキメラ収量からなる子孫分子のライブラリーが作製される。
【図９】
合成ライゲーション再集合によるイントロンの付加 核酸構築ブロック経由でイントロンがキメラ子孫分子内に導入されうることを、一般的な漫画の形式で示している。それらを動作可能にするために、イントロンはしばしば共通配列を両末端に有することが理解される。遺伝子スプライシングを可能にすることに加えて、他の核酸と類似した部位を提供することにより相同性組換えを可能にするという別の目的のためにイントロンがはたらきうることもまた理解される。この目的および潜在的な他の目的のためには、イントロンを導入するために巨大な核酸構築ブロックを産生することが時には望ましくてもよい。もし２つの一重鎖オリゴの直接化学合成により容易に産生されるよりもサイズが非常に大きいならば、図２に示されているように、そのような特殊化された核酸構築ブロックもまた２を超える一重鎖オリゴの直接化学合成により、またはポリメラーゼに基づく増幅反応を用いることにより産生されうる。
【図１０】
突出の全ヌクレオチドより少ない数を用いたライゲーション再集合
関係する突出において全てのヌクレオチドを使用しない様式で結合が起こりうるることを示している。「ギャップライゲーション」または「ギャップド（ｇａｐｐｅｄ）ライゲーション」と称されうるものを形成するリガーゼ酵素を用いた処理により結合が補強されるならば、結合は（例えば形質転換された宿主内で）特に存続する可能性が高い。示されているように、この種類の結合は不要なバックグラウンド産物の産生に寄与できるが、また設計されたライゲーション再集合により産生された子孫ライブラリーの多様性を有利に増加させるために使用されうることが理解される。
【図１１】
回文構造性結合における不要な自己ライゲーションの回避 上述し、かつ図５に示されているように、ある突出は自己結合を受けることが可能であり、回文構造性結合を形成する。もしリガーゼ酵素を用いた処理により補強されるならば、結合は実質的に強化される。したがって、示されているようにこれらの突出における５’リン酸の欠失は、この種の回文構造性自己結合を阻止するために有利に使用されうることが理解される。したがって本発明により、ライゲーション再集合過程における回文構造性自己結合を阻止するために、例えばウシ小腸アルカリフォスファターゼ（ＣＩＡＰ）等の脱リン酸化酵素を用いた処理により、５’リン酸基を欠失する核酸構築ブロックが化学的に作製（または注文）されうる（また一方それらが除去されうる）。
【図１２】
経路操作 任意で飽和突然変異導入等の他の定方向進化法を用いて、ライゲーション再集合を用いる新規遺伝子経路を作製する方法を提供することが本発明の目標である。この目標を達成するためにとられうる好ましいアプローチを図示している。天然の微生物遺伝子経路は、時に部分的に連結されているに過ぎない天然の真核生物（例えば植物）遺伝子経路よりも、しばしば連結されていることが理解される。ある特定の態様では、本発明はライゲーション再集合過程により産生された子孫遺伝子経路に、（プロモーターを含む）制御遺伝子配列が核酸構築ブロックの形で導入されうることを提供する。それゆえ、本来連結されていない遺伝子および遺伝子経路ならびに元来連結されている微生物遺伝子経路が、植物および他の真核生物における実施可能性を獲得するためにそのように変換されうる。
【図１３】
回文構造性結合における不要な自己ライゲーションの回避 新規遺伝子経路の産生に加えて、本発明で開示された定方向進化法（飽和突然変異導入および合成ライゲーション再集合を含む）を用いて改良型子孫分子を達成するため、本発明の別の目標は、天然および人工の両方の遺伝子経路を、突然変異導入および選抜に供することであることが図示されている。本発明で提供されているようにある特定の態様においては、微生物および植物の両経路を定方向進化により改良することができ、かつ示されているように、定方向進化過程を、経路に連結される前の遺伝子および遺伝子経路自身の両方に対して実施することができる。
【図１４】
微生物経路の真核生物経路への変換 ある特定の態様においては、本発明は、微生物経路が植物および他の真核生物種で機能する制御配列の導入によりそれらの種において実施可能な経路に変換されうることを提供する。好ましい制御配列はプロモーター、オペレーターおよびアクチベーター結合部位を含む。示されているようにそのような利用可能な制御配列の導入を達成する好ましい方法は、核酸構築ブロックの形式であり、特にライゲーション再集合過程における結合の使用を介する。これらの結合はＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＦの文字でマークされている。
【図１５】
指向進化および全体細胞モニターを利用した新規の遺伝子導入植物内の特異的に活性可能な蓄積された特質の操作 本発明の目的は、特異的に活性可能な蓄積された特質を遺伝子導入細胞または生体に導入する方法を提供するもので、その効果が全体的にモニターされる。図１５は、これに限らないが例として植物である生体に、複数の蓄積された特質を導入し、全体的な細胞または生体のモニターを行う方法を説明するものである。全体モニターには、ゲノム研究、ＲＮＡプロファイル、プロテオミクス、メタボロミクス、および脂質プロファイルに関する方法を含む。
【図１６】
選択された特質特異的活性化は特質の環境の調整および管理で達成できる特定の実施例において、本発明によれば、特異的に活性化できる蓄積された特質を生体に導入することができ、多用な状態下でのスクリーニングが可能となる。図１６は、遺伝的に導入された酵素からなる蓄積された特質の例を説明するものである。本例の中で、酵素は、それらが置かれた環境を調整することにより選択的に、また特異的に活性化することができる。
【図１７】
回収、処理および保管条件のための望ましいまたは改良された特質 本発明の目的の一つは、望ましいまたは改良された活性を有する組換えタンパク質の生成方法を提供することである。ある特定の実施例においては、本方法の潜在的応用は、本図で説明されるように、生物学的試薬や系統の回収、処理および保管に多様に対応するように形質転換細胞をスクリーニングすることである。形成転換細胞は、特異的に活性可能な蓄積が導入されている。ゲノム研究、ＲＮＡプロファイル、プロテオミクス、メタボロミクス、および脂質プロファイルに関するスクリーニング方法は、これに限定はされないが、ｐＨ、温度、およびその他の環境状況の変化を含む多様な特定の条件下で活用し、評価することができる。
【図１８】
突然変異誘発および形質転換生体の生成。 本発明のその他の実施例では、突然変異ヌクレオチド配列のライブラリーを生体に導入する（例えば、飽和突然変異誘発および／または結紮再分類）、および多様な全体表現型のために形態転換生体をスクリーニングする（好ましくは、高スループット方法を使用）一般的な方法を提供する。任意で、突然変異は組合せても、生体を再スクリーニングおよび／または２つ目のライブラリーを形態転換生体に導入したり、処理を繰り返してもよい。好ましい実施例において、初期個体群は、望ましい特質を有する改良された生体系統からなる合成個体群を生成するために改良または進化の対象となる生体からなる。
【図１９】
遺伝子生成物の処理。 図１９は、遺伝子生成物が活性化する前に起こる多様な処理または修飾の手段を説明するものである。これは生成物を活性または非活性化させる多くの処理手段の概略図である。一旦遺伝子生成物が活性化されると、それは、特異的に発現されることができ、一定の場合には、その作用の修正または特性をスクリーニングすることができる。
【図２０】
選択された（非活性）遺伝子生成物先駆体の特異的活性化。 図２０は、遺伝子生成物を特異的に活性化させる潜在的な方法としての、ポスト翻訳修正を説明する概略図である。遺伝子生成物の特異的活性化はスクリーニング評価を考案する際に考慮すべきである。スクリーニング評価では、遺伝子生成物がタンパク質分解等のポスト翻訳効果によって非活性化されていると、形質転換生体は、選択されないことがある。
【図２１】
望ましい特質を有する改良生体または系統の生成。 また本発明の他の実施例においては、突然変異ヌクレオチド配列のライブラリーを生体に導入する、また形質転換生体または系統を多様な表現型にスクリーニングする一般的な方法が提供される（好ましくは、高スループット方法を使用）。ゲノム研究、ＲＮＡプロファイル、プロテオミクス、メタボロミクス、および脂質プロファイルに関するスクリーニング方法は、「ＵＰ突然変異」のような望ましい突然変異のサブセットを特定するのに役立つ。任意で、突然変異は組合せても、生体を再スクリーニングおよび／または２つ目のライブラリーを形態転換生体に導入したり、処理を繰り返してもよい。好ましい実施例において、初期個体群は、望ましい特質を有する改良された生体系統からなる合成個体群を生成するために改良または進化の対象となる生体からなる。
【図２２】
望ましい特質を有する改良配列を生成するポリヌクレオチド配列の再分類。 また本発明の他の目的においては、突然変異ポリヌクレオチドの生成、ポリヌクレオチド生成物のスクリーニング、およびその結果望ましい特質を有する改良配列を生成する方法が提供される。例えば、図２２に示されるように、突然変異ポリヌクレオチドは、トランスポゾンベースまたは相同組換えベースの方法など、生体内組換え方法によって生成することができる。続いて、形質転換生体をスクリーニングして、望ましい特別変異体のサブセットを選択することができる。（例えば強化された特質を有するものまたは「ＵＰ−突然変異種」）生体のサブセットは、選択できまた、多様な特別変異を組合せることができる。生成された系統は、更に選択することができ、「ＵＰ−突然変異種」および／または改良ゲノム配列が選択および判定することができる。
【図２３】
系の改良 図２３はまた、改良系統または生体の発生に本発明が有用であることを説明するものである。概略図は、従来および本発明に提供される方法を使った改良型の従来の遺伝学方法を比較するものである。本発明は、従来の遺伝子学的方法によって生成された系統に典型的に収容されるものよりも多くの突然変異を収容する系統の発生を提供するものである。多くの突然変異を有する系統の発生およびそれに続く、そのような系統のスクリーニングにより、改良された系統の選択が可能となる。本図に説明されているように、本発明の実施例は、任意のクローンの発生（例えば、３段階の突然変異誘発結果）、高スループットのプロセスによるこれらのクローンの移入の際の遺伝形質転換生体の生成、相同組み替えによる生体内組換え、トランスポゾンまたは自殺プラスミド挿入、およびスクリーニングによる改良特徴を有する系統の特定を行うものである。続いて、特性が改良されたクローンは、特定され、複数の遺伝突然変異によって改良された系統の生成という目的を持つ単一の系統に組み込むことができる。
【図２４】
反復的系統改良。 本図は本発明がどのように複数の突然変異誘発、再結合および選択を引き起こすことによる反復的系統改良の方法を提供するかを説明するものである。本概略図では、生体からのライブラリーに突然変異が誘発され、親生体へと変化する。細胞中に新規の変形が生体内の組換えにより導入される（例えば、相同組換え）。結果得られた系統は望ましいまたは強化された特質をスクリーンし（「ＵＰ−突然変異種」）突然変異が特定され配列が決定される。その後、特定されたクローンの多様なセットやサブセットに組換えが起こり、更なる系の改良をすることができる。
【図２５】
ゲノムサイトの飽和突然変異誘発への突然変異の導入を説明する図。 ある意味において、この方法は、ゲノムサイトの飽和突然変異誘発で、ゲノム（例えば細菌染色体）への非マーカー削除、挿入および点突然変異の目標となる構成をできるようにするものである。ゲノムのライブラリーは突然変異（および、複数の突然変異）を起こして細胞内に導入され、ゲノム対立遺伝子と組換えが起きる。例えば、図示されるように、突然変異対立遺伝子および酵母大核Ｉ−ＳｃｅＩの認識サイトを有する自殺プラスミドを、突然変異体および野生型対立遺伝子間の相同的組合せにより、ゲノムに挿入することができる。更なる組合せにより、突然変異体または野生型染色体が生じる。同一のゲノム片から発生した突然変異体群は結合され、配列のある位置に保管され、それぞれのゲノムの断片すべてが突然変異を起こして飽和状態となる。
【図２６】
ポリヌクレオチド中断合成法によるポリヌクレオチドの生成。 本発明の実施例では不完全拡張によって生成されたキメラ／突然変異ポリヌクレオチド（暗号および非暗号領域を含む）の生産を提供している。不完全拡張は、最終的にキメラ／突然変異ポリヌクレオチドを大量に発生させるのに使用される、長さが違う中間体の生成に使われてもよい。核酸の合成を中断させるのに、多様な方法が使用されてもよい。：アニール回数の短縮（図２７に例示される）、ｄＮＴＰ濃度の減少、単一のポリバインダーテンプレートへの複数のモノバインダーの注入、テンプレート化学（例えば化学的に改変された塩基のテンプレートを使用）、合成中の、活性が減少したＤＮＡポリメラーゼおよび／または改変ヌクレオチドの使用（例えばｄｄＣＴＰ）。
【図２７】
アニール回数の短縮を伴うＰＣＲサイクルを利用した中断合成 本発明の実施例は、中断合成方法により発生させたキメラ／突然変異ポリヌクレオチド （暗号および非暗号領域を含む）の生成を提供するものである。アニール回数の短縮を利用した標準ＰＣＲサイクルの変形は、不完全延長を引き起こす一つの方法である。図のように、使用できる多数の変形が存在する（例えば、これに限定はされないが、変形１〜５）。
【図２８】
本発明によるコンピュータ分析に役立つフローチャートの例

Claims (108)

  1. （ａ）複数の差別小分子標識を用意し、但し、その差別小分子標識は（ｉ）ビオチンを含む第一ドメイン、及び（ｉｉ）アミノ酸に共有結合し得る反応性基を含む第二ドメインを含むキメラ標識試薬を含み、そのキメラ標識試薬は少なくとも一つの同位元素を含む、
    （ｂ）ポリペプチドを含む少なくとも２種のサンプルを用意し、
    （ｃ）差別小分子標識をポリペプチドのアミノ酸に共有結合し、
    （ｄ）標識ポリペプチドをビオチン結合カラムに結合し、非結合物質を洗浄してカラムから除き、標識ポリペプチドをカラムから溶離することにより標識ポリペプチドをそのカラムで単離し、
    （ｅ）夫々のサンプルのタンパク質濃度をタンデム質量スペクトロメータ中で測定し、そして
    （ｆ）夫々のサンプルの相対的タンパク質濃度を比較することを特徴とするサンプル中の相対的タンパク質濃度の比較方法。
  2. ａ）生物の初期集団を得、ｂ）突然変異誘発生物の組を生じ（その結果、突然変異誘発生物の組中の全ての遺伝子突然変異が全体として測定される場合には、実質的な遺伝子突然変異の組が提示される）、そしてｃ）改善された生物の存在を検出することを特徴とする望ましい形質を有する改善された生物の生産方法。
  3. 工程ｂ）における実質的な遺伝子突然変異の組が少なくとも１５種の異なる遺伝子のノックアウトを含む請求項２記載の方法。
  4. 工程ｂ）における実質的な遺伝子突然変異の組が少なくとも５０種の異なる遺伝子のノックアウトを含む請求項２記載の方法。
  5. 工程ｂ）における実質的な遺伝子突然変異の組が少なくとも１００種の異なる遺伝子のノックアウトを含む請求項２記載の方法。
  6. 工程ｂ）における実質的な遺伝子突然変異の組が少なくとも１５種の異なる遺伝子の導入を含む請求項２記載の方法。
  7. 工程ｂ）における実質的な遺伝子突然変異の組が少なくとも５０種の異なる遺伝子の導入を含む請求項２記載の方法。
  8. 工程ｂ）における実質的な遺伝子突然変異の組が少なくとも１００種の異なる遺伝子の導入を含む請求項２記載の方法。
  9. 工程ｂ）における実質的な遺伝子突然変異の組が少なくとも１５種の異なる遺伝子の発現の変化を含む請求項２記載の方法。
  10. 工程ｂ）における実質的な遺伝子突然変異の組が少なくとも５０種の異なる遺伝子の発現の変化を含む請求項２記載の方法。
  11. 工程ｂ）における実質的な遺伝子突然変異の組が少なくとも１００種の異なる遺伝子の発現の変化を含む請求項２記載の方法。
  12. ａ）生物の初期集団を得、ｂ）夫々が少なくとも一つの遺伝子突然変異を有する突然変異誘発生物の組を生じ（その結果、突然変異誘発生物の組中の全ての遺伝子突然変異が全体として測定される場合には、実質的な遺伝子突然変異の組が提示される）、ｃ）少なくとも二つの遺伝子突然変異の発現を検出し、ｄ）少なくとも二つの検出された遺伝子突然変異を一種の生物に導入し、そしてｅ）必要により工程ａ）、ｂ）、ｃ）、及びｄ）のいずれかを繰り返すことを特徴とする望ましい形質を有する改善された生物の生産方法。
  13. 工程ｄ）が一種の生物中の少なくとも１５種の異なる遺伝子のノックアウトを含む請求項１２記載の方法。
  14. 工程ｄ）が一種の生物中の少なくとも５０種の異なる遺伝子のノックアウトを含む請求項１２記載の方法。
  15. 工程ｄ）が一種の生物中の少なくとも１００種の異なる遺伝子のノックアウトを含む請求項１２記載の方法。
  16. 工程ｄ）が一種の生物への少なくとも１５種の異なる遺伝子の導入を含む請求項１２記載の方法。
  17. 工程ｄ）が一種の生物への少なくとも５０種の異なる遺伝子の導入を含む請求項１２記載の方法。
  18. 工程ｄ）が一種の生物への少なくとも１００種の異なる遺伝子の導入を含む請求項１２記載の方法。
  19. 工程ｄ）が一種の生物中の少なくとも１５種の異なる遺伝子の発現の変化を含む請求項１２記載の方法。
  20. 工程ｄ）が一種の生物中の少なくとも５０種の異なる遺伝子の発現の変化を含む請求項１２記載の方法。
  21. 工程ｄ）が一種の生物中の少なくとも１００種の異なる遺伝子の発現の変化を含む請求項１２記載の方法。
  22. ａ）生物の初期集団を得、ｂ）突然変異誘発生物の組を生じ（その結果、突然変異誘発生物の組中の全ての遺伝子突然変異が全体として測定される場合には、実質的な遺伝子突然変異の組が提示される）、ｃ）前記変化された形質を有する生物の存在を検出し、そしてｄ）変化された形質を有する生成物中で突然変異誘発された遺伝子のヌクレオチド配列を決定することを特徴とする生物の形質を変化する遺伝子の同定方法。
  23. 生物の実質的にクローンの集団中の内因性遺伝子を機能的にノックアウトし、ｂ）変化された遺伝子のライブラリーを生物の実質的にクローンの集団に導入し（夫々の変化された遺伝子は唯一のコドンで内因性遺伝子とは異なる）、ｃ）改善された形質を有する突然変異誘発生物を検出し、そしてｄ）検出された生物に導入された遺伝子のヌクレオチド配列を決定することを特徴とする改善された形質を有する生物の生産方法。
  24. 差別的に活性化可能な重層形質をトランスジェニック細胞又は生物に導入する方法であって、その方法が
    ａ）初期細胞又は生物を得る工程、
    ｂ）選択的かつ差別的に活性化可能な形質を含む、複数の形質（重層形質）を作用細胞又は生物に導入する工程（それにより、この目的に使用可能な形質が遺伝子により与えられた形質及び遺伝子経路により与えられた形質を含む）、
    ｃ）工程ａ）及びｂ）から得られた情報を分析する工程、及び
    ｄ）必要により工程ａ）、ｂ）、ｃ）、及びｄ）のいずれか又は全部を繰り返す工程
    を含むことを特徴とする方法。
  25. 工程ａ）がまた株又は生物の全体論的モニタリングを含み、それにより全体論的モニタリングが全ての検出可能な機能及び身体的パラメーター（例えば、形態学、挙動、成長、刺激〔例えば、抗生物質、異なる環境等〕に対する応答性、及び化学的に少なくとも一部核酸、タンパク質、炭水化物、プロテオグリカン、糖タンパク質、又は脂質である分子を含む、全ての検出可能な分子のプロフィールが挙げられるが、これらに限定されない）の検出及び／又は測定を含み得る請求項２４記載の方法。
  26. 工程ｄ）がまた株又は生物の全体論的モニタリングを含み、それにより全体論的モニタリングが全ての検出可能な機能及び身体的パラメーター（例えば、形態学、挙動、成長、刺激〔例えば、抗生物質、異なる環境等〕に対する応答性、及び化学的に少なくとも一部核酸、タンパク質、炭水化物、プロテオグリカン、糖タンパク質、又は脂質である分子を含む、全ての検出可能な分子のプロフィールが挙げられるが、これらに限定されない）の検出及び／又は測定を含み得る請求項２４記載の方法。
  27. 工程ａ）及びｄ）が株又は生物の全体論的モニタリングを含み、それにより全体論的モニタリングが全ての検出可能な機能及び身体的パラメーター（例えば、形態学、挙動、成長、刺激〔例えば、抗生物質、異なる環境等〕に対する応答性、及び化学的に少なくとも一部核酸、タンパク質、炭水化物、プロテオグリカン、糖タンパク質、又は脂質である分子を含む、全ての検出可能な分子のプロフィールが挙げられるが、これらに限定されない）の検出及び／又は測定を含み得る請求項２４記載の方法。
  28. 工程ｂ）が少なくとも１５の重層形質の導入を含む請求項２４記載の方法。
  29. 工程ｂ）が少なくとも５０の重層形質の導入を含む請求項２４記載の方法。
  30. 工程ｂ）が少なくとも１００の重層形質の導入を含む請求項２４記載の方法。
  31. 工程ａ）が下記の方法：
    ａ）ゲノミクス、
    ｂ）トランスクリプトム特性決定又はＲＮＡプロファイリング、
    ｃ）プロテオミクス、
    ｄ）メタボロミクス又は代謝産物の分析、
    ｅ）リピドミクス又は脂質プロファイリング
    の一つ又はいずれかの組み合わせを利用することによる細胞特性のスクリーニングを含む請求項２５記載の方法。
  32. プロテオミクスがアミノ酸反応性標識の使用を特別に含む請求項３１記載の方法。
  33. 工程ｄ）が下記の方法：
    ｆ）ゲノミクス、
    ｇ）トランスクリプトム特性決定又はＲＮＡプロファイリング、
    ｈ）プロテオミクス、
    ｉ）メタボロミクス又は代謝産物の分析、
    ｊ）リピドミクス又は脂質プロファイリング
    の一つ又はいずれかの組み合わせを利用することによる細胞特性のスクリーニングを含む請求項２６記載の方法。
  34. プロテオミクスがアミノ酸反応性標識の使用を特別に含む請求項３３記載の方法。
  35. 工程ａ）及びｄ）が下記の方法：
    ｋ）ゲノミクス、
    ｌ）トランスクリプトム特性決定又はＲＮＡプロファイリング、
    ｍ）プロテオミクス、
    ｎ）メタボロミクス又は代謝産物の分析、
    ｏ）リピドミクス又は脂質プロファイリング
    の一つ又はいずれかの組み合わせを利用することによる細胞特性のスクリーニングを含む請求項２７記載の方法。
  36. プロテオミクスがアミノ酸反応性標識の使用を特別に含む請求項３５記載の方法。
  37. 工程ｃ）が下記の方法：
    ｑ）ゲノミクス、
    ｒ）トランスクリプトム特性決定又はＲＮＡプロファイリング、
    ｓ）プロテオミクス、
    ｔ）メタボロミクス又は代謝産物の分析、
    ｄ）リピドミクス又は脂質プロファイリング
    の一つ又はいずれかの組み合わせを利用することによる細胞特性のスクリーニングを含む請求項２記載の方法。
  38. プロテオミクスがアミノ酸反応性標識の使用を特別に含む請求項３７記載の方法。
  39. 工程ｃ）が下記の方法：
    ｖ）ゲノミクス、
    ｗ）トランスクリプトム特性決定又はＲＮＡプロファイリング、
    ｘ）プロテオミクス、
    ｙ）メタボロミクス又は代謝産物の分析、
    ｚ）リピドミクス又は脂質プロファイリング
    の一つ又はいずれかの組み合わせを利用することによる細胞特性のスクリーニングを含む請求項２２記載の方法。
  40. プロテオミクスがアミノ酸反応性標識の使用を特別に含む請求項３９記載の方法。
  41. 工程ｃ）が下記の方法：
    ａａ）ゲノミクス、
    ｂｂ）トランスクリプトム特性決定又はＲＮＡプロファイリング、
    ｃｃ）プロテオミクス、
    ｄｄ）メタボロミクス又は代謝産物の分析、
    ｅｅ）リピドミクス又は脂質プロファイリング
    の一つ又はいずれかの組み合わせを利用することによる細胞特性のスクリーニングを含む請求項２３記載の方法。
  42. プロテオミクスがアミノ酸反応性標識の使用を特別に含む請求項４１記載の方法。
  43. 実時間代謝フラックス分析を使用することによる新規表現型又は修飾表現型の全細胞操作方法であって、その方法が
    （ａ）細胞の遺伝子組成を修飾することにより修飾細胞をつくる工程、
    （ｂ）修飾細胞を培養して複数の修飾細胞を生じる工程、
    （ｃ）工程（ｂ）の細胞培養物を実時間でモニターすることにより細胞の少なくとも一つの代謝パラメーターを測定する工程、及び
    （ｄ）工程（ｃ）のデータを分析して測定されたパラメーターが同様の条件下の未修飾細胞中の匹敵するパラメーターと異なるのかを測定する工程
    を含み、それにより実時間代謝フラックス分析を使用して細胞中の操作された表現型を同定することを特徴とする方法。
  44. 細胞の遺伝子組成を細胞への核酸の添加を含む方法により修飾する請求項４３記載の方法。
  45. 核酸が細胞に異種の核酸を含む請求項４４記載の方法。
  46. 核酸が細胞に相同の核酸を含む請求項４４記載の方法。
  47. 相同核酸が修飾相同核酸を含む請求項４６記載の方法。
  48. 相同核酸が修飾相同遺伝子を含む請求項４７記載の方法。
  49. 細胞の遺伝子組成を細胞中の配列の欠失又は配列の修飾を含む方法により修飾する請求項４３記載の方法。
  50. 細胞の遺伝子組成を遺伝子の発現の修飾又はノックアウトを含む方法により修飾する請求項４３記載の方法。
  51. 新たに操作された表現型を含む細胞を選択することを更に含む請求項４３記載の方法。
  52. 選択された細胞を培養し、それにより新たに操作された表現型を含む新規細胞株を生じることを更に含む請求項５１記載の方法。
  53. 新たに操作された表現型がポリペプチドの増加又は減少された発現又は量、ｍＲＮＡ転写産物の増加又は減少された量、遺伝子の増加又は減少された発現、毒素に対する増加又は減少された耐性又は感受性、代謝産物の増加又は減少された耐性使用又は生産、細胞による化合物の増加又は減少された摂取、代謝の増加又は減少された速度、及び増加又は減少された成長速度からなる群から選ばれる請求項５１記載の方法。
  54. 新たに操作された表現型を含む細胞を単離することを更に含む請求項４３記載の方法。
  55. 新たに操作された表現型が安定な表現型である請求項４３記載の方法。
  56. 細胞の遺伝子組成の修飾が細胞への構築物の挿入を含み、構築物が構成的活性プロモーターに機能し得る形で連結された核酸を含む請求項５５記載の方法。
  57. 新たに操作された表現型が誘導表現型である請求項４３記載の方法。
  58. 細胞の遺伝子組成の修飾が細胞への構築物の挿入を含み、構築物が誘導プロモーターに機能し得る形で連結された核酸を含む請求項５７記載の方法。
  59. 工程（ａ）で細胞に添加された核酸を細胞のゲノムに安定に挿入する請求項４４記載の方法。
  60. 工程（ａ）で細胞に添加された核酸が細胞中のエピソームを増殖する請求項４４記載の方法。
  61. 工程（ａ）で細胞に添加された核酸がポリペプチドをコードする請求項４４記載の方法。
  62. ポリペプチドが修飾相同ポリペプチドを含む請求項６１記載の方法。
  63. ポリペプチドが異種ポリペプチドを含む請求項６１記載の方法。
  64. 工程（ａ）で細胞に添加された核酸が相同転写産物にアンチセンスである配列を含む転写産物をコードする請求項４４記載の方法。
  65. 工程（ａ）における細胞の遺伝子組成の修飾がｍＲＮＡ転写産物の発現を増加又は減少することを含む請求項４３記載の方法。
  66. 工程（ａ）における細胞の遺伝子組成の修飾がポリペプチドの発現を増加又は減少することを含む請求項４３記載の方法。
  67. 工程（ａ）における相同遺伝子の修飾が相同遺伝子の発現のノックアウトを含む請求項４３記載の方法。
  68. 工程（ａ）における相同遺伝子の修飾が相同遺伝子の発現を増加することを含む請求項４３記載の方法。
  69. 工程（ａ）における異種遺伝子が配列修飾相同遺伝子を含み、その配列修飾が
    （ａ）鋳型ポリヌクレオチドを用意する工程（その鋳型ポリヌクレオチドは細胞の相同遺伝子を含む）、
    （ｂ）複数のオリゴヌクレオチドを用意する工程（夫々のオリゴヌクレオチドは鋳型ポリヌクレオチドに相同の配列（それにより鋳型ポリヌクレオチドの特定配列を標的とする）、及び相同遺伝子の変異体である配列を含む）、
    （ｃ）工程（ａ）の鋳型ポリヌクレオチドを工程（ｂ）のオリゴヌクレオチドで複製し、それにより相同遺伝子配列変化を含むポリヌクレオチドを生成することにより非確率的配列変化を含む子孫ポリヌクレオチドを生成する工程
    を含む方法により行なわれる請求項４３記載の方法。
  70. 工程（ａ）における異種遺伝子が配列修飾相同遺伝子を含み、その配列修飾が
    （ａ）鋳型ポリヌクレオチドを用意する工程（その鋳型ポリヌクレオチドは相同遺伝子をコードする配列を含む）、
    （ｂ）複数のビルディングブロックポリヌクレオチドを用意する工程（そのビルディングブロックポリヌクレオチドは前もって決定した配列で鋳型ポリヌクレオチドと交差再集合するように設計され、ビルディングブロックポリヌクレオチドは相同遺伝子の変異体である配列及びその変異体配列に隣接する鋳型ポリヌクレオチドに相同の配列を含む）、
    （ｃ）ビルディングブロックポリヌクレオチドを鋳型ポリヌクレオチドと合わせる工程（その結果、ビルディングブロックポリヌクレオチドが鋳型ポリヌクレオチドと交差再集合して相同遺伝子配列変化を含むポリヌクレオチドを生成する）
    を含む方法により行なわれる請求項４３記載の方法。
  71. 細胞が原核細胞である請求項４３記載の方法。
  72. 原核細胞が細菌細胞である請求項７１記載の方法。
  73. 細胞が菌類細胞、酵母細胞、植物細胞及び昆虫細胞からなる群から選ばれる請求項４３記載の方法。
  74. 細胞が真核細胞である請求項４３記載の方法。
  75. 細胞が哺乳類細胞である請求項７４記載の方法。
  76. 哺乳類細胞がヒト細胞である請求項７５記載の方法。
  77. 測定される代謝パラメーターが細胞成長の速度を含む請求項４３記載の方法。
  78. 細胞成長の速度が培養物の光学密度の変化により測定される請求項７７記載の方法。
  79. 測定される代謝パラメーターがポリペプチドの発現の変化を含む請求項４３記載の方法。
  80. ポリペプチドの発現の変化が一次元ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動、タンデム質量分光分析、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫沈殿及びウェスタンブロットからなる群から選ばれた方法により測定される請求項７９記載の方法。
  81. 測定される代謝パラメーターが少なくとも一種の転写産物の発現の変化、又は新たに導入された遺伝子の転写産物の発現を含む請求項４３記載の方法。
  82. 転写産物の発現の変化がハイブリダイゼーション、定量的増幅及びノーザンブロットからなる群から選ばれた方法により測定される請求項８１記載の方法。
  83. 転写産物発現が細胞の転写産物又はアレイに固定された核酸へのハイブリダイゼーションによる細胞の転写産物の代表的な核酸もしくは転写産物に相補性の核酸を含むサンプルのハイブリダイゼーションにより測定される請求項８２記載の方法。
  84. 測定される代謝パラメーターが二次代謝産物の増加又は減少を含む請求項４３記載の方法。
  85. 二次代謝産物がグリセロール及びメタノールからなる群から選ばれる請求項８４記載の方法。
  86. 測定される代謝パラメーターが有機酸の増加又は減少を含む請求項４３記載の方法。
  87. 有機酸がアセテート、ブチレート、スクシネート及びオキサロアセテートからなる群から選ばれる請求項８６記載の方法。
  88. 測定される代謝パラメーターが細胞内ｐＨの増加又は減少を含む請求項４３記載の方法。
  89. 細胞内ｐＨの増加又は減少が染料の細胞内適用により測定され、染料の蛍光の変化が経時測定される請求項８８記載の方法。
  90. 測定される代謝パラメーターが経時のＤＮＡの合成の増加又は減少を含む請求項４３記載の方法。
  91. 経時のＤＮＡの合成の増加又は減少が染料の細胞内適用により測定され、染料の蛍光の変化が経時測定される請求項９０記載の方法。
  92. 測定される代謝パラメーターが組成物の摂取の増加又は減少を含む請求項４３記載の方法。
  93. 組成物が代謝産物である請求項９２記載の方法。
  94. 代謝産物が単糖、二糖、多糖、脂質、核酸、アミノ酸及びポリペプチドからなる群から選ばれる請求項９３記載の方法。
  95. 単糖、二糖又は多糖がグルコース又は蔗糖を含む請求項９４記載の方法。
  96. 組成物が抗生物質、金属、ステロイド及び抗体からなる群から選ばれる請求項９２記載の方法。
  97. 測定される代謝パラメーターが副生物の分泌又は細胞の分泌組成物の増加又は減少を含む請求項４３記載の方法。
  98. 副生物又は分泌組成物が毒素、リンホカイン、多糖、脂質、核酸、アミノ酸、ポリペプチド及び抗体からなる群から選ばれる請求項９７記載の方法。
  99. 実時間モニタリングが複数の代謝パラメーターを同時に測定する請求項４３記載の方法。
  100. 複数の代謝パラメーターの実時間モニタリングが細胞成長モニター装置の使用を含む請求項９９記載の方法。
  101. 細胞成長モニター装置がウェッジウッド・テクノロジー社の細胞成長モニターモデル６５２である請求項１００記載の方法。
  102. 実時間同時モニタリングが基質の摂取、細胞内有機酸のレベル及び細胞内アミノ酸のレベルを測定する請求項１００記載の方法。
  103. 実時間同時モニタリングがグルコースの摂取；アセテート、ブチレート、スクシネート又はオキサロアセテートのレベル；及び細胞内天然アミノ酸のレベルを測定する請求項１００記載の方法。
  104. 経時の測定される代謝パラメーターの変化を実時間モニタリングするためのコンピュータ実施プログラムの使用を更に含む請求項１００記載の方法。
  105. コンピュータ実施プログラムが図２８に示されたコンピュータ実施方法を含む請求項１０４記載の方法。
  106. コンピュータ実施方法が代謝ネットワーク式を含む請求項１０５記載の方法。
  107. コンピュータ実施方法が経路分析を含む請求項１０６記載の方法。
  108. コンピュータ実施プログラムが代謝フラックス分析の前の測定誤差をフィルターアウトするためのプレプロセシングユニットを含む請求項１０５記載の方法。
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