JP5445131B2 - バイオセンサおよびバイオセンサチップ、ならびに標的分子を感知するためのバイオセンサチップの製造方法 - Google Patents
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Description
まず、これらの実施形態の基本概念が以下に説明される。上記の知見に基づいて、発明者らは、これらすべての問題点、とりわけサブミクロン寸法の生化学的インターフェイスの製造に関する問題点に対する、驚くほど容易かつ単純な解決法に気付いた。加えて、この解決法によれば、モノクローナル抗体のようなリゲート生産物をもこれらの生化学的インターフェイスの製造の中へ組み入れる可能性がもたらされる。
モリクテス綱は、以下で説明する少なくとも2つの相異なる基本方式によって、基材の表面において固定化することができる。
特定のリゲートは、以下で説明される少なくとも2つの相異なる方式によって、モリクテス綱の細胞膜の中へ埋め込むことができる。
バイオセンサチップを製造するための簡単な3つの方式が図5〜図7に表示されている。
以下に、生化学的インターフェイスとしてバイオセンシングにモリクテス綱をサブミクロン寸法で使用する利点の概要を示す。
次に、上記のバイオセンサチップを利用して標的分子を感知するバイオセンサが説明される。ここで、基本的な物理的トランスデューサ機構は光マイクロキャビティによる光学的感知に基づいている〔Appl.Phys.Lett.の2002年第80巻の第4057〜4059ページにおけるF.Vollmer氏らによる論文、Optics Lettersの2003年第28巻の第272〜274ページにおけるS.Arnold氏らによる論文〕。さらに、バイオセンサに利用される光学素子の詳細は、上記仮出願第60/796,162号によっている。
上記説明の中で使用されている用語の定義が次に記載される。他の用語の定義は上記仮出願第60/796,162号によっている。
上記のバイオセンサに加えて、バイオセンサチップへの特異的な結合を感知することができるあらゆる種類のバイオセンサを適用することができる。上記のセンサはナノスケールの方位分解能で感知することができ、すなわち、その感知区域がサブミクロン寸法を有して1つのモリクテスを含みうるものではあるが、そのような高い分解能は要求されない。低い方位分解能の場合、すなわち、マイクロメートルまたは更にミリメートルの寸法の感知区域である場合には、バイオセンサチップは、大スケール表面に互いに適切な間隔を以って、それぞれが1つあるいはいくつかのモリクテスを含んでいる上記のような多くのサブミクロン感知用区域を置くことによって、それぞれのスケールに応じて作ることができる。ひいては、センサは、複数の個々のサブミクロン感知区域への特異的結合度を平均して測定する。上記のようなバイオセンサとの唯一の相違点は、この大スケール表面における非特異的結合を防止するために特別な注意を払う必要があるということであるが、その理由は、非特異的結合が上記大スケール表面にわたる低い方位分解能のバイオセンサによって測定された平均信号に影響を及ぼすからである。
バイオセンシングのために用いることのできるサブミクロン寸法のモリクテス綱の一例として、アコレプラズマ・レイドラウィイ(APL)が選択された。APLを用いる特別な利点は、流動性および接触性の観点におけるその細胞膜の特有の性質(Biochimica et Biophysica Actaの1984年第779巻の第1〜42ページにおけるR.N.McElhaneyの論文、ニューヨークのPlenum Press社のS.Rottem氏およびI.Kahane氏によって編集されたSubcellular Biochemistry の1993年第20巻の第109〜166ページにおけるL.Rilfors氏らによる「アコレプラズマ・レイドラウィイにおける極性脂質の調整および物理化学的諸特性」(“Regulation and Physiochemical Properties of the Polar Lipids in Acholeplasma Laidlawii”)、Critical Reviews in Microbiologyの1989年第17巻の第32ページにおけるR.N.McElhaney氏による論文)、培養の容易性(The Yale Journal of Biology and Medicineの1983年第56巻の第729〜735ページにおけるE.B.Stephens氏らによる論文)、ならびに遺伝子工学についてのその可能性(アメリカ合衆国、ニュージャージー州、トトワのHumana Press社のR.J.Miles氏およびR.A.J.Nicolas氏によって編集された書籍であるMycoplasma ProtocolsにおけるMethods in Molecular Biologyの第104巻第247〜258ページにおけるT.K.Jarhede氏およびAke Wieslander氏による論文)に関連する。この例では、APLを培養し、かつ成長させるための手順が、走査型電子顕微鏡(SEM)によってそれらの形状および外観を研究するために表面吸着細胞を固定するための方法とともに説明されている。
アコレプラズマ・レイドラウィイの培地調製
17.5gのハート・インフュージョン・ブイヨン(HIB(BD 238400))を700mlのミリMilliQ(MQ)水中に溶解した。HIB溶液の38mlの分別量を、加圧滅菌し、必要になるまで4℃で保存した。マイコプラズマ培地(MycoM(アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)培地243))を、このHIB分別量に5.5mlの酵母エキス溶液(Gibco 18180−059)と11mlのウマ血清(加熱不活性化されたもの)(Gibco 26050−070)とを添加することにより調製した。
−80℃に維持されたアコレプラズマ・レイドラウィイの菌株A(APL(ATCC 14089))のグリセロール貯蔵物を、伸長フィルターチップを用いた1mlのギルソンピペットで穿刺し、次いで、ブンゼン炎の上にかざしたねじ込みキャップ付きの200ml円錐ビンの中にあるMycoMの溶液に接種するために使用した。APL培養物を、わずかにゆるめられた蓋のあるビン中に、37℃に設定された水浴(IWAKI,SHK−101B)の中において80回転/分で振盪しつつ、必要になるまで放置した。
APL培養物を、1mlのエッペンドルフ中に分取し、次いで、10,000gで20分間、遠心分離(KUBOTA 3740)した。このMycoMの上澄みを廃棄し、次いで、それぞれのチューブ中のAPLを1mlのリン酸緩衝食塩水(PBS)の中に再懸濁した。これらのチューブを、前と同じように再度遠心分離した。PBSの清浄物を棄却し、次いで、APLを所望容積のPBSの中に再懸濁した。次いで、260nmに設定された分光光度計(Beckman)を用いてAPL溶液の吸光度を測定し、およそ2.0の読取値が得られた。次いで、APL懸濁液を、6穴プレート(353046,Falcon)のウエルの中においてシリコンチップへ添加し、そして2時間放置した。次いでこれらのチップを、PBSの4%グルタルアルデヒドの中へそのまま1時間浸漬した。固定化の後、これらのチップを洗浄ビンからのMQ水にて洗浄し、次いで、加圧シリンダからの窒素で乾燥させた。次いで、表面を約4×10−5ヘクトパスカル(hPa)の窒素圧力にてエバポレータを使用することにより、10nmの金で被覆し、細胞および表面を金にて等方的に被覆した。これらのチップを次いで、SEM(Hitachi S−4200)を使用して観察した。
図12は、2日間の成育後(図12(a))および6日間の成育後(図12(b)および図12(c))の細胞を示している。これらの細胞はブドウ状のコロニーを形成しているように見える。培養物中には2つの主要寸法を認めることができる。大きい方の寸法は1つの細胞について直径が約1.2μmであり、小さい方の寸法は直径が300〜500nmである。このことは、図12(c)に示された図12(b)のクローズアップにおいてよくわかる。これら2つの寸法は、例えば、1つの細胞からの異なった外延の生体機能的インターフェイスを調製するために使用することができる。
モリクテス綱はそれらの外側細胞壁の恒久的欠如を呈するので、脂質膜は、直接接触することができ、また、例えば図3に示されたように膜を自己組織化する脂質あるいは脂肪酸分子へそれらを結合することによって、特異的プローブ分子の組み込みのために、容易に使用することができる。
図13は、蛍光体標識付き脂肪酸による染色後のAPL細胞のクラスタにおける同時に得られた共焦点の蛍光像および透過像を示している。明らかなことであるが、色素分子は細胞を完全に、すなわちその外側細胞表面をすべて染色した。われわれは、細胞膜の中へ組み込まれる以外は細胞と反応しないことが知られている脂肪酸分子を使用しているので、膜組み込みプローブ分子を介する生体機能的インターフェイスとしてAPL細胞膜を使用する実現可能性が、この実施例で実証されている。
APLの脂質細胞膜への接触の実現可能性の実証の後、次の工程は、細胞膜をその細胞膜の中へ人為的に組み込まれたプローブ分子を使用して標的分子の特異的認識のために使用することができることを示す。特異的に相互作用する対として、ビオチン/ストレプトアビジンが選択された。ビオチンは、脂質へ共有結合状に付着され、一方でストレプトアビジンは、成功裏の結合事象の追跡を可能にするために蛍光体標識が付けられた。
図14は、このプレートリーダ測定の結果を示している。上澄みおよび洗浄液の信号は、最大信号および最小信号についての推定値として観察することができ、すなわち、それらはおおよその測定範囲を表示している。従って、残るほとんどの信号はこれら2つの結果の間にあった。図14(a)からわかるように、残る信号は、脂質結合ビオチンにて標識されたそれらのAPL細胞を除いて、洗浄液と同一の強度、すなわち最小強度を基本的に有していた。純粋な脂質も純粋なビオチンも、あるいは上記対照の他のものも、顕著な蛍光強度を達成することができなかった。これは、ストレプトアビジンが、APLの細胞膜の中へ挿入された上記ビオチンへ特異的に結合することを表わしている。上記相互作用が実際に、特異的であるということは、脂質−ビオチン標識細胞が、ストレプトアビジンの代わりに、蛍光BSA分子へさらされた場合の図14(b)からわかる。しかしながら、上記洗浄液によって表示されたようにバックグラウンドより高い蛍光強度の増大は観察することができなかった。このことは、細胞が、ストレプトアビジンを特異的相互作用により、それらの脂質細胞膜の中へ挿入された脂質固定ビオチンと結合したことを立証している。従って、APLの脂質細胞膜の中へ人為的に導入されたプローブ分子による特異的認識の実現可能性が、首尾よく実証された。
実施例3は、APLが、細胞膜組み込みプローブ分子を使用する特異的相互作用のための基体として使用することができることを示している。オンチップバイオセンサの開発のためには、表面固定化モリクテス綱もまた同一目的のために使用できるということを実証することが重要である。それゆえ、実施例3において提示された実験を、表面吸着型APL細胞を用いて以下の通り繰り返す。
APLを、実施例3において説明したように、LiBで標識した。同一の対照もまた含めた。この標識付け工程の間に、100μlの上澄み、洗浄液および最終APL懸濁液を維持し、ポリ−D−リジンの96穴プレート(354461、Becton Dickinson)のウエルへ添加し、2時間、維持した。この溶液を次いで、それぞれのウエルから除去し、100μlのPBSを添加した。その後、PBS洗浄液を除去し、それぞれのウエルへ200μlのPBS1%BSA(A−7030,Sigma)を添加し、緩やかに振盪しつつ2時間放置した。次いで、BSA遮断緩衝剤を除去し、100μlのPBSを添加した。その後、PBS洗浄液を除去し、0.0002mMのSRBが含有する100μlのPBSをそれぞれのウエルへ添加し、緩やかに振盪しつつ1時間放置した。次いで、この溶液を除去し、将来の参照のために別の96穴プレートへ添加した。その後、100μlのPBS洗浄液をそれぞれのウエルへ添加した。このプレートを軽くたたき、また、この洗浄液を、次いで除去し、将来の参照のために別の96穴プレートへ添加した。その後、100μlのPBS洗浄液をこれらのウエルへ添加し、また、そのプレートは、前述のようにプレートリーダを使用して読み取った。
図15はプレートリーダ実験の結果を示している。前述の通り、上澄み液および洗浄液の読取値は、同実験の感度範囲についての大まかな指針として使用することができる。残余は、表面固定化APL細胞に対して、それらの脂質細胞膜の中に組み込まれた脂質−ビオチンプローブを介して付着されたストレプトアビジンの蛍光を表わしている。前と同様に、脂質−ビオチンを保持する細胞の場合にのみ、洗浄液の信号により示されるバックグラウンドを越えた蛍光強度の増大を観察することができた。これは、ストレプトアビジンを表面固定化APL細胞へ結合するためには脂質−ビオチンが必要であることを示している。上記対照は、ストレプトアビジンが上記表面において非特異的に吸着せず、しかして該相互作用が本来的に特異的であるという結論をさらに裏付ける証拠を与える。脂質−ビオチンのみを使用すると、表面における蛍光強度のいくらかの増大を観察することができるが、このことは、その表面のBSA不動態化が蛋白質について最もよく機能するとともに小さい分子の場合には機能しないために生じる、その表面における脂質−ビオチンの非特異的吸着によって説明することができる。その為、該細胞は、膜結合ビオチンのみがその表面に存在することを保証するために、表面固定化に先行してビオチン化された。
APL細胞のナノパターン化の実現可能性を実証するために、ナノパターンを次のように調製した。
異なった寸法(500nm−10μm)のポリスチレン(PS)ビーズを、清浄なシリコンウェハピースの上にドロップコーティング法によって付着させた。これらのPSビーズを、引続くSiウェハピースの上への50nmの金蒸着におけるコロイド状マスクとして使用した。5nmのCrを定着剤として使用さした。エバポレータから取り出した後に、コロイド状マスクを、純クロロホルム中における10分間の超音波処理により、除去し、連続する50nmの金薄膜中にコロイド粒子の直径のSiパッチを残した。この無機パターンを、10分間のUVオゾンプラズマ処理によってさらに清浄化し、次いで、アミノプロピルトリメトキシシラン(APTMS,CAS−no.13822−56−5)に対して、液相からの蒸着によるか、あるいは2mMのAPTMS/トルエン溶液からの吸着によるかのいずれかにより、直ちにさらした。純クロロホルム中における更なる10分間の清浄化処理の後に、EDC/NHSカップリングによって、Siパッチ上のAPTMSにビオチンを結合させた。次いで、これらの試料を、金薄膜に抗細胞性を付与すべく、PEG−チオール溶液の中に浸漬した。その後、Siパッチ上の表面固定化ビオチンにストレプトアビジンを結合させ、これによって、ビオチン標識APL細胞のための固定部位を与えた。将来のバイオセンサでは、マイコプラズマ細胞膜の中へ挿入されたそのようなビオチン標識は、更にその細胞膜中へのリゲートの組み込みのために使用され得る。
図19はパターン化実験のいくつかの結果を示している。非パターン化表面の曝露は、典型的には細胞のクラスタの固定化を引き起こす(図12,16および18を参照)が、ナノパターン化は主として、個々の細胞の吸着をもたらす。この傾向は、図19(d)および19(e)に示された知見によって示されるように、パターン化パッチの実際の寸法にいくぶん依存していないように見える。後者の像では、Siパッチの寸法(公称直径が500nm)と同一である1つの細胞は、そのパッチを取り巻いている金構造体によって維持されかつ中心化されているように見えるが、図19(d)における細胞は、約1μmというそのパッチのいっそう大きい寸法のために、必ずしも金構造体に接触していない。吸着細胞の密度は、例えば懸濁液中の非クラスタ化細胞の割合を増加させることによって、さらに改善することができる。また、接着プロトコルは将来、最適化される必要があろう。いずれにしても、表面のPEG被覆金領域では細胞吸着が観察されていないので、現在の結果によって、Siパッチの上へのAPL細胞吸着についての表面の選択性が実証されており、それによって、単一のAPL細胞をパターン化することによって、サブミクロン寸法のバイオセンシングのための生体機能的インターフェイスを生成する方法の実現可能性が証明されている。
この実施形態の実際の用途について、バイオセンシングのために調製された生体機能的インターフェイスの寿命および諸特性の持続性は、長い保存時間の後においても最高に重要なものである。以下に、われわれは、APL培養物をその生命力を失うことなく数日間、凍結することができる、ということを示す。従って、これらの細胞は、バイオセンシングのためにもまた必要である、特異性および流動性などのすべての細胞膜機能をもまたもたらし、そのような諸特性は、増殖および成長などのいっそう高い細胞機能のために必要である。
MycoMにおける3日間APL培養物を37℃の水浴から取り出し、−30℃の冷凍庫の中に置いた。3日後、その凍結培養物の最小部分を取得し、実施例1に説明されたように、MycoMに植菌するために使用した。2日後、その培養物を、実施例2の第1段落に説明されたように処理した。OD260nmでおよそ2.0の吸収度のある細胞懸濁液をシリコンチップへ添加し、37℃で2時間、維持した後、PBS4%のグルタルアルデヒドの中へのそのまま移送した。このチップはその後、10nmの金で被覆され、次いでSEMによって観察された。
図20は、このようにして得られた培養物のSEM像を示している。これらの細胞には、成長の前に凍結されなかった培養物(図12)の場合と同じ外観があるので、MycoM培養基における凍結は細胞機能へのどのような不都合も引き起こさない、と結論付けることができる。
Claims (12)
- 感知対象である標的分子の存在に起因する物理的変化が発生した場合に、この物理的変化を機械的に検知可能な変化に変換するための基材であって、この物理的変化を感知するための感知領域のある表面を有する基材と、
細胞膜を有するモリクテス綱を前記感知領域上に固定化するための接着材料と、
前記接着材料で前記感知領域上に固定化された前記モリクテス綱とを有し、
前記モリクテス綱の前記細胞膜が、感知対象である標的分子に対して特異的に結合可能な生体機能的インターフェイスを構成する、
前記標的分子を感知するためのバイオセンサチップ。 - 前記感知領域に属さない前記基材の前記表面の部分上に前記モリクテス綱が固定化されるのを防止するための抗細胞材料、
をさらに有してなる請求項1に記載のバイオセンサチップ。 - 前記接着材料が、
前記モリクテス綱の本体部を前記感知領域上に固定化するための第1の接着材料であって、前記モリクテス綱の本体部に特異的に結合する第1の接着材料、及び、
前記モリクテス綱の先端部を前記基材の前記表面に固定化するための第2の接着材料であって、前記モリクテス綱の先端部に特異的に結合する第2の接着材料、
を有してなる請求項1に記載のバイオセンサチップ。 - 前記モリクテス綱の前記細胞膜中へ埋め込まれた、特異的認識を行うことのできる生体分子、
を有してなる請求項3に記載のバイオセンサチップ。 - 複数の感知領域が前記基材中へ埋め込まれ、
前記接着材料が、前記複数の感知用領域の一部のみに配置されている、
請求項1に記載のバイオセンサチップ。 - 前記基材が、光学的キャビティを画定するための表面を有し、共鳴再循環により光を該粒子の該表面内に封ずる粒子を備え、および
該粒子の該表面の一部が、該基材の該表面の外側へ露出されて該粒子の該表面の前記一部によって前記感知領域を構成する、
請求項1に記載のバイオセンサチップ。 - 請求項4に記載のバイオセンサチップと、
該感知領域における質量または屈折率の変化を検出するためのトランスデューサと、
前記バイオセンサチップに分析対象物を供給するフローセルと、
を有してなる標的分子を感知するためのバイオセンサ。 - 感知対象である標的分子の存在に起因する物理的変化が発生した場合に、この物理的変化を機械的に検知可能な変化に変換するための基材であって、この物理的変化を感知するための感知領域のある表面を有する基材を調製する工程、および
細胞膜を有するモリクテス綱を前記感知領域上に固定化するために前記感知領域上に接着材料を配置する工程と、
前記接着材料で前記感知領域上に前記モリクテス綱を固定化する工程とを有し、
前記モリクテス綱の前記細胞膜が、感知対象である標的分子に対して特異的に結合可能な生体機能的インターフェイスを構成する、
前記標的分子を感知するためのバイオセンサチップの製造方法。 - 前記感知領域に属さない前記基材の前記表面の一部に、前記モリクテス綱が前記基材の前記表面の一部に固定化されるのを防止するための抗細胞材料を配置する工程、
をさらに有してなる請求項8に記載のバイオセンサチップの製造方法。 - 前記接着材料が、
前記モリクテス綱の本体部を前記感知領域上に固定化するための第1の接着材料であって、前記モリクテス綱の本体部に特異的に結合する第1の接着材料、及び、
前記モリクテス綱の先端部を前記基材の前記表面に固定化するための第2の接着材料であって、前記モリクテス綱の先端部に特異的に結合する第2の接着材料、
を有してなる請求項8に記載のバイオセンサチップの製造方法。 - 特異的認識を行うことのできる生体分子を、脂質分子がモリクテス綱の細胞膜中に組織化され得るように該生体分子を該脂質分子に結合させることにより、該モリクテス綱の該細胞膜中に埋め込む工程、
を有してなる請求項8に記載のバイオセンサチップの製造方法。 - 特異的認識を行うことのできる生体分子を、モリクテス綱が該モリクテス綱の細胞膜中に該生体分子を発現させ得るように、該細胞膜中の該生体分子の発現に必要な少なくとも1つの配列によって内在性DNA配列を変更するか、または、プラスミドもしくはバクテリオファージにて前記モリクテス綱を形質転換することによって、前記モリクテス綱の前記細胞膜中へ埋め込む工程、
を有してなる請求項8に記載のバイオセンサチップの製造方法。
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