KR20010082176A - 유전자 변형된 미생물의 폴리하이드록시알카노에이트 생성체 - Google Patents
유전자 변형된 미생물의 폴리하이드록시알카노에이트 생성체 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20010082176A KR20010082176A KR1020017002093A KR20017002093A KR20010082176A KR 20010082176 A KR20010082176 A KR 20010082176A KR 1020017002093 A KR1020017002093 A KR 1020017002093A KR 20017002093 A KR20017002093 A KR 20017002093A KR 20010082176 A KR20010082176 A KR 20010082176A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- gene
- pha
- microorganism
- phb
- pseudomonas
- Prior art date
Links
- 229920000903 polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 title claims abstract description 95
- 239000005014 poly(hydroxyalkanoate) Substances 0.000 title claims abstract description 83
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 134
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 46
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 29
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 83
- 229920000070 poly-3-hydroxybutyrate Polymers 0.000 claims description 70
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 28
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 26
- 241000252867 Cupriavidus metallidurans Species 0.000 claims description 22
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 17
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 16
- 108010078304 poly-beta-hydroxybutyrate polymerase Proteins 0.000 claims description 14
- 241000589153 Zoogloea ramigera Species 0.000 claims description 12
- 241000607516 Aeromonas caviae Species 0.000 claims description 11
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 11
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 10
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 claims description 10
- 241000193033 Azohydromonas lata Species 0.000 claims description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 9
- 108010024700 poly(3-hydroxyalkenoate)polymerase Proteins 0.000 claims description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 7
- 241000927377 Pseudomonas acidophila Species 0.000 claims description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 6
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 5
- 108010010718 poly(3-hydroxyalkanoic acid) synthase Proteins 0.000 claims description 5
- 241000589151 Azotobacter Species 0.000 claims description 4
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 3
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims description 3
- 102000002932 Thiolase Human genes 0.000 claims description 3
- 108060008225 Thiolase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 108010003902 Acetyl-CoA C-acyltransferase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010033574 phasin Proteins 0.000 claims description 2
- 229920000739 poly(3-hydroxycarboxylic acid) polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 2
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 claims 5
- 108010069175 acyl-CoA transferase Proteins 0.000 claims 3
- 241000607534 Aeromonas Species 0.000 claims 2
- 241000588881 Chromobacterium Species 0.000 claims 2
- 241000588879 Chromobacterium violaceum Species 0.000 claims 2
- 102000011426 Enoyl-CoA hydratase Human genes 0.000 claims 2
- 108010023922 Enoyl-CoA hydratase Proteins 0.000 claims 2
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 claims 2
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 claims 2
- 241001299904 Pseudomonas sp. 61-3 Species 0.000 claims 2
- 241000982080 Trophis Species 0.000 claims 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims 2
- 102100029103 3-ketoacyl-CoA thiolase Human genes 0.000 claims 1
- 241000512005 Alstonia Species 0.000 claims 1
- 101001074429 Bacillus subtilis (strain 168) Polyketide biosynthesis acyltransferase homolog PksD Proteins 0.000 claims 1
- 101000936617 Bacillus velezensis (strain DSM 23117 / BGSC 10A6 / FZB42) Polyketide biosynthesis acyltransferase homolog BaeD Proteins 0.000 claims 1
- 241000143939 Colias eurytheme Species 0.000 claims 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000012976 mRNA stabilization Effects 0.000 claims 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 claims 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 87
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 38
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 18
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 16
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 abstract description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 abstract description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 abstract description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 abstract description 2
- 208000037534 Progressive hemifacial atrophy Diseases 0.000 description 75
- 238000012017 passive hemagglutination assay Methods 0.000 description 74
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 42
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 42
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 38
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 33
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 33
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 33
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 33
- 101150048611 phaC gene Proteins 0.000 description 33
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 32
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 32
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 15
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 15
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 15
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 15
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 14
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 14
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 13
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 10
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 9
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000589781 Pseudomonas oleovorans Species 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 8
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 7
- 101150097421 phaJ gene Proteins 0.000 description 7
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 7
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 7
- 101100243777 Dictyostelium discoideum phbB gene Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 6
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 6
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 6
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 6
- 101150110984 phaB gene Proteins 0.000 description 6
- 229920000520 poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) Polymers 0.000 description 6
- 101100278012 Escherichia coli (strain K12) dnaG gene Proteins 0.000 description 5
- 229920001736 Metabolix Polymers 0.000 description 5
- 101100165173 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) basS gene Proteins 0.000 description 5
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 5
- 101100421924 Thermus thermophilus (strain ATCC BAA-163 / DSM 7039 / HB27) spo0C gene Proteins 0.000 description 5
- 101150004979 flmA gene Proteins 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 5
- 101150048892 parB gene Proteins 0.000 description 5
- -1 3-ketoacyl-CoA Chemical compound 0.000 description 4
- YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 4-Butyrolactone Chemical group O=C1CCCO1 YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 4-hydroxybutyrate Chemical compound OCCCC([O-])=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 101100243766 Dictyostelium discoideum phbA gene Proteins 0.000 description 4
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 4
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 4
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 4
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108091000039 acetoacetyl-CoA reductase Proteins 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 4
- 229940099112 cornstarch Drugs 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 4
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 101150046540 phaA gene Proteins 0.000 description 4
- 101150030205 phaG gene Proteins 0.000 description 4
- 229920000071 poly(4-hydroxybutyrate) Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 4
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 4
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 4
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 4
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 101150075835 Abr gene Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101100263205 Coxiella burnetii (strain RSA 493 / Nine Mile phase I) uspA2 gene Proteins 0.000 description 3
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 3
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 3
- 241000168053 Pseudomonas denitrificans (nomen rejiciendum) Species 0.000 description 3
- 241000589196 Sinorhizobium meliloti Species 0.000 description 3
- 241000192581 Synechocystis sp. Species 0.000 description 3
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 3
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 150000001261 hydroxy acids Chemical group 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N propionyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 101150004840 uspA gene Proteins 0.000 description 3
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 3
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutyric acid Chemical compound CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HPMGFDVTYHWBAG-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxyhexanoic acid Chemical compound CCCC(O)CC(O)=O HPMGFDVTYHWBAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000205042 Archaeoglobus fulgidus Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 2
- 101001072202 Homo sapiens Protein disulfide-isomerase Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 241000186362 Mycobacterium leprae Species 0.000 description 2
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 102100036352 Protein disulfide-isomerase Human genes 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 2
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001273 butane Substances 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 101150115959 fadR gene Proteins 0.000 description 2
- 239000005350 fused silica glass Substances 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 2
- MZFOKIKEPGUZEN-FBMOWMAESA-N methylmalonyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C(C(O)=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MZFOKIKEPGUZEN-FBMOWMAESA-N 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N n-butane Chemical compound CCCC IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N n-pentane Natural products CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 230000033578 poly(3-hydroxyalkanoate) metabolic process Effects 0.000 description 2
- 229920002791 poly-4-hydroxybutyrate Polymers 0.000 description 2
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 101150076849 rpoS gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 2
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001791 ((R)-3-Hydroxybutanoyl)(n-2) Polymers 0.000 description 1
- WHBMMWSBFZVSSR-GSVOUGTGSA-N (R)-3-hydroxybutyric acid Chemical group C[C@@H](O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- FYSSBMZUBSBFJL-VIFPVBQESA-N (S)-3-hydroxydecanoic acid Chemical compound CCCCCCC[C@H](O)CC(O)=O FYSSBMZUBSBFJL-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- UZZCGWRHMKZRER-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutanoic acid;3-hydroxyoctanoic acid Chemical compound CC(O)CC(O)=O.CCCCCC(O)CC(O)=O UZZCGWRHMKZRER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QHHKKMYHDBRONY-RMNRSTNRSA-N 3-hydroxybutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QHHKKMYHDBRONY-RMNRSTNRSA-N 0.000 description 1
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 3-hydroxybutyrate Chemical group CC(O)CC([O-])=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NDPLAKGOSZHTPH-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxyoctanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)CC(O)=O NDPLAKGOSZHTPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NFOYYXQAVVYWKV-HDRQGHTBSA-N 3-oxohexanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(=O)CCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 NFOYYXQAVVYWKV-HDRQGHTBSA-N 0.000 description 1
- 102000004672 Acetyl-CoA C-acyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 241000588624 Acinetobacter calcoaceticus Species 0.000 description 1
- 241000588625 Acinetobacter sp. Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 1
- 241000190857 Allochromatium vinosum Species 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 101100029586 Arabidopsis thaliana PHB4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000370685 Arge Species 0.000 description 1
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 1
- 241000589938 Azospirillum brasilense Species 0.000 description 1
- 241000589149 Azotobacter vinelandii Species 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 description 1
- 241000589513 Burkholderia cepacia Species 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000244202 Caenorhabditis Species 0.000 description 1
- 101100297395 Caenorhabditis elegans pha-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000222178 Candida tropicalis Species 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000193401 Clostridium acetobutylicum Species 0.000 description 1
- 241000186570 Clostridium kluyveri Species 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 240000004244 Cucurbita moschata Species 0.000 description 1
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 1
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 1
- 241000219919 Cuphea lanceolata Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000272185 Falco Species 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000605986 Fusobacterium nucleatum Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 241001509401 Gordonia rubripertincta Species 0.000 description 1
- 108091033454 Hok/sok system Proteins 0.000 description 1
- 241000243251 Hydra Species 0.000 description 1
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 101100363550 Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo-bovis (strain L550) rpsE2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100038261 Methanococcus vannielii (strain ATCC 35089 / DSM 1224 / JCM 13029 / OCM 148 / SB) rpo2C gene Proteins 0.000 description 1
- 101100254826 Methanopyrus kandleri (strain AV19 / DSM 6324 / JCM 9639 / NBRC 100938) rps5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589308 Methylobacterium extorquens Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241000187480 Mycobacterium smegmatis Species 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000600898 Nocardia salmonicolor Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000589597 Paracoccus denitrificans Species 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102100031169 Prohibitin 1 Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000960597 Pseudomonas fluorescens group Species 0.000 description 1
- 241000589538 Pseudomonas fragi Species 0.000 description 1
- 101100463818 Pseudomonas oleovorans phaC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000232299 Ralstonia Species 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 241001148115 Rhizobium etli Species 0.000 description 1
- 241000589187 Rhizobium sp. Species 0.000 description 1
- 241000191025 Rhodobacter Species 0.000 description 1
- 241000187563 Rhodococcus ruber Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 239000004990 Smectic liquid crystal Substances 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000193446 Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum Species 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000736888 Thiocystis violacea Species 0.000 description 1
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 1
- 240000009239 Tulbaghia violacea Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Natural products NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000607618 Vibrio harveyi Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N acetoacetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XYOVOXDWRFGKEX-UHFFFAOYSA-N azepine Chemical compound N1C=CC=CC=C1 XYOVOXDWRFGKEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- BYKWTTBGNVXQAB-UHFFFAOYSA-N butyl 4-hydroxybutanoate Chemical compound CCCCOC(=O)CCCO BYKWTTBGNVXQAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000003965 capillary gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M chloromercury Chemical compound [Hg]Cl RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000010960 commercial process Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 101150076598 dnaB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 101150069125 fadB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 101150045500 galK gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M octanoate Chemical compound CCCCCCCC([O-])=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- 108060005675 oleate hydratase Proteins 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- VOUGEZYPVGAPBB-UHFFFAOYSA-N penicillin acid Natural products OC(=O)C=C(OC)C(=O)C(C)=C VOUGEZYPVGAPBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150070013 pfl gene Proteins 0.000 description 1
- 101150101386 phbB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920001013 poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 101150085857 rpo2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150090202 rpoB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150027173 rpsE gene Proteins 0.000 description 1
- YYGYPCRWZMLSGK-XMWLYHNJSA-N s-[2-[3-[[(2r)-4-[[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-3-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxy-2-hydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoylamino]ethyl] 3-hydroxypentanethioate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)CC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 YYGYPCRWZMLSGK-XMWLYHNJSA-N 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N succinyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- 229920001169 thermoplastic Polymers 0.000 description 1
- 239000012815 thermoplastic material Substances 0.000 description 1
- 239000004416 thermosoftening plastic Substances 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/13—Transferases (2.) transferring sulfur containing groups (2.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
- C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/829—Alcaligenes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/831—Azotobacter
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/874—Pseudomonas
- Y10S435/877—Pseudomonas putida
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Biological Depolymerization Polymers (AREA)
- Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
Abstract
염색체상에 삽입된 폴리하이드록시알카노에이트를 만드는 데 필요한 유전자를 포함한 유전자변형된 미생물 균주가 제공된다. 그 균주는 폴리하이드록시알카노에이트 생성과정에 있어서 다음과 같은 장점이 있다. 첫째, 유지해야 할 플라스미드가 없으므로 일반적으로 항생제의 사용 또는 그의 안정화 장치가 필요하지 않다. 둘째, 플라스미드의 상실이 일어나지 않으므로 발효과정동안 세포당 유전자 복제수를 안정되게 하여 결과적으로 생성과정동안 균질한 폴리하이드록시알카노에이트를 생성하게 한다. 유전자는 일반적인 기술을 통해 삽입되며, 바람직하게는 트란스포손 돌연변이(TRANSPSON MUTAGENESIS)를 이용한다. 복합 유전자가 삽입된 보다 바람직한 실시예에서 이들은 오페론으로써 결합되어 있다.
Description
폴리 3 하이드록시알카노에이트(PHAs)는 다양한 세균에 의해 합성되는 생물학적 폴리에스테르이다. 이들 폴리머는 생분해성과 생체적합성 특성을 갖는 열가소성 물질이며, 다양한 산업적 생의학적 응용이 가능한 재생 자원으로부터 생성된다(Williams & Peoples,CHEMTECH 26:38-44(1996). PHA 생물폴리머는 본래 단일 호모폴리머인 폴리 3 하이드록시뷰틸레이트(PHB)가 다른 모노머 조성물과 다양한 물리적 특성들을 갖는 폴리에스테르의 넓은 클래스에 포함되면서 알려지게 되었다. 약 100여개의 다른 모노머들이 PHA 폴리머에 삽입되어 있다(Steinbuchel & Valentin,FEMS Microbiol. Lett. 128:219-28(1995).
PHAs는 사이드 체인의 길이와 그들의 생합성 경로에 따라 두 군으로 나뉜다. 알 3 하이드록시뷰틸산(R-3-hydroxybutyric acid) 유니트의 호모 폴리머인 PHB 같은 짧은 사이드 체인을 갖는 것들은 결정체의 열가소성 물질이다. 반면에 긴 사이드 체인을 갖는 PHA보다 탄성을 갖는다. 전자는 알려진 지 약 70년정도 되었다(Lemoigne & Roukhelman, 1925). 반면에 후자는 비교적 최근에 알려졌다(deSmet et al.,J. Bacteriol.154:870-78 1983). 그러나 이 명칭 전에는, 알 3 하이드록시뷰틸산 유니트와 C5에서 C16에 이르는 보다 긴 사이드 체인 알 3 하이드록시 산 유니트를 둘다 갖는 세균의 PHAs가 동정되었다(Wallen & Rohweder, Environ. Sci. Technol.8:576-79 1974). 알 3 하이드록시뷰틸산의 공중합체와 5번 내지 16번의 탄소원자를 포함하는 하나 이상의 긴 사이드 체인 하이드록시 산 유니트를 생성하는 다수의 세균이 동정되었다(Steinbuchel & Wiese,Appl. Microbiol. Biotechnol. 37:691-97 1992); Valentin et al.,Appl. Microbiol. Biothchnol. 36:507-14 1992); Valentin et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol. 40:710-16 1994); Abe et al.,Int. J. Biol. Macromol. 16:115-19 1994); Lee et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol. 42:901-09 1995); Kato et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol. 45:363-70 1996); Valentin et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol.46:261-67 1996); U.S. Patent No. 4,876,331 to Doi). 위에서 약술한 두개의 생합성 경로 모두 하이드록시 산 모노머를 형성한다. 이들 공중합체는 PHB-co-HX(여기서 X는 3 하이드록시알카노에이트 내지 알카노에이트 내지 6 또는 그 이상의 탄소의 알케노에이트를 말한다)로 나타낼 수 있다. 특정한 두가지 성분의 공중합체의 적당한 예로 폴리 PHB-co-3-하이드록시헥사노에이트가 있다(Brandl et al., Int.J. Biol. Macromol. 11:49-55 1989); Amos & McInerey,Arch. Microbiol. 155:103-06 1991); U. S. Patent No. 5,292,860 to Shiotani et al.).
이들과 관련해서 다양한 미생물에 의한 PHA 생성은 생장 배지의 복잡성, 긴 발효과정 혹은 특정 세균 균주의 하류 가공(downstream processing)의 어려움때문에 상업적으로 유용하지 못하다.E. coli같이 빠르게 성장하는 생물을 이용하여 유전공학적으로 제작된 PHA 생성 시스템이 개발되어 왔다. 또한 유전공학을 통해 특정 공중합체의 생성을 개선하고 혹은 다른 기질 특이성을 갖는 PHA 생합성 효소를 첨가함으로써 다른 PHA 폴리머를 생성할 수 있는 능력 및 심지어 자연계에 역학적 특징을 부여하는 개선된 야생형의 PHA 생성 미생물을 만든다. 이러한 타입의 시스템의 예는 Steinbuchel & Valentin,FEMS Microbiol. Lett.128:219-28 (1995)에서 설명하고 있다. PCT WO 98/04713은 PHA 합성 효소의 레벨을 조절하기 위해 유전공학을 이용하여 분자량을 조절하는 방법을 설명하고 있다. 알칼리제네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus, 개명한 명칭은 발스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha), 알칼리제네스 라투스(Alcaligenes latus), 아조토박터 빈란디(Azotobacter vinlandii)와 슈도모나즈(Pseudomonads)를 포함해서 PHAs를 생성하는 상업적으로 유용한 균주는 Lee,Biotechnology & Bioengineering 49:1-14 (1996)와 Braunegg et al., (1998),J. Biotechnology65:127-161에 나와 있다.
재조합형 PHA 생성 균주의 개발은 두가지 방향으로 진행되어 왔다. 첫번째 경우에 있어서, 균주는 재조합형E. coli에서 생성되어 왔던 공중합체를 생성하도록 개발되었다. 이들 공중합체는 폴리 3 하이드록시뷰틸레이트-코-3-하이드록시발러레이트(poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate), PHBV), 폴리 3 하이드록시뷰틸레이트-코-4-하이드록시뷰틸레이트(poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate), P3HB-co-4HB), 폴리 4 하이드록시뷰틸레이트(poly(4-hydroxybutyrate), P4HB)와 3 하이드록시옥타노에이트(3-hydroxyoctanoate) 유니트로 구성된 긴 사이드 체인를 갖는 PHAs를 포함한다(Madison and Huisman, 1999). 플라스미드상에phb유전자를 포함하는E. coli균주는 P(3HB-3HV)를 생성하도록 개발되어왔다(Slater, et al.,Appl. Environ. Microbiol. 58:1089-94 1992); Fidler & Dennis,FEMS Microbiol. Rev. 103:231-36 1992); Rhie & Dennis,Appl. Environ. Micobiol. 61:2487-92 1995); Zhang, H. et al.,Appl. Environ. Microbiol. 60:1198-205 1994).E. coli에서 P(4HB)와 P(3HB-4HB)의 생성은 대사적으로 관련이 없는 경로로부터 P(3HB) 생성체에 유전자를 삽입함으로써 이루어진다(Hein, et al.,FEMS Microbiol. Lett. 153:411-18 1997); Valentin & Dennis,J. Biotechnol. 58:33-38 1997). 또한E. coli는fadB:kan 돌연변이체에P.aeruginosa의phbC1과phbC2유전자를 삽입함으로써 중간에 폴리하이드록시알카노에이트(msc-PHAs)의 짧은 체인을 생성하도록 제작되었다(Langenbach, et al.,FEMS Microbiol. Lett. 150:303-09 1997); Qi, et al.,FEMS Microbiol. Lett. 157:155-62 1997).
비록 종래의 연구들에서,E. coli에서 PHB 폴리머라아제, -케토티오라아제와 아세토아세틸 코 에이(acetoacetyl-CoA) 환원제를 코딩하는A. eutrophus의 PHB 생합성 유전자의 발현으로 PHB가 생성됨을 입증했더라도(Slater, et al.,J.Bacteriol. 170:4431-36 1988); Peoples & Sinskey,J. Biol. Chem. 264:15298-303 1989); Schubert, et al.,J. Bacteriol. 170:5837-47 1988)), 이들 결과는 기본적으로 복제가능한 플라스미드 벡터를 이용하여 얻어졌으며, 이들 균주는 산업환경에서 천연 생성체에 상응하는 레벨로 축적할 수 있는 능력이 없기 때문에 그 시스템은 상업적 생산에는 적당하지 못하다.
상업적 생산을 위해서, 이들 균주는 저비용의 산업환경에서 대규모의 발효에 적당하도록 만들어져야 한다. 유가배양(fed-batch culture)을 이용한 재조합형 P(3HB)생성 실험에 대한 첫번째 보고에는 산도가 조절되는 시스템(pH-stat controlled system)을 이용하여 42시간동안 90g/L의 P(3HB)를 생성하는 비싼 복합 배지를 이용했다(Kim, et al.,Biotechnol. Lett. 14:811-16 1992). 중간 내지 높은 복제수를 갖는 플라스미드로부터 유도된 안정된 플라스미드를 이용한 경우, 후자 타입의 플라스미드를 포함한E. coliXL 1-Blue가 상당량의 P(3HB) 축적에 필요하다고 보고되어 있다(Lee, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci.721:43-53 1994). 2% 글루코우즈(glucose)/LB 배지에서 유가배양 발효동안, 이 균주는 시간당 2.1g/L의 생산성으로 81% P(3HB)를 생성했다(Lee, et al.,J. Biotechnol.32:203-11 1994). P(3HB)의 생산성은 최소배지에서 시간당 0.46g/L으로 감소되었지만, 효모 추출물(yeast extract), 트립톤(tryptone), 카사미노 산(casamino acid)과 콜라겐 하이드롤리세이트(collagen hydrolysate)같은 합성 질소원을 첨가함으로써 회복될 수 있었다(Lee & Chang, Adv.Biochem. Eng. Biotechnol. 52:27-58 1995); Lee, et al.,J. Ferment. Bioeng. 79:177-80 1995).
재조합형E. coliXL 1-Blue가 상당량의 P(3HB)를 합성할 수 있다할 지라도, 세포의 극적인 섬유화 특히 제한배지에서의 생장은 감소된다(Lee, et al.,Biotechnol. Bioeng. 44:1337-47 1994); Lee,Biotechnol. Lett. 16:1247-52 1994); Wang & Lee,Appl. Environ. Microbiol. 63:4765-69 1997). 이 균주에서 FtsZ의 과도한 발현(overexpression)으로 인해, 생체량(biomass) 생성은 20% 정도 개선되었으며, P(3HB)의 레벨은 두배로 되었다(Lee & Lee, J. Environ. Polymer Degrad.4:131-34 1996). 이 재조합형 균주는 제한배지에서 세포 건조중량의 70%에 해당하는 104g/L의 P(3HB)를 생성했다. 그러나 시간당 2g/L라는 체적 생산성은R. eutropha가 생산할 수 있는 것보다 낮다. 게다가 세포의 약 15%가 발효 말기에 PHB를 생성할수 있는 능력을 상실했다(Wang & Lee, Biotechnol. Bioeng.58:325-28 1998).
기록된 바에 따르면 재조합형E. coliP(3HB-3HV) 생성체는 고밀도로 자랄수 없어 상업적 공정에 적합하지 않다(Yim, et al.,Biotechnol. Bioeng. 49:495-503 1996). 재조합형 균주에서 P(3HB-3HV) 생성을 개선하기 위해, 4개의E. coli균주(XL1-Blue, JM109, HB101, DH5 )가 Yim 등에 의해 실험되었다. 4개의 재조합형E. coli균주 모두 글루코우즈와 프로피오네이트(propionate)에 7% HV 프렉션(fraction)이 포함된 상태에서 자랄 경우 P(3HB-3HV)를 합성했다(Yim, et al.Biotechnol. Bioeng. 49:495-503 1995). 연구되었던 다른 균주들과는 달리(Slater, et al.,Appl. Environ. Microbiol. 58:1089-94 1992), 재조합형 XL 1-Blue는 프로피온산(propionic acid)의 농도가 0에서 80mM 일 때 10%보다 적은 HV를 넣는다. 108세포수/ml 의 세포 밀도로 아세테이트(acetate)상에서 세포를 미리 배양한 후 글루코우즈와 프로피오네이트를 첨가시켜 자라게 함으로써 HV 혼합과 PHA 형성이 증가되었다. 또한 올리에이트(oleate) 보충은 HV 혼입을 촉진했다. 아세테이트상에서 미리 자라게 하고 올리에이트를 보충함으로써 세포 밀도가 8g/L에 이르렀을 경우 이 재조합형 XL 1-Blue는 75%가 0.16의 HV 프렉션을 포함한 P(3HB-3HV)였다(Yim, et al.,Biotechnol. Bioeng. 49:495-503 1996).
재조합형 생물에서 P(3HB)를 생성하는 데 필요한 첫 번째 조건은 발효동안 PHB 유전자가 안정되고 일정하게 발현되는 것이다. 재조합형 생물에 의한 P(3HB)의 생성은 종종 대다수의 세균군으로부터 플라스미드의 상실로 인해 방해를 받는다. 그러한 안정성에 대한 문제점은 생체량 보다는 플라스미드를 복제하고 아세틸-코 에이(acetyl-CoA)가 P(3HB)로 전환하는P(3HB)를 합성하는 데 필요한 대사의 로드(load)에 있다. 게다가, 플라스미드 복제수는 종종 계속된 발효로 인해 감소한다. 왜냐하면 몇몇의 복제된 플라스미드만이 항생물질 내성을 제공하거나parB를 포함함으로써 세포 사멸을 막는 복제는 거의 없기 때문이다. 이러한 이유로 인해, 상실된 플라스미드는 30℃에서 플라스미드의 복제수(copy number)는 억제되도록 설계되었으며, 38℃로 온도를 바꿈으로써 플라스미드 복제를 유도하도록 했다(Kidwell, et al.,Appl. Environ. Microbiol. 61:1391-98 1995). 이러한 시스템을 이용하여, 시간당 1g/L의 부피로 P(3HB)의 생성을 유도한 후 15시간내에 세포 건조중량의 약 43%로 P(3HB)가 생성되었다. 비록 이 생산성이 천연 P(3HB) 생성체와 같은 부피로 상응한다 해도, 이들parB-안정된 상실된 레플리콘(replicon)을 갖는 균주 역시 장기간의 발효동안 P(3HB)를 축적할 수 있는 능력을 상실한다.
높은 세포 밀도 발효에서phb유전자의 불안정성은 세포의 P(3HB) 산출을 감소시킴으로써 PHA 비용에 영향을 미치는 한편, 공급원료의 비용은 또한 비교적 고가의 PHAs에 영향을 미친다. P(3HB) 생성에 사용되는 가장 일반적인 기질은 글루코우즈이다.
따라서,E. coli와 클렙시엘라(Klebsiella) 균주는 글루코우즈보다 33-50% 낮은 비용의 당밀이 첨가된 상태에서 P(3HB) 형성을 위해 실험되었다(Zhang, et al.,Appl. Environ. Microbiol. 60:1198-1205 1994). 당밀의 주 탄소원은 자당(sucrose)이다. 6% 슈가래인(sugarane) 당밀을 포함한 최소 배지에서 자란 플라스미드상에phb로커스(locus)를 갖는 재조합형E. coli와K. aerogenes균주는 세포 건조중량의 45%에 해당하는 대략 3g/L의 P(3HB)를 축적했다.K. aerogenes가 유일한 탄소원인 당밀이 첨가된 10L 발효조에서 페드 배취(fed-batch)로 자랄 경우, P(3HB)는 24g/L에 해당하는 70%의 세포 건조중량으로 축적된다. 비록K. aerogenes의phb플라스미드가 불안정할 지라도, 이러한 균주 특히fadR돌연변이체는 프로피오네이트가 첨가된 경우 55%까지 3HV를 혼입하기 때문에 당밀상에서 P(3HB) 생성체로써 전망을 보인다(Zhang, et al.,Appl. Environ. Microbiol. 60:1198-1205 1994).
데니스의 미국 특허 제 5,334,520 호에는phbCAB유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된E. coli에서 PHB 형성을 밝혔다. rec-, lac+ E. coli균주는 유장(whey)에서 자라게 되며 밝혀진 바에 따르면 세포 건조중량의 85% 정도의 PHB를 축적한다. 데니스등의 미국 특허 제 5,371,002 호에는 구조적으로 유도되거나 또는 플라스미드로부터 기인한 아세테이트 유전자를 발현하는 숙주에서phb유전자를 갖는 높은 복제수를 갖는 플라스미드를 이용하여 재조합형E. coli에서 PHA를 생성하는 방법을 밝혔다. 데니스의 미국 특허 제 5,512,456 호는 형질전환된E. coli균주로부터 PHB의 생성과 회수 방법을 밝히고 있다. 이들E. coli균주는phb유전자를 포함한 벡터와 리소자임(lysozyme)을 포함한 벡터로 갖추어져 있다. 높은 복제수를 갖는 플라스미드 내지 상실된 레플리콘들은 생산성 개선을 위해 이용된다. 벡터는parB혹은supF/dnaB(am)에 의해 안정된다. 그러한 균주를 이용하여, 세균 집단에 의해 플라스미드가 점차적으로 상실된 후 25시간당 46g/L 해당하는 시간당 1.7g/L의 PHB 생산성을 얻었다. PCT WO94/21810에는 탄소원으로 자당을 갖는E. coli와 클렙시엘라 에어로제네스(Klebsiella aerogenes)의 재조합형 균주에서 PHB의 생성을 밝히고 있다. PCT WO 95/21257에는 형질전환된 원핵생물 숙주에서 PHB의 증진된 생성을 개시하고 있다. 전사 조절 서열과 리보좀(ribosome) 결합 사이트의 개선은phb유전자를 기본으로 한 플라스미드에 의한 PHB 형성을 개선한다. 플라스미드는parB로커스에 의해 안정된다. 단지 78 뉴클레오티드(nucleotide) 대신에R. eutro의phbC의 상류(upstream)에서 발견되는 361 뉴클레오티드를 포함함으로써 이 구조물로 인한 PHB 생성은 두배가 된다. 일반적으로 재조합형 미생물에의한 PHB 생성은 안정된 플라스미드를 이용하여 높은 레벨의 발현을 필요로 한다고 여긴다. 플라스미드는 세포에서 100여개에서 수백개에 이르는 다수 복제(multiple copies)로 이용될 수 있기 때문에, 관련된 유전자의 다수 복제가 있는 상태에서 플라스미드의 이용은 안전하다. 플라스미드가 상실될 지도 모르기 때문에, 안전 기능이 도입된다. 상기에서 설명한 그러한 시스템은 PHB 생성을 위해 실험되었고, 산업상 발효 공정에서 이들 시스템의 유용성이 조사되었다. 그러나 전체적인 PHB 산출은 여전히phb유전자의 상실에 의해 영향을 받았다.
그러므로 본 발명의 목적은 발효동안phb유전자의 안정적이며 일정한 발현을 제공하는 한편 상업적으로 의미있는 레벨로 PHB를 축적할 수 있는 산업상 발효 공정에 유용한 재조합형 미생물 균주를 제공하기 위함이다.
본 발명의 또다른 목적은 PHA의 생성 향상을 위해 유전자변형된 미생물 균주를 제공하기 위함이다.
본 발명의 또다른 목적은 발효동안phb유전자의 안정되고 일정한 발현을 유출하며 상업적으로 의미있는 레벨로 PHB를 축적하는 유전자변형된 미생물 균주 및 그것의 이용 방법을 제공하기 위함이다.
발명의 요약
유전자변형된 미생물 균주는 염색체에 삽입된 PHA에 필요한 유전자를 포함하도록 제공된다. 그 균주는 PHA 생성과정에 있어서 다음과 같은 장점이 있다. 첫째, 플라스미드를 유지할 필요가 없으므로 일반적으로 항생제 및 다른 안정화 수단을 사용할 필요가 없다. 둘째, 플라스미드의 상실이 일어나지 않으므로 발효과정동안 세포당 유전자 복제수를 안정되게 하여 결과적으로 생성과정동안 상동 PHA를 생성하게 한다. 유전자는 일반적인 기술을 통해 삽입되며, 바람직하게는 트란스포손 돌연변이(TRANSPSON MUTAGENESIS)를 이용한다. 보다 구체적으로 말해서 여기서는 복합 유전자가 결합되어 있으며, 이들은 오페론으로써 혼입되어 있다. 서열은 인산염 농도 같은 배양조건, 온도 및 스트레스와 관련하여 발현을 유도하며, 항생제 내성을 주는 마커(marker)같은 선택 마커의 혼입을 통해 선택 분리를 돕는 mRNA를 안정시키는데 이용된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 pMNXTp1kan, pMNXTp1cat, pMSXTp1kan와 pMSXTp1cat의 구조를 도식으로 나타낸 것이다.
도 2는 pMUXC5cat의 구조를 도식으로 나타낸 것이다.
도 3은 pMUXAB5cat, pMUXTp1AB5kan, pMUXTp11AB5kan, pMUXTp12AB5kan과 pMUXTp13AB5kan의 구조를 도식으로 나타낸 것이다.
본 발명은 폴리 3 하이드록시알카노에이트의 생합성 과정을 다루고 있으며, 특히 폴리하이드록시알카노에이트의 상업적 생산에 유용한 개선된 균주에 관한 것이다.
E. coli의 염색체에 PHA 생합성 효소를 코딩하는 유전자를 무작위로 삽입함으로써, 그 수단들은 발효에 근거하는 산업 배지에서 숙주의 생장에 불필요한 사이트에서 강력한 내인성의 프로모터(promotor)로부터 높은 레벨의 발현에 직접적으로 도달하는 것과 관련되었다. 실시예에서 설명되듯이, 염색체상의 싱글 복제 유전자로부터 세포 건조중량의 85%를 초과하는 레벨로 PHA를 생성하는 이들 기술을 이용하여E. coli균주가 얻어졌다. 이들 균주에서phb유전자의 발현은R. eutro의phbC의 상류(upstream)이나 높은 복제수 구조물 어느것에도 좌우되지 않는다. 이들 균주를 이용하여phb유전자를 유지하는 것은parB또는hok/sok혹은 다른 선택적인 곤경과 같이 로커스를 안정시키는 항생제 첨가와는 별개이다. 플라스미드에 근거한 시스템에 필요한 초고율의 발현은 완전히 불필요함이 밝혀졌다. 게다가, 재조합형 플라스미드에 근거한E. coli에 대한 자료(Wang & Lee,Biotechnol. Bioeng. 58:325-28 1998)에 기록된 가장 성공적인 발효와는 달리, 이들 균주와 더불어 발효는 사실상 세포 모두가 발효 말기에 PHB를 포함하도록 한다.
낮은 복제수에도 불구하고, 이들 유전자변형된 세균은 야생형(wild-type)에 관찰되는 레벨로 PHB를 축적한다. 또한 재조합형 PHB 생성에 이용된 숙주는 플라스미드에 근거한E. coli시스템을 설계하는 데 있어 중요한 매개변수이다. 예를들어, 이와 같은 숙주의 염색체에phb유전자를 삽입함으로써 발견된 플라스미드에 근거한 시스템을 이용한 경우 W3110 균주가 빈약한 PHB 생성체였다해도, 숙주는 상업적으로 의미있는 레벨의 PHB를 축적하는 한편 우수한 생장 특징들을 보유했다.
미생물 균주를 생성하는 방법과 재료
변형된 세균 균주
다수의 세균은 폴리하이드록시알카노에이트를 생성하도록 유전적으로 제작될 수 있다. 이들은 이미 폴리하이드록시알카노에이트를 생성하며, 다른 기질을 이용하고 부가적으로 모노머를 결합시키거나 또는 생성을 증가시키기 위해 변형되는 생물 및 폴리알카노에이트를 생성하는 것은 아니지만 폴리하이드록시알카노에이트의생성에 필요한 어떤 효소에 대해 어느 것도 발현하지 않는 생물을 포함한다. 예로E. coli, 알칼리제네스 라투스(Alcaligenes latus), 알칼리제네세 유트로퍼스(Alcaligenese eutrophus), 아조토발터(Azotobacter), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)가 있다.
유전자변형된 PHB 생성체를 만드는 방법
제작된 구조물을 세균 세포의 염색체 DNA에 결합시키기 위한 방법은 종래기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 잘 알려져 있다. 대표적인 삽입 메카니즘(mechanism)으로는recBC혹은recD균주에 선상의 DNA를 이용하여 상동 재조합후 특별한 플라스미드(Hamilton et al.,J. Bacteriol.171:4617 1989; Metcalf et al.,Plasmid 35:1 1996; Mascarenhas et al.의 미국 특허 제 5,470,727호)를 이용한 P1 형질도입(Miller 1992, 세균 유전학의 단기과정:E. coli와 관련된 세균에 대한 실험안내서 및 안내서. 콜드 스프링 하버 래보러토리 프레스, 콜드 스프링 하버, 뉴욕) 또는 트란스포손에 근거한 시스템을 이용한 무작위한 삽입(Herrero et al.J. Bacteriol. 171:6557 1990; Peredelchuk & Bennett,Gene 187:231 1997; Richaud et al.의 미국 특허 제 5,595,889호; Tucker et al.의 미국 특허 제 5,102,797호)을 이용하는 것을 포함한다. 일반적으로 삽입을 포함하고 있는 미생물 균주는 삽입된 구조물에 의해 첨가되어 획득된 항생제 내성을 근거로 하여 구별된다. 그러나 또한 영양요구성(auxotrophic) 돌연변이체의 보완물이 이용될 수도 있다.
염색체상의 삽입에 있어서 특정 유전자의 발현은 삽입된 DNA 구조물에 전사를 활성화하는 서열(프로모터, promoter)을 포함함으로써 이루어질 수 있다. 잉그램 등의 미국 특허 제 5,00,000호에서 설명하듯이 사이트 통제를 받는(site-directed) 상동재조합은 특정 유전자 발현의 증폭을 겸하게 될 수 있다. 비록 소형 트란스포손(mini-transposon) 시스템이 수년동안 사용되었다 해도, 그들은 특정한 삽입 유전자의 발현 레벨이 조절되지 않도록 설계되어있다. 잉그램 등은 상동 재조합에 의해E. coli염색체에 삽입된 외부 유전자의 발현을 증가하기 위해 선택했다. 이는 전사적(transcriptional) 융합체를 만들기 위해 특정 유전자의 프로모터가 없는 클로람페니콜(chloroamphenicol, Cm) 내성 유전자의 다운스트림(downstream)을 삽입함으로써 이루어졌다. 프로모터가 없는 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyl transferase)의 유전자와 알콜 디하이드로게나아제(alchol dehydrogenase) 유전자의 전사적 융합체가pfl유전자에 삽입된 후, 클로람페니콜 농도를 증가시켜 돌연변이체를 구별해 냄으로써 발현이 증가된다. 그러나, 케모스탯(chemostat)연구에서 이들 안정된 균주들은 여전히 에탄올(ethanol) 생산능력을 상실했다(Lawford & Rousseau,Appl. Biochem. Biotechnol. 57-58:293-305 1996). 또한 염색체상에 에탄올의 유전자를 포함하는 균주는 글루코우즈 최소 배지에서 생장율이 감소함을 입증했다(Lawford & Rousseau,Appl. Biochem. Biotechnol. 57-58:277-92 1996).
이러한 접근은 삽입된 유전자의 발현을 조절하는 데 있어 스크리닝(screening) 시스템과 더불어 건강하고 빨리 생장하는 유전자변형 균주를 구별해내기 위해 염색체상에 무작위로 소형 트란스포손을 삽입시키는 것을 겸하거나 변형되어왔다. 일련의 발현 카세트(cassette)는 세균 염색체내에 이종의 유전자를 삽입하기 위해 개발되었다. 이들 카세트는 Herrero et al.,J. Bacteriol. 172:6557-67 1990); de Lorenzo et al.,J. Bacteriol. 172:6568 1990)가 설명한 트란스포손 딜리버리(delivery) 시스템을 기초로 하고 있다. 비록 이들 시스템이 RP4가 관련된 결합 전달(RP4-mediated conjugal transfer)을 상술하며 단지 트란스포손 Tn10과 Tn5를 사용한다해도, 트란스포손의 말단과 딜리버리 시스템간의 어떠한 결합은 설명했던 기술에 부합될 수 있어 결과적으로 지속적이며 상동 PHA를 생성하게 된다.
유전자변형된E. coli의 PHB 생성체를 생성하기 위해 다음과 같은 일반적인 접근이 이용된다. 즉 첫째, 프로모터가 없는 항생제 내성 유전자(abr)는 pUC18NotI이나 pUC18Sfil과 같이 적절한 플라스미드의 폴리링커(polylinker)에서 복제되어 폴리링커의 주요부분은abr의 상류에 있게 된다. 둘째,phb유전자는 나중에abr유전자와 같은 방향(orientation)에서 그리고 그것의 상류에서 복제된다. 셋째,phb-abr카세트는NotI또는AvrII단편(fragment)(AvrII는 pUC18Sfil의SfiI사이트를 인식한다.)로써 절단되며, pUT 또는 pLOF 시리즈로부터 그들과 같은 어떠한 플라스미드의 해당사이트에서 복제된다. 넷째, 결과적으로 생긴 플라스미드는E. coli pir균주에 남아있게 되며, 이들 플라스미드를 복제하지 않는E. coli균주에 일렉트로포레이션(electroporation)되거나 결합된다. 다섯째,phb-abr카세트가 성공적으로 염색체상에 삽입된 새로운 균주는 숙주(예: 숙주가 날라디식 산(naladixic acid) 내성이 있을 경우 날라디식 산)와 카세트(예: 클로람페니콜, 카나마이신(kanamycin), 테트라사이클린(tetracyclin), 염화수은(mercury chloride), 비알라포스(bialaphos)에 대한 선택배지상에서 구별된다. 결과적으로phb성분은 생장과 PHB 형성을 위해 글루코우즈가 포함된 최소배지상에서 가려지게 된다.
이 과정에 있어 몇가지 변형이 만들어 질 수 있다. 만약 프로모터가 없는 항생제 내성 마커가 사용되지 않는다면,pha유전자의 삽입은 벡터에 있는 마커에 근거하여 구별되며 바라던 레벨의 PHA를 생성하는 삽입된 균주는 PHA 생성을 심사하여 탐지된다.phb유전자는 꼭 필요한 것은 아니지만 상류 활성화 서열, RNA 폴리머라아제 결합 사이트 및/또는 오퍼레이트(operator) 서열같은 내부의 전사 서열을 가질지도 모른다. 만약phb유전자가 그런 서열을 가지고 있지 않다면, 설명했던 접근방법의 경우 전사는 삽입 서열을 통해 진행될 수 있는 pUT 시리즈 같은 벡터를 사용하는 것으로 제한된다. 이러한 제한은 pLOF 플라스미드의 Tn10 플랭킹 리젼(flanking region)을 번역하는 RNA 폴리머라아제의 무능 때문이다. 만약 그렇다면abr유전자는 그 자신의 발현 서열을 진행할 지도 모른다.abr유전자 대신에 숙주 균주가 해당 야생형 유전자에서 돌연변이를 가지게 될 때 선택 마커(selective marker)로써 필수 유전자가 이용되는 구조물이 설계될지도 모른다. 이러한 목적에 유용한 유전자의 예는 일반적으로 잘 알려져 있다. 다른 구조물들은 두 구조물이 다른 마커 유전자를 운반하는 경우 나중에 혹은 동시에 하나의 숙주에 삽입될 수 있다. 복합 삽입이 이용될 경우,phb유전자는 각각 삽입될 수 있다. 예를 들어 PHB 폴리머라아제 유전자가 처음에는phbC-cat카세트로써 삽입되고 나서phbAB-kan카세트로써 티오라아제(thiolase)와 환원제(reductase)의 삽입이 있다. 혹은 한 카세트는phb유전자 모두를 포함하고 반면에 다른 카세트는 기대하는 PHA 폴리머를 생성하는 데 필요한 어떤phb유전자만을 포함한다.
어떤 경우는 pJMS1 1(Panke et al.Appl. Enviro. Microbiol. 64:748-751)같은 트란스포손 삽입 벡터가 이용되기도 하여 선택 마커는 삽입된 균주의 염색체로부터 삭제될 수 있다. 이것은 각각의 삽입이 일어난 후 마커를 삭제함으로써 같은 마커 유전자를 이용하여 복합 트란스포손 구조물을 삽입하기 위한 메카니즘 제공을 포함하여 여러가지 이유로 유용하다.
PHA 형성에 관련된
phb
및 다른 유전자원
매디슨과 휴이스먼의 (1999) Microbiology and Molecular Biology Reviews 63:21-53을 참고한다.phb유전자는 다른 출처에서 유래되고 하나의 생물속에 결합되거나 혹은 같은 출처로부터 유래될 것이다.
티오라아제(thiolase)를 코딩하는 유전자
티오라아제를 코딩하는 유전자는 알칼리제네스 라투스와 랄스토니아 유트로파(Peoples & Sinskey,J. Biol. Chem. 264(26):15298-303 1989); 아시네토박터 에스피(Acinetobacter sp.:Schembri, et al.,J. Bacteriol. 177(15):4501-7 1995)와 크로모티움 비노섬(Chromotium vinosum:Liebergesell & Steinbuchel,Eur. J. Biochem. 209(1):135-50 1992),슈도모나스 애시도필라(Pseudomonas acidophila), 슈도모나스 데니트리피칸스(Pseudomonas denitrificans:Yabutani,et al.,FEMS Microbiol. Lett. 133(1-2):85-90 1995), 리조비움 맬리로티(Rhizobium meliloti:Tombolini, et al.,Microbiology 141:2553-59 1995), 티오시스티스 비올라세아(Thiocystis violacea:Liebergesell & Steinbuchel,Appl. Microbiol. Biotechnol. 38(4):493-501 1993)과 주글로에아 라미게라(Zoogloea ramigera:Peoples, et al.,J. Biol. Chem. 262(1):97-102 1987)으로부터 분리해냈다.
PHA 형성에 관련되지는 않았지만phb유전자 및/혹은 해당 유전자 산물과 상당한 공통성을 갖고 있는 다른 유전자들이 마찬가지로 이용될 수도 있다. 티오라아제와 환원제 같은 효소를 코딩하는 유전자들은 PHB를 생성하지 않는 세균에 이르기까지 광범위하게 확인되었다.E. coli(U29581, D90851, D90777), 해모필러스 인플루엔재(Haemophilus influenzae,(U32761)), 슈도모나스 프라기(Pseudomonas fragi(D10390)), 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa, (U88653)), 클로스트리디움 아세토뷰틸리컴(Clostridium acetobutylicum, (U08465)), 마이코박테리움 레프래(Mycobacterium leprae, (U00014)), 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis, (Z73902)), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori,(AE000582)), 써모아내로박테리움 써모사카롤리티컴(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, (Z92974)), 아케오글로버스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus, (AE001021)), 퓨조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum, (U37723)), 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus, (L05770)), 바실러스서브틸리스(Bacillus subtilis, (D84432, Z99120, U29084))와 시네코시스티스 에스피(Synechocystis sp., (D90910)) 모두 그들의 염색체으로부터 한개 이상의 티오라아제를 코딩한다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae, (L20428)), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe, (D89184)), 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis, (D13470)), 캐노합디티스 엘리건스(Caenorhabditis elegans, (U41105)), 인간(S70154), 랫트(rat, D13921), 마우스(mouse,M35797), 무우(X78116), 호박(D70895)와 오이(X67696)는 또한R. eutropha로부터 3 케토티오라아제(3-ketothiolase)와 상당한 공통성을 갖는 단백질을 발현한다.
환원제를 코딩하는 유전자
환원제를 코딩하는 유전자는A. latus와R.eutropha(Peoples & Sinskey,J. Biol. Chem. 264(26):15298-303 1989); 아시네토박터 에스피.(Schembri, et al.,J. Bacteriol. 177(15):4501-7 1995),C. vinosum(Liebergesell & Steinbuchel,Eur. J. Biochem. 209(1):135-50 1992), P. acidophila,P. denitrificans(Yabutani, et al.,FEMS Microbiol. Lett. 133(1-2):85-90 1995),R. meliloti(Tombolini, et al.,Microbiology 141:2553-59 1995)와Z. ramigera(Peoples, et al.,J. Biol. Chem. 262(1):97-102 1987)로부터 분리되었다.
PHA 형성에 관련되지는 않았지만phb유전자 및/혹은 해당 유전자 산물과 상당한 공통성을 갖고 있는 다른 유전자들이 마찬가지로 이용될 수도 있다. 아세틸 코 에이 환원제(acetoacetyl CoA reductase)를 코딩하는phbB유전자와 상당한 공통성을 갖는 유전자는 아조스리릴룸 브라실리엔세(Azospirillum brasiliense, (X64772, X52913)), 리조비움 에스피.(Rhizobium sp., (U53327, Y00604)),E. coli(D90745), 비브리오 하베이(Vibrio harveyi, (U39441)),H. influenzae(U32701),B. suvtilis(U59433),P. aeruginosa(U90631), 시네코시스티스 에스피.(Synechocystis sp., (D90907)),H. pylori(AE000570), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana,(X64464)), 쿠피아 란세올라타(Cuphea lanceolata, (X64566))과 마이코박테리움 스멕마티스(Mycobacterium smegmatis,(U66800))을 포함하여 몇가지 생물로부터 분리되었다.
PHA 폴리머라아제를 코딩하는 유전자
PHA 폴리머라아제를 코딩하는 유전자는 에어로모나스 캐비애(Aeromonas caviae(Fukui & Doi,J. Bacteriol.179(15):4821-30 1997),A. latus,R. eutropha(Peoples & Sinskey,J. Biol. Chem.264(26):15298-303 1989); 아시네토박터(Schembri, et al.,J. Bacteriol.177(15):4501-7 1995), 시. 비노섬(Liebergesell & Steinbuchel,Eur. J. Biochem.209(1):135-50 1992), 메틸로박테리움 엑토쿠엔스(Methylobacterium extorquens(Valentin & Steinbuchel,Appl. Microbiol. Biotechnol.39(3):309-17 1993), 노카디아 콜라리나(Nocardia corallina,(GenBank Acc. No. AF019964), 노카디아 살모니칼라(Nocardiasalmonicolor),P. acidophila, P. denitrificans(Ueda, et al.,J. Bacteriol.178(3):774-79 1996), 슈도모나스 애루기노사(Timm & Steinbuchel,Eur. J. Biochem.209(1):15-30 1992), 슈도모나스 올레보란스(Pseudomonas oleovorans,(Huisman, et al.,J. Biol. Chem.266:2191-98 1991), 리조비움 에틀리(Rhizobium etli,(Cevallos, et al.,J. Bacteriol.178(6):1646-54 1996),R. meliloti(Tombolini, et al.,Microbiology141(Pt 10):2553-59 1995), 로도코커스 루버(Rhodococcus ruber,(Pieper & Steinbuchel,FEMS Microbiol. Lett.93:285-90 1992), 로도박터 스파로이데스(Rhodobacter spharoides, (Steinbuchel, et al.,FEMS Microbiol. Rev.9(2-4):217-30 1992); Hustede, et al.,Biotechnol. Lett.15:709-14 1993),Synechocystis sp.(Kaneko,DNA Res.3(3):109-36 1996),T. violaceae(Liebergesell & Steinbuchel,Appl. Microbiol. Biotechnol.38(4):493-501 1993)과Z. ramigera(GenBank Acc. No. U66242)로부터 분리하였다.
세균 염색체에 유전자를 삽입시키기위한 벡터
여기서 설명한 PHA 생성 방법에 유용한 플라스미드 트란스포손 딜리버리 시스템의 pUT와 pLOF 시리즈는 트란스포손 Tn5와 트란스포손 Tn10 각각의 특징들을 이용한다. 전위(transposition)를 촉진하는 효소를 코딩하는 트랜스포사아제(transposase) 유전자는 '트랜스포사아제 인지 서열'의 바깥쪽에 위치해 있으며 나중에 전위시 상실된다. Tn5와 Tn 10 둘다 예를들어 Tn7 트란스포손과는 달리 타겟 게놈(target genome)에서 무작위로 삽입되는 것으로 알려져있다. 그러나 일반적으로 어떤 트란스포손은phb유전자처럼 이형의 유전자를 세균의 게놈으로의 삽입을 촉진하도록 변형될 수 있다. 그러므로 이 방법론은 여기서 설명했던 방법에서 사용된 벡터에 한정하는 것은 아니다.
향상된 폴리머 생성을 스크리닝(screening)하는 방법과 재료
세균 균주의 스크리닝
상기의 기술은 새로운 PHA 생성 균주의 발생을 고려할 뿐 아니라 스크리닝에 유용한 새로운 세균 균주를 제공한다. 하기의 표 1에는 염색체상의 다른 결합 및 PHB 효소를 코딩하는 플라스미드 및 어떻게 특정 균주가 새로운 혹은 개선된 효소를 동정하는 데 이용될 수 있는가를 보여주고 있다.
개선된 효소를 발현하는 유전자를 위한 스크리닝 수단 외에도, 염색체에 삽입된 PHA 전 경로를 갖는E. coli균주는 PHA 형성에 영향을 주는 이형의 유전자를 스크리닝하는데 이용될 수 있다.E. coli는 유전자들이 다수의 플라스미드 벡터로부터 쉽게 발현되므로 숙주로써 유용하다.: 높은 복제수, 낮은 복제수, 화학적 내지 열 유도적인 특징 등등 그리고 돌연변이 과정들은 이 세균에 있어서 잘 정립되어 있었다. 게다가,E. coli의 완벽하게 결정된 게놈 서열은 PHA 대사에 영향을 주는 유전자의 특징화를 용이하게 한다.
불완전한 PHA 경로를 나타내는 유전자변형된E. coli균주는 원핵생물이든 진핵생물이든간에 다른 생물들로부터 분실한 유전자의 상동성을 확인하기 위해 유전자 라이브러리(library)로 형질전환될 수 있다. 이들 스크리닝 균주는 PHA 생합성 전 경로를 갖지 않기 때문에, 분실한 기능들은 PHA를 합성하는 숙주 균주의 능력으로 보완되고 확인될 수 있다. 일반적으로 PHA 합성 세균 콜로니는 아가 플레이트(agar plate)에서 불투명하게 나타나는 반면 PHA를 합성하지 않는 콜로니는 투명하게 나타난다. 분실한 유전자를 보완하는 유전자 라이브러리로부터 생긴 클론(clone)이 스크리닝 배지상에서 자라게 되면 숙주 표현형(phenotype)은 흰색으로 나타난다. 일반적으로 스크리닝 배지는 과량의 탄소원을 함유한 모든 필수 영양분 및 라이브러리 구성에 이용된 벡터에서 설명한 내성을 위한 항생제를 포함하고 있다.
또한 새로운 유전자외에도, 개선된 PHA 생합성 효소를 코딩하는 유전자가 스크리닝될 수 있다. 이 활성은 없지만 다른 PHA 생합성 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는E. coli숙주 균주속에phb생합성 유전자를 포함하는 플라스미드의 돌연변이된 콜렉션(collection)은 증가되거나 바뀐 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를들어 증가된 활성을 갖는 PHA 폴리머라아제는 PHB가 잘 형성되지 않는 조건하에서 PHB 함유 콜로니를 동정함으로써 염색체로부터 티오라아제와 환원제를 발현하는 균주에서 스크리닝될 수 있다. 4번 탄소쪽에 증가된 특이성을 갖는 mcl-PHA 폴리머라아제는 유사하게 PHB 축적 촉진 조건하에서 스크리닝될 수 있다. ACP::CoA 트랜스퍼라아제를 코딩하는phaG에서 바뀐 활성들은phbC성분에서 이 유전자의 돌연변이된 변형을 발현함으로써 그리고 짧은 체인을 갖는 지방산으로부터 PHB 형성을 스크리닝함으로써 선택될 수 있다. 계대배양의 최적의(sub-optimal) 물리적 조건(예를들어 온도, pH, 삼투성 및 산소압)하에서 증가된 활성을 갖는 효소들은 그런 조건하에서 숙주를 자라게 하고 플라스미드상에 설계된 유전자의 돌연변이된 변형 콜렉션을 제공함으로써 선택될 수 있다. 3 케토헥사노일 코 에이(3-ketohexanoyl-CoA)처럼 3 케토아실 코 에이(3-ketoacyl-CoA)의 중간 길이의 사이드 체인에 특이성을 갖는 환원제 효소는 염색체상에는 msc-PHA 폴리머라아제가 삽입되어 있고 플라스미드상에는phbB의 돌연변이된 변형을 갖는 균주에서 PHA 합성 콜로니를 동정함으로써 선택될 수 있다. PHA 효소가 다른 특이성을 겸할 경우 다수의 새로운 기질 특이성에 대해 스크리닝할 수 있다. 게다가 생장조건을 바꿈으로써 계대배양 최적조건하에서의 효소 활성 및 코엔자임 에이(Coenzyme A)와 코 에이 유도체(CoA-derivatives), 니코니나마이드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide) 혹은 니코티나마이드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NAD, NADP, NADH, NADPH)의 환원형이나 산화형처럼 세포의 보조인자(cofactor)에 의해 방해를 덜 받는 효소를 스크리닝할 수 있다.
여기서 설명한 기술을 이용하여, 중간길이의 사이드 체인을 갖는 PHA 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 발현하는E. coli균주가 만들어질 수 있다.phaC나phaG혹은 둘 모두가E. coli의 염색체상에 삽입된 균주는 3 하이드록시데카노에이트(3-hydroxydecanoate)가 주요소인 중간 체인길이의 3 하이드록시 지방산(3-hydroxy fatty acid)를 포함하는 PHA를 축적한다.phaC가 그 자체로 삽입될 때, msc-PHA는 지방산으로부터 합성될 수 있다. 그러한 균주에 있어서, 그것은 지방산 산화를 조정하여 3 하이드록시 지방산 전구체가 세포내에 축적되게 하는 데 유리하다. 이러한 조정은 돌연변이 혹은 슈도모나스 푸티다의faoAB유전자에 해당하는 유전자를 코딩하는E. coli의 지방산 분해 효소인FadA와FadB혹은 상동군 I인 형광성 슈도모나드의 관련된 rRNA를 치환함으로써 일어날 수 있다.
표 1: 새로운 혹은 개선된 효소의 스크리닝을 위한 균주의 표현형
| 염색체상에삽입된 유전자 | 플라스미드상의 유전자 | 스크리닝을 위한 탄소원 | 스크리닝에 사용되는 효소를 코딩하는 유전자 |
| phbC | 라이브러리 | 글루코우즈 | 새로운 티오라아제/환원제 |
| 라이브러리 | 지방산 | 새로운 환원제, 하이드라타아제, 트랜스퍼라아제 | |
| 라이브러리 | 하이드록시 지방산예) 4HB | 하이드록시 지방산 활성 효소 예)4HB-CoA 트랜스퍼라아제(아세틸-코 에이 혹은 석시닐 코 에이 디펜던트) 혹은 HB-CoA 신타아제 | |
| phaG | 글루코우즈 | 새로운 기질 특이성을 갖는트랜스퍼라아제 | |
| phbAB | 라이브러리 | 글루코우즈 | 새로운 폴리머라아제 유전자 |
| phaC | 글루코우즈; 바뀐 환경 조건 | 새로운 기질 특이성을 갖는폴리머라아제;계대배양 최적조건하에서 증가된 활성 | |
| phbBC | 라이브러리 | 글루코우즈 | 새로운 티오라아제 |
| phbA | 제한된 글루코우즈/적절하지 않는 탄소원 혹은 영양분이 있는 배지;바뀐 환경 조건 | 재조정된 환원제;계대배양 최적조건하에서 증가된 활성 | |
| phbAC | 라이브러리 | 글루코우즈 | 새로운 환원제 |
| phbB | 제한된 글루코우즈/적절하지 않는 탄소원 혹은 영양분이 있는 배지;바뀐 환경 조건 | 재조정된 환원제;계대배양 최적조건하에서 증가된 활성 | |
| phbCAB | 라이브러리 | any | 특정 조건하에서 PHB 형성에 영향을 주는 효소 |
| phbCAB, 무작위 돌연변이(화학적 혹은 트란스포손) | any | 특정 조건하에서 PHB 형성에 영향을 주는 효소 | |
| phaC | 라이브러리 | 헥사노에이트(hexanoate) | C6와 좀더 긴 기질에 대한특이성을 갖는하이드라타아제(hydratase) |
| phaJ | 지방산 | C6와 좀더 긴 기질에 대한특이성을 갖는 하이드라타아제(hydratase) | |
| phbB | 지방산 | 기질 특이성을 갖는환원제 | |
| phaC fadR+,△ato | phbAB | 글루코우즈 + 뷰티레이트(butyrate) | C6모노머와 티오라아제/환원제와의 특이적 결합 |
| phaJ | phaC | 지방산 | 기질 특이성을 갖는폴리머라아제 |
| phaG | phbC | 글루코우즈 | 기질 특이성을 갖는폴리머라아제 |
여기서 설명한 방법과 구성은 다음의 제한없는 실시예들을 참고함으로써 잘 이해될 것이다. 이들 실시예들은 다음의 일반적인 방법들과 재료들을 사용한다.
재료와 방법
E. coli균주는 37℃ 혹은 30℃의 Luria-Bertani 배지(Sambrook, et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2d ed.(콜드 스프링 하버 래보러토리 프레스, 콜드 스프링 하버, 뉴욕, 1992) 혹은 E2 최소 배지(Lageveen et al.,Appl. Environ. Microbiol.54:2924-2932 1988)에서 배양된다. DNA 조작은 안내서에 따라 퀴아젠 플라스미드 프레퍼레이션 키트(Qiagen plasmid preparation kits) 내지 염색체 DNA 프레퍼레이션 키트(chromosomal DNA preparation kits)로 분리한 플라스미드와 염색체 DNA에서 수행된다. DNA는 안내서에 따라 제한효소를 사용하여 온침(digest)된다(New England Biolabs, Beverly, MA). DNA 단편(fragment)는 퀴아젠 키트(Qiagen kit)를 이용하여 0.7% 아가로우즈-트리스/아세테이트/이디티에이 젤(agarose-Tris/acetate/EDTA gel)로부터 분리된다.
플라스미드 DNA는 형질전환 혹은 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해E. coli세포로 도입된다(Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2d ed.(콜드 스프링 하버 래보러토리 프레스, 콜드 스프링 하버, 뉴욕)). 플라스미드 도너(donor) 균주와 레시피언츠(recipient)의 교배를 통해 pUT 벡터로부터phb유전자의 전위(transposition)가 일어난다(Herrero et al.,J.Bacteriol. 172:6557 1990). 사용된 레시피언츠 균주는 LS5218 혹은 MBX23 중의 하나로부터 유래된E. coli의 자발적으로 생긴 날라디식 산(naladixic acid) 혹은 리팜피신(rifampicin) 내성 돌연변이체이다. MBX23은rpoS::Tn10 형질이 1106 균주( Eisenstark사)로부터 P1 형질도입을 통해 도입된 LJ14rpoS::Tn10이다.phb유전자가 염색체에 삽입된 레시피언츠는 소형 트란스포손, 카나마이신, 클로람페니콜로 설명된 항생제 내성이 보완된 날라디식 산 내지는 리팜피신 플레이트상에서 선택된다.
올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)는 바이오신세시스(Biosynthesis)사 내지는 제네시스(Genesys)사로부터 구입된다. DNA 서열은 퍼킨-엘머 ABI 373 A 시퀀싱 기(Perkin-Elmer ABI 373 A sequencing machine)를 이용하여 자동제작된 시퀀싱을 통해 결정된다. DNA는 Gibco-BRL사의 PCR 믹스(PCR mix)(Gaithersburg, MD)와 에릭컴퍼니 DNA 증폭 기(Ericomp DNA amplifying machine)를 이용하여 50㎕ 부피로 폴리머라아제 체인 리액션(polymerase chain reaction)을 통해 증폭된다.
DNA 단편은 0.7% 아가로우즈/TAE 젤상에서 분리된다. 서던 블랏(southern blots)은 Sambrook 등의 분자 클로닝:실험안내서 제 2판(콜드 스프링 하버 래보러토리 프레스, 콜드 스프링 하버, 뉴욕)에서 설명한 과정에 따라 수행된다.phb유전자를 포함하는 DNA 단편의 탐지는 화학 발광 표시법과 USB/Amersham사의 디텍션 키트(detection kit)를 이용하여 수행된다. 단백질 샘플은 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol)과 도데실황산나트륨을 첨가한 후 비등수형 수조(boiling water bath)에서 3분동안 인큐베이션(incubation)하여 변성시키며 나중에 10, 15, 10-20%에스디에스-폴리아크릴아마이드 젤(SDS-polyacrylamide gel)에서 분리한다. 단백질은 고정된 나이트로셀룰로우즈 멤브래인(nitrocellulose membranes, Gibco-BRL, Gaithersburt, MD)으로 이동시킨 후, 3 케토아실 코 에이 티오라아제, 아세토아세틸 코 에이 환원제와 PHB 폴리머라아제는 이들 효소에 대한 폴리클론성 항체(poclonal antibody)와 양고추냉이의 페록시다아제(horseradish peroxidase)로 표시된 이차 항체를 사용한 후 화학 발광 탐지(USB/Amersham)를 통해 탐지된다.
아세토아세틸 코 에이 티오라아제와 아세토아세틸 코 에이 환원제 활성은 37℃의 LB 배지에서 16시간동안 배양한 균주로부터 얻은 세포 추출물에서 Peoples and Sinskey(J. Biol. Chem. 264:15293-15297 1989)의 설명에 따라 결정된다. 아세토아세틸 코 에이 티오라아제 활성은 휴렛 팩커 분광광도계(Hewlett-Packer spectrophotometer)를 이용하여 무세포 추출물(cell-free extract)를 첨가한 후 304nm에서 흡광도의 감소를 모니터함으로써 마그네슘 아세토아세틸 코 에이 컴플레스의 분해도로 측정된다. 아세토아세틸 코 에이 활성은 휴렛 팩커 분광광도계를 이용하여 340nm에서 NADH의 NAD로의 전환을 모니터함으로써 측정된다.
축적된 PHA는 다음의 기체 크로마토크래피(gas chromatography) 분리를 이용하여 결정된다. 동결건조된 세포 질량의 약 20mg은 부피적으로 90%의 1-부탄올(butanol)과 10%의 농축된 염산(hydrochloric acid) 및 내부 표준으로 2mg/ml의 벤조산(benzoic acid)을 포함하는 2ml의 혼합물을 110℃에서 3시간동안 자발적 추출과 부탄분해(butanolysis)를 하여 얻어진다. 그 결과 생긴 혼합물의 수용성 성분은 3ml의 물로 추출하여 제거된다. 유기층(2ml/min의 유출 속도에서1:50의 분리율의 1㎕)은 다음의 온도 프로필 즉 80℃에서 2분, 분당 10℃에서 250℃로, 250℃에서 2분간 SPB-1 융합 실리카 캐필러리 쥐시 컬럼(fused silica capillary GC column, 30m;0.32mm ID; 0.25㎛ 필름; Supelco; Bellefonte, PA)을 이용하여 FID 탐지기로 HP 5890 GC(휴렛-팩커드 컴퍼니, 팔코 알토, CA)에서 분석된다. 폴리머에서 4 하이드록시뷰틸레이트 유니트를 위한 실험에 사용된 표준은 폴리 4 하이드록시뷰틸레이트처럼 부탄분해를 통해 엔 뷰틸 4 하이드록시뷰틸레이트(n-butyl 4-hydroxybutyrate)를 형성하는 감마뷰티롤락톤(γ-butyrolactone)이다. 폴리머에서 3 하이드록시뷰틸레이트 유니트를 위한 실험에 사용된 표준은 정제된 PHB다.
폴리머의 분자량은 눈금이 있는 워터 스티라젤 HT6E 컬럼(Waters Styragel HT6E column, Millipore Corp., Waters Chromatography Division, Milford, MA)과 한정된 분산능력을 갖는 폴리스틸렌(polystylene) 샘플을 이용하여 젤 삼투 크로마토그래피(gel permeation chromatography, GPC)에 의한 클로로포름(chloroform)추출로 결정된다. 1mg/ml의 샘플은 클로로포름에 용해되었고 50㎕의 샘플이 도입되어 분당 1㎕로 용출된다. 차동 굴절계(differential refractometer)를 이용하여 탐지되었다.
1 메틸 3 니트로 1 니트로소 구아니딘(1-Methyl-3-nitro-1-nitroso-guanidine, NTG) 돌연변이는 99% 사멸에 해당하는 1mg/ml의 NTG를 90분간 처리하여 Miller(세균 유전학의 단기과정, 콜드 스프링 하버 래보러토리 프레스, 콜드 스프링 하버, 뉴욕)가 설명한 대로 수행된다.
실시예 1: 유전자 삽입을 위한 플라스미드 툴(tool) 및 숙주 균주
트란스포손 벡터와 트란스포손 유도체가 개발된 균주와 플라스미드는 하기의 표 2와 표 3에 나타나 있다. MBX245 및 MBX247은 대략 30g/ml의 날라디식 산(naladixic acid)을 포함하는 LB 플레이트에서 MBX23 및 LS5218을 각각 생장시킴으로써 선택된다. MBX246 및 MBX248은 50g/ml의 리팜피신(rifampicin)을 포함하는 LB 플레이트에서 MBX23 및 LS5218을 각각 생장시킴으로써 선택된다. 24시간 내에 선택 배지에 나타난 콜로니는 같은 배지상에 레플리카(replica)로 덧입히고 나서 생장시킨 후 80℃의 15% 글리세롤(glycerol)/뉴트리언트 브로스(nutrient broth)에서 저장된다.
MBX245 및 MBX247은 30㎍/ml의 날라디식 산(naladixic acid)을 포함하는 LB 플레이트에서 MBX23 및 LS5218을 각각 생장시킴으로써 선택된다. MBX246 및 MBX248은 50㎍/ml의 리팜피신을 포함하는 LB 플레이트에서 MBX23 및 LS5218을 각각 생장시킴으로써 선택된다. 24시간 내에 이들 선택 배지에 나타난 콜로니는 같은 배지상에 레플리카로 덧입히고 나서 생장시킨후 80℃의 15% 글리세롤/뉴트리언트 브로스에서 저장된다.
표 2 : 유전자 삽입에 사용되는 숙주균주
| 균주 | 유전자형 | 소스(source) |
| DH5α | recA1 endA1 gyrA96thi hsdR17 supE44relA1△(lac-proAB)(φ80dlac△(lacZ)M15) | 1 |
| S17-1 λpir | recA thi pro hsdR-M+RP4:2-Tc::Mu::Km Tn7λpirlysogen | 2 |
| CC118 λpir | △(ara-leu)araD△lacX74galE galK phoA20thi-1 rpsE rpoB argE(Am)recA1,λpirlysogen | 2 |
| XL1-Blue | F'::Tn10lacIq△(lacZ)M15 proAB/recA1 endA1 gyrA96 thi hsdR17 supE44relA1 △(lac-proAB) | 3 |
| LS5218 | fadR601 atoC512c | Spratt et al, 1981J.Bacteriol.146:1166-1169 |
| LJ14 | LS5218 atoC2c atoA14 | Spratt et al, 1981J.Bacteriol.146:1166-1169 |
| MBX23 | LJ14rpoS | Metabolix, Inc. |
| MBX245 | MBX23NIτ | Metabolix, Inc. |
| MBX246 | MBX23Rfτ | Metabolix, Inc. |
| MBX247 | MBX218NIτ | Metabolix, Inc. |
| MBX248 | MBX218Rfτ | Metabolix, Inc. |
1. 뉴 잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs, Beverly, MA)
2. Herrero et al., J. Bacteriol. 172:6557-67(1990)
3. Stratagene(San Diego, CA)
표 3: 유전자 삽입에 사용되는 플라스미드
| 균주 | 특징 | 소스(source) |
| pUC18Not | Apτ,NotI sites flanking polylinker | 2 |
| pUC18Sfi | Apτ,SfiI sites flanking polylinker | 2 |
| pUTkan | Apτ,Kmτ,oriF6K, mobRP4 depends on λpir for replication | 2 |
| pUTHg | Apτ,Hgτ,oriF6K, mobRP4 depends on λpir for replication | 2 |
| pKPS4 | 슈도모나스 올레오보란스의 Apτ,phaC1 | |
| pUCDBK1 | 주클로에아 라미게라의 Apτ,phbA and phbB | Peoples and Sinskey 1989,Molecular microbiol. 3:349-357 |
| pZS | 주클로에아 라미게라의 Apτ,phbC | WO99/14313 |
실시예 2:
phb
유전자의 삽입을 촉진시키는 클로닝 벡터의 제조
플라스미드 pUC18Not 및 플라스미드 pUC18Sfi에 그 근거를 두고 개발된 플라스미드 pMNXTp1kan 및 플라스미드 pMNXTp1cat는 도 1에 도시되어 있다.
플라스미드 pBGS18의 Tn903 카나마이신(kanamycin, Km) 내성 유전자는 올리고뉴클레오티드 프라이머 linkK1, 5'TGCATGCGATATCAAGCCAGAAAGTGAGG 및 linkK2, 5'TTTATTCAACAAAGCCGGCC을 사용하여 PCR에 의해 증폭된다.
PCR로 증폭하기전에, 프라이머는 전형적인 방식에 의해 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(T4 polynucleotide kinase)를 사용함으로써 인산화 된다. DNa는 다음의 프로그램에 따라 증폭된다: 95℃에서 3분, 42℃에서 40초, 72℃에서 2분동안 1 사이클과, 95℃에서 40초, 42℃에서 40초, 72℃에서 90초동안 30 사이클. 그리고 나서 DNA는 페놀을 이용하여 추출되며, 젤 분리전에 T4 DNA 폴리머라아제로 처리된다. 블런트 엔드(blunt end)를 갖는 0.8kb의 DNA 단편은 pUC18Not의 폴리링크의Ecl136Ⅱ사이트로 삽입되어 pMNXkan을 얻었다.
cat유전자는 파마시아(Pharmacia)사의HindⅢ카세트로써 얻어지고, DNA 폴리머라아제의 클리노우(Klenow) 프레그먼트을 사용하여 무딘 말단을 갖게 되며, pUC18Not의 폴리링크의Ecl136Ⅲ로 삽입되어 pMNXcat를 얻었다.
trp터미네이터 서열은 두개의 합성 올리고뉴클레오티드 TERM1(5'CCCAGCCCGCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGAACAAAA3') 및 TERM2(5'TACGT ATTTTGTTCAAAAAAAAGCCCGCTCATTAGCGGGCTGGG 3')를 어니얼링함으로써 얻어진다.
그리고 나서, 터미네이터를 pMNXkan 및 pMNXcat의HindⅢ-SphⅠ사이트로 삽입하여 pMNXTkan 및 pMNXTcat을 각각 얻었다. 이들 벡터가 만들어지고 나면 어떠한 프로모터 프레그먼트가SphⅠ및SacⅠ사이트 사이에 첨가될 수 있다.
프로모터 p1은 합성 올리고뉴클레오티드 PHBB1(5'TACGTACCCCAGGCTTTACATTTATGCTTCCGGCTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGTT3')과 PHBB2(5'TTCGAACCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCAT AAATGTAAAGCCTGGGG 3')으로 어니얼링하고 DNA 폴리머라아제의 클리노우 단편을 갖는 말단에 채워넣음으로써 만들어진다.
블런트 엔드를 갖는 프로모터 단편 p1은 pMNXTkan과 pMNXTcat의HincII사이트에 삽입되어 pMNXTp1kan과 pMNXTp1cat를 각각 얻었다. 플라스미드 pMSXTp1cat는EcoRⅠ-HindⅢ단편로서 pMNXTp1cat로부터 Tp1cat 카세트를 pUC18Sfi의EcoRⅠ-HindⅢ사이트로 이동시켜 만들었다. 이와 유사하게, pMSXTp1kan은 Tp1kan을 포함한EcoRⅠ-HindⅢ단편을 pUC18Sfi의EcoRⅠ-HindⅢ사이트로 이동시켜 만들었다.
실시예 3: PHB 폴리머라아제를 코딩하는
phbC
의 염색체 삽입을 위한 플라스미드
의 제조.
도 2에 도시된 바와 같이, 플라스미드 pMUXC5cat는 레시피언츠 균주의 염색체상에 이 유전자의 삽입을 위한 전위 요소로Z. ramigera의phbC유전자를 포함한다.
강한 트랜스레이셔녈 서열(strong translational sequence)은 파마시아사의 pTrc벡터에서P. oleovorans의 PHA 폴리머라아제를 코딩하는phaCl을 포함하는pKPS4로부터 얻어진다. 이 구조물에서,phaCl는 강한 리보솜 바인딩 사이트(AGGAGGTTTTT(-ATG))보다 앞에 위치한다. 상류(upstream) 서열을 포함하는phaCl유전자는 pUC18Sfi의Smal사이트에서 블런트 엔드를 갖는EcoRⅠ-HindⅢ단편로써 복제되어 pMSXC3가 얻어졌다. 나중에 블런트 엔드를 갖는 cat 유전자 카세트는 블런트 엔드를 갖는 Sse8387II 사이트에서 복제되어 결과적으로 pMSXC3cat가 만들어졌다. 이때, 5'27 염기쌍을 제외한 모든phaCl코딩 리젼은PstⅠ-BamHI단편로써 제거되고,Z. ramigera의phbC유전자로부터 대응되는 단편로 대체된다. 결과적으로 플라스미드 pMSXC5cat는P. oleovorans의 PHA 폴리머라아제와Z. ramigera의 리마인더(remainder)로부터 유래된 9개의 아미노 말단 잔기를 가지는 하이브리드 PHB 폴리머라아제 효소를 코딩한다.
그리고 나서 C5cat 카세트는AvrⅡ단편로로 잘려져 그 근처에 이 벡터로부터 수은 내성 마커를 절단하면서 pUTHg의 대응 사이트내에서 복제된다. 결과적으로 플라스미드 pMUXC5는 프로모터 서열에phbC가 우선하지 않는 C5cat 소형-트란스포손을 포함한다.
그러므로 삽입시 카세트의 발현은 삽입사이트에 인접한 DNA에 의해 제공되는 전사 서열에 달려있다.
실시예 4 : 티오라아제와 환원제를 코딩하는
phbAB
의 염색체 삽입을 위한
플라스미드 제조.
부분적으로 도 3에 도시된 바와 같이, pMSXTp1AB5kan2는 pMSXTp1kan으로부터 제조된다. 첫 번째 pMSXTp1kan은 클리노우로 채워진NdeⅠ로 온침되고, 재결찰되어NdeⅠ사이트가 제거된 pMSXTp1kan2를 얻었다. 이러한 삭제는 클로닝 과정의 후반기 동안Z. ramigera의phbA의 상류쪽 유일무이한NdeⅠ사이트에서 생긴다.
B5는 pUCDBK1으로부터NarⅠ단편로써 복제되었고(Peoples and Sinskey 1989, Molecular Microbiol. 3: 349-357참조), pUC18Sfi의HincⅡ사이트에서 복제되어 결과적으로 pMSXB5를 얻었다. A5는Ecl136Ⅱ-SalⅠ사이트내에FseⅠ/blunt-SalⅠ단편로 삽입되어 결과적으로 pMSXAB5를 얻게되며,Z. ramigeraAB5인터제닉(intergenic) 리젼을 재생한다. pMSXAB5내의HindⅢ사이트에 프로모터가없는 cat 카세트를 삽입함으로써 pMSXAB5cat을 얻었다. pMSXAB5cat로부터 AB5단편은 pMSXTp1kan2의SmalⅠ사이트에EcorⅠ-PstⅠ단편로 복제되어, pMSXTp1AB5kan2를 얻었다. 그리고 나서 발현 카세트 AB5cat는 2.8kbAvrⅡ단편로 절단되고 pUTHg내의AvrⅡ사이트에 결찰되고(ligate)E.coli균주 CC118λpir로 변환되어 플라스미드 pMUXAB5cat을 얻었다. 그 후 이 플라스미드는E.coliS17-1λpir로 전환되고, AB5cat 발현 카세트를 접합에 의해E.coliMBX247의 염색체에 삽입하기 위해 사용한다. 결과적으로 Ap5/Cmr 접합체는phbAB유전자에 의해 코딩된 티오라아제와 환원제 유전자의 삽입과 발현의 특성을 갖게된다.
실시예 5:
E.coli
염색체에
phbAB
를 삽입하기 위해 개선된 프로모터를 갖는 플
라스미드의 제조.
도 3에 도시된 바와 같이, phbAB5는 이들 유전자의 강한 프로모터 상류의 도입에 의해 개선된다. 이들 프로모터는 가능한 안정기능을 가진 mRNA 서열, 전사 개시 사이트을 지닌 -10 프로모터 리젼, -35 프로모터 리젼, 상류 활성 서열을 제공하는 올리고뉴클레오티드 셋트로 생성된다.
플라스미드 pMSXTp1AB5kan2는PstⅠ/XbaⅠ로 온침되고,lac프로모터의 -10 리젼을 포함하는 단편은 올리고뉴클레오티드
3A(5'GGCTCGTATAATGTGTGGAGGGAGAACCGCCGGGCTCGCGCCGTT) 및
3B(5'TAGAACGGCGCGAGCCCGGCGGTTCTCCCTCCACACATTATACGAGCCTGCA)을 어니얼링한 후에 얻어진 단편로써 삽입된다.
다음으로,lac -35 리젼과rrnB리젼을 포함하는 단편은 올리고뉴클레오티드 1A(5'TCAGAAAATTATTTTAAATTTCCTCTTGACATTTATGCTGCA) 및 1B(5'CATAAATGTCAAGAGGAAATTTAAAATAATTTTCTGAATGCA)을 어니얼링한 후에 얻어진 단편로써PstⅠ사이트내에 삽입된다.
다음으로 AB5의 전사 개시 사이트를 포함하는 메신저 안정화 서열은 올리고뉴클레오티드 4A(5'CTAGTGCCGGACCCGGTTCCAAGGCCGGCCGCAAGGCTGCCAGAACTGAGGAAGCACA) 및 4B(5'TATGTGCTTCCTCAGTTCTGGCAGCCTTGCGGCCGGCCTTGGAACCGGGTCCGGCA)을 어니얼링한 후에 얻어진 단편로써Xbal-NdeⅠ사이트내에 삽입된다. 결과적으로 플라스미드 pMSXp11AB5kan2이 생긴다. Tp11AB5kan2를 포함하는AvrⅡ단편은AvrⅡ로 잘려진 pUTHg로 복제되고, MBX379 및 MBX245의 게놈으로 삽입할 때 사용된다.
플라스미드 pMSXTp12AB5kan2는 올리고뉴클레오티드 1A 또는 1B 대신에 2A(5'CCCCTGTCATAAAGTTGTCACTGCA) 및 2B(5'GTGACAACTTTATGACAGGGGATGCA)가 사용되었다는 점에서 pMSXTp11AB5kan2와 구별된다.
이들 올리고뉴클레오티드는 컨센셔스E. coli pho박스와 -35 프로모터 리젼이 배지내 인산염의 농도에 의해 실질적으로 조절되는 프로모터를 생산하도록 제공한다.
pMSXTp13AB5kan2는 영양분의 제한, pH 또는 열충격, 독성물질의 투여와 같은 일반적인 스트레스 조건하에서 발현되는 프로모터로부터 AB5발현하도록 제조된다. 95℃에서 3분동안 인큐베이션하고, 95℃에서 40초, 42℃에서 40초를 30 사이클 진행하고, 68℃에서 7분동안 인큐베이션하고, 마지막으로 4℃에서 저장하는 PCR 반응하에서uspA프로모터 리젼은 올리고뉴클레오티드 UspUp(5'GACCAACATACGAGCGGC) 및 UspDw(5'TACCAGAACTTTGCTTTCC)을 사용하여 증폭된다. 대략 350 bp길이의 PCR 생산물은 pCR2.1(미국의 Invitrogen Corp사 제조)으로 복제되어, pMBXp13을 얻었다. 프로모터와,uspA에 대한 전사 개시 사이트,uspAmRNA의 첫 번째 93 bp를 포함하는 대략 190 bp길이의HincⅡ-MscⅠ단편은 블런트 엔드를 갖는BamHⅠ-Sse8387ⅠpMSXTp1kan2에서 복제되어 pMSXTp13kan2을 얻었다. 그리고 나서 플라스미드 pMSXTp13kan2를KpnⅠ로 온침시켜, T4 폴리머라아제로 말단을 무디게 만들어, 송아지 장내의 포스파타아제를 이용하여 탈인산화(dephosphorylate)시킨다. AB5유전자를 pMSXAB5의 2.0 kbEcoRⅠ/Sse8387I 단편로 분리하여, 클리노우와 T4 폴리머라아제를 이용하여 말단을 무디게 만들고, pMSXTp13kan2의KpnI사이트에 결찰시킨다. 결과적으로 생긴 플라스미드 pMSXTp13kan2에서phbAB와kan유전자는uspA(p13)프로모터로부터 발현된다.
그리고 나서pnAB5kan(n=11,12,13) 발현 카세트를 2.8 kb 길이의AvrⅡ단편로 절단하고, pUTHg의AvrⅡ사이트에 결찰시킨 후,E. coli균주 CC118λpir으로 형질전환시켜 플라스미드 pMUXpnAB5kan을 얻었다. 그 후 이 플라스미드는E.coliS17-1λpir 로 형질전환되어, p11MUXpnAB5kan, p12MUXpnAB5kan과 p13MUXpnAB5kan 발현 카세트를 접합에 의해E.coli균주의 염색체에 삽입하는 데 사용된다.
실시예 6: C
5
cat를
E.coli
염색체에 삽입
C5cat는 도너 균주로써 S17-1λpir(pMUXC5cat)를 사용하여 접합에 의해MBX23의 염색체상에 도입된다. 접합 혼합물을 LB/NI/Cm 플레이트에 도포되며, 삽입물중 40%는 앰피실린에 민감한 데 이들 균주내에는 플라스미드가 없다는 것을 의미한다. 다섯 개의 삽입물을 pMSXAB5cat(APr)으로 형질전환시키고, LB/Ap/Cm/2% 글루코우즈상에서 생장시켜 PHB 폴리머라아제의 생합성 활성을 조사한다(표 4).
표 4 : 삽입된 균주
| 균주 | pMSXAB5cat를포함하는 균주 | PHB 표현형 | 플라스미드 교정후 균주 |
| MBX300 | MNX305 | ++++ | MBX325 |
| MBX301 | MBX308 | +++ | MNX331 |
| MBX302 | MBX310 | ++++ | MBX326 |
| MBX303 | MBX315 | ++++ | MBX327 |
| MBX304 | MBX316 | + | MBX337 |
실시예 7: 삽입된 균주내의 C5 발현 증폭
PHB 폴리머라아제 발현은 100, 200, 500 및 1000 ㎍/㎖의 클로람페니콜을 포함하는 LB 플레이트에서 연속적으로 MBX326을 리스트릭킹(restreaking)함으로써 증가된다. 균주 MBX379는 MBX326으로부터 유래되며, 1000㎍/㎖까지 클로람페니콜 내성을 나타낸다. MBX379와 그것의 프리디세서(predecessor)로부터 분리된 염색체 DNA의 서던 블랏 분석에서,phbC5복제수는 증가되지 않았다. 웨스턴 블랏(Western blot) 분석 결과phbAB유전자가 플라스미드상에 존재할 때 이들 균주의 무세포추출물에서 PHB 폴리머라아제 레벨의 강력한 증가를 나타낸다.
실시예 8 : p
11
AB`kan, p
12
AB
5
kan 및 p
12
AB
5
kan의 MBX379로의 삽입
p11AB5kan, p12AB5kan 또는 p12AB5kan중 어느 하나를 갖는 S17-1λpir 균주는 MBX379와 교배된다. phbAB5kan이 염색체상에 삽입된 유전자변형된 균주는 LB/Nl/Km 플레이트에서 선택된다. 삽입물 중에서, 생산된 PHB는 LB/글루코오스 플레이트상에서 확인된다. 대표적인 각각의 구성물로 MBX612(MBX379::p11AB5kan), MBX677(MBX379::p12AB5kan) 및 MBX680(MBX379::p13AB5kan)이 있다. 서던 블랏 및 웨스턴 블랏 결과phbAB유전자는 염색체에 삽입되며 게다가 이들 균주에서 발현된다. 표 5는 2%의 글루코우즈를 포함한 Luria-Bertani 배지 또는 2%의 글루코우즈와 0.5%의 옥수수국물를 포함한 E2 최소 배지에서 생장된 유전자변형된E. coliPHB 생성체의 PHB 축척 정도를 나타내고 있다.
표 5: 유전자변형된
E.coli
PHB 생성체의 PHB 축적 정도
| 균주 | 세포 건조중량당 PHB % | |
| LB/글루코우즈 | E2 글루코우즈 | |
| MBX612 | 56 | 35 |
| MBX677 | 58 | 38 |
| MBX680 | 39 | 50 |
실시예 9: 개선된 균주를 얻기위한 박테이로파아지 P1 형질도입 및 선택
MBX612, 677 및 680의 생장 특성들이 박테리오파아지 P1 형질도입에 의해서 개선된다. C5CAT 및 AB5kan 형질을 다른 균주로부터 LS5218으로 형질도입하는데 있어 하나의 형질도입 단계가 필요한데 이는 두 개의 서로 다른 삽입 카세트가 염색체상에서 서로 가까운 위치에 있다는 것을 의미한다. 결과적으로 생기는 균주는 MBX690(MBX681에서부터), MBX691(MBX677에서부터), MBX698(MBX680에서부터)이다. 질소를 제한하는 E2 최소 배지에서 MBX612의 반복적인 접종으로 MBX681을 얻는다. P1 형질도입에 의해 생긴 균주와는 달리, MBX681은 개선된 생장 특성을 나타내지 않는다. 서던 블랏 및 웨스턴 블랏 결과,phbC와phbAB유전자는 성공적으로 형질도입되며 게다가 이들 균주에서 발현됨을 알수있다. 하기의 표 6은 이러한 2%의 글루코우즈를 포함하는 Luria-Bertani 배지 또는 2%의 글루코우즈와 0.5%의 옥수수국물을 포함하는 E2 최소 배지에서 생장된 이들 유전자변형된E.coliPHB 생성체의 PHB 축적 정도를 나타낸다.
표 6: 유전자변형된
E.coli
PHB 생성체의 PHB 축적 정도
| 균주 | 세포건조중량당 PHB% | |
| LG/글루코우즈 | E2 글루코우즈 | |
| MBX681 | 54 | 22 |
| MBX690 | 52 | 44 |
| MBX691 | 54 | 28 |
| MBX698 | 37 | 15 |
실시예 10: PHB 생성을 위한 유전자변형된
E.coli
균주의 보다 나은 개선
MBX680에서 PHB 생산을 더욱 증가시키기위해 NTG 또는 EMS를 이용한 돌연변이가 사용된다. 균주 MBX769 및 MBX777은 각각 EMS와 NTG로 MBX680에 처리한 후 선택된다. 이들 균주는 1%의 글루코우즈, 0.5%의 옥수수국물 및 1㎎/㎖의 클로람페니콜을 포함하는 R2-배지에서 성장될 수 있는 것으로 알려져 있다. MBX769는 20내지 26시간동안 37℃에서 2 또는 3%의 글루코우즈를 포함한 50㎖의 R-10 배지/0.5%CSL에서 생장된다. PHB는 세포건조중량의 71%로 축적된다. 유사하게, MBX769는 0.375g/L KH2PO4,0.875 K2HPO4,0.25(NH4)2SO4, 총 50 g/L의 글루코우즈를 포함하거나 그렇지 않은 50㎖의 LB에서 성장된다. 63시간동안 인큐베이션한 후에, PHB는 세포건조중량의 93%까지 증가하였다.
MBX777의phbC및phbAB형질은 결과적으로 LS5218에서 형질도입되어 MBX820을 얻었다. 서던 블랏 및 웨스턴 블랏 결과,phbC와phbAB유전자는 성공적으로 형질도입되며 게다가 이들 균주에서 발현된다. 표 7은 2%의 글루코우즈를 포함한 Luria-Bertani 배지 또는 2%의 글루코우즈와 0.5%의 옥수수국물을 포함하는 E2 최소 배지에서 생장된 이들 유전자변형된E. coliPHB 생성체의 PHB 축적 정도를 나타낸다.
표 7: 유전자변형된
E.coli
PHB 생성체의 PHB 축적 정도
| 균주 | 세포건조중량당 PHB% | |
| LG/글루코우즈 | E2 글루코우즈 | |
| MBX680 | 39 | 50 |
| MBX777 | 67 | 57 |
| MBX820 | 53 | 50 |
실시예 11: 유전자변형된
E.coli
PHB 생성체의 성장 특성
phb유전자의 MBX245(td=47분)로의 도입은 성장속도의 감소를 동반한다(MBX680, td=71분). 향상된 PHB 생성은 EMS 돌연변이에 의해 이루어지지만, 성장속도(MBX777, td=72분)를 향상시키지는 않는다. 야생형 균주(MBX184)에 PHB 유전자의 P1 형질도입은 MBX245에서와 같이 동일하게 높은 성장속도를 나타내고, 24시간보다 적은 시간(MBX820, td=45분)동안 세포건조중량의 50%까지 PHB가 축적된다.
실시예 12: 다른
pha
유전자의 염색체 삽입을 위한 플라스미드
기술된Z.ramigera의phbC, phbA및phbB의 삽입은 예를 들어,R.Eutropha(C1)의 PHB 폴리머라아제,P. oleovorans(C3)의 PHB 폴리머라아제,A. caviae(C12)의 PHB 폴리머라아제,P. putida(G3)의 ACP::CoA 트랜스사카라아제,A. caviae(J12)의 (R)-특유한 엔오일-CoA 하이드라타아제(R-specific enouyl-CoA hydratase),R. eutropha(A1-Ⅱ)의 광범위한 기질 특이성의 3-케토아실-CoA 티알라제 또는R. eutropha(P1-Ⅰ 및 P1-Ⅱ)의 파신(phasin)같은 다른pha유전자에 응용될 수 있다. 이들 유전자는 하기의 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해서 얻어진다:
C1 up 5'g-GAATTC-aggaggtttt-ATGGCGACCGGCAAAGGCGCGGCAG3'
C1 dw 5'GC-TCTAGA-AGCTT-tcatgccttggctttgacgtatcgc3'
C3 up 5'g-GAATTC-aggaggtttt-ATGAGTAACAAGAACAACGATGAGC3'
C3 dw 5'GC-TCTAGA-AGCTT-tcaacgctcgtgaacgtaggtgccc3'
C12 up 5'g-GAATTC-aggaggtttt-ATAGCCAACCATCTTATGGCCCGC3'
C12 dw 5'GC-TCTAGA-AGCTT-TCATGCGGCGTCCTCCTCTGTTGGG3'
G3 up 5'g-GAATTC-aggaggtttt-ATGAGGCCAGAAATCGCTGTACTTG3'
G3 dw 5'GC-TCTAGA-AGCTT-tcagatggcaaatgcatgctgcccc3'
J12 up 5'ag-GAGCTC-aggaggtttt-ATGAGCGCACAATCCCTGGAAGTAG3'
J12 dw 5'GC-TCTAGA-AGCTT-ttaaggcagcttgaccacggcttcc3'
A1-II up 5'g-GAATTC-aggaggtttt-ATGACGCGTGAAGTGGTAGTGGTAAG3'
A1-II dw 5'GC-TCTAGA-AGCTT-tcagatacgctcgaagatggcggc3'
P1-I up 5'g-GAATTC-aggaggtttt-ATGATCCTCACCCCGGAACAAGTTG3'
P1-I dw 5'GC-TCTAGA-AGCTT-tcagggcactaccttcatcgttggc3'
P1-II up 5'g-GAATTC-aggaggtttt-ATGATCCTCACCCCGGAACAAGTTG3'
P1-II dw 5'GC-TCTAGA-AGCTT-tcaggcagccgtcgtcttctttgcc3'
PCR 반응은 10 pmol의 각 프라이머, 1 내지 5㎕의 염색체 DNA 혹은 끊인 세포, Gibco BRL(Gaithersburg, MD)사의 PCR 믹스 45㎕을 포함한다. 94℃에서 60초, 45 내지 68℃에서 60초, 72℃에서 1 내지 3분동안 30번의 사이클을 통해서 증폭이 이루어진다. PCR 생산물을 정제하고,EcoRⅠ및HindⅢ로 온침시켜, DNA 폴리머라아제의 클리노우 단편로 말단을 무디게 하여, 도 1 및 도 2에 도시된 도면과 같이 pMSXcat, pMSXkan, pMNXcat 또는 pMNXkan의SmaⅠ사이트내에서 복제한다. pMUXpha는 pUTHg 또는 pUTkan으로부터 유래되며, pMLXpha는 pLOFHg로부터 유래된다. 여기서pha는pha선택유전자를 의미한다. 이들 플라스미드는E. coli또는 PHA 생산에 적합한 어떤 다른 그람 네거티브(Gram-negative)세균 균주의 염색체에 설계된pha유전자를 삽입하는 데 사용된다.
실시예 13: 유전자변형된
E.coli
균주를 생성하는 PHBV 공중합체
상기에서 언급된 것과 같이 염색체상에 삽입된pha유전자를 갖는E.coli균주는 또한 PHBV 공중합체를 생성하는 데 사용된다. PHBV는 일반적으로 발효 시스템에서 합성된다. 여기서, 프로피오닉 산은 글루코우즈 또는 다른 탄수화물과 함께 제공된다. 프로피오네이트는 프로피오닐-CoA로 전환되며, 아실-CoA 티오라아제의 3-케토아실 CoA 환원제의 반응에 의해서 3-하이드록시발레릴-CoA(3HV-CoA)로 전환된다. 3HV-CoA은 결과적으로 PHA 폴리머라아제에 의해서 중합화된다. PHBV를 축적하는 능력은 특징적으로 HV 모노머를 합성하는 효소의 레벨을 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 그러한 효소들은 프로피오닉-CoA의 프로피오닉 산으로의 활성화 혹은 어떠한 PHB 생합성 효소에 있어서 프로피오닉 산의 흡수와 연관되어 있을 것이다. 추가적으로, 다른 효소는 다른 소스(source)에서 분리될 수 있으며, 혹은 프로피오닐-CoA 는 다른 경로에 의해서 얻어질 수 있다. 예를 들어 메틸말로닐-CoA 경로이다. 이 경로에서, 석시닐-CoA(succinyl-CoA)는 메틸말로닐-CoA(methylmalonyl-CoA)로 변환된 후에 탈탄소화되어 프로피오닐 CoA를 생성한다.
실시예 14: PHB-4HB 공중합체를 생성하는 유전자변형된
E.coli
균주
4HB 모노머를 포함하는 호모폴리머와 공중합체는 유전자변형된E.coli균주에 의해서 생성될 수 있다. 4HB-CoA로부터 4HB의 중합은 4-하이드록시뷰틸레이트를 PHA 생성 생물에 급식함으로써 이루어질 수 있다. 클로스트리디움클루이베리(Clostridium kluyveri)의hbcT(OrfZ) 처럼 4-하이드록시부티릴-CoA 트랜스퍼라아제를 통해서나 혹은 내인성의E.coli효소 또는 이런 능력을 갖는 어떤 다른 효소에 의해 4HB는 활성화되어 4HB-CoA가 된다. 유전자변형된E.coli균주가 단지phbC유전자만을 포함할 때, P4HB 호모폴리머가 생성된다. 유전자변형된E.coli균주가 PHB 생합성 전 경로를 코딩하는 유전자를 포함할 때, 공중합체를 포함하는 4HB가 합성될 수 있다.
E. coliMBX821(LS5218::C5-cat379, atoCc)는 LB 배지에서 성장되며, 5 g/L 4HB와 2 g/L 글루코우즈를 포함하는 10%의 LB 배지 100ml에서 재현탁된다. 24시간동안 이 배양한 후에, PHA는 단지 4HB 모노머만을 포함함으로써 확인되고 특정화된다. 이와 비슷하게, 단지 pFS16 처럼hbcT를 포함하는 플라스미드를 갖는E. coliMBX777을 LB/4HB(5g/L)에서 성장되며, 최종적인 폴리머는 35.5%의 4HB 모노머를 갖는 PHB4HB로서 확인되었다.
실시예 15: 여분의 염색체 DNA를 갖지 않는 재조합형
E.coli
에서 4-하이드록시뷰
틸레이트로부터 폴리(4-하이드록시뷰티레이트)의 생성
폴리(4-하이드록시뷰틸레이트)는 4-하이드록시뷰틸-CoA 트랜스퍼라아제
(hbcT) 및 플라스미드의 PHA 신타아제(pha) 유전자를 발현하는E. coli에 의해 4-하이드록시뷰틸레이트로부터 합성될 수 있다. 만약 이들 유전자가E. coli염색체내에 삽입되고 높은 정도로 발현된다면, 재조합형E. coli는 4-하이드록시부티레이트로부터 폴리(4-하이드록시뷰틸레이트)를 합성할 수 있다.hbcT및phbC유전자는 다음과 같은 pUTHg(Herrero등의 J.Baceriol. 172:6557-67, 1990)에 삽입된다. pMSXC5cat 및 pFS16은 둘다BamHⅠ와SalⅠ에서 온침된다. 그리하여phbT유전자를 포함하는 커다란 pMSXC5cat 단편 및 pFS16 단편은 T4 DNA 리가아제를 이용하여 서로 결찰시켜 pMSXC5hbcTcat을 얻었다.
phaC, hbcT및cat유전자를 포함하는 단편을AvrⅡ에 온침시킴으로써 pMSXC5hbcTcat에서 제거하였다. 이를 T4 DNA 라가아제를 사용하여 스스로 결찰되는것을 방지하기 위해서 송아지 장내의 알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase)로 처리하고AvrⅡ로 온침시킨 pUTHg에 삽입하였다. 그리하여 얻어진 플라스미드는 pMUXC5hbcTcat이다. 플라스미드 pMUXC5hbcTcat는 MBX129내에서 복제되며 MBX1177에 접합된다. 균주 MBX1177은 최소의 4-하이드록시뷰틸레이트 아가(agar) 플레이트에서 성장할 수 있는 능력으로인해 선택되는E.coli균주 DH5α자발성 돌연변이체이다. MBX1177은 일반적으로 날라디식 산에 대해 내성을 갖는다. 레시피언츠 세포는 25㎍/mL의 클로람페니콜과 30㎍/mL의 날라디식 산을 포함하는 LB-아가에 도포함으로써 도너 세포로 부터 분리된다. 이 플레이트에서 생존하는 것은 1리터당 15g의 아가(agar); 2.5g/L의 LB 파우더(디프코; 디트로이트, 미시간); 5g의 글루코우즈; 10g의 4-하이드록시뷰틸레이트; 1mmol의 MgSO4; 10mg의 티아민; 0.23g의 프롤린; 25.5mmol Na2HPO4; 33.3 mmol K2HPO4; 27.2mmol KH2PO4;2.78mg FeSO4·7H2O; 1.98mg MnCl2·2H2O; 2.81mg CoSO4·7H2O; 0.17mg CuCl2·2H2O; 1.67mgCaCl2·2H2O; O.29mg ZnSO4·7H2O 및 0.5mg의 클로람페니콜을 포함하는 최소 배지에서 리스트리킹된다. 특히 희고 불투명하게 보이는 이 플레이트의 콜로니는 아가(agar)를 제외한 상기와 동일한 배지를 포함하는 쉐이크 플라스크내에서 평가된다. 개개의 콜로니는 처음에 8시간동안 3mL의 LB 배지에서 성장되며, 각 배양액의 0.5mL를 상기의 배지 50mL에 접종하였다. 이들 플라스크는 96시간동안 30℃에서 인큐베이션된다. 하나의 분리물을 GC분석(배지에서 얻은 세포를 2000 x g에서 10분동안 원심분리하고, 물로 세척한 후 다시 원심분리하여 동결건조함)하여 확인한 결과 중량비 4.9% 폴리(4-하이드록시부테이트) 포함하고 있었다. 이 균주는 MBX1462이며, 향후 조작에 의해 선택된다. MBX1462는 90분 동안 O.1 mg/mL MNNG을 MBX 1462과 함께 액체 배양하는 방법으로 돌연변이원인 1-메틸-3-니트로-1-니트로소구아니딘(MNNG) 및 화학적 돌연변이원에 처리된다. 세포의 99.8%가 이 처리로 인해 사멸된다는 것이 밝혀졌다. 상기에서 기술한 플레이팅과 쉐이크 플라스크 실험을 반복하여 분리물 하나를 GC분석한 결과 중량비 11% 폴리(4-하이드로부테이트)를 포함하였다. 이 균주는 MBX1476이며 향후 조작에 의해 선택된다. NTG 처리를 반복한 결과 세포의 96.3%가 죽었다. 상기에서 기술한 플레이팅과 쉐이크 플라스크 실험을 다시 반복하고, 분리물 하나를 GC분석한 결과 중량비의 19% 폴리(4-하이드록시부테이트)을 포함하였다. 이 균주는 MBX1509이다.
실시예 16: PHBH 공중합체를 생성하는 유전자변형된
E.coli
균주
E.coliMBX240은 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)의phbC유전자를 코딩하는 PHB 폴리머라아제의 염색체적으로 삽입된 복제를 포함하는 XL1-blue(Stratagene, San Diego.CA) 유도체이다. 이 균주는 아세틸-CoA(일반적으로 글루코우즈와 같은 탄수화물) 또는 지방산 산화 중간체를 중합을 위한 (R)-3-하이드록시아실-CoA 모노머로 전환시키는 효소가 없기 때문에 글루코우즈 또는 지방산과 같은 탄소원으로부터 PHAs를 형성하지 않는다. pMSXJ12는EcoRⅠ및PstⅠ에 의해 온침된A. carviae의phaJ유전자를 pUC18Sfi의 대응 사이트에 삽입하도록 제조된다.phaJ유전자는 프라이머 Ac3-5'(5'AGAATTCAGGAGGACGCCGCATCAGCGCACAATCCCTGG) 및 Ac3-3'(5'TTCCTGCAGCTCAAGGCAGCTTGACCACG)를 사용하여 PCR하여 얻는다. 다음의 PCR 프로그램을 이용한다.: 95℃에서 45초, 55℃에서 45초, 72℃에서 2.5분동안 30 사이클. 에어로모나스 카비애(Aeromonas caviae)의phaJ유전자에 의해 코딩된 (R)-특유의 에노일-CoA 하이드라타아제를 포함하는 플라스미드 pMTXJ12를 갖는E.coliMBX240의 형질전환체를 10mM의 옥타노에이트와 1mM의 올리에이트를 포함하는 Luria-Bertani 배지에서 성장시켰다. 48시간동안 성장시킨 후, 50ml 배양액을 원심분리하여 세포를 얻고 세포 침전물은 동결건조하였다. 동결건조된 세포를 16시간동안 클로로포름(8ml)으로 추출하고, 특히 PHA는 클로로폼 층에 10배의 에탄올을 첨가함으로써 클로로포름 용액에서 침전된다. 침전은 4℃에서 일어나며 고체의 폴리머를 공기중에서 건조시키고, 산성의 부탄분해에 의해서 조성물을 분석하였다. 부틸레이트된 PHA 모노머를 기체 크로마토그래피로 분리하고, 2.6% 3-하이드록시헥사노에이트 모노머를 가진 폴리(3-하이드록시뷰틸레이트-co-3-하이드록시헥사노에이트)공중합체로써 PHA를 확인하였다.
실시예 17 : PHA 생성을 위한 새롭고 개선된 유전자를 스크리닝하기위한 유전자변
형된
E . coli
균주의 제조
phbC유전자는 박테리오파아지 P1 형질도입에 의해E. coli클로닝 균주에 도입된다.phbC5삽입과 동일한 과정으로,R. eutropha의phbC유전자는 MBX23 염색체에 삽입되어 결과적으로 MBX 143이 생긴다. 클로람페니콜 증폭 후에, 500㎍/ml의 클로람페니콜에 내성을 갖는 MBX150을 분리하였다. MBX150에서 성장한 박테리오파아지 P1 용해질은 phbC-cat 형질을 XL1-Blue[pT7-RecA]에 형질도입시키는 데 사용된다. 플라스미드 pT7RecA는 성공적인 P1 형질도입에 필요한 기능적인 RecA 단백질을 발현한다. 결과적으로 생긴 균주 MBX240은 염색체에서 발현된 기능적인 PHB 폴리머라아제를 가진 XL1-Blue 유도체이다. 동일한 과정을 사용하여 MBX613 및 MBX683이 개발되었다. 이들 균주는 MBX245와 XL1-Blue에서 각각 유래되어, 삽입된 AB5cat(MBX613) 또는 p13AB5kan(MBX683) 오페론을 포함한다.
실시예 18: 새롭고 향상된 혹은 부수적인 PHA 생합성 효소를 코딩하는 유전자의
확인
MBX240, 613 및 683은 새롭고 개선된 PHA 유전자의 스크리닝 과정에 사용될수 있는 3가지의 균주이다. 이들 균주를 사용하여, 다음의 유전자가 확인되었다.:P. acidophila의phbCABFA2,A.latus의phbCAB. 게다가,A. caviae의phaJ유전자는 MBX240에서 기능적으로 발현되어 지방산으로부터 PHA를 생성하였다. C3내지 C6까지의 모노머에 대해 특이적인 PHA 생합성 유전자외에도, 중간 길이의 사이드 체인 3-하이드록산으로 이루어진 PHAs의 PHA 생합성 효소는E.coli에서 발현될 수 있다. 그러한 균주는 추가적으로 PHA 생합성 효소를 확인하는데 유용하다.
실시예 19:
R.eutropha
에서
pha
유전자의 삽입
상기의 실시예에서 설명한 플라스미드는R.eutropha에서pha유전자를 삽입하는 데 사용되었다. #2(Peoples & Sinskey,J.Biol. Chem.264:15298-303(1989)) 또는 PHB4(Schubert,등.J.Bacteriol.170:5837-47(1988))과 같은R. eutropha의 PHA-negative 돌연변이체를 사용하여,Z.ramigera의phbAB또는A. caviae의phaJ와A.caviae의phaC와 더불어A. caviae의phaC를 삽입함으로써 PHA 형성이 회복된다. 결과적으로 생긴 균주는 400,000에서 10,000,000 Da 사이의 분자량을 가지고, 3-하이드록시헤사노에이트와 3-하이드록시옥타노에이트와 같은 모노머를 포함하는 조성물을 갖는 PHAs를 다양한 레벨로 생성하였다.
실시예 20:
P. putida
에서
pha
유전자의 삽입
상기의 실시예에서 설명한 플라스미드는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonasputida)에pha유전자를 삽입하는 데 사용된다.P. putidaGPp104(Huisman 등의 J.Biol. Chem.266:2191-98(1991))의 PHA-Negative 표현형은phaC3가P. oleovorans의 PHA 폴리머라아제를 코딩하는phac3kan카세트의 삽입으로 인해 복구된다. pMUXC3kan을 사용한phaC3kan의 삽입은 또한 다른phaC보다 PHA 대사에 영향을 주는 효소를 코딩하는 유전자에서 돌연변이를 갖는P. putida의 돌연변이체를 만드는 데 응용될 수 있다. 또한A.caviae의 PHA 폴리머라아제 유전자는 염색체에 도입되어 결과적으로 C3내지 C9범위의 3-하이드록시 지방산을 포함하는 PHAs를 생산하는 균주를 얻었다.
실시예 21: 최종적인 PHA의 분자량을 통제하는
phaC
유전자의 염색체 삽입
과도하게 기질이 사용될 때, PHA 폴리머라아제 농도가 생성된 PHA의 분자량을 결정하는 것으로 알려져 있다. 폴리머의 특성이 분자량에 의존함으로 인해 분자량이 다양하다.pha유전자의 염색체 삽입은 염색체 삽입 사이트에 의해 결정될 경우pha유전자는 다양한 레벨로 발현된다. 그러므로 다양한 레벨의phaC발현을 가지며 그리하여 다양한 분자량을 갖는 PHAs를 생성하는 다른 유전자변형된 세균을 얻는 것이 가능하다. 이 시스템에서, 400,000 Da보다 크고 종종 1,000,00Da보다 큰 분자량을 갖는 PHAs를 생성하는 것이 가능하다. 이 과정은 pUT 또는 pLOF에서 유래한 플라스미드가 도입될 수 있는E.coli, R.eutropha, P.putida, Klebsiella pneumoniae, Alcaligenes latus, Azotobacter vinelandii, Burkholderia cepacia,Paracoccus denitrificans및 일반적으로Escherichia, Pseudomonas, ralstonia, Burkholderia, Alcaligenes, Klebsiella, Azotobacter genera의 종과 같은 어떠한 그램-네거티브 세균에 적용가능하다.
실시예 22: 싱글 오페론으로서 PHB 유전자의 삽입
플라스미드 pMSXABC5kan는 주글로에아 라미게라(Zoogloea ramigera)의 티오라아제(phbA), 환원제(phbB) 및 PHB 신타아제(phbC)유전자와 카나마이신 내성 유전자(kan)가 오페론으로서 벡터 pUC18Sfi에 연결되도록 제작된다. 그 후 이 발현 카세트는AvrⅡ단편로서 절단되며 pUT의AvrⅡ사이트에 삽입시켜 pMUXABC5kan을 얻는다.
pMUXABC5kan을 갖는 S17-1λpir 균주를 MBX247과 교배시킨다. phbABC5kan이 염색체에 삽입된 유전자변형된 균주는 LB/Nl/Km 플레이트에서 선택하였다. 삽입물 중에서 PHB 생성체는 LB/글루코우즈 플레이트상에서 확인된다. 그리하여 제조된 한 균주인 MBX1164이 향후 연구에 사용되었다.
티오라아제(Nishimura 등 1978,Arch. Microbiol.116:21-24)와 환원제(Saito 등 1977,Arch. Microbiol. 114:211-217)분석은 정제되지 않은 MBX1164 추출물에서 수행하였다. 배양은 20g/L의 글루코우즈가 첨가된 0.5X E2 배지 50ml에서 수행된다. 1 유니트(U)는 분당 1μ㏖의 기질을 전환시키는 효소의 양으로 정의된다. 3-케토티오라아제 활성은 각각의 독립된 실험에서 2.23±0.38와2.48±0.5U/mg으로 확인되었고 3-하이드록시부티릴-CoA 환원제 활성은 각각의 독립된 실험에서 4.10±1.51와 4.10±0.15 U/mg으로 확인되었다.
균주 MBX1164는 사각의 쉐이크 바틀에서의 PHB 생산 능력으로 평가된다. 세포는 2mL의 LB에서 성장되며, 이것의 0.1mL이 50mL의 쉐이크 바틀 배양을 위해 접종된다. 이 쉐이크 바틀에는 0.25% 옥수수국물(Sigma, St. Louis, MO) 및 20g/L 글루코우즈를 포함하는 E2 배지가 포함되어 있다. 200rpm의 속도로 48시간동안 30℃에서 인큐베이션한 후에, 생중량 농도는 2.6g/L에 도달하였고, PHB농도는 11.7g/l에 도달하였으며, 세포는 중량비 82% PHB를 포함하였다.
실시예 23: 슈도모나스 올레오바란스의
PHA 신타아제를
E.coli
염색체에 삽입
슈도모나스 올레오바란스로부터 얻은 PHA 신타아제(phaC) 카세트와 프로모터가 없는 클로람페니콜 내성 유전자는 pUC118에 삽입되어 두 유전자의 오페론이 만들어진다. 즉 그들은 같은 방향에서 시작되며, 같은 mRNA에 전사될 수 있을 것이다.P.oleovorans의phaC유전자의 서열은 하기에 명시된다.phaC-cat오페론은KpnI및HindⅢ로 온침되어 이 플라스미드에서 잘려지고, pMSXC3cat을 형성하기위해 동일한 두 개의 효소로 잘린 pUC18SfiⅠ에 재결찰(religate)된다. 그리하여phaC-cat오페론은AvrⅡ사이트의 측면에 있게 된다.phaC-cat오페론은 pMSXC3cat에서AvrⅡ 및FspⅠ에 의해 온침되어 제거된다. pMSXC3cat의 두 개의AvrⅡ 단편은 거의 동일한 크기이므로, 벡터의 나머지를 두 조각으로 절단함으로써phaC-cat오페론의 분리를 촉진하는 하기 위해FspⅠ이 사용된다.AvrⅡ단편은AvrⅡ로 온침되고 스스로 결찰되는 것을 막기위해서 알칼린 포스파타아제가 처리된 pUTkan에 결찰된다. 그리하여 생성된 플라스미드는 pMUXC3cat이다. 이 플라스미드의 오페론은 실제로phaC-cat-kan으로 이루어져있다. 균주 CC118λpir(λpir 용원성(lysogenic) 균주)는 pMUXC3cat으로 형질전환되어 균주 MBX130을 생성한다. 동량의 균주 MBX130 및 MBX245는 LB 아가 플레이트에서 혼합되어 37℃에서 8시간동안 인큐베이션된다. 그리고 나서 혼합된 세포는 LB-클로람페니콜(25㎍/mL)과 날라디식 산(30㎍/mL)의 37℃에서 밤새도록 배양하기위해 접종된다. 하나의 콜로니는 LB-클로람페니콜(25㎍/mL)-날라디식 산(30㎍/mL)-카나마이신(25㎍/mL)에 도포함으로써 이 배양에서 분리된다. 다른 균주의 염색체에 카세트를 도입하여 P1형질도입을 이용할 수 있는 능력 및 클로람페니콜과 카나마이신 둘다의 내성에 대한 선택에서 나타난 바 대로, 분리된 콜로니는 염색체상에 형질도입할 수 있는phaC-cat-kan카세트를 갖는다.
Claims (18)
- 염색체에 삽입된 티오라아제(thiolase), 환원제(reductase), 폴리 3 하이드록시뷰틸레이트 신타아제(poly(3-hydroxybutyrate) synthase), 폴리 3 하이드록시알카노에이트 신타아제(poly(3-hydroxyalkanate) synthase), 아실-코에이 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase), 에노일-코에이 하이드라타아제(enoyl-CoA hydratase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리하이드록시알카노에이트 합성에 관련된, 적어도 하나의 유전자를 갖는 폴리하이드록시알카노에이트를 생성하는 유전공학적으로 제작된 미생물
- 제 1항에 있어서, 미생물은 이 콜라이(E. coli), 알칼리제네스 라투스(Alcaligenes latus), 알칼리제네세 유트로퍼스(Alcaligenese eutrophus), 아조토박터(Azotobacter), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 및 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 제작된 미생물.
- 제 1항에 있어서, 유전자는 트란스포손(transposon) 돌연변이를 이용하여 삽입되는 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 제작된 미생물.
- 제 1항에 있어서, 오페론(operon) 형태로 작동가능하게 삽입되어 있는 폴리하이드록시알카노에이트 합성과 관련된 복합 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 제작된 미생물.
- 제 1항에 있어서, 삽입된 유전자는 프로모터(promoter)의 조절하에서 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 제작된 미생물.
- 제 1항에 있어서, 삽입된 유전자는 상류 활성 서열(upstream activating sequence)과 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 제작된 미생물.
- 제 1항에 있어서, 삽입된 유전자는 mRNA 안정화 서열과 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 제작된 미생물.
- 제 5항에 있어서, 유전자는 배지에서 인산염 농도에 의해 조절되는 공통(consensus)E. coli pho박스(box)와 -35 프로모터 리젼(region)을 포함하는 프로모터와 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 제작된 미생물.
- 제 5항에 있어서, 프로모터는 영양분의 제한, pH 혹은 열 충격 및 독성 물질 투여같은 일반적인 스트레스 조건하에서 발현을 유도하는 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 제작된 미생물.
- 제 1항에 있어서, 삽입된 유전자는 선택 마커(selection marker)와 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 제작된 미생물.
- 제 1항에 있어서, 유전자는 에이. 유트로퍼스(A. eutrophus),에어로모나스 카비애(Aeromonas caviae), 주글로에아 라미게라(Zoogloea ramigera), 노카디아(Nocardia), 로도코커스(Rhodococcus),슈도모나스 에스피 61-3(Pseudomonas Sp. 61-3), 슈도모나스 액시도필라(Pseudomonas acidophila), 슈도모나스 올레오바란스(Pseudomonas oleovarans),크로모박테리움 바이오라세움(Chromobacterium violaceum)과 알칼리제네스 라투스(Alcaligenes latus)로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물로부터 분리되거나 유래된 것을 특징으로하는 유전공학적으로 제작된 미생물.
- 제 1항에 있어서, 유전자는 알. 유트로파(R. eutropha(C1))의 PHB 폴리머라아제, 피. 올레오바란스(P. olevorans(C3))의 PHA 폴리머라아제, 에이. 캐비애(A. caviae(C12)0의 PHB 폴리머라아제, 피. 푸티다(P. putida(G3))의 에시피::코에이 트랜스아실라아제(ACP::CoA transacylase), 에이. 캐비애(A. caviae(J12))의 알 스페시픽 에노우일-코에이 하이드라타아제((R)-specific enouyl-CoA hydratase), 알. 유트로파(R. eutropha(A1-II))의 넓은 범위의 기질 특이성을 갖는 3 케토아실-코에이-티오라아제(3-ketoacyl-CoA thiolase) 및 알. 유트로파(R. eutropha(P1-I과 P1-II))의 파신(phasin)으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 제작된 미생물.
- 제 1항에 있어서, 유전자는 미생물의 염색체상에 단일 복제(single copy)로 삽입되는 것을 특징으로 하는 미생물.
- 염색체에 삽입된 티오라아제, 환원제, PHB 신타아제, PHA 신타아제, 아실-코 에이 트랜스퍼라아제(acyl-CoA transferase), 에노일-코에이 하이드라타아제(enoyl-CoA hydratase)로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 PHA의 합성과 관련된 유전자를 적어도 하나 갖는 하이드록시알카노에이트를 생성하는 유전공학적으로 제작된 미생물의 돌연변이 및 PHA의 향상된 생산량의 스크리닝을 포함하는 생산량을 향상하는 PHA의 합성과 관련된 유전자에 대한 스크리닝(screening) 방법.
- 제 14항에 있어서, 유전자는 에이. 유트로퍼스(A. eutrophus),에어로모나스 카비애(Aeromonas caviae), 주글로에아 라미게라(Zoogloea ramigera), 노카디아(Nocardia), 로도코커스(Rhodococcus),슈도모나스 에스피 61-3(Pseudomonas Sp. 61-3), 슈도모나스 액시도필라(Pseudomonas acidophila), 슈도모나스 올레오바란스(Pseudomonas oleovarans),크로모박테리움바이오라세움(Chromobacterium violaceum)과 알칼리제네스 라투스(Alcaligenes latus)로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 미생물로부터 분리되거나 유래된 유전자인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
- 제 14항에 있어서, 미생물은 폴리하이드록시알카노에이트의 생성에 필요한 유전자를 하나 또는 그 이상이 상실된 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
- 제 14항에 있어서, 미생물은 폴리하이드록시알카노에이트를 생성할 뿐아니라 폴리하이드록시알카노에이트 생성을 증가시키기 위하여 유전자를 선택하는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
- 염색체에 삽입된 티오라아제, 환원제, PHB 신타아제, PHA 신타아제, 아실-코 에이 트랜스퍼라아제, 에노일-코에이 하이드라타아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 PHA의 합성과 관련된 유전자를 적어도 하나 갖는 유전학공적으로 제작된 제 1항 내지 제 13항에서 정의된 미생물을 적당한 기질 및 그 미생물이 PHA를 생성하는 조건하에서 배양하는 것을 포함하는 PHA 생성 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9685298P | 1998-08-18 | 1998-08-18 | |
| US60/096,852 | 1998-08-18 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20010082176A true KR20010082176A (ko) | 2001-08-29 |
| KR100662896B1 KR100662896B1 (ko) | 2006-12-28 |
Family
ID=22259400
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020017002093A KR100662896B1 (ko) | 1998-08-18 | 1999-08-17 | 유전자 변형된 미생물의 폴리하이드록시알카노에이트 생성체 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US6593116B1 (ko) |
| EP (1) | EP1105499B1 (ko) |
| JP (2) | JP4623829B2 (ko) |
| KR (1) | KR100662896B1 (ko) |
| AT (1) | ATE319835T1 (ko) |
| AU (1) | AU753132B2 (ko) |
| CA (1) | CA2339421C (ko) |
| DE (1) | DE69930276T2 (ko) |
| MX (1) | MXPA01001750A (ko) |
| WO (1) | WO2000011188A1 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR200453669Y1 (ko) * | 2007-12-07 | 2011-05-19 | 원정제관(주) | 용기 손잡이 |
| WO2023121282A1 (ko) * | 2021-12-24 | 2023-06-29 | 씨제이제일제당 (주) | 포스포에놀피루브산 카복실화효소를 코딩하는 유전자의 5'utr 변이 서열 및 이의 용도 |
Families Citing this family (51)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6759219B2 (en) * | 1997-03-03 | 2004-07-06 | Metabolix, Inc. | Methods for the biosynthesis of polyesters |
| US7455999B2 (en) | 1998-01-22 | 2008-11-25 | Metabolix, Inc. | Transgenic systems for the manufacture of poly (3-hydroxy-butyrate-co-3-hydroxyhexanoate) |
| EP1105499B1 (en) * | 1998-08-18 | 2006-03-08 | Metabolix, Inc. | Transgenic microbial polyhydroxyalkanoate producers |
| EP1305439B1 (en) * | 2000-07-21 | 2006-06-07 | Metabolix, Inc. | Production of polyhydroxyalkanoates from polyols |
| DE01979431T1 (de) * | 2000-09-30 | 2004-10-21 | Diversa Corp., San Diego | Konstruktion ganzer zellen durch mutagenese eines wesentlichen anteils eines ausgangsgenoms, kombination von mutationen und gegebenfalls wiederholung |
| JP2003015168A (ja) * | 2001-04-27 | 2003-01-15 | Canon Inc | 電気泳動粒子、電気泳動粒子の製造方法、および電気泳動表示素子 |
| JP4628103B2 (ja) * | 2002-09-12 | 2011-02-09 | メタボリックス，インコーポレイテッド | 補酵素ａ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ経路によるポリヒドロキシアルカノエート産生 |
| BRPI0608637A2 (pt) * | 2005-03-16 | 2010-01-19 | Metabolix Inc | vetor recombinante para expressço de enzimas, cÉlula de planta transformada, mÉtodo para produÇço de produto biossintÉtico |
| US20090130731A1 (en) * | 2005-03-24 | 2009-05-21 | Kaneka Corporation | Microorganism capable of accumulating ultra high molecular weight polyester |
| EP1951875A2 (en) * | 2005-09-08 | 2008-08-06 | Meredian, Inc. | Deregulated bacteria with improved polyhydroxyalkanoate production |
| JP5468779B2 (ja) | 2006-07-21 | 2014-04-09 | 株式会社カネカ | 遺伝子置換微生物およびそれを用いたポリエステルの製造方法 |
| US7384766B2 (en) * | 2006-07-26 | 2008-06-10 | Kaneka Corporation | Gene-substituted microorganisms, and production method of polyesters using the same |
| AU2008229076B2 (en) | 2007-03-16 | 2014-05-15 | Genomatica, Inc. | Compositions and methods for the biosynthesis of 1,4-butanediol and its precursors |
| US7947483B2 (en) | 2007-08-10 | 2011-05-24 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for the growth-coupled production of 1,4-butanediol |
| BRPI0918483A2 (pt) * | 2008-09-10 | 2020-07-14 | Genomatica, Inc | organismo microbiano que não ocorre naturalmente, e, método para produzir um composto |
| KR102237801B1 (ko) * | 2009-06-04 | 2021-04-07 | 게노마티카 인코포레이티드 | 발효액 성분들의 분리 방법 |
| US8129169B2 (en) | 2009-06-04 | 2012-03-06 | Genomatica, Inc. | Microorganisms for the production of 1,4-butanediol and related methods |
| JP5284479B2 (ja) | 2009-09-28 | 2013-09-11 | 株式会社東芝 | アリルハイドロカーボンレセプター転写活性化量を測定するための細胞、方法およびアッセイキット |
| WO2011047101A1 (en) * | 2009-10-13 | 2011-04-21 | Genomatica, Inc. | Microorganisms for the production of 1,4-butanediol, 4-hydroxybutanal, 4-hydroxybutyryl-coa, putrescine and related compounds, and methods related thereto |
| US8530210B2 (en) | 2009-11-25 | 2013-09-10 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for the coproduction 1,4-butanediol and gamma-butyrolactone |
| WO2011068952A1 (en) | 2009-12-02 | 2011-06-09 | Entrigue Surgical, Inc. | Devices for tongue stabilization |
| MX2012009134A (es) | 2010-02-11 | 2012-11-30 | Metabolix Inc | Proceso para producir componente monomerico de biomasa de polihidroxialcanoato geneticamente modificado. |
| US8048661B2 (en) | 2010-02-23 | 2011-11-01 | Genomatica, Inc. | Microbial organisms comprising exogenous nucleic acids encoding reductive TCA pathway enzymes |
| US8637286B2 (en) | 2010-02-23 | 2014-01-28 | Genomatica, Inc. | Methods for increasing product yields |
| US8956835B2 (en) | 2010-11-24 | 2015-02-17 | Suny Research Foundation | Methods for producing polyhydroxyalkanoates from biodiesel-glycerol |
| MY164367A (en) | 2011-01-27 | 2017-12-15 | Kaneka Corp | Microorganism producing high-molecular-weight pha |
| CA2825624C (en) | 2011-01-27 | 2020-01-14 | Osa Holdings, Inc. | Apparatus and methods for treatment of obstructive sleep apnea utilizing cryolysis of adipose tissues |
| MX2013010481A (es) | 2011-03-22 | 2014-03-05 | Opx Biotechnologies Inc | Produccion microbiana de productos quimicos y composiciones, metodos y sistemas relacionados. |
| WO2012170793A1 (en) | 2011-06-08 | 2012-12-13 | Metabolix, Inc. | Biorefinery process for thf production |
| EP2742143A1 (en) | 2011-08-10 | 2014-06-18 | Metabolix, Inc. | Post process purification for gamma-butyrolactone production |
| ES2689558T3 (es) | 2011-10-25 | 2018-11-14 | Marrone Bio Innovations, Inc. | Formulaciones, composiciones y metabolitos de Chromobacterium y sus usos |
| CN104685058B (zh) | 2012-06-04 | 2020-07-07 | 基因组股份公司 | 制造4-羟基丁酸酯、1，4-丁二醇和相关化合物的微生物和方法 |
| ES2879250T3 (es) | 2012-06-05 | 2021-11-22 | Cj Cheiljedang Corp | Mezclas poliméricas biodegradables |
| US9850192B2 (en) | 2012-06-08 | 2017-12-26 | Cj Cheiljedang Corporation | Renewable acrylic acid production and products made therefrom |
| AU2013299414A1 (en) | 2012-08-10 | 2015-03-26 | Opx Biotechnologies, Inc. | Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products |
| WO2014028943A1 (en) | 2012-08-17 | 2014-02-20 | Metabolix, Inc. | Biobased rubber modifiers for polymer blends |
| US20140073022A1 (en) | 2012-09-10 | 2014-03-13 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Production of polyhydroxyalkanoates with a defined composition from an unrelated carbon source |
| ES2747230T3 (es) | 2012-10-10 | 2020-03-10 | Cj Cheiljedang Corp | Método de elaboración de copolímeros de polihidroxialcanoato (3HB-co-4HB) |
| ES2952673T3 (es) | 2012-10-22 | 2023-11-03 | Kaneka Corp | Microbio productor de PHA de alto peso molecular y método de producción de PHA de alto peso molecular usando el mismo |
| US10047383B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-08-14 | Cargill, Incorporated | Bioproduction of chemicals |
| RU2684714C2 (ru) | 2013-06-17 | 2019-04-11 | Санофи | Цельноклеточная система для биокатализа монооксигеназ цитохрома p450 |
| US11408013B2 (en) | 2013-07-19 | 2022-08-09 | Cargill, Incorporated | Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products |
| WO2015010103A2 (en) | 2013-07-19 | 2015-01-22 | Opx Biotechnologies, Inc. | Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products |
| JP6663221B2 (ja) * | 2014-01-31 | 2020-03-11 | 株式会社カネカ | Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が調節された微生物及びそれを用いたポリヒドロキシアルカノエート共重合体の製造方法 |
| EP2993228B1 (en) | 2014-09-02 | 2019-10-09 | Cargill, Incorporated | Production of fatty acid esters |
| WO2016053741A1 (en) | 2014-10-01 | 2016-04-07 | Cryosa, Llc | Apparatus and methods for treatment of obstructive sleep apnea utilizing cryolysis of adipose tissues |
| ITUB20150584A1 (it) * | 2015-05-13 | 2016-11-13 | Parco Scient E Tecnologico Della Sicilia S C P A | Batteri geneticamente modificati che producono mcl-PHA |
| WO2018144701A2 (en) | 2017-02-02 | 2018-08-09 | Cargill Incorporated | Genetically modified cells that produce c6-c10 fatty acid derivatives |
| JP7009009B2 (ja) * | 2019-04-26 | 2022-01-25 | 株式会社 フューエンス | 高分子量コポリマーを合成するための遺伝子 |
| IT202100017333A1 (it) | 2021-07-01 | 2023-01-01 | Irides S R L | Produzione di biomateriali da prodotti di scarto alimentari da parte di ceppi batterici antartici |
| JPWO2023085374A1 (ko) * | 2021-11-11 | 2023-05-19 |
Family Cites Families (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3444647A (en) * | 1961-08-08 | 1969-05-20 | Masahito Takahashi | Process of cultivating algae |
| US4861718A (en) * | 1984-09-29 | 1989-08-29 | Wakamoto Pharmaceutical Co., Ltd. | Gene coding for thermostable beta-galactosidase, bacillus subtilis having the gene, enzyme coded by the gene and a process for the production thereof |
| US5245023A (en) | 1987-06-29 | 1993-09-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for producing novel polyester biopolymers |
| US4878331A (en) * | 1987-07-28 | 1989-11-07 | Janet R. Taylor | Metal roofing structure |
| US4876331A (en) | 1987-08-18 | 1989-10-24 | Mitsubishi Kasei Corporation | Copolyester and process for producing the same |
| FR2627508B1 (fr) | 1988-02-22 | 1990-10-05 | Eurolysine | Procede pour l'integration d'un gene choisi sur le chromosome d'une bacterie et bacterie obtenue par ledit procede |
| US5000000A (en) | 1988-08-31 | 1991-03-19 | University Of Florida | Ethanol production by Escherichia coli strains co-expressing Zymomonas PDC and ADH genes |
| US5268274A (en) * | 1989-04-12 | 1993-12-07 | Cetus Corporation | Methods and nucleic acid sequences for the expression of the cellulose synthase operon |
| US5102797A (en) | 1989-05-26 | 1992-04-07 | Dna Plant Technology Corporation | Introduction of heterologous genes into bacteria using transposon flanked expression cassette and a binary vector system |
| US5371002A (en) | 1989-06-07 | 1994-12-06 | James Madison University | Method of production of poly-beta-hydroxyalkanoate copolymers |
| ES2131489T3 (es) * | 1989-07-10 | 2003-05-16 | Massachusetts Inst Technology | Una planta o una celula vegetal recombinante capaz de producir polihidroxibutirato u otro polihidroxialcanoato. |
| US5407957A (en) * | 1990-02-13 | 1995-04-18 | Martek Corporation | Production of docosahexaenoic acid by dinoflagellates |
| US5244921A (en) * | 1990-03-21 | 1993-09-14 | Martek Corporation | Eicosapentaenoic acids and methods for their production |
| US5512456A (en) | 1990-05-25 | 1996-04-30 | James Madison University | Method for the improved production and recovery of poly-β-hydroxybutyrate from transformed Escherichia coli |
| DE568606T1 (de) * | 1991-01-24 | 1999-02-25 | Martek Corp., Columbia, Md. | Mikrobielle öle und ihre verwendungen |
| JP2777757B2 (ja) | 1991-09-17 | 1998-07-23 | 鐘淵化学工業株式会社 | 共重合体およびその製造方法 |
| US5569595A (en) | 1991-09-27 | 1996-10-29 | Center For Innovative Technology | Production of poly-β-hydroxybutyrate in prokaryotic host cells |
| JPH07505048A (ja) * | 1991-12-11 | 1995-06-08 | サステック（プロプライアトリー） リミテッド | γ−リノレン酸を含有するシングルセルオイルの製造方法 |
| US5658757A (en) * | 1993-03-31 | 1997-08-19 | The Regents Of The University Of California | Cloned leptospira outer membrane protein |
| DE4333181C2 (de) * | 1993-04-30 | 1995-09-14 | Siemens Ag | Elektrische Batterie, insbesondere Zink-Brom-Batterie und deren Verwendung als Speisebatterie für ein Elektroauto |
| US5576198A (en) * | 1993-12-14 | 1996-11-19 | Calgene, Inc. | Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids |
| US5470727A (en) | 1993-12-21 | 1995-11-28 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Chromosomal expression of non-bacterial genes in bacterial cells |
| US5849894A (en) * | 1995-11-29 | 1998-12-15 | Monsanto Company | Rhodospirillum rubrum poly-β-hydroxyalkanoate synthase |
| US5811272A (en) * | 1996-07-26 | 1998-09-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for controlling molecular weight of polyhydroxyalkanoates |
| US6117658A (en) * | 1997-02-13 | 2000-09-12 | James Madison University | Methods of making polyhydroxyalkanoates comprising 4-hydroxybutyrate monomer units |
| WO1999014313A2 (en) * | 1997-09-19 | 1999-03-25 | Metabolix, Inc. | Biological systems for manufacture of polyhydroxylalkanoate polymers containing 4-hydroxyacids |
| ES2302386T3 (es) * | 1998-08-04 | 2008-07-01 | Metabolix, Inc. | Produccion de polihidroxialcanoatos a partir de polioles. |
| EP1105499B1 (en) * | 1998-08-18 | 2006-03-08 | Metabolix, Inc. | Transgenic microbial polyhydroxyalkanoate producers |
-
1999
- 1999-08-17 EP EP99943723A patent/EP1105499B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-17 KR KR1020017002093A patent/KR100662896B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-08-17 AT AT99943723T patent/ATE319835T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-08-17 DE DE69930276T patent/DE69930276T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-17 JP JP2000566442A patent/JP4623829B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-08-17 AU AU56761/99A patent/AU753132B2/en not_active Ceased
- 1999-08-17 CA CA2339421A patent/CA2339421C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-08-17 WO PCT/US1999/018673 patent/WO2000011188A1/en active IP Right Grant
- 1999-08-17 MX MXPA01001750A patent/MXPA01001750A/es not_active IP Right Cessation
- 1999-08-17 US US09/375,975 patent/US6593116B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-06-13 US US10/461,069 patent/US6913911B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-02-08 US US11/053,551 patent/US20050170480A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-10-26 US US11/925,482 patent/US20100267016A1/en not_active Abandoned
-
2010
- 2010-06-16 JP JP2010137239A patent/JP2010279358A/ja not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR200453669Y1 (ko) * | 2007-12-07 | 2011-05-19 | 원정제관(주) | 용기 손잡이 |
| WO2023121282A1 (ko) * | 2021-12-24 | 2023-06-29 | 씨제이제일제당 (주) | 포스포에놀피루브산 카복실화효소를 코딩하는 유전자의 5'utr 변이 서열 및 이의 용도 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6593116B1 (en) | 2003-07-15 |
| CA2339421A1 (en) | 2000-03-02 |
| ATE319835T1 (de) | 2006-03-15 |
| US6913911B2 (en) | 2005-07-05 |
| AU753132B2 (en) | 2002-10-10 |
| WO2000011188A1 (en) | 2000-03-02 |
| AU5676199A (en) | 2000-03-14 |
| US20050170480A1 (en) | 2005-08-04 |
| JP2002523050A (ja) | 2002-07-30 |
| DE69930276D1 (de) | 2006-05-04 |
| EP1105499A1 (en) | 2001-06-13 |
| DE69930276T2 (de) | 2006-10-05 |
| WO2000011188A9 (en) | 2002-04-11 |
| US20100267016A1 (en) | 2010-10-21 |
| US20030228669A1 (en) | 2003-12-11 |
| EP1105499B1 (en) | 2006-03-08 |
| JP2010279358A (ja) | 2010-12-16 |
| KR100662896B1 (ko) | 2006-12-28 |
| MXPA01001750A (es) | 2002-04-08 |
| JP4623829B2 (ja) | 2011-02-02 |
| CA2339421C (en) | 2011-10-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100662896B1 (ko) | 유전자 변형된 미생물의 폴리하이드록시알카노에이트 생성체 | |
| AU2001275996B2 (en) | Production of polyhydroxyalkanoates from polyols | |
| CA2303070C (en) | Biological systems for manufacture of polyhydroxylalkanoate polymers containing 4-hydroxyacids | |
| AU2001275996A1 (en) | Production of polyhydroxyalkanoates from polyols | |
| CA2360801C (en) | Transgenic systems for the manufacture of poly(3-hydroxy-butyrate-co-3-hydroxyhexanoate) | |
| JP2015211681A (ja) | ポリ（５ｈｖ）および５炭素化合物を製造するための環境に優しい方法および組成物 | |
| KR100507127B1 (ko) | 폴리하이드록시알카노에이트 합성 효소 및 상기 효소를 코딩하는 유전자 | |
| EP1700909B1 (en) | Transgenic microbial polyhydroxyalkanoate producers |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20121207 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20131209 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20141209 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20151207 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20161208 Year of fee payment: 11 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |