JP4986325B2

JP4986325B2 - ポリ（３−ヒドロキシ−ブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノエートの製造のためのトランスジェニック系

Info

Publication number: JP4986325B2
Application number: JP2000594931A
Authority: JP
Inventors: ララマディソン，; グジャルトダブリュー．ヒューズマン，; オリバーピー．ピープルズ，
Original assignee: メタボリックス，インコーポレイテッド
Priority date: 1999-01-22
Filing date: 2000-01-21
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2020-01-21
Also published as: CA2360801C; CA2360801A1; US8049065B2; US7504556B2; JP2002534981A; US20040172675A1; WO2000043523A2; WO2000043523A3; ES2344000T3; EP1208208B1; EP1208208A2; AU778497B2; US7455999B2; US20020040485A1; AU2623100A; DE60042413D1; ATE434045T1; US20100311131A1; EP2088198A2; EP2088198A3

Description

【０００１】
（発明の背景）
本発明は、概して、ポリヒドロキシアルカノエート材料の分野に関し、そしてより詳細には、その生産の改善された方法に関する。
【０００２】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は、天然の熱可塑性のポリエステルであり、そして莫大な種々の適用（消費者向け包装、使い捨てのダイヤパー（ｄｉａｐｅｒ）裏打ち、ゴミ袋、食品向け製品および医療向け製品を含む）において使用するための従来のポリマー技術によって処理され得る。ポリヒドロキシアルカノエートを天然で産生する微生物からＰＨＡポリマーを産生するために使用され得る方法は、米国特許第４，９１０，１４５（Ｈｏｌｍｅｓら）；Ｂｙｒｏｍ、「ＭｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｂｙｒｏｍ編）３３３−５９頁（ＭａｃＭｉｌｌａｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｌｏｎｄｏｎ１９９１）；ＨｏｃｋｉｎｇおよびＭａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ、「Ｂｉｏｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ」、ＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＢｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅＰｏｌｙｍｅｒｓ（Ｇｒｉｆｆｉｎ編）４８−９６頁（Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ１９９４）；Ｈｏｌｍｅｓ、「ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙＰｒｏｄｕｃｅｄ（Ｒ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅＰｏｌｙｍｅｒｓａｎｄＣｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」、ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎＣｒｙｓｔａｌｌｉｎｅＰｏｌｙｍｅｒｓ（Ｂａｓｓｅｔｔ編）第２巻、１−６５頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｌｏｎｄｏｎ１９８８）；Ｌａｆｆｅｒｔｙら、「ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＰｏｌｙ−ｂ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＲｅｈｍおよびＲｅｅｄ編）第６６巻、１３５−７６頁（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ１９８８）；ＭｕｅｌｌｅｒおよびＳｅｅｂａｃｈ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３２．４７７−５０２（１９９３）に記載されている。ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）の産生のための天然の生合成経路を図１に示す。
【０００３】
天然または遺伝子操作された生物においてＰＨＡを産生するための方法は、Ｓｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌ、「ＰｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏｉｃＡｃｉｄ」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｂｙｒｏｍ編）１２３−２１３頁（ＭａｃＭｉｌｌａｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｌｏｎｄｏｎ１９９１）；ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ、ＣＨＥＭＴＥＣＨ、２６：３８−４４（１９９６）；ＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌおよびＷｉｅｓｅ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３７：６９１−９７（１９９２）；米国特許第５，２４５，０２３号；同第５，２５０，４３０号；同第５，４８０，７９４号；同第５，５１２，６６９号；同第５，５３４，４３２号（ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ）（これらはまた、レダクターゼ、チオラーゼ、およびＰＨＢポリメラーゼをコードする遺伝子を開示および請求している）；Ａｇｏｓｔｉｎｉら、Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、ＰａｒｔＡ−１、９：２７７５−８７（１９７１）；Ｇｒｏｓｓら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２１：２６５７−６８（１９８８）；Ｄｕｂｏｉｓら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２６：４４０７−１２（１９９３）；ＬｅＢｏｒｇｎｅおよびＳｐａｓｓｋｙ、Ｐｏｌｙｍｅｒ、３０：２３１２−１９（１９８９）；ＴａｎａｈａｓｈｉおよびＤｏｉ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２４：５７３２−３３（１９９１）；Ｈｏｒｉら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２６：４３８８−９０（１９９３）；Ｋｅｍｎｉｔｚｅｒら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２６：１２２１−２９（１９９３）；Ｈｏｒｉら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２６：５５３３−３４（１９９３）；ＨｏｃｋｉｎｇおよびＭａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ、Ｐｏｌｙｍ．Ｂｕｌｌ．、３０：１６３−７０（１９９３）；Ｘｉｅら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、３０：６９９７−９８（１９９７）；ならびに米国特許第５，５６３，２３９号（Ｈｕｂｂｓら）によって記載されている。ＰＨＡの産生のための一般的な経路を図２に示す。対応するラクトンの直接縮合および開環重合を含む合成ポリマーの合成アプローチは、ＪｅｓｕｄａｓｏｎおよびＭａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２７：２５９５−６０２（１９９４）；米国特許第５，２８６，８４２号（Ｋｉｍｕｒａ）；米国特許第５，５６３，２３９号（Ｈｕｂｂｓら）；米国特許第５，５１６，８８３号（Ｈｏｒｉら）；米国特許第５，４６１，１３９号（Ｇｏｎｄａら）；およびカナダ国特許出願第２，００６，５０８号において記載されている。ＷＯ９５／１５２６０は、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシバレレートｐｏｌｙ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）フィルムの製造を記載し、そして米国特許第４，８２６，４９３号および同第４，８８０，５９２号（Ｍａｒｔｉｎｉら）は、ＰＨＢおよびＰＨＢＶのフィルムの製造を記載する。米国特許第５，２９２，８６０号（Ｓｈｉｏｔａｎｉら）は、ＰＨＡコポリマーであるポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノエート）（ＰＨＢＨ）の製造を記載する。
【０００４】
今日まで、ＰＨＡは、限定されて市販されており、コポリマーＰＨＢＶのみが進展された量で利用可能である。このコポリマーは、細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａの醗酵によって生産されている。他のＰＨＡの生産のための醗酵プロセスが開発されている（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ、ＣＨＥＭＴＥＣＨ２６：３８−４４（１９９６））。植物の作物もまた、これらのポリマーを生産するために遺伝子操作されており、植物油とも遜色ない費用構造および石油ベースのポリマーに対する直接の費用競争力を提供する（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ、ＣＨＥＭＴＥＣＨ２６：３８−４４（１９９６））。
【０００５】
いくつかの因子が、ＰＨＡの経済的な生物学的生産に重要である。これは、基質の費用、醗酵時間、および下流の処理の効率を含む。日用品の大規模発酵について、一般に、プラスミドベースの系では、プラスミドを維持する過剰な負担および安定な発現を維持する際の問題に起因して、満足行かないものであることが知られている。
【０００６】
３−ヒドロキシ−コ−ヒドロキシアルカノエート（３Ｈ−コ−ＨＨ）を含むＰＨＡの産生のための公知の生物学的系では非効率的である。例えば、Ｓｈｉｍａｍｕｒａら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２７：８７８（１９９４）は、Ａｅｒｏｍｏｎａｓｃａｖｉａｅが、オリーブ油またはＣ１２〜Ｃ１８の脂肪酸上で増殖させる場合に３−ヒドロキシブチレートおよび３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）から構成されるＰＨＡを合成することを開示する。３ＨＨモノマーの部分は、炭素源の濃度および醗酵時間に依存して決定され、そして２５％のレベルの量であり得る（Ｄｏｉら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２８：４８２２（１９９５））。３ＨＨ基質レベルの増加の結果として、そのＰＨＡの結晶性、融点およびガラス転移温度が減少する。物理的特性におけるこれらの変化は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ由来のＰＨＢデポリメラーゼによる分解に対する感受性の増加をもたらす。ＰＨＢコポリマーにおける低レベルの３ＨＨを取り込む他の天然の微生物は、ＣｏｍａｍｏｎａｓｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓである（Ｈｕｉｓｍａｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：１９４９（１９８９）；Ｃａｂａｌｌｅｒｏら、Ｉｎｔ．ＪＢｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．、１７：８６（１９９５））。ＴｈｉｏｃａｐｓｉａｐｆｅｎｉｇｉｉまたはＣｈｒｏｍａｔｉｕｍｖｉｎｏｓｕｍのいずれか由来のｐｈｂ遺伝子が導入された組換えＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＧＰｐ１０４株もまた、主要成分として、３−ヒドロキシヘキサノエートを有するＰＨＡを蓄積した。
【０００７】
ＰＨＡは、一般に、以下のポリマー組成物に基づいて２つのクラスに分類される：短い側鎖のＰＨＡおよび長い側鎖のＰＨＡ。一方の群由来のモノマーの他方に属するＰＨＡの組込みは、通常、低レベルに限定される。モノマーが両方のＰＨＡについて豊富にあるいくつかの場合において、その細菌は、一般に、別個のＰＨＡ顆粒を産生する。この顆粒は各々、１つの型のＰＨＡを含む。従って、ＰＨＡポリメラーゼの基質特異性は、短い側鎖（Ｃ₄およびＣ₅）について、または中程度の側鎖（Ｃ₈〜Ｃ₁₀）について、最適であるように一般化され得る。個々の微生物によって合成されるＰＨＡの組成物に基づいて、３−ヒドロキシヘキサノエートを取り込むＰＨＡポリメラーゼが同定され得る。従って、Ａ．ｃａｖｉａｅ、Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉおよびＴ．ｐｆｅｎｉｇｉｉ由来のＰＨＡポリメラーゼは、ＰＨＡへ３−ヒドロキシヘキサノエートを取り込むことについて公知であるが、他方、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、ＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓｎａｔａｎｓおよびＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．由来の酵素は、３−ヒドロキシバレレートについて優先性を有する。後者の生物由来のＰＨＡポリメラーゼはまた、Ｃ₄を超えるＣ₅についてのそれらの優先性に起因して、ＰＨＢ−コ−ＨＨコポリマーを作製するにおいて有用である。しかし、不幸にも、これらの細菌は、一般に、低増殖速度を有し、しばしば、破壊して開口することが困難で、そして遺伝子操作に対して限定された受容性のみを有する。従って、効率よく、より費用効果のある、生物学的系による３Ｈ−コ−ＨＨを含むＰＨＡの産生方法を開発することが所望される。
【０００８】
従って、本発明の課題は、３−ヒドロキシヘキサノエートモノマー（ＨＨＰＨＡ）を含むポリヒドロキシアルカノエートポリマーの産生のための遺伝子操作された系を提供することである。
【０００９】
本発明の別の課題は、ブチレートもしくはブタノールのようなより経済的な原料からの３−ヒドロキシヘキサンモノマーを産生するために使用され得る有意な変異を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる課題は、炭化水素の原料に由来する細胞性代謝物を、３−ヒドロキシヘキサノエートコモノマーの産生のためのブチリル−ＣｏＡへと変換するために適切な遺伝子を提供することである。
【００１１】
本発明の別の課題は、３−ヒドロキシヘキサノエートをコモノマーとして含有するＰＨＡを産生するための改善された方法を提供することである。
【００１２】
本発明のなお別の課題は、３−ヒドロキシヘキサノエートモノマーの内因生合成のための生物学的系における新たな経路を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる課題は、発現が充分かつ安定である、３−ヒドロキシヘキサノエートを含むＰＨＡの産生のための、遺伝子操作された生物学的系を提供することである。
【００１４】
（発明の要旨）
３−ヒドロキシ−コ−ヒドロキシヘキサノエート（３Ｈ−コ−ＨＨ）を含むＰＨＡの産生のための生物学的系が、より速い増殖速度を有するトランスジェニック生物を用いること、および／またはこれらの生物を遺伝子操作して、より安価な原料（例えば、ブチレートまたはブタノール）から、あるいは、その細胞性中間体をブチルル−ＣｏＡへと変換し、それによってトランスジェニック生物を使用してＰＨＡ産生の費用を改善し得る酵素をコードする遺伝子を取り込むことによってグルコースから直接、コモノマー３−ヒドロキシヘキサン酸を生成することによって改善され得ることが発見された。これらの過程は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉのような遺伝子操作された細菌に基づくか、またはＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａおよびＰ．ｐｕｔｉｄａのようなＰＨＡ産生体由来のＰＨＡ生合成遺伝子を含む産生系のような植物作物に基づく。この方法の好ましい実施形態において、さらなる遺伝子は、トランスジェニックＰＨＢプロデューサーに導入され、それによって、ＰＨＡに取り込まれる３ＨＨのようなモノマーを合成する新たな株を作製する。
【００１５】
この方法の好ましい実施形態において、貯蔵ポリマーＰＨＡを通常産生しない微生物を遺伝子操作して、ＰＨＡシンターゼ遺伝子および以下をコードする遺伝子からなる群より選択されるさらなる導入遺伝子を導入することによってＰＨＡを生成する：β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ−補酵素Ａトランスフェラーゼ（ＡＣＰはアシルキャリヤータンパク質の省略形である）。これらの遺伝子は、好ましくは、３ＨＨポリマーの産生のために有利である、コードされる酵素の基質特性に基づいて選択される。より経済的な原料（例えば、ブチレートまたはブタノール）から３−ヒドロキシヘキサンモノマーを産生するために使用され得る有用な変異が記載される。これらの変異は、当業者に公知の標準的な技術によって記載される本発明を実施するために適切な細菌において容易に生成され得る。
【００１６】
３−ヒドロキシヘキサノエートをコモノマーとして含むＰＨＡを合成するトランスジェニック生物を操作するための方法が開発された。これらの系の好ましい実施形態において、この方法を使用して、以下のいずれかを操作する：（１）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｌａｔｕｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａまたはＰＨＡを合成し得る他の微生物のような細菌、あるいは（２）油作物の種（例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａ、ヒマワリ、ダイズ、トウモロコシ、ベニバナ、アマ、パームまたはココヤシ）またはデンプン蓄積植物（例えば、ポテト、タピオカ、またはキャッサバ）のような、高等植物。これらをスクリーニングして、代謝中間体を、Ｒ−３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡへの変化のために所望される酵素活性（特にブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性およびアシルＣｏＡ：ＡＣＰトランスフェラーゼ活性）を同定する。後者の変換は、単一のタンパク質によるか、またはチオエステラーゼおよびアシルＣｏＡシンターゼ活性の組合せによるかのいずれかで触媒される。通常の細胞代謝物の、３−ヒドロキシヘキサノエートへのフラックスは、３つの異なる経路の１つ以上を介して再配向される。これらの３つの経路は、３−ヒドロキシヘキサノエートを、以下のいずれかにより生成する：（１）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｉｕｍ由来のブチレート醗酵経路を用いる、（２）Ｅ．ｃｏｌｉ由来の脂肪酸生合成経路を用いる、または（３）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ由来の脂肪酸酸化複合体を用いること。導入遺伝子由来の機能的ＰＨＡシンターゼを発現する細菌、およびトランスジェニック植物作物におけるこれらの遺伝子を発現するための方法が記載されることを実施例が実証する。
【００１７】
クロトニルＣｏＡをブチリルＣｏＡへと変換する酵素をコードする遺伝子を選択する方法、ならびにＰＨＡ生合成のために、アシルＡＣＰ中間体をアシルＣｏＡへ、またはアシルＣｏＡ前駆体へと変換する酵素を同定するスクリーニング方法が提供される。ＰＨＡポリメラーゼをコードする遺伝子が染色体に組み込まれ、そしてＰＨＡ合成を支持するレベルにまで発現されるトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ株が提供される。そのようなトランスジェニック株（これはまた、染色体における特異的な変異を有する）は、異なる生物学的供給源からゲノムライブラリーを用いてこれらの活性の選択およびスクリーニングを可能にする。
【００１８】
３−ヒドロキシヘキサノエートモノマーの内因生合成のための生物学的系における新たな経路を操作するための方法が記載される。好ましい実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉは、細胞代謝物を、３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡへと変換する酵素をコードする遺伝子をＥ．ｃｏｌｉに導入することによって、唯一の炭素源として、安価な炭化水素供給源（例えば、グルコース、スクロース、キシロース、およびラクトース）またはそのような炭化水素および脂肪酸の混合物のいずれかからＰＨＢＨを合成するように操作される。組換えＥ．ｃｏｌｉ株における効率よいＰＨＡ合成のために、その経路に関与する遺伝子のすべての発現が適切であることが重要である。この目的のために、目的の遺伝子がプラスミドのような、内因的にコピー数効果および結果的に高発現レベルを生じる染色体外ＤＮＡ分子から発現され得るか、またはそれらの遺伝子は、染色体から発現され得る。日用品の大規模醗酵のために、一般に、プラスミドベースの系は、そのプラスミドを維持することの過度の負担および安定な発現の問題に起因して、満足行かないことが知られている。これらの欠点は、染色体にコードされた酵素を用いるか、ならびに／または目的の遺伝子に先行する転写シグナルおよび翻訳シグナルを、改善して、発現を充分かつ安定にすることによって、克服され得る。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
任意のＨＡ産生生物の代謝（細菌および植物作物を含む）は、代謝操作によってＰＨＡ合成についての特異的代謝物を供給するように再配向され得る。このアプローチを有効にするために、共通の代謝中間体から所望のモノマーへと導く新たな生物学的経路を開発することが必要である。そのような経路は、１つの生物に存在することは必要ではない。なぜなら、個々の工程は、遺伝子操作技術を用いて選択された産生生物において再構成され得るからである。補完された原料に由来する代替のモノマーを取り込むように開発されたプロセスは、特定の欠点を有する。第一に、醗酵槽に補完的原料を加えることは費用が高い。なぜなら、それらは、インフラストラクチャを拡張し、そしてさらなる品質管理を課すからである。第二に、原料におけるモノマー前駆体の添加は厳密に管理されて、モノマープールおよびＰＨＡ組成物の安定な組成を達成する必要があるからである。
【００２０】
従って、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｃ．Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ、Ａ．ｌａｔｕｓ、Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉおよびＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのような生物、ならびに異種遺伝子（単数または複数）からのＰＨＡシンターゼを発現するトランスジェニックの微生物および植物作物の系においてＰＨＢＨを産生させることを可能にする、代謝操作方法における類似のアプローチが開発されてきた。
【００２１】
（Ｉ．ポリヒドロキシアルカノエート）
いくつかの型のＰＨＡが公知である。それらの側鎖の長さおよび生合成のためのそれらの経路に従って、２つのグループへとＰＨＡを大まかに分けることが有用である。短い側鎖を有するもの（例えば、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、Ｒ−３−ヒドロキシ酪酸単位のホモポリマー）は、結晶性で熱可塑性であり；長い側鎖を有するＰＨＡは、よりエラストマー性である。前者のポリマーは、約７０年間知られている（ＬｅｍｏｉｇｎｅおよびＲｏｕｋｈｅｌｍａｎ１９２５）が、後者のポリマーは、比較的最近の発見である（ｄｅＳｍｅｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５４：８７０−７８（１９８３））。しかし、この命名の前に、Ｒ−３−ヒドロキシ酪酸単位およびＣ５〜Ｃ１６のより長い側鎖の両方を含む単位微生物起源のＰＨＡが同定されていた（ＷａｌｌｅｎおよびＲｏｗｈｅｄｅｒ、Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、８：５７６−７９（１９７４））。Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸、および１つ以上の、５〜１６炭素原子を含む長い側鎖のヒドロキシ酸単位のコポリマーを産生する多数の細菌がより最近になって同定された（ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌおよびＷｉｅｓｅ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３７：６９１−９７（１９９２）；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：５０７−１４（１９９２）；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４０：７１０−１６（１９９４）；Ａｂｅら、Ｉｎｔ．ＪＢｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．、１６：１１５−１９（１９９４）；Ｌｅｅら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４２：９０１−０９（１９９５）；Ｋａｔｏら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４５：３６３−７０（１９９６）；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４６：２６１−６７（１９９６）；米国特許第４，８７６，３３１号（Ｄｏｉ））。特異的な２成分コポリマーの有用な例は、ＰＨＢ−コ−３−ヒドロキシヘキサノエートが挙げられる（Ｂｒａｎｄｌら、Ｉｎｔ．ＪＢｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．、１１：４９−５５（１９８９）；ＡｍｏｓおよびＭｃＩｎｅｒｅｙ、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１５５：１０３−０６（１９９１）；米国特許第５，２９２，８６０号（Ｓｈｉｏｔａｎｉら））。他の代表的なＰＨＡは、ＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌおよびＶａｌｅｎｔｉｎ、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１２８：２１９−２８（１９９５）に記載されている。化学合成方法もまた適用されて、適用試験のために、この型のラセミＰＨＢコポリマーが調製されている（ＰＣＴＷＯ９５／２０６１４、ＰＣＴＷＯ９５／２０６１５、およびＰＣＴＷＯ９６／２０６２１）。
【００２２】
このポリマーの有用な分子量は、約１０、０００ダルトンと４、０００、０００ダルトンとの間であり、そして好ましくは、約５０、０００ダルトンと１、５００、０００ダルトンとの間である。ＰＨＡは、好ましくは、以下の式の１つ以上の単位を含む：
−ＯＣＲ¹Ｒ²（ＣＲ³Ｒ⁴）_nＣＯ−
ここで、ｎは０であるか整数であり；そして
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は、独立して、飽和および不飽和の、炭化水素ラジカル、ハロ置換ラジカルおよびヒドロキシ置換ラジカル、ヒドロキシラジカル、ハロゲンラジカル、窒素置換ラジカル、酸素置換ラジカルおよび水素原子から選択される。
【００２３】
モノマー単位は、一般に、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート、ヒドロキシヘキサノエート、ヒドロキシヘプタノエート、ヒドロキシオクタノエート、ヒドロキシノナノエート、ヒドロキシデカノエート、ヒドロキシウンデカノエート、およびヒドロキシドデカノエートの単位を包含する。ＰＨＡは、モノマーおよびポリマーならびに３−ヒドロキシ酸、４−ヒドロキシ酸および５−ヒドロキシ酸の誘導体を包含し得る。
【００２４】
（ＩＩ．ポリヒドロキシアルカノエートの調製の方法）
ＰＨＡは、生物学的供給源（例えば、天然にＰＨＡを産生し、そして培養条件および原料の操作によって所望のＰＨＡを産生するように誘導され得る微生物、本明細書において記載されるように遺伝子操作されたこれらまたは他の微生物、あるいはＰＨＡを産生するように遺伝子操作された植物のような高等生物）から調製され得る。
【００２５】
（ＰＨＡ合成のために必要とされる酵素の基質特異性）
ＰＨＡシンターゼ遺伝子の適切な供給源は、当業者に周知な方法によって脂肪酸で増殖される場合に産生されるＰＨＡの組成を分析すること、次いでＰＨＡシンターゼ遺伝子を単離することによって容易に同定される。有用なＰＨＡシンターゼ遺伝子は、例えば、以下から単離されている：Ａｅｒｏｍｏｎａｓｃａｖｉａｅ（ＦｕｋｕｉおよびＤｏｉ、ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−３０（１９９７））、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｒｕｂｒｕｍ（米国特許第５，８４９，８９４号）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｅｒ（ＰｉｅｐｅｒおよびＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌ、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．９６（ｌ）：７３−８０（１９９２））、ならびにＮｏｃａｒｄｉａｃｏｒａｌｌｉｎａ（Ｈａｌｌら、Ｃａｎ．ＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６８７−９１（１９９８））。
【００２６】
ＰＨＢポリメラーゼについてのインビトロ研究は、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａＩ−１６−Ｍ由来の酵素が、３−ヒドロキシ−ブチリルＣｏＡのＲ異性体に対して厳密に特異的であることが示されている（Ｆｕｋｕｉら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１１０：１４９（１９７６））。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のＰＨＢポリメラーゼは、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡモノマーについて高度に特異的であり、そして３−ヒドロキシバレリルＣｏＡに対して７．５％のみの活性を示す。３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡまたはより長い３−ヒドロキシアシルＣｏＡでは、インビトロ研究において、活性は検出されなかった（Ｈａｙｗｏｏｄら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、５７：１（１９８９））。
【００２７】
Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ由来のＮＡＤＰＨ結合アセトアセチルＣｏＡ還元酵素は、アセトアセチルＣｏＡで最も活性であるが、一方、３−ケトバレリルＣｏＡ（最大活性の４１％）および３−ケトヘキサノイルＣｏＡ（０．６％）もまた、この酵素に対する基質であった（Ｐｌｏｕｘら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７４：１７７（１９８８））。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａにおいて、３−ケトバレリルＣｏＡおよび３−ケトヘキサノイルＣｏＡについての還元酵素活性は、アセトアセチルＣｏＡについて決定された活性のそれぞれ４８％および３．６％である（Ｈａｙｗｏｏｄら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、５２：２５９（１９８８））。さらに、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａは、Ｃ₄基質およびＣ₈基質について最も高いＳ−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ活性に対してＮＡＤＨ依存性の活性を有する。
【００２８】
Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａはまた、アセトアセチルＣｏＡ基質に対して最も高い活性および３−ケトバレリルＣｏＡ基質に対して最大の活性の３％のみを有する、２つの３−ケトチオラーゼ（ＡおよびＢ）を有する（Ｈａｙｗｏｏｄら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、５２：９１（１９８８））。酵素Ａは、これら２つの基質に対して１０倍活性であり、そして厳密に特異的であるが、酵素Ｂもまた、より高い３−ケトアシルＣｏＡの活性に対して１〜２％の活性を有する。
【００２９】
要約すると、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａまたはＺ．ｒａｍｉｇｅｒａ由来のＰＨＢ酵素による３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡモノマーの合成は、３−ケトヘキサノイル−ＣｏＡに対して有利な基質特異性を有するチオラーゼ遺伝子および／または還元酵素遺伝子を同定し、そして使用することによって改善され得る。従って、ＰＨＡ生合成のために、３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを提供し得る活性をコードする遺伝子を同定し、そして単離することが必要である。
【００３０】
（Ｎｏｃａｒｄｉａｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ由来のｐｈｂ遺伝子の同定および単離）
Ｎ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒは、炭素供給源として単糖上で増殖する場合、高レベルの３−ヒドロキシバレレートを、ＰＨＡに組み入れることが公知であるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属の１つのメンバーである。この特性は、Ｎ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ由来のＰＨＢ生合成酵素は、おそらく他のＰＨＢ合成酵素（例えば、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のＰＨＢ生合成酵素）より広い基質範囲を有するだろうことを示唆する。ＰＨＢポリメラーゼおよびアセトアセチルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｅｒ由来のｐｈａＣ遺伝子のヌクレオチド配列ならびに公知のアセチルＣｏＡデヒドロゲナーゼのＮ末端部分およびＣ末端部分の領域において保存された領域に基づいたプライマーを使用した、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅された。Ｎ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ由来のｐｈｂＢ遺伝子およびｐｈｂＣ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントが、プローブとして、対応するＰＣＲ産物を用いたサザンブロットによるゲノム消化において同定された。３．６ｋｂＢａｍＨＩ（ｐｈｂＣ）および４．２ｋｂＰｖｕＩＩ（ｐｈｂＢ）フラグメントが、ｐＵＣ１１９にクローン化され、そしてプローブとして、対応するＰＣＲ産物を使用したコロニーブロッティングにより同定された。
【００３１】
（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のブチラート発酵経路を用いたＲ−３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡの内因性形成）
Ｒ−３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ形成を生じる生合成経路は、図４に示されるようなモノマー前駆体へ後に縮小され得る３−ケトヘキサノイルＣｏＡへのブチリルＣｏＡの伸長を含む。ブチリルＣｏＡは、ブチラート発酵生物（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）により、アセチルＣｏＡから４工程経路で形成される。３−ケトヘキサノイルＣｏＡへのブチリルＣｏＡの伸長は、チオラーゼによって触媒される。従って、完全な経路は、（１）ＰＨＢ生合成チオラーゼ、（２）ブチリルＣｏＡを形成するＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来の３つの酵素、（３）３−ケトヘキサノイルＣｏＡに特異的な第２のチオラーゼ、（４）この基質に特異的な還元酵素、および（５）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡおよび３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡの両方を受容するＰＨＢポリメラーゼを含む。
【００３２】
ブチラート発酵に関与するＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ遺伝子座は、５つの酵素／タンパク質（クロトナーゼ（ｃｒｔ）、ブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｂｃｄ）、電子伝達のための２ＥＴＦタンパク質（ｅｔｆＡおよびｅｔｆＢ）、および３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｈｂｄ））をコードする（Ｂｏｙｎｔｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：３０１５（１９９６））。これらの遺伝子が単離された別の微生物は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍである（ｖａｎＲｉｎｓｕｍ、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ．ｎｏ．）。Ｈｂｄおよびｃｒｔは、同様にＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅから単離された（Ｍｕｌｌａｎｙら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２４：６１（１９９４））。３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性は、Ｄａｓｔｒｉｃｈａｒｕｍｉｎａｔｉｕｍ（Ｙａｒｌｅｔｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２８：１８７（１９９５））、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ（ＭｉｌｌｅｒおよびＪｅｎｅｓｅｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１３８：９９（１９７９））、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐｈａｇｅｄｅｍｅｓ（ＧｅｏｒｇｅおよびＳｍｉｂｅｒｔ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５２：１０４９（１９８２））、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（ＨａｒｔｅｌおよびＢｕｃｋｅｌ、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１６６：３５０（１９９６））、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｋｌｕｙｖｅｒｉ（Ｍａｄａｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３２：５１（１９７３））、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｓｐｏｒａｂｒｙａｎｔｉ（ＤｏｎｇおよびＳａｔａｍｓ、ＡｎｔｏｎｉｅｖａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、６７：３４５（１９９５））において検出され；クロトナーゼ活性は、Ｂｕｒｙｒｉｖｉｂｒｉｏｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ（ＭｉｌｌｅｒおよびＪｅｎｅｓｅｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１３８：９９（１９７９））において検出され；そしてブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性は、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａｅｌｓｄｅｎｉｉ（ＷｉｌｌｉａｍｓｏｎおよびＥｎｇｅｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２１８：５２１（１９８４））、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｅｌｓｄｅｎｉｉ（ＥｎｇｅｌおよびＭａｓｓａｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９７１、１２５：８７９）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｓｐｏｒａｂｒｙａｎｔｉ（ＤｏｎｇおよびＳｔａｍｓ、ＡｎｔｏｎｉｅｖａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、６７：３４５（１９９５））、およびＴｒｅｐｏｎｅｍａｐｈａｇｅｄｅｍｅｓ（ＧｅｏｒｇｅおよびＳｍｉｂｅｒｔ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５２：１０４９（１９８２））において検出された。
【００３３】
今までのところ公知である全てのＣｏＡ関連チオラーゼについて、この反応は、主に異化方向に進行する。また、ｐｈｂＡによってコードされるチオラーゼは、好ましくはアセトアセチルＣｏＡを分解する。従って、３−ケトヘキサノイルＣｏＡへの生合成経路において、異化チオラーゼは、この反応が還元酵素およびＰＨＡポリメラーゼによって異化方向へと向かわされている場合、使用され得る。公知のチオラーゼに加え、これらの酵素をコードする遺伝子は、細菌、哺乳動物および植物の範囲から得られ得る。実際、Ｅ．ｃｏｌｉは、生化学的および生理学的の両方であまり特徴付けられていない５つのチオラーゼを有する。これらのチオラーゼの２つは、以前同定された遺伝子（ｆａｄＡおよびａｔｏＢ）によってコードされるが、一方他の３つは、研究されていないオープンリーディングフレームによってコードされる。これらのチオラーゼは過剰発現され、そしてインビトロアッセイにおいて異なる基質を用いてアッセイされた。還元酵素遺伝子およびポリメラーゼ遺伝子は、Ｎ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒまたはＣ₆モノマーを取り込む任意の他のＰＨＡプロデューサーから取られる。
【００３４】
（脂肪酸酸化経路によるＲ−３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡの内因性形成）
Ｐ．ｐｕｔｉｄａにおいて、ＰＨＡ生合成についてのモノマーは、アルカンまたは酸化されたアルカンが、炭素供給源およびエネルギー供給源として提供される場合、脂肪酸酸化経路から誘導される。ＰＨＡ生合成に導かれるこの経路における中間体は、Ｓ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡ（好ましくはＣ₈〜Ｃ₁₀）であると推定され、これは、ＦａｏＡＢ複合体によるＲ異性体へのエピマー化を受ける。エピメラーゼおよびＰＨＡポリメラーゼの組み合わせた作用は、ＰＨＡに対してＣ₆〜Ｃ₁₄のモノマーを提供する。結果として、このエピメラーゼおよびＰＨＡポリメラーゼを受容する３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡの組み合わせは、図５によって示されるように、トランスジェニック生物体において脂肪酸からＰＨＢＨを合成するための生合成能力を提供する。３ＨＢモノマーとしての発酵産生に有用な供給原料である脂肪酸および炭水化物の混合物は、アセチルＣｏＡから誘導され得るが、一方、３ＨＨ成分は脂肪酸からである。植物作物について、３−ヒドロキシヘキサノエートモノマーの合成は、アセチルＣｏＡから同化的に進行するか、または脂肪酸から異化的に進行する。
【００３５】
エピメラーゼ活性は、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＦａｄＡＢ）（Ｐｒａｍａｎｉｋら、Ｊ．Ｂａｔｅｒｉｏｌ．１３７：４６９（１９７９））およびＰ．ｆｒａｇｉＦａｏＡＢ（Ｉｍａｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：１８４（１９９０））由来の脂肪酸酸化複合体において検出されている。Ｐ．ｐｕｔｉｄａＫＴ２４４２由来のＦａｏＡＢ複合体を、サブユニットを過剰発現ベクターｐＴｒｃＮにおいてクローニングした後に試験し、そしてこの複合体が３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡに対してエピメラーゼ活性を示し、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに対して限定された活性を示し、そして３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡに対してほとんど検出可能でないレベルを示した。これらの結果は、ＦａｏＡＢ複合体がＰ．ｐｕｔｉｄａにおけるＰＨＡ経路の基質特異性の決定因子であり得ることを示唆する。結果として、他の供給源からのＦａｏＡＢ複合体は、組換え生物、原核生物または原始生物における新規３−ヒドロキシアシルＣｏＡプールを生成するために使用され得る。相同な遺伝子は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａＫＴ２４４２においてｆａｏＡＢ遺伝子を同定するための同じ方法を使用して、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ａ．ｌａｔｕｓ、Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｒ．ｒｕｂｅｒならびに他のＰＨＡおよび非ＰＨＡプロデューサーのような細菌から容易に単離される。
【００３６】
（脂肪酸生合成経路を介したＲ−３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡの内因性形成）
Ｐ．ｐｕｔｉｄａおよびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、糖上で増殖する場合、中程度の鎖長の３−ヒドロキシ脂肪酸から構成されるＰＨＡを合成する。これらのＰＨＡにおいて優勢なモノマーは、３−ヒドロキシデカノエートである。類似の経路は、図６によって示されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｒ．ＥｕｔｒｏｐｈａおよびＰ．ｐｕｔｉｄａのような組換え微生物ならびにトランスジェニック脂肪種子作物のいずれかにおいてＰＨＢＨの合成について操作され得る。３−ヒドロキシブチリルＣｏＡおよび３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡの前駆体を受容するポリメラーゼに加えて、３−ヒドロキシアシルＡＣＰを３−ヒドロキアシルＣｏＡに変換するか、または３−ケトアシルＡＣＰを３−ケトアシルＣｏＡに変換する酵素活性もまた、必要である。この活性がＰ．ｐｕｔｉｄａに存在することから、対応する遺伝子がスクリーニング手順により同定および単離され得る。脂肪酸生合成の調節解除およびこの経路における活性の増加は、引き続いて、ＰＨＢＨ形成のための基質を提供する。
【００３７】
この経路における重要な酵素活性は、３−ヒドロキシアシルＡＣＰのＣｏＡ誘導体への変換である。チオエステラーゼおよびアシルＣｏＡシンターゼは周知であり、その組み合わせ作用が、この工程を達成し得る。あるいは、新規活性、アシルＡＣＰ：ＣｏＡトランスフェラーゼは、ＰＨＡ経路におけるこの工程を容易にし得、そして結果として、炭水化物のような酸化された炭素供給源からＰＨＡを産生する細菌において同定され得る。
【００３８】
（増殖特徴）
効率的なＰＨＡ産生のために、菌株が、接種の作業および産生の行為の期間の間、そのバイオポリマーを合成するための能力を失わないことが重要である。ｐｈｂ遺伝子のいずれかの損失が、産生物の損失を生じるが、他方、新規モノマーを提供する遺伝子のいずれかの損失が、異種の産生物の形成を生じる。これらは共に望ましくなく、従って菌株の安定な増殖が必要である。実施例に記載される菌株の遺伝子の組込みは、２５０，０００Ｌの工業用発酵容器における産生に十分な、少なくとも５０世代にわたり安定であるように決定される。
【００３９】
これらの組換えＰＨＡプロデューサーの増殖および形態は、染色体上のｐｈｂ遺伝子の存在によって損なわれない。この選択手順の間、個々の構成要素は、栄養要求性菌株の単離を迂回して、最小の培地プレート上で選択される。異なるｐｈｂ構成要素の増殖速度は、ＰＨＢ産生株を誘導する野生型Ｅ．ｃｏｌｉの増殖速度と類似した。Ｅ．ｃｏｌｉ染色体へのｐｈｂ遺伝子の追加は、これらの菌株の下流プロセッシングに影響しなかった。なぜなら、これらが依然として従来の方法によって容易に溶解したからである。
【００４０】
（ＩＩＩ．組成物のための適用）
ＰＨＡは、成形適用、特に、消費パッケージングアイテム（例えば、瓶、化粧用容器、オムツシート、ペン、ゴルフのティー、および個人用アイテム（例えば、米国特許第３，０７２，５３８号；同第３，１０７，１７２号；および同第４，９００，２９９号（これらは、成形されたタンポンアプリケーターを記載する）））のための成形適用において、ならびに純粋なＰＨＡもしくはブレンドのフィルムまたは他の材料（例えば、デンプンエステルもしくは合成ポリマー）とのＰＨＡのラミネートにおいて、使用され得る。多くの適用において、このポリマーは、まず繊維に形成され、次いで、この繊維を使用して、不織布のような材料が構築される。
【００４１】
このポリマーはまた、熱融解接着調合物および圧力感受性接着調合物において、ならびにトナーにおいて使用される石油化学ポリマーおよび顕色剤組成物（米国特許第５，００４，６６４号）に代わるために、ならびにイオン電導性ポリマー電解質（米国特許第５，２６６，４２２号）として、使用され得る。ポリヒドロキシアルカノエートポリマーの多くの特徴は、このポリヒドロキシアルカノエートポリマーを、金属粉末、セラミック粉末または金属／セラミック粉末の加工のための結合剤として、特に魅力的にする。
【００４２】
ＰＨＡの独特な特徴の１つは、それらが、２つの別個の物理的形態（アモルファス顆粒としてか、または結晶固体としてのいずれか）において存在し得ることである。従って、ＰＨＡは、ラテックスを形成するために使用され得る。ＰＣＴＷＯ９１／１３２０７は、コーティング紙のためのＰＨＡラテックス組成物を記載する。ＧＢ２２９２６４８Ａは、建築用コーティング調合物におけるＰＨＡラテックスの使用を記載する。ＰＣＴＷＯ９６／００２６３は、食物コーティング（特に、チーズコーティング）としてのＰＨＡラテックスの使用を記載する。ＰＣＴＷＯ９２／０９２１１および米国特許第５，２２９，１５８号は、生クリーム代用物としての使用のためのＰＨＡ顆粒組成物の使用を記載する。ＰＣＴＷＯ９２／０９２１０および米国特許第５，２２５，２２７号は、食物における風味送達剤としてのＰＨＡの使用を記載する。
【００４３】
ＰＨＡは、ますます利用可能になってきているので、ＰＨＡはまた、加工補助剤として作用する適用における、それらの適合性について試験されている。１つの例は、ＰＣＴＷＯ９６／１７３６９に記載されるようなＣＲＴチューブ成分の生成におけるＰＨＡラテックスの使用である。この適用におけるＰＨＡの有用性の重要な特徴は、そのコーティング系が有機溶媒を使用しないこと、およびそのコーティング系が、引き続くオーブン処理の間に、従来の系よりも低いエネルギーを使用して、容易に除去され得ることである。
【００４４】
ＰＨＡは、ヒドロキシ酸モノマー組成物に依存して、広範な種々の型において生成され得る（ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌおよびＶａｌｅｎｔｉｎ，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２８：２１９−２８（１９９５））。ポリメラーゼ酵素がプラスミドにコードされる生物中で合成されたＰＨＡは、ポリメラーゼ酵素が染色体にコードされる生物中で合成されたＰＨＡと比較して、より低い分子量を有する傾向がある（Ｈｕｉｓｍａｎら、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｐｏｌｙ（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ）ｂｙｍｕｔａｎｔａｎｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｒａｉｎｓ」Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３８：１−５（１９９２））。この広範なポリマー組成物は、等しく広範なポリマー物理特性（４０〜１８０℃の範囲の融点、−３５〜５℃の範囲のガラス転移温度、結晶化の速度を制御する能力と合わせられる０％〜８０％の範囲の結晶化度、および５〜５００％の範囲の破断伸び（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｔｏｂｒｅａｋ）を含む）を反映する。例えば、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）は、ポリプロピレンの特徴と類似の特徴を有し、一方、ポリ（３−ヒドロキシオクタノエート）（（Ｒ）−３−ヒドロキシオクタノエートと（Ｒ）−３−ヒドロキシヘキサノエートとのコポリマー）型は、むしろエラストマーと類似に挙動し、そしてより長い側鎖を有するＰＨＡは、むしろワックスと類似に挙動する。ＰＨＡはまた、可塑化され得、そして他のポリマーまたは薬剤とともにブレンドされ得る。
【００４５】
広範なポリマー組成物は、等しく広範なポリマー物理特性（有機溶媒中の溶解度（これは、選り抜きの広範な溶媒を提供する）を含む）を反映する。例えば、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートと他のヒドロキシ酸コモノマーとのコポリマーは、ＰＨＢホモポリマーの溶解度特徴と有意に異なる溶解度特徴を有する。例えば、アセトンは、ＰＨＢに対して良溶媒ではないが、６〜１２個の炭素原子を含有する（Ｒ）−３−ヒドロキシ酸との（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレートコポリマーを溶解するためには非常に有用である（Ａｂｅら、Ｉｎｔ．ＪＢｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１６：１１５−１９（１９９４）；Ｋａｔｏら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５：３６３−７０（１９９６））。同様に、Ｍｉｔｏｍｏら、ＲｅｐｏｒｔｓｏｎＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＰｏｌｙｍｅｒＰｈｙｓｉｃｓｉｎＪａｐａｎ，３７：１２８−２９（１９９４）は、アセトン中に１５〜７５ｍｏｌ％の４−ヒドロキシブチレート残基を含むコポリエステルであるポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−４−ヒドロキシブチレート）の溶解度を記載する。一定範囲のＰＨＡのために適切な多くのさらなる溶媒は、例えば、米国特許第５，２１３，９７６号；米国特許第４，９６８，６１１号；ＪＰ９５，１３５，９８５；ＪＰ９５，７９，７８８；ＰＣＴＷＯ９３／２３５５４；ＤＥ１９５３３４５９；ＰＣＴＷＯ９７／０８９３１；およびＢｒａｚｉｌＰｅｄｉｄｏＰＩＢＲ９３０２，３１２に記載されている。
【００４６】
本明細書中に記載される組成物ならびにその調製の方法およびその使用は、以下の限定しない実施例によってさらに記載される。
【００４７】
（実施例において使用される材料および方法）
ＤＮＡの操作を、Ｑｉａｇｅｎプラスミド調製キットまたはＱｉａｇｅｎ染色体ＤＮＡ調製キットを製造業者の推奨に従って用いて精製した、プラスミドおよび染色体ＤＮＡで実施した。ＤＮＡを、制限酵素（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を製造業者の推奨に従って使用して、消化した。ＤＮＡフラグメントを、Ｑｉａｇｅｎキットを使用して０．７％アガロース−Ｔｒｉｓ／酢酸／ＥＤＴＡゲルから単離した。オリゴヌクレオチドは、ＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓまたはＧｅｎｅｓｙｓから購入した。ＤＮＡ配列を、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＡＢＩ３７３Ａ配列決定装置を使用して、自動配列決定によって決定した。ＤＮＡを、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ）のＰＣＲ−ｍｉｘおよびＥｒｉｃｏｍｐＤＮＡ増幅装置を使用して、５０μｌの容量でのポリメラーゼ連鎖反応を用いて、増幅した。増殖培地および標準的なクローニング手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９９２、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ）によって記載される通りであった。
【００４８】
精製したポリマーまたは凍結乾燥した細胞塊上で実施するガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析によって、ＰＨＡを分析した。約２０ｍｇのサンプルを、内部標準として添加した２ｍｇ／ｍＬの安息香酸と共に、（容量で）９０％の１−ブタノールおよび１０％の濃塩酸を含む混合物２ｍＬ中で、1１０℃、３時間の抽出およびブタノール分解（ｂｕｔａｎｏｌｙｓｉｓ）に同時に供した。生じた混合物の水溶性の成分は、３ｍＬの水で抽出して除去した。有機相（全体の流速が２ｍＬ／分で分離比が１：５０の１μＬ）を、ＦＩＤ検出器を備えるＨＰ５８９０ＧＣ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−ＰａｃｋａｒｄＣｏ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）で、ＳＰＢ−１融合シリカキャピラリーＧＣカラム（３０ｍ、内径０．３２ｍｍ、０．２５μｍの膜、Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、Ｐａ．）を用いて、次のような温度プロファイルで分析した。８０℃で２分間、１分間あたり１０℃づつ２５０℃まで上昇、２５０℃で２分。内部標準として、安息香酸ブチルを使用した。
【００４９】
（実施例１：ＰＨＢＨの産生を改良するのに適したＮ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ由来の遺伝子の単離）
染色体にコードされたＮ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ由来のＰＨＡポリメラーゼを発現するトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ株を、構築した。Ｎ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ由来のＰＨＢポリメラーゼ遺伝子を単離し、そしてこの遺伝子の融合体を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ酵素の末端の１０個の残基を含む、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ由来のＰＨＡポリメラーゼ遺伝子の翻訳配列を用いて産生した。次いで、プロモーターのないクロラムフェニコールトランスフェラーゼ遺伝子を、ｐｈｂＣ−ｃａｔ融合体を作製するためにそのハイブリットｐｈｂＣ遺伝子の後に配置した。この融合体を、ｐＬＯＦシステムまたはｐＵＴシステム（Ｈｅｒｒｅｒｏら）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉの染色体にランダムに挿入し、この融合体を発現するクローンを、クロラムフェニコール含有増殖培地上で選択した。この融合体の発現を、より高いレベルのクロラムフェニコールに耐性で誘導体を選択することによって、結果的に増加させた。
【００５０】
ＰｈａＣを、以下の反応混合物：５０ｍｌの最終容量中の４５ｍｌのＰＣＲＳｕｐｅｒｍｉｘ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、２０ｐｍｏｌのプライマーＲＳＣＰ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）
（５’ＧＡＴＧＣＣＧＧＴＣＧＡＣＣＣＧＣＧＧＧＡＣＣＧＣＣＧＣＴＴＣＴＣＣ）およびＲＳＰＣ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）
（５’ＴＣＡＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＣＣＧＧＡＧＣ）
中で、９５℃で６０秒、５５℃で６０秒、および７２℃で２１０秒の３０サイクル、その後の生成物伸長工程（６８℃で７分）によって、Ｎ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ染色体ＤＮＡから増幅した。Ｎ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒレダクターゼ遺伝子を、以下の反応：５０ｍｌの最終容量中の４５ｍｌのＰＣＲＳｕｐｅｒｍｉｘ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、１ｍＭのプライマーＲＤ−ｕｐ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）
（５’ＣＧＩＧＴＩＧＣＩＣＴＩＧＴＩＡＣＩＧＧ）
およびＲＤ−ｄｗｎ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）
（５’ＣＣＣＡＴＧＴＡＣＡＧＩＣＣＩＣＣＧＴＴ）
中で、９５℃で６０秒、６０℃で６０秒、および７２℃で２１０秒の３０サイクル、その後の生成物伸長工程（６８℃で７分）によって増幅した。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、そしてｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）にクローン化した。引き続いて、ポリメラーゼおよびレダクターゼをコードする精製したフラグメントを、サザンブロット実験に使用し、３．６ｋｂｐｈａＣフラグメントならびにｐｈａＢを含む４．６ｋｂＢａｍＨＩフラグメントおよび４．２ｋｂＰｖｕｌｌフラグメントを同定した。対応するサイズの染色体フラグメントを、ゲル精製し、ｐＵＣ１９にクローン化し、そして所望の挿入物を含むクローンを、プローブとして精製したｐｈｂＣ遺伝子およびｐｈｂＢ遺伝子を使用する、コロニーブロットハイブリダイゼーションによって同定した。
【００５１】
ＰＨＢＨの効率的な合成は、生合成の経路に含まれる酵素をコードする遺伝子の適切な発現を必要とするので、Ｎ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ由来のｐｈａＣ遺伝子を、図６に示されるように、この遺伝子の５’末端に強力な翻訳シグナルを操作するために再構築した。ＰｈａＣを、プライマーＣ７−５’（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）
（５’ＡＡＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＣＡＴＣＣＧＡＴＣＧＧＣＴＧＧＧＧＴ）
およびＣ７−３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）
（５’ＡＣＧＣＴＧＴＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＣＡＡＧＡＴＧＡＡＴＧＣＴＡＡＣＧ）
を使用して、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で２分を伴う熱サイクルプログラム、その後の伸長工程（７２℃で７分）によって増幅した。この反応混合物は、４７ｍｌのＰＣＲＳｕｐｅｒｍｉｘ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、各々０．１ｎｍｏｌのプライマー、およびテンプレートとして約０．０５ｍｇのｐＣＲ２．１−ｐｈａＣ７を含んでいた。このＰＣＲ生成物を、フェノール抽出により精製し、そしてＮｓｉｌおよびＢｇｌＩＩを用いて消化した。次いで、この制限フラグメントを、ｐＭＳＸＣ５ｃａｔのＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローン化した。ｐＭＳＸＣ５ｃａｔは、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ（ｐｈａＣ５）由来のＰＨＡポリメラーゼ遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子の転写融合体を含む。得られたプラスミドは、翻訳融合体を含み、これは、ＰｈａＣ５由来の１０個のＮ末端アミノ酸の、Ｎ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒＰＨＡポリメラーゼとのハイブリッドポリメラーゼを生じる。引き続いて、得られたプラスミドｐＭＳＸＣ７ｃａｔをＡｃｃＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＦｓｐＩで消化し、その後、ｐｈａＣフラグメントを、ＦｓｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐＭＳＸｐ₁₁ＡＢ５ｋａｎおよびＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐＭＳＸｐ₁₃ＡＢ５ｋａｎ中のｐ₁₁およびｐ₁₃プロモーターの後にクローニングするために単離した。ｐ₁₁Ｃ７ｃａｔおよびｐ₁₃Ｃ７ｃａｔを含むフラグメントを、ＡｖｒＩＩフラグメントとして単離し、ｐＬＯＦＨｇのＳｆｉＩ部位に挿入し、そしてＥ．ｃｏｌｉＭＢＸ４２７の染色体に組み込み、ｐＭＬＸｐ１１Ｃ７ｃａｔおよびｐＭＬＸｐ１３Ｃ７ｃａｔを得た。
【００５２】
代替的３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡ受容ＰＨＡポリメラーゼ遺伝子は、このモノマーを取り込むことが示されている生物から得られ得、この生物としては、Ａ．ｃａｖｉａｅ、Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ、Ｔ．ｐｆｅｎｉｇｉｉ、ならびにおそらくＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓおよびＳ．ｎａｔａｎｓが挙げられる。これらの遺伝子は、上記と同じ手順に従って、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され得る。
【００５３】
（実施例２：ブチレートからの、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＨＢＨ合成）
Ｒ−３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡの内因性合成は、アセチルＣｏＡとのブチリルＣｏＡの縮合、それに続く還元工程の後に、進行し得る。この経路は、広範な基質範囲のレダクターゼおよび３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡを受容するポリメラーゼのみを必要とする。ブチレートは、Ｅ．ｃｏｌｉによって取りこまれ、そしてａｔｏＤＡ遺伝子産物によってブチリルＣｏＡに変換される。ブチリルＣｏＡの分解は、ブチレートによって誘導されないａｔｏＢおよびｆａｄレギュロンに依存する。
【００５４】
プラスミドｐＭＢＸｃ１２Ｊ１２を、Ａ．ｃａｖｉａｅＰＨＢポリメラーゼ遺伝子（Ｆｕｋｕｉ＆Ｄｏｉ、Ｊ．Ｂａｃｔｉｒｉｏｌ．１７９：４８２１−３０（１９９７））を含む２．４ＫｂのＡｐｏＩフラグメントをｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって構築した。プラスミドｐＳＵ１８−ＡＢＩは、ベクターｐＳＵ１８（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ｇｅｎｅ６６：１６５９−２０（１９８８））において、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター制御下のＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａｐｈｂＡＢ遺伝子を含む。ＰＨＢＨは、以下のように、プラスミドｐＭＢＸＣ１２Ｊ１２およびｐＳＵ１８−ＡＢＩを含む、Ｅ．ｃｏｌｉＭＢＸ１３２５（株ＤＣ６７９（ｍｅｌ、ｆａｄＲ、ａｔｏＣ（ｃｏｎ）ａｄｈＣ８１）（Ｃｌａｒｋ＆Ｒｏｄ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２５：１５１（１９８７）と同一である）において、グルコースおよびブチレートから産生された。この形質転換細胞（１Ｌ）を、２０ｍＭブチレートを含むＬＢ中で２４時間３０℃にて増殖させ、そして遠心分離によって収集した。ＰＨＡポリマーを、１６時間のクロロホルム抽出によって、凍結乾燥細胞から精製し、そして５〜１０倍過剰のメタノ−ル中でＰＨＡを沈殿させた。沈殿したポリマーを、ガスクロマトグラフィーによって分析し、そして１．０％ＨＨコモノマーを含むＰＨＢＨコポリマーとして同定した。
【００５５】
（実施例３：ブチレート発酵経路を使用する、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＨＢＨ合成）
ブチレート発酵経路を、図３に示す。３−ヒドロキシヘキサノエート合成に必要な酵素は、ｐｈｂＡ_X、ｈｂｄ、ｃｒｔ、ｂｄｈ、ｐｈｂＡ_y、ｐｈｂＢおよびｐｈｂＣによってコードされ、ここでｘおよびｙは、同一のチオラーゼか、または異なるチオラーゼを示す。これらの遺伝子の供給源は、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ（ｐｈｂＡ_xy ）、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（ｈｂｄ、ｃｒｔ、ｂｄｈ）およびＮ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ（ｐｈｂＢおよびｐｈｂＣ）である。
【００５６】
Ｃｒｔおよびｈｂｄを、テンプレートとしてｐＣ１０（Ｂｏｙｎｔｏｎら）を使用して、以下のプライマー：
【００５７】
【化１】

【００５８】
を使用するポリメラーゼ連鎖反応によって単離した。
ＰＣＲ産物を精製し、ＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ（ｃｒｔ）またはＫｐｎＩ／ＳｍａＩ（ｈｂｄ）を用いて消化し、そして引き続いてｐＵＣ１８−Ｓｆｉの対応部位にクローン化し、ｐＭＳＸｃｒｔ−ｈｂｄを得た。
【００５９】
Ｂｄｈを、テンプレートとしてｐＣ１０（Ｂｏｙｎｔｏｎら）を使用しそして以下のプライマー：
【００６０】
【化２】

【００６１】
を使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、単離した。
ＰＣＲ産物を精製し、ＰｓｔＩ／ＳｐｈＩを用いて消化し、そして引き続いてｐＭＳＸｃｒｔ−ｈｂｄの対応部位にクローン化し、ｐＭＳＸｃｒｔ−ｈｂｄ−ｂｃｄを得た。
【００６２】
ｐＣ１０に由来するもとのオペロンは、推定電子伝達鎖をコードするｅｔｆＡＢを含んでいた。ｃｒｔ−ｈｂｄ−ｂｃｄオペロンは、このオペロンの非存在下において活性でないかもしれないので、ｅｔｆＡ遺伝子およびｅｔｆＢ遺伝子を、以下のプライマー：
【００６３】
【化３】

【００６４】
を用いてｐＣ１０（Ｂｏｙｎｔｏｎら）から増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、そして引き続いてｐＵＣ１８−ＳｆｉＩの対応部位にクローン化し、ｐＭＳＸｅｔｆＡＢを得た。このｅｔｆＡＢ遺伝子は、ｐＭＳＸｃｒｔ−ｈｂｄ−ｂｃｄプラスミド内に、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ部位において容易にクローン化され得る。
【００６５】
（実施例４：脂肪酸酸化経路を使用した、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＨＢＨ合成）
脂肪酸酸化経路を、図４に示す。Ｒ−３ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡは、Ｓ−３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡのエピマー化、３−ケトヘキサノイル−ＣｏＡの還元、またはＤ特異的ヒドラターゼによるエノイル−ＣｏＡの水和によって脂肪酸酸化中間体から得られ得る。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＢＸ２４０は、１コピーのＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａｐｈｂＣ遺伝子を、染色体へ挿入することによって構築された、株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）の誘導株である。この株は、糖または脂肪酸からＰＨＡを生成しない。なぜなら、アセチル−ＣｏＡまたは脂肪酸酸化中間体を、Ｒ−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡモノマーに変換するための酵素が存在しないからである。エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子（ＦｕｋｕｉおよびＤｏｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−３０（１９９７））を、以下のプライマー：
【００６６】
【化４】

【００６７】
およびＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から得られたＰＣＲ反応混合物を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によって、Ａ．ｃａｖｉａｅ株ＦＡ−４４０（受託番号ＦＥＲＭＢＰ３４３２（米国特許第５，２９２，８６０号）のもとでＪａｐａｎｅｓｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た）から調製した染色体ＤＮＡから単離した。このＰＣＲプログラムは、（９５℃、４５秒；５５℃、４５秒；７２℃、１分）の３０サイクルであった。ＰＣＲの後に、このＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いて完了するまで消化し、ゲル精製し、そしてプラスミドｐＵＣ１８Ｓｆｉ（Ｈｅｒｒｅｒｏら）のＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ部位へ連結し、プラスミドｐＭＴＸＪ１２を得た。プラスミドｐＭＴＸＪ１２を含むＥ．ｃｏｌｉＭＢＸ２４０の形質転換体を、１０ｍＭオクタノエートおよび１ｍＭオレアートならびに１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地中で増殖させた。３７℃で４８時間の増殖後、５０ｍｌの細胞を、遠心分離によって収集し、そして凍結乾燥した。凍結乾燥した細胞を、８ｍｌのクロロホルムで１６時間抽出し、そしてＰＨＡを１０倍過剰のエタノール中で、４℃で沈殿させた。この沈殿したポリマーを、ガスクロマトグラフィによって分析し、そして２．６％ＨＨコモノマーを含むＰＨＢＨコポリマーとして同定した。
【００６８】
（実施例５：Ａ．ｃａｖｉａｅＰＨＢポリメラーゼ遺伝子ならびにＲ．ｅｕｔｒｏｐｈのチオラーゼ遺伝子およびレダクターゼ遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉにおける、ブタノールからのＰＨＢＨコポリマーの生成）
ＰＨＢＨを、以下の通りに、プラスミドｐＭＢＸＣ１２Ｊ１２およびｐＳＵ１８−ＡＢ１を含むＥ．ｃｏｌｉＭＢＸ１３２６（株ＤＣ６９８（ｍｅｌ、ｆａｄＲａｔｏＣ（ｃｏｎ）ａｄｈＣ８１、ａｄｈＲ３０ａｃｅＸ）、ＣｌａｒｋおよびＲｏｄ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２５：１５１（１９８７）と同一）において、グルコースおよびブチラートから生成した。この形質転換細胞を、１Ｌ当たり５ｇのブタノールを含む１ＬのＬＢ培地で増殖させた。細胞を、実施例１の通りに収集し、そして分析した。遺伝子操作された細胞は、１．２％ＨＨを含むＰＨＢＨコポリマーを生成した。
【００６９】
（実施例６：脂肪酸生合成経路を使用した、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＨＢＨ合成）
脂肪酸生合成経路を、図５に示す。Ｒ−３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡもまた、脂肪酸生合成由来の中間体から提供され得る。Ｐ．Ｐｕｔｉｄａにおいて、３−ヒドロキシアシルＣｏＡは、この細菌がグルコースまたは他の炭水化物上で増殖する場合に、この経路から提供される。この経路は、アシルＡＣＰをアシルＣｏＡに変換する活性、ＡＣＰ／ＣｏＡトランスアシラーゼによって触媒される反応、またはアシルＡＣＰチオエステラーゼおよびアシルＣｏＡシンターゼの組み合わせ作用によって触媒される反応を必要とする。ＰＨＢ生合成遺伝子を発現し、そして構成的脂肪酸生合成レギュロン（ｆａｄＲ⁺）を有するＥ．ｃｏｌｉ株（例えば、ＭＢＸ６８９）へのこの経路の導入は、Ｒ−３−ヒドロキシヘキサノイルＣｏＡの合成を生じる。
【００７０】
ＡＣＰからＣｏＡへのトランスアシル化を容易にする酵素をコードする遺伝子を、以下のスクリーニングにおいて単離する。このスクリーニングは、図１０に示されるようなＶ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ由来のｌｕｘ系を使用する。ｌｕｘ遺伝子の誘導は、自己誘導物質である３−ケトヘキサノイルホモセリンラクトンの合成に依存する。この分子の前駆物質は、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび３−ケトヘキサノイルＡＣＰである。Ｅ．ｃｏｌｉＣＧＳＣ５６３８は、マロニルトランスアシラーゼをコードするｆａｂＤ遺伝子において変異を有し（Ｂｏｕｑｕｉｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４６：６２８（１９９５））、そしてアセトアセチルＡＣＰを合成できない。ヘキサノエートを、長側鎖脂肪酸の合成のためにこれらの細胞に提供する。さらに、ｆａｄＲ変異を導入して、ヘキサノエートを３−ケトヘキサノイルＣｏＡへ分解する。細胞が、ｌｕｘ系の発現を誘導するために、３−ケトヘキサノイルＣｏＡを、３−ケトヘキサノイルＡＣＰに変換しなければならない。次いで、種々の生物の遺伝子ライブラリーを、この宿主においてスクリーニングし得、ｌｕｘ発現を誘導する能力について陽性のクローンを選択し得る。このｌｕｘ発現は、誘導物質である３−ケトヘキサノイルホモセリンラクトンの形成に起因する、光の放射として同定する。遺伝子ライブラリーを、ゲノムＤＮＡを単離し、そしてプラスミドベクターにＤＮＡフラグメントの代表的な収集物をクローニングすることによって、選り抜きの生物から容易に構築する。代表的なライブラリーは、５，０００〜１００，０００の個々のコロニーを有するべきである。ライブラリーは、ｐＬＡＦＲ３のようなベクター中にある広範な宿主範囲のライブラリーか、またはｐＵＣ１９もしくはｐＢＲ３２２のようなベクター中にあるＥ．ｃｏｌｉライブラリーのいずれかとして作製する。ライブラリーの型および選り抜きの宿主にそのライブラリーを導入する方法に依存して、そのゲノムＤＮＡフラグメントは、大きい（１７〜３０ｋｂ）か、または比較的小さい（２〜６ｋｂ）かのいずれかである。ライブラリーを、使用する宿主およびベクターに依存して、エレクトロポレーション、形質転換または接合によってスクリーニング株に導入する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＰＨＢの生合成のための経路の模式図である。
【図２】図２は、ＰＨＡの生合成のための一般的な経路の模式図である。
【図３】図３は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｂｕｔｙｌｉｃｕｍのブチレート醗酵経路を用いたＰＨＢＨの生合成のための好ましい経路の模式図である。
【図４】図４は、脂肪酸酸化経路を用いたＰＨＢＨの生合成のための好ましい経路の模式図である。
【図５】図５は、脂肪酸経路を用いたＰＨＢＨの生合成のための好ましい経路の模式図である。
【図６】図６は、Ｎ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒからのＰＨＡポリメラーゼのＥ．ｃｏｌｉの染色体上への組込みのための、ｐＭＬＸｐＩＩＣ７ｃａｔおよびｐＭＬＸｐ１３Ｃ７ｃａｔの構築の模式図である。
【図７】図７は、Ｅ．ｃｏｌｉｆａｄＢ変異の補完による、クロトナーゼおよびヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子についての選択の模式図である。
【図８】図８は、表現型的にはｆａｄＥ欠損である、Ｅ．ｃｏｌｉ株の補完による、ブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子についての選択の模式図である。
【図９】図９は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａからのＰＨＡポリメラーゼ遺伝子ｐｈａＣを用いてＥ．ｃｏｌｉにおけるＰＨＢＨ組換え経路についての選択の模式図である。
【図１０】図１０は、Ｖｉｂｒｉｏｆｉｓｃｈｅｒｉｌｕｘ系の使用による、アシルＡＣＰからアシルＣｏＡへと変換する酵素をコードする遺伝子についての好ましいスクリーニング手順の模式図である。
【配列表】

Claims

３−ヒドロキシヘキサノエートを含むポリヒドロキシアルカノエートの生物学的生成のための方法であって、ブチリル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡを３−ケトヘキサノイル−ＣｏＡに変換する酵素をコードする３−ケトチオラーゼ遺伝子、３−ケトヘキサノイル−ＣｏＡを３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡに変換するアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼをコードするレダクターゼ遺伝子、および３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡおよび３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡを重合させるポリヒドロキシアルカノエートポリメラーゼをコードする遺伝子を発現する遺伝子操作された細菌、ならびに基質としてブタノールおよび／またはブチレートを供給する工程を包含し、前記３つの酵素がポリヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノエートを生成するために十分な量発現され、前記細菌がブタノールまたはブチレートを利用し得る、前記方法。
前記ポリヒドロキシアルカノエートポリメラーゼ遺伝子が前記細菌の染色体内に組み込まれる、請求項１に記載の方法。
３−ヒドロキシヘキサノエートのコポリマーを生成するための請求項１に記載の方法であって、Ａｅｒｏｍｏｎａｓｃａｖｉａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ、Ｔｈｉｏｃａｐｓｉａｐｆｅｎｉｇｉｉ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｖｉｎｏｓｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａｃａｒｏｌｉｎａ、Ｎｏｃａｒｄｉａｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｅｒ、ＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓおよびＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｕｍｒｕｂｒｕｍからなる群より選択される細菌に由来するポリヒドロキシアルカノエートポリメラーゼ遺伝子を供給する工程を含む、前記方法。
前記細菌が、Ｅ．Ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
前記細菌がＤ−特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子を発現する、請求項１に記載の方法。
前記細菌が３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼおよびブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼを発現する、請求項１に記載の方法。