JPH07135985A - ポリ−３−ヒドロキシ酪酸の抽出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 アセトニトリルまたはプロピオニトリルを抽
出溶剤として菌体からポリ−３−ヒドロキシ酪酸を抽出
する。 【効果】 安全で、入手しやすく、しかも安価な抽出溶
剤を用い、乾燥菌体あるいは湿菌体の如何を問わず、こ
れら菌体からポリ−３−ヒドロキシ酪酸を高収率で抽出
できる。しかも抽出後の溶液を室温に冷却するだけでポ
リ−３−ヒドロキシ酪酸をゲル化あるいは析出させるこ
とが出来、容易に回収することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、菌体内に蓄積した３−
ヒドロキシ酪酸単位からなるポリ−３−ヒドロキシ酪酸
（以下ＰＨＢと記す）を菌体から抽出する方法に関す
る。更に詳しくは、アセトニトリルまたはプロピオニト
リルを抽出溶剤として用い、菌体からＰＨＢを溶剤抽出
する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ポリ−３−ヒドロキシ酪酸は、数多くの
微生物のエネルギー貯蔵物質として菌体内部に蓄積さ
れ、生物分解性と生物適合性をもつ熱可塑性高分子であ
る。近年、合成プラスチックが環境汚染や資源循環の観
点から深刻な社会問題となっている。それ故、ＰＨＢ
は、”クリーン”プラスチックとして注目され、使用期
間が比較的短い商品の包装や手術糸、骨折固定用材など
の医療材料および医薬や農薬を徐々に放出する徐放性シ
ステムなど多方面への応用可能な有用な天然高分子であ
り長年にわたり期待されている。

【０００３】ＰＨＢの製造は、細菌例えばシュードモナ
ス（Pseudomonas ）属、アルカリゲネス（Alcaligenes
）属、プロトモナス（Protomonas）属、アゾトバクタ
ー（ Azotobacter）属、ノカルジア（Nocardia）属等の
細菌を培養し菌体内にＰＨＢを顆粒状に蓄積せしめた
後、菌体を培養液より集菌し、その菌体から分離精製し
て行われる。

【０００４】菌体からのＰＨＢの分離精製は、菌体と抽
出溶剤とを接触させ菌体よりＰＨＢを抽出する方法と、
菌体のＰＨＢ以外の成分を酵素などで取り除く方法が知
られている。溶剤抽出に従来用いられている溶剤として
クロロホルム（特開昭57-65193号）、塩化メチレン（特
開昭57-65193号）、ピリジン（米国特許第3036959 ）な
どが知られている。しかし、これらの溶剤では、乾燥菌
体からによってのみＰＨＢを抽出でき、湿菌体からは抽
出できないため培養液から得られた菌体を乾燥する工程
が必要となってくる。また、抽出後得られた抽出液に、
メタノール等のＰＨＢを溶解しない溶剤を添加しＰＨＢ
を析出させなければならない。その際、このＰＨＢ非溶
解性溶剤を多量に必要とし、非常に大きな製造設備が必
要となり経済的な方法とはいい難い。特開平2-69187 に
は溶剤による湿菌体からのＰＨＢの抽出方法が記載され
ているが、ここで用いられる溶剤はいずれも特殊なもの
であり経済性等の点で工業的に不十分である。

【０００５】一方、溶剤抽出法による精製では菌株によ
る差異が見られないのに比べ、ＰＨＢ以外の成分を酵素
などで可溶化して取り除く精製法では湿菌体を使用する
ことができるが、酵素、界面活性剤等の効果が菌株によ
り著しく異なり、高純度のＰＨＢを得るためには数多く
の工程が必要になる場合がある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
技術における上記したような課題を解決し、安価で入手
しやすい溶剤を用いて湿菌体のままでＰＨＢを抽出で
き、しかもその抽出溶液からＰＨＢを容易に得ることが
できる抽出方法を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は、
安価で入手しやすい溶剤を用いて湿菌体のままでＰＨＢ
を抽出でき、しかもその抽出溶液からＰＨＢを容易に得
ることができる抽出方法について鋭意検討を重ねた結
果、意外にも室温ではＰＨＢをほとんど溶解しないアセ
トニトリル及びプロピオニトリルが、１００℃以上、好
ましくは１２０℃以上ではＰＨＢの良溶剤となってＰＨ
Ｂを高濃度に溶解することを見出した。また、これらの
溶剤が乾燥菌体だけでなく、湿菌体からも高収率で抽出
可能であることも見出した。更に、溶解したＰＨＢは溶
解液を室温で冷却することでほとんど全て析出またはゲ
ル化し、多量のＰＨＢ非溶解性溶剤を用いずとも高純度
のＰＨＢが得られることを見出した。これらの溶剤は、
６０℃以上で乾燥菌体、湿菌体のいずれからでも抽出可
能であるが、好ましい抽出率を得るためには１００℃以
上、好ましくは１２０℃以上の温度で抽出するのがよ
い。本発明のアセトニトリルおよびプロピオニトリルが
属する脂肪族ニトリル系溶剤にはアセトニトリルおよび
プロピオニトリルのほかにブチロニトリル、イソブチロ
ニトリル、アクリロニトリル等があるが、これらの溶剤
を用いた場合には高い含水率をもつ湿菌体からでは抽出
が難しく、また高価であるため実用的ではない。また、
本発明の溶剤であるアセトニトリルおよびプロピオニト
リルは、それぞれ単独または混合溶媒としても用いるこ
とが出来る。

【０００８】すなわち、本発明は菌株を問わず、ＰＨＢ
を含有する菌体よりＰＨＢを抽出精製する方法におい
て、アセトニトリルまたはプロピオニトリルを抽出溶剤
として用いることを特徴とするＰＨＢの抽出法に関する
ものである。また、本発明におけるＰＨＢを含有する菌
体とは、ＰＨＢを菌体内に蓄積した細菌細胞であり、こ
のような細菌として例えば、アゾトバクター ビネラン
ディー（Azotobacter vinelandii）、アルカリゲネス
ユウトロフス（Alcaligenes eutrophus ）、プロトモナ
ス エクストルクエンス（Protomonas extorquens ）等
に属するものが挙げられる。該菌体は例えば上記の細菌
をグルコース、フラクトース、メタノール、酢酸、酪酸
などの炭素源、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、
ペプトンなどの窒素源、リン酸カリウム、リン酸ナトリ
ウム等のリン酸源およびその他細菌の増殖に必要なミネ
ラル、微量栄養源を含む培地で、炭素源以外の菌体増殖
に必須の栄養素、例えば窒素源などが増殖の制限因子と
なるようにして好気的に培養し、その培養液から遠心分
離等の方法で集菌して得られる湿菌体である。もちろ
ん、この湿菌体を更に乾燥したもの、またはメタノー
ル、アセトン等の脂質溶剤で洗浄乾燥したものも菌体と
して用いることができる。

【０００９】本発明の方法により実際に菌体から抽出溶
剤を用いてＰＨＢを抽出する際、その抽出溶剤が、菌体
を除く全液体に対して８０重量％以上含有されていれば
良い。すなわち、２０重量％未満の範囲であれば、湿菌
体により持ち込まれる水のようなＰＨＢ非溶解性溶剤が
含まれていても良い。ＰＨＢ非溶解性溶剤の割合が２０
重量％を超える場合、ＰＨＢの溶解性が低くなったり、
ＰＨＢ溶液の粘度が高くなったり、ＰＨＢの劣化をもた
らしたりするおそれがあるので好ましくない。抽出溶剤
は、最終的にＰＨＢ濃度が１〜１０％になるように加え
るのが適当である。その抽出温度は、１００℃以上、好
ましくは１２０℃以上である。

【００１０】純粋なＰＨＢを得るために、ＰＨＢを含有
する菌体を、好ましくは発酵槽溶液の遠心分離によって
発酵槽溶液から単離する。単離された菌体を本発明によ
る抽出剤の中で攪はんし、たとえば１００〜１３０℃の
温度に加熱し、２０〜８０分この温度で抽出する。この
際、ＰＨＢ濃度は１〜１０％に、水分濃度は２０％を超
えないようにする。次いでＰＨＢを溶解含有した抽出溶
剤を不溶性菌体と分離する。この際、ＰＨＢを溶解含有
した抽出溶剤は加圧状態であり、分離を行うときは加圧
状態で行っても良いが、７５℃まで冷却した後分離して
も良い。これは、７５℃に保温してあれば数時間、少な
くとも２時間は溶解したＰＨＢが析出してこないからで
ある。分離は常法で行うことができる。この場合加熱さ
れた濾過器を使用するのが有利である。というのは分離
がこの方法で問題なく簡単に行われるからである。その
後ＰＨＢを含有する分離された溶液を室温程度に冷却
し、溶解したＰＨＢを完全にゲル化または析出させる。
ＰＨＢの単離は、冷却したＰＨＢ溶解溶液から液体を濾
過、遠心分離など通常の方法で行われる。単離されたＰ
ＨＢを水、メタノール、エタノール、アセトン、または
その混合物で後洗浄し、次いで乾燥する。ＰＨＢの乾燥
は、常法、たとえば気流乾燥、真空乾燥などで行われ
る。

【００１１】

【実施例】次に本発明を実施例によりさらに具体的に説
明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるもの
ではない。 実施例１ プロトモナス エクストルクエンス（Protomonas extor
quens ）Ｋ（微工研菌寄第８３９５号）をメタノールを
唯一の炭素源とする完全合成培地を用いて、窒素供給を
菌体増殖の制限因子になるようにして回分培養を行い、
その発酵槽溶液の遠心分離によって得られた湿菌体を凍
結乾燥し、菌体乾燥重量に対するＰＨＢ含有率が４４
％、菌体中ＰＨＢの分子量が１．４×１０5 である乾燥
菌体を得た。この乾燥菌体３．０ｇを耐圧管に取り、４
０ｍｌのアセトニトリルを加えて懸濁した後、１２０℃
で１時間抽出を行った。その後、７５℃に冷却した後７
５℃に加温した吸引濾過器で菌体残渣を分離した後、溶
液を室温まで冷却した。この冷却によってＰＨＢは完全
にゲル化して沈澱した。沈澱したゲルを吸引濾取した
後、メタノールを加えて十分に攪拌して洗浄した。次い
で、ゲルを吸引濾過、乾燥し１．１９ｇ（理論値の９０
％に相当する）のＰＨＢ粉末を得た。得られた粉末の純
度は約１００％であり、分子量は１．１×１０⁵ であっ
た。

【００１２】実施例２ 実施例１で得られた乾燥菌体３．０ｇを耐圧管に取り、
４０ｍｌのプロピオニトリルを加えて懸濁した後、１２
０℃で１時間抽出を行った。その後、８０℃に冷却した
後８０℃に加温した吸引濾過器で菌体残渣を分離した
後、溶液を室温まで冷却した。この冷却によってＰＨＢ
は完全にゲル化して沈澱した。沈澱したゲルを吸引濾取
した後、メタノールを加えて十分に攪拌して洗浄した。
次いで、ゲルを吸引濾過、乾燥し１．１４ｇ（理論値の
８６％に相当する）のＰＨＢ粉末を得た。得られた粉末
の純度は約１００％であり、分子量は１．１×１０⁵ で
あった。

【００１３】実施例３ プロトモナス エクストルクエンス Ｋ（微工研菌寄第
８３９５号）を実施例１と同様にメタノールを炭素源と
し、窒素供給を菌体増殖の制限因子になるようにして回
分培養を行い、その発酵槽溶液の遠心分離によって湿菌
体を得た。この湿菌体は、水分含有率６１．０重量％、
菌体乾燥重量に対するＰＨＢ含有率４７．６％であり、
菌体中ＰＨＢの分子量は３．６×１０5 であった。この
湿菌体８．２０ｇを耐圧管に取り、アセトニトリル３５
ｍｌを加えて懸濁した後、１２０℃で１時間抽出を行っ
た。その後、７５℃に冷却した後７５℃に加温した吸引
濾過器で菌体残渣を分離した後、溶液を室温まで冷却し
た。冷却によってＰＨＢは完全にゲル化して沈澱した。
沈澱したゲルを吸引濾取した後、メタノールを加えて十
分に攪拌して洗浄した。次いで、ゲルを吸引濾過、乾燥
し１．２７ｇ（理論値の８３％に相当する）のＰＨＢ粉
末を得た。得られた粉末の純度は９９％であり、分子量
は２．８×１０⁵ であった。

【００１４】実施例４ アルカリゲネス ユウトロフス (Alcaligenes eutroph
us) NCIB 11509をグルコースを炭素源とし、窒素供給を
菌体増殖の制限因子になるようにして好気的に回分培養
を行い、その発酵槽溶液の遠心分離によって湿菌体を得
た。この湿菌体は、水分含有率６０．３重量％、菌体乾
燥重量に対するＰＨＢ含有率３１．１％であり、菌体中
ＰＨＢの分子量は５．５×１０⁵ であった。この湿菌体
９．４６ｇを耐圧管に取り、アセトニトリル４０ｍｌを
加えて懸濁した後、１２０℃で１時間抽出を行った。そ
の後、７５℃に冷却した後７５℃に加温した吸引濾過器
で菌体残渣を分離した後、溶液を室温まで冷却した。こ
の冷却によってＰＨＢは完全にゲル化して沈澱した。沈
澱したゲルを吸引濾取した後、メタノールを加え十分に
攪拌して洗浄した。次いで、ゲルを吸引濾過、乾燥し
０．９２８ｇ（理論値の７９．５％に相当する）のＰＨ
Ｂ粉末を得た。得られた粉末の純度は９９％であり、分
子量は３．１×１０5 であった。

【００１５】実施例におけるＰＨＢの分子量の測定は、
ゲルクロマトグラフィー（ShodexGPC K, 90 cmカラム、
溶媒：クロロホルム ,1.0ml/min 、ポリスチレンスタン
ダード、ＲＩ検出）によって行った。また菌体のＰＨＢ
含有率、得られたＰＨＢの純度の測定は、ＰＨＢをメチ
ルエステル化してガスクロマトグラフィーにより行っ
た。水分含有率は、乾燥減量により測定した。

【００１６】

【発明の効果】本発明により、安全で、入手が容易で、
しかも安価な溶剤を用いて乾燥菌体、湿菌体のいずれか
らも少なくとも９９％の極めて高純度のＰＨＢを良好な
収率で取得可能となる。また、抽出後、ＰＨＢ溶解溶液
を冷却するのみで溶解したＰＨＢのほとんど全てがゲル
化または析出し、容易に回収できる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポリ−３−ヒドロキシ酪酸を含有する菌
   体からポリ−３−ヒドロキシ酪酸を抽出するに際して、
   アセトニトリルまたはプロピオニトリルを抽出溶剤とし
   て使用することを特徴とするポリ−３−ヒドロキシ酪酸
   の抽出法。
2. 【請求項２】 抽出温度を１００℃以上とする請求項１
   記載の抽出法。