KR950002866B1 - 균체로부터 폴리-베타-하이드록시부틸산 또는 폴리-베타-하이드록시부틸산과 폴리-베타-발레릭산과의 공중합체를 분리 회수하는 방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

균체로부터 폴리-베타-하이드록시부틸산 또는 폴리-베타-하이드록시부틸산과 폴리-베타-발레릭산과의 공중합체를 분리 회수하는 방법

본 발명은 폴리-베타-하이드록시부틸산(이하, "PHB"로 칭한다) 및 폴리-베타-하이드록시부틸산과 폴리-베타-하이드록시발레릭산(이하, "PHV"로 칭한다)과의 공중합체(이하, "PHB-co-PHV"로 칭한다)를 생산하는 균체로부터 PHB 및 PHB-co-PHV를 고순도로 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다.

PHB 및 PHB-co-PHV는 자연계에 존재하는 여러가지 미생물중의 일부가 영양소의 결핍 또는 용존산소의 부족 등과 같은 좋지 못한 환경에 처하였을 때 세포내에 축적하는 에너지 저장 물질로서 아래와 같은 구조를 가지며, 생분해성과 생체 적합성, 무독성, 자외선 차단효과, 압전성, 광학 활성등을 지니는 열가소성 바이오 플라스틱의 일종이다(Dawes and Senior,1973).

상기 식에서 n=600 내지 35,000의 정수이다.

상기 구조식에서, R이 메틸기(-CH₃)인 경우에는 PHB가 되고, 에틸기(-CH₂CH₃)인 경우에는 PHV가 되며, 메틸기와 에틸기가 랜덤하게 분포되어 있는 랜덤공중합체는 PHB-co-PHV라고 한다.

대부분의 미생물은 3-히드록시부티레이트(이하, "3-HB"로 한다)를 단위체로 하는 PHB를 총 중합체중 90%이상 생산하지만, 탄소원과 배양 방법을 변화시키므로써 3-히드록시발레레이트(이하, "3-HV"로 한다)의 함량이 조절된 PHB-co-PHV공중합체를 생산할 수 있다(Doi et al., 1987).

PHB와 PHB-co-PHV공중합체는 미생물에 의해 포도당, 과당, 메탄올, 수소, 초산, 탄화수소 등을 기질로 이용하여 생산될 수 있으며, 그 물성은 폴리에스터와 폴리프로필렌의 중간적 물성을 갖고 있어 생분해성이 우수한 플라스틱을 만들 수 있으므로 최근 심각해지고 있는 난분해성 플라스틱에 의한 환경오염의 방지를 도모할 수 있을 뿐만 아니라 다양한 다른 분야, 즉 의약이나 메디칼 분야에도 크게 기여할 수 있을것으로 기대된다(Fukada,1987).

PHB 및 PHB-co-PHV공중합체의 제조방법은 예를 들면 국내특허공개 제91-6492호, 일본특허공고 소63-32438호, 유럽특허 제0,046,344호, 미국특허 제4,477,654호 및 미국특허 제4,786,598호에 기술되어 있다.

그러나, 세포내에 축적된 PHB 및 PHB-co-PHV를 경제적으로 추출하여 고순도로 정제하는 공지 기술의 방법에는 여러가지 제약과 문제점이 있어 왔다.

즉, 먼저 세포내에 축적된 PHB등을 효과적으로 추출하기 위해서는 세균 세포를 기계적 방법으로 파쇄하거나 혹은 유기 용매를 사용하여 세포벽을 제거한 후 다시 클로로포름 등의 용매를 사용하여 PHB를 용해시킨 후 농축, 침전, 여과 및 건조를 포함하는 일련의 복잡하고 어려운 공정을 거쳐야만 하는 문제점을 갖는다.

둘째로는, 이러한 기존의 추출 공정 및 침전 등을 위해 사용되는 용매는 독성과 휘발성이 강하여 위험하며 더우기 PHB 및 PHB-co-PHV를 대량 생산하는 데에는 적합하지 못한 비경제적인 추출 및 정제공정을 포함하는 결점을 갖는다.

이러한 선행기술의 단점을 보완하기 위하여, 유럽특허 제1,145,233호에서는 단백질 분해효소와 계면활성제를 사용하여 세포중의 단백질과 지질을 제거하므로써 유독성의 값비싼 용매를 사용하지 않고 PHB를 정제하는 방법을 제안하고 있다. 그러나 이 방법에 의하면, 최종적으로 생산된 PHB의 순도는 90%정도에 불과하여 식품용, 의약ㆍ 의료용 또는 위생용품등에 사용하기에는 순도가 훨씬 못미치고 있다.

본 발명자들은 이러한 상황하에서, 세포내에 축적된 PHB 또는 PHB-co-PHV공중합체를 고순도로 분리ㆍ회수할 수 있는 방법을 예의 연구한 결과, 균체배양액을 열수(hot water), 아세톤, 알칼리 수용액, 효소 제제 및 비극성 용매로 차례로 처리하면 PHB 또는 PHB-co-PHV공중합체를 순도 95% 이상의 고순도로 정제할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 PHB 또는 PHB-co-PHV를 고순도로 분리·회수하는 방법에 따르면, 제1단계에서는 PHB 또는 PHB-co-PHV를 생산할 수 있는 균주를 배양하여 균체중에 PHB 또는 PHB-co-PHV를 건조중량의 40%이상의 양으로 축적시키고, 균체 배양액을 원심분리하여 균체를 회수한다.

이때 PHB 또는 PHB-co-PHV를 생산할 수 있는 균주로는 공지의 것을 사용할 수 있는데, 예를들면 알칼리게네스 유트로푸스(Alkaligenes eutropus)의 돌연변이주 NCIB-11599 또는 H-16(ATCC-17699, KCTC-1006), 또는 이들의 PHB-생산 돌연변이주를 이용할 수 있다

제2단계에서는, 상기 제1단계에서 회수한 균체를 온도 40∼120℃의 열수에 넣고 강하게 교반하면서 30분씩 2회 세척한다. 이 제2단계에서의 PHB 또는 PHB-co-PHV의 순도는 45∼83%이다.

제3단계에서는, 상기 제2단계에서 세척한 균체를 아세톤내에서 교반하면서 30분씩 2회 세척하고, 진공중에서 건조하고, 파쇄한 후 분말화한다. 제3단계에서 얻어지는 PHB 또는 PHB-co-PHV의 순도는 62∼90%이다.

제 4 단계에서는, 파쇄된 전조 균체를 알칼리 수용액내에서 0.5∼2시간동안 교반 세척한후 열수로 2회 세척한다. 이렇게 해서 얻어진 PHB 또는 PHB-co-PHV의 순도는 79∼93%이다.

이 단계에서 사용되는 알칼리로는 KOH 또는 NaOH등을 예시할 수 있다. KOH 또는 NaOH수용액의 농도는 0.2∼2.0몰이다.

이어서, 제5단계에서는 단백질 분해효소를 포함하는 효소제제를 건조 균체 중량의 1∼20%의 양으로 첨가한 후, 20∼40℃ 온도의 중온수중에서 1∼6시간 교반하고, 다시 열수로 2회 세척한다. 제5단계에서의 PHB 또는 PHB-co-PHV의 순도는 88∼96%이다.

마지막으로 제5단계 처리에서 얻어진 균체를 아세톤 등의 비극성 용매로 1∼2회 세척하고 건조하면 순도 93∼98%의 PHB 또는 PHB-co-PHV가 얻어진다.

다음에 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명이 여기에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1

(1) PHB 또는 PHB-co-PHV를 생산하는 균주를 배양하여 균체중에 PHB 또는 PHB-co-PHV를 축적시키기 위하여, 먼저 아래의 조성을 갖는 기본 배지와 미량 원소를 탈이온수에 녹여 세포 증식용 배지2L를 만들어 5L발효조에 채우고 pH를 6.8로 조정하였다.

＜기본 배지 조성＞

과당시럽 10g/L

황산암모늄((NH₄)₂SO₄) 1.0g/L

제일인산칼륨(KH₂PO₄) 1.5g/L

제이인산소다(Na₂HPO₄) 4.6g/L

황산마그네슘(MgSO₄ㆍ12H₂O) 0.2g/L

염화칼슘(CeCl₂·2H₂O) 0.02g/L

황산제일철(FeSO₄ㆍ7H₂O) 0.01g/L

옥수수전분당화액 (Corn Steep Liguor) 4g/L

미량원소용액 4ml/L

＜미량 원소 조성＞

황산아연(ZnSO₄ㆍ7H₂O) 200mg/L

염화망간(MnC₁₂ㆍ4H₂O) 60mg/L

붕산(H₃BO₃) 600mg/L

염화코발트(CoC₁₂ㆍ6H₂O) 400mg/L

염화니켈(NlCI₂ㆍ6H₂O) 40mg/L

황산구리(CuSO₄ㆍ4H₂O) 20mg/L

몰리브덴산소다(NaMoO₄ㆍ2H₂O) 60mg/L

121℃에서 고압증기 멸균 후 세포증식용 배지에서 12-16시간 배양한 알칼리게네스 유트로푸스 H-16주의 종균 배양액 100ml를 상기 5L발효조에 무균적으로 접종한 후, 배양온도 30-34℃, pH 6.7-7.2, 용존산소 농도가 포화 용존산소값의 40-60%가 되도록 조절하면서 세포중식 속도에 맞춰 증식용 배지의 공급속도를 점차적으로, 즉 대수적으로 증가시키면서 배양을 수행하였다. 세포 증식용 배지중의 탄소원과 질소원의 비율(C/N비율)은 10-30으로 조절하였다.

PHB 및 PHB/PHV공중합체를 축척하지 않은 세포의 농도가 30g/L-40g/L정도로 될때까지 20-30시간 배양하였다.

(2) 세포의 농도가 30g-40g/L이 되면, PHB/PHV공중합체를 축적시키기 위하여, 배지중의 탄소원과 질소원의 비율(C/N비율)을 40-80으로 조절하고, 용존 산소 농도를 포화 용존 산소값의 20%이하로 유지하면서 배양을 수행하였다.

(3) 세포내 PHB 및 PHB-co-PHV의 축적율이 70%이상에 달하였을때, 배양을 종료하고 배양액을 8,000rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수확하였다.

수확된 세포를 80℃의 열수에 넣고 강하게 30분간 교반하면서 세척하는 것을 2회 반복하였다.

열수로 세척된 균체를 이번에는 아세톤에 넣고 30분간 교반하며 2회 세척하고, 진공건조시키고, 파쇄 후 분말화하였다.

파쇄한 균체를 0.5몰의 KOH수용액(40℃)내에서 약 1시간동안 교반하여 세척한 후 80℃의 열수로 2회 세척하였다. 단백질 분해효소를 포함하는 효소세제를 건조 균체 중량의 5%로 첨가한 후 온도 40℃의 물내에서 4시간 교반한 후 다시 70℃의 열수로 2회 세척하고, 이어서 아세톤을 이용하여 2회 세척하고 건조하여 정제된 PHB 및 PHB-co-PHV를 얻었다.

가스 크로마토그래피법으로 측정한 PHB 및 PHB-co-PHV의 순도는 97%이었다.

실시예 2

실시예 1의 (l) 및 (2)와 동일한 방법으로 알칼리게네스 유트로푸스 H-16구를 배양하여 PHB 및 PHB-co-PHV를 건조균체 중량의 65%이상 축적시킨 후, 배양액을 10,000rpm에서 4,5분간 원심분리하여 세포를 수확하였다.

수확된 세포를 110℃의 열수에 넣고 강하게 30분간 교반하면서 2회 세척하고, 이어서 아세톤내에서 30분간 교반하면서 2회 세척한 후, 진공 건조시키고, 파쇄하여 분말화하였다.

파쇄된 균체를 1.5몰의 NaOH수용액(50℃)내에서 약 1.5시간동안 교반하여 세척한 후 110℃의 열수로 2회 세척하였다. 단백질 분해 효소를 포함하는 효소 제제를 건조 균체 중량의 15%로 첨가한 후 온도 37℃의 물내에서 3.5시간 교반한후 다시 110℃의 열수로 2회 세척하고, 이어서 아세톤을 이용하여 2회 세척하고 건조하여 정제된 PHB 밋 PHB-co-PHV를 얻었다.

가스 크로마토그래피법으로 측정한 PHB 및 PHB-co-PHV의 순도는 97%이었다.

Claims (3)

1. PHB 혹은 PHB-co-PHV 생산 균주로부터 PHB 혹은 PHB-co-PHV를 분리 회수하는 방법에있어서, 상기 균구를 배양시킨 배양물을 원심분리하여 균체를 회수하고, 40∼120℃의 열수 및 아세톤을 이용하여 각각 2회씩 세척하며, 균체를 진공건조 및 파쇄하고, 분말화된 균체를 20∼60℃의 알칼리 수용액 및 균체 건조 중량의 1∼20%의 단백질 분해 효소 제제로 처리한 후 비극성 용매로 세척하고 건조함을 특징으로 하는 고순도의 PHB 흑은 PHB-co-PHV의 분리 회수방법.
2. 제1항에 있어서, 알칼리 수용액 및 단백질 분해효소 제제에 의한 처리후에, 각각 열수를 이용하여 2회씩 더 세척함을 특징으로 하는 고순도의 PHB 혹은 PHB-co-PHV의 분리 회수방법.
3. 제1항에 있어서, 일칼리 수용액은 0.2∼2.0몰농도의 NaOH 또는 KOH수용액임을 특징으로 하는 고순도의 PHB 혹은 PHB-co-PHV의 분리 회수방법.