WO2010050470A1 - 組み換え微生物を用いたポリ乳酸の製造方法 - Google Patents

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WO2010050470A1
WO2010050470A1 PCT/JP2009/068402 JP2009068402W WO2010050470A1 WO 2010050470 A1 WO2010050470 A1 WO 2010050470A1 JP 2009068402 W JP2009068402 W JP 2009068402W WO 2010050470 A1 WO2010050470 A1 WO 2010050470A1
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WO
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amino acid
acid sequence
protein
seq
substituted
Prior art date
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PCT/JP2009/068402
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English (en)
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小畑　充生
浩美 神戸
伊藤　正和
隆 嶋村
幸田　勝典
精一 田口
Original Assignee
トヨタ自動車株式会社
株式会社豊田中央研究所
国立大学法人 北海道大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing polylactic acid using a recombinant microorganism.
  • bio-derived polyesters have attracted attention as biodegradable plastics that are easily degraded in nature and as “green” plastics that can be synthesized from renewable carbon resources such as sugar and vegetable oils. ing.
  • polylactic acid is expected to be a practically excellent biodegradable polymer because it is relatively inexpensive, has a melting point of 170 ° C. or more, has sufficient heat resistance, and can be melt-molded.
  • polylactic acid was produced by polymerizing lactic acid produced by microorganisms after neutralizing and purifying it into a dimeric cyclic compound (lactide). Therefore, there was a problem that the cost was high.
  • Non-patent Document 1 A typical example of a biodegradable plastic produced by microorganisms is poly-3-hydroxybutyrate (PHB) having 3-hydroxybutyric acid (3HB) as a monomer.
  • PHB is a thermoplastic polymer having a melting temperature of about 180 ° C., and has an advantage of excellent melt processability in addition to biodegradability.
  • PHB has high crystallinity, it has a problem in physical properties that it is hard and brittle, that is, inferior in impact resistance.
  • Patent Document 1 discloses a method for producing a copolymer comprising 3HB and 3-hydroxyvaleric acid (3HV).
  • Patent Document 2 microorganisms belonging to the genus Methylobacterium sp., Paracoccus sp., Alcaligenes sp., Pseudomonas sp.
  • a method of producing a copolymer of 3HB and 3HV by contacting with a primary alcohol is disclosed.
  • the copolymer of 3HB and 3HV is rich in flexibility compared with PHB, and that the flexibility increases as the content of 3HV in the copolymerized polyester increases.
  • propionic acid is added to the medium in Patent Document 1 and propan-1-ol is added to the medium in Patent Document 3, respectively.
  • the content of 3HV in the polyester is controlled.
  • P (3HB-co-3HH) which is a two-component copolyester of 3HB and 3-hydroxyhexanoic acid (hereinafter abbreviated as 3HH), and its production method are also described in, for example, Patent Document 4 and Patent Document 5, respectively.
  • the methods for producing P (3HB-co-3HH) copolymers described in these publications use Aeromonas caviae isolated from soil and fermentatively produce them from fatty acids such as oleic acid and oils such as olive oil. To do. In addition, this A.I.
  • Patent Document 7 describes a mutant enzyme that produces PHB having a high content of 3HB by converting the amino acid sequence of a polyhydroxyalkanoic acid synthase of a microorganism identified as Pseudomonas sp. 61-3. Is disclosed.
  • Patent Document 8 discloses Ralstonia eutropha incorporating a nucleic acid encoding a propionyl CoA transferase of Clostridium propionium as an example of such a copolyester containing a monomer unit other than 3-hydroxyalkanoic acid. Discloses a method for producing a copolyester composed of 3HB and lactic acid (LA) by culturing an old name Alcaligenes eutrophus while adding lactic acid to the medium. In addition, the same document describes C.I.
  • the above is a copolyester having 3-hydroxyalkanoic acid as a monomer unit, a copolyester having monomers other than 3-hydroxyalkanoic acid as a monomer unit, and a production method using a microorganism.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing polylactic acid by microbial fermentation using sugar as a raw material.
  • the present inventors have found that a recombinant microorganism into which a nucleic acid encoding a polyhydroxyalkanoic acid synthase variant described in Patent Document 7 has been introduced can efficiently produce polylactic acid directly from sugar. As a result, the following inventions have been completed.
  • a process for producing polylactic acid comprising:
  • amino acid sequence of the protein that catalyzes the reaction of transferring CoA to propionic acid and / or lactic acid is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • amino acid sequence of the protein that catalyzes the reaction of transferring CoA to propionic acid and / or lactic acid is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, or one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6
  • the amino acid sequence of the protein that catalyzes the synthesis reaction of polyhydroxyalkanoic acid is an amino acid sequence in which the 325th and 481st amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are substituted with other amino acids, respectively ( The manufacturing method as described in 1).
  • the amino acid sequence of the protein that catalyzes the synthesis reaction of polyhydroxyalkanoic acid is an amino acid sequence in which the 325th Ser in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is substituted with Thr and the 481st Gln is substituted with Lys.
  • the manufacturing method according to (1) is an amino acid sequence in which the 325th Ser in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is substituted with Thr and the 481st Gln is substituted with Lys.
  • each of the proteins is a protein encoded by a recombinant expression vector introduced into a microorganism.
  • a recombinant microorganism having a protein that catalyzes a reaction in which CoA is transferred to propionic acid and / or lactic acid, and a protein that catalyzes a synthesis reaction of polyhydroxyalkanoic acid having the amino acid sequence of a) or b) below.
  • (8) Propionic acid and / or lactic acid
  • the amino acid sequence of the protein that catalyzes the reaction to transfer CoA to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, or one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 has been deleted, substituted, or added.
  • the recombinant microorganism according to (7) which is an amino acid sequence.
  • amino acid sequence of the protein that catalyzes the reaction of transferring CoA to propionic acid and / or lactic acid is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, or one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6
  • the amino acid sequence of the protein that catalyzes the synthesis reaction of polyhydroxyalkanoic acid is an amino acid sequence in which the 325th and 481st amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are substituted with other amino acids, respectively ( The recombinant microorganism according to 7).
  • the amino acid sequence of the protein that catalyzes the synthesis reaction of polyhydroxyalkanoic acid is an amino acid sequence in which the 325th Ser in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is substituted with Thr and the 481st Gln is substituted with Lys.
  • the production method of the present invention can efficiently produce polylactic acid using an inexpensive carbon source as a raw material, and can reduce the production cost of biodegradable plastics.
  • phaC1 (ST / QK) represents the STQK gene
  • PCT represents M.P.
  • PRe is R.D.
  • a promoter derived from R. eutropha and Plac represents an E. coli lactose operon promoter, respectively. It is a molecular weight distribution curve of the polymer prepared in the Example. M.M.
  • the present invention relates to a recombinant microorganism having a protein that catalyzes a reaction in which CoA is transferred to propionic acid and / or lactic acid, and a protein that catalyzes a synthesis reaction of polyhydroxyalkanoic acid comprising the following amino acid sequence a) or b): Step 1) of culturing the bacterium in a medium containing a carbon source: a) an amino acid sequence in which at least one of the 130th, 325th, 477th and 481st amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is substituted with another amino acid b) in the protein defined in a), An amino acid sequence in which one or several amino acids other than the 130th, 325th, 477th and 481th positions are deleted or substituted, or one or several amino acid residues are inserted; And the manufacturing method of polylactic acid including the process 2) which collect
  • the conditions of the protein
  • PCT propionyl CoA transferase
  • Table 1 shows representative examples of PCT origins (microorganism names) reported so far, and literature information disclosing information on the base sequences encoding them.
  • any of the PCTs reported so far can be used.
  • an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the known amino acid sequence of PCT Even a protein consisting of can be used.
  • the term “several” used in connection with the amino acid sequence of PCT means 1 to 50, preferably 1 to 25, more preferably 10 or less.
  • the catalytic activity of the reaction in which CoA is transferred to propionic acid and / or LA is, for example, A. E. It can be measured according to the method described in Hofmeister et al. (Eur. J. Biochem., 206, 547-552).
  • a preferred PCT in the present invention is a PCT derived from Megaphaeera elsdenii.
  • the amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 4, and an example of the nucleotide sequence of a nucleic acid (DNA) encoding the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 3. .
  • PCT in the present invention is a PCT derived from Staphylococcus aureus, the amino acid sequence thereof is represented by SEQ ID NO: 6, and an example of the nucleotide sequence of the nucleic acid (DNA) encoding the amino acid sequence is represented by the sequence. The number 5 is shown.
  • PCT derived from Staphylococcus aureus showed higher lactate CoA productivity at an early stage of microbial culture compared to PCT derived from Megasphaela erusdeni, which was more rapidly This suggests that polylactic acid can be produced. Therefore, the use of PCT derived from Staphylococcus aureus has the advantage that the costs associated with the production of polylactic acid can be reduced.
  • any one of the above-mentioned PCTs may be used alone, or PCTs derived from a plurality of types may be used in combination.
  • PCT derived from Megasphaela elsdeni exhibits higher lactic acid CoA productivity in the later stage of microbial culture compared to PCT derived from Staphylococcus aureus. Based on the characteristics of PCT derived from Megasphaela erusdeni and the characteristics of PCT derived from Staphylococcus aureus described above, it is considered that lactic acid CoA productivity can be maintained over a longer period of time by using both together.
  • the protein that catalyzes the synthesis of polyhydroxyalkanoic acid in the present invention is a) the 130th, 325th, 477th and 481st positions of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence in which at least one of the amino acids is substituted with another amino acid, or b) a protein defined in a), wherein one or several amino acids other than the 130th, 325th, 477th and 481st positions are A protein consisting of an amino acid sequence that is deleted or substituted, or into which one or several amino acid residues are inserted.
  • the protein defined in a) is a protein in which a part of the amino acid sequence of polyhydroxyalkanoate synthase derived from Pseudomonas sp. 61-3 described in Patent Document 7 is mutated.
  • the protein defined in b) is obtained by introducing an additional mutation into the protein defined in a) to such an extent that the activity is not lost.
  • the term “several” used in connection with the protein defined in b) means 1 to 50, preferably 1 to 25, more preferably 10 or less.
  • PhaCm the protein that catalyzes the synthesis of polyhydroxyalkanoic acid in the present invention
  • PhaCm are the amino acids at the 130th, 325th, 477th and 481th positions of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 described in Table 6 and Table 7 of Patent Document 7, each independently.
  • a preferred protein is a double mutation in which any two amino acids are substituted, and particularly preferably a double mutation in which the 325th Ser is substituted with Thr and the 481st Gln is substituted with Lys (hereinafter referred to as STQK). ).
  • the DNA encoding PhaCm is based on the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of polyhydroxyalkanoic acid synthase derived from Pseudomonas sp. 61-3 and the base sequence (SEQ ID NO: 1) of the DNA encoding the same. Furthermore, it can be produced recombinantly by site-directed mutagenesis methods known to those skilled in the art. Further, as described in Patent Document 7, the activity of catalyzing the synthesis of PhaCm polyhydroxyalkanoic acid is obtained by obtaining a host cell transformed with a nucleic acid capable of expressing the PhaCm, and polyhydroxyalkane of the host cell. This can be confirmed by the acid accumulation ability.
  • Nucleic acid encoding protein It is preferable to use each of the proteins 1) to 2) above by introducing the nucleic acid encoding them into a microorganism and translating and translating the protein into the microorganism.
  • the nucleic acid introduced into the microorganism is preferably in a form incorporated into a vector.
  • the vector for introducing the nucleic acid into the microorganism may be any vector that can replicate autonomously in the host, and is preferably in the form of plasmid DNA or phage DNA.
  • vectors for introducing a nucleic acid into Escherichia coli include plasmid DNAs such as pBR322, pUC18, and pBLuscriptII, and phage DNAs such as EMBL3, M13, and ⁇ gtII.
  • Examples of vectors for introduction into yeast include YEp13 and YCp50.
  • vectors for introducing a nucleic acid into a bacterium belonging to the genus Ralstonia or Pseudomonas include pLA2917 (ATCC 37355) having an RK2 replication origin and RSF1010 replication origin which are replicated and maintained in a wide range of hosts.
  • PJRD215 ATCC 33533 having
  • the nucleic acid encoding each of the above proteins 1) to 2), preferably DNA, can be inserted into a vector using a gene recombination technique known to those skilled in the art.
  • a promoter capable of controlling transcription and translation of each protein from the DNA inserted into the vector.
  • Any promoter may be used as long as it can regulate gene transcription in the host.
  • E. coli is used as a host
  • trp promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter, T7 promoter and the like can be used
  • yeast is used as a host
  • gal1 promoter, gal10 promoter and the like can be used.
  • a region considered to contain a promoter upstream of the phaC1Ps gene or upstream of the phbCRe can be used.
  • the vector of the present invention includes a terminator sequence, an enhancer sequence, a splicing signal sequence, a poly A addition signal sequence, a ribosome binding sequence (SD sequence), a selection that can be used in a microorganism into which a nucleic acid is to be introduced, as necessary
  • a marker gene or the like can be linked.
  • selectable marker genes include drug resistance genes such as ampicillin resistance gene, tetracycline resistance gene, neomycin resistance gene, kana machine resistance gene, chloramphenicol resistance gene, and intracellular biosynthesis of nutrients such as amino acids and nucleic acids.
  • examples include genes involved, genes encoding fluorescent proteins such as luciferase, and the like.
  • the nucleic acid described above preferably in the form of a vector, is introduced into the microorganism by methods known to those skilled in the art.
  • Examples of the method for recombination of a vector into a microorganism include a calcium phosphate method, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, a junction transfer method, a method using calcium ions, and the like.
  • Microorganism The recombinant microorganism in the present invention is transformed by introduction of a microorganism expressing the protein of 1) to 2) above, preferably a nucleic acid capable of functionally expressing the protein of 1) to 2) above.
  • Microorganisms. Suitable microorganisms include bacteria belonging to the genus Pseudomonas such as Pseudomonas sp.
  • Ralstonia bacteria such as Eutropha, Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis, Escherichia bacteria such as Escherichia coli, Corynebacterium b -Saccharomyces (Saccharomyces) genus yeasts, such as Saccharomyces cerevisiae, Candida (Candida maltosa) yeasts, such as Candida maltosa, etc. can be mentioned.
  • Escherichia coli, Corynebacterium, and R. Eutropha is preferable, and Escherichia coli and Corynebacterium are particularly preferable.
  • a microorganism having its own unique polyhydroxyalkanoate synthase such as utropha
  • Microorganisms that have lost such expression ability are treated with a chemical mutagen such as nitrosoguanidine or a physical mutagen such as UV, or the nucleic acid encoding polyhydroxyalkanoate synthase is modified to function the enzyme. It can be prepared by introducing a mutated nucleic acid that has made inappropriate expression into a microorganism and performing “homologue recombination”. Confirmation that the polyhydroxyalkanoate synthase gene has been disrupted is based on Southern hybridization using a part of the gene as a probe. This can be done by examining the shift.
  • Polylactic acid is produced by culturing a recombinant microorganism into which the nucleic acid is introduced in a medium containing a carbon source, producing and accumulating polylactic acid in a cultured cell or culture, and This is done by recovering polylactic acid from the body or culture.
  • the culture of the recombinant microorganism of the present invention is preferably carried out under general culture conditions for each microorganism according to the type of the recombinant microorganism, except for the medium composition.
  • a medium having a special composition is not particularly required, but it is preferable to use a medium in which any of nitrogen sources other than carbon sources, inorganic salts, and other organic nutrient sources is limited.
  • a medium for culturing a recombinant microorganism in which a nucleic acid is incorporated into a bacterium belonging to the genus Ralstonia or Pseudomonas for example, a medium in which a nitrogen source is limited to 0.01 to 0.1% can be mentioned.
  • Examples of the carbon source include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, and maltose.
  • oil-related substances having 4 or more carbon atoms can be used as a carbon source.
  • oils and fats having 4 or more carbon atoms include corn oil, soybean oil, safflower oil, sunflower oil, olive oil, coconut oil, palm oil, rapeseed oil, fish oil, whale oil, pig oil or cow oil, Fatty acids such as butanoic acid, pentanoic acid, hexanoic acid, octanoic acid, decanoic acid, lauric acid, oleic acid, palmitic acid, linolenic acid, linoleic acid or myristic acid or esters of these fatty acids, octanol, lauryl alcohol, oleyl alcohol or Examples include palmityl alcohol and the like, and esters of these alcohols.
  • nitrogen source examples include ammonium salts such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, and ammonium phosphate, as well as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, and the like.
  • inorganic substances include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, and sodium chloride.
  • Cultivation is preferably carried out at a temperature of 25 to 37 ° C. under aerobic conditions such as shaking culture for at least 24 hours after the transcription of the proteins 1) to 2).
  • antibiotics such as kanamycin, ampicillin, and tetracycline may be added to the medium.
  • a factor that induces transcription of the promoter may be added to the medium.
  • a preferred embodiment of the present invention is M.I. Nucleic acid (SEQ ID NO: 3) encoding PCT from M. elsdenii or S. cerevisiae.
  • SEQ ID NO: 3 encoding PCT from M. elsdenii or S. cerevisiae.
  • This is a method for producing polylactic acid by culturing a recombinant Escherichia coli introduced with a nucleic acid (SEQ ID NO: 5) encoding PCT derived from S. aureus and an expression vector having a nucleic acid encoding STQK.
  • This method is advantageous in terms of production cost because polylactic acid can be produced from inexpensive molasses without adding a monomer component constituting the target polymer such as LA to the medium. is there.
  • polylactic acid may be recovered by a method known to those skilled in the art for recovering polylactic acid or PHA from microorganisms.
  • the microorganism is collected from the culture solution by centrifugation, washed, dried, suspended in chloroform, heated to extract the target polyester into the chloroform fraction, and methanol solution added to the chloroform solution. Is added to precipitate polylactic acid, the supernatant is removed by filtration or centrifugation, and then dried to obtain purified polylactic acid.
  • Confirmation that the recovered polyester is polylactic acid may be performed by an ordinary method such as gas chromatography or nuclear magnetic resonance.
  • Example 1 1) Production of recombinant microorganisms In order to amplify the nucleic acid encoding propionyl CoA transferase (Accession No. J04987) by PCR after extracting genomic DNA from M. elsdenii (ATCC17753) using DNeasy Tissue Kit (Qiagen), EcoRI recognition sequence Primer DNA of a forward primer containing a reverse primer containing a PstI recognition sequence was synthesized.
  • PCR amplification conditions were as follows: PCR reaction (enzyme KOD-PLUS), 94 ° C. for 1 cycle, 94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 cycles, and 94 °C 2 minutes.
  • the sequence of the primer set used for amplification of each gene is as follows: M.M.
  • MePCTN 5'-atgagaaaagtagaaatcattac-3 '
  • MePCTC 5'-ttattttttcagtcccatgggaccgtcctg-3 '
  • CpPCTN 5'-gggggccatgggaaaggttcccattattaccgcagatgag -3 '
  • CpPCTC 5'-ggggctcgagtcaggacttcatttccttcagacccat-3 ' S.
  • Plasmid pTV118N (Takara Shuzo) was digested with EcoRI and PstI, dephosphorylated with alkaline phosphatase, About 4.7 kbp of the recombinant plasmid PTV118N M. coli containing the DNA fragment encoding the propionyl-CoA transferase ligated by adding the DNA fragment from Oersdeni. E. -PCT was prepared.
  • Plasmid pGEMC1 (ST / QK) AB containing all of the DNA encoding STQK was prepared according to the method described in Takase et al. (J. Biochem., 2003, Vol. 133, pp. 139-145).
  • pGEMC1 (ST / QK) AB is digested with BamHI to recover a DNA fragment of about 6 kbp, which contains 66 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 0.5 mM DTT, 0.1 mg / mL BSA, 3 mM containing 0.1 mM dNTP.
  • Tris acetate buffer (pH 7.9) 200 units of T4 polymerase was allowed to act at 37 ° C. for 5 minutes to obtain a DNA fragment encoding STQK.
  • PTV118N M PTV118N M.
  • E. -PCT was digested with PstI and allowed to act on T4 polymerase under the same conditions as described above, then dephosphorylated using alkaline phosphatase, and then the DNA fragment encoding the phaCm was ligated to pTV118N M.
  • pTV118N-PCT-Cl was obtained by amplifying the region of pTV118N-PCT-C1AB excluding the phaA and phaB portions by PCR and self-ligating the product (FIG. 1).
  • E. coli species W3110 competent cells were transformed with pTV118N-PCT-C1 (ST / QK).
  • 200 ml culture was performed by the above-described culture method, and the obtained culture solution was collected in a 50 ml falcon tube (3000 ⁇ g, 5 min, RT) and then frozen at ⁇ 80 ° C. overnight.
  • the frozen cells were dried for 2 days with a freeze dryer (Model 77400 manufactured by LABCONCO).
  • the dried cells were transferred to a pressure-resistant test tube, 1 ml of chloroform was added per 100 mg of cells, and refluxed in a water bath at 95 ° C. for 3 hours.
  • the sample after reflux was returned to room temperature and filtered through a 0.22 ⁇ m PTFE filter into a silicon centrifuge tube to remove the cells.
  • the extracted sample was dried at room temperature until the chloroform was completely removed.
  • 2 ml of hexane was added, vortexed for about 1 minute, and then centrifuged (6,000 ⁇ g, 15 minutes, RT) to remove the supernatant. This washing with hexane was performed twice.
  • the sample after dry-up was dissolved in 2 ml of chloroform, transferred to a glass vial and dried up, and this was used as a sample for polymer analysis.
  • GC / MS analysis 200 ml culture was carried out by the culture method described above, and the obtained culture solution was collected in a 50 ml falcon tube (3000 ⁇ g, 5 min, RT) and then frozen at ⁇ 80 ° C. overnight. The frozen cells were dried for 2 days with a freeze dryer (Model 77400 manufactured by LABCONCO). 100 mg of the dried cells were weighed into a pressure-resistant test tube, 1.6 ml of chloroform was added, and the mixture was allowed to stand overnight at room temperature.
  • PLA-0020 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., weight average molecular weight 20,000
  • 10 ml of chloroform 10 ml of chloroform in a 20 ml vial
  • 1 ml of this was pressure tested.
  • the mixture was transferred to a tube, 0.6 ml of chloroform, 1.6 ml of methanol sulfuric acid and 100 ⁇ l of an internal standard were added, and methylation was performed by refluxing in a water bath at 95 ° C. for 3 hours.
  • the standard sample after completion of methylation was returned to room temperature and transferred to a disposable test tube having a diameter of 18 mm.
  • the methylated product was either GC / MS (HP6890 Series GC system / 5973 Mass Selective Detector) DB-1 (122-10G3: 150 meters ⁇ 0.25 mm ⁇ 1 mm) or DB-1 (122-1063) manufactured by Agilent. : The analysis was performed using 60 meters ⁇ 0.25 mm ⁇ 1 mm). The analysis method when using each column is described below.
  • CE-MS analysis conditions were analyzed in Anal. According to Chem 2002, 74, 6224-6229 “Pressure-Assisted Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry for Analysis of Multivalents”. The result is shown in FIG.
  • FIG. 7 shows the quantification result of lactic acid derivatives from ii) GC / MS analysis.
  • PCT derived from Elsdeni is C.I. It has been found that it contributes better to the productivity of polylactic acid compared to PCT derived from propionium.
  • pTV118N-PCT-C1 Pseudomonas sp. 61-3 polyhydroxyalkanoate synthase (wild type, SEQ ID NO: 1)
  • a competent cell of E. coli W3110 was transformed with pTV118N-PCT-C1, and the resulting transformant was cultured in 10 ml of LB liquid containing active colonies formed on LB agar medium in a 100 ml Erlenmeyer flask.
  • a pre-cultured bacterial solution that was inoculated into the medium and grown by shaking culture at 30 ° C.
  • 200 ml culture was performed by the above-described culture method, and the obtained culture solution was collected in a 50 ml falcon tube (3000 ⁇ g, 5 min, RT) and then frozen at ⁇ 80 ° C. overnight.
  • the frozen cells were dried for 2 days with a freeze dryer (Model 77400 manufactured by LABCONCO). 100 mg of the dried cells were weighed into a pressure-resistant test tube, 1.6 ml of chloroform was added, and the mixture was allowed to stand overnight at room temperature.
  • Methylation was carried out by adding 1.6 ml of methanol sulfuric acid and 100 ⁇ l of internal standard (benzoic acid 10 mg / CHCl 310 ml) to this bacterial cell / chloroform solution and refluxing in a water bath at 95 ° C. for 3 hours.
  • the sample after completion of methylation was returned to room temperature and transferred to a disposable test tube having a diameter of 18 mm.
  • 800 ⁇ l of Milli-Q water was added, stirred for about 30 seconds, and allowed to stand until it was separated into an aqueous layer and a solvent layer. After separation, the chloroform layer was separated with a Pasteur pipette, filtered into a 2 ml vial with a 0.22 ⁇ m PTFE filter, and subjected to GS / MS analysis.

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Abstract

　本発明は、ポリ乳酸を、糖を原料とした微生物発酵によって効率よく生産する方法を提供することを目的とする。 　プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質、及び下記のａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質を有する組み換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する工程１）： 　ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸の少なくとも１以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列 　ｂ）ａ）に規定されるタンパク質において、さらに１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目以外の1若しくは数個のアミノ酸が欠失若しくは置換され、又は1以上のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列、 及び、工程１）の培養物から前記ポリエステルを回収する工程２）を含む、ポリエステルの製造方法。

Description

組み換え微生物を用いたポリ乳酸の製造方法
　本発明は、組み換え微生物を用いたポリ乳酸の製造方法に関する。
　地球環境問題の観点から、自然界で容易に分解される生分解性プラスチックとして、また糖や植物油などの再生可能な炭素資源から合成することができる“グリーン”プラスチックとして生物由来のポリエステルが注目を浴びている。中でもポリ乳酸は、比較的コストが安く、融点も１７０℃以上と充分な耐熱性を有し、溶融成型可能なため、実用上優れた生分解性ポリマ－と期待されている。
　しかし従来は、特開2004-204464に示すように微生物で生産した乳酸を中和，精製工程を経て，二量体の環状化合物（ラクチド）にしてから重合することでポリ乳酸を生産していたことから，コストが高くなるという問題点があった。
　現在までに、糖を炭素源としてポリエステルを生産する能力を有する微生物が多数報告されている（非特許文献１）。微生物が生産する生分解性プラスチックの代表例は、３－ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）をモノマーとするポリ－３－ヒドロキシ酪酸（ｐｏｌｙｈｙｄｏｒｏｘｙｂｕｔｙｌａｔｅ、ＰＨＢ）である。ＰＨＢは、１８０℃程度に融解温度をもつ熱可塑性高分子であり、生分解性に加えて溶融加工性に優れるという利点を有する。その一方、ＰＨＢは、結晶性が高いために、硬くて脆い、すなわち耐衝撃性に劣るという物性上の問題を抱えている。
　ＰＨＢの物性上の問題を解消する方法の一つとして、３ＨＢとその他のヒドロキシアルカン酸とからなる共重合ポリエステルを、微生物を用いて製造する方法が開発されている。
　例えば、特許文献１には３ＨＢと３－ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）とからなる共重合体の製造方法が開示されている。また特許文献２には、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）の微生物を、炭素数３から７の第一アルコールに接触させることにより、３ＨＢと３ＨＶとの共重合体を生産させる方法が開示されている。
　この３ＨＢと３ＨＶとの共重合体はＰＨＢに比べると柔軟性に富み、また共重合ポリエステル中の３ＨＶの含有率が増加すると柔軟性が高まることが確認されている。上記の微生物を用いた３ＨＢと３ＨＶとの共重合体の製造法では、例えば前記特許文献１ではプロピオン酸を、また特許文献３ではプロパン－１－オールをそれぞれ培地に添加することで、共重合ポリエステル中の３ＨＶの含有率を制御している。
　３ＨＢと３－ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと略す）との２成分共重合ポリエステルであるＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）およびその製造方法も、例えば、特許文献４及び特許文献５にそれぞれ記載されている。これらの公報のＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）共重合体の製造方法は、土壌より単離されたアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）を用い、オレイン酸等の脂肪酸やオリーブオイル等の油脂から発酵生産するものである。また、このＡ．ｃａｖｉａｅのＰＨＡシンターゼ遺伝子をクローニングし、この遺伝子をアルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）に導入した組換え株を用いて、脂肪酸を炭素源としてＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）を生産する報告もなされている（特許文献６）。
　また、上記の共重合ポリエステルの微生物を用いた製造法では、何れの場合にも、直接ポリマーを合成する活性を有する酵素タンパク質であるポリヒドロキシアルカン酸合成酵素を使用することが必要であるが、この合成酵素を改変して、モノマー単位のモル分率を調節する試みも行われている。例えば特許文献７は、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）６１－３として同定されている微生物のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素のアミノ酸配列を変換して、３ＨＢの含有率が高いＰＨＢを生産する変異酵素を開示している。
　一方、３－ヒドロキシアルカン酸以外の成分をモノマー単位とする共重合ポリエステルは、上記の共重合ポリエステルとは異なる物性を有することが期待される。特許文献８は、その様な３－ヒドロキシアルカン酸以外のモノマー単位を含む共重合ポリエステルの例として、クロストリジウム・プロピオニウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）のプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸を組み込んだラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｅｕｔｒｏｐｈａ、旧名アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ））を、培地に乳酸を添加しながら培養して、３ＨＢと乳酸（ＬＡ）とからなる共重合ポリエステルを製造する方法を開示している。また、同文献は、Ｃ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｕｍ由来のプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸と、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６１－３由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする核酸とを組み込んだ大腸菌を、培地に乳酸とデセノイン酸を添加しながら培養して、３－ヒドロキシヘキサノエート、３－ヒドロキシオクタノエート、３－ヒドロキシデカノエート及び乳酸からなるコポリマーを製造する方法も開示している。
　以上は、３－ヒドロキシアルカン酸をモノマー単位とする共重合ポリエステルや３－ヒドロキシアルカン酸以外の成分をモノマー単位とする共重合ポリエステルと、微生物を用いたその製造法である。
　しかし、糖を原料として、微生物発酵によってポリ乳酸を効率的に生産する方法についての報告はない。
「生分解性プラスチックハンドブック」、生分解性プラスチック研究会編、１９９５年、第１７８－１９７頁、（株）エヌ・ティー・エス発行） 特開昭５７－１５０３９３号公報 特開平５－７４４９２号公報 特公平７－７９７０５号公報 特開平５－９３０４９号公報 特開平７－２６５０６５号公報 特開平１０－１０８６８２号公報 国際公開公報ＷＯ２００３／１０００５５ 国際公開公報ＷＯ２００６／１２６７９６
　本発明は、ポリ乳酸を、糖を原料とした微生物発酵によって効率よく生産する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、前記特許文献７に記載のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素の変異体をコードする核酸を導入した組み換え微生物が、糖から直接的にポリ乳酸を効率的に製造することができることを見いだし、下記の各発明を完成した。
（１）プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質、及び下記のａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質を有する組み換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する工程１）：
　ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸の少なくとも１以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
　ｂ）ａ）に規定されるタンパク質において、さらに１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目以外の1若しくは数個のアミノ酸が欠失若しくは置換され、又は1若しくは数個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列、
及び、工程１）の培養物から前記ポリ乳酸を回収する工程２）
を含む、ポリ乳酸の製造方法。
（２）プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列である、（１）に記載の製造方法。
（３）プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列である、（１）に記載の製造方法。
（４）ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３２５番目及び４８１番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列である、（１）に記載の製造方法。
（５）ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３２５番目のＳｅｒがＴｈｒに、４８１番目のＧｌｎがＬｙｓにそれぞれ置換されたアミノ酸配列である、（１）に記載の製造方法。
（６）前記タンパク質のいずれもが、微生物に導入された組み換え発現ベクターにコードされているタンパク質である、（１）に記載の製造方法。
（７）プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質、及び下記のａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質を有する組み換え微生物。
　ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸の少なくとも１以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
　ｂ）ａ）に規定されるタンパク質において、さらに１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目以外の1若しくは数個のアミノ酸が欠失若しくは置換され、又は1若しくは数個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列
（８）プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列である、（７）に記載の組み換え微生物。
（９）プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列である、（７）に記載の組み換え微生物。
（１０）ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３２５番目及び４８１番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列である、（７）に記載の組み換え微生物。
（１１）ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３２５番目のＳｅｒがＴｈｒに、４８１番目のＧｌｎがＬｙｓにそれぞれ置換されたアミノ酸配列である、（７）に記載の組み換え微生物。
（１２）前記タンパク質をコードする遺伝子を有する組み換え発現ベクターが導入されていることを特徴とする、（７）に記載の組み換え微生物。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2008-276185号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明の製造方法は、安価な炭素源を原料として、ポリ乳酸を効率的に製造することができ、生分解性プラスチックの製造コストを低くすることができる。
組換えプラスミドｐＴＶ１１８ＮＰＣＴＣ１（ＳＴ／ＱＫ）の構成を示す概略図である。図中、ｐｈａＣ１（ＳＴ／ＱＫ）はＳＴＱＫ遺伝子を、ＰＣＴはＭ．エルスデニ（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ）由来のＰＣＴ遺伝子を、ＰＲｅはＲ．ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来プロモーターを、及びＰｌａｃは大腸菌ラクトースオペロンプロモーターを、それぞれ表す。 実施例で調製したポリマーの分子量分布曲線である。 Ｍ．エルスデニ由来のＰＣＴ遺伝子と、ｐｈａＣ１（ＳＴ／ＱＫ）遺伝子とを含む組換えプラスミドｐＴＶ１１８ＮＰＣＴＣ１（ＳＴ／ＱＫ）を用いて調製したポリマーのＧＣ／ＭＳ分析の結果を表わすチャートである。 Ｍ．エルスデニ由来のＰＣＴ遺伝子と、ｐｈａＣ１（ＷＴ）遺伝子とを含む組み換えプラスミドｐＴＶ１１８ＮＰＣＴＣｌ（ＷＴ）を用いて調製したポリマーのＧＣ／ＭＳ分析の結果を表わすチャートである。 ＰＬＡ標品（ＭＷ２０，０００）を用いて調製したポリマーのＧＣ／ＭＳ分析の結果を表わすチャートである。 Ｍ．エルスデニ由来のＰＣＴ遺伝子又はＣ．プロピオニウム由来のＰＣＴ遺伝子と、ｐｈａＣ１（ＳＴ／ＱＫ）遺伝子とを含む組み換えプラスミドｐＴＶ１１８ＮＰＣＴＣ１（ＳＴ／ＱＫ）を用いて調製したポリマーのＧＣ／ＭＳ分析の結果を表すチャートである。 実施例で調製したポリマーの１Ｈ－ＮＭＲスペクトル分析の結果を表わすチャートである。 組換えプラスミドｐＴＶ１１８ＮＰＣＴＣ１（ＷＴ）の構成を示す概略図である。図中、ｐｈａＣ１（ＷＴ）はシュードモナスｓｐ．６１－３由来ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子（野生型）を、ＰＣＴはＭ．エルスデニ由来ＰＣＴ遺伝子を、ＰＲｅはアルカリゲネス・ユウトロファス由来プロモーターを、及びＰｌａｃはラクトースオペロンプロモーターを、それぞれ示す。 ＰＣＴ遺伝子の違いによるラクトイルＣｏＡの生産量の違いを経時的に示すグラフである。 Ｍ．エルスデニ由来のＰＣＴ遺伝子とＣ．プロピオニウム由来のＰＣＴ遺伝子とのポリ乳酸生産性の比較を示すグラフである。
　本発明は、プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質と、下記のａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質を有する組み換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する工程１）：
　ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸の少なくとも１以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
　ｂ）ａ）に規定されるタンパク質において、さらに１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目以外の1若しくは数個のアミノ酸が欠失若しくは置換され、又は1若しくは数個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列、
及び、工程１）の培養物から前記ポリ乳酸を回収する工程２）を含む、ポリ乳酸の製造方法である。以下、本発明で使用されるタンパク質、組み換え微生物、及び本発明の製造方法の諸条件について、説明する。
１）プロピオン酸及び／又は乳酸（ＬＡ）にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質
　本発明で使用される「プロピオン酸及び／又はＬＡにＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質」は、適当なＣｏＡ基質からプロピオン酸及び／又はＬＡにＣｏＡが転移される反応を触媒する活性を有するタンパク質である。かかる活性を有するタンパク質は、一般にプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＰｒｏｐｉｏｎｙｌＣｏＡ　Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＰＣＴ）と称されている。以下、本発明では、当該タンパク質をＰＣＴと表すこととする。
　表１に、これまでに報告されたＰＣＴの由来（微生物名）の代表例と、それをコードする塩基配列情報を開示した文献情報を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明では、上記表１の他にも、これまでに報告されたＰＣＴのいずれも利用することができる。また、「プロピオン酸及び／又はＬＡにＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質」であるかぎり、既知のＰＣＴのアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても利用することができる。なお、ＰＣＴのアミノ酸配列の関連で使用する用語「数個」とは、１～５０個、好ましくは１～２５個、より好ましくは１０個以下をいう。
　プロピオン酸及び／又はＬＡにＣｏＡが転移される反応の触媒活性は、例えばＡ．Ｅ．Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒら（Ｅｕｒ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第２０６巻、第５４７－５５２頁）に記載された方法に従って測定することができる。
　本発明における好ましいＰＣＴは、メガスファエラ・エルスデニ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）由来のＰＣＴであり、そのアミノ酸配列を配列番号４に、当該アミノ酸配列をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列の例を配列番号３に示す。
　本発明における他の好ましいＰＣＴは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）由来のＰＣＴであり、そのアミノ酸配列を配列番号６に、当該アミノ酸配列をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列の例を配列番号５に示す。下記実施例に示すように、スタフィロコッカス・アウレウス由来のＰＣＴは、メガスファエラ・エルスデニ由来のＰＣＴに比較して、微生物培養の初期で高い乳酸ＣｏＡ生産性を示し、これはより迅速に乳酸ＣｏＡ及びポリ乳酸を生産できることを示唆している。したがって、スタフィロコッカス・アウレウス由来のＰＣＴの使用は、ポリ乳酸の生産に伴うコストを削減できるという利点を有する。
　本発明において、上記いずれか１種のＰＣＴを単独で用いてもよいし、複数種に由来するＰＣＴを組合せて用いてもよい。例えば、メガスファエラ・エルスデニ由来のＰＣＴは、スタフィロコッカス・アウレウス由来のＰＣＴに比較して、微生物培養の後期で高い乳酸ＣｏＡ生産性を示す。このようなメガスファエラ・エルスデニ由来のＰＣＴの特性と、上述したスタフィロコッカス・アウレウス由来のＰＣＴの特性に基づき、両者を併用することで、より長期間にわたって乳酸ＣｏＡ生産性を維持できると考えられる。
２）ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質
　本発明におけるポリヒドロキシアルカン酸の合成を触媒するタンパク質は、ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸の少なくとも１以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、又はｂ）ａ）に規定されるタンパク質において、さらに１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失若しくは置換され、又は1若しくは数個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質である。ａ）で規定するタンパク質は、前記特許文献７に記載されている、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）６１－３由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素のアミノ酸配列の一部を変異させたタンパク質であり、ｂ）で規定するタンパク質は、ａ）で規定するタンパク質にその活性を失わない程度にさらに追加の変異が導入されたものである。なお、ｂ）に規定するタンパク質に関連して使用される用語「数個」とは、１～５０個、好ましくは１～２５個、より好ましくは１０個以下をいう。以下、本発明におけるポリヒドロキシアルカン酸の合成を触媒するタンパク質をＰｈａＣｍと表し、また特許文献７の記載を全て本明細書に取り込むこととする。
　ＰｈａＣｍの好適な具体例は、特許文献７の表６及び表７に記載されている、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸が、それぞれ単独で置換された単独変異、任意の２つのアミノ酸が置換された二重変異、任意の３つのアミノ酸が置換された三重変異、４つ全てのアミノ酸が置換された四重変異を挙げることができる。
　好ましいタンパク質は、任意の２つのアミノ酸が置換された二重変異であり、特に好ましくは３２５番目のＳｅｒがＴｈｒに、及び４８１番目のＧｌｎがＬｙｓに置換された二重変異（以下、ＳＴＱＫと表す）である。
　ＰｈａＣｍをコードするＤＮＡは、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）６１－３由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素のアミノ酸配列（配列番号２）及びそれをコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号１）を基に、当業者に知られた部位特異的変異導入法によって組み換え的に作製することができる。また、特許文献７に記載されている通り、ＰｈａＣｍのポリヒドロキシアルカン酸の合成を触媒する活性は、前記ＰｈａＣｍを発現可能な核酸で形質転換された宿主細胞を得、当該宿主細胞のポリヒドロキシアルカン酸の蓄積能によって確認することができる。
３）タンパク質をコードする核酸
　上記１）～２）の各タンパク質は、それらをコードする核酸を微生物に導入して、当該微生物内でタンパク質に転写翻訳させて使用することが好ましい。微生物に導入される核酸は、ベクターに組み込まれた形態にあることが好ましい。
　前記の核酸を微生物に導入するためのベクターは、宿主中で自立複製可能なものであればよく、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡの形態にあることが好ましい。核酸を大腸菌に導入するためのベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢＬｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ等のプラスミドＤＮＡを、ＥＭＢＬ３、Ｍ１３、λｇｔＩＩ等のファージＤＮＡ等を、それぞれ挙げることができる。また酵母に導入するためのベクターの例としては、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等を挙げることができる。
　また、核酸をラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属細菌やシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌に導入するためのベクターの例としては、広範囲の宿主において複製・保持されるＲＫ２複製起点を有するｐＬＡ２９１７（ＡＴＣＣ３７３５５）やＲＳＦ１０１０複製起点を有するｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ ３７５３３）等を挙げることができる。
　上記１）～２）の各タンパク質をコードする核酸、好ましくはＤＮＡのベクターへの挿入は、当業者に知られた遺伝子組み換え技術を用いて行うことができる。また組み換えに際して、ベクターに挿入されるＤＮＡからの各タンパク質の転写翻訳を調節することのできるプロモーターの下流に、前記ＤＮＡを連結することが好ましい。プロモーターとしては、宿主中で遺伝子の転写を調節できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーターなどを、酵母を宿主として用いる場合には、ｇａｌ1プロモーター、ｇａｌ１０プロモーターなどを用いることができる。また、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌を本発明の微生物として用いる場合には、プロモーターとして、ｐｈａＣ１Ｐｓ遺伝子上流やｐｈｂＣＲｅ上流のプロモーターを含むと考えられる領域などを用いることができる。
　また、本発明のベクターには、必要に応じて、核酸を導入しようとする微生物において利用可能なターミネーター配列、エンハンサー配列、スプライシングシグナル配列、ポリＡ付加シグナル配列、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）、選択マーカー遺伝子などを連結することができる。選択マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子の他、アミノ酸や核酸等の栄養素の細胞内生合成に関与する遺伝子、あるいはルシフェラーゼとうの蛍光タンパク質をコードする遺伝子などを挙げることができる。
　上記の核酸、好ましくはベクターの形態にある核酸は、当業者に知られた方法によって、微生物に導入される。微生物へのベクターの組み換え方法としては、例えばリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、接合伝達法、カルシウムイオンを用いる方法や等が挙げられる。
４）微生物
　本発明における組み換え微生物としては、上記１）～２）のタンパク質を発現している微生物、好ましくは上記１）～２）のタンパク質を機能的に発現し得る核酸の導入によって形質転換された微生物である。好適な微生物としては、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）６１－３株などのシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、Ｒ．ユートロファなどのラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属細菌、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などのエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、サッカロマイセス・セレビシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）などのカンジダ(Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母などを挙げることができる。中でも大腸菌、コリネバクテリウム属細菌、及びＲ．ユートロファが好ましく、特に好ましくは大腸菌、コリネバクテリウム属細菌である。
　Ｒ．ユートロファなどの、それ自体が固有のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素を持つ微生物の場合には、当該固有のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素の発現能を失った微生物を使用することが好ましい。かかる発現能を失った微生物は、ニトロソグアニジンなどの化学変異源やＵＶ等の物理的変異源によって微生物を処理したり、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする核酸を改変して当該酵素の機能的な発現を不能とした変異核酸を微生物に導入し、「相同的組み換え」（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を行わせたりして、作製することができる。ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子が破壊されていることの確認は、該遺伝子の一部をプローブとして用いるサザンハイブリダイゼーションによって、ハイブリダイズするバンドが、野性株由来のバンドに比べて予想される位置にシフトしていることを調べることによって行うことができる。
５）ポリ乳酸の製造
　ポリ乳酸の製造は、前記の核酸が導入された組み換え微生物を、炭素源を含む培地で培養し、培養菌体又は培養物中にポリ乳酸を生成蓄積させ、該培養菌体又は培養物からポリ乳酸を回収することにより行われる。
　本発明の組み換え微生物の培養は、培地組成を除き、組み換え微生物の種類に応じて、それぞれの微生物についての一般的な培養条件で行うことが好ましい。
　特殊な組成を有する培地は特に必要とされないが、炭素源以外の窒素源、無機塩類その他の有機栄養源のいずれかを制限した培地を利用することが好ましい。例えば、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属細菌やシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌等に核酸を組み込んだ組み換え微生物を培養する培地としては、例えば窒素源を０．０１～０．１％に制限した培地が挙げられる。
　炭素源としては、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、マルトース等の炭水化物が挙げられる。また、炭素数４以上の油脂関連物質を炭素源とすることもできる。炭素数４以上の油脂関連物質としては、コーン油、大豆油、サフラワー油、サンフラワー油、オリーブ油、ヤシ油、パーム油、ナタネ油、魚油、鯨油、豚油又は牛油などの天然油脂、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノレン酸、リノール酸若しくはミリスチン酸等の脂肪酸又はこれらの脂肪酸のエステル、オクタノール、ラウリルアルコール、オレイルアルコール若しくはパルミチルアルコール等又はこれらアルコールのエステル等が挙げられる。
　窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
　培養は、通常振盪培養などの好気的条件下、２５～３７℃の範囲で、前記１）～２）のタンパク質が転写発現されてから２４時間以上行うことが好ましい。培養中は、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。前記１）～２）のタンパク質をコードするＤＮＡのいずれか或いは全てを誘導性プロモーターの制御下に連結した場合には、当該プロモーターの転写に誘導する因子を培地に添加すればよい。
　本発明の好ましい態様は、Ｍ．エルスデニ（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ）由来のＰＣＴをコードする核酸（配列番号３）又はＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＰＣＴをコードする核酸（配列番号５）、及びＳＴＱＫをコードする核酸を有する発現ベクターを導入した組み換え大腸菌を培養し、ポリ乳酸を製造する方法である。この方法は、培地にＬＡなどの、目的とするポリマーを構成するモノマー成分を培地に添加しなくても、安価な廃糖蜜から、ポリ乳酸を製造することができ、製造コストの点で有利である。
　本発明において、ポリ乳酸の回収は、微生物からポリ乳酸あるいはＰＨＡを回収するための、当業者に公知の方法によって行えばよい。例えば、培養液から遠心分離によって集菌、洗浄した後、乾燥させ、クロロホルムに乾燥菌体を懸濁し、加熱することによって、目的とするポリエステルをクロロホルム画分に抽出し、さらにこのクロロホルム溶液にメタノールを加えてポリ乳酸を沈殿させ、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去した後、乾燥することで、精製されたポリ乳酸を得ることができる。
　回収されたポリエステルがポリ乳酸であることの確認は、通常の方法、例えばガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行えばよい。
　以下、非限定的な実施例を示して本発明をさらに詳細に説明する。なお、実施例における各実験操作は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ　ｅｄ．　１９８９年、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎ．Ｙ．）を初めとする各種の実験操作を紹介したマニュアル、又は各種試薬及びキットに添付された指示書の各記載に従い、行った。
＜実施例１＞
１）組み換え微生物の作製
　Ｍ．エルスデニ（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ、ＡＴＣＣ１７７５３）からＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出後、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ（アクセッションＮｏ．Ｊ０４９８７）をコードする核酸をＰＣＲで増幅するために、ＥｃｏＲＩ認識配列を含むフォワードプライマーと、ＰｓｔＩ認識配列を含むリバースプライマーのプライマーＤＮＡを合成した。
　前記ゲノムＤＮＡを鋳型として、ｉＣｙｃｌｅｒ(ＢｉｏＲａｄ)を用い、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－ＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ）、ＰＣＲバッファー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、各プライマー１５ｐｍｏｌ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（全て東洋紡株式会社製）を含む反応液中、９４℃２分を１サイクル、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分を１サイクルとするＰＣＲ反応を３０サイクル行った後、約１，５００ｂｐの増幅断片を回収し、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化して、ＤＮＡフラグメントを得た。
　また、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、ＡＴＣＣ１０８３２）及びＣ．プロピオニウム（Ｃ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、ＡＴＣＣ２５５２２）からも同様に、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼをコードするＤＮＡフラグメントを取得した。使用したＰＣＲ増幅条件は次の通りである： ＰＣＲ反応（酵素ＫＯＤ‐ＰＬＵＳ）、９４℃ １分の１サイクル、９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、及び７２℃ ２分の３０サイクル、及び９４℃２分。
　各遺伝子の増幅に使用したプライマーセットの配列は次の通りである：
Ｍ．エルスデニＰＣＴ用：
MePCTN：5’-atgagaaaagtagaaatcattac-3’
MePCTC：5’-ttattttttcagtcccatgggaccgtcctg-3’
Ｃ．プロピオニウムＰＣＴ用：
CpPCTN：5’-gggggccatgggaaaggttcccattattaccgcagatgag -3’
CpPCTC：5’-ggggggctcgagtcaggacttcatttccttcagacccat-3’
Ｓ．アウレウスＰＣＴ用：
SpctN：5’-gtgccatggaacaaatcacatggcacgac-3’
SpctC：5’-cacgaattcatactttatgaattgattg-3’
　プラスミドｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造）をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩを用いて消化し、アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化した後、Ｍ．エルスデニ由来の前記ＤＮＡフラグメントを加えてライゲーションし、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを含む、約４．７ｋｂｐの組み換えプラスミドＰＴＶ１１８Ｎ Ｍ．Ｅ．－ＰＣＴを調製した。
　同様に、Ｃ．プロピオニウム及びＳ．アウレウスの各ＰＣＴ遺伝子を、それぞれｐＴＶ１１８Ｎベクター(宝酒造)のＮｃｏＩ－ＢａｍＨＩ、ＮｃｏＩ－ＥｃｏＲＩ間に挿入することで、発現プラスミドＰＴＶ１１８Ｎ Ｃ．Ｐ．－ＰＣＴ、ＰＴＶ１１８Ｎ Ｓ．Ａ．－ＰＣＴを作製した。
　Ｔａｋａｓｅら（Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００３年、第１３３巻、第１３９－１４５頁）に記載されている方法に従い、ＳＴＱＫをコードするＤＮＡを全て含むプラスミドｐＧＥＭＣ１（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢを調製した。
　ｐＧＥＭＣ１（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢをＢａｍＨＩで消化して、約６ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収し、６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ ＤＴＴ，０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰを含む３ｍＭ トリス酢酸緩衝液（ｐＨ７．９）中、２００ユニットのＴ４ポリメラーゼを３７℃で５分間作用させて、ＳＴＱＫをコードするＤＮＡ断片を得た。
　ｐＴＶ１１８Ｎ Ｍ．Ｅ．－ＰＣＴをＰｓｔＩで消化し、上記と同条件でＴ４ポリメラーゼを作用させた後、アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化した後、前記ｐｈａＣｍをコードするＤＮＡ断片をライゲーションして、ｐＴＶ１１８Ｎ Ｍ．Ｅ．－ＰＣＴのＳａｌＩサイトにＳＴＱＫをコードするＤＮＡを導入した、約９．６ｋｂｐのプラスミドｐＴＶ１１８Ｎ‐ＰＣＴ‐Ｃ１（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢを得た。ｐＴＶ１１８Ｎ‐ＰＣＴ－Ｃｌは、ｐＴＶ１１８Ｎ－ＰＣＴ－Ｃ１ＡＢのｐｈａＡ、ｐｈａＢ部分を除く領域をＰＣＲ法で増幅させ、その産物をセルフライゲーションして得た（図１）。大腸菌種Ｗ３１１０のコンピテントセルをｐＴＶ１１８Ｎ‐ＰＣＴ‐Ｃ１（ＳＴ／ＱＫ）を用いて形質転換した。
　また同様にして、発現プラスミドＰＴＶ１１８Ｎ　Ｃ．Ｐ．－ＰＣＴを用い、前記ｐｈａＣｍをコードするＤＮＡ断片を保持するｐＴＶ１１８Ｎ－Ｃ．Ｐ　ＰＣＴ－Ｃ１（ＳＴＱＫ）を取得し、大腸菌種Ｗ３１１０のコンピテントセルを形質転換した。
２）ポリマーの生産
　得られた形質転換体の培養は、ＬＢ寒天培地上で形成したアクティブコロニーを１００ｍｌ容三角フラスコに入った１０ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３０℃でＯＤ　０．６～１．０まで振盪培養（オリエンタル技研工業（株）製ＩＦＭ型，１３０ｒｐｍ）して生育した前培養菌液を、５００ｍｌ容三角フラスコに入った２００ｍｌの本培養用培地に１％容量接種し振盪培養を行った。
　前述した培養法により２００ｍｌ培養を行い、得られた培養液を５０ｍｌファルコンチューブで集菌（３０００×ｇ，５ｍｉｎ，ＲＴ）後、－８０℃で一晩凍結した。この凍結菌体を、凍結乾燥機（ＬＡＢＣＯＮＣＯ社製Ｍｏｄｅｌ　７７４００型）にて２日間乾燥した。
　乾燥菌体を耐圧試験管へ移し、菌体100mg当たり1mlのクロロホルムを添加して、95℃のウォーターバス中で3時間リフラックスした。リフラックス後のサンプルを室温に戻し、0.22μm PTFEフィルターでシリコン製遠心管へろ過し、菌体を取り除いた。抽出されたサンプルは、クロロホルムが完全になくなるまで室温で乾燥させた。この乾燥後のペレットにヘキサン2mlを加え、約1分間ボルテックスし、その後遠心（6,000×g、15分、RT）して上清を取り除いた。このヘキサンによる洗浄は2回行った。ドライアップ後のサンプルを、2mlのクロロホルムに溶解し、ガラス製バイアルビンに移してドライアップし、これをポリマー分析用サンプルとした。
３）ポリマーの分析
ｉ）ＧＰＣ
　２）で回収されたポリマー約１ｍｇにクロロホルムを１ｍＬ加え、これを０．２μｍＰＴＦＥフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）で濾過した溶液をサンプルとして、下記の条件でＧＰＣ測定を行った。
　　システム　：Ｓｈｉｍａｄｚｕ　Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ　ＧＰＣ　ｓｙｓｔｅｍ
　　カラム　　：ＴＳＫｇｅｌ－Ｓｕｐｅｒ　ＴＨＺ－Ｍ（６．０ｍｍ×１５０ｍｍ）
　　溶離液　　：ＣＨＣｌ３ 
　　流量　　　：０．８ｍＬ／分
　　温度　　　：４０°
　　検出　　　：１０Ａ　ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｄｅｔｅｃｔｏｒ
　　サンプル量：１０μＬ
　測定された分子量分布曲線を図２に示す。分子量較正曲線は標準ポリスチレンを用いて作成し、標準ポリスチレン分子量の換算値で分子量を表した。その結果、ポリマーの分子量（Ｍｗ）は２２，０００であった。
ｉｉ）ＧＣ／ＭＳ分析
　前述した培養法により２００ｍｌ培養を行い、得られた培養液を５０ｍｌファルコンチューブで集菌（３０００×ｇ，５ｍｉｎ，ＲＴ）後、－８０℃で一晩凍結した。この凍結菌体を、凍結乾燥機（ＬＡＢＣＯＮＣＯ社製Ｍｏｄｅｌ　７７４００型）にて２日間乾燥した。この乾燥菌体のうち１００ｍｇを耐圧試験管へ量り取り、クロロホルム１．６ｍｌを添加して一晩室温で静置した。この菌体／クロロホルム溶液に、メタノール硫酸（メタノール：硫酸＝17:3の混合液）１．６ｍｌ、内部標準１００μｌ（安息香酸１０ｍｇ／ＣＨＣｌ３１０ｍｌ）を添加し、９５℃のウォーターバス中で３時間リフラックスすることでメチル化を行った。メチル化終了後のサンプルは室温に戻し、Φ１８ｍｍのディスポ試験管に移した。ここに、ミリＱ水を８００μｌ加え、約３０秒撹拌した後、水層と溶媒層に分離するまで静置した。分離後、クロロホルム層をパスツールピペットで分取し、０．２２μｍ　ＰＴＦＥフィルターで２ｍｌ容バイアルビンへろ過し、分析に供した。
　ポリ乳酸の標品は、まず２０ｍｇのＰＬＡ－００２０（和光純薬工業（株）製、重量平均分子量２０，０００）を２０ｍｌ容バイアルビン中で１０ｍｌのクロロホルムに溶解し、このうち１ｍｌを耐圧試験管へ移し、クロロホルム０．６ｍｌ、メタノール硫酸１．６ｍｌ、内部標準１００μｌを添加し、９５℃のウォーターバス中で３時間リフラックスすることでメチル化を行った。メチル化終了後の標準サンプルは室温に戻し、Φ１８ｍｍのディスポ試験管に移した。ここに、ミリＱ水を８００μｌ加え、約３０秒間撹拌した後、水層と溶媒層に分離するまで静置した。分離後、パスツールピペットで２ｍｌ容バイアルビンへ移し、分析に用いた。
　ＧＣ／ＭＳ分析は下記の条件で行った。
　メチル化された生産物は、ＧＣ／ＭＳ（ＨＰ６８９０　Ｓｅｒｉｅｓ　ＧＣ　ｓｙｓｔｅｍ／５９７３　Ｍａｓｓ　ＳｅｌｅｃｔｉｖｅＤｅｔｅｃｔｏｒ）にＡｇｉｌｅｎｔ製カラムのＤＢ－１（１２２－１０Ｇ３　：１５０ｍｅｔｅｒｓ×０．２５ｍｍ×１ｍｍ）もしくはＤＢ－１（１２２－１０６３：　６０ｍｅｔｅｒｓ×０．２５ｍｍ×１ｍｍ）を用いて分析を行った。各カラム使用時の分析メソッドを下記に記す。
１２２－１０Ｇ３：　１５０℃で２分間ホールド、５℃／１分で昇温、３００℃で１０分ホールド
１２２－１０６３：　１２０℃で５分間ホールド、５℃／１分で昇温、３００℃で１０分ホールド
　上記条件での分析結果及び乳酸メチルのＭＳスペクトルを図３Ａ～Ｄに示す。なお、図３Ｄの結果のみ、クロロホルムを除去しないサンプルから取得されたものである。ＧＣ／ＭＳの結果より、２）で回収されたポリマーはＬＡをモノマー単位として含むことが確認された。
ｉｉｉ）ＮＭＲ分析
　２）で回収されたポリマーを重水素化クロロホルムに溶解してサンプルとし、３００ＭＨｚで１Ｈ－ＮＭＲ（図４）を測定した。その結果、２）で回収されたポリマーは乳酸をモノマー単位として含むことが判明した。
４）微生物内でのＰＣＴ発現及びラクトイルＣｏＡ合成
　１）で作成した組み換えプラスミドＰＴＶ１１８Ｎ Ｍ．Ｅ．－ＰＣＴ、ＰＴＶ１１８Ｎ Ｃ．Ｐ．－ＰＣＴ、及びＰＴＶ１１８Ｎ Ｓ．Ａ．－ＰＣＴを用いて、大腸菌種Ｗ３１１０のコンピテントセルを形質転換した。
　各菌株を前培養後、２００ｍｌ ＬＢ／２Ｌ ｆｌａｓｋに２％で植菌し、３７℃、１８０ｒｐｍで３時間培養した。ＯＤ６００＝０．５付近で１０ｍＭ ＩＰＴＧにより発現誘導し、３０℃、８０ｒｐｍで６時間培養した。次に遠心により菌体を回収し、Ｍ９（＋１．５％Ｇｌｕｃｏｓｅ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ パントテン酸Ｃａ）中３７℃で培養（ＯＤ＝２０，３ｍｌ）培養し、適宜サンプリングを行った。
　菌体を回収（１×１０５ｃｅｌｌに相当量）し、試料調製を行った（ｎ＝３）。サクションフィルターシステムにアプライし、ミリＱ水で２回洗浄した。ＭｅＯＨ溶液２ｍｌ入りのシャーレにフィルター（裏返）を入れ、室温で１０分間放置後、１．６ｍｌのＭｅＯＨ溶液を遠沈管に移送し、１．６ｍｌのクロロホルム及び６４０ｕｌのミリＱ水を混合し、懸濁した。４６００ｇ、４℃、５ｍｉｎ遠心後、水＋ＭｅＯＨ層１．５ｍｌを５ｋ限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ社製）にて約２時間遠心ろ過した。ろ液を回収し凍結乾燥した後、二次内部標準物質を含むミリＱ水により２００倍濃縮溶解しＣＥ－ＭＳ分析に供した。ＣＥ－ＭＳ分析条件はＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ　２００２，７４，　６２２４－６２２９「Ｐｒｅｓｓｕｒｅ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　ｆｏｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ　Ａｎｉｏｎｓ」に準じた。その結果を図６に示す。
　図６から、Ｓ．アウレウス由来のＰＣＴ遺伝子は、Ｍ．エルスデニ由来のＰＣＴ遺伝子に比較して、培養初期に高い乳酸ＣｏＡ生産性を示すことが明らかになった。
５）ポリ乳酸生産性に及ぼすＰＣＴ遺伝子の影響
　図７は上記ｉｉ）ＧＣ／ＭＳ分析からの乳酸誘導体の定量結果を示している。
　図７の結果から、Ｍ．エルスデニ由来のＰＣＴは、Ｃ．プロピオニウム由来のＰＣＴに比較して、ポリ乳酸の生産性により良好に寄与することが明らかになった。
＜比較例＞
　実施例１で作製したプラスミドｐＴＶ１１８Ｎ‐ＰＣＴ‐Ｃ１（ＳＴ／ＱＫ）に含まれるＳＴＱＫをコードする塩基配列を、下記のタンパク質をコードする塩基配列に置き換えた発現ベクターを作製した。当該発現ベクターの構成を纏めて図５に示す。
　ｐＴＶ１１８Ｎ‐ＰＣＴ‐Ｃ１（ＷＴ）：シュードモナスｓｐ．６１－３のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素（野性型、配列番号１）
　大腸菌Ｗ３１１０のコンピテントセルをｐＴＶ１１８Ｎ－ＰＣＴ－Ｃ１を用いて形質転換し、得られた形質転換体の培養は、ＬＢ寒天培地上で形成したアクティブコロニーを１００ｍｌ容三角フラスコに入った１０ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３０℃でＯＤ　０．６～１．０まで振盪培養（オリエンタル技研工業（株）製ＩＦＭ型，　１３０ｒｐｍ）して生育した前培養菌液を、５００ｍｌ容三角フラスコに入った２００ｍｌの本培養用培地に１％容量接種し振盪培養を行った。
　前述した培養法により２００ｍｌ培養を行い、得られた培養液を５０ｍｌファルコンチューブで集菌（３０００×ｇ，５ｍｉｎ，ＲＴ）後、－８０℃で一晩凍結した。この凍結菌体を、凍結乾燥機（ＬＡＢＣＯＮＣＯ社製Ｍｏｄｅｌ　７７４００型）にて２日間乾燥した。この乾燥菌体のうち１００ｍｇを耐圧試験管へ量り取り、クロロホルム１．６ｍｌを添加して一晩室温で静置した。この菌体／クロロホルム溶液に、メタノール硫酸１．６ｍｌ、内部標準１００μｌ（安息香酸１０ｍｇ／ＣＨＣｌ３１０ｍｌ）を添加し、９５℃のウォーターバス中で３時間リフラックスすることでメチル化を行った。メチル化終了後のサンプルは室温に戻し、Φ１８ｍｍのディスポ試験管に移した。ここに、ミリＱ水を８００μｌ加え、約３０秒撹拌した後、水層と溶媒層に分離するまで静置した。分離後、クロロホルム層をパスツールピペットで分取し、０．２２μｍ　ＰＴＦＥフィルターで２ｍｌ容バイアルビンへろ過し、ＧＳ／ＭＳ分析に供した。
　ＧＳ／ＭＳ分析は、上記実施例１の記載と同様にして行った。図３Ｂに示す結果から、ｐＴＶ１１８ＮＰＣＴＣｌ（ＷＴ）を用いた場合、乳酸を含むポリマーはほとんど生産されないことが確認された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (12)

  1. 　プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質、及び下記のａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質を有する組み換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する工程１）：
    　ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸の少なくとも１以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
    　ｂ）ａ）に規定されるタンパク質において、さらに１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失若しくは置換され、又は1若しくは数個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列、
    及び、工程１）の培養物から前記ポリ乳酸を回収する工程２）
    を含む、ポリ乳酸の製造方法。
  2. 　プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列である、請求項１に記載の製造方法。
  4. 　ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３２５番目及び４８１番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列である、請求項１に記載の製造方法。
  5. 　ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３２５番目のＳｅｒがＴｈｒに、４８１番目のＧｌｎがＬｙｓにそれぞれ置換されたアミノ酸配列である、請求項１に記載の製造方法。
  6. 　前記タンパク質のいずれもが、微生物に導入された組み換え発現ベクターにコードされているタンパク質である、請求項１に記載の製造方法。
  7. 　プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質、及び下記のａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質を有する組み換え微生物。
    　ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸の少なくとも１以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
    　ｂ）ａ）に規定されるタンパク質において、さらに１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目以外の1若しくは数個のアミノ酸が欠失若しくは置換され、又は1若しくは数個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列
  8. 　プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列である、請求項７に記載の組み換え微生物。
  9. 　プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列である、請求項７に記載の組み換え微生物。
  10. 　ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３２５番目及び４８１番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列である、請求項７に記載の組み換え微生物。
  11. 　ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３２５番目のＳｅｒがＴｈｒに、４８１番目のＧｌｎがＬｙｓにそれぞれ置換されたアミノ酸配列である、請求項７に記載の組み換え微生物。
  12. 　前記タンパク質をコードする遺伝子を有する組み換え発現ベクターが導入されていることを特徴とする請求項７に記載の組み換え微生物。
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