KR20010095189A

KR20010095189A - 폴리히드록시알카노에이트 합성효소 및 이 효소를 코딩하는 유전자

Info

Publication number: KR20010095189A
Application number: KR1020010017032A
Authority: KR
Inventors: 야노테츠야; 이마무라타께시; 수다사까에; 혼마츠토무
Original assignee: 미다라이 후지오; 캐논 가부시끼가이샤
Priority date: 2000-03-30
Filing date: 2001-03-30
Publication date: 2001-11-03
Also published as: KR100479945B1; US20010046692A1; EP1172438A1; ATE469227T1; JP3848047B2; US20030049806A1; DE60142206D1; JP2001275673A; US6485951B2; EP1172438B1

Abstract

신규한 측쇄구조를 가진 폴리히드록시알카노에이트(PHA)를 생산하는 미생물에 유래하는, 신규한 PHA합성요소와 그 아미노산배열을 코드하는 DNA를 제공한다. 슈도모나스 젯세니이 P161주(Pseudomonas jessenii P161: FERM BP-7376)에 유래하는 2종의 PHA합성효소단백질(배열번호: 1 및 배열번호: 3)과 상기 2종의 PHA합성효소를 각각 코드하는 PHA합성효소유전자(배열번호: 2 및 배열번호: 4)를 제공한다. 재조합체 미생물에는 PHA합성능이 부여된다

Description

폴리히드록시알카노에이트 합성효소 및 이 효소를 코딩하는 유전자{Polyhydroxyalknoate Synthase and Gene Encoding the Same Enzyme}

본 발명은 폴리히드록시알카노에이트(이하, "PHA"라 함)합성효소, 그 PHA합성효소를 코드하는 유전자, 그 유전자를 포함하는 재조합벡터, 그 재조합벡터에 의해 형질변환되고, PHA합성효소의 발현능을 가진 형질변환체, 이 형질변환체를 이용한 PHA합성효소의 생산방법, 및 이 형질변환체를 이용한 PHA의 제조방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 폴리히드록시알카노에이트의 생산능을 가진 미생물 유래의 PHA합성효소, 및 그 PHA합성효소의 재조합 발현에 이용되는 PHA합성효소를 코드하는 유전자에 관한 것이다.

이제까지 많은 미생물이 폴리-3-히드록시낙산(PHB) 또는 기타의 PHA를 생산해서, 균체 내에 축적하는 것이 보고되어 왔다("생분해성 플라스틱핸드북", 생분해성 플라스틱연구회편, (주)NTS, P178-197). 이들 폴리머는 종래의 플라스틱과 마찬가지로 용융가공 등에 의해 각종 제품의 생산에 이용할 수 있다. 또한, 이들은 생분해성이 있기 때문에 자연계에서 미생물에 의해 완전분해된다고 하는 이점을 가지고 있어, 종래의 많은 합성고분자화합물과 같이 자연환경에 잔류해서 오염을 야기하는 일은 없다. 또한 생체적합성도 뛰어나서, 의료용 연질부재 등으로서의 응용도 기대되고 있다.

이와 같은 미생물에 의해 생산된 PHA는 그 생산에 사용하는 미생물의 종류나 배지조성, 배양조건 등에 따라 여러 가지 조성이나 구조의 것으로 될수 있는 것이 알려져 있으며, 이제까지 주로 PHA의 물성의 개량이라고 하는 관점으로부터 이와 같은 조성이나 구조의 제어에 관한 연구가 행해져 왔다.

예를 들면, 알칼리게네스 유트로푸스 H16주(Alcaligenes eutropus H16, ATCC No. 17699) 및 그 변이주는 그 배양시의 탄소원을 변화시킴으로써 3-히드록시낙산 (3HB)과 3-히드록시길초산(3HV)과의 공중합체를 여러 가지 조성비로 생산하는 것이 보고되어 있다(일본국 특표평6-15604호 공보, 동 특표평7-14352호 공보, 동 특표평8-19227호 공보 등).

또한, 일본특허공보 제 2642937호에서는 슈도모나스 올레오보란스 ATCC29347주(Pseudomonas oleovorans ATCC29347)에 탄소원으로서 비환상지방족탄화수소를 부여함으로써 탄수소가 6에서 12까지의 3-히드록시알카노에이트를 모노머유닛으로 하는 PHA를 생산하는 것이 기재되어 있다.

일본 특개평5-74492호 공보에는 메틸로박테리움속(Methylobacterium sp.), 파라코커스속(Paracoccus sp.), 알칼리게네스속(Alcaligenes sp.), 슈도모나스속 (Pseudomonas sp.)의 미생물을 탄소수 3에서 7의 제 1급 알콜에 접촉시킴으로써 3HB가 3HV와의 공중합체를 생산하는 방법이 기재되어 있다.

일본 특개평5-93049호 공보 및 동 특개평7-265065호 공보에는 아에로모나스 캬비에(Aeromonas caviae)를 올레인산이나 올리브유를 탄소원으로서 배양함으로써 3HB와 3-히드록시헥산산(3HHx)의 2성분 공중합체를 생산하는 것이 기재되어 있다.

일본 특개평9-191893호 공보에는 코마모나스아시도보란스IFO13852주(Comamonas acidovorans IFO13852)가 탄소원으로서 글루콘산 및 1, 4 부탄디올을 사용한 배양에 의해 3HB와 4-히드록시낙산을 모노머유닛으로서 가진 폴리에스테르를 생산하는 것이 기재되어 있다.

또한, 어떤 미생물에서는 여러 가지 치환기, 예를 들면 불포화탄화수소, 에스테르기, 아릴기(방향환기), 시아노기, 할로겐화탄화수소, 에폭시드 등이 도입된 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다. 최근, 이와 같은 수법에 의해서 미생물에 의해 생산되는 PHA의 물성개량을 목표로 하는 시도도 행해지기 시작하고 있다. 예를 들면 Makromol. chem., 191, 1957-1965, 1990, Macromolecules, 24,5256-5260, 1991, Chirality, 3, 492-494, 1991 등에는 슈도모나스 올레오보란스가 3-히드록시-5-페닐길초산(3HPV)을 모너머유닛으로서 포함하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있어, 3HPV가 포함되는 것에 기인한다고 생각되는 폴리머물성의 변화가 인정되고 있다.

이상과 같이, 미생물에 의해 생산되는 PHA에 있어서는 그 생산에 사용하는 미생물의 종류나 배지조성, 배양조건 등을 변화시킴으로써 여러 가지 조성 및 구성의 조합이 얻어지고 있다. 그러나, 그 미생물 자체의 PHA합성효소는 각각의 미생물에 따라서 그 기질특성이 크게 다르다. 그에 따라 공지의 미생물 또는 그와 같은 공지의 미생물이 가진 PHA합성효소만으로는 여러 가지 사용목적에 적합한 각종 모너머단위를 조성에 포함하는 PHA를 생산하는 것은 곤란하였다.

한편, 상술한 바와 같이, 여러 가지 치환기를 측쇄(側鎖)에 도입한 PHA는 도입한 치환기의 특성 등에 기인해서 극히 유용한 기능ㆍ특성을 구비한 "기능성 폴리머"로서의 전개도 기대할 수 있다. 따라서, 그와 같은 기능성과 생분해성을 겸비한 뛰어난 유용성을 가진 폴리머를 생산해서, 균체 내에 축적할 수 있는 미생물의 탐색, 개발은 극히 유용하고 중요하다. 또한, 이 높은 유용성을 가진 PHA의 생산에 관한 PHA합성효소의 특정, 그 PHA합성요소를 코드하는 유전자를 취득하는 것은 목적으로 하는 PHA의 생산능을 가진, 신규한 형질전환미생물의 생산을 가능하게 한다. 즉, PHA합성효소를 코드하는 유전자를 포함하는 재조합벡터를 구축하고, 이 재조합벡터에 의해 형질전환된 형질전환미생물을 얻고, 이 형질전환미생물을 이용한 PHA의 제조, 또는 재조합형 PHA합성효소를 발현시키는 방법에의 적용을 가능하게 한다. 이와 같이, 형질전환미생물을 이용해서 목적하는 PHA를 제조하는 것은 PHA의 생산성을 높이는데 있어서 극히 유용한 수단을 제공하고, PHA의 이용을 촉진함에 있어서도 중요하다고 생각된다.

본 발명은 상기의 과제를 해결하는 것으로, 본 발명의 목적은 신규한 측쇄구조를 가진 PHA를 생산해서, 그 균체 내에 축적하는 능력을 가진 신규한 미생물을 탐색하고, 그 신규한 PHA생산능에 관련하는 효소단백질, 즉 신규한 PHA합성효소를 특정하고, 또한 그 아미노산배열을 코드하는 유전자를 해명하는 데 있다. 더 구체적으로는, 본 발명의 목적은 신규한 측쇄구조를 가진 PHA를 생산하는 미생물에 유래하는 신규한 PHA합성효소와 그 아미노산배열을 코드하는 DNA를 제공하는 데 있다. 또한, 본 발명은 제공되는 PHA합성효소를 코드하는 DNA를 도입해서, 숙주미생물의 형질전환에 이용되는 재조합벡터, 이 재조합벡터를 사용해서 형질전환된 형질전환미생물의 제공을 그 목적으로 한다. 또한, 얻어진 형질전환미생물에 있어서, 재조합형 PHA합성효소의 발현ㆍ생산을 행하는 방법, 및 형질전환미생물을 이용해서 목적하는 PHA를 제조하는 방법의 제공도 본 발명은 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환미생물에 있어서의 재조합형 PHA합성효소의 발현시에 효소활성을 손상시키지 않는 범위에서 PHA합성효소의 아미노산배열을 개변시킨 개변형의 PHA합성효소, 그 개변아미노산배열을 코드하는 DNA의 제공도 그 목적에 포함하는 것이다.

도 1은 슈도모나스 젯세니이 P161주((Pseudomonas jessenii P161: FERM BP-7376) 유래의 제 1의 PHA합성효소의 아미노산배열을 표시하는 도면;

도 2는 슈도모나스 젯세니이 P161주((Pseudomonas jessenii P161: FERM BP-7376) 유래의 제 1의 PHA합성효소의 아미노산배열을 표시하는 도면;

도 3은 슈도모나스 젯세니이 P161주((Pseudomonas jessenii P161: FERM BP-7376) 유래의 제 2의 PHA합성효소의 아미노산배열을 표시하는 도면;

도 4는 슈도모나스 젯세니이 P161주((Pseudomonas jessenii P161: FERM BP-7376) 유래의 제 2의 PHA합성효소의 아미노산배열을 표시하는 도면.

상기의 과제를 해결하기 위해서 본 발명자들은 디바이스재료나 의료용재료 등으로서 유용한, 신규한 측쇄구조를 가진 PHA의 개발을 목표로 해서, 소망의 PHA를 생산해서 균체 내에 축적하는 능력을 가진 신규한 미생물의 탐색을 행했다. 또한, 본 발명자들은 예의 연구를 거듭해서, 탐색한 신규한 PHA를 생산하는 신규 미생물에 대해서 그 신규한 PHA의 생산에 관한 PHA합성효소의 특정, 및 그 PHA합성효소를 코드하는 유전자의 취득을 행했다. 또한, 본 발명자들은 취득된 PHA합성효소의 유전자를 포함하는 재조합벡터의 구축, 이 재조합벡터에 의한 숙주미생물의 형질변환, 얻어진 형질전환미생물에 있어서의 재조합형 PHA합성효소의 발현, 그에 수반하는 소망의 PHA의 생산의 확인을 행했다.

상기 탐색과정에서, 본 발명자들은 화학식 (Ⅱ):

으로 표시되는 5-(4-플루오로페닐)길초산(FPVA)을 합성하고, 이것을 원료(기질)로 해서 대응하는 화학식(Ⅲ):

으로 표시되는 3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산(3HFPV)으로 변환하고,이 3HFPV에 유래하는 화학식(Ⅰ):

로 표시되는 모노머유닛을 포함하는 신규한 PHA를 생산해서 균체 내에 축적하는 능력을 가진 미생물을 토양으로부터 새로이 분리했다. 이 새로이 분리한 미생물을 P161주라 했다. 본 발명자들은 상기 FPVA로부터 3HFPV로의 변환을 행하는 효소활성 이외에 이 P161주는 화학식(Ⅳ):

로 표시되는 4-페녹시낙산(PxBA)을 원료(기질)로 해서, 대응하는 화학식(Ⅴ):

로 표시되는 3-히드록시-4-페녹시낙산(3HPxB)으로 변환하고, 이 3HPxB에 유래하는 화학식(Ⅵ):

로 표시되는 모노머유닛을 포함하는 PHA를 생산해서 균체 내에 축적하는 능력도 가진 것을 발견했다. 또한, 이제까지 PxBA를 기질로 한 3HPxB를 모노머유닛으로서 포함하는 PHA의 미생물생산의 보고예는 없으며, 또한, 3HPxB만을 페녹시기함유 모너머유닛으로서 포함하는 PHA의 미생물생산에 관한 보고예도 없다.

또한, PxBA 이외의 기질을 사용해서, 3HPxB에 유래하는 화학식(Ⅵ)의 모노머유닛을 포함하는 PHA를 생산해서 균체 내에 축적하는 미생물은 보고예로서는 Macromolecules, 29, 3432-3435, 1996에 기재된 8-페녹시옥탄산(PxOA)을 기질로 해서, 슈도모나스 올레오보란스를 사용한 방법이 있다. 그러나, 이 슈도모나스 올레오보란스는 8-페녹시옥탄산(PxOA)을 기질로서 사용한다고 하는 점에서, PxBA를 기질로서 대응하는 3HPxB에 유래하는 화학식(Ⅵ)의 모노머유닛을 포함하는 PHA합성을 행하는 P161주에 있어서의 효소반응과는 전혀 다르다. 또한, 생산되는 PHA의 조성에 관해서도 전술한 슈도모나스 올레오보란스를 사용한 보고예의 방법에서는 기질인 PxOA에 대응하는 3-하드록시-8-페녹시옥탄산과, 그 대사산물 유래의 부생물인 3-히드록시-6-페녹시헥산산 및 목적으로 하는 3HPxB의 3종류의 모노머유닛으로 이루어진 공중합체가 생산되고 있다. 그에 대해서, P161주를 기질 PxBA에 작용시키는 방법에서는 PxBA유래의 3HPxB만을 페녹시기함유모너머유닛으로서 포함하는 PHA가 생산된다. 이 얻어지는 PHA의 조성의 면도 고려하면, 전술한 보고예에서 사용되고 있는 슈도모나스 올레오보란스와 이 P161주와는 PHA합성효소의 기질특이성에 근본적인 차이가 존재한다고 판단할 수 있다. 즉, P161주를 생산하는 PHA합성효소는 3HPxB를 모너머유닛으로서 포함하는 PHA의 생산에 의해 바람직한 것이라고 판단된다.

또한, 본 발명자들은 이 P161주는 화학식(Ⅶ):

로 표시되는 6-페닐헥산산(PHxA)을 원료(기질)로 해서, 대응하는 화학식(Ⅷ):

로 표시되는 3-히드록시-6-페닐헥산산(3HPHx)으로 변환하고, 이 3HPHx에 유래하는 화학식(Ⅸ):

으로 표시되는 모노머유닛을 포함하는 신규한 PHA를 생산해서 균체 내에 축적하는 능력을 가지는 것도 발견했다.

이 P161주의 균학적 성질을 열거하면 이하와 같다.

<P161주의 균학적 성질>

형태학적 성질

세포의 형과 크기: 구형상, φ0.6㎛

간(桿)형상, 0.6㎛×1.5㎛~2.0㎛

세포의 다형성 : 있음(신장형)

운동성 : 있음

포자형성 : 없음

그램염색성 : 음성

콜로니 형상 : 원형, 전체 가장자리 매끄러움, 저(低)볼록형상, 표층매끄러움, 담황색

생리학적 성질

카탈라제 : 양성

옥시다제 : 양성

O/F시험 : 산화형

초산염의 환원 : 양성

인돌의 생성 : 음성

포도당의 산성화 : 음성

알기닌 디히드로라제: 양성

우레아제 : 음성

에스쿨린 가수분해: 음성

젤라틴 가수분해 : 음성

β-갈락토시다제 : 음성

King's B 한천에서의 형광색소 생산: 양성

기질 자화능

포도당 : 양성

L-아라비노스 : 양성

D-만노스 : 양성

D-만니톨 : 양성

N-아세틸-D-글루코사민: 양성

말토스 : 음성

글루콘산 칼륨 : 양성

n-카프린산 : 양성

아디핀산 : 음성

d1-말산 : 양성

구연산 나트륨 : 양성

초산페닐 : 양성

이상의 균학적 성질로부터 버제스 메뉴얼 오브 시스터매틱 박테리올로지, 제1권(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Volume 1)(1984년), 및 버제스 메뉴얼 오브 디터미네이티브 박테리올로지(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology) 제 9판(1994년)에 의거해서 귀속을 시도한 바, 이 P161주는 슈도모나스속(Pseudomonas sp.)에 속한다고 판정했지만, 상기의 균학적 성질로부터는 분류학상의 위치를 확정할 수는 없었다.

따라서, 유전적 성질로부터 분류를 행하기 위해서, 본 발명자들은 P161주의 16S rRNA의 염기배열을 결정하고(배열번호: 5로 표시), 공지의 슈도모나스속미생물의 16S rRNA의 염기배열과 그 상동성(相同性)을 비교했다. 그 결과, P161주와 기지의 슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii)와의 사이에서 16Sr RNA의 염기배열의 상동성이 극히 높은 것이 판명되었다. 또한, System. Appl. Microbiol.,20, 137-149(1997), 및 System. Appl. Microbiol., 22, 45-58(1999)에 기재된 기지의 슈도모나스 젯세니이 균주에 대해서 보고되어 있는 균학적 정질과 P161주의 균학적 성질을 대비시키면 상당한 상동성이 인정되었다. 이상의 결과로부터 P161주는 슈도모나스 젯세니이에 속하게 하는 것이 타당하다고 판단되었기 때문에 슈도모나스 젯세니이 P161주(Pseudomonas jessenii P161)라고 명명했다. 또한, 슈도모나스 젯세니이 (Pseudomonas jessenii)에 있어서, 이 P161주가 표시하는 PHA생산능을 가진 균주의 보고는 없으므로, 본 발명자들은 P161주를 신규한 미생물로 판단했다. 또한, 본원 출원인에 의해 슈도모나스 젯세니이 P161주(Pseudomonas jessenii P161)는 기탁번호 "FERM P-17445"로 해서 통상산업성ㆍ공업기술원ㆍ생명공학공업기술연구소(특허 미생물 기탁센터)에 기탁되어 있다.

본 발명자들은 이 신규 미생물 P161주로부터 그 PHA합성효소의 유전자를 클로닝하는 데에 성공해서, 그 염기배열을 결정했다. 또한, 본 발명자들은 이 유전자가 코드되어 있는 PHA합성요소의 아미노산배열을 해명했다. 이상의 지견에 의거해서 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 PHA합성효소는 배열번호: 1로 표시하는 아미노산배열을 가진 폴리히드록시알카노에이트합성효소, 또는 배열번호: 3으로 표시하는 아미노산배열을 가진 폴리히드록시알카노에이트합성효소이다. 또한, 본 발명의 PHA합성효소는, 상기 배열번호: 1호 표시하는 아미노산배열을 실질적으로 유지하고, 그 폴리히드록시알카노에이트합성효소활성을 손상시키지 않는 범위에서 아미노산의 삭제, 치환 또는 부가가 행해진 개변아미노산배열을 가진 PHA합성효소 또는 상기 배열번호: 3으로 표시하는 아미노산배열을 실질적으로 유지하고, 그 폴리히드록시알카노에이트합성효소활성을 손상시키지 않는 범위에서 아미노산의 삭제, 치환 또는 부가가 행해진 개변아미노산배열을 가진 PHA합성효소로 할 수 있다.

한편, 본 발명의 PHA합성효소 유전자는 상기한 배열번호: 1로 표시하는 아미노산배열, 또는 그 개변아미노산배열을 코드하는 DNA를 포함하는 폴리히드록시알카노에이트합성효소 유전자, 또는 마찬가지로 상기한 배열번호: 3으로 표시하는 아미노산배열, 또는 그 개변아미노산배열을 코드하는 DNA를 포함하는 폴리히드록시알카노에이트 합성효소 유전자이다. 특히, 배열번호: 1로 표시하는 아미노산배열을 코드하는 DNA로서 배열번호: 2로 표시하는 DNA염기배열을 포함하는 PHA합성효소 유전자, 및 배열번호: 3으로 표시하는 아미노산배열을 코드하는 DNA로서 배열번호: 4로표시하는 DNA염기배열을 포함하는 PHA합성효소 유전자는 각각 P161주의 게놈유전자에 유래하는 본 발명의 PHA합성효소 유전자의 일태양이다.

본 발명은 또한 폴리히드록시알카노에이트합성효소 유전자로서 상기한 아미노산배열을 코드하는 유전자DNA를 함유하는 재조합벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 숙주에 적합시킨 재조합벡터도입에 의해 형질전환된 형질전환미생물을 제공한다. 또한, 본 발명은 제조합벡터를 도입한 상기한 형질전환 미생물을 폴리히드록시알카노에이트합성효소의 기질을 포함하는 배지에서 배양해서, 얻어지는 배양물로부터 폴리히드록시알카노에이트를 취득하는 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 재조합벡터를 도입한 상기한 형질전환미생물을 배양해서, 상기 형질전환미생물에 폴리히드록시알카노에이트를 산출시키는 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트의 생산방법을 제공한다.

예를 들면, 본 발명의 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법은, 상기한 형질전환미생물을 이용해서 3HFPV에 유래하는 화학식(Ⅰ)로 표시되는 모노머유닛을 포함하는 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법, 3HPxB에 유래하는 화학식(Ⅵ)으로 표시되는 모노머유닛을 포함하는 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법, 또는 3HPHx에 유래하는 화학식(Ⅸ)으로 표시되는 모노머유닛을 포함하는 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법과 같이 P161주 유래의 폴리히드록시알카노에이트합성효소에 특징적인 기질특이성을 이용하는 제조방법으로 하면 바람직한 것이다.

(바람직한 실시형태의 상세한 설명)

본 발명의 PHA합성효소는 본 발명자들에 의해 분리된 신규한 미생물, 슈도모나스 젯세니이 P161주(Pseudomonas jessenii P161: FERM BP-7376)에 유래하는 효소단백질이다. 즉, 이것은 5-(4-플루오로페닐)길초산(FPVA)을 대응하는 3-히드록시 -5-(4-플루오로페닐)길초산(3HFPV)으로 변환하고, 또한, 4-페녹시낙산(PxBA)을 대응하는 3-히드록시-4-페녹시낙산(3HPxB)으로 변환하거나, 6-페닐헥산산(PHxA)을 대응하는 3-히드록시-6-페닐헥산산(3HPHx)으로 변환해서, 각각 대응하는 모노머유닛을 포함하는 PHA의 합성에 관한 효소활성을 가진다.

이하, 본 발명의 PHA합성효소와 그것을 코드하는 유전자에 대해 더 구체적으로 설명한다.

본 발명자들은 P161주로부터 상기한 기질특이성을 표시하는 PHA합성효소로 번역되는 유전자의 클로닝을 행하고, 적어도 2종의 아미노산배열을 가진 PHA합성효소의 존재를 확인했다. 즉, 본 발명의 PHA합성효소는, P161주의 염색체유전자 중에 있어서는, 배열번호: 2로 기재하는 염기배열의 DNA에 의해 코드되어 있는, 배열번호: 1로 기재하는 아미노산배열을 가진 PHA합성효소, 및 배열번호: 4로 기재하는 염기배열의 DNA에 의해 코드되어 있는, 배열번호: 3으로 기재하는 아미노산 배열을 가진 PHA합성효소, 이 2종류의 효소가 존재한다. 상기 배열번호: 2로 기재하는 염기배열의 유전자 DNA는 하기하는 순서에 의해 클로닝된다.

우선, PHA합성효소는 염색체유전자로부터 번역되는 효소단백질이기 때문에 목적으로 하는 PHA합성효소를 내재하고 있는 염색체DNA를 취득한다. P161주의 균체로부터 염색체DNA의 분리에는 공지의 분리방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, P161주를 LB배지, 또는 M9배지에 적당한 탄소원을 추가한 것 등으로 배양한 후, 균체를 파쇄해서, 예를 들면 마머러의 방법(Journal of Molecular Biology, 3권, 208쪽, 1961년) 등에 의해 염색체DNA를 조제한다.

이어서, 상기 방법에 의해 얻어진 염색체 DNA로부터 유전자 라이브러리를 제작한다. 염색체DNA를 적당한 제한효소(예를 들면, Sau 3AI 등)를 사용해서 분해하고 ,적당한 단편길이를 가진 분해물에 대해서, 이것을 연결가능한 제한효소(예를 들면, BamHI 등)로 절단한 벡터에 연결해서 유전자라이브러리를 제작한다.

라이브러리의 제작에 이용하는 벡터에 따라서 적당한 단편길이는, 통상의 플라스미드벡터를 사용할 때는 4000~25000염기쌍 정도, 코스미드 또는 파지벡터를 사용할 때는 15000~30000염기쌍 정도로한다. 적당한 길이의 DNA단편을 회수하는 방법으로서는 자당밀도구배를 사용하는 방법이나, 아가로스겔을 사용하는 방법(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory 출판 (1982년))등 공지의 방법을 사용하면 된다.

통상, 유전자라이브러리에 있어서의 숙주미생물로는 대장균을 이용하기 때문에 벡터는 숙주미생물(대장균)에 있어서 자율적으로 증식할 수 있는 파지벡터 또는 플라스미드벡터가 사용된다. 범용되는 파지벡터 또는 코스미드벡터로서는, 예를 들면pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, charon4A, charon21A 등을 들 수 있다. 또한, 다용되는 플라스미드벡터로서는, 예를 들면 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pET계 등을 들 수 있다. 기타, 대장균에 추가해서 슈도모나스속 등의 복수의 숙주미생물에서 자율적 증식이 가능한 벡터 등의 각종 셔틀벡터를 사용할 수 있다. 이 벡터에 대해서도 그것과 연결하는 염색체DNA에 맞추어서 마찬가지로 적당한 제한효소로 절단함으로써 소망의 단편을 얻을 수 있다.

염색체DNA단편과 벡터단편과의 연결은 DNA리가제를 사용하면 되며, 예를 들면 시판의 라이게이션 키트(다카라 주조(주) 등)를 사용해서 행할 수 있다. 이와 같이, 예를 들면 여러 가지 염색체DNA단편과 플라스미드벡터단편을 연결시켜, 여러가지 DNA단편을 포함하는 재조합플라스미드의 혼합물(이하, "유전자라이브러리"라 함)을 제작한다.

여기서 유전자라이브러리제작에 있어서, 적당한 길이의 염색체DNA단편을 사용하는 방법 외에 P161주로부터 전 mRNA를 추출ㆍ정제하고, 역전사효소를 이용해서 cDNA단편을 합성하는 방법(Moleular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory 출판, 1982년)을 이용할 수 있다. 또한, 유전자라이브러리에 조제한 벡터를 이용해서 대장균에 한 번 형질전환 또는 형질도입한 후, 숙주대장균을 배양해서 유전자라이브러리를 대량으로 증폭하는 것도 가능하다(Moleular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory 출판, 1982년).

유전자DNA단편을 포함하는 재조합벡터의 숙주미생물로의 도입은 공지의 방법에 의해 행한다. 예를 들면, 숙주미생물로 대장균을 사용하는 경우에는 염화칼슘법(Journal of Molecular Biology, 53권, 159쪽, 1970년), 염화루비듐법(Methods in Enzymology, 68권, 253쪽, 1979년)이나 일렉트로포레이션법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 1.8.4쪽, 1994년) 등을 이용해서 재조합플라스미드벡터를 도입할 수 있다. 또한, 코스미드벡터나 파지벡터를 이용할 경우, 숙주대장균의 형질도입에 대해서는, 인비트로 패키징법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 5.7.1쪽, 1994년) 등을 사용할 수 있다. 기타, 재조합벡터를 유지하는 균주와의 접합전달에 의한 방법도 벡터를 유지하는 균주의 취득에 이용가능하다.

다음에, 상기 유전자라이브러리로부터 P161주의 PHA합성효소유전자를 포함하는 DNA단편을 얻기 위한 프로브를 조제한다.

공지의 미생물에 있어서, 그 PHA합성효소유전자에 대해서, 이미 몇 개의 염기배열이 보고되어 있다(Peoples, O. P. and Sinskey, A. J., J. Biol. chem., 264, 15293(1989);Huisman, G. W. et al., J. Biol. chem., 266, 2191(1991);Pieper, U. et al., FEMS Microbiol. Lett., 96, 73(1992);Timm, A. and Steinbuchel, A., Eur, J. Biochem., 209, 15(1992);Matsusaki, H. et al., J. Bacteriol., 180, 6459(1998)). 이들 보고되어 있는 염기배열을 비교해서 염기배열의 보존도가 높은 영역을 선택해서, 폴리메라제연쇄반응(이하, "PCR"이라 함)에 사용하는 프라이머용의 올리고누클레오티드를 설계한다. PHA합성효소유전자의 공통성을 이용하는, 이와 같은 프라이머용 올리고누클레오티드로서는 Timm, A. and Steinbuchel, A., Eur, J. Biochem., 209, 15(1992)에 의해 보고된 염기배열을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 올리고누클레오티드는 설계된 염기배열에 따라서, 예를 들면 아머샴-파마시아 바이오텍의 커스톰 합성서비스 등의 상업적인 DNA합성장치 등을 이용해서 합성이 가능하다.

본 발명의 P161주 유래의 PHA합성효소유전자에 대해서는, 배열번호: 6에 기재하는 염기배열 및 배열번호: 7에 기재하는 염기배열의 합성DNA를 설계했다.

다음에, 설계한 올리고누클레오티드를 프라이머로 하고, P161주의 염색체DNA를 주형으로 해서 폴리메라제연쇄반응(PCR)을 행해서, PCR증폭단편을 얻는다. 얻어진 PCR증폭단편은 프라이머에 유래하고, PHA합성효소유전자에 공통하는 염기배열을 양단에 포함한다. 양단의 프라이머에 상보적인 염기배열 사이에 템플레이트인 P161주의 PHA합성효소유전자 자체에 유래하는 부분염기배열을 가지게 된다.

따라서, 얻어진 PCR증폭단편은 P161주의 PHA합성효소유전자에 100%가까운 상동성을 가진 단편이며, 콜로니 하이브리다이제이션을 행할 때의 프로브로서 높은 S/N비를 기대할 수 있다. 또한, 하이브리다이제이션의 스트린젠시제어를 용이하게 하는 것이 가능하다.

상기 PCR증폭단편을 적당한 시약을 사용해서 표시하고, 프로브로서 사용해서 상기 염색체DNA라이브러리에 대해서 콜로니 하이브리다이제이션을 행해서, PHA합성효소유전자를 유지하는 재조합대장균균수를 선발한다(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 6.0.3쪽, 1994년). 예를 들면, PCR증폭단편의 표지는 표지효소를 사용하는 범용의 검출계, AlkPhosDirect(아머샴-파마시아 바이오텍)등의 시판의 키트를 이용할 수 있다.

또한, PHA합성효소유전자를 포함하는 유전자단편을 유지하는 재조합대장균균주의 선발은 상기 유전자형을 이용한 선발방법 이외에도 PHA합성의 유무를 직접 평가하는 표현형을 이용한 방법에 의하는 것도 가능하다. 즉, 재조합대장균균주에 있어서, 유지하는 PHA합성효소유전자로부터 PHA합성효소의 발현이 행해질 경우, 그PHA합성효소에 의한 PHA의 생산이 행해진다. 이 PHA합성의 유무를 조사해서 PHA합성요소의 발현이 행해지고 있는 재조합대장균균주를 선별하는 것도 가능하다. PHA합성의 유무를 조사하는 방법으로서는, 예를 들면 수단 블랙 B에 의해 염색하는 방법(Archives of Biotechnology, 71권, 283쪽, 1970년), 위상차현미경에 의해 PHA의 축적을 조사하는 방법등을 사용할 수 있다.

상기의 어느 하나의 방법에 의해 선발한 재조합대장균으로부터 알칼리법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 1.6.1쪽, 1994년)을 사용해서 프라스미드를 회수한다. 이 회수된 플라스미드로부터 PHA합성효소유전자를 포함하는 DNA단편, 또는 PHA합성효소유전자를 부분적으로 포함하는 DNA단편 복수를 얻을 수 있다. 채취한 DNA단편의 염기배열의 결정은, 예를 들면 상거법 (Molecular Cloning, 2권, 13.3쪽, 1989년) 등에 의해서 행하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 염기배열자동분석장치, 예를 들면 DNA시퀀서377A(파킨엘머) 등을 사용해서 다이프라이머법 또는 다이터미네이터법에 의해 행할 수 있다. DNA단편이 도입된 벡터 자체의 염기배열은 기지이기 때문에 그 곳에 클로닝되어 있는 DNA단편의 염기배열은 일의적으로 해석이 가능하다.

또한, 상기 방법에 의해, 채취한 PHA합성효소유전자를 포함하는 DNA단편의 전 염기배열을 결정한 후에는 화학합성법, 염색체DNA를 주형으로 한 PCR법 또는 이 염기배열을 가진 DNA단편의 제한효소에 의한 분해 등의 임의의 방법에 의해 조제된 DNA단편을 프로브로서 하이브리다이즈함으로써 본 발명의 PHA합성효소유전자DNA를 얻는 것이 가능하다.

본 발명자들은 상술한 순서에 따라서 P161주로부터 상기한 기질특이성을 표시하는 PHA합성효소로 번역되는 유전자의 선별을 행해서, 적어도 2종의 아미노산배열을 가진 PHA합성효소의 존재를 발견했다. 즉, 본 발명자들은 P161주의 염색체 DNA로부터 채취한, 배열번호: 2로 표시하는 염기배열을 가진 본 발명의 PHA합성효소 유전자와, 이 유전자에 의해 코드되어 있는 배열번호: 1로 표시하는 아미노산배열을 가진 PHA합성효소, 및 배열번호: 4로 표시하는 염기배열을 가진 본 발명의 PHA합성효소유전자와, 이 유전자에 의해 코드되어 있는 배열번호: 3으로 표시하는 아미노산배열을 가진 PHA합성효소를 발견했다.

또한, 본 발명의 PHA합성효소유전자는, 예를 들면 그 코드하는 아미노산배열이 같게 되는, 축중 코돈에 있어서만 다른, 동일한 폴리펩티드를 코드하는 축중 이성체도 포함한다. 더 구체적으로는, 동일한 아미노산을 코드하는 축중 고돈을 숙주에 의존해서 보다 사용빈도가 높은 코돈을 선택해서, 변환한 축중 이성체도 포함한다. 한편, 본 발명의 PHA합성효소는 P161주 고유의 배열번호: 1로 표시하는 아미노산배열을 가진 PHA합성효소, 및 배열번호: 3으로 표시하는 아미노산배열을 가진 PHA합성효소에 추가해서, 그 PHA합성활성 및 기질특이성을 손상시키지 않는 한, 또한 아미노산배열을 실질적으로 유지하는 범위 내에서 몇 개의 아미노산에 대해서 삭제, 치환, 부가 등의 변이가 있어도 된다. 여기서, 삭제, 치환, 부가 등의 변이는 배열번호: 2로 표시하는 염기배열 또는 배열번호: 4로 표시하는 염기배열을 가지는, P161주 고유의 PHA합성효소유전자에 의거해서 부위돌연변이도입방법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 8.1.1쪽,1994년) 등에 의해 도입가능하다.

본 발명의 재조합벡터는 본 발명의 재조합형 PHA합성효소를 슈도모나스속에 속하는 미생물, 대장균 등의 미생물을 숙주로 해서 발현하는 용도에 사용하는 것이다. 따라서, 본 발명의 재조합벡터 자체가 사용하는 숙주 속에서 자율 복제가 가능한 동시에, 발현을 야기하는 프로모터, 본 발명의 PHA합성효소유전자DNA, 및 숙주에 적합한 전사종결배열을 포함하는 구성인 것이 바람직하다. 또한, 재조합벡터의 도입 후, 그 선별에 이용되는 각종 마커유전자를 구비하는 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.

슈도모나스속에 속하는 미생물, 대장균 등 다종의 세균의 숙주에 적합한 발현벡터로서는, 광범위한 숙주에 있어서 복제ㆍ유지되는 RK2복제기점을 가진 PLA2917(ATCC 37355)나 RSF1010복제기점을 가진 pJRD215(ATCC 37533) 등을 들수 있다. 이들에 한정되지 않고, 광범위한 숙주에 있어서 복제ㆍ유지되는 복제기점을 가진 벡터라면 모두 사용가능하다. 프로모터는 숙주로 하는 세균중에서 발현할 수 있는 것이면 모두 사용가능하며, 예를 들면 trp프로모터, trc프로모터, tac프로모터, lac프로모터, PL프로모터, PR프로모터, T7프로모터, T3프로모터 등의 대장균이나 파지 등에 유래하는 프로모터를 사용할 수 있다.

효모를 숙주로서 사용하는 경우는 발현벡터로서, 예를 들면 YEp13, YCp50, pRS계, pYEX계 벡터 등이 이용가능하다. 프로모터로서는, 예를 들면 GAL프로모터, AOD프로모터 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 형질전환미생물은 본 발명의 재조합벡터를, 그 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 중에 도입함으로써 얻어진다. 숙주로서 이용가능한 균종류로서, 에세리치아(Esherichia)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 알칼리게네스(Alcaligenes)속, 코마모나스(Comamonas)속, 벌크홀데리아(Burkholderia)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 플라보박테리움(Flabobacterium)속, 비브리오(Vibrio)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 리조비움(Rhizobium)속, 글루코노박터(Gluconobacter)속, 아시네토박터(Acinetobacter)속, 모라세라(Moraxella)속, 니트로소모나스(Nitrosomonas)속, 아에로모나스(Aeromonas)속, 파라코커스(Paracoccus)속, 바칠루스(Bacillus)속, 클로스트리듐(Clostridium)속, 락토바칠루스(Lactobacillus)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 아르스로박터(Arthrobacter)속, 아크로모박터(Achromobacter)속, 미크로코커스(Micrococcus)속, 마이코박테리움(Mycobacterium)속, 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 악티노마이세스(Actinomyces)속, 노카르디아(Nocardia)속, 메틸로박테리움(Methylobacterium)속 등의 각종 세균을 들수 있다. 세균으로의 재조합DNA의 도입방법으로서는 상술한 염화칼슘법이나 일렉트로포레이션법 등이 이용가능하다.

또한, 상기 세균 이외에도 숙주로 이용할 수 있는 미생물로서 사카로미세스(Saccharomyces)속, 칸디다(Candida)속 등의 효모, 곰팡이 등을 들 수 있다. 효모로의 재조합 DNA의 도입방법으로서는, 예를 들면 일렉트로포레이션법(Methods Enzymol., 194, 182-187(1990)),스페로플라스트법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929-1933(1978)), 초산리티움법(J. Bacteriol., 153, 163-168(1983), 등이 이용가능하다.

본 발명의 PHA합성효소는 상기 수법으로 창제되는 본 발명의 형질변환체를 배양해서, 도입되어 있는 발현벡터 중의 대응하는 PHA합성효소유전자로부터 재조합형단백질로서 생산된다. 그 배양물(배양균체 또는 배양상청) 중에 본 발명의 PHA합성효소를 생산ㆍ축적시키고, 배양물로부터 목적하는 PHA합성효소를 분리ㆍ취득함으로써 재조합형효소단백질의 생산을 행할 수 있다. 이 목적에는, 본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다. 또한, 배양방법은 배치식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 또한, 이 배양에는, 예를 들면 상기 폴리히드록시알카노에이트합성효소유전자발현의 유도물질을 포함하는 배지를 사용할 수도 있다.

대장균 등의 세균을 숙주로해서 얻어진 형질변환체에 있어서는 배양에 사용하는 배지로서 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB배지, M9배지 등을 들 수 있다. 또한, 배양온도는 25~37℃의 범위에서 호기적으로 8~72시간 배양함으로써 미생물의 증식을 도모한다. 그 후 집균해서, 균체내에 축적된 PHA합성효소의 회수를 행할 수 있다. 이 미생물의 증식에 필요한 탄소원으로서, 예를 들면 글루코스, 프락토스, 스크로스, 말토스, 갈락토스, 전분 등의 당류, 에타놀, 프로파놀, 부타놀 등의 저급알콜류, 글리세린 등의 다가알콜류, 초산, 구연산, 호박산, 주석산, 유산, 타르타르산 등의 유기산, 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 이용할 수 있다.

질소원으로서는, 예를 들면 암모니아, 염화암모니움, 황산암모니움, 인산암모니움 등의 암모니움염 외에 펩프톤, 육엑기스, 효모엑기스, 액아엑기스, 카제인분해물, 콘스티프리커 등의 천연물 유래의 것을 들수 있다. 또한 무기물로서, 예를 들면 인산 제 1칼륨, 인산 제 2칼륨, 인산 마그네슘, 황산 마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 배양액으로는 마커유전자로서 사용하고 있는 각종 약제 내성유전자 등에 따라서 가나마이신, 앰피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다.

또한, 발현벡터에 있어서, 유도성의 프로모터를 사용하고 있는 경우는 형질전환한 미생물을 배양할 때에 그 프로모터의 종류에 따라서 적합한 유도물질을 배지에 첨가해서 발현을 촉진하면 된다. 예를 들면, 이소프로필-β-D-디오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린 또는 인돌아크릴산(IAA) 등을 유도물질로서 들수 있다.

PHA합성요소의 분리ㆍ정제는 얻어지는 배양물을 원심ㆍ회수해서, 아피니티 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환 크로마토그래피, 겔여과 등의 수단을 단독으로 또는 적절히 조합함으로써 행할 수 있다. 얻어진 정제물질이 목적하는 효소인 지의 확인은 통상의 방법, 예를 들면 SDS폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 웨스턴 블로팅 등에 의해 행한다.

또한, 본 발명의 형질전환미생물의 배양, 본 발명의 형질전환미생물에 의한PHA합성효소의 생산, 균체 내로의 축적, 및 균체로부터의 PHA합성효소의 회수 및 정제는 위에 예시한 방법에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 형질전환미생물을 배양해서, 재조합형PHA합성효소를 발현시켜서, 목적하는 PHA를 생산시킬수 있다. 예를 들면, 이 미생물을 상기 배양조건에서 배양해서, 재조합형 PHA합성효소를 생산시키고, 그 때, 목적으로 하는 PHA에 대응하는 기질을 배지에 첨가하고, PHA합성효소를 작용시킨다. 배양물 및 생산균체로부터의 PHA의 회수는 통상 행해지고 있는 클로로포름 등의 유기용매에 의한 추출이 가장 간편하다. 또한, 클로로포름 등의 유기용매가 사용하기 어려운 환경 속에 있어서는 SDS 등의 계면활성제에 의한 처리, 리소짐 등의 효소에 의한 처리, EDTA, 차아염소산나트륨, 암모니아 등의 약제에 의한 처리에 의해서 PHA 이외의 균체성분을 제거하고, PHA를 회수하는 방법을 사용할 수도 있다. 또한, PHA제조를 목적으로 하는 본 발명의 형질전환나 미생물의 배양, 배양한 미생물에 의한 PHA의 생산, 균체 내로의 축적, 및 재조합미생물의 균체로부터의 PHA의 회수는 위에 예시한 방법에 한정되는 것은 아니다.

(실시예)

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더 구체적으로 설명한다. 단, 이하에 설명하는 실시예는 본 발명의 최량의 실시형태의 일례이지만, 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1)P161주의 PHA합성효소유전자의 클로닝

P161주를 100㎖의 LB배지(1%폴리펩톤, 0.5%효모엑기스, 0.5%염화나트륨, PH7.4)에서 30℃에서, 하룻밤 동안 배양 후, 마머 등의 방법에 의해 염색체 DNA를 분리회수했다. 얻어진 염색체DNA를 제한효소 BglII로 완전 분해했다. 벡터로는 pUC18을 사용하고, 제한효소 BamHI로 절단했다. 말단의 탈인산화처리(Molecular Cloning, 1권, 5.7.2쪽, 1989년; Cold Spring Harbor Laboratory출판) 후, DNA 라이게이션 키트 Ver.II(다카라 주조)를 사용해서 벡터의 절단부위 (클로닝 사이트)와 염색체DNA의 BglⅡ완전분해 단편을 연결했다. 이 염색체DNA단편을 짜넣은 플라스미드 벡터를 사용해서 대장균(Escheichia coli)HB101주를 형질전환해서, P161주의 염색체DNA라이브러리를 제작했다.

다음에, P161주의 PHA합성효소유전자를 포함하는 DNA단편을 선택하기 위해서, 콜로니 하이브리다이즈용의 프로브의 조제를 행했다. 배열번호: 6 및 배열번호: 7의 염기배열로 이루어진 올리고누클레오티드를 합성하고(아머샴-파마시아 바이오텍), 이 올리고누클레오티드를 프라이머로 사용해서 염색체DNA를 템플레이트로 해서 PCR을 행했다. PCR증폭되어 온 DNA단편을 프로브로서 사용했다. 프로브의 표지화는 시판의 표지효소계 AlkPhosDirect(아머샴-파마시아 바이오텍)를 이용해서 행했다. 얻어진 표지화프로브를 사용해서 P161주의 염색체DNA라이브러리로부터 콜로니 하이브리다이제이션법에 의해서 PHA합성효소유전자를 포함하는 재조합플라스미드를 가진 대장균균주를 선발했다. 선발한 균주로부터 알칼리법에 의해서 플라스미드를 회수함으로써 PHA합성효소유전자를 포함하는 DNA단편을 얻을 수 있다.

여기서 취득한 유전자DNA단편을 불화합성그룹인 IncP,IncQ, 또는 IncW의 어느 것에도 속하지 않는 광숙주역복제영역을 포함하는 벡터 pBBR122(Mo BiTec)로 재조합했다. 이 재조합플라스미드를 슈도모나스 젯세니이 P161ml주(PHA합성능결손주)로 일렉트로포레이션법에 의해 형질전환한 바, P161ml주의 PHA합성능이 복귀하고, 상보성을 표시했다. 따라서, 선발된 유전자DNA단편은 슈도모나스 젯세이 P161주 내에 있어서, PHA합성효소로 번역가능한 PHA합성효소유전자 영역을 포함하는 것이 확인된다.

이 PHA합성효소유전자를 포함하는 DNA단편에 대해서 상거법에 의해 염기배열을 결정했다. 그 결과, 결정된 염기배열 중에는 각각 펩티드쇄를 코드하는, 배열번호 : 2 및 배열번호 : 4로 표시되는 염기배열이 존재하는 것이 확인되었다. 아래에서 설명하는 바와 같이, 개개의 펩티드쇄로 이루어진 단백질은 모두 효소 활성을 가지고 있으며, 배열번호 : 2 및 배열번호 : 4로 표시되는 염기배열은 각각 PHA 합성효소유전자인 것을 확인할 수 있었다. 즉, 배열번호 : 1로 표시하는 아미노산 배열을 배열번호 : 2의 염기배열은 코드하고 있으며, 배열번호 : 3으로 표시하는 아미노산 배열을 배열번호 : 4의 염기배열은 코드하고 있으며, 이 어느 한 쪽의 아미노산배열을 가진 단백질만으로 PHA합성능이 발휘되는 것을 확인했다.

(실시예 2 ) 'P161주의 PHA합성효소유전자의 발현 베터로의 재조합

배열번호 : 2로 표시되는 염기배열의 PHA합성효소유전자에 대해서 염색체 DNA를 템플레이트로 해서 PCR을 행해서, PHA합성효소유전자의 완전길이를 재조제했다. 배열번호 : 2로 표시되는 염기배열에 대해서 상류 쪽 프라이머가 되고, 그 개시 코돈보다 부터 상류의 염기배열을 가진 올리고누클레오티드(배열번호 : 8) 및배열번호 : 2로 표시되는 염기배열에 대해서 하류 쪽 프라이머가 되고, 종지 코돈보다 하류의 염기배열을 가진 올리고누 클레오티드(배열번호 : 9)를 각각 설계 합성했다(아머샴 파마시아 바이오켁). 이 올리고누 클레오티드를 프라이머로 해서 PCR을 행하고, PHA합성효소유전자의 완전길이를 증폭했다(LA-PCR키트 ; 다카라 주조).

마찬가지로, 배열번호 : 4로 표시되는 염기배열의 PHA합성효소유전자에 대해서도 염색체 DNA를 템플레이트로해서 PCR을 행해서, PHA합성효소유전자의 완전길이를 재조제했다. 배열번호 : 4로 표시되는 염기배열에 대해서 상류 쪽 프라이머가 되고, 그 개시 고돈보다 상류의 염기배열을 가진올리고누클레오티드(배열번호 : 10) 및 배열번호 : 4로 표시되는 염기배열에 대해서 하류 쪽 프라이머가 되고, 종지 고돈보다 하류의 염기배열을 가진 올리고 누클레오티드(배열번호 : 11)를 각각 설계합성했다(아머샴-파마시아 바이오텍), 이 올리고누클레오티드를 프라이머로서 PCR을 행하고, PHA합성효소유전자의 완전길이를 증폭했다(LA-PCR 키트 : 다카라 주조).

다음에, 얻어진 PHA합성효소유전자의 완전길이를 포함하는 PCR증폭단편을 각각에 대해서 제한효소 Hind III을 사용해서 완전분해했다. 또한, 발현벡터 pTrc 99A도 제한효소 Hind III 으로 절단하고, 탈인산화처리 (Molecular Cloning, 1권, 5.7.2 쪽, 1989년 ; Cold Spring Harbor Laboratory 출판)했다.

이 발현벡터 pTrc 99A의 절단부위에 양 말단의 불필요한 염기배열을 제외한 PHA합성효소유전자의 완전길이를 포함하는 DNA단편을 DNA 라이게이션 키트 Ver.II(다카라 주조)를 사용해서 연결했다.

얻어진 재조합 플라스미드에 의해 대장균(Escherichia coli HB101:다카라 주조)을 염화칼슘법에 의해 형질변환했다. 얻어진 재조합체를 배양해서, 재조합 플라스미드의 증폭을 행하고, 재조합플라스미드를 각각 회수했다. 배열번호 : 2의 유전자 DNA를 유지하는 재조합플라스미드를 pP161-C1(배열번호 2 유래), 배열번호 : 4의 유전자DNA를 유지하는 재조합 플라스미드를 pP161-C2(배열번호 4 유래)로 했다.

(실시예 3 ) PHA합성효소유전자재조합대장균에 의한 PHA생산 - 1

실시예 2에서 얻어진 재조합 플라스미드, pP161-C1 (배열 번호 2 유래), pP161-C2 (배열번호 4 유래)에 의해 대장균 (Esherichia coli HB101fB fadB결손주)을 염화 칼슘법에 의해 형질전환하고, 각각의 재조합플라스미드를 유지하는 재조합 대장균주, PP616-C, 재조합주, pP161-C2 재조합주를 얻었다.

pP161-C1재조합주, pP161-C2재조합주 각각을 효모엑기스 0.5%,FPVA 0.1%를 포함하는 M9배지 200ml로 식균해서, 37℃에서 , 125스트로크/분으로 흔들어 배양했다. 24시간 후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메타놀로 한 번 세정해서 동결건조했다.

이 동결건조 펠렛을 100ml의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20 시간 교반해서 PHA를 추출했다. 추출액을 구멍경0.45㎛의 멤브레인필터에 의해 여과한 후, 회전증발기에 의해 농축했다. 이어서, 농축액을 냉메타놀 중에서 침전시키고, 다시 침전 만을 회수해서 진공건조해서 PHA를 얻었다. 얻어진 PHA는 통상과 같이 메타놀리시스를 행한 후, 가스 크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS,시마즈 QP-5050,EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 확인을 행했다. 표1에 각 균주에 대해서 균체건조중량, 회수된 PHA의 폴리머건조중량, 균체당의 폴리머수율(폴리머 건조중량/균체건조중량) 및 모노머유닛의 확인결과를 아울러서 표시한다.

	pP161-C1 재조합주	pP161-C2 재조합주
균체건조중량	900mg/L	940mg/L
폴리머건조중량	35mg/L	37mg/L
폴리머건조중량/균체건조중량	4%	4%
모노머유닛조성(면적비)
3-히드록시낙산	0%	0%
3-히드록시길초산	0%	0%
3-히드록시헥산산	0%	0%
3-히드록시헵탄산	7%	5%
3-히드록시옥탄산	6%	5%
3-히드록시노난산	9%	12%
3-히드록시데칸산	12%	12%
3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산	66%	66%

이상에 표시한 바와 같이, pP161-C1재조합주, pP161-C2재조합주 모두 기질의 5-(4-플루오로 페닐)길초산으로부터 대응하는 3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산에 유래하는 화학식(I)로 표시하는 모노머유닛을 주성분으로 하는 PHA를 생산하는 것을 알 수 있다. 따라서, pP161-C1재조합주는 배열번호 : 2로 표시하는 염기배열을 포함하는 PHA합성효소유전자로부터 번역되는, 배열번호 : 1로 표시하는 아미노산배열의 PHA합성효소만을, pP161-C2재조합주는 배열번호 :4로 표시하는 염기배열을 포함하는 PHA합성효소유전자로부터 번역되는, 배열번호 : 3으로 표시하는 아미노산배열의 PHA합성효소만을 각각 생산하지만, 양자 모두 마찬가지로 기질의 5-(4-플루오로 페닐) 길초산으로부터 대응하는 3-하이드록시-5(4-플루오로 페닐)길초산에 유래하는 화학식(I)에 표시하는 모노머유닛으로의 변환과, 그것을 포함하는 PHA의 합성을 행하는 것이 확인된다.

(실시예 4) PHA합성효소유전자 재조합 대장균에 의한 PHA생산-2

pP161-C1재조합주, pP161-C2 재조합주 각각을 효모엑기스 0.5%, 4-페녹시낙산(P BA)0.2%를 포함하는 M9배지 200ml로 식균해서, 37℃에서 , 125스트로크/분으로 흔들어 배양했다. 24시간 후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메타놀로 한 번 세정해서 동결건조했다.

이 동결건조 펠렛을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃ 에서 20시간 교반해서 PHA를 추출했다. 추출액을 구멍경0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전증발기로 농축했다. 농축액을 냉메타놀 속에서 재침시키고, 다시 침전물만을 회수해서 진공건조해서 PHA를 얻었다. 얻어진 PHA는 통상과 같이 메타놀리시스를 행한 후, 가스 크로마토그래피질량 분석장치(GS-MS,시마즈 QP-5050,EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 확인을 행했다. 표2에 각 전주에 대해서 전체 건조중량, 회수된 PHA의 폴리머건조중량, 전체당의 폴리머수율(폴리머건조중량/균체건조중량) 및 모노머유닛의 확인결과를 아울러서 표시한다.

	pP161-C1 재조합주	pP161-C2 재조합주
균체건조중량	750mg/L	720mg/L
폴리머건조중량	4mg/L	4mg/L
폴리머건조중량/균체건조중량	0.5%	0.5%
모노머유닛조성(면적비)
3-히드록시낙산	0%	0%
3-히드록시길초산	0%	0%
3-히드록시헥산산	0%	0%
3-히드록시헵탄산	2%	2%
3-히드록시옥탄산	3%	3%
3-히드록시노난산	5%	7%
3-히드록시데칸산	5%	6%
3-히드록시-4-페녹시낙산	85%	82%

이상에 표시한 바와 같이,pP161-C1재조합주, pP161-C2재조합주 모두 기질의 4-페녹시낙산으로부터 대응하는 3-히드록시-4-페녹시낙산에 유래하는 화학식(V1)로 표시하는 모노머유닛을 주성분으로 하는 PHA를 생산하는 것을 알 수 있다. 따라서, pP161-C1재조합주는 배열번호 : 2로 표시하는 염기배열을 포함하는 PHA합성효소유전자로부터 번역되는, 배열번호 : 1로 표시하는 아미노산배열의 PHA합성효소만을, pP161-C2재조합주는 배열번호 : 4로 표시하는 염기배열을 포함하는 PHA합성효소유전자로부터 번역되는, 배열번호 : 3으로 표시하는 아미노산 배열의 PHA합성효소만을 각각 생산하지만, 양자 모두 마찬가지로 기질의 4-페녹시낙산으로부터 대응하는 3-히드록시-4-페녹시낙산에 유래하는 화학식(V1)에 표시하는 모노머유닛으로의 변환과, 그것을 포함하는 PHA의 합성을 행하는 것이 확인된다.

(실시예5) PHA합성효소유전자재조합 대장균에 의한 PHA생산-3

pP161-C1 재조합주, pP161-C2재조합주 각각을 효모엑기스 0.5%, 6-페닐헥산산 (PH A)0.1%를포함하는 M9배지 200㎖에 식균해서 37℃에서 ,125스트로크분으로 흔들어 배양했다. 24시간 후, 전체를 원심분리에 의해서 회수해서, 냉메타놀로 한 번 세정해서 동결건조했다.

이 동결건조펠렛을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃ 에서 20시간 교반해서 PHA를 추출했다. 추출액을 구명경 0.45㎛ 의 멤브레인 필터로 여과한 후, 회전 증발기에의해 농축했다. 농축액을 냉메타놀 속에서 재침전시키고, 다시 침전물만을 회수해서 진공건조해서 PHA를 얻었다. 얻어진 PHA는 통상과 같이 메타놀리시스를 행한 후, 가스 크로마토그래피 질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해서 PHA 모노머유닛의 메칠에스테르화물의 확인을 행했다. 표 3에 각 균주에 대해서 균체건조중량, 회수된 PHA의 폴리머건조중량, 균체당의 회수율(폴리머건조중량/균체건조중량) 및 모노머유닛의 확인결과를 아울러서 표시한다.

	pP161-C1 재조합주	pP161-C2 재조합주
균체건조중량	1050mg/L	980mg/L
폴리머건조중량	73mg/L	70mg/L
폴리머건조중량/균체건조중량	7%	7%
모노머유닛조성(면적비)
3-히드록시낙산	0%	0%
3-히드록시길초산	0%	0%
3-히드록시헥산산	0%	0%
3-히드록시헵탄산	3%	3%
3-히드록시옥탄산	3%	4%
3-히드록시노난산	5%	2%
3-히드록시데칸산	5%	4%
3-히드록시-6-페닐헥산산	84%	87%

이상에 표시한 바와 같이, pP161-C1 재조합주, pP161-C2 재조합주 모두 기질의 6-페닐헥산산으로부터 대응하는 3-히드록시-6-페닐헥산산에 유래하는 화학식(IX로 표시하는 모노머유닛을 주성분으로 하는 PHA를 생산하는 것을 알 수 있다. 따라서, pP161-C1 재조합주는 배열번호 : 2로 표시하는 염기배열을 포함하는 PHA합성효소유전자로부터 번역되는, 배열번호 : 1로 표시하는 아미노산배열의 PHA합성효소만을, pP161-C2재조합주는 배열번호 : 4로 표시하는 염기배열을 포함하는 PHA합성효소유전자로부터 번역되는, 배열번호 : 3으로 표시하는 아미노산 배열의 PHA합성효소만을 각각 생산하지만, 양자 모두 마찬가지로 기질의 6-페닐헥산산 낙산으로부터 대응하는 3-히드록시-6-패닐헥산산에 유래하는 화학식(XI)로 표시하는 모노머유닛으로의 변환과, 그것을 포함하는 PHA의 합성을 행하는 것이 확인된다.

상시 실시예 3,4의 결과도 고려하면, 배열번호 : 1로 표시하는 아미노산배열의 PHA합성효소와 배열번호 : 3으로 표시하는 아미노산배열의 PHA 합성효소는 서로의 기질의 특이성이 유사한 효소활성을 가진 것을 알 수 있다.

본 발명의 PHA 합성효소, 및 이 PHA합성효소를 코드하는 유전자는 신규한 미생물 슈도모나스 젯세니이 P161주에 유래하는 것이며, 신규한 측쇄구조를 가진 모노머유닛을 선택적으로 포함하는 PHA합성을 행한다고 하는 기질 특이성을 표시한다. 또한, 이 PHA합성효소 유전자를 포함하는 재조합벡터, 및 이 재조합백터에 의해서 형질 전환된 형질전환미생물은 슈도모나스 젯세니이 P161주와 마찬가지의 기질특이성을 표시하는 PHA합성능을 가진게된다. 이와 같이, 본 발명의 PHA합성효소유전자는 신규한 측쇄구조를 가진 모노머유닛을 선택적으로 포함하는 PHA합성을 가능하게 하는 효소를 코드하고 있으며, 여러 가지 유용한 물성을 가지며, 기능성 폴리머로의 응용이 기대되는 PHA를 합성함에 있어서 유용한 형질전환미생물의 창제를 가능하게 한다.

Claims

배열번호 : 1로 표시하는 아미노산배열을 가진 폴리히드록시알카노에이트 합성효소.
배열번호 : 1로 표시하는 아미노산배열을 실질적으로 유지하고, 그 폴리히드록시알카노에이트 합성효소 활성을 손상시키지 않는 범위에서 아미노산의 삭제, 치환 또는 부가가 행해진 개변 아미노산배열을 가진 폴리히드록시알카노에이트 합성효소.
제 2항에 기재한 폴리히드록시알카노에이트 합성효소의 아미노산배열을 코드하는 DNA배열을 포함하는 폴리히드록시알카노에이트 합성효소 유전자.
배열번호 : 1로 표시하는 아미노산배열을 코드하는, 배열번호 : 2로 표시하는 DNA배열을 포함하는 폴리히드록시알카노에이트 합성효소유전자.
배열번호 : 3으로 표시하는 아미노산배열을 가진 폴리히드록시알카노에이트 합성효소.
배열번호 : 3으로 표시하는 아미노산배열을 실질적으로 유지하고, 그 폴리히드록시알카노에이트 합성효소 활성을 손상시키지 않는 범위에서 아미노산의 삭제, 치환 또는 부가가 행해진 개변 아미노산배열을 가진 폴리히드록시알카노에이트 합성효소.
제 6항에 기재한 폴리히드록시알카노에이트 합성효소의 아미노산 배열을 코드하는 DNA배열을 포함하는 폴리히드록시알카노에이트 합성효소 유전자.
배열번호 : 3으로 표시하는 아미노산배열을 코드하는, 배열번호 : 4로 표시하는 DNA배열을 포함하는 폴리히드록시알카노에이트 합성효소 유전자.
폴리히드록시알카노에이트 합성효소 유전자로서 제 3항 또는 제 4항 또는 제 7항 또는 제 8항에 기재한 유전자를 함유하는 재조합벡터.
제 9항에 기재한 재조합벡터의 도입에 의해 형질전환된 형질전환미생물
제 10항에 기재한 형질전환미생물을 폴리히드록시알카노에이트 합성효소의 기질을 포함하는배지에서 배양하고, 얻어지는 배양물로부터 폴리히드록시알카노에이트를 분리하는 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법
제 10항에 기재한 형질전환미생물을 배양하고, 상기 형질전환미생물에 폴리히드록시알카노에이트 합성효소를 산출시키는 것을 특징으로 하는 폴리히드록시 알카노에이트 합성효소의 생산방법.