JP2001275673A - ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素及び該酵素をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 新規な側鎖構造を有するポリヒドロキシアル
カノエート（ＰＨＡ）を生産する微生物に由来する、新
規なＰＨＡ合成酵素とそのアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡの提供。 【解決手段】 シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６
１株（Pseudomonas jessenii P161：ＦＥＲＭ Ｐ−１７
４４５）に由来する二種のＰＨＡ合成酵素蛋白質と前記
二種のＰＨＡ合成酵素をそれぞれコードするＰＨＡ合成
酵素遺伝子であり、組換え体微生物にＰＨＡ合成能を付
与する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ポリヒドロキシア
ルカノエート（以下、ＰＨＡと記載）合成酵素、このＰ
ＨＡ合成酵素をコードする遺伝子、その遺伝子を含む組
換えベクター、その組換えベクターにより形質転換さ
れ、ＰＨＡ合成酵素の発現能を有する形質転換体、該形
質転換体を利用したＰＨＡ合成酵素の生産方法、ならび
に該形質転換体を利用したＰＨＡの製造方法に関する。
より具体的には、ポリヒドロキシアルカノエートの産生
能を有する微生物由来のＰＨＡ合成酵素、ならびにその
ＰＨＡ合成酵素の組換え発現に利用される、ＰＨＡ合成
酵素をコードする遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】これまで、多くの微生物がポリ−３−ヒ
ドロキシ酪酸（ＰＨＢ）あるいはその他のＰＨＡを生産
し、菌体内に蓄積することが報告されてきた（「生分解
性プラスチックハンドブック」，生分解性プラスチック
研究会編，（株）エヌ・ティー・エス，Ｐ１７８−１９
７）。これらのポリマーは従来のプラスチックと同様
に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することが
できる。さらに、生分解性であるがゆえに、自然界で微
生物により完全分解されるという利点を有しており、従
来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留し
て汚染を引き起こすことがない。また、生体適合性にも
優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待され
ている。

【０００３】このような微生物産生ＰＨＡは、その生産
に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、
様々な組成や構造のものとなり得ることが知られてお
り、これまで主に、ＰＨＡの物性の改良という観点か
ら、このような組成や構造の制御に関する研究がなされ
てきた。

【０００４】例えば、アルカリゲネス・ユウトロファス
Ｈ１６株（Alcaligenes eutropusH16、ATCC No.17699）
及びその変異株は、その培養時の炭素源を変化させるこ
とによって、３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒド
ロキシ吉草酸（３ＨＶ）との共重合体を様々な組成比で
生産することが報告されている（特表平６−１５６０４
号公報、特表平７−１４３５２号公報、特表平８−１９
２２７号公報 等）。

【０００５】また、特許公報第２６４２９３７号では、
シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ２９３４７
株（Pseudomonas oleovorans ATCC29347）に、炭素源と
して非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数
が６から１２までの３−ヒドロキシアルカノエートをモ
ノマーユニットとするＰＨＡを生産することが開示され
ている。

【０００６】特開平５−７４４９２号公報では、メチロ
バクテリウム属（Methylobacteriumsp.）、パラコッカ
ス属（Paracoccus sp.）、アルカリゲネス属（Alcalige
nessp.）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）の微
生物を、炭素数３から７の第一級アルコールに接触させ
ることにより、３ＨＢと３ＨＶとの共重合体を生産させ
る方法が開示されている。

【０００７】特開平５−９３０４９号公報、及び、特開
平７−２６５０６５号公報では、アエロモナス・キャビ
エ（Aeromonas caviae）を、オレイン酸やオリーブ油を
炭素源として培養することにより、３ＨＢと３−ヒドロ
キシヘキサン酸（３ＨＨｘ）の２成分共重合体を生産す
ることが開示されている。

【０００８】特開平９−１９１８９３号公報では、コマ
モナス・アシドボランス・ＩＦＯ１３８５２株（Comamo
nas acidovorans IFO13852）が、炭素源としてグルコン
酸及び１，４−ブタンジオールを用いた培養により、３
ＨＢと４−ヒドロキシ酪酸とをモノマーユニットに持つ
ポリエステルを生産することが開示されている。

【０００９】さらに、ある種の微生物では、様々な置換
基、例えば、不飽和炭化水素、エステル基、アリール基
（芳香環基）、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキ
シド等が導入されたＰＨＡを生産することが報告されて
おり、このような手法によって微生物産生ＰＨＡの物性
改良を目指す試みもなされ始めている。例えば、Ｍａｋ
ｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９１，１９５７−１９６
５，１９９０、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２４，
５２５６−５２６０，１９９１、Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ，
３，４９２−４９４，１９９１等では、シュードモナス
・オレオボランスが３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草
酸（３ＨＰＶ）をモノマーユニットとして含むＰＨＡを
生産することが報告されており、３ＨＰＶが含まれるこ
とに起因すると思われる、ポリマー物性の変化が認めら
れている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】以上のように、微生物
産生ＰＨＡにおいては、その生産に用いる微生物の種類
や培地組成、培養条件等を変えることにより、何通りか
の組成・構造のものが得られている。しかしながら、そ
の微生物自体のＰＨＡ合成酵素は、それぞれの微生物に
よって、その基質特異性が大きく異なっている。それに
伴い、公知の微生物、あるいは、そのような公知の微生
物が持つＰＨＡ合成酵素のみでは、様々な使用目的に適
合した各種モノマー単位を組成に含むＰＨＡを生産させ
ることは困難であった。

【００１１】一方、上述するように、様々な置換基を側
鎖に導入したＰＨＡは、導入した置換基の特性等に起因
して、極めて有用な機能・特性を具備した「機能性ポリ
マー」としての展開も期待できる。従って、そのような
機能性と生分解性とを兼ね備えた、優れた有用性を持つ
ポリマーを生産し、菌体内に蓄積し得る微生物の探索、
開発は極めて有用かつ重要である。さらには、この高い
有用性を持つＰＨＡの産生に係わるＰＨＡ合成酵素の特
定、そのＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を取得する
ことは、目的とするＰＨＡの産生能を有する、新規な形
質転換微生物の創製を可能とする。すなわち、ＰＨＡ合
成酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターを構築
し、該組換えベクターにより形質転換された形質転換微
生物を得て、この形質転換微生物を利用したＰＨＡの製
造、あるいは、組換え型ＰＨＡ合成酵素を発現させる方
法へ適用を可能とする。このように、形質転換微生物を
利用して、目的のＰＨＡを製造することは、ＰＨＡの生
産性を高める上で、極めて有用な手段を提供し、ＰＨＡ
の利用を進める上でも重要であると考えられる。

【００１２】本発明は、上記の課題を解決するもので、
本発明の目的は、新規な側鎖構造を有するＰＨＡを生産
し、その菌体内に蓄積する能力を有する新規微生物を探
索し、その新規なＰＨＡ産生能に関連する酵素蛋白質、
すなわち、新規なＰＨＡ合成酵素を特定し、また、その
アミノ酸配列をコードする遺伝子を解明することにあ
る。より具体的には、新規な側鎖構造を有するＰＨＡを
生産する微生物に由来する、新規なＰＨＡ合成酵素とそ
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを提供することにあ
る。さらに、本発明は、提供されるＰＨＡ合成酵素をコ
ードするＤＮＡを組み込み、宿主微生物の形質転換に利
用される組換えベクター、この組換えベクターを用いて
形質転換した形質転換微生物の提供をもその目的とす
る。ならびに、得られた形質転換微生物において、組換
え型ＰＨＡ合成酵素の発現・生産を行う方法、および形
質転換微生物を利用して、目的のＰＨＡを製造する方法
の提供をも、本発明は目的とする。

【００１３】加えて、本発明は、前記の形質転換微生物
における組換え型ＰＨＡ合成酵素の発現に際し、酵素活
性を損なわない範囲で、ＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列
に改変を施した改変型のＰＨＡ合成酵素、その改変アミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡの提供も、その目的に含む
ものである。

【００１４】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決すべ
く、本発明者らは、デバイス材料や医用材料等として有
用な、新規な側鎖構造を有するＰＨＡの開発を目指し、
所望のＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有する新
規微生物の探索を進めた。更に、本発明者らは、鋭意研
究を重ね、探索した新規なＰＨＡを生産する新規微生物
について、その新規なＰＨＡの生産に係わるＰＨＡ合成
酵素の特定、ならびに、そのＰＨＡ合成酵素をコードす
る遺伝子の取得を進めた。加えて、取得されたＰＨＡ合
成酵素の遺伝子を含む組換えベクターの構築、該組換え
ベクターによる宿主微生物の形質転換、得られた形質転
換微生物における組換え型ＰＨＡ合成酵素の発現、それ
に伴う、所望のＰＨＡの生産の確認を進めた。

【００１５】その過程で、本発明者らは、化学式（I
I）：

【００１６】

【化１】 で表される５−（４−フルオロフェニル）吉草酸（ＦＰ
ＶＡ）を合成し、これを原料（基質）として、対応する
化学式（III）：

【００１７】

【化２】 で表される３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロフェニ
ル）吉草酸（３ＨＦＰＶ）に変換し、この３ＨＦＰＶに
由来する化学式（Ｉ）：

【００１８】

【化３】 で示されるモノマーユニットを含む新規なＰＨＡを生産
し菌体内に蓄積する能力を有する微生物を土壌から新た
に分離した。この新たに分離した微生物を、Ｐ１６１株
とした。本発明者らは、前記のＦＰＶＡから３ＨＦＰＶ
への変換を行う酵素活性以外に、このＰ１６１株は、化
学式（IV）：

【００１９】

【化４】 で表される４−フェノキシ酪酸（ＰｘＢＡ）を原料（基
質）として、対応する化学式（Ｖ）：

【００２０】

【化５】 で表される３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸（３Ｈ
ＰｘＢ）に変換し、この３ＨＰｘＢに由来する化学式
（VI）：

【００２１】

【化６】 で示されるモノマーユニットを含むＰＨＡを生産し菌体
内に蓄積する能力をも有することを見出した。なお、こ
れまでに、ＰｘＢＡを基質とした、３ＨＰｘＢをモノマ
ーユニットとして含むＰＨＡの微生物生産の報告例はな
く、また、３ＨＰｘＢのみをフェノキシ基含有モノマー
ユニットとして含むＰＨＡの微生物生産に関する報告例
もない。

【００２２】なお、ＰｘＢＡ以外の基質を用い、３ＨＰ
ｘＢに由来する化学式（VI）のモノマーユニットを含む
ＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する微生物の報告例として
は、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２９，３４３２−
３４３５，１９９６に記載の、８−フェノキシオクタン
酸（ＰｘＯＡ）を基質とし、シュードモナス・オレオボ
ランスを用いた方法がある。しかしながら、このシュー
ドモナス・オレオボランスは、８−フェノキシオクタン
酸（ＰｘＯＡ）を基質として用いるという点で、ＰｘＢ
Ａを基質として、対応する３ＨＰｘＢに由来する化学式
（VI）のモノマーユニットを含むＰＨＡ合成を行うＰ１
６１株における酵素反応とは全く異なっている。さら
に、生産されるＰＨＡの組成に関しても、前述のシュー
ドモナス・オレオボランスを用いた報告例の方法では、
基質であるＰｘＯＡに対応する３−ヒドロキシ−８−フ
ェノキシオクタン酸と、その代謝産物由来の副生物であ
る３−ヒドロキシ−６−フェノキシヘキサン酸及び目的
とする３ＨＰｘＢの３種類のモノマーユニットからなる
共重合体が生産されている。それに対して、Ｐ１６１株
を基質ＰｘＢＡに作用させる方法では、ＰｘＢＡ由来の
３ＨＰｘＢのみをフェノキシ基含有モノマーユニットと
して含むＰＨＡが生産される。この得られるＰＨＡの組
成の面をも考慮すると、前述の報告例で用いられている
シュードモナス・オレオボランスとこのＰ１６１株と
は、ＰＨＡ合成酵素の基質特異性に根本的な差異が存在
すると判断できる。つまり、Ｐ１６１株の産生するＰＨ
Ａ合成酵素は、３ＨＰｘＢをモノマーユニットとして含
むＰＨＡの生産により好ましいものと判断される。

【００２３】加えて、本発明者らは、このＰ１６１株
は、化学式（VII）：

【００２４】

【化７】 で表される６−フェニルヘキサン酸（ＰＨｘＡ）を原料
（基質）として、対応する化学式（VIII）：

【００２５】

【化８】 で表される３−ヒドロキシ−６−フェニルヘキサン酸
（３ＨＰＨｘ）に変換し、この３ＨＰＨｘに由来する化
学式（IX）：

【００２６】

【化９】 で示されるモノマーユニットを含む新規なＰＨＡを生産
し菌体内に蓄積する能力を有することも見出した。

【００２７】このＰ１６１株の菌学的性質を列挙すれば
以下の通りである。 ＜Ｐ１６１株の菌学的性質＞形態学的性質 細胞の形と大きさ ：球状、φ０．６μｍ 桿状、０．６μｍ×１．５〜２．０μｍ 細胞の多形性 ：あり（伸長型） 運動性 ：あり 胞子形成 ：なし グラム染色性 ：陰性 コロニー形状 ：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、淡黄色生理学的性質 カタラーゼ ：陽性 オキシダーゼ ：陽性 Ｏ／Ｆ試験 ：酸化型 硝酸塩の還元 ：陽性 インドールの生成 ：陰性 ブドウ糖酸性化 ：陰性 アルギニンジヒドロラーゼ ：陽性 ウレアーゼ ：陰性 エスクリン加水分解 ：陰性 ゼラチン加水分解 ：陰性 β−ガラクトシダーゼ ：陰性 Ｋｉｎｇ'ｓＢ寒天での蛍光色素産生：陽性基質資化能 ブドウ糖 ：陽性 Ｌ−アラビノース ：陽性 Ｄ−マンノース ：陽性 Ｄ−マンニトール ：陽性 Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン ：陽性 マルトース ：陰性 グルコン酸カリウム ：陽性 ｎ−カプリン酸 ：陽性 アジピン酸 ：陰性 ｄｌ−リンゴ酸 ：陽性 クエン酸ナトリウム ：陽性 酢酸フェニル ：陽性

【００２８】以上の菌学的性質から、バージェーズ・マ
ニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー
・第１巻（Ｂｅｒｇｅｙ'ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓ
ｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕ
ｍｅ１）（１９８４年）、及び、バージェーズ・マニュ
アル・オブ・ディタミネーティブ・バクテリオロジー
（Ｂｅｒｇｅｙ'ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第９版（１
９９４年）に基づいて帰属を試みたところ、このＰ１６
１株は、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）に属す
ると判明したものの、上記の菌学的性質からは、分類学
上の位置を確定するには至らなかった。

【００２９】そこで、遺伝的性質から分類を行うべく、
Ｐ１６１株の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を決定し（配
列番号：５に示す）、公知のシュードモナス属微生物の
１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列とその相同性を比較した。
その結果、Ｐ１６１株と既知のシュードモナス・ジェッ
セニイ（Pseudomonas jessenii）との間で、１６ＳｒＲ
ＮＡの塩基配列の相同性が極めて高いことが判明した。
さらに、Ｓｙｓｔｅｍ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，２０，１３７−１４９（１９９７）、及び、Ｓｙ
ｓｔｅｍ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２２，４
５−５８（１９９９）に記載された、既知のシュードモ
ナス・ジェッセニイ菌株について報告されている菌学的
性質と、Ｐ１６１株の菌学的性質とを対比させると、相
当の相同性が認められた。以上の結果から、Ｐ１６１株
は、シュードモナス・ジェッセニイに属せしめるのが妥
当と判断されたため、シュードモナス・ジェッセニイ・
Ｐ１６１株（Pseudomonas jessenii P161）と命名し
た。また、シュードモナス・ジェッセニイ（Pseudomona
s jessenii）において、このＰ１６１株の示すＰＨＡ生
産能を有する菌株の報告はなく、本発明者らは、Ｐ１６
１株を新規な微生物と判断した。なお、本願出願人によ
り、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株（Pseu
domonas jessenii P161）は寄託番号「ＦＥＲＭ Ｐ−１
７４４５」として、通商産業省・工業技術院・生命工学
工業技術研究所（特許微生物寄託センター）に寄託され
ている。

【００３０】本発明者らは、この新規微生物Ｐ１６１株
から、そのＰＨＡ合成酵素の遺伝子をクローニングする
ことに成功し、その塩基配列を決定した。また、この遺
伝子がコードしているＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列を
解明した。以上の知見に基づき、本発明を完成するに至
った。

【００３１】すなわち、本発明のＰＨＡ合成酵素は、配
列番号：１に示すアミノ酸配列を有するポリヒドロキシ
アルカノエート合成酵素、あるいは、配列番号：３に示
すアミノ酸配列を有するポリヒドロキシアルカノエート
合成酵素である。さらには、本発明のＰＨＡ合成酵素
は、前記配列番号：１に示すアミノ酸配列を実質的に保
持し、そのポリヒドロキシアルカノエート合成酵素活性
を損なわない範囲でアミノ酸の欠失、置換もしくは付加
がなされた改変アミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素、
あるいは、前記配列番号：３に示すアミノ酸配列を実質
的に保持し、そのポリヒドロキシアルカノエート合成酵
素活性を損なわない範囲でアミノ酸の欠失、置換もしく
は付加がなされた改変アミノ酸配列を有するＰＨＡ合成
酵素とすることができる。

【００３２】一方、本発明のＰＨＡ合成酵素遺伝子は、
上記の配列番号：１に示すアミノ酸配列、またはその改
変アミノ酸配列をコードするＤＮＡを含むポリヒドロキ
シアルカノエート合成酵素遺伝子、あるいは、同じく、
上記の配列番号：３に示すアミノ酸配列、またはその改
変アミノ酸配列をコードするＤＮＡを含むポリヒドロキ
シアルカノエート合成酵素遺伝子である。特に、配列番
号：１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡとして、
配列番号：２に示すＤＮＡ塩基配列を含むＰＨＡ合成酵
素遺伝子、ならびに、配列番号：３に示すアミノ酸配列
をコードするＤＮＡとして、配列番号：４に示すＤＮＡ
塩基配列を含むＰＨＡ合成酵素遺伝子は、それぞれ、Ｐ
１６１株のゲノム遺伝子に由来する本発明のＰＨＡ合成
酵素遺伝子の一態様である。

【００３３】本発明の組換えベクターは、ポリヒドロキ
シアルカノエート合成酵素遺伝子として、上記するアミ
ノ酸配列をコードする遺伝子ＤＮＡを含有する組換えベ
クターである。また、本発明の形質転換微生物は、宿主
に適合させた組換えベクター導入により形質転換された
形質転換微生物である。

【００３４】さらに、本発明のポリヒドロキシアルカノ
エートの製造方法は、組換えベクターを導入した、上記
の形質転換微生物をポリヒドロキシアルカノエート合成
酵素の基質を含む培地で培養し、得られる培養物からポ
リヒドロキシアルカノエートを取得することを特徴とす
るポリヒドロキシアルカノエートの製造方法である。加
えて、本発明のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素
の生産方法は、組換えベクターを導入した、上記の形質
転換微生物を培養し、前記形質転換微生物にポリヒドロ
キシアルカノエート合成酵素を産出させることを特徴と
するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産方法
である。

【００３５】例えば、本発明のポリヒドロキシアルカノ
エートの製造方法は、上記の形質転換微生物を利用し
て、３ＨＦＰＶに由来する化学式（Ｉ）で示されるモノ
マーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートの製
造方法、３ＨＰｘＢに由来する化学式（VI）で示される
モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエート
の製造方法、あるいは、３ＨＰＨｘに由来する化学式
（IX）で示されるモノマーユニットを含むポリヒドロキ
シアルカノエートの製造方法のように、Ｐ１６１株由来
のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素に特徴的な基
質特異性を利用する製造方法とすると、好ましいもので
ある。

【００３６】

【発明の実施の形態】本発明のＰＨＡ合成酵素は、本発
明者らより分離された新規な微生物、シュードモナス・
ジェッセニイ・Ｐ１６１株（Pseudomonas jessenii P16
1：ＦＥＲＭＰ−１７４４５）に由来する酵素蛋白質で
ある。すなわち、５−（４−フルオロフェニル）吉草酸
（ＦＰＶＡ）を対応する３−ヒドロキシ−５−（４−フ
ルオロフェニル）吉草酸（３ＨＦＰＶ）に変換し、ま
た、４−フェノキシ酪酸（ＰｘＢＡ）を対応する３−ヒ
ドロキシ−４−フェノキシ酪酸（３ＨＰｘＢ）に変換
し、あるいは、６−フェニルヘキサン酸（ＰＨｘＡ）を
対応する３−ヒドロキシ−６−フェニルヘキサン酸（３
ＨＰＨｘ）に変換し、それぞれ対応するモノマーユニッ
トを含むＰＨＡの合成に係わる酵素活性を有する。

【００３７】以下、本発明のＰＨＡ合成酵素とそれをコ
ードする遺伝子について、より具体的に説明する。

【００３８】本発明者らは、Ｐ１６１株から、前記する
基質特異性を示すＰＨＡ合成酵素へ翻訳される遺伝子の
クローニングを行い、少なくとも二種のアミノ酸配列を
有するＰＨＡ合成酵素の存在を確認した。すなわち、本
発明のＰＨＡ合成酵素は、Ｐ１６１株の染色体遺伝子中
においては、配列番号：２に記載する塩基配列のＤＮＡ
によりコードされている、配列番号：１に記載するアミ
ノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素、ならびに、配列番
号：４に記載する塩基配列のＤＮＡによりコードされて
いる、配列番号：３に記載するアミノ酸配列を有するＰ
ＨＡ合成酵素、この二種類の酵素が存在する。前記の配
列番号：２に記載する塩基配列の遺伝子ＤＮＡおよび配
列番号：４に記載する塩基配列の遺伝子ＤＮＡは、下記
する手順によりクローニングされる。

【００３９】先ず、ＰＨＡ合成酵素は、染色体遺伝子か
ら翻訳される酵素蛋白質であるので、目的とするＰＨＡ
合成酵素遺伝子を内在している染色体ＤＮＡを取得す
る。Ｐ１６１株の菌体から染色体ＤＮＡの分離には、公
知の分離方法を用いることができる。例えば、Ｐ１６１
株をＬＢ培地、あるいはＭ９培地に適当な炭素源を加え
たもの等で培養した後、菌体を破砕して、例えば、マー
マーらの方法（Journalof Molecular Biology，３巻，
２０８頁，１９６１年）等により、染色体ＤＮＡを調製
する。

【００４０】次いで、上記の方法により得られた染色体
ＤＮＡより、遺伝子ライブラリーを作製する。染色体Ｄ
ＮＡを適当な制限酵素（例えば、Sau3AI等）を用いて分
解し、適当な断片長を有する分解物について、これを連
結可能な制限酵素（例えば、BamHI等）で切断したベク
ターに連結し、遺伝子ライブラリーを作製する。

【００４１】ライブラリーの作製に利用するベクターに
応じて、適当な断片長は、通常のプラスミドベクターを
用いるときは４０００〜２５０００塩基対程度、コスミ
ドあるいはファージベクターを用いるときは１５０００
〜３００００塩基対程度とする。適当な長さのＤＮＡ断
片を分取する方法としては、蔗糖密度勾配を用いる方法
やアガロースゲルを用いる方法（Molecular Cloning，C
old Spring Harbor Laboratory出版（１９８２年））な
ど公知の方法を用いれば良い。

【００４２】通常、遺伝子ライブラリーにおける宿主微
生物には、大腸菌を利用するので、ベクターは、宿主微
生物（大腸菌）において自律的に増殖し得るファージベ
クターまたはプラスミドベクターが使用される。汎用さ
れるファージベクターあるいはコスミドベクターとして
は、例えばpWE15、M13、λEMBL3、λEMBL4、λFIXII、
λDASHII、λZAPII、λgt10、λgt11、Charon4A、Charo
n21A等が挙げられる。また、多用されるプラスミドベク
ターとしては、例えばpBR系、pUC系、pBluescriptII
系、pGEM系、pTZ系、pET系等が挙げられる。その他、大
腸菌に加えて、シュードモナス属などの複数の宿主微生
物で自律的増殖が可能なベクター等の各種シャトルベク
ターを使用することもできる。このベクターについて
も、それと連結する染色体ＤＮＡ断片に合わせて、同様
に適当な制限酵素で切断することにより、所望の断片を
得ることができる。

【００４３】染色体ＤＮＡ断片とベクター断片との連結
はＤＮＡリガーゼを用いればよく、例えば、市販のライ
ゲーションキット（宝酒造（株）など）を用いて行うこ
とができる。このように、例えば、様々な染色体ＤＮＡ
断片とプラスミドベクター断片とを連結させ、種々のＤ
ＮＡ断片を含む組換えプラスミドの混合物（以下、遺伝
子ライブラリーと記載）を作製する。

【００４４】ここで遺伝子ライブラリー作製において、
適当な長さの染色体ＤＮＡ断片を用いる方法の他に、Ｐ
１６１株から全ｍＲＮＡを抽出・精製し、逆転写酵素を
利用してｃＤＮＡ断片を合成する方法（Molecular Clon
ing，Cold Spring Harbor Laboratory出版，１９８２
年）を利用することもできる。また、遺伝子ライブラリ
ーに調製したベクターを利用して、大腸菌に一度形質転
換あるいは形質導入した後、宿主大腸菌を培養して、遺
伝子ライブラリーを大量に増幅することも可能である
（Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory
出版，１９８２年）。

【００４５】遺伝子ＤＮＡ断片を含む組換えベクターの
宿主微生物への導入は、公知の方法により行う。例え
ば、宿主微生物に大腸菌を用いる場合には、塩化カルシ
ウム法（Journal of Molecular Biology，５３巻，１５
９頁，１９７０年）、塩化ルビジウム法（Methods in E
nzymology，６８巻，２５３頁，１９７９年）やエレク
トロポレーション法（Current Protocols in Molecular
Biology,１巻，１.８.４頁,１９９４年）等を利用し
て、組換えプラスミドベクターを導入できる。また、コ
スミドベクターやファージベクターを利用する場合、宿
主大腸菌の形質導入については、インビトロ・パッケー
ジング法（Current Protocols in Molecular Biology,
1巻， ５.７.１頁， １９９４年）等を用いることがで
きる。その他、組換えベクターを保持する菌株との接合
伝達による方法も、ベクターを保持する菌株の取得に利
用可能である。

【００４６】次に、前記遺伝子ライブラリー中から、Ｐ
１６１株のＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得
るためのプローブを調製する。

【００４７】公知の微生物において、そのＰＨＡ合成酵
素遺伝子について、既にいくつか、その塩基配列が報告
されている（Peoples, O. P. and Sinskey,A. J., J. B
iol.Chem., 264, 15293 (1989)；Huisman, G. W. et a
l., J. Biol. Chem., 266, 2191 (1991)；Pieper,U. et
al., FEMS Microbiol. Lett., 96, 73 (1992)；Timm,
A. and Steinbuchel, A., Eur. J. Biochem., 209, 15
(1992)；Matsusaki, H. et al., J. Bacteriol., 180,
6459 (1998)）。これら報告されている塩基配列を比較
して、塩基配列の保存度の高い領域を選択し、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと記載）に用いるプライマ
ー用のオリゴヌクレオチドを設計する。ＰＨＡ合成酵素
遺伝子の共通性を利用する、このようなプライマー用オ
リゴヌクレオチドとしては、Timm, A. and Steinbuche
l, A., Eur. J. Biochem., 209, 15 (1992)により報告
された塩基配列が挙げられるが、これに限定されるもの
ではない。オリゴヌクレオチドは、設計された塩基配列
に従って、例えば、アマシャム・ファルマシアバイオテ
クのカスタム合成サービス等、商業的なＤＮＡ合成装置
などを利用して合成が可能である。

【００４８】本発明のＰ１６１株由来のＰＨＡ合成酵素
遺伝子に対しては、ＰＣＲプライマー用のオリゴヌクレ
オチドとして、配列番号：６に記載する塩基配列ならび
に配列番号：７に記載する塩基配列の合成ＤＮＡを設計
した。

【００４９】次に、設計したオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとし、Ｐ１６１株の染色体ＤＮＡを鋳型として、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ＰＣＲ増幅断
片を採取する。得られたＰＣＲ増幅断片は、プライマー
に由来して、ＰＨＡ合成酵素遺伝子に共通する塩基配列
を両端に含む。両端のプライマーに相補的な塩基配列の
間に、テンプレートであるＰ１６１株のＰＨＡ合成酵素
遺伝子自体に由来する部分塩基配列を有するものとな
る。

【００５０】従って、得られたＰＣＲ増幅断片はＰ１６
１株のＰＨＡ合成酵素遺伝子に１００％近い相同性を有
する断片であり、コロニーハイブリダイゼーションを行
う際のプローブとして高いＳ／Ｎ比を期待することがで
きる。加えて、ハイブリダイゼーションのストリンジェ
ンシー制御を容易なものとすることが可能である。

【００５１】前記のＰＣＲ増幅断片を適当な試薬を用い
て標識し、プローブに用いて前記染色体ＤＮＡライブラ
リーについてコロニーハイブリダイゼーションを行い、
ＰＨＡ合成酵素遺伝子を保持する組換え大腸菌菌株を選
抜する（Current Protocolsin Molecular Biology，１
巻，６.０.３頁，１９９４年）。例えば、ＰＣＲ増幅断
片の標識は、標識酵素を用いる汎用の検出系、AlkPhosD
irect（アマシャム・ファルマシアバイオテク）などの
市販のキットを利用することができる。

【００５２】また、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を含む遺伝子
断片を保持する組換え大腸菌菌株の選抜は、上記の遺伝
子型を利用した選抜方法以外にもＰＨＡ合成の有無を直
接評価する表現型を利用した方法に拠ることも可能であ
る。すなわち、組換え大腸菌菌株において、保持するＰ
ＨＡ合成酵素遺伝子からＰＨＡ合成酵素の発現がなされ
る場合、そのＰＨＡ合成酵素によるＰＨＡの生産がなさ
れる。このＰＨＡ合成の有無を調べ、ＰＨＡ合成酵素の
発現がなされている組換え大腸菌菌株を選別することも
可能である。ＰＨＡ合成の有無を調べる方法としては、
例えば、スダンブラックＢにより染色する方法（Archiv
es of Biotechnology，７１巻，２８３頁，１９７０
年）、位相差顕微鏡によりＰＨＡの蓄積を調べる方法な
どを用いることができる。

【００５３】前記の何れかの方法により選抜した組換え
大腸菌から、アルカリ法（CurrentProtocols in Molecu
lar Biology，１巻，１.６.１頁，１９９４年）を用い
てプラスミドを回収する。この回収されたプラスミドか
ら、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片、あるい
は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を部分的に含むＤＮＡ断片複
数を得ることができる。採取したＤＮＡ断片の塩基配列
の決定は、例えばサンガー法（Molecular Cloning，２
巻，１３.３頁，１９８９年）等によって行うことが可
能である。具体的には、塩基配列自動分析装置、例えば
ＤＮＡシーケンサー３７７Ａ（パーキン・エルマー）等
を用いてダイプライマー法あるいはダイターミネーター
法により行うことができる。ＤＮＡ断片が組み込まれた
ベクター自体の塩基配列は既知であるので、そこにクロ
ーニングされているＤＮＡ断片の塩基配列は、一義的に
解析が可能である。

【００５４】なお、上記方法により、採取したＰＨＡ合
成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片の全塩基配列を決定した
後は、化学合成法、染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ
法、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片の制限酵素
による分解等の任意の方法により調製したＤＮＡ断片を
プローブとしてハイブリダイズすることにより、本発明
のＰＨＡ合成酵素遺伝子ＤＮＡを得ることが可能であ
る。

【００５５】本発明者らは、上述の手順に従って、Ｐ１
６１株から、前記する基質特異性を示すＰＨＡ合成酵素
へ翻訳される遺伝子の選別を行い、少なくとも二種のア
ミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素の存在を見出した。
すなわち、Ｐ１６１株の染色体ＤＮＡから採取した、配
列番号：２に示す塩基配列を有する本発明のＰＨＡ合成
酵素遺伝子と、この遺伝子によりコードされている配列
番号：１に示すアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素、
ならびに、配列番号：４に示す塩基配列を有する本発明
のＰＨＡ合成酵素遺伝子と、この遺伝子によりコードさ
れている配列番号：３に示すアミノ酸配列を有するＰＨ
Ａ合成酵素である。

【００５６】また、本発明のＰＨＡ合成酵素遺伝子は、
例えば、そのコードするアミノ酸配列が同じとなる、縮
重コドンにおいてのみ異なる、同一のポリペプチドをコ
ードする縮重異性体も包含する。より具体的には、同一
のアミノ酸をコードする縮重コドンを、宿主に依存し
て、より使用頻度の高いコドンを選択し、変換した縮重
異性体をも包含する。一方、本発明のＰＨＡ合成酵素
は、Ｐ１６１株固有の配列番号：１に示すアミノ酸配列
を有するＰＨＡ合成酵素、および配列番号：３に示すア
ミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素に加え、そのＰＨＡ
合成活性ならびに基質特異性を損なわない限り、また、
アミノ酸配列を実質的に維持する範囲内で、いくつかの
アミノ酸について欠失、置換、付加等の変異があっても
よい。ここで、欠失、置換、付加等の変異は、配列番
号：２に示す塩基配列あるいは配列番号：４に示す塩基
配列を有する、Ｐ１６１株固有のＰＨＡ合成酵素遺伝子
を基にして、部位突然変異導入方法（Current Protocol
s in Molecular Biology１巻，８.１.１頁，１９９４
年）等により導入可能である。

【００５７】本発明の組換えベクターは、本発明の組換
え型ＰＨＡ合成酵素を、シュードモナス属に属する微生
物、大腸菌等の微生物を宿主として、発現する用途に用
いるものである。従って、本発明の組換えベクター自体
が、用いる宿主中で自律複製可能であると同時に、発現
を誘起するプロモーター、本発明のＰＨＡ合成酵素遺伝
子ＤＮＡ、ならびに宿主に適する転写終結配列を含む構
成であることが好ましい。加えて、組換えベクターの導
入後、その選別に利用される各種のマーカー遺伝子を具
えるベクターを用いるとよい。

【００５８】シュードモナス属に属する微生物、大腸菌
など、多種な細菌の宿主に適合する発現ベクターとして
は、広範囲の宿主において複製・保持されるRK2複製起
点を有するpLA2917 (ATCC 37355)やRSF1010複製起点を
有するpJRD215 (ATCC 37533)等が挙げられる。これらに
限らず、広範囲の宿主において複製・保持される複製起
点を有するものならば何れも使用可能である。プロモー
ターは、宿主とする細菌中で発現できるものであれば何
れも使用可能であり、例えば、trpプロモーター、trcプ
ロモーター、tacプロモーター、lacプロモーター、PLプ
ロモーター、PRプロモーター、T7プロモーター、T3プロ
モーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモー
ターを用いることができる。

【００５９】酵母を宿主として用いる場合は、発現ベク
ターとして、例えば、YEp13、YCp50、pRS系、pYEX系ベ
クター等が利用可能である。プロモーターとしては、例
えば、ＧＡＬプロモーター、ＡＯＤプロモーター等を用
いることができる。

【００６０】本発明の形質転換微生物は、本発明の組換
えベクターを、その組換えベクターを作製する際に用い
た発現ベクターに適合する宿主中に導入することにより
得られる。宿主として利用可能な細菌類として、エシェ
リチア（Esherichia）属、シュードモナス(Pseudomona
s）属、ラルストーニャ（Ralstonia）属、アルカリゲネ
ス属(Alcaligenes）、コマモナス（Comamonas）属、バ
ルクホルデリア（Burkholderia）属、アグロバクテリウ
ム(Agrobacterium）属、フラボバクテリウム(Flabobact
erium)属、ビブリオ(Vibrio)属、エンテロバクター(Ent
erobacter)属、リゾビウム(Rhizobium）属、グルコノバ
クター（Gluconobacter)属、アシネトバクター（Acinet
obacter）属、モラセラ（Moraxella）属、ニトロゾモナ
ス（Nitrosomonas）属、アエロモナス（Aeromonas）
属、 パラコッカス（Paracoccus）属、バチルス（Bacil
lus）属、クロストリヂウム(Clostridium）属、ラクト
バチルス（Lactobacillus）属、コリネバクテリウム(Co
rynebacterium）属、アルスロバクター（Arthrobacte
r）属、アクロモバクター（Achromobacter）属、ミクロ
コッカス（Micrococcus）属、マイコバクテリウム（Myc
obacterium）属、ストレプトコッカス(Streptococcus）
属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、アクチノマ
イセス(Actinomyces）属、ノカルジア（Nocardia）属、
メチロバクテリウム（Methylobacterium）属などの各種
細菌が挙げられる。細菌への組換えＤＮＡの導入方法と
しては、前述した塩化カルシウム法やエレクトロポレー
ション法等が利用可能である。

【００６１】また、上記の細菌以外にも、宿主に利用で
きる微生物として、サッカロミセス（Saccharomyces）
属、カンジダ（Candida）属等の酵母、かび等が挙げら
れる。酵母への組換えＤＮＡの導入方法としては、例え
ば、エレクトロポレーション法（Methods Enzymol.,19
4,182-187(1990))、スフェロプラスト法（Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 84, 1929-1933 (1978))、酢酸リチウ
ム法（J. Bacteriol., 153, 163-168 (1983)）等が利用
可能である。

【００６２】本発明のＰＨＡ合成酵素は、上記の手法で
創製される本発明の形質転換体を培養し、導入されてい
る発現ベクター中の対応するＰＨＡ合成酵素遺伝子から
組換え型蛋白質として生産される。その培養物（培養菌
体又は培養上清）中に本発明のＰＨＡ合成酵素を産生・
蓄積させ、培養物から目的のＰＨＡ合成酵素を分離・取
得することにより、組換え型酵素蛋白質の生産を行うこ
とができる。この目的では、本発明の形質転換体を培養
する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法を用い
ればよい。また培養方法は、バッチ式、流動バッチ式、
連続培養、リアクター形式等、通常の微生物の培養に用
いるいかなる方法をも用いることができる。なお、この
培養には、例えば、前記ポリヒドロキシアルカノエート
合成酵素遺伝子発現の誘導物質を含む培地を用いること
もできる。

【００６３】大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質
転換体においては、培養に用いる培地として、完全培地
あるいは合成培地、例えばＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げ
られる。また、培養温度は２５〜３７℃の範囲で、好気
的に８〜７２時間培養することにより、微生物の増殖を
図る。その後、集菌し、菌体内に蓄積されたＰＨＡ合成
酵素の回収を行うことができる。この微生物の増殖に必
要な炭素源として、例えば、グルコース、フラクトー
ス、スクロース、マルトース、ガラクトース、でんぷん
等の糖類、エタノール、プロパノール、ブタノール等の
低級アルコール類、グリセリン等の多価アルコール類、
酢酸、クエン酸、コハク酸、酒石酸、乳酸、グルコン酸
等の有機酸、プロピオン酸、ブタン酸、ペンタン酸、ヘ
キサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン
酸、ウンデカン酸、ドデカン酸等の脂肪酸等が利用でき
る。

【００６４】窒素源としては例えばアンモニア、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等
のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、麦芽エキス、カゼイン分解物、コーンスティープリ
カー等の天然物由来のものが挙げられる。また、無機物
として、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリ
ウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナ
トリウム等が挙げられる。培養液には、マーカー遺伝子
として用いている各種薬剤耐性遺伝子等に応じて、カナ
マイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラム
フェニコール、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加
してもよい。

【００６５】また、発現ベクターにおいて、誘導性のプ
ロモーターを用いている場合は、形質転換した微生物を
培養する際に、そのプロモーターの種類に応じて適する
誘導物質を培地に添加して、発現を促せばよい。例え
ば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、インドールアクリル
酸（ＩＡＡ）等が誘導物質として挙げられる。

【００６６】ＰＨＡ合成酵素の分離・精製は、得られる
培養物を遠心・回収し、アフィニティークロマトグラフ
ィー、陽イオン又は陰イオン交換クロマトグラフィー、
ゲルろ過等の手段を単独でまたは適宜組み合わせること
によって行うことができる。得られた精製物質が目的の
酵素であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動、ウエスタンブロッティ
ング等により行う。

【００６７】なお、本発明の形質転換微生物の培養、本
発明の形質転換微生物によるＰＨＡ合成酵素の生産、菌
体内への蓄積、並びに、菌体からのＰＨＡ合成酵素の回
収および精製は、上に例示した方法に限定されるもので
はない。

【００６８】本発明の形質転換微生物を培養して、組換
え型ＰＨＡ合成酵素を発現させ、目的のＰＨＡを産生さ
せることができる。例えば、前記の培養条件で培養し
て、組換え型ＰＨＡ合成酵素を生産させ、その際、目的
とするＰＨＡに対応する基質を培地に添加し、ＰＨＡ合
成酵素を作用させる。培養物、生産菌体からのＰＨＡの
回収は、通常行われているクロロホルム等の有機溶媒に
よる抽出が最も簡便ではある。また、クロロホルム等の
有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の
界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処
理、ＥＤＴＡ、次亜塩素酸ナトリウム、アンモニア等の
薬剤による処理によってＰＨＡ以外の菌体成分を除去し
て、ＰＨＡを回収する方法を用いることもできる。な
お、ＰＨＡ製造を目的とする本発明の形質転換微生物の
培養、培養した微生物によるＰＨＡの生産、菌体内への
蓄積、並びに、形質転換微生物の菌体からのＰＨＡの回
収は、上に例示した方法に限定されるものではない。

【００６９】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、以下に述べる実施例は本発明の最良の
実施形態の一例ではあるものの、本発明の技術的範囲
は、これら実施例に限定されるものではない。

【００７０】（実施例１） Ｐ１６１株のＰＨＡ合成酵
素遺伝子のクローニング Ｐ１６１株を１００mlのＬＢ培地（１％ポリペプトン、
０.５％酵母エキス、０.５％塩化ナトリウム、ｐＨ７.
４）で、３０℃、一晩培養後、マーマーらの方法により
染色体ＤＮＡを分離回収した。得られた染色体ＤＮＡを
制限酵素Bgl IIで完全分解した。ベクターにはpUC18を
使用し、制限酵素BamH Iで切断した。末端の脱リン酸化
処理（Molecular Cloning，１巻，５.７.２頁，１９８
９年；Cold Spring Harbor Laboratory出版）の後、Ｄ
ＮＡライゲーションキットVer.II（宝酒造）を用いて、
ベクターの切断部位（クローニングサイト）と染色体Ｄ
ＮＡのBgl II完全分解断片とを連結した。この染色体Ｄ
ＮＡ断片を組み込んだプラスミドベクターを用いて、大
腸菌（Escheichia coli）HB101株を形質転換し、Ｐ１６
１株の染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。

【００７１】次に、Ｐ１６１株のＰＨＡ合成酵素遺伝子
を含むＤＮＡ断片を選択するため、コロニー・ハイブリ
ダイズ用のプローブ調製を行った。配列番号：６および
配列番号：７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを
合成し（アマシャムファルマシア・バイオテク）、この
オリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、染色体ＤＮ
ＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅さ
れてきたＤＮＡ断片をプローブとして用いた。プローブ
の標識化は、市販の標識酵素系AlkPhosDirect（アマシ
ャムファルマシア・バイオテク）を利用して行った。得
られた標識化プローブを用いて、Ｐ１６１株の染色体Ｄ
ＮＡライブラリーからコロニーハイブリダイゼーション
法によってＰＨＡ合成酵素遺伝子を含む組換えプラスミ
ドを有する大腸菌菌株を選抜した。選抜した菌株から、
アルカリ法によってプラスミドを回収することで、ＰＨ
Ａ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができ
た。

【００７２】ここで取得した遺伝子ＤＮＡ断片を、不和
合性グループであるIncP、IncQ、あるいはIncWの何れに
も属さない広宿主域複製領域を含むベクターpBBR122（M
o BiTec）に組み換えた。この組み換えプラスミドをシ
ュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１ｍ１株（ＰＨＡ
合成能欠損株）にエレクトロポレーション法により形質
転換したところ、Ｐ１６１ｍ１株のＰＨＡ合成能が復帰
し、相補性を示した。従って、選抜された遺伝子ＤＮＡ
断片は、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１ｍ１
株内において、ＰＨＡ合成酵素に翻訳可能な、ＰＨＡ合
成酵素遺伝子領域を含むことが確認される。

【００７３】このＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断
片について、サンガー法により塩基配列を決定した。そ
の結果、決定された塩基配列中には、それぞれペプチド
鎖をコードする、配列番号：２および配列番号：４で示
される塩基配列が存在することが確認された。下で述べ
るように、個々のペプチド鎖からなる蛋白質は、ともに
酵素活性を有しており、配列番号：２および配列番号：
４で示される塩基配列はそれぞれＰＨＡ合成酵素遺伝子
であることを確認することができた。すなわち、配列番
号：１に示すアミノ酸配列を配列番号：２の塩基配列は
コードしており、配列番号：３に示すアミノ酸配列を配
列番号：４の塩基配列はコードしており、この何れか一
方のアミノ酸配列を有する蛋白質のみで、ＰＨＡ合成能
が発揮されることを確認した。

【００７４】（実施例２） ＹＮ２株のＰＨＡ合成酵素
遺伝子の発現ベクターへの組換え 配列番号：２で示される塩基配列のＰＨＡ合成酵素遺伝
子について、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ
を行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を再調製した。
配列番号：２で示される塩基配列に対して、上流側プラ
イマーとなる、その開始コドンより上流の塩基配列を有
するオリゴヌクレオチド（配列番号：８）および下流側
プライマーとなる、終止コドンより下流の塩基配列を有
するオリゴヌクレオチド（配列番号：９）をそれぞれ設
計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテ
ク）。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐ
ＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した
（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造）。

【００７５】同様に、配列番号：４で示される塩基配列
のＰＨＡ合成酵素遺伝子についても、染色体ＤＮＡをテ
ンプレートとしてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子
の完全長を再調製した。配列番号：４で示される塩基配
列に対して、上流側プライマーとなる、その開始コドン
より上流の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列
番号：１０）および下流側プライマーとなる、終止コド
ンより下流の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配
列番号：１１）をそれぞれ設計・合成した（アマシャム
ファルマシア・バイオテク）。このオリゴヌクレオチド
をプライマーとして、ＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺
伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒
造）。

【００７６】次に、得られたＰＨＡ合成酵素遺伝子の完
全長を含むＰＣＲ増幅断片を、それぞれについて制限酵
素Hind IIIを用いて完全分解した。また、発現ベクター
pTrc99Aも制限酵素Hind IIIで切断し、脱リン酸化処理
（Molecular Cloning，１巻，５.７.２頁，１９８９
年；Cold Spring Harbor Laboratory出版）した。この
発現ベクターpTrc99Aの切断部位に、両末端の不用な塩
基配列を除いたＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を含むＤ
ＮＡ断片を、ＤＮＡライゲーションキットVer.II（宝酒
造）を用いて連結した。

【００７７】得られた組換えプラスミドで大腸菌（Esch
erichia coli HB101：宝酒造）を塩化カルシウム法によ
り形質転換した。得られた組換え体を培養し、組換えプ
ラスミドの増幅を行い、組換えプラスミドをそれぞれ回
収した。配列番号：２の遺伝子ＤＮＡを保持する組換え
プラスミドをpP161-C1（配列番号２由来）、配列番号：
４の遺伝子ＤＮＡを保持する組換えプラスミドをpP161-
C2（配列番号４由来）とした。

【００７８】（実施例３） ＰＨＡ合成酵素遺伝子組換
え大腸菌によるＰＨＡ生産−１ 実施例２で得られた組換えプラスミド、pP161-C1（配列
番号２由来）、pP161-C2（配列番号４由来）で大腸菌
（Escherichia coli HB101fB fadB欠損株）を塩化カル
シウム法により形質転換し、それぞれの組換えプラスミ
ドを保持する組換え大腸菌株、pP161-C1組換え株、pP16
1-C2組換え株を得た。

【００７９】pP161-C1組換え株、pP161-C2組換え株それ
ぞれを酵母エキス０．５％、ＦＰＶＡ０．１％とを含む
Ｍ９培地２００ｍｌに植菌して、３７℃、１２５ストロ
ーク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離
によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥
した。

【００８０】この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのクロ
ロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを
抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィ
ルターでろ過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮
した。次いで、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、
更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得
られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったの
ち、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−Ｍ
Ｓ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモ
ノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。
表１に、各菌株について、菌体乾燥重量、回収されたＰ
ＨＡのポリマー乾燥重量、菌体当たりのポリマー収率
（ポリマー乾燥重量／菌体乾燥重量）ならびにモノマー
ユニットの同定結果を併せて示す。

【００８１】

【表１】

【００８２】以上に示すように、pP161-C1組換え株、pP
161-C2組換え株ともに、基質の５−（４−フルオロフェ
ニル）吉草酸から、対応する３−ヒドロキシ−５−（４
−フルオロフェニル）吉草酸に由来する化学式（Ｉ）に
示すモノマーユニットを主成分とするＰＨＡを生産する
ことが判る。従って、pP161-C1組換え株は、配列番号：
２に示す塩基配列を含むＰＨＡ合成酵素遺伝子から翻訳
される、配列番号：１に示すアミノ酸配列のＰＨＡ合成
酵素のみを、pP161-C2組換え株は、配列番号：４に示す
塩基配列を含むＰＨＡ合成酵素遺伝子から翻訳される、
配列番号：３に示すアミノ酸配列のＰＨＡ合成酵素のみ
を、それぞれ生産するが、この両者ともに、同じく基質
の５−（４−フルオロフェニル）吉草酸から、対応する
３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロフェニル）吉草酸
に由来する化学式（Ｉ）に示すモノマーユニットへの変
換と、それを含むＰＨＡの合成を行うことが確認され
る。

【００８３】（実施例４） ＰＨＡ合成酵素遺伝子組換
え大腸菌によるＰＨＡ生産−２ pP161-C1組換え株、pP161-C2組換え株それぞれを酵母エ
キス０．５％、４−フェノキシ酪酸（ＰｘＢＡ）０．２
％とを含むＭ９培地２００ｍｌに植菌して、３７℃、１
２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体
を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄し
て凍結乾燥した。

【００８４】この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのクロ
ロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを
抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィ
ルターでろ過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮
した。濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿
のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰ
ＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガス
クロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津
ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユ
ニットのメチルエステル化物の同定を行った。表２に、
各菌株について、菌体乾燥重量、回収されたＰＨＡのポ
リマー乾燥重量、菌体当たりのポリマー収率（ポリマー
乾燥重量／菌体乾燥重量）ならびにモノマーユニットの
同定結果を併せて示す。

【００８５】

【表２】

【００８６】以上に示すように、pP161-C1組換え株、pP
161-C2組換え株ともに、基質の４−フェノキシ酪酸か
ら、対応する３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸に由
来する化学式（VI）に示すモノマーユニットを主成分と
するＰＨＡを生産することが判る。従って、pP161-C1組
換え株は、配列番号：２に示す塩基配列を含むＰＨＡ合
成酵素遺伝子から翻訳される、配列番号：１に示すアミ
ノ酸配列のＰＨＡ合成酵素のみを、pP161-C2組換え株
は、配列番号：４に示す塩基配列を含むＰＨＡ合成酵素
遺伝子から翻訳される、配列番号：３に示すアミノ酸配
列のＰＨＡ合成酵素のみを、それぞれ生産するが、この
両者ともに、同じく基質の４−フェノキシ酪酸から、対
応する３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸に由来する
化学式（VI）に示すモノマーユニットへの変換と、それ
を含むＰＨＡの合成を行うことが確認される。

【００８７】（実施例５） ＰＨＡ合成酵素遺伝子組換
え大腸菌によるＰＨＡ生産−３ pP161-C1組換え株、pP161-C2組換え株それぞれを酵母エ
キス０．５％、６−フェニルヘキサン酸（ＰＨｘＡ）
０．１％とを含むＭ９培地２００ｍｌに植菌して、３７
℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間
後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一
度洗浄して凍結乾燥した。

【００８８】この凍結乾燥ペレットを１００ｍｌのクロ
ロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを
抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィ
ルターでろ過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮
した。濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿
のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰ
ＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガス
クロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津
ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユ
ニットのメチルエステル化物の同定を行った。表３に、
各菌株について、菌体乾燥重量、回収されたＰＨＡのポ
リマー乾燥重量、菌体当たりのポリマー収率（ポリマー
乾燥重量／菌体乾燥重量）ならびにモノマーユニットの
同定結果を併せて示す。

【００８９】

【表３】

【００９０】以上に示すように、pP161-C1組換え株、pP
161-C2組換え株ともに、基質の６−フェニルヘキサン酸
から、対応する３−ヒドロキシ−６−フェニルヘキサン
酸に由来する化学式（IX）に示すモノマーユニットを主
成分とするＰＨＡを生産することが判る。従って、pP16
1-C1組換え株は、配列番号：２に示す塩基配列を含むＰ
ＨＡ合成酵素遺伝子から翻訳される、配列番号：１に示
すアミノ酸配列のＰＨＡ合成酵素のみを、pP161-C2組換
え株は、配列番号：４に示す塩基配列を含むＰＨＡ合成
酵素遺伝子から翻訳される、配列番号：３に示すアミノ
酸配列のＰＨＡ合成酵素のみを、それぞれ生産するが、
この両者ともに、同じく基質の６−フェニルヘキサン酸
から、対応する３−ヒドロキシ−６−フェニルヘキサン
酸に由来する化学式（IX）に示すモノマーユニットへの
変換と、それを含むＰＨＡの合成を行うことが確認され
る。

【００９１】上記実施例３、４の結果をも考慮すると、
配列番号：１に示すアミノ酸配列のＰＨＡ合成酵素と配
列番号：３に示すアミノ酸配列のＰＨＡ合成酵素は、互
いの基質の特異性が類似した酵素活性を有することが判
る。

【００９２】

【発明の効果】本発明のＰＨＡ合成酵素、ならびにこの
ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子は、新規な微生物シ
ュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株に由来するも
のであり、新規な側鎖構造を有するモノマーユニットを
選択的に含むＰＨＡ合成を行うという基質特異性を示
す。また、このＰＨＡ合成酵素遺伝子を含む組換えベク
ター、および該組換えベクターにより形質転換された形
質転換微生物は、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１
６１株と同様の基質特異性を示すＰＨＡ合成能を有した
ものとなる。このように、本発明のＰＨＡ合成酵素遺伝
子は、新規な側鎖構造を有するモノマーユニットを選択
的に含むＰＨＡ合成を可能とする酵素をコードしてお
り、種々の有用な物性を有し、機能性ポリマーへの応用
が期待されるＰＨＡを合成する上で、有用な形質転換微
生物の創製を可能とする。

【００９３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> CANON INC. <120> Enzymes for Preparation of Poly-hidroxyalkanoic Acid and Genes Enc oding those <130> 4051021 <160> 11 <170> Microsoft Word <210> 1 <211> 559 <212> PRT <213> Pseudomonas jessenii P161 ; FERM P-17445 <400> 1 Met Ser Asn Lys Asn Asn Asp Asp Leu Lys Ser Gln Ala Ser Glu 1 5 10 15 Asn Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Val Gly Leu Arg Gly Lys Asp 20 25 30 Leu Leu Ala Ser Ala Arg Met Val Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln 35 40 45 Pro Ile His Ser Ala Arg His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu 50 55 60 Lys Asn Val Leu Leu Gly Lys Ser Glu Leu Leu Pro Thr Ser Asp 65 70 75 Asp Arg Arg Phe Ala Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr 80 85 90 Lys Arg Tyr Leu Gln Thr Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His 95 100 105 Asp Trp Ile Asp Asp Ser Asn Leu Pro Ala Lys Asp Val Ser Arg 110 115 120 Gly His Phe Val Ile Asn Leu Met Thr Glu Ala Phe Ala Pro Thr 125 130 135 Asn Thr Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val Lys Arg Phe Phe Glu Thr 140 145 150 Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser His Leu Ala Lys Asp 155 160 165 Leu Val His Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val Asn Met Gly Ala 170 175 180 Phe Glu Val Gly Lys Thr Leu Gly Val Thr Glu Gly Ala Val Val 185 190 195 Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro Ile Thr 200 205 210 Glu Gln Val His Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln Ile 215 220 225 Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Glu Lys Ser Leu Ala 230 235 240 Arg Phe Cys Leu Arg Asn Asn Val Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp 245 250 255 Arg Asn Pro Thr Lys Glu Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr 260 265 270 Ile Glu Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Thr Ala Ile Thr 275 280 285 Gly Ser Lys Asp Val Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile 290 295 300 Thr Cys Thr Ala Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Ile Gly Glu Asn 305 310 315 Lys Val Asn Ala Leu Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr 320 325 330 Leu Asp Ser Asp Val Ala Leu Phe Val Asp Glu Gln Thr Leu Glu 335 340 345 Ala Ala Lys Arg Gln Ser Tyr Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg 350 355 360 Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile 365 370 375 Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu Leu Gly Asn Glu Pro Pro 380 385 390 Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp Thr Thr Arg Leu Pro 395 400 405 Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Met Phe Lys Ser Asn Pro 410 415 420 Leu Thr Arg Ala Asp Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr Pro Ile Asp 425 430 435 Leu Lys Lys Val Thr Ala Asp Ile Phe Ser Leu Ala Gly Thr Ser 440 445 450 Asp His Ile Thr Pro Trp Arg Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln Leu 455 460 465 Phe Gly Gly Asn Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile 470 475 480 Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met 485 490 495 Thr Ser Thr Glu Met Pro Ala Asn Ala Asp Asp Trp Gln Glu Glu 500 505 510 Ser Thr Lys His Ala Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp 515 520 525 Gln Ala Gln Arg Ser Gly Asn Leu Lys Lys Ala Pro Leu Lys Leu 530 535 540 Gly Asn Lys Ala Tyr Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr 545 550 555 Val His Glu Arg <210> 2 <211> 1680 <212> DNA <213> Pseudomonas jessenii P161 ; FERM P-17445 <400> 2 atgagtaaca agaataacga tgacttgaag agtcaagcct cggaaaacac 50 cttggggctg aatcctgtcg ttggactgcg tggaaaggat ctactggctt 100 ctgctcgaat ggtgctcagg caggccatca agcaaccgat tcacagcgcc 150 aggcatgtcg ctcatttcgg cctggaactc aagaacgtgc tgctcggcaa 200 atccgagctg ctaccgacca gcgatgaccg tcgtttcgcg gatccggcct 250 ggagccagaa cccgctctac aaacgttatc tgcaaaccta cctggcgtgg 300 cgcaaggaac tccacgactg gatcgacgac agcaacctgc cggccaagga 350 cgtcagccgc gggcacttcg tgatcaacct catgaccgag gccttcgccc 400 cgaccaacac ggcggccaac ccggcggcgg tcaaacgctt cttcgaaacc 450 ggtggcaaga gcctgctcga tggcctctcg catctggcca aggacctggt 500 acataacggc ggcatgccga gccaggtcaa catgggcgca ttcgaggtcg 550 gcaagaccct tggcgtgacc gagggcgcgg tggtctttcg caatgacgtg 600 ctggaactga tccagtacaa accgatcacc gagcaggtgc atgaacgccc 650 actgctggtg gtaccgccac agatcaacaa gttctacgtt ttcgacctga 700 gcccggaaaa gagcctggcg cgattctgcc tgcgcaacaa cgtgcagacc 750 ttcatcgtca gctggcgcaa cccgaccaag gagcagcgcg agtggggcct 800 gtcgacctac atcgaagcgc tcaaggaagc ggttgatgtg gtcaccgcca 850 tcaccggcag caaagacgtg aacatgctcg gtgcctgctc cggcggcatc 900 acctgcaccg cgctgctggg ccactacgca gcaatcggcg agaacaaggt 950 caacgccctg accctgctgg tcagcgtgct cgacaccacc ctggacagcg 1000 acgtggccct gttcgtcgac gagcagaccc tcgaagccgc caagcgccag 1050 tcgtaccagg ccggtgtact cgaaggccgt gacatggcga aagtcttcgc 1100 ctggatgcgc cccaacgacc tgatctggaa ctactgggtc aacaactact 1150 tgttgggcaa cgagccgccg gtattcgaca ttctgttctg gaacaacgac 1200 accacccggt tgcccgccgc gttccatggc gacctgatcg agatgttcaa 1250 aagtaacccg ttgacccgtg ccgatgcact ggaagtgtgc ggtacgccga 1300 tcgatctgaa gaaagtcacc gccgacatct tctcgctggc cggcaccagc 1350 gaccacatta ccccgtggcg ctcctgctac aagtcggcgc aactgttcgg 1400 cggcaacgtt gaattcgtat tgtccagcag cgggcacatc cagagcattc 1450 tgaacccgcc gggcaatccg aaatcgcgtt acatgaccag caccgaaatg 1500 cccgccaatg ccgatgactg gcaggaagag tcgaccaagc acgccgactc 1550 ctggtggctg cactggcagg catggcaggc acagcgttcg ggcaacctga 1600 aaaaagcccc gctgaaattg ggcaacaagg cctatccagc gggtgaagcc 1650 gcaccgggca cttacgtgca tgagcggtaa 1680 <210> 3 <211> 560 <212> PRT <213> Pseudomonas jessenii P161 ; FERM P-17445 <400> 3 Met Arg Glu Lys Pro Ala Arg Asp Ser Leu Pro Thr Pro Ala Ala 1 5 10 15 Phe Ile Asn Ala Gln Ser Ala Ile Thr Gly Leu Arg Gly Arg Asp 20 25 30 Leu Leu Ser Thr Leu Arg Ser Val Ala Ala His Gly Leu Arg Asn 35 40 45 Pro Val His Ser Ala Arg His Ala Leu Lys Leu Gly Gly Gln Leu 50 55 60 Gly Arg Val Leu Leu Gly Glu Thr Leu His Pro Thr Asn Pro Gln 65 70 75 Asp Thr Arg Phe Ala Asp Pro Ala Trp Ser Leu Asn Pro Phe Tyr 80 85 90 Arg Arg Ser Leu Gln Ala Tyr Leu Ser Trp Gln Lys Gln Val Lys 95 100 105 Ser Trp Ile Asp Glu Ser Asn Met Ser Pro Asp Asp Arg Ala Arg 110 115 120 Ala His Phe Ala Phe Ala Leu Leu Asn Asp Ala Val Ser Pro Ser 125 130 135 Asn Thr Leu Leu Asn Pro Leu Ala Val Lys Glu Phe Phe Asn Ser 140 145 150 Gly Gly Asn Ser Leu Val Arg Gly Ile Gly His Leu Val Asp Asp 155 160 165 Leu Leu His Asn Asp Gly Leu Pro Arg Gln Val Thr Lys Gln Ala 170 175 180 Phe Glu Val Gly Lys Thr Val Ala Thr Thr Thr Gly Ala Val Val 185 190 195 Phe Arg Asn Glu Leu Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro Met Ser 200 205 210 Glu Lys Gln Tyr Ser Lys Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln Ile 215 220 225 Asn Lys Tyr Tyr Ile Phe Asp Leu Ser Pro His Asn Ser Phe Val 230 235 240 Gln Tyr Ala Leu Lys Asn Gly Leu Gln Thr Phe Met Ile Ser Trp 245 250 255 Arg Asn Pro Asp Val Arg His Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr 260 265 270 Val Glu Ala Val Glu Glu Ala Met Asn Val Cys Arg Ala Ile Thr 275 280 285 Gly Ala Arg Glu Val Asn Leu Met Gly Ala Cys Ala Gly Gly Leu 290 295 300 Thr Ile Ala Ala Leu Gln Gly His Leu Gln Ala Lys Arg Gln Leu 305 310 315 Arg Arg Val Ser Ser Ala Thr Tyr Leu Val Ser Leu Leu Asp Ser 320 325 330 Glu Leu Asp Ser Pro Ala Ser Leu Phe Ala Asp Glu Gln Thr Leu 335 340 345 Glu Ala Ala Lys Arg Arg Ser Tyr Gln Lys Gly Val Leu Asp Gly 350 355 360 Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp Met Arg Pro Asn Asp Leu 365 370 375 Ile Trp Ser Tyr Phe Val Asn Asn Tyr Leu Leu Gly Lys Glu Pro 380 385 390 Pro Ala Phe Asp Ile Leu Tyr Trp Asn Asn Asp Ser Thr Arg Leu 395 400 405 Pro Ala Ala Leu His Gly Asp Leu Leu Asp Phe Phe Lys His Asn 410 415 420 Pro Leu Thr His Pro Gly Gly Leu Glu Val Cys Gly Thr Pro Ile 425 430 435 Asp Leu Gln Lys Val Thr Val Asp Ser Phe Ser Val Ala Gly Ile 440 445 450 Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Asp Ala Val Tyr Arg Ser Ala Leu 455 460 465 Leu Leu Gly Gly Glu Arg Arg Phe Val Leu Ser Asn Ser Gly His 470 475 480 Val Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Ser Asn Pro Lys Ala Asn Tyr 485 490 495 Val Glu Asn Gly Lys Leu Ser Ser Asp Pro Arg Ala Trp Tyr Tyr 500 505 510 Asp Ala Arg His Val Asp Gly Ser Trp Trp Thr Gln Trp Leu Ser 515 520 525 Trp Ile Gln Glu Arg Ser Gly Ala Gln Lys Glu Thr His Met Ala 530 535 540 Leu Gly Asn Gln Asn Tyr Pro Pro Met Glu Ala Ala Pro Gly Thr 545 550 555 Tyr Val Arg Val Arg 560 <210> 4 <211> 1683 <212> DNA <213> Pseudomonas jessenii P161 ; FERM P-17445 <400> 4 atgcgcgaga aaccagcgag ggattcctta ccgactcccg ccgcgttcat 50 caatgcacag agtgcgatta ccggcctgcg cggtcgggat ctgttatcga 100 ccctgcgtag tgtggccgcc catggcttgc gcaatccggt gcacagtgcc 150 cgacatgccc tcaaactcgg cggccagctc ggtcgtgtgt tgctgggcga 200 aaccctgcac ccgaccaacc cgcaggacac tcgcttcgcc gatccggcgt 250 ggagcctcaa cccgttttat cggcgcagcc tgcaggctta tctgagctgg 300 cagaagcagg tcaaaagctg gatcgacgag agcaacatga gcccggacga 350 ccgtgcccgc gcccacttcg ctttcgcctt gctcaacgac gccgtatcgc 400 cctccaacac cctgctcaat ccattggcgg tcaaggagtt cttcaattcc 450 gggggtaaca gcctggtgcg tggcatcggc catctggtgg acgatctgct 500 gcacaacgat ggcctgcccc ggcaagtcac caagcaagcg ttcgaggtcg 550 gcaagacggt cgccaccacc accggtgccg tggtgtttcg caacgaactg 600 ctggagttga tccagtacaa gccgatgagc gaaaagcagt attccaagcc 650 cctgttggtg gtgccgccgc aaatcaacaa gtactacatt ttcgacctga 700 gcccccacaa cagcttcgtc cagtacgcgc tgaaaaacgg cctgcaaacc 750 ttcatgatca gctggcgcaa cccggatgtg cgtcaccgcg aatgggggct 800 ctcgacctac gtggaagccg tggaagaagc catgaatgtc tgccgggcga 850 tcaccggtgc acgcgaggtc aacctgatgg gcgcctgcgc cggcgggctg 900 accattgccg cgttgcaggg ccacttgcaa gccaaacggc agctgcgcag 950 ggtgtccagt gcaacgtatc tggtgagcct gctcgacagt gaactggaca 1000 gccccgcttc actgttcgcc gacgaacaga ctctggaggc tgccaagcgt 1050 cgctcctatc agaaaggtgt gctggacggc cgcgacatgg ccaaggtctt 1100 cgcctggatg cgccccaacg atttgatctg gagctacttc gtcaacaact 1150 acctgttggg caaggagccg ccggcgttcg acatcctcta ctggaacaac 1200 gacagcacgc gcttgcctgc cgccctgcat ggcgacctgc tggacttctt 1250 caagcacaac ccgctgaccc acccgggcgg cctggaagtg tgtggcacgc 1300 cgatcgattt gcagaaggtc accgttgaca gcttcagcgt cgccggcatc 1350 aacgatcaca tcacgccttg ggatgcggtg tatcgctcgg cgctgttgct 1400 cggtggcgag cggcgcttcg tgctgtccaa cagcggccat gtgcagagca 1450 tcctcaaccc gccgagcaac ccgaaagcca actacgtcga aaacggcaag 1500 ctgagcagcg acccccgcgc ctggtactac gacgccaggc atgtcgacgg 1550 cagttggtgg acccaatggc tgagctggat tcaggaacgc tccggcgcgc 1600 agaaggaaac ccacatggcg ctcggcaacc agaactatcc accgatggaa 1650 gctgcgcccg gtacctacgt acgtgtgcgc tga 1683 <210> 5 <211> 1501 <212> DNA <213> Pseudomonas jessenii P161 ; FERM P-17445 <220> <220> cDNA to 16S rRNA <400> 5 tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgagcgg atgacgggag 50 cttgctcctg aattcagcgg cggacgggtg agtaatgcct aggaatctgc 100 ctggtagtgg gggacaacgt ctcgaaaggg acgctaatac cgcatacgtc 150 ctacgggaga aagcagggga ccttcgggcc ttgcgctatc agatgagcct 200 aggtcggatt agctagttgg tgaggtaatg gctcaccaag gcgacgatcc 250 gtaactggtc tgagaggatg atcagtcaca ctggaactga gacacggtcc 300 agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat gggcgaaagc 350 ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa ggtcttcgga ttgtaaagca 400 ctttaagttg ggaggaaggg cattaaccta atacgttagt gttttgacgt 450 taccgacaga ataagcaccg gctaactctg tgccagcagc cgcggtaata 500 cagagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgcgcgtagg 550 tggtttgtta agttggatgt gaaagccccg ggctcaacct gggaactgca 600 ttcaaaactg acaagctaga gtatggtaga gggtggtgga atttcctgtg 650 tagcggtgaa atgcgtagat ataggaagga acaccagtgg cgaaggcgac 700 cacctggact gatactgaca ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag 750 gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgtcaa ctagccgttg 800 ggagccttga gctcttagtg gcgcagctaa cgcattaagt tgaccgcctg 850 gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca 900 caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 950 aggccttgac atccaatgaa ctttccagag atggatgggt gccttcggga 1000 acattgagac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1050 tgggttaagt cccgtaacga gcgcaaccct tgtccttagt taccagcacg 1100 taatggtggg cactctaagg agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg 1150 gggatgacgt caagtcatca tggcccttac ggcctgggct acacacgtgc 1200 tacaatggtc ggtacagagg gttgccaagc cgcgaggtgg agctaatccc 1250 acaaaaccga tcgtagtccg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag 1300 tcggaatcgc tagtaatcgc gaatcagaat gtcgcggtga atacgttccc 1350 gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagtgggt tgcaccagaa 1400 gtagctagtc taaccttcgg gaggacggtt accacggtgt gattcatgac 1450 tggggtgaag tcgtaccaag gtagccgtag gggaacctgc ggctggatca 1500 c 1501 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 6 tgctggaact gatccagtac 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 7 gggttgagga tgctctggat gtg 23 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 8 ctacaaagct tgacccggta ctcgtctcag 30 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 9 gcgagcaagc ttgctcctac agggatagc 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 10 gttttaagct tgaagacgaa ggagtgttg 29 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 11 ctcctacaag cttggagact gactgtggcc 30

【図面の簡単な説明】

【図１】シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株
（Pseudomonas jessenii P161：ＦＥＲＭ Ｐ−１７４
４５）由来の第一のＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列を示
す図である。

【図２】シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株
（Pseudomonas jessenii P161：ＦＥＲＭ Ｐ−１７４
４５）由来の第一のＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列を示
す図である。

【図３】シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株
（Pseudomonas jessenii P161：ＦＥＲＭ Ｐ−１７４
４５）由来の第二のＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列を示
す図である。

【図４】シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株
（Pseudomonas jessenii P161：ＦＥＲＭ Ｐ−１７４
４５）由来の第二のＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列を示
す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/00 (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:38） //(Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:38） 5/00 Ａ (72)発明者 本間 務 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 (72)発明者 須田 栄 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA17 BA07 CA03 DA06 EA04 GA11 GA19 HA01 HA14 4B050 CC03 DD02 LL05 4B064 AD83 CA02 CA19 CC24 CD07 CE03 CE08 CE16 DA16 4B065 AA26X AA41Y AB01 AC14 BA02 BB08 CA27 CA54 CA60

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１に示すアミノ酸配列を有す
   るポリヒドロキシアルカノエート合成酵素。
2. 【請求項２】 配列番号：１に示すアミノ酸配列を実質
   的に保持し、そのポリヒドロキシアルカノエート合成酵
   素活性を損なわない範囲でアミノ酸の欠失、置換もしく
   は付加がなされた改変アミノ酸配列を有するポリヒドロ
   キシアルカノエート合成酵素。
3. 【請求項３】 請求項１あるいは２に記載するポリヒド
   ロキシアルカノエート合成酵素のアミノ酸配列をコード
   するＤＮＡ塩基配列を含むポリヒドロキシアルカノエー
   ト合成酵素遺伝子。
4. 【請求項４】 配列番号：１に示すアミノ酸配列をコー
   ドする、配列番号：２に示すＤＮＡ塩基配列を含む請求
   項３に記載のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺
   伝子。
5. 【請求項５】 配列番号：３に示すアミノ酸配列を有す
   るポリヒドロキシアルカノエート合成酵素。
6. 【請求項６】 配列番号：３に示すアミノ酸配列を実質
   的に保持し、そのポリヒドロキシアルカノエート合成酵
   素活性を損なわない範囲でアミノ酸の欠失、置換もしく
   は付加がなされた改変アミノ酸配列を有するポリヒドロ
   キシアルカノエート合成酵素。
7. 【請求項７】 請求項５あるいは６に記載するポリヒド
   ロキシアルカノエート合成酵素のアミノ酸配列をコード
   するＤＮＡ塩基配列を含むポリヒドロキシアルカノエー
   ト合成酵素遺伝子。
8. 【請求項８】 配列番号：３に示すアミノ酸配列をコー
   ドする、配列番号：４に示すＤＮＡ塩基配列を含む請求
   項７に記載のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺
   伝子。
9. 【請求項９】 ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素
   遺伝子として、前記請求項３または４、あるいは、請求
   項７または８に記載する遺伝子を含有する組換えベクタ
   ー。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載の組換えベクターの導
    入により形質転換された形質転換微生物。
11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の形質転換微生物を
    ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の基質を含む培
    地で培養し、得られる培養物からポリヒドロキシアルカ
    ノエートを取得することを特徴とするポリヒドロキシア
    ルカノエートの製造方法。
12. 【請求項１２】 請求項１０に記載の形質転換微生物を
    培養し、前記形質転換微生物にポリヒドロキシアルカノ
    エート合成酵素を産出させることを特徴とするポリヒド
    ロキシアルカノエート合成酵素の生産方法。