JP5103619B2 - 共重合ポリエステルの製造法 - Google Patents
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前述の通り、本発明は、ポリ(3−ヒドロキシブタン酸)生産能を有するクプリアビダス属、ラルストニア属、アルカリゲネス属、ヒドロゲノモナス属、又はワウテルシア属に属する微生物をマロニル−CoA還元酵素遺伝子及び3−ヒドロキシプロピオニル−CoA合成酵素遺伝子を含有する組換えベクターを用いて形質転換し、炭素源を含有する培地で形質転換体を増殖させることにより、形質転換体内でポリ(3−ヒドロキシブタン酸−co−3−ヒドロキシプロピオン酸)を製造する方法に関する。
本発明の製造方法に使用されるマロニル−CoA還元酵素をコードする核酸及び3−ヒドロキシプロピオニル−CoA合成酵素をコードする核酸は、一本鎖又は二本鎖型DNA、及びそのRNA相補体も含む。DNAには、例えば、天然由来のDNA、組換えDNA、化学合成したDNA、PCRによって増幅されたDNA、及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明で使用される核酸としてはDNAが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があり、1つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、各々のマロニル−CoA還元酵素をコードする核酸の塩基配列及び3−ヒドロキシプロピオニル−CoA合成酵素をコードする核酸の塩基配列であれば、いずれの塩基配列を有する核酸も本発明の範囲に含まれる。
マロニル−CoA還元酵素は、NADPHの存在下でマロニル−CoAを還元して3−ヒドロキシプロピオン酸を生成する酵素である(図1、2を参照)。本発明の製造方法においては、マロニル−CoA還元酵素遺伝子として、例えば、公知のマロニル−CoA還元酵素遺伝子の塩基配列(GenBank Accession No.AY530019)を利用することができる。該酵素をコードする遺伝子は、AY530019に示されるヌクレオチド1−3898のうちヌクレオチド79−3741である。本明細書では、該遺伝子の塩基配列(AY530019のヌクレオチド79−3741に相当)及びそれがコードする推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号1及び2として配列表に記載する。
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつマロニル−CoAから3−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質
をコードする核酸からなる。
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質;又は
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつマロニル−CoAから3−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質
をコードする核酸からなる。
(a)配列番号1で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号1で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつマロニル−CoAから3−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
(a)配列番号1で表される塩基配列から成る核酸;又は
(b)配列番号1で表される塩基配列から成る核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつマロニル−CoAから3−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
3−ヒドロキシプロピオニル−CoA合成酵素遺伝子は、プロピオニル−CoA合成酵素遺伝子(配列番号3)の1ドメインを構成することが知られている(Alber,B.E.及びFuchs,G.、上述)。典型的には、該酵素の遺伝子は、配列番号3においてヌクレオチド1−2643に相当する塩基配列からなる。この合成酵素は、3−ヒドロキシプロピオン酸サイクルのうちCoA及びATPの存在下で3−ヒドロキシプロピオン酸から3−ヒドロキシプロピオニル−CoAを合成する酵素である(図1、2を参照)。本発明の製造方法においては、プロピオニル−CoA合成酵素を使用することもできるが、該遺伝子の1ドメインである3−ヒドロキシプロピオニル−CoA合成酵素を使用することが好ましい。
(a)配列番号4のアミノ酸残基1−881で表されるアミノ配列で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(b)配列番号4のアミノ酸残基1−881で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ3−ヒドロキシプロピオン酸から3−ヒドロキシプロピオニル−CoAを生成する触媒活性を有するタンパク質
をコードする核酸からなる。
(a)配列番号4のアミノ酸残基1−881で表されるアミノ配列で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質;又は
(b)配列番号4のアミノ酸残基1−881で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつ3−ヒドロキシプロピオン酸から3−ヒドロキシプロピオニル−CoAを生成する触媒活性を有するタンパク質
をコードする核酸からなる。
(a)配列番号3のヌクレオチド1−2643で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号3のヌクレオチド1−2643で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3−ヒドロキシプロピオン酸から3−ヒドロキシプロピオニル−CoAを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
(a)配列番号3のヌクレオチド1−2643で表される塩基配列から成る核酸;又は
(b)配列番号3のヌクレオチド1−2643で表される塩基配列から成る核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3−ヒドロキシプロピオン酸から3−ヒドロキシプロピオニル−CoAを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
本発明によれば、単離したマロニル−CoA還元酵素をコードする遺伝子及び3−ヒドロキシプロピオニル−CoA合成酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターが提供される。各遺伝子は、同一のベクター又は別個のベクターに組み込むことができる。別個のベクターに各遺伝子を組み込む場合、各ベクターの種類は同一であるか又は異なっていてもよい。なお、上述の通り、3−ヒドロキシプロピオニル−CoA合成酵素は、プロピオニル−CoA合成酵素遺伝子の1ドメインを構成するため、本発明の製造方法においては、プロピオニル−CoA合成酵素遺伝子(配列番号3)を組み込んだベクターを使用することもできる。
ポリエステル合成は、上述した形質転換体を所定の培地で培養し、培養細胞(例えば、菌体)内又は培養物(例えば、培地)中に共重合ポリエステルを生成及び蓄積させ、培養細胞又は培養物から目的とする共重合ポリエステルを採取することにより行われる。なお、本発明の製造方法に使用される形質転換体の培養法は、通常、宿主細胞の培養に使用される方法に従って行われる。
本発明において、共重合ポリエステルは、下記の通り精製することができる:培地から遠心分離によって形質転換体を回収し、蒸留水で洗浄後、乾燥又は凍結乾燥させる。その後、クロロホルムに乾燥した形質転換体を懸濁させ、室温で所定時間撹拌し、共重合ポリエステルを抽出する。抽出の段階で、必要であれば加熱してもよい。濾過によって残渣を除去し、上清にメタノールを加えて共重合ポリエステルを沈殿させ、沈殿物を濾過又は遠心分離によって、上清を除去し、乾燥させて精製した共重合ポリエステルを得ることができる。
実施例1 マロニル−CoA還元酵素遺伝子及び3−ヒドロキシプロピオニル−CoA合成酵素遺伝子のクローニング
緑色非硫黄細菌クロロフレクサス・アウランティアカス(Chloroflexus aurantiacus)DSM636株(DSMZより入手)の凍結乾燥菌体を3mlの滅菌生理食塩水に懸濁した後、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム法(Current Protocols in Molecular Biology,1巻、2.4.3頁、1994年;John Wiley&Sons出版)により染色体DNAを得た。
配列1:GGGGAATTCATGAGCGGAACAGGACGACTGG(配列番号5)
(下線部:配列番号1のヌクレオチド1−22に対応)
配列2:GTAGAATTTACACGGTAATCGC(配列番号6)
(下線部:配列番号1のヌクレオチド3663−3649に対応)
を設計した。
配列3:GCAGGAGGAATTACCATGATCGACACTGCGCCCCTTG(配列番号7)
(下線部:配列番号2のヌクレオチド1−22に対応)
配列4:GGGGAATTCTTATGTCACCGTCACTACCGCG(配列番号8)
(下線部:配列番号2のヌクレオチド2643−2625に対応)
を設計した。なお、配列番号8の塩基12−10(ATT)は、終始コドン(TAA)の相補配列に対応し、3−ヒドロキシプロピオニル−CoA合成酵素が、配列番号3のヌクレオチド1−2643のみから翻訳されるよう付加した。
多くのグラム陰性菌で自律複製することが知られている広宿主域ベクターpBBR1−MCS2(GenBank Accession No.U23751)を制限酵素SspIで切断し、複製起点等を含むDNA断片を単離して脱リン酸化処理を行った。また、大腸菌においてアラビノースの添加で発現を誘導できるBADプロモーターを有するプロモーターを有するプラスミドpBAD24(GenBank Accession No.X81837)を制限酵素BanIIIとAlw44Iで切断し、転写因子araC、BADプロモーター領域、マルチクローニングサイト、rrnBターミネーター領域を含むDNA断片を単離した。このDNA断片をBlunting High(トーヨーボー社製)を用いて末端平滑化し、次いで、上述のpBBR1−MCS2 SspI断片と連結した。得られたpBBR−BAD(図3)を制限酵素EcoRIで切断して脱リン酸化処理し、pUC−mcracsから制限酵素EcoRIで切り出したmcr−acs断片と連結することで発現ベクターpBBR−BAD−mcracs(図4)を構築した。また、このpBBR−BAD−mcracsを制限酵素XbaIで切断した後に、セルフライゲーションした。この処理によって、acs領域を除去し、mcr領域のみを含むpBBR−BAD−mcr(図5)を得た。
得られた組換えプラスミドを用いて、P(3HB)生産菌であるクプリアビダス・ネカトールJMP134株(DSM4058)又はH16株(DSM428)(DSMZより入手)を接合伝達法によって形質転換した。まず、塩化カルシウム法によって、pBBR−BAD−mcracsを大腸菌S17−1株に導入した。次に、この組換え大腸菌をLB培地(1%イーストエキス、0.5%トリプトン、0.5%塩化ナトリウム、pH7.5)1.5ml中で、37℃で終夜培養した。これと並行して、クプリアビダス・ネカトールJMP134株又はH16株をNR培地(1%魚肉エキス、1%ポリペプトン、2%酵母エキス)1.5ml中で、30℃で終夜培養した。その後、それぞれの培養液0.1mlを混合して30℃で4時間培養した。この菌体混合液を0.3mg/mlカナマイシンを添加したSimmons Citrate寒天培地(ディフコ社製)に塗布し、30℃で5日間培養した。組換え大腸菌中のプラスミドが、クプリアビダス・ネカトールに伝達された場合、該菌体はカナマイシン耐性を示し、一方、組換え大腸菌はSimmons Citrate寒天培地では増殖不能であるため、上記培地上で増殖したコロニーは、組換え大腸菌からpBBR−BAD−mcracsが伝達したクプリアビダス・ネカトール形質転換体である。pBBR−BAD−mcracsをJMP134株に接合伝達した株を「JMA64株」、pBBR−BAD−mcrを伝達した株を「JM37株」、pBBR−BADを伝達した株を「JBAD株」と命名した。また、H16株にpBBR−BAD−mcracsを接合伝達した株を「HMA64株」と命名した。
クプリアビダス・ネカトール形質転換体による共重合ポリエステル合成は、下記に示すように一段培養及び二段培養で行った。
(a)一段培養
NR培地(前述)で前培養したクプリアビダス・ネカトール形質転換体を100mlのMB−Frc培地(0.9% リン酸二ナトリウム、0.15% リン酸一カリウム、0.05% 塩化アンモニウム、1% 微量金属溶液、0.5%又は2% フルクトース)に植菌し、坂口フラスコ中、30℃で72時間振とう培養した。培養開始後8〜24時間で遺伝子発現誘導剤であるアラビノースを所定量(0〜0.1%、表1等を参照)で添加した。
0.1mg/mlのカナマイシンを添加したNR培地でクプリアビダス・ネカトール形質転換体を30℃、24時間培養した。その後、遠心分離及び洗浄した菌体を0.1mg/mlのカナマイシン及び所定量(0〜0.1%、表1等を参照)のアラビノースを添加した100ml MB−Frc培地(塩化アンモニウム不含)に移し、30℃で48時間培養した。
乾燥菌体10〜30mgに2mlの硫酸−メタノール混液(15:85)と2mlのクロロホルムを添加して密栓し、100℃で140分間加熱することにより、菌体内ポリエステル分解物のメチルエステルを得た。これに1mlの蒸留水を添加して激しく撹拌した。静置して二層に分離させた後、下層の有機層を取り出した。有機層0.1mlに0.1%のオクタン酸メチル・クロロホルム溶液を0.1ml、ジメチルホルムアミドを0.3mlとビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミドを0.1mlを添加し、70℃で30分加熱して水酸基をトリメチルシリル化した。室温まで冷却し、1mLのヘキサン及び1mLのH2Oを添加して激しく撹拌し、静置後、上層の有機層をキャピラリーガスクロマトグラフィーによって分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所製GC−17A、キャピラリーカラムはGLサイエンス社製InertCap−1(カラム長25m、カラム内径0.25mm、液膜厚0.4μm)を用いた。温度条件は、初発温度100℃から8℃/分の速度で昇温した。
0.5%フルクトースで二段培養したクプリアビダス・ネカトールJMP64株(P(3HB−co−1.9mol%3HP)を24.5重量%で蓄積)の凍結乾燥菌体150mgをクロロホルムに懸濁し、室温で48時間撹拌した。フィルターで濾過し、上清の5倍量のメタノールを加え、沈殿したポリエステルを濾過により回収した。真空乾燥後の秤量により、29.3mgのポリエステルを得た。全量を重クロロホルムに溶解し、1H−NMRにより構造解析した(図6)。3−ヒドロキシプロピオニル基中の3位の炭素に結合したメチレン基に由来する水素のシグナルが4.35ppm付近に観察されたことから、このポリエステルがP(3HB−co−3HP)共重合体であることが確認できた。ピーク面積積分値から3HP分率1.6モル%と産出された。これはガスクロマトグラフィーによる結果(1.9モル%)とほぼ一致している。
実施例5により得られた共重合ポリエステルP(3HB−co−1.9mol%3HPの分子量測定は、クロマトグラフィー(GPC)法により行った。高速液体クロマトグラフィーは、島津製作所製LC−10A GPCを用い、カラムはショーデックス社製K806MカラムとK802カラムを連結して用いた。移動相は、クロロホルム0.8ml/分とし、乾燥菌体より精製した共重合体のクロロホルム溶液(濃度1mg/ml)を分析サンプルとした。分子量計算のための検量線はポリスチレン標準品により作製した。これにより、重量平均分子量(Mw)=約1.16×106、数平均分子量(Mn)=3.36×105が得られた。また、この共重合体の分散比(Mw/Mn)は、約3.45となる。したがって、本発明の製造方法によって、高分子量であり、かつ分子量分布のやや広い共重合ポリエステルが得られた。
Claims (10)
- ポリ(3−ヒドロキシブタン酸)生産能を有するクプリアビダス(Cupriavidus)属、ラルストニア(Ralstonia)属、アルカリゲネス(Alcaligenes)属、ヒドロゲノモナス(Hydrogenomonas)属、又はワウテルシア(Wautersia)属に属する微生物をマロニル−CoA還元酵素遺伝子及び3−ヒドロキシプロピオニル−CoA合成酵素遺伝子を含有する組換えベクターを用いて形質転換し、炭素源を含有する培地で形質転換体を増殖させることにより、形質転換体内でポリ(3−ヒドロキシブタン酸−co−3−ヒドロキシプロピオン酸)を製造する方法。
- 微生物が、クプリアビダス・ネカトール(Cupriavidus necator)、ラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)、アルカリゲネス・ユートロファス(Alcaligenes eutrophus)、ヒドロゲノモナス・ユートロファ(Hydrogenomonas eutropha)、又はワウテルシア・ユートロファ(Wautersia eutropha)である、請求項1に記載の製造方法。
- クプリアビダス・ネカトールが、JMP134株(DSM4058)又はH16株(DSM428)である、請求項2に記載の製造方法。
- マロニル−CoA還元酵素遺伝子が、
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは2〜10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつマロニル−CoAから3−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質
をコードする核酸から成る、請求項1〜3のいずれか1項に記載の製造方法。 - マロニル−CoA還元酵素遺伝子が、
(a)配列番号1で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号1で表される塩基配列を含む核酸と高程度なストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつマロニル−CoAから3−ヒドロキシプロピオン酸を生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の製造方法。 - 3−ヒドロキシプロピオニル−CoA合成酵素遺伝子が、
(a)配列番号4のアミノ酸残基1−881で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(b)配列番号4のアミノ酸残基1−881で表されるアミノ酸配列において1若しくは2〜10個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を含み、かつ3−ヒドロキシプロピオン酸から3−ヒドロキシプロピオニル−CoAを生成する触媒活性を有するタンパク質
をコードする核酸からなる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の製造方法。 - 3−ヒドロキシプロピオニル−CoA合成酵素遺伝子が、
(a)配列番号3のヌクレオチド1−2643で表される塩基配列を含む核酸;又は
(b)配列番号3のヌクレオチド1−2643で表される塩基配列を含む核酸と高程度なストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3−ヒドロキシプロピオン酸から3−ヒドロキシプロピオニル−CoAを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の製造方法。 - 製造されるポリ(3−ヒドロキシブタン酸−co−3−ヒドロキシプロピオン酸)に含有する3−ヒドロキシプロピオン酸分率が0.01〜20モル%であることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の製造方法。
- 製造されるポリ(3−ヒドロキシブタン酸−co−3−ヒドロキシプロピオン酸)が重量平均分子量1×105〜3×106を有することを特徴とする、請求項8に記載の製造方法。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の製造方法において使用される、マロニル−CoA還元酵素遺伝子及び3−ヒドロキシプロピオニル−CoA合成酵素遺伝子を含有する組換えベクターを用いて形質転換した形質転換体。
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