JP4445852B2 - ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、所望の物性を示す生分解性ポリエステルを製造できるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素に関する。
背景技術
持続可能な社会を築いていく一環として、環境調和型の生分解性プラスチックの創製が注目されている。ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）等の微生物によって生産されるポリ３−ヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ；ｐｏｌｙ（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ））は、熱可塑性及び生分解性を兼ね備えていることから、生分解性プラスチックとしての応用が検討され、既に一部で実用化が始まっている。
生分解性プラスチックを、より広範に実用化するためには、より安価な生産システムの構築及び所望の物性を示す生分解性プラスチックを自在に生産することのできる微生物の育種が重要である。これを達成するために、これまでに、新しいタイプの生分解性ポリエステル合成酵素の探索、遺伝子工学的手法による酵素生産量の増強、細胞内の生合成経路の代謝工学的改変等が試みられている。
例えば、生分解性プラスチックがコポリマーの場合には、モノマーの組成比によって当該生分解性プラスチックの諸物性を制御することができる。しかしながら、コポリマーにおけるモノマー組成比を効率的に改変する手法は特に確立されておらず、所望の物性を示す生分解性プラスチックは得られていない。
発明の開示
そこで、本発明は、所望の物性を示す生分解性ポリエステルを製造できる新規なポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、進化工学的手法によって、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸の生合成に関与する酵素を所望の性質を有する酵素に改変することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列の１３０番目のグルタミン酸、３２５番目のセリン、４７７番目のセリン及び４８１番目のグルタミンからなる群のうち少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列の１３０番目のグルタミン酸、３２５番目のセリン、４７７番目のセリン及び４８１番目のグルタミンからなる群のうち少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列において、１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸を除く少なくとも１以上のアミノ酸を欠失、置換、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、生分解性ポリエステル酸生合成活性を示すアミノ酸配列
（２）上記３２５番目のセリンをシステイン又はスレオニンに置換したことを特徴とする（１）記載のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素。
（３）上記４８１番目のグルタミンをグリシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アルギニン、セリン又はスレオニンに置換したことを特徴とする（１）記載のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素。
（４）上記４８１番目のグルタミンをリジン、アルギニン又はメチオニンに置換したことを特徴とする（１）記載のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素。
（５）上記１３０番目のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換したことを特徴とする（１）記載のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素。
（６）上記４７７番目のセリンをアルギニンに置換したことを特徴とする（１）記載のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素。
（７）配列番号１のアミノ酸配列において、２７番目のアルギニンからヒスチジンへの置換及び４７７番目のセリンからアルギニンへの置換からなる変異と、１３０番目のグルタミン酸からアスパラギン酸への置換及び３２７番目のロイシンからフェニルアラニンへの置換からなる変異と、１２番目のグルタミンからアルギニンへの置換、３６２番目のメチオニンからロイシンへの置換及び４９７番目のセリンからグリシンへの置換からなる変異と、３０４番目のアラニンからバリンへの置換及び３６９番目のメチオニンからロイシンへの置換からなる変異と、３０番目のアスパラギン酸からアスパラギンへの置換及び２７４番目のアスパラギンからチロシンへの置換からなる変異と、４７７番目のセリンからアルギニンへの置換からなる変異と、１３０番目のグルタミン酸からアスパラギン酸への置換からなる変異とからなる群から選ばれる１つの変異を有することを特徴とするポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素。
（８）（１）〜（７）いずれか１に記載された生分解性ポリエステル酸生合成変異酵素により製造された生分解性ポリエステル。
（９）（１）〜（７）いずれか１に記載された生分解性ポリエステル酸生合成変異酵素をコードするポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素遺伝子。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る生分解性ポリエステル生合成変異酵素は、配列番号１にアミノ酸配列において、１３０番目のグルタミン酸、３２５番目のセリン、４７７番目のセリン及び４８１番目のグルタミンからなる群のうち少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する。配列番号１に示すアミノ酸配列は、シュードモナスｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）６１−３株由来の野生型のポリ３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素のアミノ酸配列である。
１３０番目のグルタミン酸を置換する他のアミノ酸とは、グルタミン酸以外のアミノ酸であれば特に限定されないが、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、システイン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン及びグリシンを挙げることができる。特に、１３０番目のグルタミン酸を置換する他のアミノ酸としては、アスパラギン酸が好ましい。
３２５番目のセリンを置換する他のアミノ酸とは、セリン以外のアミノ酸であれば特に限定されないが、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン及びグリシンを挙げることができる。特に、３２５番目のセリンを置換する他のアミノ酸としては、システイン又はスレオニンが好ましい。
また、４７７番目のセリンを置換する他のアミノ酸とは、セリン以外のアミノ酸であれば特に限定されないが、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン及びグリシンを挙げることができる。特に、４７７番目のセリンを置換する他のアミノ酸としては、アルギニンが好ましい。
さらに、４８１番目のグルタミンを置換する他のアミノ酸とは、グルタミン以外のアミノ酸であれば特に限定されないが、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、スレオニン及びグリシンを挙げることができる。特に、４８１番目のグルタミンを置換する他のアミノ酸としては、グリシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アルギニン、セリン又はスレオニンが好ましく、特に、リジン、アルギニン又はメチオニンがより好ましい。
ここで、「ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素」とは、ポリエステル合成に必須な鍵酵素であり、（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡモノマーの重合を触媒する酵素である。ポリ３−ヒドロキシアルカン酸とは、３−ヒドロキシアルカン酸を構成ユニットとし、エステル結合によって３−ヒドロキシアルカン酸が結合した重合物であって、生物によって生合成され且つ土中や水中の微生物によって分解されるエステル重合物を意味する。
また、本発明に係るポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素は、配列番号１のアミノ酸配列において、２７番目のアルギニンからヒスチジンへの置換及び４７７番目のセリンからアルギニンへの置換からなる変異と、１３０番目のグルタミン酸からアスパラギン酸への置換及び３２７番目のロイシンからフェニルアラニンへの置換からなる変異と、１２番目のグルタミンからアルギニンへの置換、３６２番目のメチオニンからロイシンへの置換及び４９７番目のセリンからグリシンへの置換からなる変異と、３０４番目のアラニンからバリンへの置換及び３６９番目のメチオニンからロイシンへの置換からなる変異と、３０番目のアスパラギン酸からアスパラギンへの置換及び２７４番目のアスパラギンからチロシンへの置換からなる変異と、４７７番目のセリンからアルギニンへの置換からなる変異と、１３０番目のグルタミン酸からアスパラギン酸への置換からなる変異とからなる群から選ばれる１つの変異を有するものである。
一般に、細菌中でのポリ３−ヒドロキシアルカン酸の生合成経路は、図１のように、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸を構成するモノマーユニットを供給する系（モノマー供給系）とモノマーユニットを重合する系（モノマー重合系）の２つの系から構成される。例えば、細菌中でのポリ３−ヒドロキシンアルカン酸の生合成は、図２及び３のように、３−ケトチオラーゼ（ＰｈｂＡ、ＢｋｔＢ）やアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＰｈｂＢ）等により構成されるアセチルＣｏＡ二量体化系や、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＰｈａＪ）や３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＧ）等により構成される脂肪酸分解経路、（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ−ＣｏＡトランスアシラーゼ（ＰｈａＧ）、３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩＩ（ＦａｂＨ）、マロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼ（ＦａｂＤ）等により構成される脂肪酸生合成経路などを経て生合成されたモノマーユニット（図２中：（Ｒ）−３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡ，（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ；図３中：（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡが、ポリ３−ヒドロキシブタン酸合成酵素やポリ３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素によって重合されることによって行われる。ここで、ポリ３−ヒドロキシブタン酸は、３−ヒドロキシブタン酸のホモポリマーであり、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸は、炭素数４のヒドロキシブタン酸、炭素数５のヒドロキシ吉草酸、炭素数６のヒドロキシヘキサン酸、炭素数７のヒドロキシヘプタン酸、炭素数８のヒドロキシオクタン酸、炭素数９のヒドロキシノナン酸、炭素数１０のヒドロキシデカン酸及び炭素数１２のヒドロキシドデカン酸等、様々なモノマーユニットから構成される広範囲の３−ヒドロキシアルカン酸ホモポリマーを意味する。
特に、シュードモナスｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）６１−３株由来の野生型のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素（以下、野生型酵素と呼ぶ場合もある）は、中長鎖（炭素数６〜１４）の３−ヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとした共重合ポリヒドロキシアルカン酸を合成でき、且つ、炭素数４の３−ヒドロキシブタン酸をモノマーユニットとした共重合ポリヒドロキシアルカン酸を合成することができる。
本発明に係るポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素は、野生型酵素と比較して、３−ヒドロキシブタン酸の含有率（組成比）が高い共重合ポリヒドロキシアルカン酸を合成できる。このように、本発明に係るポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素は、野生型酵素と異なる物性を示す共重合ポリヒドロキシアルカン酸を合成できる。
特に、配列番号１における３２５番目のセリンをシステイン又はスレオニンに置換してなるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素は、野生型酵素と比較して、３−ヒドロキシブタン酸の含有率が大幅に高くなった共重合ポリヒドロキシアルカン酸を合成できる。また、配列番号１における４８１番目のグルタミンをリジン、アルギニン又はメチオニンに置換してなるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素は、野生型酵素と比較して、３−ヒドロキシブタン酸の含有率が大幅に高くなった共重合ポリヒドロキシアルカン酸を合成できる。さらに、配列番号１における４７７番目のセリンをアルギニンに置換してなるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素は、野生型酵素と比較して、３−ヒドロキシヘキサン酸の含有率が大幅に高くなった共重合ポリヒドロキシアルカン酸を合成できる。
さらに、配列番号１における３２５番目のセリンをシステイン又はスレオニンに置換し、且つ４８１番目のグルタミンをリジン、アルギニン又はメチオニンに置換してなるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素は、３−ヒドロキシブタン酸の含有率が上述した場合よりも高くなった共重合ポリヒドロキシアルカン酸を合成できる。
本発明に係るポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素をコードする遺伝子は、シュードモナスｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）６１−３株から採取したポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素をコードする遺伝子（以下、野生型遺伝子と呼ぶ）における所定の塩基に突然変異を導入することで得ることができる。
このとき、野生型遺伝子は、例えば、Ｍａｔｓｕｓａｋｉ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０，６４５９−６４６７（１９９８）に記載された方法に準じて得ることができ、また、既にクローニングされているＰｈａＣｌＰｓを持つプラスミドを鋳型としてＰＣＲ法で増幅させることによって得ることができる。野生型遺伝子における３２５番目のセリンをコードするコドンをセリン以外の他のアミノ酸をコードするコドンに変異させる場合には、いわゆる部位特異的変異導入法を用いることができる。同様に、野生型遺伝子における４８１番目のグルタミンをコードするコドンをグルタミン以外の他のアミノ酸をコードするコドンに変異させる場合にも、この部位特異的変異導入法を用いることができる。
部位特異的変異導入法としては、特に限定されないが、例えば以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。すなわち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、野生型遺伝子中の変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、そこを前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、野生型遺伝子中の変異導入を希望する目的の部位に目的の変異を導入した変異プライマーと前記遺伝子の一方の末端部位の配列を含む変異を有しない増幅用プライマーとで前記遺伝子の片側を増幅し、前記変異用プライマーに対して相補的な配列を有する変異用プライマーと前記遺伝子のもう一方の末端部位の配列を含む変異を有しない増幅用プライマーでもう片側を増幅し、得られた２つの増幅断片をアニール後、さらに前記２種類の増幅用プライマーでＰＣＲをすることにより行うことができる［ＳＨＯＲＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，３ｒｄ ｅｄ，１９９５，Ｆ．Ａ．Ｓｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＷＩＬＥＹ］。
このようにして得られた３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素をコードする遺伝子（以下、３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素遺伝子と呼ぶ）は、適当なベクターに連結することによって、所定の宿主でポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素を発現しうる組換えベクターを得ることができる。また、得られた組換えベクターを所定の宿主に導入することによって、当該ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素を発現する形質転換体を得ることができる。
３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素遺伝子を挿入するためのベクターは、所定の宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ等のプラスミドＤＮＡ、ＥＭＢＬ３、Ｍ１３、λｇｔ１１等のファージＤＮＡ等を、酵母を宿主として用いる場合は、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等を、植物細胞を宿主として用いる場合には、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１等を、動物細胞を宿主として用いる場合は、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社）等をベクターとして用いることができる。
組換えベクターを導入する宿主としては、３−ヒドロキシアルカン酸を構成ユニットとし、エステル結合によって３−ヒドロキシアルカン酸を重合させポリ３−ヒドロキシアルカン酸を合成できるものであれば限定されないが、例えば、大腸菌ＬＳ５２１８（ｆａｄＲ−）、ＬＳ１２９８（ｆａｂＢ−）、ＬＳ１３００（ｆｒｅ）、ＬＳ６５９６（ｆａｄＡ３０）等のＬＳシリーズの大腸菌株を挙げることができる。これらＬＳシリーズの大腸菌株は、脂肪酸β酸化経路関連酵素遺伝子のマイナス制御因子であるｆａｄＲが破壊された変異株であり、他の大腸菌と比較して脂肪酸を効率よく代謝できるといった特徴を有している。また、宿主としては、通常の大腸菌であっても、アクリル酸（最適濃度０．２４ｍｇ／ｍｌ）を添加することによって脂肪酸β酸化経路を阻害することによって使用することができる。
細菌への組換えベクターの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１巻，１．８．１頁，１９９４年］やエレクトロポレーション法［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１巻，１．８．４頁，１９９４年］等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２−１８７（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９−１９３３（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３−１６８（１９８３）］等が挙げられる。植物細胞への組換えベクターの導入方法としては、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法等が挙げられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。
上述した形質転換体で産生されたポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素の酵素活性は、例えば、当該形質転換体を、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸の生成が可能な条件下で培養し、細胞内におけるポリ３−ヒドロキシアルカン酸の生成蓄積状況を調べることで評価できる。すなわち、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸の生成蓄積量を、当該ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素と野生型のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素とで比較することで、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素の酵素活性を評価できる。
ポリ３−ヒドロキシアルカン酸の生産蓄積状況は、例えば、ポリ３−ヒドロキシブタン酸に特異的に染色するＮｉｌｅ Ｒｅｄを寒天培地プレートに含有させることによって、プレート上に生育したコロニーのピンク色の呈色度合いを調べることによって判別することができる。ここで、呈色度が強い程、ポリ３−ヒドロキシブタン酸の細胞内含量が高いと評価することができ、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素の活性が高いと評価することができる。また、３１２ｎｍの光照射によって発する蛍光の強度によっても高感度に観察できる［Ｓｐｉｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７１：７３−８０（１９９９）］。
また、各クローン中のポリ３−ヒドロキシブタン酸含量の正確な定量は、以下のようにして行うことができる。すなわち、ポリ３−ヒドロキシブタン酸含量が乾燥菌体重量換算で約１％以上の場合には、菌体からポリ３−ヒドロキシブタン酸を、有機溶媒（例えば、クロロホルム）により抽出後、メタノール−濃硫酸溶液中でメタノリシスさせ、３−ヒドロキシブタン酸のメチル化体をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析する方法により行うことができる。また、ポリ３−ヒドロキシブタン酸含量が乾燥菌体重量換算で約１％未満の場合には、ポリ３−ヒドロキシブタン酸を、高温下濃硫酸によってクロトン酸変換（脱離反応）し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供試し、他成分と分離させ、２１０ｎｍでの吸収を分光学的に検出する方法等によって行うことができる［Ｋａｒｒ ｅｔ ａｌ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４６：１３３９−１３４４（１９８３）；Ｓｅｅｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２４：３１７−３２８（１９９４）］。
また、上述した形質転換体を培地で培養し、培養物（培養菌体又は培養上清）中にポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより製造することができる。
形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、完全培地又は合成培地、例えばＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。また、培養温度は３７℃で好気的に１２〜１４時間培養することによりポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素を菌体内に蓄積させ、回収する。
炭素源は微生物の増殖に必要であり、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、マルトース等の炭水化物が挙げられる。窒素源としては例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。また、無機物としては例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。プラスミド保持用の選択圧など必要に応じて、培地中に、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素の精製は、得られる培養物を遠心して回収し（細胞についてはソニケーターにて破砕する）、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン又は陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等を単独で又は適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的の酵素であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
さらに、上述した形質転換体を適当な培地で培養することによって、所定の物性を示す生分解性ポリエステルを製造することができる。得られた生分解性ポリエステルは、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素により生合成されたものであるため、野生型酵素により生合成されえものとは異なる物性を示すものとなる。
得られた生分解性ポリエステルとしては、３−ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシアルカン酸（３ＨＡ）とのコポリマー、例えば、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨｘ）とのコポリマーを例示することができる。なお、以下において、３ＨＢと３ＨＡとのコポリマーを「Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）」と記載し、３ＨＢと３ＨＨｘとのコポリマーを「Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）」と記載する場合もある。
すなわち、上述した形質転換体を適当な培地で培養することによって、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を製造することができる。例えば、宿主として大腸菌ＬＳ５２１８を用いた場合には、菌体内部にＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を製造することができる。
上述した形質転換体においては、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）の蓄積量が多量であり、且つ、野生型酵素を用いる場合とは異なり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）における３−ヒドロキシブタン酸の含有量（組成比）が大幅に向上している。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）において、３ＨＢの組成比が高いことによりリジッドなものとなり、実用的に優れた特性を示すこととなる。
なお、細胞内に蓄積されたポリエステルの細胞内含量及びポリエステルの組成は、加藤らの方法［Ｋａｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５，３６３（１９９６）；Ｋａｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．６９，５１５（１９９６）］に従い、細胞からクロロホルム等の有機溶媒を用いて抽出後、抽出物をガスクロマトグラフィー、ＮＭＲなどに供試することに測定・分析することができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００２−１５４３７４号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。なお、以下の実施例では、一例として、いわゆる進化工学的手法を用いて本発明に係るポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素を取得した例を説明する。しかしながら、本発明は、以下の実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。すなわち、本発明に係るポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素の取得方法は、以下の実施例に限定されない。
〔実施例１〕
ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法によるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素の改変
ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法によって、シュードモナスｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）６１−３株由来のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素をコードする遺伝子（ＰｈａＣｌＰｓ）における全領域にランダム変異を導入した。ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法には、鋳型としてＰｈａＣｌＰｓを含むプラスミドベクターｐＥＴｐｈａＣｌＰｓ（図４参照）を用い、基本ベクターｐＥＴ−２３ａ（＋）のマルチクローニングサイト上流側に対応する順方向プライマーｐＥＴＭＣＳ−ｆｏｒ．：５’−ＣＣＣＡＡＣＧＣＴＧＣＣＣＧＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＣＣＣＧＣＧ−３’（配列番号２）及び基本ベクターｐＥＴ−２３ａ（＋）のマルチクローニングサイト下流側に対応する逆方向プライマーｐＥＴＭＣＳ−ｒｅｖ．：５’−ＡＧＣＴＴＣＣＴＴＴＣＧＧＧＣＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧ−３’（配列番号３）を用いた。ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法では、ポリメラーゼの基質取り込み忠実性を低下させる条件でＰＣＲを行うことにより、変異の場所を限定することなくＰｈａＣｌＰｓ全域への変異の導入を試みた。
なお、ｐＥＴｐｈａＣｌＰｓは、基本ベクターとしてｐＥＴ−２３ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いた。ＰｈａＣｌＰｓは、まずｐＢＳＥＸ２２（Ｍａｔｓｕｓａｋｉ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．１８０，６４５９（１９９８））を鋳型とし、ＰｈａＣｌＰｓの開始コドン（ＡＴＧ）にオーバーラップするように制限酵素ＮｄｅＩ認識配列（ＣＡＴＡＴＧ）を導入したプライマーとＰｈａＣｌＰｓの停止コドン下流に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列（ＧＧＡＴＣＣ）を導入したプライマーを用いＰＣＲ法により増幅した。次いで、ＰＣＲによって得られた増幅ＤＮＡ断片を精製単離した後にＮｄｅＩとＢａｍＨＩによって処理した。次いで、制限酵素によって処理されたＤＮＡ断片を基本プラスミドベクターｐＥＴ−２３ａ（＋）の同制限酵素サイトに置換挿入することにより野生型ＰｈａＣｌＰｓを有するｐＥＴｐｈａＣｌＰｓを得た。
ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲに際しては表１の組成となるように反応溶液を調製した。
ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲの温度サイクルは、９４℃１分間の熱変性、５０℃で１分間のアニーリング、７２℃で２分間の伸長反応を１サイクルとして、２５サイクル行った。ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲには、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いた。
次いで、ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲによって得られた増幅ＤＮＡ断片を精製単離した後にＸｂａＩとＢａｍＨＩによって処理した。次いで、制限酵素によって処理されたＤＮＡ断片を用いてモノマー供給系遺伝子発現プラスミドｐＧＥＭ″ＡＢＲｅのＸｂａＩとＢｇＩＩＩ制限酵素サイトの間に置換挿入することにより変異型ＰｈａＣｌＰｓの分子集団（変異クローンのプール）を得た。得られたプラスミドベクターをｐＧＥＭ″ＣｌＰｓＡＢＲｅとした（図５参照）。
なお、ｐＧＥＭ″ＡＢＲｅは、基本ベクターｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のマルチクローニングサイトに、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のｐｈｂオペロンのプロモーター、β−ケトチオラーゼ遺伝子（ｐｈｂＡＲｅ）、アセトアセチルＣｏＡリダクターゼ遺伝子（ｐｈｂＢＲｅ）及びｐｈｂオペロンのターミネーターをこの順で挿入したものである。これらｐｈｂオペロンのプロモーター、β−ケトチオラーゼ遺伝子（ｐｈｂＡＲｅ）、アセトアセチルＣｏＡリダクターゼ遺伝子（ｐｈｂＢＲｅ）及びｐｈｂオペロンのターミネーターは、Ｍａｔｓｕｓａｋｉ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０，６４５９−６４６７（１９９８）に記載されているプラスミドベクターｐＧＥＭ’−ｐｈｂＣＡＢＲｅを制限酵素処理することにより得た。
得られたプラスミドベクターｐＧＥＭ″ＣｌＰｓＡＢＲｅは、変異型ＰｈａＣｌＰｓの分子集団であり、ＰｈａＣｌＰｓ全領域にランダムに突然変異が導入された様々なＰｈａＣｌＰｓが含まれている。次に、ｐＧＥＭ″ＣｌＰｓＡＢＲｅを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株のコンピテント細胞に形質転換した。形質転換処理細胞を、ポリ３−ヒドロキシブタン酸を特異的に染色することができるＮｉｌｅ Ｒｅｄ、グルコース及びアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地（０．５μｇ／ｍｌ Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ、２％グルコース、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）上で植え、３７℃で１４時間培養することによって形質転換細胞を選別するとともに、ピンク色の度合いによって、各形質転換細胞におけるポリ３−ヒドロキシブタン酸の生産蓄積量を見積もった。
その結果、ＬＢ寒天培地上に形成された１３３６７１個のクローンのうち１２１個のクローンが淡いピンク色を呈した。これら１２１個のクローンにおけるＰＨＢ含有量についてＨＰＬＣを用いて分析した。なお、ＨＰＬＣによる分析は、濃硫酸処理を行うことによって細胞内ＰＨＢをクロトン酸に変化させた後に行った。
詳細には、菌体を３０℃で９６時間培養した後、１．５ｍｌマイクローチューブにて集菌し、凍結させた後に凍結乾燥を行った。乾燥菌体重量を測定した後、濃硫酸による菌体内ＰＨＢのクロトン酸変換を行った。クロトン酸変換は、マイクロチューブ中の乾燥菌体に対し１ｍｌの濃硫酸を加え、１２０℃、４０分間加熱した後、氷中で急冷した。なお、この操作により菌体内のＰＨＢは、高温下濃硫酸によって脱水反応がおこり、クロトン酸に変換される。
次に、冷却したサンプルを、４倍量の０．０１４Ｎ硫酸溶液にて希釈し、さらに冷却した後ＨＰＬＣサンプルとした。サンプルは、親水性ＰＶＤＦ膜、孔径０．４５μｍのフィルターでろ過した後、１０μｌをＨＰＬＣ装置へ注入した。ＨＰＬＣ装置は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０Ａｖｐシステムを用いた。カラムは、架橋度８％スチレンジビニルベンゼンコポリマー系陽イオン交換樹脂カラムであるＢｉｏ−ｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ（３００ｘ７．８ｍｍ）を用いた。また、ガードカラムとしてＢｉｏ−ｒａｄ Ｃａｔｉｏｎ−Ｈ Ｒｅｆｉｌｌ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（３０ｘ４．６ｍｍ）を用いた。移動層は、０．０１４Ｎ硫酸溶液を用い、流速は０．７ｍｌ／ｍｉｎで測定を行った。カラム温度は６０℃に設定し、脱水反応により生成したクロトン酸のカルボニル基に由来する２１０ｎｍの吸収を分光学的に検出した。クロトン酸の保持時間は、２０．４分であった。ＰＨＢ蓄積率は、クロトン酸量と面積の関係式（検量線）を基にして算出した
１２１個のクローンについてＨＰＬＣ装置を用いてＰＨＢ蓄積量を測定した結果、１８個のクローンが野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株より高いＰＨＢ蓄積量を示した。なお、野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株は、野生型のＰｈａＣｌＰｓを用いた以外は上述した方法と同様にして作製した。１８個全ての変異体の塩基配列を決定したところ、その内訳は以下の通りだった。単独変異：７個、二重変異：９個、三重変異：２個であった。なお、塩基配列決定は、ＢｉｇＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、Ｐｒｉｓｍ３１０ ＤＮＡシーケンサー又はＰｒｉｓｍ３７７ ＤＮＡシーケンサーを用いたジデオキシ連鎖ターミネーション法で行った。塩基配列決定により得られた塩基配列情報は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣソフトウェア（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）又はＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｉｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎからの提供）を用いて解析した。この中で、有意にＰＨＢ含量が増大したアミノ酸置換体において後述のように部位指定飽和変異（Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を実施することにした。
野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株より高いＰＨＢ蓄積量を示した１８個のクローンと野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株とにおけるＰＨＢ蓄積量測定結果を図６に示した。図６は、縦軸をＰＨＢ蓄積量とし横軸をクローン名とする。
また、これら１８個のクローンからｐＧＥＭ″ＣｌＰｓＡＢＲｅを抽出し、ＰｈａＣｌＰｓの塩基配列を決定して変異箇所を同定した。また、同定した変異箇所に基づいて、ＰｈａＣｌＰｓにおけるアミノ酸変異を解析した。図６に示した各クローンにおけるＰＨＢ蓄積量とアミノ酸変異との関係を表２に示す。
〔実施例２〕
実施例２では、図６及び表２に示した結果から、ＰＨＢ蓄積量の向上に起因すると考えられるアミノ酸変異を検討した。先ず、野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株より高いＰＨＢ蓄積量を示した１８個のクローンにおいて、図６及び表２に示した結果から３２５番目のセリン及び４８１番目のグルタミンにおけるアミノ酸置換がＰＨＢ蓄積量の向上に影響を与えていると考えられた。
そこで、有意にＰＨＢ含量が増大する変異をもたらす３２５番目及び４８１番目での部位指定飽和変異を試みた。先ず、３２５番目のセリンをセリン以外の他のアミノ酸に置換し、その置換がＰＨＢ蓄積量に与える影響を検討した。具体的には、先ず、３２５番目のセリンをコードするコドンを、セリン以外の他のアミノ酸をコードするコドンに変異させるべく変異導入用プライマーを設計した。次に、変異導入用プライマーを用いた部位特異的突然変異導入法により、３２５番目のセリンを所定のアミノ酸に置換したＰｈａＣｌＰｓを作製した。すなわち、３２５番目のアミノ酸がセリン以外の１９種類のアミノ酸のうちいずれかに置換さたポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素をコードする１９種類のＰｈａＣｌＰｓを作製した。なお、これら１９種類のＰｈａＣｌＰｓは、上述したｐＧＥＭ″ＡＢＲｅに挿入されている。
次に、得られた１９種類のＰｈａＣｌＰｓを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株のコンピテント細胞に形質転換した。形質転換処理細胞を用いて、実施例１と同様にしてＰＨＢ蓄積量を測定した。１９種類のＰｈａＣｌＰｓ発現株と野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株とにおけるＰＨＢ蓄積量測定結果を図７に示した。図７は、縦軸をＰＨＢ蓄積量とし横軸を変異の種類とする。図７に示した各変異におけるＰＨＢ蓄積量とアミノ酸変異との関係を表３に示す。
図７及び表３に示した結果から、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素における３２５番目のセリンをシステイン又はスレオニンに置換したポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素は、野生型のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素と比較して非常に高いＰＨＢ蓄積量を示すことが明らかとなった。このことから、これらポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素によれば、野生型のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素とは異なる組成比のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を取得することができる。特に、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素によれば、野生型のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素から取得されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）と比較すると、３ＨＢ成分の組成比が高いＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を取得することができる。
次に、４８１番目のグルタミンをグルタミン以外の他のアミノ酸に置換し、その置換がＰＨＢ蓄積量に与える影響を、上述した３２５番目のセリンをセリン以外の他のアミノ酸に置換した際の手法に準じて検討した。４８１番目のグルタミンをグルタミン以外の他のアミノ酸に置換した１９種類のＰｈａＣｌＰｓ発現株と野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株とにおけるＰＨＢ蓄積量測定結果を図８に示した。図８は、縦軸をＰＨＢ蓄積量とし横軸を変異の種類とする。図８に示した各変異におけるＰＨＢ蓄積量とアミノ酸変異との関係を表４に示す。
図８及び表４に示した結果から、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素における４８１番目のグルタミンを、グリシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アルギニン、セリン又はスレオニンに置換したポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素は、野生型のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素と比較して非常に高いＰＨＢ蓄積量を示すことが明らかとなった。この中でも、リジン、アルギニン又はメチオニンに置換したポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素は、ＰＨＢ蓄積量の向上が顕著であった。
このことから、これらポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素によれば、野生型のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素とは異なる組成比のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を取得することができる。特に、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素によれば、野生型のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素から取得されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）と比較すると、３ＨＢ成分の組成比が高いＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を取得することができる。
また、図７及び８並びに表３及び４に示した結果においてより高いＰＨＢ蓄積量を示したクローンに含まれるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素によれば、３ＨＢ成分の組成比がより高いＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を取得することができる。さらに、この結果から、これら３ＨＢ基質に対して高い基質特異性を示すようになった変異の位置の探索・特定には、今回採用した進化工学的手法は非常にパワフルに機能することが示された。
次に、基質特異性の変換に強く関与し、ＰＨＡ含量を底上げする優良変異が特定された段階で、次世代の進化を試みた。すなわち、３２５番目（Ｓ３２５ＴとＳ３２５Ｃの２種）と４８１番目（Ｑ４８１Ｋ、Ｑ４８１Ｒ、Ｑ４８１Ｍの３種）で得られた優良変異の組み合わせ（計６種の二重変異体）を遺伝子工学的に作製した。また、実施例１の結果より、ＰＨＢ蓄積量を向上させると考えられる１３０番目の置換、４７７番目の置換、３２５番目の置換及び４８１番目の置換をそれぞれ単独で有するＰｈａＣｌＰｓ発現株と、これらの変異を組み合わせて有する（二重変異、三重変異及び四重変異）ＰｈａＣｌＰｓ発現株と野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株とにおけるＰＨＢ蓄積量測定結果を表５及び６に示す。また、表５に示した結果の中から、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ３２５Ｃ、Ｑ４８１Ｋ、Ｑ４８１Ｒ及びＱ４８１Ｍを単独で有するＰｈａＣｌＰｓ発現株及び組み合わせて有するＰｈａＣｌＰｓ発現株について図９に示す。図９は、縦軸をＰＨＢ蓄積量とし横軸を変異の種類とする。
図９、表５及び表６に示した結果から、１３０番目の置換、４７７番目の置換、３２５番目の置換及び４８１番目の置換をそれぞれ単独で有するＰｈａＣｌＰｓ発現株と、これらの変異を組み合わせて有する（二重変異、三重変異及び四重変異）ＰｈａＣｌＰｓ発現株において、野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株と比較して、非常に高いＰＨＢ蓄積量を示した。また、二重変異、三重変異及び四重変異ＰｈａＣｌＰｓ発現株では、単独変異ＰｈａＣｌＰｓ発現株と比較して、非常に高いＰＨＢ蓄積量を示した。特に、３２５番目のセリンをシステイン又はスレオニンに置換するとともに４８１番目のグルタミンをリジン、アルギニン又はメチオニンに置換したポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変換酵素によれば、野生型のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素から取得されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）と比較すると、３ＨＢ成分の組成比がより高いＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を取得することができる。この結果から、優良変異の相乗効果（３２５番目のセリン置換の効果及び４８１番目のグルタミン置換の効果）が出現し、それぞれの単独変異より飛躍的にＰＨＢ含量を増加（平均約３８％）させることができた。
基質特異性の決定に関与するアミノ酸残基の位置がこのマッピングによって、特定できたと推定される。このように本手法により、今後、他の基質特異性に関与する残基の位置が特定されていくことにより、それらの位置におけるアミノ酸置換体の組み合わせにより様々な優良変異酵素が創生できる可能性を示した。
〔実施例３〕
実施例３では、実施例１で得られた１８個のクローンのなかでクローン名ｅｐ（１−１）、ｅｐ（１−８）、ｅｐ（１−１６）、ｅｐ（４−２）、ｅｐ（１０−３）、ｅｐ（１０−４）及びｅｐ（１０−５）について、それぞれに含まれる変異型ＰｈａＣｌＰｓで大腸菌ＬＳ５２１８を形質転換し、形質転換された大腸菌ＬＳ５２１８におけるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）コポリマー蓄積量及びＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を構成するモノマーの組成について検討した。なお、大腸菌ＬＳ５２１８は、ドデカン酸からＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）コポリマーを合成することができる。大腸菌ＬＳ５２１８は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒから入手した（寄託番号ＣＧＳＣ ６９６６）。
先ず、実施例１で得られたｅｐ（１−１）、ｅｐ（１−８）、ｅｐ（１−１６）、ｅｐ（４−２）、ｅｐ（１０−３）、ｅｐ（１０−４）及びｅｐ（１０−５）それぞれについて、Ｍｉｌｌｅｒらの方法により変異型ＰｈａＣｌＰｓを含むプラスミドベクターｐＧＥＭ″ＣｌＰｓＡＢＲｅを精製した。
次に、精製したプラスミドベクターを制限酵素ＸｂａＩとＰｓｔＩで処理し変異型ＰｈａＣｌＰｓを含むＤＮＡ断片を精製した。次いで、精製したＤＮＡ断片を用いてモノマー供給系遺伝子発現プラスミドｐＧＥＭ″ＡＢＲｅＪＡｃのＸｂａＩとＰｓｔＩ制限酵素サイトの間に置換挿入することによりＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）コポリマー合成用プラスミドベクターを得た。得られたプラスミドベクターをｐＧＥＭ″ＣｌＰｓＡＢＲｅＪＡｃとした（図１０参照）。
なお、ｐＧＥＭ″ＡＢＲｅＪＡｃは、実施例１で用いたｐＧＥＭ″ＡＢＲｅのｐｈｂＢＲｅの下流にＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来の（Ｒ）−特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪＡｃ）を挿入したものである。（Ｒ）−特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪＡｃ）は、Ｆｕｋｕｉ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０，６６７（１９９８）に記載されているプラスミドベクターｐＥＴＮＢ３を制限酵素処理することにより得た。
次に、精製したプラスミドベクターｐＧＥＭ″ＣｌＰｓＡＢＲｅＪＡｃを用いて大腸菌ＬＳ５２１８を形質転換した。形質転換された大腸菌ＬＳ５２１８は、０．５％のドデカン酸及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭ９培地において７２時間３７℃で培養した。当該Ｍ９培地の組成を表７に示した。
培養後、細胞内のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）コポリマー含有量と、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を構成する３ＨＡモノマーの分率を測定した。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）コポリマー含有量測定及び３ＨＡモノマーの分率測定に際しては、先ず、約３０ｍｇの乾燥菌体を、１．７ｍｌのメタノール、０．３ｍｌの９８％硫酸及び２．０ｍｌのクロロフォルムからなる溶液で１００℃、１４０分間処理してメタノリシスさせ、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）コポリマーの組成物をメチルエステルに変換した。その後、反応液に１ｍｌの水を加え、相分離させた。そして、下層のクロロフォルム層をガスクロマトグラフィー分析に供した。ガスクロマトグラフィー分析は、ニュートラボンド−Ｉキャピラリーカラム及びフレームイオン化検出装置を備える島津ＧＣ−１７Ａシステムを用いて行った。結果を図１１及び１２並びに表８に示す。なお、表７及び図１２において、炭素数４の３ＨＡを「Ｃ４」と表記し、炭素数６の３ＨＡを「Ｃ６」と表記し、炭素数８の３ＨＡを「Ｃ８」と表記し、炭素数１０の３ＨＡを「Ｃ１０」と表記し、炭素数１２の３ＨＡを「Ｃ１２」と表記している。
この表８から判るように、野生型の大腸菌ＬＳ５２１８では、乾燥菌体重量において３ｗｔ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）コポリマーを含有し、Ｃ４（炭素数４の３ＨＡ、以下同様）の分率が２１％、Ｃ６の分率が４５％、Ｃ８の分率が２０％、Ｃ１０の分率が９％及びＣ１２の分率が５％であった。これに対して、ｅｐ（１−８）、ｅｐ（１−１６）、ｅｐ（４−２）及びｅｐ（１０−５）においては、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）コポリマー含有量が野生型と比較してそれぞれ４．７倍、８倍、１２倍及び９．５倍に増加していた。
また、ｅｐ（１−８）、ｅｐ（１−１６）、ｅｐ（４−２）及びｅｐ（１０−５）においては、３ＨＢモノマー（Ｃ４）の分率がそれぞれ３０％、３９％、４０％及び５５％となっており、野生型と比較して３ＨＢの分率が高いコポリマーを生産していることが判った。
〔実施例４〕
実施例４では、１３０番目の置換、４７７番目の置換、３２５番目の置換及び４８１番目の置換をそれぞれ単独で有するＰｈａＣｌＰｓ発現株と、これらの変異を組み合わせて有する（二重変異、三重変異及び四重変異）ＰｈａＣｌＰｓ発現株における、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）コポリマー含有量と、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を構成する３ＨＡモノマーの分率を検討した。
本例では、実施例３で使用したプラスミドベクターｐＧＥＭ″ＣｌＰｓＡＢＲ ｅＪＡｃにおけるＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来の（Ｒ）−特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪＡｃ）を、Ｐｓｅｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の（Ｒ）−特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪ４Ｐａ）に置換してなるプラスミドベクターｐＧＥＭ″ＣｌＡＢＪ４を使用した（図１３）。なお、Ｐｓｅｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の（Ｒ）−特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪ４Ｐａ）は、Ｔｓｕｇｅ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｉｃｒｏｍｏｌ．３１．１９５（２００３）に記載されているプラスミドベクターｐＵＣＪ４を制限酵素処理することによって得ることができる。
次に、プラスミドベクターｐＧＥＭ″ＣｌＡＢＪ４で大腸菌ＬＳ５２１８を形質転換した。その後、形質転換された大腸菌ＬＳ５２１８を、０．３％のドデカン酸及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭ９培地で、実施例３と同様にして培養した。培養後、細胞内のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）コポリマー含有量と、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を構成する３ＨＡモノマーの分率を、実施例３と同様にして測定した。結果を表９及び表１０に示す。
表９及び１０に示した結果から、Ｅ１３０Ｄ単独変異を有するＰｈａＣｌＰｓ発現株では、野生株と比較してＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）蓄積量が増加しており、野生株と同様な３ＨＡモノマー分率を有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を合成することが明らかになった。また、Ｓ４７７Ｒ単独変異を有するＰｈａＣｌＰｓ発現株では、野生株と比較して３ＨＡモノマー分率が異なり、炭素数６の３ＨＨｘ分率の高いＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を合成することが明らかになった。また、Ｓ３２５Ｃ、Ｓ３２５Ｔ、Ｑ４８１Ｋ、Ｑ４８１Ｍ及びＱ４８１Ｒ単独変異を有するＰｈａＣｌＰｓ発現株では、野生株と比較して３ＨＡモノマー分率が異なり、炭素数４の３ＨＢ分率の高いＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を合成することが明らかになった。なかでも、Ｓ３２５Ｃ、Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｍ単独変異を有するＰｈａＣｌＰｓ発現株では、野生株と比較してＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）蓄積量が増加していることも明らかとなった。
一方、二重変異、三重変異及び四重変異ＰｈａＣｌＰｓ発現株に関する結果からは、複数の変異を組み合わせることによって、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）蓄積量を増加させられるとともに、様々な３ＨＡモノマー分率のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を合成できることが判る。特に、Ｓ４７７Ｒを含む三重変異及び四重変異を有するＰｈａＣｌＰｓ発現株では、野生株と比較して、３ＨＢ分率及び３ＨＨｘ分率の高いＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を合成できる傾向にあることが判る。
本実施例により、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を合成するに際して、配列番号１における１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも１のアミノ酸を置換することで、実用に即した物性を示すＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を合成できることが実証された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
以上、詳細に説明したように、本発明に係るポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素によれば、野生型酵素が製造する生分解性ポリエステルとは異なる組成比を有し、異なる物性を示す生分解性ポリエステルを製造できる。
配列表フリーテキスト
配列番号２及び３は合成ＤＮＡである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸の生合成スキームを示した図である。
図２は、細菌におけるアセチル−ＣｏＡ二量化系からのポリエステル生産とそれにかかわる酵素を示した図である。
図３は、細菌における脂肪酸代謝系からのポリエステル生産とそれにかかわる酵素を示した図である。
図４は、プラスミドベクターｐＥＴｐｈａＣｌＰｓの概略構成図である。
図５は、プラスミドベクターをｐＧＥＭ″ＣｌＰｓＡＢＲｅの概略構成図である。
図６は、野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株より高いＰＨＢ蓄積量を示した１８個のクローンと野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株とにおけるＰＨＢ蓄積量測定結果を示す特性図である。
図７は、３２５番目のアミノ酸を変異させたＰｈａＣｌＰｓ発現株と野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株とにおけるＰＨＢ蓄積量測定結果を示す特性図である。
図８は、４８１番目のアミノ酸を変異させたＰｈａＣｌＰｓ発現株と野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株とにおけるＰＨＢ蓄積量測定結果を示す特性図である。
図９は、３２５番目及び４８１番目のアミノ酸を変異させたＰｈａＣｌＰｓ発現株と野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株とにおけるＰＨＢ蓄積量測定結果を示す特性図である。
図１０は、プラスミドベクターｐＧＥＭ″ＣｌＰｓＡＢＲｅＪＡｃの概略構成図である。
図１１は、変異型ＰｈａＣｌＰｓ発現株と野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株とにおけるＰＨＡ蓄積量測定結果を示す特性図である。
図１２は、変異型ＰｈａＣｌＰｓ発現株と野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株とにおけるモノマー分率を示す特性図である。
図１３は、プラスミドベクターｐＧＥＭ″ＣｌＡＢＪ４の概略構成図である。
本発明は、所望の物性を示す生分解性ポリエステルを製造できるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素に関する。
背景技術
持続可能な社会を築いていく一環として、環境調和型の生分解性プラスチックの創製が注目されている。ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）等の微生物によって生産されるポリ３−ヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ；ｐｏｌｙ（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ））は、熱可塑性及び生分解性を兼ね備えていることから、生分解性プラスチックとしての応用が検討され、既に一部で実用化が始まっている。
生分解性プラスチックを、より広範に実用化するためには、より安価な生産システムの構築及び所望の物性を示す生分解性プラスチックを自在に生産することのできる微生物の育種が重要である。これを達成するために、これまでに、新しいタイプの生分解性ポリエステル合成酵素の探索、遺伝子工学的手法による酵素生産量の増強、細胞内の生合成経路の代謝工学的改変等が試みられている。
例えば、生分解性プラスチックがコポリマーの場合には、モノマーの組成比によって当該生分解性プラスチックの諸物性を制御することができる。しかしながら、コポリマーにおけるモノマー組成比を効率的に改変する手法は特に確立されておらず、所望の物性を示す生分解性プラスチックは得られていない。
発明の開示
そこで、本発明は、所望の物性を示す生分解性ポリエステルを製造できる新規なポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、進化工学的手法によって、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸の生合成に関与する酵素を所望の性質を有する酵素に改変することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列の１３０番目のグルタミン酸、３２５番目のセリン、４７７番目のセリン及び４８１番目のグルタミンからなる群のうち少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列の１３０番目のグルタミン酸、３２５番目のセリン、４７７番目のセリン及び４８１番目のグルタミンからなる群のうち少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列において、１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸を除く少なくとも１以上のアミノ酸を欠失、置換、及び／又は付加したアミノ酸配列であって、生分解性ポリエステル酸生合成活性を示すアミノ酸配列
（２）上記３２５番目のセリンをシステイン又はスレオニンに置換したことを特徴とする（１）記載のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素。
（３）上記４８１番目のグルタミンをグリシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アルギニン、セリン又はスレオニンに置換したことを特徴とする（１）記載のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素。
（４）上記４８１番目のグルタミンをリジン、アルギニン又はメチオニンに置換したことを特徴とする（１）記載のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素。
（５）上記１３０番目のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換したことを特徴とする（１）記載のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素。
（６）上記４７７番目のセリンをアルギニンに置換したことを特徴とする（１）記載のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素。
（７）配列番号１のアミノ酸配列において、２７番目のアルギニンからヒスチジンへの置換及び４７７番目のセリンからアルギニンへの置換からなる変異と、１３０番目のグルタミン酸からアスパラギン酸への置換及び３２７番目のロイシンからフェニルアラニンへの置換からなる変異と、１２番目のグルタミンからアルギニンへの置換、３６２番目のメチオニンからロイシンへの置換及び４９７番目のセリンからグリシンへの置換からなる変異と、３０４番目のアラニンからバリンへの置換及び３６９番目のメチオニンからロイシンへの置換からなる変異と、３０番目のアスパラギン酸からアスパラギンへの置換及び２７４番目のアスパラギンからチロシンへの置換からなる変異と、４７７番目のセリンからアルギニンへの置換からなる変異と、１３０番目のグルタミン酸からアスパラギン酸への置換からなる変異とからなる群から選ばれる１つの変異を有することを特徴とするポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素。
（８）（１）〜（７）いずれか１に記載された生分解性ポリエステル酸生合成変異酵素により製造された生分解性ポリエステル。
（９）（１）〜（７）いずれか１に記載された生分解性ポリエステル酸生合成変異酵素をコードするポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素遺伝子。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る生分解性ポリエステル生合成変異酵素は、配列番号１にアミノ酸配列において、１３０番目のグルタミン酸、３２５番目のセリン、４７７番目のセリン及び４８１番目のグルタミンからなる群のうち少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する。配列番号１に示すアミノ酸配列は、シュードモナスｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）６１−３株由来の野生型のポリ３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素のアミノ酸配列である。
１３０番目のグルタミン酸を置換する他のアミノ酸とは、グルタミン酸以外のアミノ酸であれば特に限定されないが、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、システイン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン及びグリシンを挙げることができる。特に、１３０番目のグルタミン酸を置換する他のアミノ酸としては、アスパラギン酸が好ましい。
３２５番目のセリンを置換する他のアミノ酸とは、セリン以外のアミノ酸であれば特に限定されないが、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン及びグリシンを挙げることができる。特に、３２５番目のセリンを置換する他のアミノ酸としては、システイン又はスレオニンが好ましい。
また、４７７番目のセリンを置換する他のアミノ酸とは、セリン以外のアミノ酸であれば特に限定されないが、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン及びグリシンを挙げることができる。特に、４７７番目のセリンを置換する他のアミノ酸としては、アルギニンが好ましい。
さらに、４８１番目のグルタミンを置換する他のアミノ酸とは、グルタミン以外のアミノ酸であれば特に限定されないが、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、セリン、スレオニン及びグリシンを挙げることができる。特に、４８１番目のグルタミンを置換する他のアミノ酸としては、グリシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アルギニン、セリン又はスレオニンが好ましく、特に、リジン、アルギニン又はメチオニンがより好ましい。
ここで、「ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素」とは、ポリエステル合成に必須な鍵酵素であり、（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡモノマーの重合を触媒する酵素である。ポリ３−ヒドロキシアルカン酸とは、３−ヒドロキシアルカン酸を構成ユニットとし、エステル結合によって３−ヒドロキシアルカン酸が結合した重合物であって、生物によって生合成され且つ土中や水中の微生物によって分解されるエステル重合物を意味する。
また、本発明に係るポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素は、配列番号１のアミノ酸配列において、２７番目のアルギニンからヒスチジンへの置換及び４７７番目のセリンからアルギニンへの置換からなる変異と、１３０番目のグルタミン酸からアスパラギン酸への置換及び３２７番目のロイシンからフェニルアラニンへの置換からなる変異と、１２番目のグルタミンからアルギニンへの置換、３６２番目のメチオニンからロイシンへの置換及び４９７番目のセリンからグリシンへの置換からなる変異と、３０４番目のアラニンからバリンへの置換及び３６９番目のメチオニンからロイシンへの置換からなる変異と、３０番目のアスパラギン酸からアスパラギンへの置換及び２７４番目のアスパラギンからチロシンへの置換からなる変異と、４７７番目のセリンからアルギニンへの置換からなる変異と、１３０番目のグルタミン酸からアスパラギン酸への置換からなる変異とからなる群から選ばれる１つの変異を有するものである。
一般に、細菌中でのポリ３−ヒドロキシアルカン酸の生合成経路は、図１のように、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸を構成するモノマーユニットを供給する系（モノマー供給系）とモノマーユニットを重合する系（モノマー重合系）の２つの系から構成される。例えば、細菌中でのポリ３−ヒドロキシンアルカン酸の生合成は、図２及び３のように、３−ケトチオラーゼ（ＰｈｂＡ、ＢｋｔＢ）やアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＰｈｂＢ）等により構成されるアセチルＣｏＡ二量体化系や、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＰｈａＪ）や３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＧ）等により構成される脂肪酸分解経路、（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ−ＣｏＡトランスアシラーゼ（ＰｈａＧ）、３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩＩ（ＦａｂＨ）、マロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼ（ＦａｂＤ）等により構成される脂肪酸生合成経路などを経て生合成されたモノマーユニット（図２中：（Ｒ）−３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡ，（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ；図３中：（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡが、ポリ３−ヒドロキシブタン酸合成酵素やポリ３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素によって重合されることによって行われる。ここで、ポリ３−ヒドロキシブタン酸は、３−ヒドロキシブタン酸のホモポリマーであり、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸は、炭素数４のヒドロキシブタン酸、炭素数５のヒドロキシ吉草酸、炭素数６のヒドロキシヘキサン酸、炭素数７のヒドロキシヘプタン酸、炭素数８のヒドロキシオクタン酸、炭素数９のヒドロキシノナン酸、炭素数１０のヒドロキシデカン酸及び炭素数１２のヒドロキシドデカン酸等、様々なモノマーユニットから構成される広範囲の３−ヒドロキシアルカン酸ホモポリマーを意味する。
特に、シュードモナスｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）６１−３株由来の野生型のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素（以下、野生型酵素と呼ぶ場合もある）は、中長鎖（炭素数６〜１４）の３−ヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとした共重合ポリヒドロキシアルカン酸を合成でき、且つ、炭素数４の３−ヒドロキシブタン酸をモノマーユニットとした共重合ポリヒドロキシアルカン酸を合成することができる。
本発明に係るポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素は、野生型酵素と比較して、３−ヒドロキシブタン酸の含有率（組成比）が高い共重合ポリヒドロキシアルカン酸を合成できる。このように、本発明に係るポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素は、野生型酵素と異なる物性を示す共重合ポリヒドロキシアルカン酸を合成できる。
特に、配列番号１における３２５番目のセリンをシステイン又はスレオニンに置換してなるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素は、野生型酵素と比較して、３−ヒドロキシブタン酸の含有率が大幅に高くなった共重合ポリヒドロキシアルカン酸を合成できる。また、配列番号１における４８１番目のグルタミンをリジン、アルギニン又はメチオニンに置換してなるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素は、野生型酵素と比較して、３−ヒドロキシブタン酸の含有率が大幅に高くなった共重合ポリヒドロキシアルカン酸を合成できる。さらに、配列番号１における４７７番目のセリンをアルギニンに置換してなるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素は、野生型酵素と比較して、３−ヒドロキシヘキサン酸の含有率が大幅に高くなった共重合ポリヒドロキシアルカン酸を合成できる。
さらに、配列番号１における３２５番目のセリンをシステイン又はスレオニンに置換し、且つ４８１番目のグルタミンをリジン、アルギニン又はメチオニンに置換してなるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素は、３−ヒドロキシブタン酸の含有率が上述した場合よりも高くなった共重合ポリヒドロキシアルカン酸を合成できる。
本発明に係るポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素をコードする遺伝子は、シュードモナスｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）６１−３株から採取したポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素をコードする遺伝子（以下、野生型遺伝子と呼ぶ）における所定の塩基に突然変異を導入することで得ることができる。
このとき、野生型遺伝子は、例えば、Ｍａｔｓｕｓａｋｉ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０，６４５９−６４６７（１９９８）に記載された方法に準じて得ることができ、また、既にクローニングされているＰｈａＣｌＰｓを持つプラスミドを鋳型としてＰＣＲ法で増幅させることによって得ることができる。野生型遺伝子における３２５番目のセリンをコードするコドンをセリン以外の他のアミノ酸をコードするコドンに変異させる場合には、いわゆる部位特異的変異導入法を用いることができる。同様に、野生型遺伝子における４８１番目のグルタミンをコードするコドンをグルタミン以外の他のアミノ酸をコードするコドンに変異させる場合にも、この部位特異的変異導入法を用いることができる。
部位特異的変異導入法としては、特に限定されないが、例えば以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。すなわち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、野生型遺伝子中の変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、そこを前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、野生型遺伝子中の変異導入を希望する目的の部位に目的の変異を導入した変異プライマーと前記遺伝子の一方の末端部位の配列を含む変異を有しない増幅用プライマーとで前記遺伝子の片側を増幅し、前記変異用プライマーに対して相補的な配列を有する変異用プライマーと前記遺伝子のもう一方の末端部位の配列を含む変異を有しない増幅用プライマーでもう片側を増幅し、得られた２つの増幅断片をアニール後、さらに前記２種類の増幅用プライマーでＰＣＲをすることにより行うことができる［ＳＨＯＲＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，３ｒｄ ｅｄ，１９９５，Ｆ．Ａ．Ｓｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＷＩＬＥＹ］。
このようにして得られた３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素をコードする遺伝子（以下、３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素遺伝子と呼ぶ）は、適当なベクターに連結することによって、所定の宿主でポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素を発現しうる組換えベクターを得ることができる。また、得られた組換えベクターを所定の宿主に導入することによって、当該ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素を発現する形質転換体を得ることができる。
３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素遺伝子を挿入するためのベクターは、所定の宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ等のプラスミドＤＮＡ、ＥＭＢＬ３、Ｍ１３、λｇｔ１１等のファージＤＮＡ等を、酵母を宿主として用いる場合は、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等を、植物細胞を宿主として用いる場合には、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１等を、動物細胞を宿主として用いる場合は、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社）等をベクターとして用いることができる。
組換えベクターを導入する宿主としては、３−ヒドロキシアルカン酸を構成ユニットとし、エステル結合によって３−ヒドロキシアルカン酸を重合させポリ３−ヒドロキシアルカン酸を合成できるものであれば限定されないが、例えば、大腸菌ＬＳ５２１８（ｆａｄＲ−）、ＬＳ１２９８（ｆａｂＢ−）、ＬＳ１３００（ｆｒｅ）、ＬＳ６５９６（ｆａｄＡ３０）等のＬＳシリーズの大腸菌株を挙げることができる。これらＬＳシリーズの大腸菌株は、脂肪酸β酸化経路関連酵素遺伝子のマイナス制御因子であるｆａｄＲが破壊された変異株であり、他の大腸菌と比較して脂肪酸を効率よく代謝できるといった特徴を有している。また、宿主としては、通常の大腸菌であっても、アクリル酸（最適濃度０．２４ｍｇ／ｍｌ）を添加することによって脂肪酸β酸化経路を阻害することによって使用することができる。
細菌への組換えベクターの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１巻，１．８．１頁，１９９４年］やエレクトロポレーション法［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１巻，１．８．４頁，１９９４年］等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２−１８７（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９−１９３３（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３−１６８（１９８３）］等が挙げられる。植物細胞への組換えベクターの導入方法としては、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法等が挙げられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。
上述した形質転換体で産生されたポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素の酵素活性は、例えば、当該形質転換体を、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸の生成が可能な条件下で培養し、細胞内におけるポリ３−ヒドロキシアルカン酸の生成蓄積状況を調べることで評価できる。すなわち、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸の生成蓄積量を、当該ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素と野生型のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素とで比較することで、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素の酵素活性を評価できる。
ポリ３−ヒドロキシアルカン酸の生産蓄積状況は、例えば、ポリ３−ヒドロキシブタン酸に特異的に染色するＮｉｌｅ Ｒｅｄを寒天培地プレートに含有させることによって、プレート上に生育したコロニーのピンク色の呈色度合いを調べることによって判別することができる。ここで、呈色度が強い程、ポリ３−ヒドロキシブタン酸の細胞内含量が高いと評価することができ、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素の活性が高いと評価することができる。また、３１２ｎｍの光照射によって発する蛍光の強度によっても高感度に観察できる［Ｓｐｉｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７１：７３−８０（１９９９）］。
また、各クローン中のポリ３−ヒドロキシブタン酸含量の正確な定量は、以下のようにして行うことができる。すなわち、ポリ３−ヒドロキシブタン酸含量が乾燥菌体重量換算で約１％以上の場合には、菌体からポリ３−ヒドロキシブタン酸を、有機溶媒（例えば、クロロホルム）により抽出後、メタノール−濃硫酸溶液中でメタノリシスさせ、３−ヒドロキシブタン酸のメチル化体をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析する方法により行うことができる。また、ポリ３−ヒドロキシブタン酸含量が乾燥菌体重量換算で約１％未満の場合には、ポリ３−ヒドロキシブタン酸を、高温下濃硫酸によってクロトン酸変換（脱離反応）し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供試し、他成分と分離させ、２１０ｎｍでの吸収を分光学的に検出する方法等によって行うことができる［Ｋａｒｒ ｅｔ ａｌ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４６：１３３９−１３４４（１９８３）；Ｓｅｅｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２４：３１７−３２８（１９９４）］。
また、上述した形質転換体を培地で培養し、培養物（培養菌体又は培養上清）中にポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより製造することができる。
形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、完全培地又は合成培地、例えばＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。また、培養温度は３７℃で好気的に１２〜１４時間培養することによりポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素を菌体内に蓄積させ、回収する。
炭素源は微生物の増殖に必要であり、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、マルトース等の炭水化物が挙げられる。窒素源としては例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。また、無機物としては例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。プラスミド保持用の選択圧など必要に応じて、培地中に、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素の精製は、得られる培養物を遠心して回収し（細胞についてはソニケーターにて破砕する）、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン又は陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等を単独で又は適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的の酵素であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
さらに、上述した形質転換体を適当な培地で培養することによって、所定の物性を示す生分解性ポリエステルを製造することができる。得られた生分解性ポリエステルは、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素により生合成されたものであるため、野生型酵素により生合成されえものとは異なる物性を示すものとなる。
得られた生分解性ポリエステルとしては、３−ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシアルカン酸（３ＨＡ）とのコポリマー、例えば、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨｘ）とのコポリマーを例示することができる。なお、以下において、３ＨＢと３ＨＡとのコポリマーを「Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）」と記載し、３ＨＢと３ＨＨｘとのコポリマーを「Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）」と記載する場合もある。
すなわち、上述した形質転換体を適当な培地で培養することによって、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を製造することができる。例えば、宿主として大腸菌ＬＳ５２１８を用いた場合には、菌体内部にＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を製造することができる。
上述した形質転換体においては、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）の蓄積量が多量であり、且つ、野生型酵素を用いる場合とは異なり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）における３−ヒドロキシブタン酸の含有量（組成比）が大幅に向上している。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）において、３ＨＢの組成比が高いことによりリジッドなものとなり、実用的に優れた特性を示すこととなる。
なお、細胞内に蓄積されたポリエステルの細胞内含量及びポリエステルの組成は、加藤らの方法［Ｋａｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５，３６３（１９９６）；Ｋａｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．６９，５１５（１９９６）］に従い、細胞からクロロホルム等の有機溶媒を用いて抽出後、抽出物をガスクロマトグラフィー、ＮＭＲなどに供試することに測定・分析することができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００２−１５４３７４号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。なお、以下の実施例では、一例として、いわゆる進化工学的手法を用いて本発明に係るポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素を取得した例を説明する。しかしながら、本発明は、以下の実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。すなわち、本発明に係るポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素の取得方法は、以下の実施例に限定されない。
〔実施例１〕
ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法によるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素の改変
ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法によって、シュードモナスｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）６１−３株由来のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素をコードする遺伝子（ＰｈａＣｌＰｓ）における全領域にランダム変異を導入した。ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法には、鋳型としてＰｈａＣｌＰｓを含むプラスミドベクターｐＥＴｐｈａＣｌＰｓ（図４参照）を用い、基本ベクターｐＥＴ−２３ａ（＋）のマルチクローニングサイト上流側に対応する順方向プライマーｐＥＴＭＣＳ−ｆｏｒ．：５’−ＣＣＣＡＡＣＧＣＴＧＣＣＣＧＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＣＣＣＧＣＧ−３’（配列番号２）及び基本ベクターｐＥＴ−２３ａ（＋）のマルチクローニングサイト下流側に対応する逆方向プライマーｐＥＴＭＣＳ−ｒｅｖ．：５’−ＡＧＣＴＴＣＣＴＴＴＣＧＧＧＣＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧ−３’（配列番号３）を用いた。ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法では、ポリメラーゼの基質取り込み忠実性を低下させる条件でＰＣＲを行うことにより、変異の場所を限定することなくＰｈａＣｌＰｓ全域への変異の導入を試みた。
なお、ｐＥＴｐｈａＣｌＰｓは、基本ベクターとしてｐＥＴ−２３ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いた。ＰｈａＣｌＰｓは、まずｐＢＳＥＸ２２（Ｍａｔｓｕｓａｋｉ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．１８０，６４５９（１９９８））を鋳型とし、ＰｈａＣｌＰｓの開始コドン（ＡＴＧ）にオーバーラップするように制限酵素ＮｄｅＩ認識配列（ＣＡＴＡＴＧ）を導入したプライマーとＰｈａＣｌＰｓの停止コドン下流に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列（ＧＧＡＴＣＣ）を導入したプライマーを用いＰＣＲ法により増幅した。次いで、ＰＣＲによって得られた増幅ＤＮＡ断片を精製単離した後にＮｄｅＩとＢａｍＨＩによって処理した。次いで、制限酵素によって処理されたＤＮＡ断片を基本プラスミドベクターｐＥＴ−２３ａ（＋）の同制限酵素サイトに置換挿入することにより野生型ＰｈａＣｌＰｓを有するｐＥＴｐｈａＣｌＰｓを得た。
ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲに際しては表１の組成となるように反応溶液を調製した。
次いで、ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲによって得られた増幅ＤＮＡ断片を精製単離した後にＸｂａＩとＢａｍＨＩによって処理した。次いで、制限酵素によって処理されたＤＮＡ断片を用いてモノマー供給系遺伝子発現プラスミドｐＧＥＭ″ＡＢＲｅのＸｂａＩとＢｇＩＩＩ制限酵素サイトの間に置換挿入することにより変異型ＰｈａＣｌＰｓの分子集団（変異クローンのプール）を得た。得られたプラスミドベクターをｐＧＥＭ″ＣｌＰｓＡＢＲｅとした（図５参照）。
なお、ｐＧＥＭ″ＡＢＲｅは、基本ベクターｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のマルチクローニングサイトに、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のｐｈｂオペロンのプロモーター、β−ケトチオラーゼ遺伝子（ｐｈｂＡＲｅ）、アセトアセチルＣｏＡリダクターゼ遺伝子（ｐｈｂＢＲｅ）及びｐｈｂオペロンのターミネーターをこの順で挿入したものである。これらｐｈｂオペロンのプロモーター、β−ケトチオラーゼ遺伝子（ｐｈｂＡＲｅ）、アセトアセチルＣｏＡリダクターゼ遺伝子（ｐｈｂＢＲｅ）及びｐｈｂオペロンのターミネーターは、Ｍａｔｓｕｓａｋｉ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０，６４５９−６４６７（１９９８）に記載されているプラスミドベクターｐＧＥＭ’−ｐｈｂＣＡＢＲｅを制限酵素処理することにより得た。
得られたプラスミドベクターｐＧＥＭ″ＣｌＰｓＡＢＲｅは、変異型ＰｈａＣｌＰｓの分子集団であり、ＰｈａＣｌＰｓ全領域にランダムに突然変異が導入された様々なＰｈａＣｌＰｓが含まれている。次に、ｐＧＥＭ″ＣｌＰｓＡＢＲｅを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株のコンピテント細胞に形質転換した。形質転換処理細胞を、ポリ３−ヒドロキシブタン酸を特異的に染色することができるＮｉｌｅ Ｒｅｄ、グルコース及びアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地（０．５μｇ／ｍｌ Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ、２％グルコース、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）上で植え、３７℃で１４時間培養することによって形質転換細胞を選別するとともに、ピンク色の度合いによって、各形質転換細胞におけるポリ３−ヒドロキシブタン酸の生産蓄積量を見積もった。
その結果、ＬＢ寒天培地上に形成された１３３６７１個のクローンのうち１２１個のクローンが淡いピンク色を呈した。これら１２１個のクローンにおけるＰＨＢ含有量についてＨＰＬＣを用いて分析した。なお、ＨＰＬＣによる分析は、濃硫酸処理を行うことによって細胞内ＰＨＢをクロトン酸に変化させた後に行った。
詳細には、菌体を３０℃で９６時間培養した後、１．５ｍｌマイクローチューブにて集菌し、凍結させた後に凍結乾燥を行った。乾燥菌体重量を測定した後、濃硫酸による菌体内ＰＨＢのクロトン酸変換を行った。クロトン酸変換は、マイクロチューブ中の乾燥菌体に対し１ｍｌの濃硫酸を加え、１２０℃、４０分間加熱した後、氷中で急冷した。なお、この操作により菌体内のＰＨＢは、高温下濃硫酸によって脱水反応がおこり、クロトン酸に変換される。
次に、冷却したサンプルを、４倍量の０．０１４Ｎ硫酸溶液にて希釈し、さらに冷却した後ＨＰＬＣサンプルとした。サンプルは、親水性ＰＶＤＦ膜、孔径０．４５μｍのフィルターでろ過した後、１０μｌをＨＰＬＣ装置へ注入した。ＨＰＬＣ装置は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０Ａｖｐシステムを用いた。カラムは、架橋度８％スチレンジビニルベンゼンコポリマー系陽イオン交換樹脂カラムであるＢｉｏ−ｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ（３００ｘ７．８ｍｍ）を用いた。また、ガードカラムとしてＢｉｏ−ｒａｄ Ｃａｔｉｏｎ−Ｈ Ｒｅｆｉｌｌ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（３０ｘ４．６ｍｍ）を用いた。移動層は、０．０１４Ｎ硫酸溶液を用い、流速は０．７ｍｌ／ｍｉｎで測定を行った。カラム温度は６０℃に設定し、脱水反応により生成したクロトン酸のカルボニル基に由来する２１０ｎｍの吸収を分光学的に検出した。クロトン酸の保持時間は、２０．４分であった。ＰＨＢ蓄積率は、クロトン酸量と面積の関係式（検量線）を基にして算出した
１２１個のクローンについてＨＰＬＣ装置を用いてＰＨＢ蓄積量を測定した結果、１８個のクローンが野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株より高いＰＨＢ蓄積量を示した。なお、野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株は、野生型のＰｈａＣｌＰｓを用いた以外は上述した方法と同様にして作製した。１８個全ての変異体の塩基配列を決定したところ、その内訳は以下の通りだった。単独変異：７個、二重変異：９個、三重変異：２個であった。なお、塩基配列決定は、ＢｉｇＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、Ｐｒｉｓｍ３１０ ＤＮＡシーケンサー又はＰｒｉｓｍ３７７ ＤＮＡシーケンサーを用いたジデオキシ連鎖ターミネーション法で行った。塩基配列決定により得られた塩基配列情報は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣソフトウェア（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）又はＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｉｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎからの提供）を用いて解析した。この中で、有意にＰＨＢ含量が増大したアミノ酸置換体において後述のように部位指定飽和変異（Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を実施することにした。
野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株より高いＰＨＢ蓄積量を示した１８個のクローンと野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株とにおけるＰＨＢ蓄積量測定結果を図６に示した。図６は、縦軸をＰＨＢ蓄積量とし横軸をクローン名とする。
また、これら１８個のクローンからｐＧＥＭ″ＣｌＰｓＡＢＲｅを抽出し、ＰｈａＣｌＰｓの塩基配列を決定して変異箇所を同定した。また、同定した変異箇所に基づいて、ＰｈａＣｌＰｓにおけるアミノ酸変異を解析した。図６に示した各クローンにおけるＰＨＢ蓄積量とアミノ酸変異との関係を表２に示す。
実施例２では、図６及び表２に示した結果から、ＰＨＢ蓄積量の向上に起因すると考えられるアミノ酸変異を検討した。先ず、野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株より高いＰＨＢ蓄積量を示した１８個のクローンにおいて、図６及び表２に示した結果から３２５番目のセリン及び４８１番目のグルタミンにおけるアミノ酸置換がＰＨＢ蓄積量の向上に影響を与えていると考えられた。
そこで、有意にＰＨＢ含量が増大する変異をもたらす３２５番目及び４８１番目での部位指定飽和変異を試みた。先ず、３２５番目のセリンをセリン以外の他のアミノ酸に置換し、その置換がＰＨＢ蓄積量に与える影響を検討した。具体的には、先ず、３２５番目のセリンをコードするコドンを、セリン以外の他のアミノ酸をコードするコドンに変異させるべく変異導入用プライマーを設計した。次に、変異導入用プライマーを用いた部位特異的突然変異導入法により、３２５番目のセリンを所定のアミノ酸に置換したＰｈａＣｌＰｓを作製した。すなわち、３２５番目のアミノ酸がセリン以外の１９種類のアミノ酸のうちいずれかに置換さたポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素をコードする１９種類のＰｈａＣｌＰｓを作製した。なお、これら１９種類のＰｈａＣｌＰｓは、上述したｐＧＥＭ″ＡＢＲｅに挿入されている。
次に、得られた１９種類のＰｈａＣｌＰｓを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株のコンピテント細胞に形質転換した。形質転換処理細胞を用いて、実施例１と同様にしてＰＨＢ蓄積量を測定した。１９種類のＰｈａＣｌＰｓ発現株と野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株とにおけるＰＨＢ蓄積量測定結果を図７に示した。図７は、縦軸をＰＨＢ蓄積量とし横軸を変異の種類とする。図７に示した各変異におけるＰＨＢ蓄積量とアミノ酸変異との関係を表３に示す。
次に、４８１番目のグルタミンをグルタミン以外の他のアミノ酸に置換し、その置換がＰＨＢ蓄積量に与える影響を、上述した３２５番目のセリンをセリン以外の他のアミノ酸に置換した際の手法に準じて検討した。４８１番目のグルタミンをグルタミン以外の他のアミノ酸に置換した１９種類のＰｈａＣｌＰｓ発現株と野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株とにおけるＰＨＢ蓄積量測定結果を図８に示した。図８は、縦軸をＰＨＢ蓄積量とし横軸を変異の種類とする。図８に示した各変異におけるＰＨＢ蓄積量とアミノ酸変異との関係を表４に示す。
このことから、これらポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素によれば、野生型のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素とは異なる組成比のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を取得することができる。特に、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素によれば、野生型のポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成酵素から取得されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）と比較すると、３ＨＢ成分の組成比が高いＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を取得することができる。
また、図７及び８並びに表３及び４に示した結果においてより高いＰＨＢ蓄積量を示したクローンに含まれるポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素によれば、３ＨＢ成分の組成比がより高いＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を取得することができる。さらに、この結果から、これら３ＨＢ基質に対して高い基質特異性を示すようになった変異の位置の探索・特定には、今回採用した進化工学的手法は非常にパワフルに機能することが示された。
次に、基質特異性の変換に強く関与し、ＰＨＡ含量を底上げする優良変異が特定された段階で、次世代の進化を試みた。すなわち、３２５番目（Ｓ３２５ＴとＳ３２５Ｃの２種）と４８１番目（Ｑ４８１Ｋ、Ｑ４８１Ｒ、Ｑ４８１Ｍの３種）で得られた優良変異の組み合わせ（計６種の二重変異体）を遺伝子工学的に作製した。また、実施例１の結果より、ＰＨＢ蓄積量を向上させると考えられる１３０番目の置換、４７７番目の置換、３２５番目の置換及び４８１番目の置換をそれぞれ単独で有するＰｈａＣｌＰｓ発現株と、これらの変異を組み合わせて有する（二重変異、三重変異及び四重変異）ＰｈａＣｌＰｓ発現株と野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株とにおけるＰＨＢ蓄積量測定結果を表５及び６に示す。また、表５に示した結果の中から、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ３２５Ｃ、Ｑ４８１Ｋ、Ｑ４８１Ｒ及びＱ４８１Ｍを単独で有するＰｈａＣｌＰｓ発現株及び組み合わせて有するＰｈａＣｌＰｓ発現株について図９に示す。図９は、縦軸をＰＨＢ蓄積量とし横軸を変異の種類とする。
基質特異性の決定に関与するアミノ酸残基の位置がこのマッピングによって、特定できたと推定される。このように本手法により、今後、他の基質特異性に関与する残基の位置が特定されていくことにより、それらの位置におけるアミノ酸置換体の組み合わせにより様々な優良変異酵素が創生できる可能性を示した。
〔実施例３〕
実施例３では、実施例１で得られた１８個のクローンのなかでクローン名ｅｐ（１−１）、ｅｐ（１−８）、ｅｐ（１−１６）、ｅｐ（４−２）、ｅｐ（１０−３）、ｅｐ（１０−４）及びｅｐ（１０−５）について、それぞれに含まれる変異型ＰｈａＣｌＰｓで大腸菌ＬＳ５２１８を形質転換し、形質転換された大腸菌ＬＳ５２１８におけるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）コポリマー蓄積量及びＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を構成するモノマーの組成について検討した。なお、大腸菌ＬＳ５２１８は、ドデカン酸からＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）コポリマーを合成することができる。大腸菌ＬＳ５２１８は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒから入手した（寄託番号ＣＧＳＣ ６９６６）。
先ず、実施例１で得られたｅｐ（１−１）、ｅｐ（１−８）、ｅｐ（１−１６）、ｅｐ（４−２）、ｅｐ（１０−３）、ｅｐ（１０−４）及びｅｐ（１０−５）それぞれについて、Ｍｉｌｌｅｒらの方法により変異型ＰｈａＣｌＰｓを含むプラスミドベクターｐＧＥＭ″ＣｌＰｓＡＢＲｅを精製した。
次に、精製したプラスミドベクターを制限酵素ＸｂａＩとＰｓｔＩで処理し変異型ＰｈａＣｌＰｓを含むＤＮＡ断片を精製した。次いで、精製したＤＮＡ断片を用いてモノマー供給系遺伝子発現プラスミドｐＧＥＭ″ＡＢＲｅＪＡｃのＸｂａＩとＰｓｔＩ制限酵素サイトの間に置換挿入することによりＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）コポリマー合成用プラスミドベクターを得た。得られたプラスミドベクターをｐＧＥＭ″ＣｌＰｓＡＢＲｅＪＡｃとした（図１０参照）。
なお、ｐＧＥＭ″ＡＢＲｅＪＡｃは、実施例１で用いたｐＧＥＭ″ＡＢＲｅのｐｈｂＢＲｅの下流にＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来の（Ｒ）−特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪＡｃ）を挿入したものである。（Ｒ）−特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪＡｃ）は、Ｆｕｋｕｉ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０，６６７（１９９８）に記載されているプラスミドベクターｐＥＴＮＢ３を制限酵素処理することにより得た。
次に、精製したプラスミドベクターｐＧＥＭ″ＣｌＰｓＡＢＲｅＪＡｃを用いて大腸菌ＬＳ５２１８を形質転換した。形質転換された大腸菌ＬＳ５２１８は、０．５％のドデカン酸及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭ９培地において７２時間３７℃で培養した。当該Ｍ９培地の組成を表７に示した。
また、ｅｐ（１−８）、ｅｐ（１−１６）、ｅｐ（４−２）及びｅｐ（１０−５）においては、３ＨＢモノマー（Ｃ４）の分率がそれぞれ３０％、３９％、４０％及び５５％となっており、野生型と比較して３ＨＢの分率が高いコポリマーを生産していることが判った。
〔実施例４〕
実施例４では、１３０番目の置換、４７７番目の置換、３２５番目の置換及び４８１番目の置換をそれぞれ単独で有するＰｈａＣｌＰｓ発現株と、これらの変異を組み合わせて有する（二重変異、三重変異及び四重変異）ＰｈａＣｌＰｓ発現株における、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）コポリマー含有量と、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を構成する３ＨＡモノマーの分率を検討した。
本例では、実施例３で使用したプラスミドベクターｐＧＥＭ″ＣｌＰｓＡＢＲ ｅＪＡｃにおけるＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来の（Ｒ）−特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪＡｃ）を、Ｐｓｅｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の（Ｒ）−特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪ４Ｐａ）に置換してなるプラスミドベクターｐＧＥＭ″ＣｌＡＢＪ４を使用した（図１３）。なお、Ｐｓｅｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の（Ｒ）−特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪ４Ｐａ）は、Ｔｓｕｇｅ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｉｃｒｏｍｏｌ．３１．１９５（２００３）に記載されているプラスミドベクターｐＵＣＪ４を制限酵素処理することによって得ることができる。
次に、プラスミドベクターｐＧＥＭ″ＣｌＡＢＪ４で大腸菌ＬＳ５２１８を形質転換した。その後、形質転換された大腸菌ＬＳ５２１８を、０．３％のドデカン酸及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭ９培地で、実施例３と同様にして培養した。培養後、細胞内のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）コポリマー含有量と、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を構成する３ＨＡモノマーの分率を、実施例３と同様にして測定した。結果を表９及び表１０に示す。
一方、二重変異、三重変異及び四重変異ＰｈａＣｌＰｓ発現株に関する結果からは、複数の変異を組み合わせることによって、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）蓄積量を増加させられるとともに、様々な３ＨＡモノマー分率のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を合成できることが判る。特に、Ｓ４７７Ｒを含む三重変異及び四重変異を有するＰｈａＣｌＰｓ発現株では、野生株と比較して、３ＨＢ分率及び３ＨＨｘ分率の高いＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を合成できる傾向にあることが判る。
本実施例により、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を合成するに際して、配列番号１における１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも１のアミノ酸を置換することで、実用に即した物性を示すＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＡ）を合成できることが実証された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
以上、詳細に説明したように、本発明に係るポリ３−ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素によれば、野生型酵素が製造する生分解性ポリエステルとは異なる組成比を有し、異なる物性を示す生分解性ポリエステルを製造できる。
配列表フリーテキスト
配列番号２及び３は合成ＤＮＡである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸の生合成スキームを示した図である。
図２は、細菌におけるアセチル−ＣｏＡ二量化系からのポリエステル生産とそれにかかわる酵素を示した図である。
図３は、細菌における脂肪酸代謝系からのポリエステル生産とそれにかかわる酵素を示した図である。
図４は、プラスミドベクターｐＥＴｐｈａＣｌＰｓの概略構成図である。
図５は、プラスミドベクターをｐＧＥＭ″ＣｌＰｓＡＢＲｅの概略構成図である。
図６は、野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株より高いＰＨＢ蓄積量を示した１８個のクローンと野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株とにおけるＰＨＢ蓄積量測定結果を示す特性図である。
図７は、３２５番目のアミノ酸を変異させたＰｈａＣｌＰｓ発現株と野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株とにおけるＰＨＢ蓄積量測定結果を示す特性図である。
図８は、４８１番目のアミノ酸を変異させたＰｈａＣｌＰｓ発現株と野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株とにおけるＰＨＢ蓄積量測定結果を示す特性図である。
図９は、３２５番目及び４８１番目のアミノ酸を変異させたＰｈａＣｌＰｓ発現株と野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株とにおけるＰＨＢ蓄積量測定結果を示す特性図である。
図１０は、プラスミドベクターｐＧＥＭ″ＣｌＰｓＡＢＲｅＪＡｃの概略構成図である。
図１１は、変異型ＰｈａＣｌＰｓ発現株と野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株とにおけるＰＨＡ蓄積量測定結果を示す特性図である。
図１２は、変異型ＰｈａＣｌＰｓ発現株と野生型ＰｈａＣｌＰｓ発現株とにおけるモノマー分率を示す特性図である。
図１３は、プラスミドベクターｐＧＥＭ″ＣｌＡＢＪ４の概略構成図である。
Claims (2)
- 以下の(a)又は(b)のアミノ酸配列からなるポリ3-ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素。
（a）配列番号１のアミノ酸配列の130番目のグルタミン酸をアスパラギン酸とする置換、325番目のセリンをシステイン又はスレオニンとする置換、477番目のセリンをアルギニンとする置換及び481番目のグルタミンをリジン、アルギニン又はメチオニンとする置換からなる群のうち少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列
（b）上記(a)のアミノ酸配列において、130番目、325番目、477番目及び481番目のアミノ酸を除く、１又は２のアミノ酸を欠失、置換、及び/又は付加したアミノ酸配列であって、生分解性ポリエステル酸生合成活性を示すアミノ酸配列 - 請求項１に記載された生分解性ポリエステル酸生合成変異酵素をコードするポリ3-ヒドロキシアルカン酸生合成変異酵素遺伝子。
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