JP2010510775A - シュードモナス・スピーシーズ6−19由来のpha合成酵素変異体及びそれを用いたラクテート重合体または共重合体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
化学合成により、ラクテートを用いてPLAを合成する場合、PLA重合体(homopolymer)は容易に収得することができる。しかし、様々なモノマー単位(unit)を有するPLA共重合体の合成は難しく、商業的に効用性が非常に劣るという短所がある。
一方、ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)は過度の炭素源が存在しながら、リン、窒素、マグネシウム、酸素などの他の栄養分が不足する時、微生物がエネルギーや炭素源貯蔵化合物としてその内部に蓄積するポリエステルである。PHAは、既存の石油に由来した合成高分子に似た物性を有しながら、完全な生分解性を示すため、既存の合成プラスチックに代わる物質として認識されている。
微生物でPHAを生産するためには、微生物の代謝産物をPHA単量体に転換する酵素と、PHA単量体を利用してPHA重合体を合成するPHA合成酵素が必須的である。微生物を利用してPLA及びラクテート共重合体を合成する時も、同様のシステムが必要とされるので、元来のPHA合成酵素の基質であるヒドロキシアシル−CoAを提供しうる酵素以外に、さらにラクチル−CoAを提供しうる酵素が必要とされる。
本発明の別の目的は、上記ラクチル−CoAを基質として利用できるPHA合成酵素及びプロピオニル−CoAトランスフェラーゼの遺伝子を含有する植物または細胞を利用して、PLA及びラクテート共重合体を製造する方法を提供することにある。
a)S325T及びQ481M;
b)E130D及びQ481K;
c)S325T及びQ481K;
d)E130D及びQ481M;
e)E130D及びQ481R;
f)E130D、S325T及びQ481M;
g)E130D、S325T及びQ481K;
h)E130D、S477R及びQ481K;
i)E130D、S477R及びQ481M;
j)E130D、S477R及びQ481R;
k)E130D、S477H及びQ481K;
l)E130D、S477H及びQ481M;
m)E130D、S477H及びQ481R;
n)E130D、S477F及びQ481K;
o)E130D、S477F及びQ481M;
p)E130D、S477F及びQ481R;
q)E130D、S477Y及びQ481K;
r)E130D、S477Y及びQ481M;
s)E130D、S477Y及びQ481R;
t)E130D、S325T、S477R及びQ481M;
u)E130D、S325T、S477R及びQ481K;
v)E130D、S325T、S477F及びQ481M;
w)E130D、S325T、S477G及びQ481M;又は
x)E130D、S325T、S477F及びQ481K
を有するアミノ酸配列を有することを特徴とするラクチル−CoAを基質として利用して、ラクテート重合体またはラクテート共重合体を合成しうるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体を提供する。
さらに、本発明は、上記遺伝子を含有するラクテート重合体または共重合体合成用組換えベクターを提供する。
より好ましくは、本発明は、上記組換えベクターがプロピオニル−CoAトランスフェラーゼ遺伝子(pct)をさらに含有することを特徴とする組換えベクターを提供する。
さらに、本発明は、プロピオニル−CoAトランスフェラーゼ遺伝子を有しない細胞または植物を上記組換えベクターで形質転換して得られることを特徴とする細胞または植物を提供する。
さらにまた、本発明は、上記細胞または植物を培養または栽培することを特徴とするラクテート重合体または共重合体の製造方法を提供する。
より好ましくは、本発明は、上記培養または栽培が、3−ヒドロキシブチレート(3−HB)を含有する環境で遂行され、製造された共重合体が3−ヒドロキシブチレート単量体単位及びラクテート単量体単位を含む共重合体であることを特徴とする製造方法を提供する。
本発明において、上記ヒドロキシアルカノエートは、3−ヒドロキシブチレート、3−ヒドロキシ吉草酸、4−ヒドロキシブチレート、炭素数が6〜14の中鎖長の(D)−3−ヒドロキシカルボン酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、3−ヒドロキシヘキサン酸、3−ヒドロキシヘプタン酸、3−ヒドロキシオクタン酸、3−ヒドロキシノナン酸、3−ヒドロキシデカン酸、3−ヒドロキシウンデカン酸、3−ヒドロキシドデカン酸、3−ヒドロキシテトラデカン酸、3−ヒドロキシヘキサデカン酸、4−ヒドロキシ吉草酸、4−ヒドロキシヘキサン酸、4−ヒドロキシヘプタン酸、4−ヒドロキシオクタン酸、4−ヒドロキシデカン酸、5−ヒドロキシ吉草酸、5−ヒドロキシヘキサン酸、6−ヒドロキシドデカン酸、3−ヒドロキシ−4−ペンテン酸、3−ヒドロキシ−4−trans−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−4−cis−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−5−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−6−trans−オクテン酸、3−ヒドロキシ−6−cis−オクテン酸、3−ヒドロキシ−7−オクテン酸、3−ヒドロキシ−8−ノネン酸、3−ヒドロキシ−9−デセン酸、3−ヒドロキシ−5−cis−ドデセン酸、3−ヒドロキシ−6−cis−ドデセン酸、3−ヒドロキシ−5−cis−テトラデセン酸、3−ヒドロキシ−7−cis−テトラデセン酸、3−ヒドロキシ−5,8−cis−cis−テトラデセン酸、3−ヒドロキシ−4−メチル吉草酸、3−ヒドロキシ−4−メチルヘキサン酸、3−ヒドロキシ−5−メチルヘキサン酸、3−ヒドロキシ−6−メチルヘプタン酸、3−ヒドロキシ−4−メチルオクタン酸、3−ヒドロキシ−5−メチルオクタン酸、3−ヒドロキシ−6−メチルオクタン酸、3−ヒドロキシ−7−メチルオクタン酸、3−ヒドロキシ−6−メチルノナン酸、3−ヒドロキシ−7−メチルノナン酸、3−ヒドロキシ−8−メチルノナン酸、3−ヒドロキシ−7−メチルデカン酸、3−ヒドロキシ−9−メチルデカン酸、3−ヒドロキシ−7−メチル−6−オクテン酸、リンゴ酸、3−ヒドロキシコハク酸−メチルエステル、3−ヒドロキシアジピン酸−メチルエステル、3−ヒドロキシスベリン酸−メチルエステル、3−ヒドロキシアゼライン酸−メチルエステル、3−ヒドロキシセバシン酸−メチルエステル、3−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル、3−ヒドロキシセバシン酸−エチルエステル、3−ヒドロキシピメリン酸−プロピルエステル、3−ヒドロキシセバシン酸−ベンジルエステル、3−ヒドロキシ−8−アセトキシオクタン酸、3−ヒドロキシ−9−アセトキシノナン酸、フェノキシ−3−ヒドロキシブチレート、フェノキシ−3−ヒドロキシ吉草酸、フェノキシ−3−ヒドロキシヘプタン酸、フェノキシ−3−ヒドロキシオクタン酸、para−シアノフェノキシ−3−ヒドロキシブチレート、para−シアノフェノキシ−3−ヒドロキシ吉草酸、para−シアノフェノキシ−3−ヒドロキシヘキサン酸、para−ニトロフェノキシ−3−ヒドロキシヘキサン酸、3−ヒドロキシ−5−フェニル吉草酸、3−ヒドロキシ−5−シクロヘキシルブチレート、3,12−ジヒドロキシドデカン酸、3,8−ジヒドロキシ−5−cis−テトラデセン酸、3−ヒドロキシ−4,5−エポキシデカン酸、3−ヒドロキシ−6,7−エポキシドデカン酸、3−ヒドロキシ−8,9−エポキシ−5,6−cis−テトラデカン酸、7−シアノ−3−ヒドロキシヘプタン酸、9−シアノ−3−ヒドロキシノナン酸、3−ヒドロキシ−7−フルオロヘプタン酸、3−ヒドロキシ−9−フルオロノナン酸、3−ヒドロキシ−6−クロロヘキサン酸、3−ヒドロキシ−8−クロロオクタン酸、3−ヒドロキシ−6−ブロモヘキサン酸、3−ヒドロキシ−8−ブロモオクタン酸、3−ヒドロキシ−11−ブロモウンデカン酸、3−ヒドロキシ−2−ブテン酸、6−ヒドロキシ−3−ドデセン酸、3−ヒドロキシ−2−メチルブチレート、3−ヒドロキシ−2−メチル吉草酸及び3−ヒドロキシ−2,6−ジメチル−5−ヘプテン酸からなる群から選択された一つ以上である。
また、原核細胞の形質転換はSambrook et al., supraの1.82セクションに記載されたカルシウムクロリド方法を用いて容易に達成できる。また、選択的にエレクトロポレーション法(Neumann et al., EMBO J., 1: 841(1982))もこのような細胞を形質転換するのに用いることができる。
本発明で、“外植片(explant)”とは、植物体から切断した組織の切片を意味するもので、子葉(cotyledon)または胚軸(hypocotyl)を含む。本発明の方法に使われる植物の外植片には、子葉または胚軸を使用することができ、植物の種子を消毒して洗浄した後、MS培地で発芽させて得た子葉を使用することがさらに好ましい。
本発明で利用可能な形質感染対象植物としてはタバコ、トマト、唐辛子、豆、稲、トウモロコシなどが挙げられるが、これに制限されるものではない。また、形質転換に使われる植物が有性繁殖植物であっても、組織培養などにより無性的に繰返生殖させることができることは当業者にとって自明である。
特に、以下実施例では、PHA合成酵素変異体を用いてラクテート共重合体を合成するのに、3−ヒドロキシブチレート(3−HB)を添加し、ポリ(3−ヒドロキシブチレート−co−ラクテート)(P(3HB−co−LA))を合成することだけが記載されているが、3−HB以外のヒドロキシアルカノエートを添加し、上記ヒドロキシアルカノエートとラクテートの共重合体を製造することができることは当業者にとって自明なことである。
本発明に使われたシュードモナス属(KCTC 11027BP)由来PHA合成酵素(phaC1Ps6−19)遺伝子を分離するために、Pseudomonas sp.6−19の全体DNAを抽出し、phaC1Ps6−19遺伝子配列(Ae-jin Song, Master's Thesis, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST, 2004)に基づいた配列番号1及び2の塩基配列を有するプライマーを作製し、PCRを遂行してphaC1Ps6−19遺伝子を得た。
配列番号1:5- GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG -3
配列番号2:5- CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC -3
PCR反応物をアガロースゲル電気泳動してphaC1Ps6−19遺伝子に該当する1.7kbpサイズの遺伝子断片を確認した。phaC1Ps6−19合成酵素の発現のために単量体供給酵素と合成酵素が共に発現されるオペロン形態の恒常的発現システムを導入した(図1)。
pSYL105ベクター(Lee et al., Biotech. Bioeng., 1994, 44:1337-1347)からラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutrophus)H16由来のPHB生産オペロンが含有されたDNA切片をBamHI/EcoRIで切断し、pBluescript II(Stratagene社製)のBamHI/EcoRI認識部位に挿入することによって、pReCAB組換えベクターを製造した。
pReCABベクターはPHA合成酵素(phaCRE)と単量体供給酵素(phaARE及びphaBRE)がPHBオペロンプロモーターにより恒常的に発現され、大腸菌でもよく作動すると知られている(Lee et al., Biotech. Bioeng., 1994, 44:1337-1347)。pReCABベクターをBstBI/SbfIで切断し、R.eutrophus H16 PHA合成酵素(phaCRE)を除去した後、上記で得たphaC1Ps6−19遺伝子をBstBI/SbfI認識部位に挿入することによってpPs619C1−ReAB組換えベクターを製造した(図1)。
配列番号3:5- atg ccc gga gcc ggt tcg aa - 3
配列番号4:5- CGT TAC TCT TGT TAC TCA TGA TTT GAT TGT CTC TC - 3
配列番号5:5- GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG - 3
配列番号6:5- CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC - 3
配列番号7:5- GTA CGT GCA CGA ACG GTG ACG CTT GCA TGA GTG - 3
配列番号8:5- aac ggg agg gaa cct gca gg - 3
上記作製したpPs619C1−ReAB組換えベクターのphaC1Ps6−19遺伝子塩基配列はシークエンスによって確認し、その結果を配列番号9に示した。これによりコードされるアミノ酸配列を配列番号10に示した。
上記遺伝子塩基配列の類似性を分析した結果、Pseudomonas sp.strain 61−3(Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180:6459, 1998)由来phaC1と塩基配列で84.3%の相同性を有し、アミノ酸配列相同性は88.9%と上記2合成酵素が非常に類似した酵素であることを確認した。これらの結果から、本発明で得たphaC1Ps6−19合成酵素はType II PHA合成酵素であることを確認した。
上記phaC1Ps6−19合成酵素がPHBを合成するか否かを確認するために、pPs619C1−ReAB組換えベクターをE.coli XL1−Blue(Stratagene社製)に形質転換させ、これをPHB検出培地(LB agar、グルコース20g/L、ナイルレッド0.5μg/mL)で生育させた結果、PHB生成は観察されなかった。
多様な種類のPHA合成酵素の中で、Type II PHA合成酵素は比較的炭素数の長い基質を重合させるMCL−PHA(medium-chain-length PHA)合成酵素として知られている。このMCL合成酵素はラクテート重合体生産に非常に有用となることが期待されている。本発明で獲得したphaC1Ps6−19合成酵素と非常に相同性の高いPseudomonas sp.61−3由来phaC1合成酵素は、Type II合成酵素であるが、比較的広い範囲の基質特異性を有することが報告(Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180:6459, 1998)されており、SCL−PHA(short-chain-length PHA)生産に適した突然変異体に関する研究結果が報告(Takase et al., Biomacromolecules, 5:480, 2004)されれている。これらの結果に基づいて、本発明ではSCL活性に影響を及ぼすアミノ酸位置3個所を配列アライメント解析を通して探し出し、配列番号11〜配列番号14のプライマーを用いたSDM方法を利用して、下記表1のようなphaC1Ps6-19合成酵素変異体を作った。
配列番号12:5- GGT GGT ATC AAG CAC GGT CAC CAG CAA GGT CAG- 3
配列番号13:5- CGA GCA GCG GGC ATA TC A TGA GCA TCC TGA ACC CGC- 3
配列番号14:5- GCG GGT TCA GGA TGC TCA TGA TAT GCC CGC TGC TCG- 3
配列番号15:5- atc aac ctc atg acc gat gcg atg gcg ccg acc- 3
配列番号16:5- ggt cgg cgc cat cgc atc ggt cat gag gtt gat- 3
本実施例では、PLA及びラクテート共重合体合成時に必要な単量体であるラクチル−CoAを提供するために、クロストリジウム・プロピオニカム(Clostridium propionicum)由来のプロピオニル−CoAトランスフェラーゼ(CP−PCT)を使用した。図3のようにPHA合成酵素とCP−PCTが共に発現されるオペロン形態の恒常的発現システムを構築した。CP−PCTの場合、微生物に毒性を示すものと知られているが、一般的に組換えタンパク質発現に広く使われるtacプロモーターやT7プロモーターを使用したIPTGによる発現誘導システムでは誘導剤添加直後に組換え微生物が全て死滅する。このために弱く発現されるが、微生物増殖によって持続的に発現される恒常的発現システムを使用することが適していると判断した。cp−pctはクロストリジウム・プロピオニカムの染色体DNAを配列番号17及び配列番号18のプライマーを利用してPCRして得られた断片を使用した。この時、元来野生型CP−PCTに存在するNdeI siteをクローニングの容易性のためにSDM方法を利用して除去した(図4)。
配列番号17:5-ggaattcATGAGAAAGGTTCCCATTATTACCGCAGATGA
配列番号18:5-gc tctaga tta gga ctt cat ttc ctt cag acc cat taa gcc ttc tg
また、SbfI/NdeI認識部位を添加するために、配列番号19と配列番号20の塩基配列を有するプライマーを利用してオーバーラップPCRを遂行した。
配列番号19:5-agg cct gca ggc gga taa caa ttt cac aca gg- 3
配列番号20:5-gcc cat atg tct aga tta gga ctt cat ttc c- 3
上記作製されたpPs619C1300−CPPCT組換えベクターを利用して様々な条件でフラスコ培養を遂行し、PLA及びラクテート共重合体の生産を試みた。その結果を表2に示した。
pPs619C1300−CPPCTベクターで形質転換された組換え大腸菌を20g/Lのグルコース、100mg/Lのアンピシリンなどが含まれた3mLのLB培地で37℃、撹拌速度200rpmで12時間培養した。この培養液を同一培地100mLに接種し、同一条件で6時間培養した。これを流加培養の種培養液(seed culture)として使用した。流加培養のための開始培地としてMR培地を使用した。MR培地2.4Lが含有された発酵槽に100mLの種培養液を接種して流加培養を解した。培養液の温度は37℃であり、pHは14%アンモニア水溶液を用いて6.8〜6.9になるように調節し、溶存酸素は空気供給及び撹拌速度調節を介して飽和空気の20%以上を維持した。この時、空気供給速度は1vvmであった。初期開始培地に含有されたグルコースが枯渇した時、グルコース20gと3−ヒドロキシブチレート(3HB)5gを供給し、同時に撹拌速度を200rpmに、そして空気供給速度を0.1vvmにそれぞれ低減させ、培養条件を好気条件から嫌気条件に転換した。培養期間の間、グルコースは5回供給した。この中の第1回目と第3回目の供給時には、5gの3HBを共に供給した。培養終了後、遠心分離により細胞を回収し、凍結乾燥した。
合成された重合体の分離精製のために、ソックスレー抽出器でクロロホルムを利用して凍結乾燥細胞から重合体を抽出した。クロロホルムに溶けている重合体抽出液から回転蒸発器を利用して、クロロホルムをほとんど除去し、そこにメタノールを添加して重合体を沈澱させた。沈澱された重合体をフィルタろ過を用いてろ過した後、真空乾燥器で12時間乾燥し、最終回収した。
分析結果、大腸菌内に合成されたP(3HB−co−LA)の含量は、乾燥細胞重量に対して約10%、共重合体の中のPLA含量は88mol%であった。
本実施例を通して最終回収された重合体のガスクロマトグラフィー分析を遂行した結果、回収された重合体はP(3HB−co−LA)共重合体であることを再確認しており、重合体の中のPLA含量また88mol%であることを再確認した。
実施例4と同様にして、pPs619C1300−CPPCTベクターで形質転換された組換え大腸菌の種培養を実施し、MR培地2.4Lが含有された発酵槽に100mLの種培養液を接種して流加培養を開始した。培養液の温度は37℃、pHは14%アンモニア水溶液を利用して6.8〜6.9になるように調節し、溶存酸素は空気供給及び撹拌速度調節を通して飽和空気の20%以上を維持した。この時、空気供給速度は1vvmであり、初期開始培地に含有されたグルコースが枯渇した時、グルコース20gを供給し、同時に撹拌速度を200rpmに、空気供給速度を0.1vvmにそれぞれ低減し、培養条件を好気条件から嫌気条件に転換させた。培養期間の間、グルコースを5回供給した。培養終了後、遠心分離により細胞を回収し、これを凍結乾燥した。重合体は実施例4と同様にして最終回収した。
さらに、遠心分離によって回収された菌体の一部を80℃の乾燥器で48時間乾燥した後、ガスクロマトグラフィー分析を遂行して細胞内合成されたPLA含量を測定した。3HV含量が重量比で12%のP(3HB−co−3HV)共重合体、メチル−4HB及びPLA単独重合体を標準物質として使用した。
分析結果、3HB及び4HBは全く検出されていなく、PLAだけが検出されたことを確認することができた。大腸菌内に合成されたPLAの含量は乾燥細胞重量に対して約10%であった。本実施例を通して最終回収された重合体のガスクロマトグラフィー分析を遂行した結果、回収された重合体はPLA含量が99.1mol%ポリラクテート重合体であった。
上記実施例2と同様にして、下記プライマーを利用して様々なPHA合成酵素変異体を作製した。作製された変異体を下記表4、5、6及び7に総合して示した。
E130D
配列番号15:5’-atc aac ctc atg acc gat gcg atg gcg ccg acc- 3’
配列番号16:5' -ggt cgg cgc cat cgc atc ggt cat gag gtt gat- 3'
S325T
配列番号11:5'-CTG ACC TTG CTG GTG ACC GTG CTT GAT ACC ACC- 3'
配列番号12:5'- GGT GGT ATC AAG CAC GGT CAC CAG CAA GGT CAG- 3'
S477R
配列番号21:5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc cgc ggg cat atc- 3'
配列番号22:5'-gat atg ccc gcg gct cga cag cac gaa ttc- 3'
S477H
配列番号23:5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc cat ggg cat atc- 3'
配列番号24:5'-gat atg ccc atg gct cga cag cac gaa ttc- 3'
S477F
配列番号25:5'- gaa ttc gtg ctg tcg agc ttt ggg cat atc- 3'
配列番号26:5'- gat atg ccc aaa gct cga cag cac gaa ttc- 3'
S477Y
配列番号27:5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc tat ggg cat atc- 3'
配列番号28:5'-gat atg ccc ata gct cga cag cac gaa ttc- 3'
S477G
配列番号29:5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc ggc ggg cat atc- 3'
配列番号30:5'-gat atg ccc gcc gct cga cag cac gaa ttc- 3'
Q481K
配列番号31:5'-ggg cat atc aaa agc atc ctg aac ccg c- 3'
配列番号32:5'-gcg ggt tca gga tgc ttt tga tat gcc c- 3'
Q481M
配列番号33:5'-ggg cat atc atg agc atc ctg aac ccg c- 3'
配列番号34:5'-gcg ggt tca gga tgc tca tga tat gcc c- 3'
Q481R
配列番号35:5'-ggg cat atc cgc agc atc ctg aac ccg c- 3'
配列番号36:5'-gcg ggt tca gga tgc tgc gga tat gcc c- 3'
上記実施例3に記載された方法と同様にして、シュードモナス・スピーシーズ6−19由来PHA合成酵素変異体とプロピオニル−CoAトランスフェラーゼの発現が可能な組換え大腸菌を作製し、これを利用して実施例4と同様にしてP(3HB−co−LA)を作製した。その結果を下記表8、9及び10に示した。
Claims (11)
- 配列番号10のアミノ酸配列で481位のアミノ酸であるグルタミンが変異されたことを特徴とするラクチル−CoAを基質として利用して、ラクテート重合体またはラクテート共重合体を合成しうるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体。
- 前記変異体は、130位のアミノ酸であるグルタミン酸、325位のアミノ酸であるセリン及び477位のアミノ酸であるセリンよりなる群から選択された一つ以上のアミノ酸が、さらに変異されたことを特徴とする請求項1に記載のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体。
- 前記変異体は配列番号10のアミノ酸配列で、
a)S325T及びQ481M;
b)E130D及びQ481K;
c)S325T及びQ481K;
d)E130D及びQ481M;
e)E130D及びQ481R;
f)E130D、S325T及びQ481M;
g)E130D、S325T及びQ481K;
h)E130D、S477R及びQ481K;
i)E130D、S477R及びQ481M;
j)E130D、S477R及びQ481R;
k)E130D、S477H及びQ481K;
l)E130D、S477H及びQ481M;
m)E130D、S477H及びQ481R;
n)E130D、S477F及びQ481K;
o)E130D、S477F及びQ481M;
p)E130D、S477F及びQ481R;
q)E130D、S477Y及びQ481K;
r)E130D、S477Y及びQ481M;
S)E130D、S477Y及びQ481R;
t)E130D、S325T、S477R及びQ481M;
u)E130D、S325T、S477R及びQ481K;
v)E130D、S325T、S477F及びQ481M;
w)E130D、S325T、S477G及びQ481M;又は
x)E130D、S325T、S477F及びQ481K;
が変異されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項2に記載のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体。 - 請求項1に記載のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体をコードする遺伝子。
- 請求項4に記載の遺伝子を含有するラクテート重合体またはラクテート共重合体合成用組換えベクター。
- 前記組換えベクターは、プロピオニル−CoAトランスフェラーゼ遺伝子(pct)をさらに含有することを特徴とする請求項5に記載の組換えベクター。
- 請求項5に記載の組換えベクターで形質転換された細胞または植物。
- プロピオニル−CoAトランスフェラーゼ遺伝子を有しない細胞または植物を請求項6に記載の組換えベクターで形質転換して得られることを特徴とする細胞または植物。
- 請求項7または8に記載の細胞または植物を培養または栽培することを特徴とするラクテート重合体またはラクテート共重合体の製造方法。
- 前記培養または栽培はヒドロキシアルカノエートを含有する環境で遂行され、共重合体はヒドロキシアルカノエート単量体単位及びラクテート単量体単位を含有することを特徴とする請求項9に記載の製造方法。
- 上記ヒドロキシアルカノエートは、3−ヒドロキシブチレート、3−ヒドロキシ吉草酸、4−ヒドロキシブチレート、炭素数が6〜14の中鎖長の(D)−3−ヒドロキシカルボン酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、3−ヒドロキシヘキサン酸、3−ヒドロキシヘプタン酸、3−ヒドロキシオクタン酸、3−ヒドロキシノナン酸、3−ヒドロキシデカン酸、3−ヒドロキシウンデカン酸、3−ヒドロキシドデカン酸、3−ヒドロキシテトラデカン酸、3−ヒドロキシヘキサデカン酸、4−ヒドロキシ吉草酸、4−ヒドロキシヘキサン酸、4−ヒドロキシヘプタン酸、4−ヒドロキシオクタン酸、4−ヒドロキシデカン酸、5−ヒドロキシ吉草酸、5−ヒドロキシヘキサン酸、6−ヒドロキシドデカン酸、3−ヒドロキシ−4−ペンテン酸、3−ヒドロキシ−4−trans−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−4−cis−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−5−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−6−trans−オクテン酸、3−ヒドロキシ−6−cis−オクテン酸、3−ヒドロキシ−7−オクテン酸、3−ヒドロキシ−8−ノネン酸、3−ヒドロキシ−9−デセン酸、3−ヒドロキシ−5−cis−ドデセン酸、3−ヒドロキシ−6−cis−ドデセン酸、3−ヒドロキシ−5−cis−テトラデセン酸、3−ヒドロキシ−7−cis−テトラデセン酸、3−ヒドロキシ−5,8−cis−cis−テトラデセン酸、3−ヒドロキシ−4−メチル吉草酸、3−ヒドロキシ−4−メチルヘキサン酸、3−ヒドロキシ−5−メチルヘキサン酸、3−ヒドロキシ−6−メチルヘプタン酸、3−ヒドロキシ−4−メチルオクタン酸、3−ヒドロキシ−5−メチルオクタン酸、3−ヒドロキシ−6−メチルオクタン酸、3−ヒドロキシ−7−メチルオクタン酸、3−ヒドロキシ−6−メチルノナン酸、3−ヒドロキシ−7−メチルノナン酸、3−ヒドロキシ−8−メチルノナン酸、3−ヒドロキシ−7−メチルデカン酸、3−ヒドロキシ−9−メチルデカン酸、3−ヒドロキシ−7−メチル−6−オクテン酸、リンゴ酸、3−ヒドロキシコハク酸−メチルエステル、3−ヒドロキシアジピン酸−メチルエステル、3−ヒドロキシスベリン酸−メチルエステル、3−ヒドロキシアゼライン酸−メチルエステル、3−ヒドロキシセバシン酸−メチルエステル、3−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル、3−ヒドロキシセバシン酸−エチルエステル、3−ヒドロキシピメリン酸−プロピルエステル、3−ヒドロキシセバシン酸−ベンジルエステル、3−ヒドロキシ−8−アセトキシオクタン酸、3−ヒドロキシ−9−アセトキシノナン酸、フェノキシ−3−ヒドロキシブチレート、フェノキシ−3−ヒドロキシ吉草酸、フェノキシ−3−ヒドロキシヘプタン酸、フェノキシ−3−ヒドロキシオクタン酸、para−シアノフェノキシ−3−ヒドロキシブチレート、para−シアノフェノキシ−3−ヒドロキシ吉草酸、para−シアノフェノキシ−3−ヒドロキシヘキサン酸、para−ニトロフェノキシ−3−ヒドロキシヘキサン酸、3−ヒドロキシ−5−フェニル吉草酸、3−ヒドロキシ−5−シクロヘキシルブチレート、3,12−ジヒドロキシドデカン酸、3,8−ジヒドロキシ−5−cis−テトラデセン酸、3−ヒドロキシ−4,5−エポキシデカン酸、3−ヒドロキシ−6,7−エポキシドデカン酸、3−ヒドロキシ−8,9−エポキシ−5,6−cis−テトラデカン酸、7−シアノ−3−ヒドロキシヘプタン酸、9−シアノ−3−ヒドロキシノナン酸、3−ヒドロキシ−7−フルオロヘプタン酸、3−ヒドロキシ−9−フルオロノナン酸、3−ヒドロキシ−6−クロロヘキサン酸、3−ヒドロキシ−8−クロロオクタン酸、3−ヒドロキシ−6−ブロモヘキサン酸、3−ヒドロキシ−8−ブロモオクタン酸、3−ヒドロキシ−11−ブロモウンデカン酸、3−ヒドロキシ−2−ブテン酸、6−ヒドロキシ−3−ドデセン酸、3−ヒドロキシ−2−メチルブチレート、3−ヒドロキシ−2−メチル吉草酸及び3−ヒドロキシ−2,6−ジメチル−5−ヘプテン酸からなる群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項10に記載の製造方法。
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