KR20120103996A - 글루코오스로부터〔락테이트?ｃｏ?글리콜레이트〕공중합체 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 〔락테이트?ｃｏ?글리콜레이트〕공중합체의 제조방법 - Google Patents

글루코오스로부터〔락테이트?ｃｏ?글리콜레이트〕공중합체 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 〔락테이트?ｃｏ?글리콜레이트〕공중합체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글루코오스로부터 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체를 생산능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것으로 더욱 자세하게는, 외부로부터의 글리콜레이트 프리커서를 공급없이도 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체를 생산하는 능력을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 글리옥실레이트의 외부 공급없이도 글리콜레이트 분획 농도가 높은 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체를 높은 농도로 제조할 수 있다.

Description

글루코오스로부터〔락테이트？ｃｏ？글리콜레이트〕공중합체 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 〔락테이트？ｃｏ？글리콜레이트〕공중합체의 제조방법{Recombinant Microorganism Having Producing Poly(lactate-co-glycolate) from Glucose and Preparing Method of Poly(lactate-co-glycolate) Using Thereof}
본 발명은 글루코오스로부터 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체를 생산하는 능력을 가지는 재조합 미생물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 외부로부터의 글리콜레이트 프리커서를 공급하지 않아도 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체를 생산하는 능력을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체의 제조방법에 관한 것이다.
락테이트-글리콜레이트 공중합체 [Poly(lactate-co-glycolate), PLGA]는 락테이트(lactate)와 글리콜레이트(glycolate)로부터 유래된 대표적인 생분해성 고분자로서 범용고분자 혹은 의료용 고분자로서의 응용성이 높은 고분자이다. 현재 PLGA는 락테이트와 글리콜레이트의 직접중합반응에 의해 제조될 수 있으나, 상기 반응을 통해서는 주로 낮은 분자량(1000-5000 달톤)의 PLGA만이 생성된다. 100,000 달톤 이상의 높은 분자량의 PLGA는 락타이드(lactide)와 글라이콜라이드(glycolide)의 링 개환축합반응을 통해 합성되어질 수 있다. 락타이드와 글라이콜라이드는 각각 락테이트와 글리콜레이트의 고리 디에스테르(cyclic diester)로서, 각각 락테이트 올리고머와 글리콜레이트 올리고머의 열분해에 의해 만들어진다. 링 개환축합반응에는 2-에틸헥사논산 주석(tin(II) 2-ethylhexanoate), 주석 알콕사이드(tin(II) alkoxide), 또는 알루미늄 이소프로폭사이드(aluminum isopropoxide) 등의 촉매의 사용이 요구되어진다. 직접중합으로 얻어진 낮은 분자량의 고분자로부터 chain coupling agent를 이용하여 보다 분자량이 높은 고분자로 중합하는 방법이 있으나 chain coupling agent를 이용하기 때문에 고분자량의 PLGA를 제조하는 방법은 유기용제(solvent)나 chain coupling agent의 첨가로 인해 공정이 복잡해지고, 또한 이들을 제거가 쉽지 않다는 단점이 있다. 현재 상용화되고 있는 고분자량의 PLGA 생산공정은 락테이트와 글리콜레이트를 각각 락타이드와 글라이콜라이드로 전환한 다음, 락타이드와 글라이콜라이드의 링 개환축합반응을 통해 PLGA를 합성하는 방법이 사용되고 있다.
한편, PHA는 과도한 탄소원이 존재하면서 인, 질소, 마그네슘, 산소 등의 다른 영양분이 부족할 때, 미생물이 에너지나 탄소원 저장물질로 그 내부에 축적하는 폴리에스터(polyester)이다. PHA는 기존의 석유로부터 유래된 합성고분자와 비슷한 물성을 가지면서 완전한 생분해성을 보이기 때문에 기존의 합성 플라스틱을 대체할 물질로 인식되고 있다.
기존에 알려진 PHA는 대표적으로 짧은 탄소수를 가진 SCL-PHA (short-chain-length PHA)와 긴 탄소수를 가진 MCL-PHA (medium-chain-length PHA)로 나눌 수 있다. PHA를 합성하는 유전자는 Ralstonia eutropha, Pseudomonas 등으로부터 클로닝되었으며 재조합 미생물을 통해 다양한 종류의 모노머로 구성된 PHA가 합성되었다 (Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 157:155, 1997; Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 167:89, 1998; Langenbach et al., FEMS Microbiol. Lett., 150:303, 1997; WO 01/55436; US 6,143,952; WO 98/54329; WO 99/61624).
글리콜릭산이 가장 단순한 하이드록시카복시산이기 때문에 Ralstonia europha의 PHA 합성효소와 기질로 베타 산화경로로부터 생성된 글리콜릴-CoA를 사용하여, 글리콜릭산을 PHA 폴리머로 삽입하고자 하는 시도가 있어 왔다.
본 발명자들은, 락테이트와 글리콜레이트를 각각 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자인 Clostridium propionicum 유래 프로피오네이트 CoA-트랜스퍼라아제(Pct) 유전자와 lactyl-CoA와 glycolyl-CoA를 기질로 사용할 수 있는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 합성효소 유전자로 형질전환된 재조합 대장균을 글루코오스와 글리콜레이트 또는 글루코오스와 글리콜레이트, 하이드록시알카노에이트가 포함된 생산배지에서 배양하는 경우, poly(lactate-co-glycolate) 공중합체 및 poly(lactate-co-glycolate-co-hydroxyalkanoate) 공중합체가 생성되는 것을 확인하였다(대한민국 특허출원 제10-2009-0030133호).
그러나, 상기 재조합 대장균을 이용하여 PLGA를 생성하는데에는 단량체의 프리커서가 되는 글루코오스와 글리콜레이트를 각각 첨가하여 주어야만 하는 단점이 있었다.
이에, 본 발명자들은 글리콜레이트를 외부에서 첨가하지 않아도 글리콜레이트 분획의 함량이 높은 PLGA를 생산할 수 있는 재조합 대장균을 개발하고자 예의 노력한 결과, Clostridium propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소와, Pseudomonas sp. 6-19의 PHA 합성효소로 형질전환된 대장균에 P. multocida 또는 대장균의 글리세레이트 디하이드로게네이즈를 발현시키고, iclR(isocitrate lyase regulator) 및 aceB(malate synthase) 유전자를 결실시키고 aceA (isocitrate lyase) 유전자를 증폭시킬 경우, 글리콜레이트를 첨가하지 않아도 글루코오스 만으로 글리콜레이트 분획의 함량이 높은 PLGA를 고농도로 생산할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 글리콜레이트의 외부 첨가 없이 고농도로 PLGA를 생산할 수 있는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 글리콜레이트의 외부 첨가 없이 고농도로 PLGA를 생산할 수 있는 재조합 미생물을 이용한 PLGA의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 및 글리세레이트 디하이드로게네이즈(EC 1.1.1.26)를 코딩하는 유전자로 형질전환된 변이체를 제공한다.
본 발명은 또한, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 및 글리세레이트 디하이드로게네이즈(EC 1.1.1.26)를 코딩하는 유전자가 삽입되고, 이소시트레이트 라이에이즈 조절인자를 코딩하는 유전자(iclR) 또는 이소시트레이트 라이에즈를 코딩하는 유전자 (aceB)가 결실되어 있는 형질전환된 변이체를 제공한다.
본 발명은 또한, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 및 글리세레이트 디하이드로게네이즈(EC 1.1.1.26)를 코딩하는 유전자로 형질전환된 변이체를 글루코오스 함유 배지에서 배양하여 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체를 생산하는 단계 및 상기 생산된 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체를 수득하는 단계를 포함하는 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 및 글리세레이트 디하이드로게네이즈(EC 1.1.1.26)를 코딩하는 유전자가 삽입되고, 이소시트레이트 라이에이즈 조절인자를 코딩하는 유전자(iclR) 또는 malate synthase 를 코딩하는 유전자 (aceB)가 결실되고 isocitrate lyase (aceA)가 증폭되어 있는 형질전환된 변이체를 글루코오스 함유 배지에서 배양하여 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체를 생산하는 단계 및 상기 생산된 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체를 수득하는 단계를 포함하는 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 글리옥실레이트의 외부 공급없이도 글리콜레이트 분획 농도가 높은 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체를 높은 농도로 제조할 수 있다.
도 1의 A는 본 발명에서 제조하는 PLGA와 PGA 및 PLA의 화학식을 나타낸 것이고, B는 본 발명에서 수행한 대사조작에 의한 PLGA 생산경로를 나타낸 것이다.
도 2는 대장균 XL1-Blue의 염색체에서, PLGA 생산과 관련된 유전자의 지도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에서 제작된 재조합 대장균 JLXF5의 염색체에서, PLGA 생산과 관련된 유전자의 지도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에서 제작된 재조합 대장균 JLXF8의 염색체에서, PLGA 생산과 관련된 유전자의 지도를 나타낸 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 및 글리세레이트 디하이드로게네이즈(EC 1.1.1.26)를 코딩하는 유전자로 형질전환되고, (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프로피오닐-CoA 전이효소는 C. propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소 또는 C. propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소의 변이효소인 Pct540인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소는 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase 또는 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase의 변이 효소인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 PHA synthase의 변이효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K 및 Q481R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 PHA synthase의 변이효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477G 및 Q481M이 변이된 아미노산 서열(C1335); 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(C1310); 및 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481R이 변이된 아미노산 서열(C1312)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 글리세레이트 디하이드로게네이즈(EC 1.1.1.26)를 코딩하는 유전자는 Pyrococcus multocida 또는 대장균 유래인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 글리세레이트 디하이드로게네이즈(EC 1.1.1.26)를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 및 글리세레이트 디하이드로게네이즈(EC 1.1.1.26)를 코딩하는 유전자가 삽입되고, 이소시트레이트 라이에이즈 조절인자를 코딩하는 유전자(iclR) 또는 malate synthase (aceB)가 결실되고 는이소시트레이트 라이에즈 (aceA)를 코딩하는 유전자가 증폭되어 있는 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에서 "결실" 이란 유전자의 치환, 삭제, 변이를 통하여 유전자가 코딩하는 단백질이 원래의 기능을 하지 못하는 상태가 되도록 조작하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 이소시트레이트 라이에이즈 조절인자를 코딩하는 유전자(iclR) 와 이소시트레이트 라이에즈를 코딩하는 유전자 (aceB)가 모두 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 이소시트레이트 라이에이즈(isocitrate lyase)를 코딩하는 유전자 (aceA)가 추가로 증폭되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 변이체의 모균주는 E.coli XL1-Blue, E.coli JLX5, E.coli JLX6, E.coli JLX7, E.coli JLX8, E.coli JLX10, E.coli JLX11, E.coli JLX12 및 E.coli JLX13로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 모균주의 특질은 표 1에 나타내었다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 및 글리세레이트 디하이드로게네이즈(EC 1.1.1.26)를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물을 글루코오스 함유 배지에서 배양하여 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체를 생산하는 단계 및 상기 생산된 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체를 수득하는 단계를 포함하는 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 자연상태에서 생산되지 않는 폴리머인 PLGA를 생산하는 대장균 균주를 개발하였으며, 대장균의 대사경로를 조작하여, PLGA의 단량체인 글리콜레이트를 더 많이 생산하도록 하였다.
본 발명이 일양태에서, Pct540 Cp , PhaC1437Ps6-19 및 P. multocida의 글리세레이트 디하이드로게네이즈를 발현하는 재조합 E.coli JLXF5 균주는 P(35.2 mol% LA-co-64.8mol% GA)의 중합체를 33.6 중량%로 생산하였으며, 이는 대사공학적으로 재조합된 대장균에서 글루코오스로부터 락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체를 생산한 첫번째 연구결과이다
또 다른 관점에서, 본 발명은 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 및 글리세레이트 디하이드로게네이즈(EC 1.1.1.26)를 코딩하는 유전자가 삽입되고, 이소시트레이트 라이에이즈 조절인자를 코딩하는 유전자(iclR) 또는 이소시트레이트 라이에즈를 코딩하는 유전자 (aceB)가 결실되어 있는 재조합 미생물을 글루코오스 함유 배지에서 배양하여 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체를 생산하는 단계 및 상기 생산된 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체를 수득하는 단계를 포함하는 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체의 제조방법에 관한 것이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 사용균주 및 분석방법
하기 실시예에서 사용한 균주, 플라스미드 및 프라이머를 표 1에 나타내었다.
하기 실시예에서 재조합 대장균에서, PLGA 공중합체를 생산하기 위하여 사용되는 MR 배지는 1L 당, 6.67 g KH2PO4, 4 g (NH4)2HPO4, 0.8 g MgSO4◎H2O, 0.8 g citric acid, 및 5 ml trace metal 용액을 함유하고, 상기 trace metal 용액은 1L 당, 0.5 M HCl: 10 g FeSO4?H2O, 2 g CaCl2, 2.2 g ZnSO4?H2O, 0.5 g MnSO4?H2O, 1 g CuSO4?H2O, 0.1 g (NH4)6Mo7O24?H2O, and 0.02 g Na2B4O7?10H2O. Carbon source 및 MgSO4?H2O를 함유한다.
각 균주 배양에 있어서, 종균배양은 10mL LB 배지가 첨가된 25mL 튜브에서 30℃로 하룻밤 진탕배양하며, 1mL의 배양액을 20g/L 글루코오스를 함유하는 100mL의 MR 배지를 함유하는 250mL 플라스크에 접종하여 30℃에서 72시간 동안 진탕배양하였다. p(3HB-co-LA-co-GA)을 합성할 경우, 2 g/L의 3HB를 배양배지에 첨가하였다.
숙주세포로 JLX10 균주(Jung et al., 2010)를 사용할 경우, ppc 유전자 결실에 의하여 발생하는 성장제한을 극복하기 위하여, 4g/L 의 소듐숙시네이트(Sigma-Aldrich, USA)를 배양배지에 첨가해 주었으며, trc 프로모터에 의해 조절받는 ldhA 및 acs 유전자의 발현을 위하여, OD600수치가 0.5일때, 1mM IPTG를 첨가하였다. 필요에 따라, 100μM/mL의 앰피실린, 34μg/mL의 클로람페니콜 및 10μg/mL의 티아민을 배지에 첨가해 주었다.
본 발명에서 사용된 재조합 균주 및 플라스미드의 유전적 특징을 표 1에 나타내었으며, 본 발명에서 재조합 균주 및 플라스미드 제작에 사용된 프라이머를 표 2에 나타내었다.
본 발명에서 사용된 재조합 균주의 제조에 있어서, 염색체 상에서, iclR 유전자 및 aceB 유전자를 삭제하고, aceA 유전자의 프로모터를 trc 프로모터로 대체하는 것은 표 2에 기재된 프라이머를 사용한 one-step inacitvation 방법을 사용하였다 (Datsenko and Wanner, Proc Natl Acad Sci U S A. 6;97:6640, 2000) .
균쥬 , 플라스미드 또는 프라이머 특징 a 인용문헌 또는 입수처
균주
XL1-Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F' proAB lacI q ZΔM15 Tn10 (TetR)] Stratageneb
JLX10 XL1-Blue ΔackA PldhA::Ptrc Δppc Pacs::Ptrc ΔadhE 본 발명
JLX11 JLX10 ΔiclR 본 발명
JLX12 JLX10 ΔaceB PaceA::Ptrc 본 발명
JLX13 JLX10 ΔiclR ΔaceB PaceA::Ptrc 본 발명
JLXF5 XB-F ΔiacI ΔpflB ΔfrdABCD ΔadhE PldhA::Ptrc Pacs::Ptrc 본 발명
JLXF6 JLXF5 ΔiclR 본 발명
JLXF7 JLXF5 ΔaceB PaceA::Ptrc 본 발명
JLXF8 JLXF5 ΔiclR ΔaceB PaceA::Ptrc 본 발명
본 발명
플라스미드
pBluescript ApR, cloning and expression vector Stratageneb
pPs619C1400-CpPCT532 ApR, Promoter of the C. necator PHA biosynthesis operon, phaC1 Ps 6-19 variant (phaC1400 Ps 6-19; E130D, S325T, S477R, Q481M), pct Cp variant (pct532 Cp ; A243T, silent mutations: A1200G), transcriptional terminator of the C. necator PHA biosynthesis operon, derivative of pBluescript II KS(+) 본 발명
pPs619C1310-CpPCT540 ApR, Promoter of the C. necator PHA biosynthesis operon, phaC1 Ps 6-19 variant (phaC1310 Ps 6-19 ; E130D, S477F, Q481K), pct Cp variant (pct540 Cp ; V193A, Silent mutations: T78C, T669C, A1125G, T1158C), transcriptional terminator of the C. necator PHA biosynthesis operon, derivative of pBluescriptII KS(+) 대한민국공개특허2010-0111766호
pPs619C1437-CpPCT540 ApR, Promoter of the C. necator PHA biosynthesis operon, phaC1 Ps 6-19 variant (phaC1337 Ps 6-19; E130D, S325T, S477G, Q481K), pct Cp variant (pct540 Cp ; V193A, Silent mutations: T78C, T669C, A1125G, T1158C), transcriptional terminator of the C. necator PHA biosynthesis operon, derivative of pBluescriptII KS(+) 본 발명
pTac15k p15A origin of replication, KmR, tac promoter Lab stock
pTac15kPmu0559 Derivative of pTac15k, expression of Pasteurella multocida glycerate dehydrogenase gene under tac promoter 본 발명
pBBR1MCS2 Broad host range vector; Kmr
pZE12-MCS Expression vector; P LlacO-1 promoter; Apr EXPRESSYSc
pKE12-MCS Expression vector; P LlacO-1 promoter, R. eutropha PHA biosynthesis genes transcription terminator; Apr 본 발명
pZA31-MCS Expression vector; P LtetO-1 promoter; Cmr EXPRESSYS
pKA32-MCS Expression vector; P LlacO-1 promoter, R. eutropha PHA biosynthesis genes transcription terminator; Cmr 본 발명
pKM22-MCS Expression vector; P LlacO-1 promoter; Kmr 본 발명
pKM22-YcdW Derivative of pKM22-MCS, expression of E. coli glycerate dehydrogenase gene (ycdW) under lacIO promoter 본 발명
프라이머
PmuFEcoRI
(서열번호3)		 GTAGAATTCATGTTAAAAATTGTTTTTCTAGATAGTACC 본 발명
PmuRPstI
(서열번호 4)		 GTATGCAACTGCAGTTAAGCAATCTGCTCATTTTTTAC 본 발명
a Ap: ampicillin; Km: kanamycin; R: resistance.
bStratagene Cloning System, La Jolla, CA, USA.
cwww.expressys.com
프라이머 리스트
JLX10
K.O.
adhE FDadhE1
(서열번호 5)		 TCGAGCAGATGATTTACTAAAAAAGTTTAACATTATCAGGAGAGCATTATTAGGTGACACTATAGAACGCG
RdadhE1
(서열번호 6)		 GATTTTCATAGGTTAAGCAAATCATCACCGCACTGACTATACTCTCGTATTCGAGCAGATGATTTACTAA
FDadhE2
(서열번호 7)		 TGATCGGCATTGCCCAGAAGGGGCCGTTTATGTTGCCAGACAGCGCTACTTAGTGGATCTGATGGGTACC
RdadhE2
(서열번호 8)		 GGAAGCCGTTATAGTGCCTCAGTTTAAGGATCGGTCAACTAATCCTTAACTGATCGGCATTGCCCAGAAG
Ptrc
acs FPacs1
(서열번호 9)		 TCACGACAGTAACCGCACCTACACTGTCATGACATTGCTCGCCCCTATGTGTAACAAATA
RPacs1
(서열번호 10)		 TGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACAGCTAGTGGATCTGATGGGTACC
FPacs2
(서열번호 11)		 TCACGACAGTAACCGCACCTACACTGTCATGACATTGCTCGCCCCTATGTGTAACAAATA
RPacs2
(서열번호 12)		 CGATGTTGGCAGGAATGGTGTGTTTGTGAATTTGGCTCATGGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCC
FPacs3
(서열번호 13)		 CGAATTGCGCCATTGTTGCAATGGCGGTTTTTATTGTTTTTCACGACAGTAACCGCACCT
RPacs3
(서열번호 14)		 TTGTTGATACATCGCCTCGTACTGCTGAGGGTTTATCAGGCAACGGTCTGCGATGTTGGCAGGAATGGTG
JLXF5
K.O.
pflB FDpflB1
(서열번호 15)		 TTACGGGCCTATAAGCCAGGCGAGATATGATCTATATCAATTTCTCATCTTAGGTGACACTATAGAACGCG
RDpflB1
(서열번호 16)		 TTCTTTAGTCAGCGAGTTGAAACGTACTGCGTAGCCAGATACACGGATGGTAGTGGATCTGATGGGTACC
FDpflB2
(서열번호 17)		 TATTTGGATAATCAAATATTTACTCCGTATTTGCATAAAAACCATGCGAGTTACGGGCCTATAAGCCAGG
RDpflB2
(서열번호 18)		 TCTAATTACATAGATTGAGTGAAGGTACGAGTAATAACGTCCTGCTGCTGTTCTTTAGTCAGCGAGTTGA
frdABCD FDfrd1
(서열번호 19)		 ATTACGTGCTGCAATTGCTGCCGCGCAGGCAAATCCGAATGCAAAAATCGTAGGTGACACTATAGAACGCG
RDfrd1
(서열번호 20)		 GACCGTAGAAAACCCATTTGCCCGCAGGTACGTGGATTTTCAGATCGTGCTAGTGGATCTGATGGGTACC
FDfrd2
(서열번호 21)		 GTGCAAACCTTTCAAGCCGATCTTGCCATTGTAGGCGCCGGTGGCGCGGGATTACGTGCTGCAATTGCTG
RDfrd2
(서열번호 22)		 TTAGATTGTAACGACACCAATCAGCGTGACAACTGTCAGGATAGCAGCCAGACCGTAGAAAACCCATTTG
adhE FDadhE1
(서열번호 23)		 TCGAGCAGATGATTTACTAAAAAAGTTTAACATTATCAGGAGAGCATTATTAGGTGACACTATAGAACGCG
RDadhE1
(서열번호 24)		 TGATCGGCATTGCCCAGAAGGGGCCGTTTATGTTGCCAGACAGCGCTACTTAGTGGATCTGATGGGTACC
FDadhE2
(서열번호 25)		 GATTTTCATAGGTTAAGCAAATCATCACCGCACTGACTATACTCTCGTATTCGAGCAGATGATTTACTAA
RDadhE2
(서열번호 26)		 GGAAGCCGTTATAGTGCCTCAGTTTAAGGATCGGTCAACTAATCCTTAACTGATCGGCATTGCCCAGAAG
lacI FDlacI1
(서열번호 27)		 TCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAATAGGTGACACTATAGAACGCG
RDlacI1
(서열번호 28)		 TGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTAGTGGATCTGATGGGTACC
FDlacI2
(서열번호 29)		 GTGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGG
RDlacI2
(서열번호 30)		 CATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAAT
Ptrc
ldhA FPldhA1
(서열번호 31)		 CATCTAATGCAATACGTGTCCCGAGCGGTAGCCAGATGCTAGGTGACACTATAGAACGCG
RPldhA1
(서열번호 32)		 TGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACAGCTAGTGGATCTGATGGGTACC
FPldhA2
(서열번호 33)		 GATCGGGAATGATTAAACCTTTACGCGTAATGCGTGGGCTTTCATCTAATGCAATACGTGTC
RPldhA2
(서열번호 34)		 TCTTGTCGTACTGTTTTGTGCTATAAACGGCGAGTTTCATGGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCC
FPldhA3
(서열번호 35)		 GGTGATATGCGCAAGCTGACAATCTCCCACCAGATAACGGAGATCGGGAATGATTAAACC
RPldhA3
(서열번호 36)		 CAAAAAATTCCAGCTCAAAGCCAAAGGACTCGTTCACCTGTTGCAGGTACTTCTTGTCGTACTGTTTTGTG
acs FPacs1
(서열번호 37)		 TCACGACAGTAACCGCACCTACACTGTCATGACATTGCTCGCCCCTATGTGTAACAAATA
RPacs1
(서열번호 38)		 TGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACAGCTAGTGGATCTGATGGGTACC
FPacs2
(서열번호 39)		 TCACGACAGTAACCGCACCTACACTGTCATGACATTGCTCGCCCCTATGTGTAACAAATA
RPacs2
(서열번호 40)		 CGATGTTGGCAGGAATGGTGTGTTTGTGAATTTGGCTCATGGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATC CGCTCACAATTCC
FPacs3
(서열번호 41)		 CGAATTGCGCCATTGTTGCAATGGCGGTTTTTATTGTTTTTCACGACAGTAACCGCACCT
RPacs3
(서열번호 42)		 TTGTTGATACATCGCCTCGTACTGCTGAGGGTTTATCAGGCAACGGTCTGCGATGTTGGCAGGAATGGTG
PLGA
K.O.
iclr 11HLiclR- inXB:
(서열번호 43)		 TGAAAATGATTTCCACGATACAGAAAAAAGAGACTGTCATGGTCGCACCCATTCCGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAG
12HLiclR-inXB: (서열번호 44) TGATGGGCAGAATATTGCCTCTGCCCGCCAGAAAAAGTCAGCGCATTCCACCGTACCTGATTCTGTGGATAACCGTATTAC
K.O. +PaceA
aceB-A 11HLaceB-A_PC inXB:
(서열번호 45)		 GCGGATAAATCGCTGGAAGCCAATAACGGTCACGATGGCACATGGATCGCCGCGTCATACACATACGATT
12HRaceB-A_PC-inXB:
(서열번호 46)		 GGTTGAGTCCACTCTTTCTGTAATTCTTCAATTTGTTGTGTACGGGTTTTCATGGTCTGTTTCCTGTGTG
ycdWf ycdWf-EcoRI(서열번호 47) gaattc atggatatcatcttttatcac
ycdWb-KpnI
(서열번호 48)		 ggtacc ttagtagccgcgtgcgcggtc
hprAf hprAf-EcoRI
(서열번호 49)		 gaattc atgcccagcccgcgtcgcgc
hprAb-KpnI
(서열번호 50)		 ggtacc tcagctgaccacgcggcgtg
세포 성장 및 대사산물 분석
글루코오스와 피루브산, 아세트산, 포름산, 락트테이트, 숙시네이트를 포함하는 대사산물은 UV/VIS(Varian ProStar 320, USA) and refractive index(Shodex RI-71, 일본)가 장착된 HPLC(Varian ProStar 210, USA)로 MetaCarb 87H 컬럼(300 x 7.8mM)을 사용하여 분석하였다. 세포 성장은 600nm 흡광도에서 Ultraspec 300 스펙트로포토메타(Amersham Bioscience, 스웨덴)를 사용하여 측정하였다.
실시예 2: PHA 합성효소, 프로피오닐-CoA 전이효소 및 글리세레이트 디하이드로게나아제를 발현하는 대장균을 이용한 P(LA-co-GA)의 생합성
본 실시예에서는 글리콜레이트 분획이 증가된 P(LA-co-GA)를 생산하는 재조합 대장균을 제작하기 위하여, 삽입될 유전자를 선택하였다.
Clostridium propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소에서 V193A 변이와 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C의 4가지 침묵 변이를 가지는 효소(Pct 540)와, Pseudomonas sp. 6-19의 PHA 합성효소에서 쿼드러플 변이 PhaC1437(E130D, S325T, S477G 및 Q481K)를 가지는 효소로 형질전환된 대장균이 높은 락테이트 분획을 가지는 P(LA-co-GA) 공중합체를 생산하는 것을 이전 연구(대한민국 특허공개 2010-0111766호)를 통하여 확인하고, P(LA-co-GA) 공중합체 합성을 위해 상기 두 변이 효소를 선택하였다.
먼저, 글리콜레이트 함유 폴리머를 제조하기 위하여, 글리코릴-CoA의 프리커서로 2g/L 농도로 소듐 글리콜레이트를 배지에 첨가하였다. 글리콜레이트가 대장균에서 단독 탄소원으로 사용된다고 보고되었지만, 배지에서의 글리콜레이트 농도는 배양기간동안 줄어들 지 않았다. 3HB와 글리콜레이트를 각각 2g/L로 배지에 첨가하였을 때, P(3HB-co-LA) 합성에 글리콜레이트는 사용되지 않았다. 이는 본 실험 조건에서 글리콜레이트 퍼미아제(GlcA)에 의해 매개되는 글리콜레이트 수송 시스템이 작동하지 않는 다는 것을 의미한다.
그러므로, 글리콜레이트가 세포 내로 이송되지 않는 것을 극복하기 위하여, 글리옥실레이트 리덕테이즈/글리세레이트 디하이드로게네이즈에 의하여 글리옥실레이트로부터 글리콜레이트를 생산하도록 하였다 (도 1).
글리세레이트를 글리콜레이트로 전환하는 반응은 EC(enzyme commission) 넘버 1.1.1.79(NAD(P)H-의존적 글리옥실레이트 리덕테이즈), 1.1.1.29(NADH-의존적 글리옥실레이트 리덕테이즈) 또는 1.1.1.26(글리세레이트 디하이드로게네이즈)에 의하여 수행된다. ATCC 및 KCTC에서 구입한 균주 E.coli MG1655, P. putida KT2440 및 P. multocida의 크로모좀으로부터 증폭된 E. coli MG1655 의 NADPH-의존성 글리옥실레이트 리덕타아제(EC 1.1.1.79)의 유전자, P. putida KT2440 및 P. multocida의 글리세레이트 디하이드로게네이즈(EC 1.1.1.26) 유전자를 사용하여 글루코오스로부터 PLGA 공중합체 합성을 위한 글리콜레이트의 생산능을 확인하였다.
그 결과, 상기 유전자들 중, 대장균의 글리세레이트 디하이드로게네이즈(서열번호 51)와 P. multocida의 글리세레이트 디하이드로게네이즈(서열번호 2) 만이 PLGA 공중합체를 생산할 수 있었으나, 고분자의 GA 분율이 P. multocida의 글리세레이트 디하이드로게네이즈를 사용하였을 때 더 높았기 때문에 향후 실험은 P. multocida의 글리세레이트 디하이드로게네이즈를 이용하여 진행하였다.
재조합 균주 폴리머 폴리머 조성 (mol%) 폴리머 농도
(wt%)
LA GA
XB/pPs619C1437-CpPCT540 +pTac15kPmu05591 P(LA-co-GA) 47.8 52.2 12.3
XB/p619C1437-PCT540
+ pKM22-ycdW		 P(LA-co-GA) 61.4 38.6 12.8
Pct540 Cp , PhaC1437Ps6 -19 및 P. multocida의 글리세레이트 디하이드로게네이즈를 발현하는 재조합 E. coli XL-1 Blue는 P(47.8 mol% LA-co-52.2mol% GA)를 폴리머 농도 12.3중량%로 생산하였다 (표 3).
Pseudomonas sp. 6-19의 PHA 합성효소가 폴리머 합성에서, 가장 친화성있는 단량체인, 3HB 없이는 락테이트를 함유하는 폴리머를 효율적으로 생산하지 못하였으며, 이는 락틸-CoA에 대한 낮은 기질 특이성과, 야생형 대장균주 내의 제한된 락틸-CoA 함량 때문이었으며, 3HB-CoA가 아마도 락테이트 함유 폴리머 합성에서 시발자(iniciator)의 역할을 하는 것으로 생각된다 (Yang et al., Biotechnol Bioeng., 105:150, 2010). 그러나, PLGA 합성에서는 3HB를 첨가하지 않아도, 락테이트 단량체가 PLGA에 50 mol%이상으로 효율적으로 함입되어, 글리콜릴-CoA가 PhaC1437Ps6-19 에 대하여, 매우 친화적인 기질이며, 글리콜릴-CoA가 락테이트 함유고분자 합성에서 3HB와 같은 시발자 역할로 사용될 수 있다는 것을 확인하였다. 글리콜릴-CoA는 표 2에 기재된 P. multocida의 글리세레이트 디하이드로게네이즈를 발현하는 재조합 대장균에서 생성되었다.
상기 결과로부터, P. multocida의 글리세레이트 디하이드로게네이즈의 효소활성은 글리세레이트로부터 글리콜레이트를 합성하는데 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다.
상기 효소활성 측정에서, 재조합 대장균은 1mM IPTG 유도 후, 10시간 및 70시간째에 샘플링하여 10,000xg에서 5분간 원심분리하여 세포 펠렛을 수득한 후, TDM 버퍼(50mM Tris hydrochloride, 10mM MgCl2 및 1mM dithiothreitol, pH 7.5)로 2번 세척한 후, 동일한 버퍼에 현탁시킨 후, 초음파 호모게나이져(VCX-600, Sonics and Materials Inc., USA)의 티타늄 프로브 40T(직경:4mm, 길이:127mm)로 세포를 파쇄하였으며, 4℃ 16,000xg에서 10분간 원심분리하여 상등액을 효소 활성 측정에 사용하였다. 상기 효소활성 측정용 세포 추출물의 단백질 농도는 브래드포드 방법으로 측정하였다.
여기서, 효소 활성은 3반복 실험 후 평균수치이고, 재조합 JLX10 균주는 20 g/L glucose and 4 g/L succinate를 첨가한 MR 배지를 사용하여 30oC 에서 72시간 배양하였다. 재조합 XL1-Blue 균주는 20 g/L glucose 만을 첨가한 MR 배지에서 배양하였다.
효소 활성 분석용 샘플은 1 mM IPTG 유도후 10시간 및 70시간 째에 채취하였다. 효소활성 1 유니트는 30 oC에서 1 분간 1mmole의 기질을 특정 산물로 전환하는 양으로 정의하였다. 단위 활성은 unit/mg 단백질로 정의하였다.
효소활성은 온도 조절 스펙트로포토메터(SpectraMax M2, Molecular Devices co, USA)를 사용하여 30℃에서 수행하였다. 효소 활성은 3반복 실험하여 분석하였으며, 분석에 사용한 세포추출액의 양은 16.5μL/mL이었다. 반응은 340nm에서 NAD(P)H 를 모니터링하여 수행하였으며, NAD(P)H에 대한 340nm에서의 흡광계수(extinction coefficient)로 6.23/mM/cm를 사용하였으며, 효소활성 1 유니트는 30 oC에서 1 분간 1 mmole의 기질을 특정 산물로 전환하는 양으로 정의하였다. 단위 활성은 unit/mg 단백질로 정의하였다.
P. multocida의 글리세레이트 디하이드로게네이즈의 활성은 Rintala 등의 방법으로 수행하였다 (Rintalla et al., Yeast 24: 129-136 2007). 50mM 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.0)에 세포 추출물과 0.2mM NAD(P)H을 함유한 반응 혼합물에 25mM 농도가 되도록 글리옥실레이트를 첨가하여 반응시켰으며, 글리옥실레이트를 첨가하지 않는 반응 혼합물을 대조군으로 사용하였다.
야생형 대장균 XL1-Blue는 0.06U/mg의 매우 낮은 글리세레이트 디하이드로게네이즈 활성을 나타낸 반면, P. multocida의 글리세레이트 디하이드로게네이즈를 과발현하는 플라스미드로 형질전환된 재조합 균주는 1.4 U/mg 전체 단백질 이상의 글리세레이트 디하이드로게네이즈 활성을 나타내어, 야생형 대장균 균주보다 23배의 매우 높은 활성을 나타내었다 (표 4).
P. multocida의 글리세레이트 디하이드로게네이즈는 NADH를 코펙터로하여 사용하였을 때 효소활성이 측정되었으며, NADPH를 코펙터로 사용하였을때는 효소반응이 일어나지 않아, P. multocida의 글리세레이트 디하이드로게네이즈가 NADPH에 대해서는 활성이 없음을 알 수 있었다.
P. multocida 글리세레이트 디하이드로게네이즈의 활성
재조합 균주 글리세레이트 디하이드로게네이즈 효소의 단위활성*
(U/mg of protein) 		중합체 조성
(mol%) 		중합체
농도
(중량%)
10 h 70 h LA GA
XL1-Blue/pBluescript+pTac15k 0.06 0.03 - - -
XL1-Blue/pPs619C1437-CpPCT540+pTac15kPmu0559 1.60 1.40 49 51 13.5
재조합 균주에서의 락테이트 함유 폴리머의 생산에서, 락틸-CoA 생성이 폴리머 생성 효율을 저해하는 속도제한단계로 이기 때문에, 균주 내의 락테이트 함량을 증가시키기 위하여, 대장균 XL1-Blue의 염색체에서 락테이트 프리커서와 경쟁하는 몇가지 대사 경로를 결실시킨 JLXF5 균주를 제작하였다. 또한, trc 프로모터 하의 lacIq 유전자도 결실시켰다(표 1 및 도 1~4 참조).
표 5에 나타낸 바와 같이, Pct540, PhaC1437 및 P. multocida의 글리세레이트 디하이드로게네이즈를 발현하는 대장균 JLXF5 균주는 IPTG 유도 없이도, P(57.2mol%LA-co-42.8mol%GA)를 20.3중량%이상의 폴리머 농도로 생산하였다.
균주 내의 락테이트 농도를 증가시킨 결과, PLGA에서 락테이트 분획이 증가하였다. IPTG를 첨가하면 폴리머 농도는 20.3 중량%에서 26.9중량%로 증가하였으며, 단량체 조성은 큰 차이가 없었다.
재조합 대장균이 생산하는 PLAG 공중합체의 조성 및 농도
재조합 균주 폴리머 폴리머 조성 (mol%) 폴리머 농도
(wt%)
LA GA
XB/pPs619C1437-CpPCT540 +pTac15kPmu05591 P(LA-co-GA) 47.8 52.2 12.3
JLXF5/pPs619C1437-CpPCT540+pTac15kPmu05591 P(LA-co-GA) 54.6 45.4 26.9
JLXF5/pPs619C1437-CpPCT540+pTac15kPmu0559 P(LA-co-GA) 57.2 42.8 20.3
JLXF6/pPs619C1437-CpPCT540+pTac15kPmu0559 P(LA-co-GA) 43.7 56.2 23.9
JLXF7/pPs619C1437-CpPCT540+pTac15kPmu0559 P(LA-co-GA) 40.2 59.8 29.6
JLXF8/pPs619C1437-CpPCT540+pTac15kPmu0559 P(LA-co-GA) 38.4 61.6 32.6
1trc 프로모터 하에 있는 염색체의 ldhA 및 acs 유전자의 발현 및 플라스미드의 tac 프로모터 하의 P. multocida의 글리세레이트 디하이드로게네이즈 유전자의 발현을 위하여, 배양액의 농도가 OD600에서 0.5가 되었을때, 1mM IPTG를 처리하였음.
실시예 3: 대장균의 대사조작을 통한 높은 글리콜레이트 함량을 가지는 PLGA의 생산
실시예 2에서 재조합 XL1-Blue균주와 재조합 JLXF5 균주를 사용하여, 글루코오스로부터 PLGA를 성공적으로 생산하였으나, 생산되는 폴리머 농도가 낮았다. 재조합 균주에서 PLGA 생합성을 향상시키기 위하여, 글루코오스로부터 락테이트를 효율적으로 생산하도록 조작되어 있는 JLXF5 균주에서 글리콜레이트 합성 경로를 강화시켰다. 또한, 글리콜레이트 함량을 증가시키는 것은 글리콜릴-CoA가 폴리머 합성을 시작하게 하는 데 있어서 더 이로울 것이다. 글리콜레이트 합성을 증가시키기 위하여, 글리옥실레이트 션트(shunt)에 관여하는, aceB 유전자 및 iclR 유전자를 결실시키고 aceA 유전자를 증폭시켰다.
글리옥실레이트 경로를 증가시키기 위하여, 염색체 DNA에서 iclR(isocitrate lyase regulator) 및 aceB(malate synthase)유전자를 결실시키고, aceA(isocitrate lyase) 유전자의 프로모터를 trc 프로모터로 교체하는 것은 one-step 불활성화 방법(Datsenko and Wanner, 2000)을 사용하였다.
iclR 유전자를 결실시켰을 때, 재조합 균주에서 생성되는 PLGA 농도는 14.2 중량%에서 23.9 중량%로 증가하였으며, PLGA 폴리머 중 글리콜레이트 단량체 분획은 42.8 mol%에서 56.2 mol%로 증가하였다. 추가로 aceB 유전자를 삭제하고 aceA 유전자를 증폭시켰을 때, 재조합 균주가 생산하는 PLGA의 농도는 32.6 중량%였으며, 이는 JLFX5 균주에서 생산된 양보다 2.3배나 높았다. 또한, 글리콜레이트 단량체는 61.6 mol% 이상으로 증가되었다.
실시예 4: 재조합 대장균에서 합성된 PLGA의 특질
본 발명에서 합성된 공중합체의 단량체 성분 분석은 가스크로마토그래피로 분석하였으며, 중합체는 세포로부터 유기용매 추출방법(Jacquel et al., Biochem Eng J 39:15-27, 2008)의 방법으로 정제하였다. 폴리머의 분자량은 NMR 스펙트로스코피와 GPC(gel permeation chromatography)를 사용하여 측정하였다.
대장균 JLXF5에 의해 생산되는 PLGA는 화학적으로 합성되는 PLGA와 동일한 구조로 나타났다(도 1의 A참조). PLGA의 500MHz1H NMR 스펙트럼에서 LA의 옥시메틴(oxymethine) 양자(-OCH-)는 5.2ppm에서 GA의 메틸양자(-CH3)는 각각 4.6~4.9 ppm 에서 나타났다(도 5의 A).
1H-1H COSY 스펙트럼에서 양자들의 내부 3 결합 커플링을 확인하였고, 이를 통하여 PLGA의 구조를 밝혔다. LA의 옥시메틴 양자와 옥시메틴 양자와 이웃하는 메틸렌 양자 사이의 커플링은 5.1 ppm/1.6 ppm의 크로스 피크로 확인하였다(도 5의 B). GA의 메틸렌 양자 사이의 커플링은 4.6-4.9 ppm에 존재하는 크로스피크로 확인하였다. PLGA의 125MHz 13C NMR 스펙트럼에서 GA*-GA sequence의 카르보닐 카본피크는 169.4 ppm, LA*-LA and LA-LA* sequences의 카르보닐 피크는 169.63 ppm, LA*-GA + GA-LA*sequences의 카르보닐 피크는 169.80 ppm에서 나타났다(도 5의 C).
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology Korea Institute of Chemical Technology <120> Recombinant Microorganism Having Producing Poly(lactate-co-glycolate) from Glucose and Preparing Method of Poly(lactate-co-glycolate) Using Thereof <130> P10-B274 <160> 51 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 559 <212> PRT <213> Pseudomonas sp. 6-19 <400> 1 Met Ser Asn Lys Ser Asn Asp Glu Leu Lys Tyr Gln Ala Ser Glu Asn 1 5 10 15 Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Val Gly Leu Arg Gly Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Ala Ser Ala Arg Met Val Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln Pro Val His 35 40 45 Ser Val Lys His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu 50 55 60 Leu Gly Lys Ser Gly Leu Gln Pro Thr Ser Asp Asp Arg Arg Phe Ala 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr 85 90 95 Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Asp Trp Ile Asp Glu Ser Asn 100 105 110 Leu Ala Pro Lys Asp Val Ala Arg Gly His Phe Val Ile Asn Leu Met 115 120 125 Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Thr Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val 130 135 140 Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser 145 150 155 160 His Leu Ala Lys Asp Leu Val His Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val 165 170 175 Asn Met Gly Ala Phe Glu Val Gly Lys Ser Leu Gly Val Thr Glu Gly 180 185 190 Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro 195 200 205 Thr Thr Glu Gln Val Tyr Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln 210 215 220 Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Asp Lys Ser Leu Ala 225 230 235 240 Arg Phe Cys Leu Arg Asn Asn Val Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg 245 250 255 Asn Pro Thr Lys Glu Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Glu 260 265 270 Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Thr Ala Ile Thr Gly Ser Lys 275 280 285 Asp Val Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala 290 295 300 Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Ile Gly Glu Asn Lys Val Asn Ala Leu 305 310 315 320 Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Leu Asp Ser Asp Val Ala 325 330 335 Leu Phe Val Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr 340 345 350 Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp 355 360 365 Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu 370 375 380 Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp 385 390 395 400 Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Leu Phe 405 410 415 Lys Asn Asn Pro Leu Ile Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr 420 425 430 Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Phe Ser Leu Ala Gly 435 440 445 Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln 450 455 460 Leu Phe Gly Gly Asn Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile 465 470 475 480 Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met Thr 485 490 495 Ser Thr Glu Val Ala Glu Asn Ala Asp Glu Trp Gln Ala Asn Ala Thr 500 505 510 Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala Gln 515 520 525 Arg Ser Gly Glu Leu Lys Lys Ser Pro Thr Lys Leu Gly Ser Lys Ala 530 535 540 Tyr Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg 545 550 555 <210> 2 <211> 951 <212> DNA <213> Pyrococcus multocida <400> 2 atgttaaaaa ttgtttttct agatagtacc gcgataccta aacatatccc gattcctcgc 60 ccaagttttc cacatcaatg ggttgaatat gagcatacga caccagatca agtcgtagaa 120 cgtatgcaag atgtagacat tgcggtaacc agtaaagtcc tctttagtcg tgaagtgatg 180 caacaattac ctaaattaaa attaatcgcg attacggcaa cagggaccaa taatgtggat 240 ttggtggctg cacaagaact tggaatcacg gtgaaaaatg tgacagggta ttcatctaca 300 accgtaccag aacatgtgat aggtctgata tatgcgctca aacacagtat tatgagctgg 360 tatcgcgatc aattatctgc aaaatgggca gattgcaaac aattttgtta ctttgattat 420 ccgattacag atgtgaaagg ctcaaccctt ggtgtcgtgg gacgaggctg tttaggctct 480 gaaatcggtc gattagcgac cgcacttggc atgaatgtac tttatgcaga acataaaggt 540 gcgaaaacat gtcgtgaggg ttatacccct tttgaagacg tgttagcaca agcggatatc 600 ttgacattac attgcccatt gacggacacc acacaaaatc tgatcaatca agacacgtta 660 gctttgatga aaaaaggcgc atttttaatt aatacagggc gtggtccttt agtggatgaa 720 caggcgttag tcgctgcatt agaaagtgga catcttggtg gtgccgcggt tgatgtgtta 780 gtgaaagaac cgcctgaaaa aaacaactca attatccaag ctgccacacg tttgcctaat 840 ttaattgtta ccccgcatat tgcttgggca tctgacagtg cggttaccac cttagtgaat 900 aaggtgaaac aaaacattga agactttgta aaaaatgagc agattgctta a 951 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gtagaattca tgttaaaaat tgtttttcta gatagtacc 39 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtatgcaact gcagttaagc aatctgctca ttttttac 38 <210> 5 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tcgagcagat gatttactaa aaaagtttaa cattatcagg agagcattat taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 6 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gattttcata ggttaagcaa atcatcaccg cactgactat actctcgtat tcgagcagat 60 gatttactaa 70 <210> 7 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tgatcggcat tgcccagaag gggccgttta tgttgccaga cagcgctact tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 8 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggaagccgtt atagtgcctc agtttaagga tcggtcaact aatccttaac tgatcggcat 60 tgcccagaag 70 <210> 9 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tcacgacagt aaccgcacct acactgtcat gacattgctc gcccctatgt gtaacaaata 60 60 <210> 10 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tgttatccgc tcacaattcc acacattata cgagccggat gattaattgt caacagctag 60 tggatctgat gggtacc 77 <210> 11 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primeer <400> 11 tcacgacagt aaccgcacct acactgtcat gacattgctc gcccctatgt gtaacaaata 60 60 <210> 12 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cgatgttggc aggaatggtg tgtttgtgaa tttggctcat ggtctgtttc ctgtgtgaaa 60 ttgttatccg ctcacaattc c 81 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cgaattgcgc cattgttgca atggcggttt ttattgtttt tcacgacagt aaccgcacct 60 60 <210> 14 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ttgttgatac atcgcctcgt actgctgagg gtttatcagg caacggtctg cgatgttggc 60 aggaatggtg 70 <210> 15 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ttacgggcct ataagccagg cgagatatga tctatatcaa tttctcatct taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 16 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ttctttagtc agcgagttga aacgtactgc gtagccagat acacggatgg tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 17 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 tatttggata atcaaatatt tactccgtat ttgcataaaa accatgcgag ttacgggcct 60 ataagccagg 70 <210> 18 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tctaattaca tagattgagt gaaggtacga gtaataacgt cctgctgctg ttctttagtc 60 agcgagttg 69 <210> 19 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 attacgtgct gcaattgctg ccgcgcaggc aaatccgaat gcaaaaatcg taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 20 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gaccgtagaa aacccatttg cccgcaggta cgtggatttt cagatcgtgc tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 21 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gtgcaaacct ttcaagccga tcttgccatt gtaggcgccg gtggcgcggg attacgtgct 60 gcaattgctg 70 <210> 22 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ttagattgta acgacaccaa tcagcgtgac aactgtcagg atagcagcca gaccgtagaa 60 aacccatttg 70 <210> 23 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 tcgagcagat gatttactaa aaaagtttaa cattatcagg agagcattat taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 24 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 tgatcggcat tgcccagaag gggccgttta tgttgccaga cagcgctact tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 25 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gattttcata ggttaagcaa atcatcaccg cactgactat actctcgtat tcgagcagat 60 gatttactaa 70 <210> 26 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 ggaagccgtt atagtgcctc agtttaagga tcggtcaact aatccttaac tgatcggcat 60 tgcccagaag 70 <210> 27 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 tcagaccgtt tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 28 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 29 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt 60 tcccgcgtgg 70 <210> 30 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 60 attaatgaat 70 <210> 31 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 catctaatgc aatacgtgtc ccgagcggta gccagatgct aggtgacact atagaacgcg 60 60 <210> 32 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 tgttatccgc 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ctgcccgcca gaaaaagtca gcgcattcca ccgtacctga 60 ttctgtggat aaccgtatta c 81 <210> 45 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 gcggataaat cgctggaagc caataacggt cacgatggca catggatcgc cgcgtcatac 60 acatacgatt 70 <210> 46 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 ggttgagtcc actctttctg taattcttca atttgttgtg tacgggtttt catggtctgt 60 ttcctgtgtg 70 <210> 47 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 gaattcatgg atatcatctt ttatcac 27 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 ggtaccttag tagccgcgtg cgcggtc 27 <210> 49 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 gaattcatgc ccagcccgcg tcgcgc 26 <210> 50 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 ggtacctcag ctgaccacgc ggcgtg 26 <210> 51 <211> 939 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 51 atggatatca tcttttatca cccaacgttc gatacccaat ggtggattga ggcactgcgc 60 aaagctattc ctcaggcaag agtcagagca tggaaaagcg gagataatga ctctgctgat 120 tatgctttag tctggcatcc tcctgttgaa atgctggcag ggcgcgatct taaagcggtg 180 ttcgcactcg gggccggtgt tgattctatt ttgagcaagc tacaggcaca ccctgaaatg 240 ctgaaccctt ctgttccact ttttcgcctg gaagataccg gtatgggcga gcaaatgcag 300 gaatatgctg tcagtcaggt gctgcattgg tttcgacgtt ttgacgatta tcgcatccag 360 caaaatagtt cgcattggca accgctgcct gaatatcatc gggaagattt taccatcggc 420 attttgggcg caggcgtact gggcagtaaa gttgctcaga gtctgcaaac ctggcgcttt 480 ccgctgcgtt gctggagtcg aacccgtaaa tcgtggcctg gcgtgcaaag ctttgccgga 540 cgggaagaac tgtctgcatt tctgagccaa tgtcgggtat tgattaattt gttaccgaat 600 acccctgaaa ccgtcggcat tattaatcaa caattactcg aaaaattacc ggatggcgcg 660 tatctcctca acctggcgcg tggtgttcat gttgtggaag atgacctgct cgcggcgctg 720 gatagcggca aagttaaagg cgcaatgttg gatgttttta atcgtgaacc cttaccgcct 780 gaaagtccgc tctggcaaca tccacgcgtg acgataacac cacatgtcgc cgcgattacc 840 cgtcccgctg aagctgtgga gtacatttct cgcaccattg cccagctcga aaaaggggag 900 agggtctgcg ggcaagtcga ccgcgcacgc ggctactaa 939

Claims (18)

  1. 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자, 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 및 글리세레이트 디하이드로게네이즈(EC 1.1.1.26)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로피오닐-CoA 전이효소는 C. propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소 또는 C. propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소의 변이효소인 Pct540인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소는 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase 또는 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase의 변이 효소인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  4. 제3항에 있어서, PHA synthase의 변이효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K 및 Q481R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  5. 제3항에 있어서,
    PHA synthase의 변이효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477G 및 Q481M이 변이된 아미노산 서열(C1335);
    서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(C1310); 및
    서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481R이 변이된 아미노산 서열(C1312)로
    이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 글리세레이트 디하이드로게네이즈(EC 1.1.1.26)를 코딩하는 유전자는 Pyrococcus multocida 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 글리세레이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  8. 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 및 글리세레이트 디하이드로게네이즈(EC 1.1.1.26)를 코딩하는 유전자가 삽입되고, 이소시트레이트 라이에이즈 조절인자를 코딩하는 유전자(iclR) 또는 이소시트레이트 라이에즈를 코딩하는 유전자 (aceB)가 결실되어 있는 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 프로피오닐-CoA 전이효소는 C. propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소 또는 C. propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소의 변이효소인 Pct540인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소는 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase 또는 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase의 변이 효소인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  11. 제10항에 있어서, PHA synthase의 변이효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K 및 Q481R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  12. 제10항에 있어서,
    PHA synthase의 변이효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477G 및 Q481M이 변이된 아미노산 서열(C1335);
    서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(C1310); 및
    서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481R이 변이된 아미노산 서열(C1312)로
    이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  13. 제10항에 있어서, 글리세레이트 디하이드로게네이즈(EC 1.1.1.26)를 코딩하는 유전자는 Pyrococcus multocida 또는 대장균 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  14. 제13항에 있어서, 글리세레이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  15. 제10항에 있어서, 이소시트레이트 라이에이즈 조절인자를 코딩하는 유전자(iclR) 와 malate synthase를 코딩하는 유전자 (aceB)가 모두 결실되어 있는 재조합 미생물.
  16. 제10항에 있어서, isocitrate lyase를 코딩하는 유전자(aceA)가 추가로 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  17. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하여 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체를 생산하는 단계 및 상기 생산된 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체를 수득하는 단계를 포함하는 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체의 제조방법.
  18. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 글루코오스 함유 배지에서 배양하여 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체를 생산하는 단계 및 상기 생산된 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체를 수득하는 단계를 포함하는 (락테이트-co-글리콜레이트) 공중합체의 제조방법.
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