KR102072488B1 - 자일로즈로부터 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트) 또는 그 공중합체 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트) 또는 그 공중합체의 제조방법 - Google Patents

자일로즈로부터 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트) 또는 그 공중합체 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트) 또는 그 공중합체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자일로즈로부터 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트)와 그 공중합체 생산능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것으로 더욱 자세하게는, 외부로부터의 글라이콜레이트 프리커서를 공급없이도 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트)와 그 공중합체를 생산하는 능력을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트) 공중합체의 제조방법에 관한 것이다.

Description

자일로즈로부터 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트) 또는 그 공중합체 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트) 또는 그 공중합체의 제조방법{Recombinant Microorganism Having Ability Producing Poly(lactate-co-glycolate) and Its Copolymers from Xylose and Preparing Method of Poly(lactate-co-glycolate) and its copolymers Using Thereof}
본 발명은 자일로즈를 단일 탄소원으로 사용하거나 또는 자일로즈와 글루코오스를 동시에 탄소원으로 사용하여 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트)와 그 공중합체를 생산하는 능력을 가지는 재조합 미생물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 외부로부터의 락테이트와 글라이콜레이트 프리커서를 공급하지 않아도 (락테이트-co-글라이콜레이트) 공중합체를 생산하는 능력을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 (락테이트-co-글라이콜레이트) 공중합체의 제조방법에 관한 것이다.
폴리(락테이트-co-글라이콜레이트) [Poly(lactate-co-glycolate), PLGA]는 락테이트(lactate)와 글라이콜레이트(glycolate)의 랜덤 공중합체로, 대표적인 생분해성 고분자로서 범용고분자 혹은 의료용 고분자로서의 응용성이 높은 고분자이다. 현재 PLGA는 락테이트와 글라이콜레이트의 직접중합반응에 의해 제조될 수 있으나, 상기 반응을 통해서는 주로 낮은 분자량(1000-5000 달톤)의 PLGA만이 생성된다. 100,000 달톤 이상의 높은 분자량의 PLGA는 락타이드(lactide)와 글라이콜라이드(glycolide)의 링 개환축합반응을 통해 합성되어질 수 있다. 락타이드와 글라이콜라이드는 각각 락테이트와 글라이콜레이트의 고리 디에스테르(cyclic diester)로서, 각각 락테이트 올리고머와 글라이콜레이트 올리고머의 열분해에 의해 만들어진다. 링 개환축합반응에는 2-에틸헥사논산 주석(tin(II) 2-ethylhexanoate), 주석 알콕사이드(tin(II) alkoxide), 또는 알루미늄 이소프로폭사이드(aluminum isopropoxide) 등의 촉매의 사용이 요구되어진다. 직접중합으로 얻어진 낮은 분자량의 고분자로부터 chain coupling agent를 이용하여 보다 분자량이 높은 고분자로 중합하는 방법이 있으나 chain coupling agent를 이용하기 때문에 고분자량의 PLGA를 제조하는 방법은 유기용제(solvent)나 chain coupling agent의 첨가로 인해 공정이 복잡해지고, 또한 이들을 제거가 쉽지 않다는 단점이 있다. 현재 상용화되고 있는 고분자량의 PLGA 생산공정은 락테이트와 글라이콜레이트를 각각 락타이드와 글라이콜라이드로 전환한 다음, 락타이드와 글라이콜라이드의 링 개환축합반응을 통해 PLGA를 합성하는 방법이 사용되고 있다.
한편, polyhydroxyalkanoate (PHA)란 인, 질소, 마그네슘, 산소 등의 영양분이 부족할 때, 미생물이 잉여 탄소원을 에너지나 탄소원 저장물질로 세포 내부에 축적하는 폴리에스터(polyester)이다. PHA는 완전한 생분해성을 가지며 기존의 석유로부터 생산되는 합성고분자와 유사한 물성을 가질 수 있기 때문에 석유 기반 합성 플라스틱을 대체할 환경 친화 물질로 대두되고 있다.
Ralstonia eutropha, Pseudomonas, Bacillus, 재조합 대장균 등 다양한 생물체로부터 생산될 수 있으며 현재까지 150 여 종이상의 다양한 단량체들이 PHA에 포함될 수 있다고 알려져있다. 이러한 PHA는 크게 짧은 탄소수를 가진 SCL-PHA (short-chain-length PHA)와 긴 탄소수를 가진 MCL-PHA (medium-chain-length PHA)로 구분되어지며, PHA를 합성하는 핵심 효소인 PHA 합성효소의 경우 기질로 이용하는 단량체 종류 및 효소를 이루는 서브유닛에 따라 크게 4가지 클래스로 나누어 진다. (Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 157:155, 1997; Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 167:89, 1998; Langenbach et al., FEMS Microbiol. Lett., 150:303, 1997; WO 01/55436; US 6,143,952; WO 98/54329; WO 99/61624).
글라이콜릭산(glycolic acid)은 탄소 길이 2개의 가장 단순한 하이드록시카복시산으로 자연적으로 글라이콜릭산을 포함한 PHA에 대한 보고는 없다. 하지만, 폴리락테이트와 더불어 대표적인 합성 바이오고분자로 활용도가 높기 때문에 PHA 단량체로 삽입하고자 하는 여러 시도가 있어 왔다.
본 발명자들은, 이전 특허에서 (US 8,883,463 B2) 글루코즈를 탄소원으로 이용하여 글라이옥실레이트 션트 (glyoxylate shunt) 대사회로를 조작하여 외부 프리커서 첨가 없이 글라이콜레이트를 생산하는 대장균을 제조하였고, 락테이트와 글라이콜레이트를 각각 락틸-CoA와 글라이콜릴-CoA로 전환하는 효소인 Clostridium propionicum 유래 프로피오닐-CoA 전이효소 (Pct) 유전자와 락틸-CoA와 글라이콜릴-CoA를 기질로 사용할 수 있는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 합성효소 (PhaC1) 유전자로 형질전환된 상기 재조합 대장균을 배양하여 글루코즈로부터 PLGA가 생성되는 것을 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 자일로즈를 주 탄소원으로 이용하여 글라이콜레이트를 외부에서 첨가하지 않아도 글라이콜레이트 분획의 함량이 높은 PLGA를 보다 더 고 효율로 생산할 수 있는 재조합 대장균을 개발하고자 예의 노력한 결과, Clostridium propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소와, Pseudomonas sp. 6-19의 PHA 합성효소, 자일로즈 디하이드로제네이즈 및 자일로노락토네이즈를 발현하는 재조합 미생물을 제작하고, 상기 미생물이 자일로스를 단일 탄소원으로 사용하거나 또는 자일로즈와 글루코오스를 동시에 탄소원으로 사용하여 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트)와 그 공중합체를 생산하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 글라이콜레이트의 외부 첨가 없이 고농도의 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트)와 다양한 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트) 공중합체를 생산할 수 있는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 글라콜레이트의 외부 첨가 없이 고농도의 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트)와 다양한 PLGA 공중합체를 생산할 수 있는 재조합 미생물을 이용한 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트)의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 및 자일로즈 디하이드로제네이즈와 자일로노락토네이즈를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트) 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트)의 제조방법를 제공한다.
본 발명은 또한, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자, 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 자일로즈 디하이드로제네이즈를 코딩하는 유전자, 자일로노락토네이즈를 코딩하는 유전자, 베타-케토사이올레이즈(beta-ketothiolase)를 코딩하는 유전자 및 아세토아세틸-CoA 리덕테이즈 (acetoacetyl-CoA reductase)를 코딩하는 유전자로 형질전환된 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-3-하이드록시뷰트레이트) 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-3-하이드록시뷰트레이트)의 제조방법를 제공한다.
본 발명은 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자, 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 자일로즈 디하이드로제네이즈를 코딩하는 유전자, 자일로노락토네이즈를 코딩하는 유전자, CoA-의존 석시네이트 세미알데하이드 디하이드로제네이즈 (succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 4-하이드록시뷰트레이트 디하이드로제네이즈 (4-hydroxybutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자로 형질전환된 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-4-하이드록시뷰트레이트) 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-4-하이드록시뷰트레이트)의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 락테이트와 글라이콜레이트 프리커서의 외부 공급없이도 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트) 및 그 공중합체를 높은 농도로 제조할 수 있다.
도 1의 A는 본 발명에서 제조하는 PLGA의 화학식을 나타낸 것이고, B는 본 발명에서 수행한 대사조작에 의한 PLGA 생산경로를 나타낸 것이다.
도 2는 A는 pTacxylBC 플라스미드, B는 pTacxylBC_phaAB 플라스미드 C는. pTacxylBC_s4D 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 3는 본 발명에서 수행한 대사 조작에 의한 자일로즈를 단일 탄소원으로 사용하는 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트) 생산 경로를 나타낸 것이다.
도 4 및 도 5는 본 발명에서 제작된 재조합 대장균들이 생성하는 락테이트 및 글라이콜레이트 생산능을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에서 제작된 재조합 대장균 X17ld-p로부터 생산된 PLGA의 1H NMR 및 13C NMR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에서 수행한 대사 조작에 의한 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-3-하이드록시뷰트레이트) 생산 경로를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에서 수행한 대사 조작에 의한 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-4-하이드록시뷰트레이트) 생산 경로를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 글루코오스가 아닌 자일로즈를 주 탄소원으로 이용하여 글라이콜레이트를 외부에서 첨가하지 않아도 글라이콜레이트 분획의 함량이 높은 PLGA를 보다 더 고 효율로 생산할 수 있는 재조합 대장균 및 락테이트와 글라이콜레이트를 포함하는 다양한 고분자 생산이 가능한 대장균을 개발하기 위하여, Clostridium propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소와, Pseudomonas sp. 6-19의 PHA 합성효소, 자일로즈 디하이드로제네이즈 및 자일로노락토네이즈를 형질전환키고, 글루코즈 PTS 효소 IIBC 컴포넌트를 코딩를 코딩하는 유전자 (ptsG), 알데하이드-알코올 디하이드로제네이즈 (aldehyde-alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 (adhE), 파이루베이트-포메이트 라이에이즈 (pyruvate-formate lyase) 코딩하는 유전자 (pflB), 푸마레이트 리덕테이즈 (fumarate reductase)를 코딩하는 유전자 (frdB), 파이루베이트 옥시데이즈 (pyruvate oxidase)를 코딩하는 유전자 (poxB), 락테이트 디하이드로제네이즈 (lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 (dld), 말레이트 신세이즈 (malate synthase)를 코딩하는 유전자 (aceB), 글라이콜레이트 옥시데이즈 (glycolate oxidase_를 코딩하는 유전자 (glcDEFG), 또 다른 말레이트 신세이즈 (malate synthase)를 코딩하는 유전자 (glcB)가 결실되고, 락테이트 디하이드로제네이즈를 코딩하는 유전자(ldhA)의 크로모좀상의 프로모터가 trc 프로모터로 치환된 경우, 글라이콜레이트 분획의 함량이 높은 PLGA와 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-2-하이드록시뷰트레이트)를 고농도로 생산할 수 있다는 것을 확인하였다.
또 상기 개발된 재조합 대장균으로부터 또한 외부로부터 프리커서 공급 없이 베타-케토사이올레이즈 (beta-ketothiolase)를 코딩하는 유전자 (phaA)와 아세토아세틸-CoA 리덕테이즈 (acetoacetyl-CoA reductase)를 코딩하는 유전자 (phaB)를 추가로 형질변환시켜 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-3-하이드록시뷰트레이트)를 생성하였고, CoA-의존 석시네이트 세미알데하이드 디하이드로제네이즈 (succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 (sucD)와 4-하이드록시뷰트레이트 디하이드로제네이즈 (4-hydroxybutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 (4hbD)를 추가로 형질 변환 시에는 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-4-하이드록시뷰트레이트)를 생산하였다. 이 외에도 외부로부터 프리커서를 공급하는 방법을 통해 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-2-하이드록시아이소발러레이트), 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-5-하이드록시발러레이트), 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-6-하이드록시헥사노에이트)를 생산할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 피루브산으로부터 락틸-CoA 생성능을 가지는 미생물에서, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 및 자일로즈 디하이드로제네이즈와 자일로노락토네이즈를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트) 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트)의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소는 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase 또는 하기에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 PHA synthase의 변이효소인 것을 특징으로 할 수 있다:
서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, S477G, S477F, S477Y, S477G 및 Q481K로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(PhaC1202); 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S325T 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(PhaC1301); 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(PhaC1310); 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, S477G 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(PhaC1437); 및 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, S477F 및 Q481R이 변이된 아미노산 서열(PhaC1439).
본 발명에 있어서, 상기 자일로즈 디하이드로제네이즈와 자일로노락토네이즈를 코딩하는 유전자는 Caulobacter crescentus 유래인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 유전자들을 도입하여 댐스 대사회로 (Dahms pathway)를 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 자일로즈 디하이드로제네이즈와 자일로노락토네이즈를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트)의 제조방법은 (a) 상기 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트) 생성능을 가지는 재조합 미생물을 배양하여 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트)를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트)를 수득하는 단계를 포함하며, 상기 배양의 탄소원으로는 자일로스 단독 또는 자일로즈와 글루코오스를 동시에 공급하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명자들은 글라이콜레이트의 외부 첨가 없이 자일로즈와 같은 바이오매스 유래 탄소원으로부터 직접 PLGA를 생산할 수 있는 대장균 변이체를 제작하기 위하여, 균주 조작을 수행하였다. 대장균 XL1-Blue 균주의 경우 글라이옥실레이트 (gloxylate)를 거쳐 글라이콜레이트가 생성되는 대사회로에 해당하는 유전자를 가지고 있지만, 배양 시 글라이콜레이트를 자연적으로 생산하지 않는 것을 확인하였고, 따라서 글라이콜레이트 대사회로 강화 및 대사 흐름 최적화를 진행하였다.
대장균 내에 글라이콜레이트를 생산할 수 있는 대사회로를 살펴보면, TCA cycle을 이루는 대사체인 아이소시트레이트 (isocitrate)가 글라이옥실레이트로 전환된 후 (glyoxylate shunt) 글라이옥실레이트가 글라이옥실레이트 효소에 의하여 글라이콜레이트로 전환되어진다. 즉 아이소시트레이트 마디에서 아이소시트레이트 라이에이즈 (isocitrate lyase) 효소에 의해 글라이옥실레이트로 전환되거나, 아이소시트레이트 디하이드로제네이즈 (isocitrate dehydrogenase) 효소에 의해 2-케토글루타레이트 (2-ketoglutarate)로 전환되어 TCA cycle로 흐르게 된다. 이러한 대사 흐름 기작은 아이소시트레이트 디하이드로제네이즈의 phosphorylation / dephosphorylation에 의하여 활성이 조절되며 여러 가지 regulator에 의해 조절되어진다. 이러한 대사회로를 이용하여 글루코즈로부터 PLGA를 생산하는 시도가 특허에서 (US 8,883,463 B2) 이루어졌다.
본 발명에서는 자일로즈를 주 탄소원으로 이용하여 고농도의 PLGA를 생산하는 대장균을 제작하고자 하였는데, 자일로즈로부터 댐스 대사회로 (Dahms pathway)라고 불리는 자일로즈 이용 회로로부터 글라이콜레이트가 생산될 수 있다는 것에 착안하였다.
댐스 대사회로는 Caulobacter와 같은 균주가 자일로즈를 탄소원으로 이용 시 자일로노락톤 (xylonolactone), 자일로네이트 (xylonate), 2-디하이드로-3-디옥시펜토네이트 (2-dehydro-3-deoxy-pentonate)로 차례로 전환된 후 알돌레이즈 (aldolase) 효소에 의해 글라이콜알데하이드 (glycolaldehyde)와 파이루베이트 (pyruvate)로 나누어지고, 글라이콜알데하이드는 알데하이드 디하이드로제네이즈 (aldehyde dehydrogenase)에 의해 글라이콜레이트로 전환된다 (도 1의 B 참고). 대장균의 경우 xylose를 탄소원으로 이용할 때 transporter에 의해 셀 내부로 들어온 후 댐스 대사회로가 아닌 자일로즈 아이소머레이즈 (xylose isomerase), 자일룰로즈 (xylulose) 효소에 의해 전환되어 펜토즈 포스페이트 대사회로 (pentose phosphate pathway)를 통해 대사되어진다. 따라서 댐스 대사회로를 이용하는 미생물로부터 외래 유전자를 도입하여 대장균 내에 댐스 대사회로를 구축하고자 하였다. 대장균에 경우 댐스 대사회로의 다운스트림을 이루는 효소가 존재한다고 알려져있으므로 업스트림에 해당하는 자일로즈 디하이드로제네이즈 (xylose dehydrogenase) 및 자일로노락토네이즈 (xylonolactonase)를 Caulobacter crescentus의 크로모좀으로부터 증폭하여 pTacxylBC 플라스미드를 제작하였다. 대장균 XL1-Blue 균주에 pTacxylBC 벡터를 형질전환시킨 후 MR 배지에 xylose 단일 탄소원으로 (20g/l) 배양한 결과 0.89 g/L의 글라이콜레이트 생산되었다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물의 락테이트 디하이드로제네이즈를 코딩하는 유전자의 크로모좀 상의 프로모터는 trc, tac, pBAD, trp, lacUV5 및 T7 및 으로 구성되는 군에서 선택되는 스트롱 프로모터로 치환되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 글루코즈 PTS 효소 IIBC 컴포넌트를 코딩하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 알데하이드-알콜 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 (adhE), 피루베이트-포메이트 라이에이즈를 코딩하는 유전자 (pflB) 및 푸마레이트 리덕타아제(fumarate reductase)를 코딩하는 유전자 및 피루베이트 옥시데이즈(pyruvate oxidase)를 코딩하는 유전자가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 또다른 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자인 dld 유전자가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 말레이트 신세이즈 (malate synthase)를 코딩하는 유전자 및 글라이콜레이트 옥시데이즈(glycolate oxidase)를 코딩하는 유전자가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는 PLGA 또 다른 단량체인 락테이트는 파이루베이트를 전구체로 만들어지기 때문에 파이루베이트가 각각 아세테이트, 포메이트로 전환되어 락테이트로의 플럭스를 감소시키지 않는 것이 중요하다. 따라서 해당 유전자인 poxB (파이루베이트 옥시데이즈, pyruvate oxidase)와 pflB (파이루베이트-포메이트 라이에이즈, pyruvate-formate lyase)를 결실 시켰고, 가능한 부산물인 석시네이트의 생산을 막고, 락테이트 생산 증가에 효과가 있다고 알려진 frdB (퓨마레이트 리덕테이즈, fumarate reductase) 유전자 또한 결실시켰다. 그리고 락테이트와 글라이콜레이트가 Pct540 효소에 의하여 락틸-CoA 및 글라이콜릴-CoA로 전환될 시 Coenzyme A 제공역할을 해주는 아세틸코에이 (acetyl-CoA)의 풀을 늘리며 대장균 발효 부산물인 에탄올의 생산을 막고자 adhE 유전자 또한 결실시켜 X15 균주를 제작하였다. 이렇게 완성된 X15 균주의 경우 1.06 g/L의 글라이콜레이트를 생산하였다 (도 3).
하지만 이 경우 락테이트가 생산되지 않았으므로 락테이트 생산 증대를 위하여 파이루베이트를 락테이트로 전환시켜주는 효소인 락테이트 디하이드로제네이즈 (lactate dehydrogenase)에 해당하는 ldhA 유전자의 기존 프로모터를 더 강한 trc 프로모터로 치환시켜 X15-p 균주를 제작하였다. 그 결과 미량 증가하여 최대 0.07 g/l 락테이트가 생산되는 것을 확인하였다 (도 3). 보다 강한 락테이트 플럭스 유지가 PLGA 생산에 중요한 것으로 생각되며, 시간에 따른 락테이트의 감소를 막고자하였다. 대장균은 ldhA 이외에 dld 라는 다른 락테이트 디하이드로제네이즈를 코딩하는 유전자를 가지고 있는데, 이것이 락테이트를 다시 파이루베이트로 전환할 것이라 추측하여 해당 유전자를 결실시켜 X15ld 균주를 제작하였다. X15ld 균주의 경우 락테이트가 0.67 g/L로 생산량이 크게 증가하였을 뿐만 아니라 배양 시간에 따라 감소하는 경향이 사라졌고, 동시에 글라이콜레이트도 0.95 g/L로 생산하는 균주가 완성되었다 (도 3).
따라서, 본 발명은 일 양태에서, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 및 자일로즈 디하이드로제네이즈 와 자일로노락토네이즈를 코딩하는 유전자가 삽입되고, 글루코즈 PTS 효소 IIBC 컴포넌트를 코딩를 코딩하는 유전자 (ptsG), aldehyde-alcohol dehydrogenase를 코딩하는 유전자 (adhE), pyruvate-formate lyase 코딩하는 유전자 (pflB), fumarate reductase 코딩하는 유전자 (frdB), pyruvate oxidase 코딩하는 유전자 (poxB), lactate dehydrogenase (dld), 말레이트 신세이즈 (malate synthase)를 코딩하는 유전자 (aceB), 글라이콜레이트 옥시데이즈(glycolate oxidase)를 코딩하는 유전자 (glcDEFG), 또다른 말레이트 신세이즈를 코딩하는 유전자 (glcB)가 결실되고, 락테이트 디하이드로제네이즈를 코딩하는 유전자(ldhA)의 크로모좀상의 프로모터가 trc 프로모터로 치환되어 있는 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트) 공중합체 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제조하였다.
다른 관점에서, 본 발명은 피루브산으로부터 락틸-CoA 생성능을 가지는 미생물에서, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자, 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 자일로즈 디하이드로제네이즈를 코딩하는 유전자, 자일로노락토네이즈를 코딩하는 유전자, 베타-케토사이올레이즈(beta-ketothiolase)를 코딩하는 유전자 및 아세토아세틸-CoA 리덕테이즈 (acetoacetyl-CoA reductase)를 코딩하는 유전자가 되입되어 있는 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-3-하이드록시뷰트레이트) 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-3-하이드록시뷰트레이트) 의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-3-하이드록시뷰트레이트)의 제조방법은 (a) 상기 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-3-하이드록시뷰트레이트)생성능을 가지는 재조합 미생물을 배양하여 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-3-하이드록시뷰트레이트)를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 폴리(락테이트-co-3-하이드록시뷰트레이트)를 수득하는 단계를 포함하고, 상기 배양의 탄소원으로는 자일로스 단독 또는 자일로즈와 글루코오스를 동시에 공급하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소는 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase 또는 하기에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 PHA synthase의 변이효소인 것을 특징으로 할 수 있다:
서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, S477G, S477F, S477Y, S477G 및 Q481K로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열;
서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(PhaC1202); 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S325T 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(PhaC1301); 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(PhaC1310); 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, S477G 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(PhaC1437); 및 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, S477F 및 Q481R이 변이된 아미노산 서열(PhaC1439).
본 발명에 있어서, 상기 프로피오닐-CoA 전이효소는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 Pct540 효소인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 글루코즈 PTS 효소 IIBC 컴포넌트를 코딩하는 유전자, 알데하이드-알콜 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자, 피루베이트-포메이트 라이에이즈를 코딩하는 유전자 및 푸마레이트 리덕타아제(fumarate reductase)를 코딩하는 유전, 피루베이트 옥시데이즈(pyruvate oxidase), 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자인 dld 유전자 및 말레이트 신세이즈 (malate synthase)를 코딩하는 유전자 및 글라이콜레이트 옥시데이즈(glycolate oxidase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 유전자가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 피루브산으로부터 락틸-CoA 생성능을 가지는 미생물에서, 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자, 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자 자일로즈 디하이드로제네이즈를 코딩하는 유전자, 자일로노락토네이즈를 코딩하는 유전자, CoA-의존 석시네이트 세미알데하이드 디하이드로제네이즈 (succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 4-하이드록시뷰트레이트 디하이드로제네이즈 (4-hydroxybutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는, 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-4-하이드록시뷰트레이트) 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-4-하이드록시뷰트레이트) 의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-4-하이드록시뷰트레이트)의 제조방법은 (a) 상기 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-4-하이드록시뷰트레이트) 생성능을 가지는 재조합 미생물을 배양하여 폴리(락테이트-글라이콜레이트-co-4-하이드록시뷰트레이트)를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-4-하이드록시뷰트레이트)를 수득하는 단계를 포함하고,상기 배양의 탄소원으로는 자일로스 단독 또는 자일로즈와 글루코오스를 동시에 공급하는 것을 특징으로 할 수 있다. 아울러, 배양 시에 이소루신 및/또는 프리커서로서 2-하이드록시아이소발러레이트를 첨가할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소는 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase 또는 하기에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 PHA synthase의 변이효소인 것을 특징으로 할 수 있다:
서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, S477G, S477F, S477Y, S477G 및 Q481K로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열;
서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(PhaC1202); 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S325T 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(PhaC1301); 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(PhaC1310); 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, S477G 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(PhaC1437); 및 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, S477F 및 Q481R이 변이된 아미노산 서열(PhaC1439).
본 발명에 있어서, 상기 프로피오닐-CoA 전이효소는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 Pct540 효소인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 글루코즈 PTS 효소 IIBC 컴포넌트를 코딩하는 유전자, 알데하이드-알콜 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자, 피루베이트-포메이트 라이에이즈를 코딩하는 유전자 및 푸마레이트 리덕타아제(fumarate reductase)를 코딩하는 유전, 피루베이트 옥시데이즈(pyruvate oxidase), 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자인 dld 유전자 및 말레이트 신세이즈 (malate synthase)를 코딩하는 유전자 및 글라이콜레이트 옥시데이즈(glycolate oxidase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 유전자가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 "결실" 이란 유전자의 치환, 삭제, 변이를 통하여 유전자가 코딩하는 단백질이 원래의 기능을 하지 못하는 상태가 되도록 조작하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 글루코즈 PTS 효소 IIBC 컴포넌트를 코딩를 코딩하는 유전자 (ptsG)의 결실을 통하여 자일로즈와 글루코즈가 동시에 탄소원으로 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 락테이트 디하이드로제네이즈 (ldhA)의 크로모좀상의 프로모터가 trc 프로모터로 치환되고, 락테이트 디하이드로제네이즈를 코딩하는 유전자(dld)가 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 말레이트 신세이즈 (malate synthase)를 코딩하는 유전자 (aceB), 글라이콜레이트 옥시데이즈(glycolate oxidase)를 코딩하는 유전자 (glcDEFG), 또다른 말레이트 신세이즈를 코딩하는 유전자 (glcB)가 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는 자연상태에서 생산되지 않는 폴리머인 PLGA를 생산하는 대장균 균주를 개발하였으며, 대장균의 대사경로를 조작하여, 다양한 단량체 분획을 가지는 PLGA를 고농도로 생산하도록 하였다. 또한 외부로부터 프리커서 공급 없이 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-3-하이드록시뷰트레이트), 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-4-하이드록시뷰트레이트), 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-2-하이드록시뷰트레이트)를 생산하는 단계 및 상기 생산된 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트) 공중합체를 수득하는 단계를 포함하는 공중합체의 제조방법에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 상기 재조합 미생물을 하이드록시카복시산의 존재하에 배양하여 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-하이드록시카복시산)를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-하이드록시카복시산)를 수득하는 단계를 포함하는 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-하이드록시카복시산)의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 하이드록시카복시산은 2-하이드록시아이소발러레이트, 5-하이드록시발러레이트 및 6-하이드록시헥사노에이트로구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트) 생성능을 가진 재조합 미생물로부터 여러가지 프리커서를 공급하여 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-2-하이드록시아이소발러레이트), 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-5-하이드록시발러레이트), 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-6-하이드록시헥사노에이트)를 생산 및 수득하는 단계를 포함한 제조 방법을 제공한다.
본 발명이 일양태에서, Pct540 Cp , PhaC1437Ps6-19 및 C. crescentus의 자일로즈 디하이드로제네이즈와 자일로노락토네이즈를 발현하는 재조합 대장균 X17ld-p 균주는 폴리(68.4 mol% 락테이트-co-31.6 mol% 글라이콜레이트)를 4.5 중량%로 생산하였으며, 이는 대사공학적으로 재조합된 대장균에서 자일로즈를 주 탄소원으로 이용하여 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트)를 생산한 첫번째 결과이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: PLGA 생산에 관여하는 유전자들의 플라스미드 제작 및 균주, 배양 방법
하기 실시예에서 사용한 균주, 플라스미드 및 프라이머를 표 1과 표 2에 나타내었다.
1-1: 플라스미드 pTacxylBC의 제작
KCTC로부터 구입한 Caulobacter crescentus 균주의 크로모좀으로부터 자일로즈 디하이드로제네이즈 (xylose dehydrogenase)를 코딩하는 유전자인 xylB, 자일로노락토네이즈 (xylonolactonase)를 코딩하는 유전자인 xylC가 오페론 형태로 존재하고 있으므로, xylBC 유전자를 표 2에 기재한 xylBC_F 및 xylBC_R 프라이머를 이용하여 동시에 PCR을 통해 증폭한 후, pTac15k 벡터(표 1)에 EcoRI, PstI 제한 효소 사이트를 이용하여 클로닝하여 tac 프로모터 하에서 발현하도록 제작하였다.
1-2: 플라스미드 pTacxylBC_phaAB의 제작
Ralstonia eutropha(KCTC No. 22469) 유래의 phaCAB 오페론과 그 프로모터를 클로닝한 pCnCAB 벡터를 주형으로 두 프라이머를 (Pcncab_invF, Pcncab_invR) 이용하여 inverse PCR 방법을 통해 phaC가 제거된 pCnAB 벡터를 구축하였다. pCnAB 플라스미드로부터 R. eutropha PHA 생합성 프로모터와 phaAB 유전자를 두 프라이머를 (phaAB_F, phaAB_R) 이용한 PCR로 증폭시킨 후 SphI 제한 효소 사이트를 이용하여 pTacxylBC 벡터에 클로닝하여 pTacxylBC_phaAB 벡터를 제작하였다.
1-3: 플라스미드 pTacxylBC_s4D의 제작
두 프라이머 (s4D_F, s4D_R primers)를 이용하여 pTrc99s4 플라스미드로부터 trc promoter-sucD-4hbD에 해당하는 DNA를 PCR을 통해 증폭시킨 후 SphI 제한 효소 사이트를 이용하여 pTacxylBC 플라스미드에 클로닝하였다.
1-4: 배양 조건 및 분석 방법
본 발명의 실시예에서 재조합 대장균에서, PLGA 공중합체를 생산하기 위하여 사용되는 100mM MOPS 첨가 MR 배지는 1L 당, 6.67 g KH2PO4, 4 g (NH4)2HPO4, 0.8 g MgSO4◎H2O, 0.8 g citric acid, 0.8 g/l의 MgSO4·H2O, 100mM (3-morpholinopropane-1-sulfonic acid) MOPS 및 5 ml trace metal 용액을 함유하고, 상기 trace metal 용액은 1L 당, 0.5 M HCl: 10 g FeSO4·H2O, 2 g CaCl2, 2.2 g ZnSO4·H2O, 0.5 g MnSO4·H2O, 1 g CuSO4·H2O, 0.1 g (NH4)6Mo7O24·H2O, and 0.02 g Na2B4O7·10H2O를 함유한다.
각 균주 배양에 있어서, 종균배양은 5mL LB 배지가 첨가된 25mL 튜브에서 30℃로 하룻밤 진탕배양하였으며, 1mL의 배양액을 10g/L의 자일로즈와 10g/L의 글루코즈를 함유하는 100 mL의 100mM MOPS 첨가 MR 배지를 함유하는 250 mL 플라스크에 접종하여 30℃에서 96시간 동안 진탕배양하였다.
trc 프로모터에 의해 조절받는 ldhA 유전자의 발현을 위하여, OD600수치가 0.4-0.6일 때, 1mM IPTG를 첨가하였다. 필요에 따라, 50 μg/mL의 앰피실린, 30 μg/mL 카나마이신 및 10μg/mL의 티아민을 배지에 첨가해 주었다.
본 발명에서 사용된 재조합 균주 및 플라스미드의 유전적 특징을 표 1에 나타내었으며, 본 발명에서 재조합 균주 및 플라스미드 제작에 사용된 프라이머를 표 2에 나타내었다.
사용된 균주와 플라스미드
균주 또는 플라스미드 특징 a 인용문헌 또는 입수처
균주
XL1-Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F' proAB lacI q ZΔM15 Tn10 (TetR)] Stratageneb
X15 XL1-Blue ΔadhE ΔpflB ΔfrdB ΔpoxB 본 발명
X15l XL1-Blue ΔadhE ΔpflB ΔfrdB ΔpoxB PldhA::Ptrc 본 발명
X15ld XL1-Blue ΔadhE ΔpflB ΔfrdB ΔpoxB PldhA::Ptrc Δdld 본 발명
XB-p XL1-Blue ΔptsG 본 발명
X15-p XL1-Blue ΔadhE ΔpflB ΔfrdB ΔpoxB ΔptsG 본 발명
X15l-p XL1-Blue ΔadhE ΔpflB ΔfrdB ΔpoxB ΔptsG PldhA::Ptrc 본 발명
X15ld-p XL1-Blue ΔadhE ΔpflB ΔfrdB ΔpoxB ΔptsG PldhA::Ptrc Δdld 본 발명
X17ld-p XL1-Blue ΔadhE ΔpflB ΔfrdB ΔpoxB ΔptsG PldhA::Ptrc Δdld ΔaceB ΔglcDEFGB 본 발명
X15ld-pi XL1-Blue ΔadhE ΔpflB ΔfrdB ΔpoxB ΔptsG PldhA::Ptrc Δdld ΔilvA 본 발명
X17ld-pyg XL1-Blue ΔadhE ΔpflB ΔfrdB ΔpoxB ΔptsG PldhA::Ptrc Δdld ΔaceB ΔglcDEFGB ΔyneI ΔgabD 본 발명
플라스미드
pTac15k pACYC177 derivative, p15A origin, tac promoter, KmR 1
pTacxylBC pTac15k derivative; tac promoter, xylBC from Caulobacter crescentus, KmR 본 발명
pTacxylBC_phaAB pTacxylBC derivative; tac promoter, xylBC from Caulobacter crescentus, R. eutropha PHA biosynthesis operon promoter, phaAB from R. eutropha, KmR 본 발명
pTacxylBC_s4D pTacxylBC derivative; tac promoter, xylBC from C. crescentus, trc promoter sucD, 4hbD from Clostridium kluyveri, KmR 본 발명
pPs619C1437Pct540 pBluescript II KS(+) derivative, Ralstonia eutropha PHA biosynthesis operon promoter, Pseudomonas sp. MBEL 6-19 phaC P s6-19 variant(phaC1437; E130D, S325T, S477G, Q481K), Clostridium propionicum pct Cp variant (pct540; V193A, silent mutations: T78C, T669C, A1125G, T1158C), transcriptional terminator of the R. eutropha PHA biosynthesis operon, ApR 2
pPs619C1wtPct540 pPs619C1437Pct540 derivative, phaC1437 was replaced by phaC1 Ps 6-19wildtype,ApR 2
pPs619C1202Pct540 pPs619C1437Pct540 derivative, phaC1437 was replaced by phaC1202 (E130D,Q481K), ApR 2
pPs619C1301Pct540 pPs619C1437Pct540 derivative, phaC1437 was replaced by phaC1301 (E130D,S325T, Q481K), ApR 2
pPs619C1310Pct540 pPs619C1437Pct540 derivative, phaC1437 was replaced by phaC1310 (E130D, S477F, Q481K), ApR 2
pPs619C1439Pct540 pPs619C1437Pct540 derivative, phaC1437 was replaced by phaC1439 (E130D, S325T, S477F, Q481K), ApR 2
pCnCAB pBluescript II KS(+) derivative, Ralstonia eutropha PHA biosynthesis operon promoter, R. eutropha phaCAB genes, transcriptional terminator of the R. eutropha PHA biosynthesis operon, ApR 3
pCnAB pCnCAB14derivative, R. eutropha PHA biosynthesis operon promoter, R. eutropha phaAB, ApR 본 발명
ptrc99s4D trc promoter, sucD, 4hbD from Clostridium kluyveri, ApR 랩 스탁
aAp: ampicillin; Km: kanamycin; R: resistance. bStratagene Cloning System, La Jolla, CA, USA. c, 1. US 20130078673 A1 2. Yang, T.H. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 90, 603-614 (2011). 3. Yang, T.H. et al. Biotechnol. Bioeng. 105, 150-160 (2010).
본 발명에서 사용된 프라이머 시퀀시퀀스
Cloning 이름(#서열번호) 서열
xylBC xylBC_F(#5) agacaggaattcatgtcctcagccatctatcccag
xylBC_R(#6) agacagctgcagttagacaaggcggacctcatg
phaAB Pcncab_invF(#7) atgactgacgttgtcatcgtatcc
Pcncab_invR(#8) gatttgattgtctctctgccgtc
phaAB_F(#9) agacaggcatgccgggcaagtaccttgcc
phaAB_R(#10) agacaggcatgctcagcccatatgcaggcc
s4D s4D_F(#11) agacag gcatgc ttgacaattaatcatccggctc
s4D_R(#12) agacag gcatgc ttaatataactttttatatgtgtttactatgtc
Knockout
frdB frdB_KOF(#13) gcggaagcagccaataagaaggagaaggcgaatggctgagatgaaaaaccgacactatagaacgcggccg
frdB _KOR(#14) gacgtgtttcgggcagacttcggagcagtagcccacgaaagtacagctccccgcataggccactagtgga
frdB _EXF(#15) tgccgccagctaaacgcgtttacggtggcgaagcggatgcagccgataaggcggaagcagccaataagaa
frdB _EXR(#16) aagtctttcgaactttctactttgccctgctgaatggccgcagccggatcgacgtgtttcgggcagactt
poxB poxB_KOF(#17) tttctctcccatcccttccccctccgtcagatgaactaaacttgttaccggacactatagaacgcggccg
poxB _KOR(#18) gcgcagcatatacaggctgaaacctttggcctgttcgagtttgatctgcgccgcataggccactagtgga
poxB _EXF(#19) tatgcccgatgatattcctttcatcgggctatttaaccgttagtgcctcctttctctcccatcccttccc
poxB _EXR(#20) tttgttttcgccagttcgatcacttcatcaccgcgtccgctgatgattgcgcgcagcatatacaggctga
adhE adhE_KOF(#21) tgaacttaacgcactcgtagagcgtgtaaaaaaagcccagcgtgaatatggacactatagaacgcggccg
adhE_KOR(#22) gcttttttctcagctttagccggagcagcttctttcttcgctgcagtttcccgcataggccactagtgga
adhE_EXF(#23) aaaaaagtttaacattatcaggagagcattatggctgttactaatgtcgctgaacttaacgcactcgtagag
adhE_EXR(#24) aggggccgtttatgttgccagacagcgctactgattaagcggattttttcgcttttttctcagctttagccg
pflB pflB_KOF(#25) taccaaaggtgactggcagaatgaagtaaacgtccgtgacttcattcagagacactatagaacgcggccg
pflB_KOR(#26) gcgagttgaaacgtactgcgtagccagatacacggatggtcagctgcggaccgcataggccactagtgga
pflB_EXF(#27) tgttacatgtccgagcttaatgaaaagttagccacagcctgggaaggttttaccaaaggtgactggcaga
pflB_EXR(#28) agattgagtgaaggtacgagtaataacgtcctgctgctgttctttagtcagcgagttgaaacgtactgcg
aceB aceB_KOF(#29) ccttcgttcacagtggggaagttttcggatccatgacgaggagctgcacggacactatagaacgcggccg
aceB_KOR(#30) aatttgttgtgtacgggttttcatgtgcagatgctccatagttatgtggtggtccgcataggccactagtgga
aceB_EXF(#31) cattttaaatgagtagtcttagttgtgctgaacgaaaagagcacaacgatccttcgttcacagtgggga
aceB_EXR(#32) aatgccttcccaacgcggttgagtccactctttctgtaattcttcaatttgttgtgtacgggttttcatg
glcDEFGB glcDEFGB_KOF(#33) cagcgcgcaaaaatcagctgccacacaacacaacaaagcgaagcctactcgacactatagaacgcggccg
glcDEFGB_KOR(#34) cagttactatcatagccccgacaataaaacttgccggggcttttttgacgctaccgcataggccactagtgga
glcDEFGB_KOExF(#35) gctaaagagatagacgaaaacgaaaagcccgcttaataactgttcacagaagcagcgcgcaaaaatcagc
glcDEFGB_KOExR(#36) aaaccctgataatcgctccggttatttccgggataaatgtactaccgcagttactatcatagccccgaca
ptsG ptsG_F(#37) cctgtacacggcgaggctctccccccttgccacgcgtgagaacgtaaaaagacactatagaacgcggccg
ptsG_R(#38) gtaaaaaaggcagccatctggctgccttagtctccccaacgtcttacggaccgcataggccactagtgga
ptsG_exF(#39) tggcactgaattattttactctgtgtaataaataaagggcgcttagatgccctgtacacggcgaggctct
ptsG_exR(#40) caccgcgtaatttcagcattaccggcacgtatcaattctgaataacacctgtaaaaaaggcagccatctgg
ilvA ilvA_F(#41) cggtgcgcgataaatcgaaactggggggttaataatggctgactcgcaacgacactatagaacgcggccg
ilvA_R(#42) gcatttttccctaacccgccaaaaagaacctgaacgccgggttattggttccgcataggccactagtgga
ilvA_exF(#43) ctttgccctgcgtgcttatgccagcctggcaaccagcgccgacaaaggcgcggtgcgcgataaatcgaaa
ilvA_exR(#44) cacaaatgacgttgtcgcgcgggtaggcctgataagcgaagcgctatcaggcatttttccctaacccgcc
yneI yneI_F(#45) gcgtatcttcataccatgactcataaaggagataccccgatgaccattacgacactatagaacgcggccg
yneI_R(#46) accgcaggtctgaaaagacctgcgagtatatcagagctgaatatgtcgcgccgcataggccactagtgga
yneI_exF(#47) ttcgtgaataagtggcttaatattattcattttaaagcaagagtaaatctgcgtatcttcataccatgactca
yneI_exR(#48) tgttttctaaaattgcattatccatggcgactgccactttctactcctggaccgcaggtctgaaaagacc
gabD gabD_F(#49) tgccttacacgccgcatttaatcaataacctttgaaaacaggatgtagcggacactatagaacgcggccg
gabD_R(#50) gactgcggcgctgcattaactctttattgctgttcattcgcattctccagccgcataggccactagtgga
gabD_exF(#51) gcaagccagagtaaccccggacgcacgctgcgagcggcacgtagtgtggatgccttacacgccgcattta
gabD_exR(#52) gcgcggtcagcgaaaatcgggtgaatttgcccaacgccacggggaatcgcctgactgcggcgctgcatta
promoter
ldhA ldhApc_F(#53) agaataatcagtaataacagcgcgagaacggctttatatttacccagcatgacactatagaacgcggccg
ldhApc_R(#54) ctgttgcaggtacttcttgtcgtactgttttgtgctataaacggcgagtttcatggtctgtttcctgtgtgaa
ldhApc_exF(#55) cgtgggaacccacagcccgagcgtcatcagcagcgtcaacggcacaagaataatcagtaataacagcgcg
ldhApc_exR(#56) cagcagaaagtcaaaaaattccagctcaaagccaaaggactcgttcacctgttgcaggtacttcttgtcg
자일로즈와 글루코즈, 피루브산, 아세트산, 포름산, 락테이트, 숙시네이트를 포함하는 대사산물은 UV/VIS(Varian ProStar 320, USA) 및 refractive index(Shodex RI-71, 일본)가 장착된 HPLC(Varian ProStar 210, USA)로 MetaCarb 87H 컬럼(300 x 7.8mM)을 사용하여 분석하였다. 세포 성장은 600nm 흡광도에서 Ultraspec 300 스펙트로포토메타(Amersham Bioscience, 스웨덴)를 사용하여 측정하였다.
세포 내 고분자 농도와 성분 분석은 가스 크로마토그래피를 (Agilent 7683 자동 인젝터, flame ionization 디텍터, fused 실리카 capillary 컬럼 (ATTM-Wax, 30 m, ID 0.53mm, 필름 두께 1.20m, Alltech, Deerfield, IL, USA)이 장착된 Agilent 6890N) 사용하여 측정하였다.
실시예 2: PHA 합성효소, 프로피오닐-CoA 전이효소를 발현시킨 재조합 대장균에서의 글라이콜레이트 포함 고분자 생성 확인
본 실시예에서는 글라이콜레이트를 포함하는 PHA 생산 재조합 대장균을 제작하기 위하여, 삽입될 유전자를 확인하였다.
Clostridium propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소에서 V193A 변이와 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C의 4가지 침묵 변이를 가지는 효소(Pct 540)를 선택하여 글라이콜레이트가 글라이콜릴-CoA로 전환될 수 있게 하였고 해당 효소는 in vitro 활성 측정을 진행하여 확인하였다.
다음으로, PHA 합성 효소 선택에 있어서는 높은 락테이트 분획을 가지는 폴리(락테이트-co-3-하이드록시뷰트레이트) 공중합체를 생산하는 Pseudomonas sp. 6-19 유래의 PHA 합성 효소 야생형의 PhaC1과 변이 효소 5종, PhaC1202 (E130D, Q481K), PhaC1301 (E130D, S325T, Q481K), PhaC1310 (E130D, S477F, Q481K), PhaC1437 (E130D, S325T, S477G 및 Q481K), PhaC1439 (E130D, S325T, S477F, Q481K) 테스트를 진행하였다. 글라이콜레이트가 세포 내 고분자로 합성되는 정도를 확인하기 위하여, 배지에 프리커서로 2g/L 농도로 소듐 글라이콜레이트를 첨가하였고, 동시에 PHA 활성효소가 선호하는 기질인 3-하이드록시뷰트레이트-CoA를 제공해주어 고분자 생산을 촉진시키기 위하여 2g/L의 소듐 3-하이드록시뷰트레이트를 첨가하였다. 상기 배지에서 배양된 형질전환된 재조합 대장균 XL1-Blue 균주로부터 생산된 고분자 분석 결과를 표 3에 나타내었다.
재조합 대장균이 생산하는 공중합체의 조성 및 농도
재조합 균주 폴리머 조성 a (mol%) 폴리머 농도
(wt%)
LA GA 3HB
XL1-Blue /pPs619CwtPct540 0 40.1 59.9 1.9
XL1-Blue /pPs619C1202Pct540 27.0 6.9 66.1 55.0
XL1-Blue /pPs619C1301Pct540 28.9 9.6 61.5 56.7
XL1-Blue /pPs619C1310Pct540 37.2 11.0 51.8 19.7
XL1-Blue /pPs619C1437Pct540 31.6 17.2 51.2 46.6
XL1-Blue /pPs619C1439Pct540 25.6 8.2 66.2 49.4
aLA: 락테이트, GA: 글라이콜레이트, 3HB: 3-하이드록시뷰트레이트
상기 유전자들 중, 야생형의 PhaC1을 제외한 나머지 변이 효소들에 대해서는 글라이콜레이트와 락테이트가 포함된 고분자가 생성됨을 확인하였으며, PhaC1437 변이 효소의 경우 상대적으로 가장 높은 글라이콜레이트와 락테이트 함량을 가진 고분자를 생성하였으므로, 향후 실험은 PhaC1437을 이용하여 진행하였다.
실시예 3: 자일로즈를 탄소원으로 이용하는 대장균의 대사조작을 통한 PLGA의 생산
실시예 2에서 대장균 XL1-Blue 균주가 외부에서 첨가하여준 글라이콜레이트를 PhaC1437과 Pct540에 의하여 세포 내에서 고분자로 전환할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 실시예 3에서는 글라이콜레이트의 외부 첨가 없이 자일로즈와 같은 바이오매스 유래 탄소원으로부터 직접 PLGA를 생산하고자 대장균 균주 조작을 수행하였다. 대장균 XL1-Blue 균주의 경우 글라이옥실레이트 (gloxylate)를 거쳐 글라이콜레이트가 생성되는 대사회로에 해당하는 유전자를 가지고 있지만, 배양 시 글라이콜레이트를 자연적으로 생산하지 않는 것을 확인하였고, 따라서 글라이콜레이트 대사회로 강화 및 대사 흐름 최적화를 진행하였다.
대장균 내에 글라이콜레이트를 생산할 수 있는 대사회로를 살펴보면, TCA cycle을 이루는 대사체인 아이소시트레이트 (isocitrate)가 글라이옥실레이트로 전환된 후 (glyoxylate shunt) 글라이옥실레이트가 글라이옥실레이트 효소에 의하여 글라이콜레이트로 전환되어진다. 즉 아이소시트레이트 마디에서 아이소시트레이트 라이에이즈 (isocitrate lyase) 효소에 의해 글라이옥실레이트로 전환되거나, 아이소시트레이트 디하이드로제네이즈 (isocitrate dehydrogenase) 효소에 의해 2-케토글루타레이트 (2-ketoglutarate)로 전환되어 TCA cycle로 흐르게 된다. 이러한 대사 흐름 기작은 아이소시트레이트 디하이드로제네이즈의 phosphorylation / dephosphorylation에 의하여 활성이 조절되며 여러 가지 regulator에 의해 조절되어진다. 이러한 대사회로를 이용하여 글루코즈로부터 PLGA를 생산하는 시도가 특허에서 (US 8,883,463 B2) 이루어졌다.
본 발명에서는 자일로즈를 주 탄소원으로 이용하여 고농도의 PLGA를 생산하는 대장균을 제작하고자 하였는데, 자일로즈로부터 댐스 대사회로 (Dahms pathway)라고 불리는 자일로즈 이용 회로로부터 글라이콜레이트가 생산될 수 있다는 것에 착안하였다.
댐스 대사회로는 Caulobacter와 같은 균주가 자일로즈를 탄소원으로 이용 시 자일로노락톤 (xylonolactone), 자일로네이트 (xylonate), 2-디하이드로-3-디옥시펜토네이트 (2-dehydro-3-deoxy-pentonate)로 차례로 전환된 후 알돌레이즈 (aldolase) 효소에 의해 글라이콜알데하이드 (glycolaldehyde)와 파이루베이트 (pyruvate)로 나누어지고, 글라이콜알데하이드는 알데하이드 디하이드로제네이즈 (aldehyde dehydrogenase)에 의해 글라이콜레이트로 전환된다 (도 1의 B 참고). 대장균의 경우 xylose를 탄소원으로 이용할 때 transporter에 의해 셀 내부로 들어온 후 댐스 대사회로가 아닌 자일로즈 아이소머레이즈 (xylose isomerase), 자일룰로즈 (xylulose) 효소에 의해 전환되어 펜토즈 포스페이트 대사회로 (pentose phosphate pathway)를 통해 대사되어진다. 따라서 댐스 대사회로를 이용하는 미생물로부터 외래 유전자를 도입하여 대장균 내에 댐스 대사회로를 구축하고자 하였다. 대장균에 경우 댐스 대사회로의 다운스트림을 이루는 효소가 존재한다고 알려져있으므로 업스트림에 해당하는 자일로즈 디하이드로제네이즈 (xylose dehydrogenase) 및 자일로노락토네이즈 (xylonolactonase)를 Caulobacter crescentus의 크로모좀으로부터 증폭하여 pTacxylBC 플라스미드를 제작하였다. 대장균 XL1-Blue 균주에 pTacxylBC 벡터를 형질전환시킨 후 MR 배지에 xylose 단일 탄소원으로 (20g/l) 배양한 결과 0.89 g/L의 글라이콜레이트 생산되었다.
PLGA 또 다른 단량체인 락테이트는 파이루베이트를 전구체로 만들어지기 때문에 파이루베이트가 각각 아세테이트, 포메이트로 전환되어 락테이트로의 플럭스를 감소시키지 않는 것이 중요하다. 따라서 해당 유전자인 poxB (파이루베이트 옥시데이즈, pyruvate oxidase)와 pflB (파이루베이트-포메이트 라이에이즈, pyruvate-formate lyase)를 결실 시켰고, 가능한 부산물인 석시네이트의 생산을 막고, 락테이트 생산 증가에 효과가 있다고 알려진 frdB (퓨마레이트 리덕테이즈, fumarate reductase) 유전자 또한 결실시켰다. 그리고 락테이트와 글라이콜레이트가 Pct540 효소에 의하여 락틸-CoA 및 글라이콜릴-CoA로 전환될 시 Coenzyme A 제공역할을 해주는 아세틸코에이 (acetyl-CoA)의 풀을 늘리며 대장균 발효 부산물인 에탄올의 생산을 막고자 adhE 유전자 또한 결실시켜 X15 균주를 제작하였다. 이렇게 완성된 X15 균주의 경우 1.06 g/L의 글라이콜레이트를 생산하였다 (도 3).
하지만 이 경우 락테이트가 생산되지 않았으므로 락테이트 생산 증대를 위하여 파이루베이트를 락테이트로 전환시켜주는 효소인 락테이트 디하이드로제네이즈 (lactate dehydrogenase)에 해당하는 ldhA 유전자의 기존 프로모터를 더 강한 trc 프로모터로 치환시켜 X15-p 균주를 제작하였다. 그 결과 미량 증가하여 최대 0.07 g/l 락테이트가 생산되는 것을 확인하였다 (도 3). 보다 강한 락테이트 플럭스 유지가 PLGA 생산에 중요한 것으로 생각되며, 시간에 따른 락테이트의 감소를 막고자하였다. 대장균은 ldhA 이외에 dld 라는 다른 락테이트 디하이드로제네이즈를 코딩하는 유전자를 가지고 있는데, 이것이 락테이트를 다시 파이루베이트로 전환할 것이라 추측하여 해당 유전자를 결실시켜 X15ld 균주를 제작하였다. X15ld 균주의 경우 락테이트가 0.67 g/L로 생산량이 크게 증가하였을 뿐만 아니라 배양 시간에 따라 감소하는 경향이 사라졌고, 동시에 글라이콜레이트도 0.95 g/L로 생산하는 균주가 완성되었다 (도 3).
X15ld 균주에 XylBC, PhaC1437, Pct540을 모두 발현한 결과 전체 건조 균체 무게의 3.1 중량% 농도에 해당하는 고분자가 생산되었으며 락테이트와 글라이콜레이트 각각 63.8 mol%, 34.9 mol% 포함되는 PLGA 유사 고분자가 생산되었다 (표 4). 그러나 예상과 다르게 2-하이드록시뷰트레이트 (2-hydroxybutyrate)가 미량 포함된 고분자가 생성되었으므로 이를 해결하기 위해 대장균 내에 2-하이드록시뷰트레이트가 생성될 수 있는 경로로 여겨지는 2-케토뷰트레이트 생합성 대사회로를 차단하고자 하였다. 쓰레오닌을 2-케토뷰트레이트로 전환시켜주는 효소인 쓰레오닌 디하이드라테이즈 (threonine dehydratase)를 코딩하는 두 개의 유전자 중 (ilvA, tdcB), 호기성 배양에서 주요 역할을 하는 것으로 알려진 ilvA의 경우 아이소루신에 의해 활성이 억제된다 (feedback inhibition). 따라서 상기 재조합 대장균을 5mM 농도의 아이소루신이 첨가된 배지에 배양하였고 그 결과 건조 균체 무게의 1. 8 중량% 농도에 해당하는 74.5 mol%, 23.7 mol%의 PLGA 생산을 확인하였다 (표 4).
재조합 대장균이 생산하는 PLGA 공중합체의 조성 및 농도
재조합 균주 a 폴리머 조성 b (mol%) 폴리머 농도
(wt%)
LA GA 2HB
X15ld 63.8 34.9 1.3 3.1
X15ld* 74.5 23.7 1.8 1.9
a각각의 균주의 경우 pPs619C1437Pct540, ptacxylBC로 형질전환되어 100mM MOPS 첨가 배지에서 96시간동안 배양되었다.
bLA: 락테이트, GA: 글라이콜레이트, 2HB: 2-하이드록시뷰트레이트
* 5mM 농도의 아이소루신이 첨가된 배지에서 배양
실시예 4: 자일로즈와 글루코즈를 동시에 이용하는 대장균 개발 및 PLGA 생산능 확인
실시예 3에서 언급한 바와 같이, 대장균 XL1-Blue 균주를 자일로즈 디하이드로제네이즈를 코딩하는 xylB 유전자와 자일로노락토네이즈를 코딩하는 xylC 유전자로 형질전환시켜 배양한 결과 0.89 g/L의 글라이콜레이트 생산되었으나, 이 경우 XylBC 발현하지 않은 컨트롤 균주와 비교할 시 느린 성장 속도 및 세포 밀도를 나타내는 OD600 값이 절반 수준으로 감소하는 결과를 보여주었다. 이러한 셀 성장 저해 문제를 해결하는 방안으로 글루코즈를 추가 탄소원으로 동시에 이용하게끔 균주를 조작하였다. 대장균은 자일로즈와 글루코즈가 동시에 주어질 경우 carbon catabolite repression이라는 기작에 의해 글루코즈를 우선 이용 후 글루코즈가 모두 소모된 이후에 자일로즈를 탄소원으로 사용한다. 이를 극복하고 두 탄소원을 동시에 이용할 수 있는 균주 개발을 위하여 글루코즈 수송 시스템에 관여하는 ptsG 유전자를 대장균 XL1-Blue 균주에서 결실시켜 XB-p 균주를 제작하였다. pTacxylBC로 형질전환시킨 XB-p 균주의 경우 글루코즈와 자일로즈를 동시에 사용할 수 있었으며, 세포 성장 수준이 XylBC를 발현시키지 않은 경우와 비슷한 수준으로 회복되었다. 또 이와 함께 글라이콜레이트 생산량도 1.82 g/L로 크게 증가되었다. 따라서 글루코즈를 추가 탄소원으로 도입하는 전략이 효과적임을 확인하여 실시 예 4에서는 두 가지 탄소원을 이용하는 균주를 구축하여 PLGA 생산능을 향상시켰다.
XB-p 균주로부터 poxB (파이루베이트 옥시데이즈, pyruvate oxidase)와 pflB (파이루베이트-포메이트 라이에이즈, pyruvate-formate lyase)를 frdB (퓨마레이트 리덕테이즈, fumarate reductase) adhE 유전자가 결실된 X15-p 균주의 경우 1.82 g/L의 글라이콜레이트를 생산하고, 배양 후반으로 갈수록 감소하지만 최대 0.99 g/L의 락테이트를 생산하였다 (도 4).
X15-p 균주를 XylBC와 PhaC1437, Pct540을 모두 발현시켜 배양하였으나 무시할 만큼의 매우 미량의 고분자만이 생산되는 것을 확인하였다. 글라이콜레이트의 경우 배양시간 동안 일정 수준이상으로 생산이 유지되지만, 락테이트의 경우 최대 0.99 g/l로 생산되지만 일정시간 이후 다시 감소하는 것을 보아 락테이트로의 플럭스 강화가 PLGA 생산에 중요할 것으로 판단되었다 (도 4).
락테이트 생산 증대를 위하여 파이루베이트를 락테이트로 전환시켜주는 효소인 락테이트 디하이드로제네이즈 (lactate dehydrogenase)에 해당하는 ldhA 유전자의 기존 프로모터가 더 강한 trc 프로모터로 치환된 X15l-p 균주에서 XylBC발현 배양시 최대 1.38 g/l 락테이트가 생산되며 락테이트 플럭스가 강화된 것을 확인하였으나 (도 5), 이전 균주와 마찬가지로 일정시간 이후 생산된 락테이트가 다시 소모되어 배양 마지막 시간에서는 배지 내에 남아있는 락테이트가 거의 없었다. 그러나 X15l-p 균주에 XylBC, PhaC1437과 Pct540을 모두 발현시켰을 경우 락테이트와 글라이콜레이트로 이루어진 고분자를 생산할 수 있었다. 이것은 락테이트가 이전 균주와 마찬가지로 특정 배양시간 이후 감소되긴 하지만 더 높은 생산량을 보여주므로, 고분자가 만들어진 것으로 보인다 (표 5).
dld 라는 다른 락테이트 디하이드로제네이즈를 추가로 결실된 X15ld-p 균 주의 경우 락테이트가 2.51 g/L로 생산량이 크게 증가하였을 뿐만 아니라 배양 시간에 따라 감소하는 경향이 사라졌고, 동시에 글라이콜레이트도 1.48 g/L로 약간 증가하여 두 화합물 모두를 배양 시간동안 일정 농도 이상 유지하며 생산하는 균주가 완성되었다 (도 5).
X15ld-p 균주에 XylBC, PhaC1437, Pct540을 모두 발현한 결과 전체 건조 균체 무게의 16.5 중량% 농도에 해당하는 고분자가 생산되었으며 락테이트와 글라이콜레이트 각각 77.6 mol%, 19.6 mol% 포함되는 PLGA 유사 고분자가 생산되었다 (표 5). 그러나 예상과 다르게 2-하이드록시뷰트레이트 (2-hydroxybutyrate)가 미량 포함된 고분자가 생성되었으므로 이를 해결하기 위해 대장균 내에 2-하이드록시뷰트레이트가 생성될 수 있는 경로로 여겨지는 2-케토뷰트레이트 생합성 대사회로를 차단하고자 하였다. 쓰레오닌을 2-케토뷰트레이트로 전환시켜주는 유전자인 쓰레오닌 디하이드라테이즈 (threonine dehydratase) 효소에 해당하는 두 개의 유전자 중 (ilvA, tdcB) 호기성 배양에서 주요 역할을 하는 것으로 알려진 ilvA 유전자를 결실시켜 아이소루신 영양요구주인 X15ld-pi 균주를 제작하였다. PhaC1437, Pct540, XylBC를 모두 발현시킨 X15ld-pi 균주의 배양 결과 2-하이드록시뷰트레이트가 포함되지 않은 89.6 mol%의 락테이트와 10.2 mol%의 글라이콜레이트로 이루어진 PLGA를 생산할 수 있었다 (표 5).
재조합 대장균이 생산하는 PLGA 공중합체의 조성 및 농도
재조합 균주 a 폴리머 조성 b (mol%) 폴리머 농도
(wt%)
LA GA 2HB
X15l-p 70.8 25.9 3.3 6.1
X15ld-p 78.5 17.8 3.7 19.0
X15ld-pi 88.2 11.8 0 12.6
a각각의 균주의 경우 pPs619C1437Pct540, ptacxylBC로 형질전환되어 100mM MOPS 첨가 배지에서 96시간동안 배양되었다.
bLA: 락테이트, GA: 글라이콜레이트, 2HB: 2-하이드록시뷰트레이트
실시예 5: 추가 대사조작을 통한 높은 글라이콜레이트 함량을 가지는 PLGA의 생산
실시예 4에서 XL1-Blue로부터 조작된 재조합 X15l-p, X15ld-p 균주를 사용하여, 자일로즈와 글루코즈로부터 PLGA를 성공적으로 생산하였으나, 상대적으로 락테이트 함량이 높은 고분자만이 생성되었다. 따라서 고분자의 글라이콜레이트의 함량을 증가시키기 위하여 세포 내 글라이콜레이트 생성을 강화시키기 위한 조작을 진행하였다 (도 5). 글리옥실레이트 경로를 증가시키기 위하여, 염색체 DNA에서 말레이트 신세이즈 (malate synthase)를 코딩하는 유전자인 aceB 및 글라이콜레이트 옥시데이즈 (glycolate oxidase)를 코딩하는 유전자 glcDEFG와 또 다른 malate synthase를 코딩하는 유전자 glcB가 오페론을 이루고 있으므로 glcDEFG을 한번에 결실시켜 X17ld-p 균주를 제작하였다. X17ld-p 균주의 경우 자일로즈 디하이드로제네이즈와 자일로노락토네이즈를 발현시켜주었을 때, 2. 32 g/L의 글라이콜레이트가 생산되었고, 이것은 이전 재조합 균주 (X15ld-p)와 비교 시 1.6 배 증가한 것으로 상기 유전자 결실이 글라이콜레이트 증가에 효과적임을 나타낸다. 대장균 X17ld-p 균주에 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 및 프로피오닐-CoA 전이효소, 자일로즈 디하이드로제네이즈와 자일로노락토네이즈를 모두 발현시켜 배양한 경우 두 모노머의 생산 비율 변화로부터 예측할 수 있듯이 글라이콜레이트 몰분율이 크게 증가하여 약 48 %의 글라이콜레이트를 포함하는 PLGA 유사 고분자가 15.0 중량% 농도로 생성되었다 (표 6). 이 경우에서도 마찬가지로 미량의 2-하이드록시뷰트레이트가 포함되었으므로 ilvA 유전자를 결실시켜 배양하였으나, 세포 성장이 매우 저해되어 충분한 양의 고분자를 생산하지 못하였다. 따라서 다른 대안으로 ilvA를 결실시키지 않고 아이소루신을 배지 내에 첨가하는 방법으로 IlvA의 활성을 저해시키고자 5 mM의 아이소루신을 배지에 첨가하여 배양하였다. 그 결과 세포 성장이 크게 저해되지 않고, 2-하이드록시뷰트레이트가 포함되지 않고, X15ld-pi 균주에 비해 글라이콜레이트가 크게 증가한, 68.4 mol%의 락테이트와 31.6 mol%의 글라이콜레이트로 이루어진 PLGA를 성공적으로 생산할 수 있었다 (표 6).
재조합 대장균이 생산하는 PLGA 공중합체의 조성 및 농도
재조합 균주 a 폴리머 조성 b (mol%) 폴리머 농도
(wt%)
LA GA 2HB
X17-ldp 50.3 48.1 1.6 15.0
X17-ldp* 68.4 31.6 - 4.5
a각각의 균주의 경우 pPs619C1437Pct540, ptacxylBC로 형질전환되어 100mM MOPS 첨가 배지에서 96시간동안 배양되었다. bLA: 락테이트, GA: 글라이콜레이트, 3HB: 2-하이드록시뷰트레이트 *해당 균주의 경우 5mM 아이소루신이 첨가된 배지에서 배양되었다.
실시예 6: 재조합 대장균에서 합성된 PLGA의 특질
본 발명에서 합성된 공중합체의 단량체 성분 분석은 가스크로마토그래피와 NMR로 분석하였으며, 중합체는 세포로부터 유기용매 추출방법(Jacquel et al., Biochem Eng J 39:15-27, 2008)의 방법으로 정제하였다. 폴리머의 분자량 및 열물성은 GPC(gel permeation chromatography)와 DSC (Differential scanning calorimetry)를 사용하여 각각 측정하였다.
대장균 X17ld-p에 의해 생산되는 PLGA는 mol% 락테이트와 mol%의 글라이콜레이트로 이루어져있으며, 1H NMR 및 13C NMR을 통해 화학적으로 합성되는 PLGA와 동일한 구조임을 확인하였다 (도 5). PLGA의 600MHz 1H NMR 스펙트럼에서 락테이트의 옥시메틴(oxymethine) 양자(-OCH-)는 5.2ppm에서 글라이콜레이트의 메틸양자(-CH3)에 해당하는 피크인 4.6~4.9 ppm 에서 피크를 확인할 수 있다 (도 6의 A). PLGA의 125MHz 13C NMR 스펙트럼에서 GA*-GA sequence의 카르보닐 카본피크는 169.4 ppm, LA*-LA and LA-LA* sequences의 카르보닐 피크는 169.63 ppm, LA*-GA + GA-LA*sequences의 카르보닐 피크는 169.80 ppm에서 나타났다 (도 6의 B).
GPC 분석을 통해 얻어진 분자량과 DSC 분석을 통해 얻어진 열물성 값은 표 5에 나타내었다. 분자량의 경우 15 kDa-25 kDa의 범위로, 약물 전달시 많이 사용되는 PLGA의 분자량에 적합하였고, DSC 그래프로부터 melting temperature (Tm)에 해당하는 피크가 관측되지 않아, 화학 합성을 통해 만들어지는 PLGA와 동일한 무정형의 PLGA가 생산됨을 알 수 있었다. glass transition temperature (Tg) 값도 40 ℃~ 46℃ 범위로 2HB가 미량 포함된 경우에도 판매되는 PLGA와 같은 범위의 온도 값을 나타내었다 (표 7).
재조합 대장균이 생산하는 PLGA 공중합체의 분자량 및 열물성
재조합 균주 a 폴리머 조성 b (mol%) 분자량 (Da) Tg(ºC)
LA GA 2HB Mn Mw Mw/Mn
X15l-p 70.8 25.9 3.3 10115 15493 1.53 40.3
X15ld-p 78.5 17.8 3.7 15270 25375 1.66 45.3
X17ld-p 50.3 48.1 1.6 6648 19125 2.88 42.3
X15ld-pi 88.2 11.8 0 15595 24446 1.57 46.0
X17ld-p* 68.4 31.6 0 9935 18026 1.81 44.1
a각각의 균주의 경우 pPs619C1437Pct540, ptacxylBC로 형질전환되어 100mM MOPS 첨가 배지에서 96시간동안 배양되었다. bLA: 락테이트, GA: 글라이콜레이트, 2HB: 2-하이드록시뷰트레이트 *해당 균주의 경우 5mM 아이소루신이 첨가된 배지에서 배양되었다.
실시예 7: 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-3-하이드록시뷰트레이트)를 생성하는 재조합 미생물 균주의 개발
3-하이드록시뷰트레이트의 경우 가장 잘 알려진 PHA 단량체로 폴리3-하이드록시뷰트레이트의 생합성 대사회로를 도입하여 락테이트와 글라이콜레이트, 3-하이드록시뷰트레이트로 이루어진 신규 고분자를 생성하는 미생물 균주를 개발하고자 하였다 (도 7). R. eutropha 유래의 베타-케토사이올레이즈를 코딩하는 유전자인 phaA와 아세토아세틸-CoA 리덕테이즈를 코딩하는 유전자인 phaB를 클로닝한 pTacxylBC_phaAB (표 1) 플라스미드와 pPs619C1437Pct540 플라스미드를 X15ld-p, X17ld-p 균주에 각각 형질전환 시켰다. 상기 균주를 5 mM 아이소루신 첨가된 100mM MOPS 첨가 MR 배지에서 96시간 배양한 결과 재조합 대장균 X15ld-p 균주의 경우 폴리(51.9 mol% 락테이트-co-7.3 mol% 글라이콜레이트-co-40.8 mol% 3-하이드록시뷰트레이트)를 29.5 중량%의 농도로 생산하였고, X17ld-p 균주의 경우 폴리(63.3 mol% 락테이트-co-13.2 mol% 글라이콜레이트-co-23.5 mol% 3-하이드록시뷰트레이트)를 20.0 중량%의 농도로 생산하였다.
실시예 8: 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-4-하이드록시뷰트레이트)를 생성하는 재조합 미생물 균주의 개발
4-하이드록시뷰트레이트를 외부 프리커서 제공없이 생산하고자 CoA-의존 석시네이트 세미알데하이드 디하이드로제네이즈 (CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자인 sucD와 4-하이드록시뷰트레이트 디하이드로제네이즈 (4-hydroxybutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자인 4hbD를 Clostridium kluyveri의 크로모좀으로부터 증폭하여 pTacxylBC_s4D 플라스미드를 제작하였다 (표 1). pTacxylBC_s4D 플라스미드와 pPs619C1437Pct540 플라스미드로 형질전환시킨 재조합 대장균 X17ld-p 균주를 5 mM 아이소루신, 100mM MOPS가 첨가된 MR 배지에서 10 g/L의 자일로즈와 10 g/L의 글루코즈를 탄소원으로 공급하였을 경우 배양 96시간 동안 폴리(61.2 mol% 락테이트-co-38.4 mol% 글라이콜레이트-co-0.4 mol% 4-하이드록시뷰트레이트)를 7.3 중량%의 농도로 생성하였다. 4-하이드록시뷰트레이트 분획을 증가시키기 위하여 석시네이트 세미알데하이드를 석시네이트로 전환하여, 4Hbd와 경쟁관계에 있는 석시네이트 세미알데하이드 디하이드로제네이즈를 코딩하는 두 유전자인 yneI과 gabD를 X17ld-p 균주로부터 결실시켜 X17ld-pyg 균주를 제작하였다 (표 1 및 도 8). X17ld-pyg 균주에 PhaC1437, Pct540, XylBC, SucD, 4HbD를 모두 발현시켜 상기 배양조건에서 배양한 결과 13.8 중량%의 농도를 가지는 폴리(67.1 mol% 락테이트-co-23.8 mol% 글라이콜레이트-co-9.1 mol% 4-하이드록시뷰트레이트)가 생산되었다. 이 때 4-하이드록시뷰트레이트 함량이 9.1 ml%로 크게 증가하여 yneI과 gabD 두 유전자 결실이 4-하이드록시뷰트레이트 플럭스 증가에 효과적임을 확인하였다.
실시예 9: PLGA 생산 재조합 미생물 균주를 이용한 락테이트와 글라이콜레이트를 포함하는 다양한 공중합체의 제조
실시예 7 및 실시예 8에서 제조한 3-하이드록시뷰트레이트 및 4-하이드록시뷰트레이트 이외에도 다양한 하이드록시카복시산을 포함하는 공중합체를 제조하기 위해 2-하이드록시아이소발러레이트 (2-hydroxyisovalerate), 5-하이드록시발러레이트 (5-hydroxyvalerate)와 6-하이드록시헥사노에이트 (6-hydroxyhexanoate)를 선택하였다.
pTacxylBC와 pPs619C1437Pct540 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균 X17ld-p 균주의 경우 5 mM 아이소루신 첨가된 배지에서 프리커서로 2 g/L 농도의 2-하이드록시아이소발러레이트를 첨가 후 배양 시 폴리(53.6 mol% 락테이트-co-23.3 mol% 글라이콜레이트-co-23.1 mol% 2-하이드록시아이소발러레이트) 20.8 중량%의 농도로 생성하였다.
상기 재조합 균주에 대해서 프리커서로 2 g/L 농도의 소듐 5-하이드록시발러레이트를 첨가 후 배양 한 결과 폴리(69.2 mol% 락테이트-co-24.7 mol% 글라이콜레이트-co-6.1 mol% 5-하이드록시발러레이트)를 16.7 중량%가 생산되었다. 또한 상기 균주의 경우 2 g/L 농도의 6-하이드록시헥사노에이트를 프리커서로 첨가하여준 경우 폴리(76.4 mol% 락테이트-co-22.0 mol% 글라이콜레이트-co-1.6 mol% 6-하이드록시헥사노에이트)를 16.5 중량%의 농도로 생성하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Recombinant Microorganism Having Ability Producing Poly(lactate-co-glycolate) and Its Copolymers from Xylose and Preparing Method of Poly(lactate-co-glycolate) and its copolymers Using Thereof <130> P16-B010 <160> 56 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 559 <212> PRT <213> Pseudomonas sp. 6-19 <400> 1 Met Ser Asn Lys Ser Asn Asp Glu Leu Lys Tyr Gln Ala Ser Glu Asn 1 5 10 15 Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Val Gly Leu Arg Gly Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Ala Ser Ala Arg Met Val Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln Pro Val His 35 40 45 Ser Val Lys His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu 50 55 60 Leu Gly Lys Ser Gly Leu Gln Pro Thr Ser Asp Asp Arg Arg Phe Ala 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr 85 90 95 Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Asp Trp Ile Asp Glu Ser Asn 100 105 110 Leu Ala Pro Lys Asp Val Ala Arg Gly His Phe Val Ile Asn Leu Met 115 120 125 Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Thr Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val 130 135 140 Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser 145 150 155 160 His Leu Ala Lys Asp Leu Val His Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val 165 170 175 Asn Met Gly Ala Phe Glu Val Gly Lys Ser Leu Gly Val Thr Glu Gly 180 185 190 Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro 195 200 205 Thr Thr Glu Gln Val Tyr Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln 210 215 220 Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Asp Lys Ser Leu Ala 225 230 235 240 Arg Phe Cys Leu Arg Asn Asn Val Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg 245 250 255 Asn Pro Thr Lys Glu Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Glu 260 265 270 Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Thr Ala Ile Thr Gly Ser Lys 275 280 285 Asp Val Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala 290 295 300 Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Ile Gly Glu Asn Lys Val Asn Ala Leu 305 310 315 320 Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Leu Asp Ser Asp Val Ala 325 330 335 Leu Phe Val Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr 340 345 350 Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp 355 360 365 Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu 370 375 380 Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp 385 390 395 400 Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Leu Phe 405 410 415 Lys Asn Asn Pro Leu Ile Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr 420 425 430 Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Phe Ser Leu Ala Gly 435 440 445 Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln 450 455 460 Leu Phe Gly Gly Asn Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile 465 470 475 480 Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met Thr 485 490 495 Ser Thr Glu Val Ala Glu Asn Ala Asp Glu Trp Gln Ala Asn Ala Thr 500 505 510 Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala Gln 515 520 525 Arg Ser Gly Glu Leu Lys Lys Ser Pro Thr Lys Leu Gly Ser Lys Ala 530 535 540 Tyr Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg 545 550 555 <210> 2 <211> 524 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pct540 <400> 2 Met Arg Lys Val Pro Ile Ile Thr Ala Asp Glu Ala Ala Lys Leu Ile 1 5 10 15 Lys Asp Gly Asp Thr Val Thr Thr Ser Gly Phe Val Gly Asn Ala Ile 20 25 30 Pro Glu Ala Leu Asp Arg Ala Val Glu Lys Arg Phe Leu Glu Thr Gly 35 40 45 Glu Pro Lys Asn Ile Thr Tyr Val Tyr Cys Gly Ser Gln Gly Asn Arg 50 55 60 Asp Gly Arg Gly Ala Glu His Phe Ala His Glu Gly Leu Leu Lys Arg 65 70 75 80 Tyr Ile Ala Gly His Trp Ala Thr Val Pro Ala Leu Gly Lys Met Ala 85 90 95 Met Glu Asn Lys Met Glu Ala Tyr Asn Val Ser Gln Gly Ala Leu Cys 100 105 110 His Leu Phe Arg Asp Ile Ala Ser His Lys Pro Gly Val Phe Thr Lys 115 120 125 Val Gly Ile Gly Thr Phe Ile Asp Pro Arg Asn Gly Gly Gly Lys Val 130 135 140 Asn Asp Ile Thr Lys Glu Asp Ile Val Glu Leu Val Glu Ile Lys Gly 145 150 155 160 Gln Glu Tyr Leu Phe Tyr Pro Ala Phe Pro Ile His Val Ala Leu Ile 165 170 175 Arg Gly Thr Tyr Ala Asp Glu Ser Gly Asn Ile Thr Phe Glu Lys Glu 180 185 190 Ala Ala Pro Leu Glu Gly Thr Ser Val Cys Gln Ala Val Lys Asn Ser 195 200 205 Gly Gly Ile Val Val Val Gln Val Glu Arg Val Val Lys Ala Gly Thr 210 215 220 Leu Asp Pro Arg His Val Lys Val Pro Gly Ile Tyr Val Asp Tyr Val 225 230 235 240 Val Val Ala Asp Pro Glu Asp His Gln Gln Ser Leu Asp Cys Glu Tyr 245 250 255 Asp Pro Ala Leu Ser Gly Glu His Arg Arg Pro Glu Val Val Gly Glu 260 265 270 Pro Leu Pro Leu Ser Ala Lys Lys Val Ile Gly Arg Arg Gly Ala Ile 275 280 285 Glu Leu Glu Lys Asp Val Ala Val Asn Leu Gly Val Gly Ala Pro Glu 290 295 300 Tyr Val Ala Ser Val Ala Asp Glu Glu Gly Ile Val Asp Phe Met Thr 305 310 315 320 Leu Thr Ala Glu Ser Gly Ala Ile Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 325 330 335 Arg Phe Gly Ala Ser Tyr Asn Ala Asp Ala Leu Ile Asp Gln Gly Tyr 340 345 350 Gln Phe Asp Tyr Tyr Asp Gly Gly Gly Leu Asp Leu Cys Tyr Leu Gly 355 360 365 Leu Ala Glu Cys Asp Glu Lys Gly Asn Ile Asn Val Ser Arg Phe Gly 370 375 380 Pro Arg Ile Ala Gly Cys Gly Gly Phe Ile Asn Ile Thr Gln Asn Thr 385 390 395 400 Pro Lys Val Phe Phe Cys Gly Thr Phe Thr Ala Gly Gly Leu Lys Val 405 410 415 Lys Ile Glu Asp Gly Lys Val Ile Ile Val Gln Glu Gly Lys Gln Lys 420 425 430 Lys Phe Leu Lys Ala Val Glu Gln Ile Thr Phe Asn Gly Asp Val Ala 435 440 445 Leu Ala Asn Lys Gln Gln Val Thr Tyr Ile Thr Glu Arg Cys Val Phe 450 455 460 Leu Leu Lys Glu Asp Gly Leu His Leu Ser Glu Ile Ala Pro Gly Ile 465 470 475 480 Asp Leu Gln Thr Gln Ile Leu Asp Val Met Asp Phe Ala Pro Ile Ile 485 490 495 Asp Arg Asp Ala Asn Gly Gln Ile Lys Leu Met Asp Ala Ala Leu Phe 500 505 510 Ala Glu Gly Leu Met Gly Leu Lys Glu Met Lys Ser 515 520 <210> 3 <211> 747 <212> DNA <213> Caulobacter crescentus <400> 3 atgtcctcag ccatctatcc cagcctgaag ggcaagcgcg tcgtcatcac cggcggcggc 60 tcgggcatcg gggccggcct caccgccggc ttcgcccgtc agggcgcgga ggtgatcttc 120 ctcgacatcg ccgacgagga ctccagggct cttgaggccg agctggccgg ctcgccgatc 180 ccgccggtct acaagcgctg cgacctgatg aacctcgagg cgatcaaggc ggtcttcgcc 240 gagatcggcg acgtcgacgt gctggtcaac aacgccggca atgacgaccg ccacaagctg 300 gccgacgtga ccggcgccta ttgggacgag cggatcaacg tcaacctgcg ccacatgctg 360 ttctgcaccc aggccgtcgc gccgggcatg aagaagcgtg gcggcggggc ggtgatcaac 420 ttcggttcga tcagctggca cctggggctt gaggacctcg tcctctacga aaccgccaag 480 gccggcatcg aaggcatgac ccgcgcgctg gcccgggagc tgggtcccga cgacatccgc 540 gtcacctgcg tggtgccggg caacgtcaag accaagcgcc aggagaagtg gtacacgccc 600 gaaggcgagg cccagatcgt ggcggcccaa tgcctgaagg gccgcatcgt cccggagaac 660 gtcgccgcgc tggtgctgtt cctggcctcg gatgacgcgt cgctctgcac cggccacgaa 720 tactggatcg acgccggctg gcgttga 747 <210> 4 <211> 870 <212> DNA <213> Caulobacter crescentus <400> 4 atgaccgctc aagtcacttg cgtatgggat ctgaaggcca cgttgggcga aggcccgatc 60 tggcatggcg acaccctgtg gttcgtcgac atcaagcagc gtaaaatcca caactaccac 120 cccgccaccg gcgagcgctt cagcttcgac gcgccggatc aggtgacctt cctcgcgccg 180 atcgtcggcg cgaccggctt tgtcgtcggt ctgaagaccg ggattcaccg cttccacccg 240 gccacgggct tcagcctgct gctcgaggtc gaggacgcgg cgctgaacaa ccgccccaac 300 gacgccacgg tcgacgcgca aggccgtctg tggttcggca ccatgcacga cggggaagag 360 aacaatagcg gctcgctcta tcggatggac ctcaccggcg tcgcccggat ggaccgcgac 420 atctgcatca ccaacggccc gtgcgtctcg cccgacggca agaccttcta ccacaccgac 480 accctggaaa agacgatcta cgccttcgac ctggccgagg acggcctgct gtcgaacaag 540 cgcgtcttcg tgcagttcgc cctgggcgac gatgtctatc cggacggttc ggtcgtcgat 600 tccgaaggct atctgtggac cgccctgtgg ggcggtttcg gcgcggtccg cttctcgccg 660 caaggcgacg ccgtgacgcg catcgaactg cccgccccca acgtcaccaa gccctgcttc 720 ggcgggcctg acctgaagac cctctatttc accaccgccc gcaagggcct gagcgacgag 780 accctggccc agtacccgct ggccggcggt gtgttcgccg ttccggtcga tgtggccggc 840 caaccccagc atgaggtccg ccttgtctaa 870 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 agacaggaat tcatgtcctc agccatctat cccag 35 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 agacagctgc agttagacaa ggcggacctc atg 33 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 atgactgacg ttgtcatcgt atcc 24 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gatttgattg tctctctgcc gtc 23 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 agacaggcat gccgggcaag taccttgcc 29 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 agacaggcat gctcagccca tatgcaggcc 30 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 agacaggcat gcttgacaat taatcatccg gctc 34 <210> 12 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 agacaggcat gcttaatata actttttata tgtgtttact atgtc 45 <210> 13 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gcggaagcag ccaataagaa ggagaaggcg aatggctgag atgaaaaacc gacactatag 60 aacgcggccg 70 <210> 14 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gacgtgtttc gggcagactt cggagcagta gcccacgaaa gtacagctcc ccgcataggc 60 cactagtgga 70 <210> 15 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tgccgccagc taaacgcgtt tacggtggcg aagcggatgc agccgataag gcggaagcag 60 ccaataagaa 70 <210> 16 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 aagtctttcg aactttctac tttgccctgc tgaatggccg cagccggatc gacgtgtttc 60 gggcagactt 70 <210> 17 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 tttctctccc atcccttccc cctccgtcag atgaactaaa cttgttaccg gacactatag 60 aacgcggccg 70 <210> 18 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gcgcagcata tacaggctga aacctttggc ctgttcgagt ttgatctgcg ccgcataggc 60 cactagtgga 70 <210> 19 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tatgcccgat gatattcctt tcatcgggct atttaaccgt tagtgcctcc tttctctccc 60 atcccttccc 70 <210> 20 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tttgttttcg ccagttcgat cacttcatca ccgcgtccgc tgatgattgc gcgcagcata 60 tacaggctga 70 <210> 21 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 tgaacttaac 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gtaaccccgg acgcacgctg cgagcggcac gtagtgtgga tgccttacac 60 gccgcattta 70 <210> 52 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 gcgcggtcag cgaaaatcgg gtgaatttgc ccaacgccac ggggaatcgc ctgactgcgg 60 cgctgcatta 70 <210> 53 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter <400> 53 gcgcggtcag cgaaaatcgg gtgaatttgc ccaacgccac ggggaatcgc ctgactgcgg 60 cgctgcatta 70 <210> 54 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter <400> 54 ctgttgcagg tacttcttgt cgtactgttt tgtgctataa acggcgagtt tcatggtctg 60 tttcctgtgt gaa 73 <210> 55 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter <400> 55 cgtgggaacc cacagcccga gcgtcatcag cagcgtcaac ggcacaagaa taatcagtaa 60 taacagcgcg 70 <210> 56 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter <400> 56 cagcagaaag tcaaaaaatt ccagctcaaa gccaaaggac tcgttcacct gttgcaggta 60 cttcttgtcg 70

Claims (1)

  1. 공중합체 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-4-하이드록시뷰트레이트)에 있어서, 단량체의 몰분율이 61.2-67.1mol% 락테이트, 23.6-38.4mol% 글라이콜레이트 및 0.4-9.1 mol% 4-하이드록시뷰트레이트인 것을 특징으로 하는 공중합체 폴리(락테이트-co-글라이콜레이트-co-4-하이드록시뷰트레이트).


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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Li 등. Metabolic Engineering. Vol. 35, 페이지 1-8 (2016.01.14.)*
Zhou 등. Microbial Cell Factories. Vol. 11, No. 54, 페이지 1-8 (2012.05.02.)*

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