MX2011000351A - Metodo para la polimerizacion del acido glicolico con microorganismos. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para la producción y preparación de poliglicolato (PGA) a partir de organismos diseñados genéticamente; más específicamente, la invención se refiere a un método que comprende estos dos pasos: 1) cultivar en un medio que contiene ácido glicólico o no el microorganismo que expresa al menos un gen que codifica una enzima que convierte el glicolato en CoA glicólico y un gen que codifica la polihidroxialcanoato sintetasa (PHA) que utiliza CoA glicólico como substrato, 2) recuperar el polímero poliglicolato.

Description

TODO PARA LA POLIMERIZACIÓN DEL ÁCIDO GLICÓLICO C MICROORGANISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para la reali imeros del ácido poliglicólico llamados PGA. Más específicame ión se refiere a un método que comprende los pasos de: - cultivar un microorganismo diseñado genéticamente co adecuada de carbono, incluyendo o no el ácido glicólico, rganismo expresa un gen que codifica una enzima que convi to en CoA glicólico y por lo menos un gen que codifica una enzim a en la síntesis de la PHA y - recuperar el polímero poliglicolato. 1998), Langer, ), andamios de biomateriales y dispositivos m gradable polyesters for medical and ecological applications. Mac Commum. 21 , 117-132 (2000), Ikada, Y & Tsuji, H.; Sterili , biocompatibility and clinical applications of polylactic acid/polyg polymers. Biomaterials 17, 93-102 (1996), Athanasiou, K. A. y c es una resina de poliéster con grandes propiedades: eabilidad al gas, incluso bajo una humedad del radabilidad, gran resistencia mecánica y buena moldeabilidad ie acid) In polymer data handbook (ed. Mark, J. E.) 566-569 ( sity Press, Nueva York, 1999) Lu, L; & Mikos, A. G): Esta combi de propiedades hace que el PGA sea especialmente adecuado ue de alto rendimiento y las aplicaciones industriales. Actualme ión dirigida del PGA son los frascos de polientilentereftalano pa que se utilizan para las bebidas gaseosas y cervezas. Puesto ermite una barrera de gas 100 veces más alta que la del P a de gas y humedad de los polímeros biológicos como el tico (PLA). A través del uso generalizado de las aplica radables, el PGA colabora además con la conservació mbiente.

Hoy en día, el PGA se prepara mediante dos vías qu tes: la polimerización de apertura de anillo de los diésteres cíclic densación de los ácidos alfa hicroxicarboxílicos. La polimerizac ra de anillo de los diésteres cíclicos se realiza en tres pasos ndensación de los ácidos alfa hidroxicarboxílicos, (ii) la síntesis res cíclicos mediante una reacción de apertura térmica y rización de apertura de anillo del diéster cíclico (Preparative Met er Chemistry 2nd edition, Interscience Publishers lnc Nueva York sen, W. R. & Campbell, T. W. Controlled Ring-opening Polymer tide and Glycolide. Chem. Rev. 104, 6147-6176 (2004), Dechy-C ai). Alternativamente, es de gran conocimiento que el PGA d roceso presenta desventajas debido a la adición de los disolve s de enlace de cadenas (iniciadores) que no son fáciles de remov Mientras tanto, los poliésteres bacterianos (también Ha teres microbianos y polihidroxialcanoato, PHA) se almacenan los intracelulares como resultado de una tensión metabólica iento desequilibrado debido al limitado suministro de un nu ial y la presencia de una fuente de carbono en exceso (L essault 2005; Lenz 1993; Sudesh et al., 2000; Sudesh y Doi üchel y Füchtenbusch 1998; Steinbüchel y Valentín 1995; Stein . Los PHA se sintetizan naturalmente a partir de una gran canti ntes bacterias grampositivas y gramnegativas así como de a obacterias. Los PHA han obtenido gran atención en las últimas d o a la similitud de las propiedades físicas de este biopolímero al polipropileno a base de petroquímicos en cuanto a su resisten sión y agarrotamiento (Sudesh et al., 2000). A diferencia de los pl El segundo tipo es el formado por ácidos hidroxialcanoi a media, mc/PHA, con cadenas laterales alquilas largas (6 a 14 rbono) que son producidas por Pseudomonas oleovorans y omonas (Timm y Steinbüchel, 1990) (Nomura, C. T. & Tagu Steinbüchel, A. & Hazer, B., 2007). Aunque el PHA más estudiad hidroxibutirato) (PHB), un polímero de 3-hidroxibutiratos (3HB), e 150 monómeros constituyentes (Steinbüchel A. Valentín AE. iol Lett 995, 128:219-228; Madison L. y Huisman G. Microbiol a eviews, 1999, 63:21-53; Rehm B. Biochem J 2003, 376:15-33 cantidad de monómeros producen PHA con diversas propi ¡ales que dependen de la composición del polímero.

Los requisitos mínimos para la síntesis de la PHA organismo son la fuente de (>3)-hidroxialcanoil-CoA y una PHA si spondiente (Gerngross y Martin, PNAS 92:6279-83, 1995) ntan la enzima principal para la biosíntesis de la PHA, la varia PHA bacterianas que se pueden producir directament tación es extraordinariamente alta. Si se selecciona una ce ión apropiada así como condiciones de cultivo y fuentes de ca das, se puede producir la PHA con composiciones a medida. E s ejemplos en publicaciones que muestran la producción de de organismos de productores naturales como Ralstonia eut bacterium, Pseudomonas y a partir de productores nat anos recombinantes o no como E.coli (Qi et al., FEMS Microbio!. 5, 1997; Qi et al., FEMS Microbio!. Leff., 167:89, 1998; Langenb MS Microbio!. Lett., 150:303, 1997; Madison L. y Huisman G., /55436; patente de los Estados Unidos No. 6.143.952; WO 98/ /61624).

La PHA sintetasa sintetiza la PHA utilizando (>3)-hidroxiac substrato. Por lo tanto, el primer paso de la polimerización acteriol. 180:667, 1998; Tsage et a/., FEMS MicrobioL Lett 18 3-cetoacil-ACP reductasa (FabG) derivada de la E.coli y Pseudo osa (Taguchi et a/., FEMS Microbio!. Lett 176:183, 1999; Ren ef 0/. 182:2978, 2000; Park et al., FEMS MicrobioL Lett. 214:217, tipos de PHA se han sintetizado con estas enzimas utilizando h atos hidroxilados en diferentes posiciones a lo largo de la cade o (principalmente en las posiciones 3, 4, 5 y 6). Sin embargo, do que presenta poca actividad de PHA sintetasa en los atos que se hidroxila en la segunda posición (Zhan et a/., ioL Biotechnol. 56:131 , 2001 ; Valentín y Steinbüchel, AppL Mic nol. 40:699, 1994; Yuan ef a/., Arch. Biochem. Biophysics. 3 El gen que codifica la propionil coenzima A sintetasa ella entérica se clonó en 2000 y se denominó PrpE véase cia, (Valentín et al., 2000). Substratos informados de esta enzi icroorganismo transformando dicho acetato en acetil-coA.

Aunque se han incorporado más de 150 diferentes monó en organismos, nunca se ha informado la producción de lido biosintético debido a que un hidroxi alcanoato tal como el gli do en el carbono de posición 2, no es un substrato adecuado p tetasa.

Existen dos solicitudes de patentes que describe ración de monómeros 2-hidroxiácido en polímeros por la acción d tetasa en células vivas.

La patente de Estados Unidos 2007/0277268 (Cho e a la bioproducción de polilactato (PLA) o sus copolímeros me o plantas.

La patente WO 2004/038030 (Martin et al.) muestra la forr límeros que contienen monómeros de CoA glicólico y, al menos ero seleccionado del grupo formado por el ácido 3-hidroxibu rganismos. Como se devela en la presente memoria descriptiv res describen que los homopolímeros de ácido poliglicóli en mediante el cultivo de microorganismos recombin rnados con un gen de PHA sintetasa y un gen que codifica una e nvierte el glicolato en CoA glicólico en un medio de producció e una fuente de carbono adecuada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El objetivo de la presente invención es proporcionar un m biosíntesis de PGA, un homopolímero del ácido glicólico.

Este método se basa en el uso de un microorga inante que expresa: 1. un gen que codifica una polihidroxialcanoato sin oga (PHA).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra las sucesivas reacciones para la prod polímero de ácido poliglicólico, el PGA. La primera reacción ión de un CoA glicólico, substrato de la segunda reacció rización catalizada por la PHA sintetasa.

La figura 2 es un diagrama esquemático que muestra la rut esis del poliglicolato utilizando células cultivadas en un medi e glucosa más glicolato.

La figura 3 es un diagrama esquemático que muestra la rut esis del poliglicolato utilizando células cultivadas en un medi e glucosa sin ningún glicolato exógeno.

La figura 4 representa la observación microscópica (X10 iento de la cepa AG1122 en un matraz Erlenmeyer en LB+ gluco copio óptico AVANTEC 3804921.

La figura 8 representa un cromatograma LC-MS de la re olato en la proteína PrpEst pura.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para la obt olimerización del ácido glicólico en PGA con un microorganism nde los pasos de: cultivar un microorganismo que expresa un ge a una polihidroxialcanoato sintetasa heteróloga (PHA) en un medi nde una fuente de carbono, y recuperar el ácido glicólico polimerizado (PGA). en donde el microorganismo además expresa un gen que C enzima(s) que transforma(n) el ácido glicólico en CoA glicólico.

El término "polimerización" o "homopolimerización" se ref El PGA es un homopolímero que comprende, al menos, 5 e la anteriormente mencionada unidad recurrente de ácido gli n llamada glicolato). El contenido de la anteriormente menci recurrente de ácido glicólico en la resina de PGA es, al menos, 5 preferentemente al menos 70% en peso, más preferentemente 9 Es posible que el PGA tenga un peso molecular promedio escala de los 10.000 a 600.000 daltones según la medición do un solvente de hexafluoroisopropanol. Son de mayor preferen moleculares promedio de 150.000 a 300.000 daltones.

Según la invención, los términos "cultivo" o "fermentaci indistintamente para indicar el crecimiento de bacterias en un cimiento apropiado que contenga una fuente de carbono.

La frase "la recuperación del ácido glicólico polimerizado a dio de cultivo" se refiere a la acción de recuperar el PGA, se mediante centrifugación, se disuelve en cloroformo y se pr ente en orden hasta llegar a un PGA altamente purificado ros se analizan posteriormente mediante RMN.

El término "microorganismo" se refiere a una bacteria, leva Preferentemente, el microorganismo se selecciona bacteriaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae y Corynebacterí referentemente, el microorganismo es una especie de la Esche lla, Pantoea, Salmonella o Corynebacterium. Aún ntérnente, el microorganismo es Escherichia coli.

El término "fuente de carbono" según la presente inv cualquier fuente de carbono que pueden utilizar los expertos para soportar el crecimiento normal de un microorganismo que p exosas (tal como glucosa, galactosa o lactosa), pen acáridos, disacáridos (tal como sacarosa, celobiosa o ma cáridos, melaza, almidón o sus derivados, hemicelulosas, glic ido por el mismo microorganismo que expresa los genes que cod A sintetasa y una enzima que transforma el ácido glicólico en ). Los microorganismos que producen un alto nivel de ácido gli te fermentación a partir de una fuente renovable de carbono s o anteriormente véase particularmente los docum 07/140816 y WO 2007/141316.

Asimismo, sería de gran provecho reducir la exportado licólico a partir de este microorganismo que produce ácido gli pertos en la técnica conocen numerosos medios para obtener ión del transporte de un metabolito específico, en partícul ión o inhibición de la actividad y/o la expresión de una proteí rte, capaz de exportar el ácido glicólico del microorganismo ha Según un segundo aspecto de la invención, el ácido glicóli ciona al microorganismo de forma exógena en el medio de cultivo. conoce numerosos medios para obtener dicha mejora de transpo tabolito específico, en particular incrementando la actividad ión de una proteína permeasa, capaz de importar el ácido gli el medio al microorganismo. En particular, puede ser útil sobreex es glcA, IldP y yjcG que codifican los importadores de glicolato (N /., 2001 Microbiology, 147, 1069-1077; Nunez, F. et ai, 2002 Bio ophysical research Communications 290, 824-829; Giménez, R. of Bacterio!. 185, 21 , 6448-6455).

En un aspecto preferido de la invención, la enzima rma el ácido glicólico en CoA glicólico se elige entre: - acil-CoA sintetasas o acil-CoA transferasas, - fosfotransbutirilasa relacionada con butirato cinasa.

Las acil-CoA transferasas encontradas en la bacteria anae nocidas por catalizar la formación de CoA-tioésteres de longit pequeña a mediana (Mack, M. and Buckel, W., 1997). en buk.

La frase "que codifica" o "codificante" se refiere al proceso n polinucleótido, mediante los mecanismos de transcripci ión, produce una secuencia aminoacídica. Este proceso es per ódigo genético, que es la relación entre la secuencia de bases del cuencia de los aminoácidos de las proteínas. Una caracter l del código genético es el de estar degenerado, lo que quiere aminoácido se puede codificar mediante más de un triplete de ón"). La consecuencia directa es que distintos polinucleótidos pu r la misma secuencia aminoacídica. Los expertos en la materia S uso de los codones puede variar según los organismos. Entr S que codifican el mismo aminoácido algunos pueden ser utili ntérnente por un microorganismo en particular. De este mod importante diseñar un polinucleótido adaptado al uso de los cod microorganismo particular para optimizar la expresión d iones y modelos ocultos de M ww.sanqer.ac.uk/Software/Pfam/) es una gran recolección ión de secuencias de proteínas. Con cada PFAM se pueden visu s alineaciones, ver dominios de proteínas, evaluar las distribuc os organismos, obtener acceso a otras bases de datos y visu uras proteicas conocidas.

Las COG (agrupaciones de grupos ortólogos de prot ww.ncbi.nlm.nih.gov/COGA se obtienen comparando las secuenci as que derivan de 66 genomas de secuencias completas ntan 30 líneas filogenéticas principales. Cada COG se define a enos tres líneas, permitiendo la identificación de antiguos do ados.

Los expertos en la materia conocen muy bien los medi ación de las secuencias homologas y su porcentaje de homol n, en particular, los programas BLAST que se pueden utilizar mos, cepas bacterianas, levaduras, hongos, mamíferos, plantas rea de rutina se realiza utilizando las secuencias de consenso q determinar llevando a cabo alineaciones de secuencias con os de otros microorganismos y diseñando sondas de degener lonar el gen correspondiente en otro organismo. Estos métod e biología molecular son muy conocidos por los expertos en la té claman, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989 Molecular Cloni tory Manual 2da ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring H York).

La presente invención también se refiere a un case ión que comprende un polinucleótido que codifica una enzim rma el ácido glicólico en CoA glicólico bajo el control de elem ores funcionales en un microorganismo anfitrión.

El término "expresión" se refiere a la transcripción y trad secuencia de genes que propicia la generación de la correspon un aumento de la cantidad de enzimas en la célula.

Para aumentar la expresión de un gen, el experto en la t diferentes formas de manipular la expresión de los gene lar, es posible que el gen se exprese utilizando promotore s concentraciones, que pueden ser inducibles. Estos prom ser homólogos o heterólogos. El experto en la técnica conoce S promotores más adecuados. Por ejemplo, Ptrc, Ptac, Plac or lambda el son los más utilizados.

En una modalidad de la invención, el(los) gen(s) se expr te un plásmido o vector introducido en el microorganismo. rganismo se denomina entonces "microorganismo anfitrión", ha cia a un microorganismo capaz de recibir genes extraños o heter s extras de sus propíos genes y de expresar esos genes para pr teína activa.

El término "transformación" se refiere a la introducción de n resión, otros elementos para facilitar la transformación de una na en particular. Un vector de expresión comprende un cas ión que permite la expresión adecuada del gen que transporta el elementos adicionales que permiten la replicación del vector mo anfitrión. Un vector de expresión puede estar presente e nica en el organismo anfitrión o en múltiples copias. El experto conoce los distintos tipos de plasmidos que difieren en su orig ción y, de este modo, en su número de copias en la célula. Es p tén presentes como 1 a 5 copias, aproximadamente 20 o hast , según los plásmidos de número bajo de copias con repli a (pSC101 , RK2), plásmidos de número bajo de copias (p 010) o plásmidos de gran número de copias (pSK bluescript II).

La presente invención proporciona un vector de transfor mprende un gen que codifica una enzima que transforma el ? en CoA glicólico. ible aumenta.

El microorganismo recombinante utilizado en la inv n expresa un gen que codifica una polihidroxialcanoato sinteta distinguir cuatro clases principales de PHA (Rhem, B.f 2003 intetasas de clase I y II comprenden enzimas formadas por solo bunidad (PhaC). Según su especificidad in vivo e in vitro, las sas de clase I (por ejemplo, en Ralstonia eutropha) u ntemente tioéster CoA de distintos ácidos grasos que comprende omos de carbono, mientras que las PHA sintetasas de clase lo, en Pseudomonas aeruginosa) utilizan preferentemente tioéste intos ácidos grasos que comprenden de 6 a 14 átomos de carbon sas de clase III (por ejemplo, en Allochromatium vinosum) compr as formadas por dos tipos diferentes de subunidades: las subuni y PhaE. Estas PHA sintetasas prefieren tioésteres CoA de hidroxi que comprenden de 3 a 5 átomos de carbono. Las PHA sinteta organismos, más particularmente microorganismos. De este do las referencias de GenBank para los genes conocidos, los ex écnica pueden determinar los genes equivalentes en otros organi bacterianas, levaduras, hongos, mamíferos, plantas, etc. Esta ta se realiza utilizando las secuencias de consenso que se p inar llevando a cabo alineaciones de secuencias con genes deri s microorganismos y diseñando sondas de degeneración para cl orrespondiente en otro organismo. Todos los genes equivalent oran en la presente memoria descriptiva como referencia.

Preferentemente, se sobreexpresa el gen que codifica un sa heteróloga. Como se describió anteriormente, la sobreexpres se puede obtener de diferentes maneras conocidas por el expe nica; el gen se puede expresar mediante un vector de exp cido en el microorganismo o se puede integrar en el cromoso microorganismo. estigado in vitro e in vivo (Wieczorek R. et al. 1995 y York G.M. se plantea que funcionen como un regulador de la transcripci El uso de las denominaciones 'phaP' y 'phaR' abarca tod proteínas correspondientes en otros microorganismos.

La invención también se refiere a un ácido glicólico polimer obtenido a partir del método según la invención.

La principal ventaja de la invención es la producción de P rma más fácil y económica que la química que requiere el us o, un compuesto de difícil producción a partir del ácido glicólico.

La invención también se refiere a un microorganismo a los genes que codifican una PHA sintetasa heteróloga y por lo zima que transforma el ácido glicólico en CoA glicólico.

Preferentemente, dicho microorganismo es bacteriaceae, más preferentemente una Escheríchia coli.

EJEMPLOS CUADRO 1 más abalo Promotor PtrcOI con operador y la secuencia RBS SEQ ID ttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaattTACGT tatt EJEMPLO 1 strucción de vectores recombinantes que contienen un gen q fica una construcción de acil-CoA sintetasa de pSCB-acs, pS prpE y pSCB-prpEst Se utilizan dos proteínas para transformar el ácido glicóli icólico, ya sea una propionil-CoA sintetasa codificada por PrpE ( e S.thyphimuríum) o una acetil-CoA sintetasa codificada por acs. coexpresa en la célula con el gen phaC1 de Ralstonia eutroph la PHA sintetasa.

Para amplificar los genes acs y prpE, se realizó una do un ADN cromosomico de la Escheríchia coli como molde res anteriores (cuadro 1), denominados ase F y acs R p cación de acs y prpE F y prpE F para la amplificación de prpE.

El fragmento de la PCR de acs se clona en el vector ls Required for Propionyl-AMP Shyntesis") como molde res anteriores (cuadro 1 ), denominados prpEstF y prpEst R pa ación de prpEst.

El fragmento de la PCR de prpEst se clona en el vector ene Blunt PCR Cloning Kit CAT 240207-5) que resulta en el plás rpEst.

EJEMPLO 2 strucción de vectores recombinantes que contienen genes q codifican una PHA sintasa y acil-CoA sintetasa Construcción de pMK-Ptrc01/OP01/RBS01-jpA?aCYre-TT02 El plásmido que transporta el gen phaC1 de la Ral a se proporciona mediante una compañía que sintetiza el gen co cia optimizada para obtener la mejor tasa de transcripción de E.co con el operador y secuencias RBS (SEQ ID NO. 1) ubicad ón 5' del gen y una secuencia del terminador ubicada en direcció re, llevando al plásmido pMK-Ptrc01/OP01/RBS01 -p/?aCíre-TT02 Construcción de pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-jp/7aCíreT MCS5-Ptrc01/OP01/RBS01 -p/?aC re-TT02 El plásmido p K-Ptrc01/OP01/RBS01-p/7aCíre-TT02 se nd\\\ y Bam \ y el fragmento de ADN resultante que com /OP0l/RBS01-p ?aCíre-TT02 se clona en el vector pBBR1 o por las mismas enzimas de restricción. El plásmido resulta inado pBBR1 CS5-Ptrc01/OP01/RBS01 -p/?aCíre-TT02.

El plásmido pMK-Ptrc01/OP01/RBS01-p/?aC re-TT02 es di //?dlll y BamHI y el fragmento de ADN resultante que com /OP01/RBS01-p/?aC1re-TT02 se clona en el vector pUC19 corta smas enzimas de restricción. El plásmido resultante es deno rcOMOPOIIRBSO l -phaCIre-acs-TJO y pMK-Ptrc01/OP01/R Construcción de pBBR1 MCS5-Ptrc01/OP01/RBS01-p/7 -TT02 y pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-jp/?aCíre-jDrpEsf-TT02 El plásmido pSCB-prpEsf se digiere con Pací y Nhe\ nto de ADN resultante que comprende prpEst se clona en el MCS5- Ptrc01/OP01/RBS01-p/?aCíreí-TT02 cortado por las m s de restricción. El plásmido resultante es denominado pBBRI /OP01/RBS01-p ?aC1re-prpEsf-TT02.

El plásmido pSCB-prpEsf se digiere con Pací y Nhe\ nto de ADN resultante que comprende prpEst es clonado en el -Ptrc01/OP01/RBS01 -phaC1 re-TT02 cortado por las mismas e estricción. El plásmido resultante es denominado p /OP01/RBS01-p ?aC7 re-prpEsf-TT02. cepa tipo silvestre MG1655 E.co//, conduciendo a cepas MG trc01/OP01/RBS01-p/?aCíre-acs-TT02) y MG1655 ( OP01/RBS01-p/?aCíre-prpE-TT02) respectivamente.

El vector pBBR CS5-Ptrc01/OP01/RBS01-phaCíre-pr pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-phaCíre-prpEsf-TT02 se introduce oración en una cepa tipo silvestre MG1655 Eco//, conducien MG1655 (pBBRMCS5-Ptrc01/OP01/RBS01-p/?aCíre-acs-TT0 5 (pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-p/7aC7re-prpE-TT02) respectivam Las cepas resultantes (figura 2) se cultivan en un medio e contiene aproximadamente 5 g/L de glicolato (los detalles d ones en los siguientes ejemplos), seguido por centrifugación rar las cepas. Las cepas recuperadas son secadas por congela cuperar la sustancia de polímero acumulado en las células utili es como hexafluoroisopropanol o cloroformo. Para confirmar q ro obtenido es poliglicolato, se realizan análisis RMN en la sustan se utilizan en la presente para introducción de plásmidos que pe ucción de PGA sólo de glucosa.

El vector pMK-Ptrc01/OP01/RBS01-p/?aCíre-prpE-TT02 y /OP01/RBS01-p/?aCíre-acs-TT02 se introduce por electroporaci pa E. coli genéticamente modificada para producir ácido glicólico.

El vector pBBRMCS5-Ptrc01/OP01/RBS01-p/?aC re-p y pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-p/iaC7re^ Esf-TT02 se introdu poración en una cepa E.coli genéticamente modificada para pr licólico.

EJEMPLO 4 ntación de la cepa que produce el polímero de ácido PQLIqli de glucosa en matraces Erlenmever La producción de PGA por fermentación se realizó con l eyer con deflectores de 500 mi utilizando un caldo LB (Bertani, eriol. 62:293-300) o un medio M9 modificado (Anderson, 1946, cad. Sci. USA 32:120-128) complementado con 12.5 g/l de glucos e 5 g/l de MOPS y 5 g/L de glucosa. El pH del medio entonc a pH 6.8. Los antibióticos Espectinomicina y kanamicina se agrega ncentración final de 50 mg/l. Se utilizó un precultivo durante la nocular un cultivo de 50 mi a OD6oo nm de 0.3. Los cultiv ieron en un agitador a 37°C y 200 rpm hasta que la glucosa de cultivo se agotó. La producción de ácido poliglicólico se sigui aciones microscópicas con un microscopio óptico de Avantec 380 Se presentó una foto de las células después de varias hor iento en la figura 1. Las zonas blancas en las células correspon s del polímero.

EJEMPLO 5 ación.

Un precultivo único se llevó a cabo en un matraz 21 Erlenr con 200 mi de caldo LB (Bertani, 1951 , J. Bacteríol. 62:293-300 plementó con 12.5 g/l de glucosa a 37°C durante 24 horas, ivo se utilizó para inoculación del termentador.

El termentador se llenó con 400 mi de caldo LB compleme g/l de glucosa y 50 mg/l de espectinomicina y canamicina q ron a una densidad óptica inicial de 1.5. El cultivo se llevó a c on agitación y aireación ajustada para mantener el oxígeno disuel de una saturación al 30%. El pH se ajustó a 6.8 con adición de ba se llevó a cabo en un modo por lotes durante 24 horas o m>10.

Se siguió la producción de polímero de ácido poliglicólic aciones microscópicas. Una foto de la cepa bajo el microsco tó en la figura 2.

EJEMPLO 6 ntación de una cepa que produce polímero de ácido POLIqlic or bioconversión de ácido glicólico en matraces Erlenmever La bioconversión del ácido glicólico en PGA se realizó G1327 (MG1655 (pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-p/?aC1re-p/pEsí-T La bioconversión por AG1327 se evaluó en un eyer con deflectores de 500 mi utilizando un medio M9 modificad plementó con 5 g/l de MOPS, 5 g/l de glucosa y 5g/L de ácido gli justó a un pH 6.8. Un suministro de caldo LB a 10% v/v tambi con el fin de mejorar el crecimiento de la biomasa. Se agre lina y carbenicilina a una concentración de 100 mg/l. Se utili ivo durante la noche para inocular un cultivo de 50 mi a OD6oo s cultivos se mantuvieron en un agitador a 30°C y 200 rp ción de polímero fue seguida por observaciones microscópicas. ta el alcance de la presente invención. De este modo, el al ial de la presente invención se definirá por las reivindicaciones a alentes de las mismas.

EJEMPLO 7 nversión de ácido qlicólico y CoA qlicólico por Propionil-Co sin te tas a a partir de Salmonella tvohimuhum Construcción de la cepa BL21 (DE3) (pLvsS) (pPAL-p inante Para amplificar el gen prpE de Salmonella en uríum se llevó a cabo una PCR utilizando un plásmido pPRP45 y los cebadores denominados pPAL-prpEst R y pPAL-prpEst F pPAL-prpEst R (SEQ ID NO 8) CGAATTCCTATTCTTCGATCGCCTGGCG ) (pPAL-prpEst) denominada AG1354.

Sobreproducción de la propionil-CoA sintetasa, PrpEst La sobreproducción de la proteína PrpEst se realizó Erlenmeyer de 2 L. Un precultivo único se llevó a cabo en un eyer de 500 mL llenado con 50 mi de caldo LB (Bertani, 19 ol. 62:293-300) que se complementó con 5 g/l de glucosa, 100 p lina y 1 g/L de MgS04. El precultivo se cultivó a 37°C, 200 rpm =0.5 y posteriormente se utilizó para inoculación del matraz con 500 mL de caldo LB con 5 g/l de glucosa, 100 ppm de ampic e MgS04. El cultivo se llevó a cabo primero a 37°C y 200 rpm que es 0.6 - 0.8, y en un segundo paso movido a 25°C antes cción con 500 µ de IPTG. El cultivo se detuvo cuando OD6oo f or de 4. Las células se centrifugaron a 7000 rpm, 10 minutos a ormente se lavaron con regulador de fosfato antes de almacenar a por escisión con 100 mM de fluoruro a temperatura ambiente d utos. El regulador de elución se intercambió por diálisis contr n compuesta de 100 mM de fosfato de potasio, 150 mM de NaCI rol.

La prueba de proteína Bradford se utilizó para me tración de proteína (es decir, 0.23µg/µL para 45 mg de peso seco Detección de CoA glicólico por LC-MS La actividad de PrpE en glicolato se midió por L j/DIONEX), mediante detección de la molécula resultante, o (características químicas en el esquema 1 ). La mezcla de re L) contiene 75 mM de regulador de fosfato de potasio (pH 7.5), 1. , 0.75 mM de CoA y cualquiera de 10 a 40 µg del extracto celular de proteína purificada.

Las mezcla de r ción a PrepEst.

Figura 8: La reacción se realizó con 40 mM de glicolato y 9 a purificada.

En cada caso únicamente se detectó un pico con una ma asa-1 =824.0) que corresponde a CoA glicólico. 0^p-OH HO Peso molecular = 825.58 Masa exacta = 825 Fórmula molecular = C23H38N7018P3 REFERENCIAS DOCUMENTOS DE PATENTES DE EE.UU. N°: 2.772.268 A 11/2007 Cho J-H. et al. 6.143.952 A 11/2000 Srienc F. et al.

DOCUMENTOS DE PATENTES INTERNACIONALES N°: WO 2004/038030 A2 05/2004 Martin D. et al.

WO 2007/141316 A 12/2007 Soucaille P.

WO 2007/140816 A 12/2007 Soucaille P.

WO 01/55436 08/2001 Green P. R WO 98/54329 12/1998 Witholt B. et al. WO 99/61624 12/1999 Skraly F. et al.

Otras publicaciones: - Sorensen, W. R. & Campbell, T. W. Preparative Meth r Chemistry 2nd edition, Interscience Publishers Inc, Nueva York, - Dechy-Cabaret, O. et al. Chem. Rev. 104, 6147-6176, 200 - Hyon, S. -H. et al. Biomaterials, 18, 1503-1508, 1997.

- Lenz R. W. y Marchessault R. H. Biomacromolecules.

- Lenz R. W. Adv. Polym. Sci. 107:1-40, 1993.

- Sudesh K. et al. Progr. Polym. Sci. 25:1503-1555, 2000.

- Sudesh K. y Doi Y. Handbook of biodegradable pol technology, Reino Unido, pág. 219-256, (Bastioli C. Editions), 200 - Steinbüchel A. y Füchtenbusch B. TIBTECH 16:419-427, - Steinbüchel A. Valentín AE. FEMS Microbiol. Lett. 9-228.

- Steinbüchel A. Biomaterials. Macmillan, Nueva York, pág , 1999.

- Rehm B. Biochem. J. 376:15-33, 2003.

- Gemgross T. y Martin D. Proc. Nati. Acad. Sci., E -83, 1995.

- Qi et al. FEMS Microbiol. Lett, 157:155, 1997.

- Qi et al. FEMS Microbiol. Lett, 167:89, 1998.

- Langenbach et al. FEMS Microbiol. Lett., 150:303, 1997.

- Amara A. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 59:477-82, 20 - Fukui et al. J. Bacterio!. 180:667, 1998.

- Tsage et al. FEMS Microbiol. Lett. 184:193, 2000.

- Taguchi et al. FEMS Microbiol. Lett. 176:183, 1999.

- Ren et al.f J. Bacteriol. 182:2978, 2000.

- Park y col, FEMS Microbiol. Lett. 214:217, 2002.

- Zhan et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56:131 , 2001.

- Valentín y Steinbüchel, Appl. Microbiol. Biotechnol. 4 - Wieczorek R. et al. J. Bacteriol. 177: 2425-2435, 1995.

- York G.M. et al. J. Bacteriol. 184: 59-66, 2002.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1. - Método para la obtención de la polimerización del > en PGA con un microorganismo, que comprende los sigu cultivar un microorganismo que expresa un gen que codific roxialcanoato sintetasa heterologa (PHA) en un medio que comp ente de carbono; y recuperar el ácido glicólico polimerizado (PG el microorganismo además expresa al menos un gen que codifi que transforma el ácido glicólico en CoA glicólico. 2. - El método de conformidad con la reivindicaci rizado además porque el ácido glicólico es producido por el rganismo que expresa los genes que codifican una PHA sintetas os una enzima que transforma el ácido glicólico en CoA glicólico. 5. - El método de conformidad con la reivindicaci rizado además porque la acil-CoA sintetasa y la acil-CoA trans dificadas por los genes PrpE o acs. 6. - El método de conformidad con la reivindicaci rizado además porque la fosfotransbutirilasa se codifica por el g tirato cinasa se codifica por el gen buk. 7. - El método de conformidad con la reivindicación 5 erizado además porque dichos genes se sobreexpresan. 8. - El método de conformidad con la reivindicaci erizado además porque dichos genes se expresan por un plá cido en el microorganismo. 9. - El método de conformidad con la reivindicaci erizado además porque dichos genes se han integrado soma de dicho microorganismo. 10. - El método de conformidad con cualquiera d rizado además porque dicho gen se ha integrado en el cromoso icroorganismo. 14. - El método de conformidad con cualquiera d icaciones 1 a 13, caracterizado además porque el microorga a el sistema regulador de PhaR/PhaP. 15. - Ácido glicólico polimerizado obtenido a partir del méto iera de las reivindicaciones 1 a 14. 16. - Microorganismo que expresa genes que codifican una sa heteróloga y por lo menos una enzima que transforma el ) en CoA glicólico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15. 17. - El microorganismo de conformidad con la reivindicaci rizado además porque dicho microorganismo es una enterobacter