JP2011527367A - 微生物を用いたグリコール酸の重合方法 - Google Patents
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Abstract
Description
遺伝子組み換え微生物を、グリコール酸を含むまたは含まない、適切な炭素源を用いて、培養し、前記微生物は、グリコレート(glycolate)をグリコリル−CoAに変換する酵素をコードする遺伝子と、PHA合成にかかわる酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子とを発現する微生物であり、かつ
ポリグリコレート(polyglycolate)ポリマーを回収する
ことを含んでなる方法に関する。
1.異種由来のポリヒドロキシアルカノエート(PHA)シンターゼをコードする遺伝子、および
2.グリコール酸をグリコリル−CoAに変換する酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子。
炭素源を含む培地において、異種由来のポリヒドロキシアルカノエート(PHA)シンターゼをコードする遺伝子を発現する微生物を培養し、かつ
重合されたグリコール酸(PGA)を回収する
ことを含んでなり、
該微生物が、さらに、グリコール酸をグリコリル−CoAに変換する酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子を発現する方法に関する。
−(−O−CH2−CO−)− 式I
アシル−CoAシンテターゼまたはアシル−CoA転移酵素、
ブチレートキナ−ゼに関連するホスホトランスブチリラーゼ。
prpE遺伝子によりコードされる大腸菌またはサルモネラ チピムリウム(Salmonella Thyphimurium)由来のプロピニルコエンザイムAシンテターゼ、または
acs遺伝子によりコードされる大腸菌由来のアセチル−CoA転移酵素。
gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaattTACGTAtaaggaggtatatt
大文字記載:SnaBI制限酵素認識部位
アシル−CoAシンセターゼをコードする遺伝子を含む組換えベクターの構築
pSCB−acs、pSCB−prpEおよびpSCB―prpEstの構築
prpE(大腸菌由来またはS.thyphimurium由来)によりコードするプロピオニル−CoAシンテターゼ、またはacsによりコードするアセチル−CoAシンテターゼの、2つのタンパク質が、グリコール酸をグルコリルCoAに変換するために使用される。各遺伝子は、PHAシンターゼをコードする、ラルストニア ユートロファ由来のphaC1遺伝子と共に、細胞内で、共発現される。
PHAシンターゼおよびアシル−CoAシンテターゼをコードする遺伝子を含む組換えベクターの構築
pMK−Ptrc01/OP01/RBS01−phaC1re−TT02の構築
ラルストニア ユートロファ由来のphaC1の遺伝子を有するプラスミドは、企業により供給され、大腸菌において、最高の転写速度を得るための最適系列を備える遺伝子を合成する。
プラスミドpMK−Ptrc01/OP01/RBS01−phaC1re−TT02
を、HindIIIとBamHIとを用いて切断し、得られたPtrc01/OP01/RBS01−phaC1re−TT02を含むDNA断片を、同じ制限酵素により切断したpBBR1MCS5ベクターにクローンニングする。得られたプラスミドはpBBR1MCS5−Ptrc01/OP01/RBS01−phaC1re−TT02と呼ばれる。
を、HindIIIとBamHIとを用いて切断し、得られたPtrc01/OP01/RBS01−phaC1re−TT02を含むDNA断片を、同じ制限酵素により切断したpUC19ベクターにクローンニングする。得られたプラスミドはpUC19−Ptrc01/OP01/RBS01−phaC1re−TT02と呼ばれる。
pSCB−acsおよびpSCB−prpEプラスミドを、XbaIと、NheIとを用いて切断し、得られたacsまたはprpEのいずれかを含むDNA断片を、同じ制限酵素により切断したpMK−Ptrc01/OP01/RBS01−phaC1re−TT02ベクターにクローンニングする。得られたプラスミドは、pMK−Ptrc01/OP01/RBS01−phaC1re−acs−TT02およびpMK−Ptrc01/OP01/RBS01−phaC1re−prpE−TT02と呼ばれる。
pSCB−prpEstプラスミドを、PacIとNheIとを用いて切断し、得られたprpEstを含むDNA断片を、同じ制限酵素により切断したpBBR1MCS5−Ptrc01/OP01/RBS01−phaC1re−TT02ベクターにクローンニングする。得られたプラスミドは、pBBR1MCS5−Ptrc01/OP01/RBS01−phaC1re−prpEst−TT02と呼ばれる。
グリコレート存在下で培養した場合、PGAを生産する組換え大腸菌株の構築およびポリグリコレートポリマーの調製
pMK−Ptrc01/OP01/RBS01−phaC1re−acs−TT02およびpMK−Ptrc01/OP01/RBS01−phaC1re−prpE−TT02ベクターを、エレクトロポレーションにより、大腸菌MG1655野生株に導入し、それぞれMG1655(pMK−Ptrc01/OP01/RBS01−phaC1re−acs−TT02)およびMG1655(pMK−Ptrc01/OP01/RBS01−phaC1re−prpE−TT02)株を得た。
炭素源としてグルコースからグリコール酸を生産するように遺伝子組換えされた菌株は、特許WO2007/141316A、WO2007/140816A、US61/162,712およびEP09155971,6に公開されている。該菌株は、本明細書では、グルコースのみからPGAの生産を可能にするプラスミドの導入のために使われる。
三角フラスコにおけるグルコースからポリグルコール酸ポリマーを生産する菌株の発酵
発酵によるPGAの生産は以下の、遺伝子型(MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG−icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta(pME101−ycdW−TT07−PaceA−aceA−TT01)(pMK−Ptrc01/OP01/RBS01−phaC1re−prpE−TT02))を有するAG112株を用いて行われた。
バッチ式ファーメンターにおけるグルコースからポリグルコール酸ポリマーを生産する菌株の発酵
AG1122株(MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG−icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta(pME101−ycdW−TT07−PaceA−aceA−TT01)(pMK−Ptrc01/OP01/RBS01−phaC1re−prpE−TT02))によるPGAの生産を、供給バッチプロトコールを用いて、600mlのファーメンターの生産条件で、評価した。
三角フラスコにおけるグリコール酸のバイオコンバーションによるポリグリコール酸を生産する菌株の発酵
グリコール酸のPGAへのバイオコンバーションを、AG1327株(MG1655(pUC19−Ptrc01/OP01/RBS01−phaC1re−prpEst−TT02))により確認した。
サルモネラ チピムリウム由来のプロピオニル−CoAシンテターゼによるグリコール酸のグリコリル−CoAへの変換
[BL21(DE3)(pLysS)(pPAL−prpEst)組換え株の構築]
サルモネラ エンテリカ チピムリウム由来のprpE遺伝子を増幅するために、テンプレートとしてのプラスミドpPRP45と、pPAL−prpEst RおよびpPAL−prpEst Fと呼ばれるプライマー
pPAL−prpEst R(配列番号8)
CGAATTCCTATTCTTCGATCGCCTGGCG
pPAL−prpEst F(配列番号9)
CCCAAGCTTTGATGTCTTTTAGCGAATTTTATCAGCG
とを用いてPCRを行う。
PrpEstタンパク質の過剰生産は、2l三角フラスコの中で行う。
ユニークな前培養を、5g/lのグルコース、100ppmのアンピシリンおよび1g/lの硫酸マグネシウムを補充したLB培地(Bertani,1951,J.Bacteriol.62:293-300)50mlで満たした500ml三角フラスコで行う。前培養を、OD600=0.5になるまで、37℃、200rpmで培養し、その後、5g/lのグルコース、100ppmのアンピシリンおよび1g/lの硫酸マグネシウムを補充したLB培地500mlで満たされた2lフラスコの植え継ぎ用に使う。培養を、最初は、OD600が0.6〜0.8になるまで、37℃、200rpmで行い、500μMIPTGを用いた誘導前に、2つ目の工程として25℃に移動する。培養は、OD600が約4になる時、止められた。細胞を、4℃で、7000rpm、10分間遠心分離し、その後、−20℃で保管する前に、リン酸緩衝液で洗浄した。
細胞(45mg)を、超音波処理により溶解し、細胞片を、12000g(4℃)、30分間で遠心分離することにより取り除いた。タンパク質を、製造会社が推薦するプロトコールに従いProfinityカラム(BIORAD,Bio−Scale Mini Profinity exact cartridge)の親和性により、粗細胞抽出物から精製した。標識を、室温、30分間、100mMフッ化物を用いた開裂により、タンパク質から取り除いた。溶出バッファーは、100mMリン酸緩衝液、150mM塩化ナトリウムおよび10%グリセロールから成る溶液に対する透析により、交換した。
グリコレートにおけるPrpEの活性を、LC−MS(Applied/DIONEX)により、得られた分子、グリコリル−CoA(式1の化学的特徴)の検出により、測定する。反応混合物(250μl)は、75mMのリン酸緩衝バッファー(pH7.5)、1.5mM ATP、0.75mM CoAと、粗細胞抽出物10〜40μgまたは精製タンパク質9μgのいずれかとを含む。
図7:反応は、100mMグリコレートおよびPrepEstタンパク質を過剰生産するAG1354菌株の粗細胞抽出物40μgを用いて行った。
図8:反応は、40mMグリコレートおよび精製タンパク質9μgを用いて行った。
計算精密質量(Exact Mass)=825
分子式 =C23H38N7O18P3S
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Claims (17)
- 微生物を用いてグリコール酸を重合してPGAを得る方法であって、
炭素源を含む培地において、異種由来のポリヒドロキシアルカノエート(PHA)シンターゼをコードする遺伝子を発現する微生物を培養し、かつ
重合されたグリコール酸(PGA)を回収する
ことを含んでなり、
該微生物が、さらに、グリコール酸をグリコリルCoAに変換する酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子を発現する、方法。 - グリコール酸が、PHAシンターゼと、グリコール酸をグリコリルCoAに変換する少なくとも1つの酵素とをコードする遺伝子を発現する同じ微生物により生産される、請求項1に記載の方法。
- グリコール酸が、培養培地の中の微生物に対して外来的に供給される、請求項1に記載する方法。
- グリコール酸のグリコリル−CoAへの変換が、
a.アシル−CoAシンテターゼ
b.アシル−CoA転移酵素
c.ブチレートキナーゼに関連するホスホトランスブチリラーゼ
の中から選ばれる少なくとも1つの酵素によりなされる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の、方法。 - アシル−CoAシンテターゼおよびアシルCoA転移酵素が、prpEまたはacs遺伝子によりコードされる、請求項4に記載の方法。
- ホスホトランスブチリラーゼが、ptb遺伝子によりコードされ、かつ、ブチレートキナーゼが、buk遺伝子によりコードされる、請求項4に記載の方法。
- 前記遺伝子が過剰発現される、請求項5または6に記載の方法。
- 前記遺伝子が、微生物に導入されたプラスミドにより発現される、請求項7に記載の方法。
- 前記遺伝子が、前記微生物の染色体に組み込まれている、請求項7に記載の方法。
- 異種由来のPHAシンターゼをコードする遺伝子が、phaC、phaECまたはphaCRの中から選択される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子が過剰発現される、請求項10に記載の方法。
- 前記遺伝子が、微生物に導入されたプラスミドにより発現される、請求項11に記載の方法。
- 前記遺伝子が、前記微生物の染色体に組み込まれている、請求項11に記載の方法。
- 微生物が、PhaR/PhaP調節系を発現する、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法により得られる、重合されたグリコール酸。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載の、異種由来のPHAシンターゼとグリコール酸をグリコリルCoAに変換する少なくとも1つの酵素とをコードする遺伝子を発現する微生物。
- 前記微生物が、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)である、請求項16に記載の微生物。
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