KR20110033265A - 미생물에 의해 글리콜산을 중합하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전적으로 조작된 유기체로부터 폴리글리콜레이트(PGA)를 생산하고 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은;
1) 글리콜산을 함유하거나 함유하지 않는 배지 내에서, 글리콜레이트를 글리콜릴-CoA로 변환시키는 효소(들)을 코딩하는 하나 이상의 유전자 및 글리콜릴-CoA를 기질로 사용하는 폴리히드록시알카노에이트(PHA) 신타아제를 코딩하는 유전자를 발현시키는 미생물을 배양하는 단계,
2) 폴리글리콜레이트 중합체를 회수하는 단계
를 포함하는 방법에 관한 것이다.
1) 글리콜산을 함유하거나 함유하지 않는 배지 내에서, 글리콜레이트를 글리콜릴-CoA로 변환시키는 효소(들)을 코딩하는 하나 이상의 유전자 및 글리콜릴-CoA를 기질로 사용하는 폴리히드록시알카노에이트(PHA) 신타아제를 코딩하는 유전자를 발현시키는 미생물을 배양하는 단계,
2) 폴리글리콜레이트 중합체를 회수하는 단계
를 포함하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 PGA라고 불리우는 폴리글리콜산 중합체 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다:
- 글리콜레이트를 글리콜릴-CoA로 바꾸는 효소를 코딩하는 유전자 및 PHA 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 발현시키는 유전적으로 조작된 미생물을 글리콜산을 포함하거나 포함하지 않는 적절한 탄소원으로 배양시키는 단계 및
- 폴리글리콜레이트 중합체를 회수하는 단계.
PLA 및 PGA 중합체는 생분해성 열가소성 물질이며, 산업상 및 생의학상 용도가 광범위하다 (문헌 [Williams and Peoples, 1996, CHEMTECH 26, 38-44]).
이러한 폴리에스테르는 산업용 플라스틱 뿐 아니라 약물 전달 담체 (문헌 [Drug delivery and targeting. Nature 392, 5-10 (1998), Langer, R.]), 생체 물질 스캐폴드 및 의학 장치 (문헌[Biodegradable polyesters for medical and ecological applications. Macromol. Rapid Commum. 21, 117-132 (2000), Ikada, Y. & Tsuji, H.; Sterilization, toxicity, biocompatibility and clinical applications of polylactic acid/polyglycolic acid copolymers. Biomaterials 17, 93-102 (1996), Athanasiou, K. A. et al])와 같은 용도에서 의학용 생체 중합체로써도 중요한 역할을 한다. PGA는 양호한 특성: 심지어는 습도 80%에서도 매우 높은 기체 불투과성, 생분해성, 높은 기계적 강도, 및 양호한 성형성을 갖는 폴리에스테르 수지이다 (폴리(글리콜산), 문헌[Polymer data handbook (ed. Mark, J. E.) 566-569 (Oxford University Press, New York, 1999) Lu, L; & Mikos, A. G]). 이러한 고유의 특성의 조합은 PGA를 고성능 패키징 및 산업상 용도에 이상적으로 적절하게 한다. 오늘날, PGA가 목적으로 하는 용도는 탄산 음료 및 맥주를 위한 다중층 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 병이다. PGA가 PET에 비해 100배 더 높은 기체 차단성을 제공하므로, CO2 손실에 대해 동등한 차단성을 유지하면서 병에 사용되는 PET의 양을 20% 넘게 줄이는 것이 가능하다. 이러한 병 재디자인은 가격을 감소시킬 수 있는 잠재성을 갖는다. 아마도 가장 중요하게는, PGA의 고유의 가수분해 특성은 넓게 실행되는 산업용 PET 재활용 공정과의 상용성을 높게 하며, 물질이 재활용된 PET의 순도 및 품질에 지장을 주지 않음을 보장한다. 또 다른 패키징 용도에서, PGA 다중층 디자인은 폴리락트산(PLA)와 같은 생물-기반 중합체의 기체 및 수분 차단성을 향상시키는 것으로 나타났다. 생분해성 용도에서의 확장된 용도 전반에서, PGA는 추가로 환경 보존에 기여할 것이다.
현재, PGA는 두 가지 다른 화학적 경로, 즉 시클릭 디에스테르의 개환 중합 또는 2-히드록시카르복실산의 중축합 중 하나로 제조된다. 시클릭 디에스테르의 개환 중합은 다음 세 단계로 구성된다: (i) α-히드록시카르복실산의 중축합, (ii) 열 짝풀림(unzipping) 반응에 의한 시클릭 디에스테르의 합성 및 (iii) 시클릭 디에스테르의 개환 중합 (문헌[Preparative Methods of Polymer Chemistry 2nd edition, Interscience Publishers Inc, New York 1963, Sorensen, W. R. & Campbell, T. W.; Controlled Ring-opening Polymerization of Lactide and Glycolide. Chem. Rev. 104, 6147-6176 (2004), Dechy-Cabaret, O. et al.,]). 다르게는, 글리콜산의 직접적인 중축합에 의해 저분자량 PGA가 생산될 수 있음이 공지되어 있다. 저분자량 중합체만이 달성되는 것은 주로 물, 해중합을 선호하는 중합 도중의 부산물 제거의 어려움 때문이다 (문헌[Synthesis of polylactides with different molecular weights. Biomaterials 18, 1503-1508 (1997), Hyon, S. -H. et al.,]). 따라서, 배위 개시제를 사용한 시클릭 디에스테르의 개환 중합이 고분자량 중합체의 합성에 바람직하다. 그러나 이러한 과정은 제거하기 쉽지 않은 용매 또는 사슬 커플링제 (개시제)의 첨가 때문에 단점을 갖는다.
한편, 또한 미생물성 폴리에스테르 및 폴리히드록시알카노에이트, PHA라고 불리우는 박테리아성 폴리에스테르는 필수 영양소의 공급 제한 및 여분의 탄소원의 존재 때문에 불균형한 성장에 의한 대사 스트레스의 결과로써 세포 내 과립으로 저장된다 (렌츠 및 마르쉐솔트 2005; 렌츠 1993; 수데쉬 등 2000; 수데쉬 및 도이 2005; 스타인뷔헬 및 퓌흐텐부쉬 1998; 스타인뷔헬 및 발렌틴 1995; 스타인뷔헬 1991). PHA는 광범위한 다른 그램-양성 및 그램-음성 박테리아, 및 일부 고세균에 의해 자연적으로 합성된다. PHA는 인장 강도 및 강성 측면에서, 기존의 석유화학-기반의 폴리프로필렌과 이러한 생체 중합체와의 물리적 특성의 유사성 때문에 최근 수십년간 상당한 주목을 끌어왔다 (수데쉬 등, 2000). 그러나, 기존의 플라스틱과는 달리, PHA는 생분해성이고 자연에서 재활용 가능하므로, 이러한 종류의 중합체는 환경친화적이다.
측쇄의 길이에 따라 두 유형의 PHA가 구별된다.
한 유형은 짧은 알킬 측쇄 (3-5 탄소 원자)가 있는 단쇄 길이의 히드록시알칸산, sclPHA로 이루어지며, 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)에 의해 생성된다 (렌츠 및 마르쉐솔트 2005).
두 번째 유형은 긴 알킬 측쇄 (6-14 탄소 원자)가 있는 중간 길이의 히드록시알칸산, mclPHA로 이루어지며, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans) 및 다른 슈도모나스(Pseudomonas)에 의해 생산된다 (팀 및 스타인뷔헬, 1990) (노무라, 씨. 티. & 타구치, 에스., 2007; 스타인뷔헬, 에이. & 하제르, 비., 2007). 비록 가장 잘 연구된 PHA가 폴리(3-히드록시부티레이트)(PHB), 즉 3-히드록시부티레이트(3HB)의 중합체이지만, 150가지가 넘는 구성성분 단량체가 있다 (문헌[Steinbuechel A. Valentin AE. FEMS Microbiol Lett 1995, 128:219-228; Madison L. and Huisman G. Microbiol and Mol Biol Reviews, 1999, 63:21-53; Rehm B. Biochem J 2003, 376:15-33]). 이러한 매우 다양한 단량체는 중합체 조성에 따르는 다양한 물질 특성을 갖는 PHA를 야기한다.
미생물 내 PHA 합성에의 최소 요구조건은 (>3)-히드록시알카노일-CoA 공급원 및 적절한 PHA 신타아제이다 (문헌[Gerngross and Martin, PNAS 92:6279-83, 1995]). 폴리에스테르 신타아제는 폴리에스테르 생합성의 핵심 효소이고 CoA를 공동 방출시키면서 (R)-(>3)-히드록시아실-CoA 티오에스테르가 폴리에스테르로 변환하는 것에 대한 촉매 작용을 한다. 이러한 폴리에스테르 신타아제는 생화학적으로 특성화된다. 이러한 최근 발견의 개요가 (렘, 2003)에 제공되어 있다. 그들의 서열, 그들의 기질 특이성, 및 그들의 서브유닛 조성에 따라 4 가지의 주요 PHA 신타아제 종류가 있다 (문헌[Rhem B. H. A. Biochem J. 2003, 376: 15-33]). PHA 생합성에 대한 주요 효소를 대표하는 PHA 신타아제의 낮은 기질 특이성 때문에, 발효에 의해 직접적으로 생산될 수 있는 박테리아성 PHA의 가변성은 보기 드물게 크다. 적절한 생산 균주 및 적절한 배양 조건 및 탄소원의 선택에 의해, 맞춤 조성을 갖는 PHA가 생산될 수 있다. 문헌에는 랄스토니아 유트로파, 메틸박테리아, 슈도모나스와 같은 천연 생산자의 유기체에 의해, 그리고 대장균 같은 재조합 박테리아 천연 생산자 등에 의한 PHA의 생산을 나타내는 많은 예들이 있다 (문헌[Qi et al, FEMS Microbiol. Lett, 157:155, 1997; Qi et al, FEMS Microbiol. Lett., 167:89, 1998; Langenbach et al., FEMS Microbiol. Lett., 150:303, 1997; Madison L. and Huisman G., 1999; WO 01/55436; U. S. Pat. No. 6.143.952; WO 98/54329; WO 99/61624]).
PHA 신타아제는 (>3)-히드록시아실-CoA를 기질로 사용하여 PHA를 합성한다. 따라서, 중합의 제1 단계는 (>3)-히드록시아실-CoA 티오에스테르, 즉 신타아제 기질의 획득이다. 따라서, 히드록시산에서 (R)-(>3)-히드록시아실-CoA 티오에스테르로의 형질전환은 폴리에스테르의 생합성에 필수적인 단계이다.
다음 효소들이 3-히드록시아실-CoA을 생성할 수 있는 효소로 알려져 있다: β-케토티올라아제 (PhaA), 랄스토니아 유트로파로부터 클로닝된 아세토아세틸-CoA 환원효소 (PhaB), 슈도모나스로부터 클로닝된 3-히드록시데카노일-ACP:CoA 전이효소 (PhaG), 에어로모나스 카비에(Aeromonas caviae) 및 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유도된 (R)-특이성 에노일-CoA 수화효소 (PhaJ) [문헌[Fukui et al., J. Bacteriol. 180:667, 1998; Tsage et al., FEMS Microbiol. Lett. 184:193, 2000]), 대장균 및 슈도모나스 애루지노사로부터 유도된 3-케토아실-ACP 환원효소 (FabG) (문헌[Taguchi et al., FEMS Microbiol. Lett. 176:183, 1999; Ren et al., J. Bacteriol. 182:2978, 2000; Park et al., FEMS Microbiol. Lett. 214:217, 2002]). 다양한 종류의 PHA가 탄소 사슬 내 다양한 위치 (주로 3,4,5 및 6 위치)에서 히드록실화된 히드록시알카노에이트를 사용하여 이러한 효소로 합성되어 왔다. 그러나, 이는 2-위치에서 히드록실화된 히드록시알카노에이트에 대해 매우 작은 PHA 신타아제 활성을 갖는다고 보고되어 있다 (문헌[Zhan et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 56:131, 2001; Valentin and Steinbuechel, Appl. Microbiol. Biotechnol. 40:699, 1994; Yuan et al, Arch. Biochem. Biophysics. 394:87, 2001]).
살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)로부터 유전자를 코딩하는 프로피오닐 보조효소 A 합성효소는 2000년에 클로닝되었고 PrpE라고 명명되었다; 참고자료 (발렌틴 등., 2000) 참고. 이 효소의 보고된 기질은 프로피오네이트, 아세테이트, 3-히드록시프로피오네이트, 및 부티레이트이다. 이 효소는 이러한 기질이 그들의 상응하는 보조효소 A 에스테르로의 형질전환되는 데에 촉매 작용을 한다. 이 효소가 재조합 대장균 내 랄스토니아 유트로파로부터 PHA 신타아제와 함께 공동-발현할 때, PHA 공중합체의 형성이 관찰된다.
대장균으로부터 유전자를 코딩하는 아세틸-CoA 합성효소는 2006년에 클로닝되었고 acs라고 명명되었다; 참고자료 (린 등, 2006) 참조. 대장균 내에서 과발현되면, 이 효소는 아세테이트를 아세틸-CoA로 형질전환시킴으로써 상기 아세테이트가 미생물 내에 축적되는 것을 감소시킨다.
비록 150이 넘는 다른 단량체가 유기체 내 PHA로 혼입되더라도, 2-위치 탄소에서 히드록실화된 글리콜레이트와 같은 히드로알카노에이트가 PHA 신타아제에 대한 적절한 기질이 아니기 때문에, 생합성 폴리글리콜리드 PGA의 생산이 전혀 보고된 바 없다.
두 개의 특허 출원이 살아있는 세포 내 PHA 신타아제의 활동에 의한 중합체 내 2-히드록시산 단량체의 혼입을 기술한다.
US 2007/0277268 (조 등)은 세포 또는 식물에 의한 폴리락테이트(PLA) 또는 이의 공중합체의 생물 생산에 관한 것이다.
WO 2004/038030 (마틴 등)은 글리콜릴-CoA 단량체 및 3-히드록시부티르산, 3-히드록시프로피온산, 3-히드록시발레르산 등으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 다른 단량체 함유 공중합체의 형성을 개시한다. 이 경우, 기질 글리콜릴-CoA는 4-히드록시부티릴-CoA 분자를 통해 얻고, 반응은 FadE, AtoB 및 티올라아제 II를 요한다.
현재까지, 입수 가능한 선행 기술 문헌에는 미생물 발효에 의한 글리콜산(PGA) 단독중합체의 생산 과정이 결코 보고된 바 없다.
이에, 발명자들은 미생물을 이용하여 고분자량 PGA를 생산하는 방법을 개발하였다. 본 명세서에서 개시된 바와 같이, 발명자들은 폴리글리콜산 단독중합체가 적절한 탄소원 함유 생산 배지 내에서 PHA 신타아제 유전자 및 글리콜레이트를 글리콜릴-CoA로 바꾸는 효소를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물을 배양함으로써 생산된다는 것을 개시한다.
본 발명의 대상은 PGA, 즉 글리콜산 단독중합체의 생합성 방법을 제공하는 것이다.
이 방법은 재조합 미생물의 사용에 기초하며,
1. 이종 폴리히드록시알카노에이트(PHA) 신타아제를 코딩하는 유전자, 및
2. 글리콜산을 글리콜릴-CoA로 형질전환시키는 효소(들)을 코딩하는 하나 이상의 유전자
를 발현시킨다.
본 발명의 다른 대상은 본 발명에 따른 공정으로 얻어진 것과 같은 생합성 PGA, 및 본 발명에 따른 PGA 생합성을 위한 유전자를 발현시키는 미생물이다.
도 1은 폴리글리콜산 중합체 PGA의 생산을 위한 연속 반응을 나타낸다. 제1 반응은 글리콜릴-CoA, 즉 PHA 신타아제에 의해 촉매 작용을 받는 중합의 제2 반응 기질의 형성이다.
도 2는 포도당 및 글리콜레이트를 함유하는 배지 상에서 배양된 세포를 사용하여 폴리글리콜레이트를 합성하는 경로를 나타내는 개략도이다.
도 3은 외인성 글리콜레이트가 전혀 없는 포도당을 함유하는 배지 상에서 배양된 세포를 사용하여 폴리글리콜레이트를 합성하는 경로를 나타내는 개략도이다.
도 4는 삼각 플라스크 내 LB + 포도당에서 성장된 균주 AG1122의 현미경 관찰 (X100)을 나타낸다. 광학 현미경 AVANTEC 3804921.
도 5는 발효기 내 LB + 포도당에서 성장된 균주 AG1122의 현미경 관찰 (X100)을 나타낸다. 광학 현미경 AVANTEC 3804921.
도 6은 삼각 플라스크 내 변형된 M9 + 포도당에서 성장된 균주 AG1327의 현미경 관찰 (X100)을 나타낸다.
도 7은 균주 AG1354의 조 세포 추출물에서 글리콜레이트와의 반응의 LC-MS 크로마토그램을 나타낸다.
도 8은 순수한 단백질 PrpEst 상에서 글리콜레이트와의 반응의 LC-MS 크로마토그램을 나타낸다.
도 2는 포도당 및 글리콜레이트를 함유하는 배지 상에서 배양된 세포를 사용하여 폴리글리콜레이트를 합성하는 경로를 나타내는 개략도이다.
도 3은 외인성 글리콜레이트가 전혀 없는 포도당을 함유하는 배지 상에서 배양된 세포를 사용하여 폴리글리콜레이트를 합성하는 경로를 나타내는 개략도이다.
도 4는 삼각 플라스크 내 LB + 포도당에서 성장된 균주 AG1122의 현미경 관찰 (X100)을 나타낸다. 광학 현미경 AVANTEC 3804921.
도 5는 발효기 내 LB + 포도당에서 성장된 균주 AG1122의 현미경 관찰 (X100)을 나타낸다. 광학 현미경 AVANTEC 3804921.
도 6은 삼각 플라스크 내 변형된 M9 + 포도당에서 성장된 균주 AG1327의 현미경 관찰 (X100)을 나타낸다.
도 7은 균주 AG1354의 조 세포 추출물에서 글리콜레이트와의 반응의 LC-MS 크로마토그램을 나타낸다.
도 8은 순수한 단백질 PrpEst 상에서 글리콜레이트와의 반응의 LC-MS 크로마토그램을 나타낸다.
본 발명은 미생물에 의해 글리콜산을 PGA로 중합하는 방법에 관한 것이며, 하기 단계들을 포함한다:
- 탄소원을 포함하는 배지 내에서 이종 폴리히드록시알카노에이트(PHA) 신타아제를 코딩하는 유전자를 발현시키는 미생물을 배양시키는 단계(이때 미생물은 또한 글리콜산을 글리콜릴-CoA로 형질전환시키는 효소(들)을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 발현시킴), 및
- 중합된 글리콜산(PGA)를 회수하는 단계.
용어 "중합" 또는 "동종중합"은 단량체 분자가 서로 연결되어 분자량이 원 물질의 분자량의 다수배인 거대 분자를 형성하는 화학 반응을 의미한다. 둘 이상의 다른 단량체들이 관여하면, 과정은 공중합 또는 이종중합이라고 불리운다.
'PGA'는 도 1에서 하기 화학식 I로 나타난 글리콜산-반복 단위로 이루어진, 또한 폴리글리콜레이트라고 불리우는 폴리글리콜산을 지칭한다:
-(-O-CH2-CO-)-
PGA는 55 중량% 이상의 상기 글리콜산-반복 단위 (또한 글리콜레이트라고 불리움)을 포함하는 단독중합체이다. PGA 수지 내 상기 글리콜산-반복 단위의 함량은 55 중량% 이상, 바람직하게는 70 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 90 중량%이다.
PGA는 헥사플루오로이소프로판올 용매를 사용한 GPC 측정에 따르면, 바람직하게는 10,000 - 600,000 달톤 범위의 중량-평균 분자량을 갖는다. 150,000 - 300,000 달톤의 중량-평균 분자량이 더욱 바람직하다.
본 발명에 따르면, 용어 '배양' 또는 '발효'는 상호교환적으로 사용되며, 탄소원을 함유하는 적절한 성장 배지 상에서의 박테리아의 성장을 의미한다.
문장 "배지로부터 중합된 글리콜산을 회수함"은 당업자에게 잘 알려진 것과 같은 PGA 회수 활동을 지칭한다. 특히, 생산 세포가 원심분리로 수집되고 동결-건조된 후, 균주 내에 축적된 중합체 물질은 헥사플루오로이소프로판올(HFIP), 테트라히드로푸란(THF), 디메틸술폭시드 또는 클로로포름과 같은 용매를 사용하여 회수된다 (라가빈 등, 1988; 아마라 등, 2002). PGA는 상기 용매 중 하나 이상을 사용하여, 가장 우선적으로는 HFIP 용매를 사용하여 동결건조된 세포로부터 추출되고, 그 뒤 에탄올 또는 메탄올 내 침전된다. 고순도의 PGA를 위해 침전물을 원심분리로 얻고, 클로로포름에 용해시키고 다시 침전시킨다. 중합체는 NMR에 의해 추가로 분석된다.
용어 "미생물"은 박테리아, 효모 또는 진균류를 지칭한다. 우선적으로는, 미생물은 장내세균과(Enterobacteriaceae), 간균과(Bacillaceae), 스트렙토마이세스과(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아과(Corynebacteriaceae) 중에서 선택된다. 더욱 우선적으로는, 미생물은 대장균속(Escherichia), 클렙시엘라(Klebsiella), 판토에아(Pantoea), 살모넬라(Salmonella) 또는 코리네박테리아 종이다. 더욱 우선적으로는, 미생물은 대장균이다.
본 발명에 따른 용어 "탄소원"은 당업자가 미생물의 정상 성장을 지지하는데 사용할 수 있는, 6탄당류 (예를 들어, 포도당, 갈락토오스 또는 락토오스), 5탄당류, 단당류, 이당류 (예를 들어, 수크로오스, 셀로바이오스 또는 말토오스), 올리고당류, 당밀류, 전분 또는 그의 유도체, 헤미셀룰로오스, 글리세롤 및 그들의 조합일 수 있는 임의의 탄소원을 의미한다. 특히 바람직한 간단한 탄소원은 포도당이다. 또 다른 바람직한 간단한 탄소원은 수크로오스이다.
용어 "글리콜산을 글리콜릴-CoA로 형질전환시키는 효소"는 글리콜산 분자를 글리콜릴-CoA, 즉 중합 과정에서 PHA 신타아제에 대한 기질로 활성화시킬 수 있는 효소를 지칭한다.
본 발명의 제1 양상에 따르면, 글리콜산은 PHA 신타아제를 코딩하는 유전자 및 글리콜산을 글리콜릴-CoA로 형질전환시키는 하나 이상의 효소를 발현시키는 동일 미생물에 의해 생산된다. 발효에 의해 재생가능한 탄소원으로부터 고수준의 글리콜산을 생산하는 미생물은 앞서 기술되었다; 특히 WO 2007/140816 및 WO 2007/141316을 참조한다.
이는 또한 미생물을 생산하는 이러한 글리콜산으로부터 글리콜산의 외수송(exportation)을 감소시키기에 유리할 것이다. 당업자는 그러한 특정 대사물의 수송 감소를 이루는, 특히 글리콜산을 미생물로부터 배지로 외수송시킬 수 있는 수송 단백질의 활성 및/또는 발현을 감소시키거나 저해하는 다수의 수단을 안다.
본 발명의 제2 양상에 따르면, 글리콜산은 배지 내에서 외인성으로 미생물에 제공된다.
특히, 2 그램/리터 이상의, 우선적으로는 10 g/L 이상의 양의 글리콜산이 배지에 첨가된다. 당업자는 고농도의, 예를 들어 30 g/L의 글리콜산의 독성을 회피하게끔 투여량을 조절할 것이다. 앞서 기술된 바와 같이, 본 발명에 따른 미생물 내에서 글리콜산의 외수송은 감소될 수 있거나 심지어는 완전히 방지된다. 배지에 존재하는 글리콜산의 내수송(importation)을 향상시키는 것이 또한 유리할 것이다. 당업자는 그러한 특정 대사물 내수송의 향상을 이루기 위한, 특히 글리콜산을 배지로부터 미생물로 내수송시킬 수 있는 투과효소 단백질의 활성 및/또는 발현을 증가시키기 위한 다수의 수단을 안다. 특히, 글리콜레이트 수송자를 코딩하는 유전자 glcA, lldP 및 yjcG를 과발현시키는 것이 유리할 것이다 (문헌[Nunez, F. et al., 2001 Microbiology, 147, 1069-1077; Nunez, F. et al, 2002 Biochem. And Biophysical research communications 290, 824-829; Gimenez, R. et al., 2003 J. of Bacteriol. 185, 21, 6448-6455]).
본 발명의 바람직한 양상에서, 글리콜산을 글리콜릴-CoA로 형질전환시키는 효소는 다음 중에서 선택된다:
- 아실-CoA 합성효소 또는 아실-CoA 전이효소,
- 부티레이트 키나아제 관련 포스포트랜스부티릴라아제.
혐기성 박테리아 내에서 발견되는 아실-CoA 전이효소는 단쇄 내지 중간쇄 길이 CoA-티오에스테르의 형성에 대한 촉매 작용을 하는 것으로 알려져 있다 (마크, 엠. 및 버클, 더블유. 1997).
본 발명의 제1 양상에서, 글리콜산을 글리콜릴-CoA로 형질전환시키는 효소는 장내세균과 종에 속하는 유전자 중에서 선택되고, 가장 바람직하게는 다음과 같다:
- 유전자 prpE에 의해 코딩된 대장균 또는 살모넬라 티피무리움(Salmonella Thyphimurium)으로부터의 프로피오닐 보조효소 A 합성효소; 또는
- 유전자 acs에 의해 코딩된 대장균으로부터의 아세틸-CoA 전이효소.
본 발명의 제2 실시예에서, 포스포트랜스부티릴라아제는 유전자 ptb에 의해 코딩되고 부티레이트 키나아제는 유전자 buk에 의해 코딩된다.
용어 "코딩됨" 또는 "코딩"은 폴리뉴클레오티드가 전사 및 번역 메커니즘을 거쳐 아미노산 서열을 생산하는 과정을 의미한다. 이 과정은 DNA 내 염기 서열 및 단백질 내 아미노산 서열 간의 관계인 유전자 코드에 의해 이루어진다. 유전자 코드의 하나의 주요한 특성은 변성되는 것이며, 이는 하나의 아미노산이 하나 초과의 염기의 트리플렛 (하나의 "코돈")에 의해 코딩될 수 있음을 의미한다. 직접적인 결과는 동일한 아미노산 서열이 다른 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다는 것이다. 당업자들은 코돈의 사용이 유기체에 따라 달라질 수 있음을 잘 안다. 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 중에서, 일부는 특정 미생물에 의해 우선적으로 사용될 수 있다. 따라서 이러한 유기체 내 상응하는 단백질의 발현을 최적화하기 위해 특정 미생물의 코돈 사용량에 맞게 폴리뉴클레오티드를 디자인하는 것이 관심의 대상일 수 있다.
본 발명의 명세서에서, 유전자 및 단백질은 대장균 내 상응하는 유전자 명칭을 사용하여 확인된다. 그러나, 그리고 달리 구체화하지 않으면, 이러한 종류의 사용은 본 발명에 따라 더욱 일반적인 의미를 갖고, 다른 유기체, 더욱 특히 미생물 내 모든 상응하는 유전자 및 단백질을 포괄한다.
PFAM (단백질 정렬 과 데이터베이스 및 히든(hidden) 마르코프 모델; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)은 단백질 서열 정렬의 많은 수집을 보여준다. 각각의 PFAM은 다중 정렬을 가시화하고, 단백질 도메인을 알고, 유기체간의 분포를 평가하고, 다른 데이터베이스로 접근하고, 공지의 단백질 구조를 가시화하는 것을 가능하게 한다.
COG (단백질의 이종상동 군의 클러스터; http://www.ncbi.nlm.nih. gov/COG/)은 30개의 주요 계통발생학적 세포주를 나타내는 66개의 완전히 서열화된 게놈과 단백질 서열을 비교하여 얻는다. 각각의 COG는 3개 이상의 세포주로부터 정의되며, 이전에 보존된 도메인의 확인을 가능하게 한다.
상동 서열 및 그들의 상동성 백분율을 확인한다는 것의 의미는 당업자에게 잘 알려져 있고, 특히 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/와 웹사이트 상에서 지시된 디폴트 파라미터로부터 사용될 수 있는 BLAST 프로그램을 포함한다. 획득된 서열은 그 뒤, 예를 들어, 프로그램 CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) 또는 MULTALIN (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)와 웹사이트 상에 지시된 디폴트 파라미터를 사용하여 개발(예를 들어, 정렬)될 수 있다.
당업자들은 진뱅크(GenBank)에서 제공하는 공지의 유전자에 대한 참고자료를 사용하여, 다른 유기체, 박테리아성 균주, 효모, 진균류, 포유류, 식물 등 내의 동등한 유전자를 결정할 수 있다. 이러한 일상적인 일은 다른 미생물로부터 유도된 유전자로 서열 정렬을 수행함으로써, 그리고 변성 프로브를 또 다른 유기체 내 상응하는 유전자를 클로닝하도록 디자인함으로써 결정될 수 있는 공통 서열을 사용하여 유리하게 행할 수 있다. 이러한 분자 생물학의 일상적인 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어, 샘브루크 등 (문헌[1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York])에서 주장되었다.
본 발명은 또한 숙주 미생물 내에서 기능을 발휘하는 조절 요소의 제어 하에서 글리콜산을 글리콜릴-CoA로 형질전환시키는 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다.
용어 "발현"은 상응하는 단백질, 유전자 생성물의 생성을 야기하는 유전자 서열의 전사 및 번역을 말한다.
본 발명의 바람직한 양상에서, 글리콜산을 글리콜릴-CoA로 형질전환시키는 효소(들)을 코딩하는 유전자(들)이 미생물로 과발현된다.
용어 "증가된 발현" "향상된 발현" 또는 "과발현"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고 유사한 의미, 즉 비-재조합 미생물에 비해 유전자의 전사 및 번역이 증가되어, 세포 내로 증가된 양의 효소를 야기하는 것을 말한다.
유전자의 발현을 증가시키기 위해, 본 분야의 전문가는 유전자 발현을 조종하는 다른 방법을 안다. 특히, 유전자는 유도될 수 있는 다른 강도를 갖는 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다. 이러한 프로모터는 상동 또는 이종일 수 있다. 당업자는 어느 프로모터가 가장 편리한지 알며, 예를 들어 프로모터 Ptrc, Ptac, Plac 또는 람다 프로모터 cI이 널리 사용된다.
본 발명의 일 실시예에서, 유전자(들)은 미생물로 도입되는 플라스미드 또는 벡터에 의해 발현될 수 있다. 상기 미생물은 그 뒤 "숙주 미생물"이라고 불리우며, 외래 또는 이종 유전자 또는 그 자신의 유전자의 여분의 복제본을 받아들일 수 있고 그러한 유전자를 발현시켜 활성 단백질 생산물을 생산하게 할 수 있는 미생물을 말한다.
용어 "형질전환"은 새로운 유전자 또는 존재하는 유전자의 여분의 복제본의 숙주 유기체 내로의 도입을 말한다. 예를 들어, 대장균에서, DNA를 숙주 유기체로 전달시키는 방법은 전기천공법(electroporation)이다.
용어 "형질전환 벡터"는 숙주 유기체 내에 폴리뉴클레오티드를 도입시키는데에 사용되는 임의의 운반체를 말한다. 그러한 운반체는 사용되는 유기체에 따라 예를 들어 플라스미드, 파지 또는 본 기술분야의 전문가에게 공지된 다른 성분들일 수 있다. 형질전환 벡터는 일반적으로 폴리뉴클레오티드 또는 발현 카세트에 추가로 특정 숙주 세포의 형질전환을 용이하게 하는 다른 성분을 함유할 수 있다. 발현 벡터는 카세트 및 숙주 유기체 내로 벡터의 복제를 가능하게 하는 추가의 성분들에 의해 전달되는 유전자의 적절한 발현을 가능하게 하는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 숙주 유기체 내 단일 복제본이나 다중 복제본으로 존재할 수 있다. 당업자는 그들의 복제 개시점 및 그에 따른 세포 내 복제수가 다른, 다른 유형의 플라스미드를 안다. 그들은 치밀한 복제 (pSC101, RK2)가 있는 저복제수 플라스미드, 저복제수 플라스미드 (pACYC, pRSF1010) 또는 고복제수 플라스미드 (pSK 블루스크립트 II)에 대하여 1-5 복제본, 약 20 또는 500 이하의 복제본으로 존재할 수 있다.
본 발명은 글리콜산을 글리콜릴-CoA로 형질전환시키는 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 유전자(들)은 미생물의 염색체로 통합될 수 있다. 당업자에게 잘 알려진 재조합 방법에 의해 유기체 게놈으로 도입될 수 있는 하나 또는 몇몇의 유전자 복제본이 있을 수 있다.
유전자의 과발현을 획득할 수 있는 또 다른 수단은, 만약 mRNA의 번역이 최적화되었다면, 상응하는 메신저 RNA를 안정화시키는 성분의 발현 또는 조절을 개선하여 (문헌[Carrier et al. Biotechnol Bioeng. 59:666-72, 1998]) 이용 가능한 효소의 양을 증가시키는 것이다.
본 발명에서 사용된 재조합 미생물은 또한 폴리히드록시알카노에이트 신타아제를 코딩하는 유전자를 발현시킨다. PHA의 네 가지의 주요 클래스가 구별될 수 있다(렘, 비., 2003). 클래스 I 및 클래스 II PHA 신타아제는 단지 한 가지 유형의 서브유닛 (PhaC)로 이루어진 효소를 포함한다. 그들의 생체 내 및 시험관 내 특이성에 따라, 클래스 I PHA 신타아제 (예를 들어, 랄스토니아 유트로파 내)는 3 내지 5의 탄소 원자를 포함하는 다양한 히드록시 지방산의 CoA-티오에스테르를 우선적으로 이용하며, 클래스 II PHA 신타아제 (예를 들어, 슈도모나스 애루지노사 내)는 6 내지 14 탄소 원자를 포함하는 다양한 히드록시 지방산의 CoA-티오에스테르를 우선적으로 이용한다. 클래스 III 신타아제 (예를 들어, 알로크로마티움 비노섬(Allochromatium vinosum) 내)는 두 가지 다른 유형의 서브유닛: PhaC 및 PhaE 서브유닛으로 이루어진 효소를 포함한다. 이러한 PHA 신타아제는 3 내지 5의 탄소 원자를 포함하는 히드록시 지방산의 CoA-티오에스테르를 선호한다. 클래스 IV PHA 신타아제 (예를 들어, 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium) 내)는 클래스 III PHA 신타아제와 유사하나, PhaE가 PhaR로 대체된다.
본 발명의 특정 실시예에서, 이종 PHA 신타아제를 코딩하는 유전자는 phaC, phaEC 또는 phaCR 중에서, 우선적으로는 phaC 및 phaEC 중에서 선택되고, 가장 우선적으로 선택된 유전자는 클래스 I PHA 신타아제의 효소를 코딩하는 phaC이다. 사전에 언급한 바와 같이, 이러한 명칭 'phaC, 'phaEC' 및 'phaCR'의 사용은 다른 유기체 내, 더욱 특히 미생물 내 모든 상응하는 유전자 및 단백질을 포괄한다. 사실, 진뱅크에서 제공하는 공지의 유전자에 대한 참고자료를 사용하면, 당업자들은 다른 유기체, 박테리아성 균주, 효모, 진균류, 포유류, 식물 등 내의 동등한 유전자를 결정할 수 있다. 이러한 일상적인 일은 다른 미생물로부터 유도된 유전자로 서열 정렬을 수행함으로써, 그리고 변성 탐침이 또 다른 유기체 내 상응하는 유전자를 클로닝하도록 디자인함으로써 결정될 수 있는 공통 서열을 사용하여 유리하게 행할 수 있다. 모든 동등한 유전자는 본 명세서에서 참고로 포함된다.
우선적으로는, 이종 PHA 신타아제를 코딩하는 상기 유전자는 과발현된다. 앞서 언급한 바와 같이, 유전자의 과발현은 당업자에게 공지된 다른 방법으로 이루어질 수 있다; 유전자는 미생물로 도입된 발현 벡터에 의해 발현될 수 있거나, 상기 미생물의 염색체로 통합될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 방법에서 사용된 재조합 미생물은 또한 PhaR/PhaP 조절 시스템을 발현시키며, 특히 미생물은 각각 파진(phasin) 및 그것의 전사 발현 조절자를 코딩하는 W. 유트로파로부터의 유전자 phaP 및 phaR을 발현시킨다. 파진 단백질, PhaP는 PHA 합성의 최적의 세포 내 환경의 유지에 관여하고 과립 형성 과정 도중의 유도를 제공하는 것 같다 (바이조렉, 알. 등 1995). PhaR 동종체는 시험관 내 및 생체 내 양쪽 모두에서 연구되었고 (바이조렉 알. 등 1995 및 요크 지.엠. 등 2002) phaP 전사의 조절자로써 기능을 수행한다고 제안되었다.
이러한 명칭 'phaP' 및 'phaR'의 사용은 다른 미생물 내 모든 상응하는 유전자 및 단백질을 포괄한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법으로 얻은 중합된 글리콜산 (PGA)에 관한 것이다.
본 발명의 주요 이점은 글리콜산으로부터 생산하기 어려운 화합물인 글리콜리드의 사용이 필요한 화학적 방법에 비해 더 쉽고 더 싼 방법으로 PGA를 생산하는 것이다.
본 발명은 또한 이종 PHA 신타아제 및 글리콜산을 글리콜릴-CoA로 형질전환시키는 하나 이상의 효소를 코딩하는 유전자를 발현시키는 미생물에 관한 것이다.
우선적으로, 상기 미생물은 장내세균과이고, 더욱 우선적으로는 대장균이다.
실시예
표 1: 하기 기술된 구조로 사용되는 올리고뉴클레오티드의 서열.
오퍼레이터가 있는 Ptrc01 프로모터 및 RBS 서열 7:
대문자: 제한 자리 SnaBI.
실시예
1
아실-
CoA
합성효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터의 구축
pSCB
-
acs
,
pSCB
-
prp
E
및
pSCB
-
prp
E
st
의 구축
두 가지 단백질이 글리콜산을 글리콜릴-CoA로 형질전환시키는데에 사용되며, 각각 (대장균 또는 S. 티피무리움으로부터) prpE에 의해 코딩되는 프로피오닐-CoA 합성효소이거나 acs에 의해 코딩되는 아세틸-CoA 합성효소이다. 각각의 유전자는 PHA 신타아제를 코딩하는 랄스트로니아 유트로파로부터 세포 내에서 유전자 phaC1과 공동 발현된다.
acs 및 prpE 유전자를 증폭시키기 위해, 대장균의 염색체 DNA를 주형으로, 그리고 acs 증폭을 위해 asc F 및 acs R, 및 prpE 증폭을 위해 prpE F 및 prpE R로 명명된 상기 프라이머들 (표 1 참조)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
acs의 PCR 절편은 벡터 pSCB (스트라테이진 블런트 PCR 클로닝 키트 CAT 240207-5)로 클로닝되어 플라스미드 pSCB-acs를 야기한다.
prpE의 PCR 절편은 벡터 pSCB로 클로닝되어 플라스미드 pSCB-prpE를 야기한다.
살모넬라 엔테리카 티피무리움으로부터 유전자 prpE를 증폭하기 위해, 플라스미드 pPRP45을 주형으로 (문헌[Alexander R Horswill, Jorge C Escalante-Semerena "Characterization of the Propionyl-CoA Synthetase (PrpE) Enzyme of Salmonella enterica: Residue Lys592 Is Required for Propionyl-AMP Synthesis"]), 그리고 prpEst 증폭을 위해 prpEst F 및 prpEst R로 명명된 상기 프라이머들 (표 1 참조)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
prpEst의 PCR 절편은 벡터 pSCB (스트라테진 블런트 PCR 클로닝 키트 CAT 240207-5)로 클로닝되어 플라스미드 pSCB-prpEst를 야기한다.
실시예
2
PHA
신타아제
및 아실-
CoA
합성효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터의 구축
pMK
-
Ptrc01
/
OP01
/
RBS01
-
pha
C1
re
-
TT02
의 구축
랄스토니아 유트로파로부터 유전자 phaC1을 운반하는 플라스미드는 최적화된 서열을 갖는 유전자를 합성하는 회사로부터 공급받아 대장균 내 최적의 전사율을 얻었다.
코돈 사용의 상대적 빈도는 유기체 및 세포 기관에 따라 광범위하게 바뀐다. 서열을 코딩하는 합성 단백질에 대한 많은 디자인 프로그램은 유기체의 선택을 가능하게 한다. 코돈 사용 데이터베이스는 대장균과 같은 많은 일반적이고 서열화된 유기체에 대한 코돈 사용 통계를 갖는다.
PHA 신타아제를 코딩하는 합성 유전자 phaC1은 회사로부터 사용 준비가 된 상태로 공급받는다. 유전자는 오퍼레이터가 있는 Ptrc01 프로모터 및 유전자 상류에 위치한 RBS 서열 (서열 1) 및 phaC1re 하류에 위치한 터미네이터 서열 하에서 클로닝되어, 플라스미드 pMK-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-TT02를 야기한다.
pUC19
-
Ptrc01
/
OP01
/
RBS01
-
pha
C1
re
-
TT02
및
pBBR1MCS5
-
Ptrc01
/
OP01
/
RBS01
-
pha
C1
re
-TT02의 구축
플라스미드 pMK-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-TT02를 HindIII 및 BamHI으로 소화(digest)시키고 그 결과로 생긴 Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-TT02를 포함하는 DNA 절편은 동일한 제한 효소로 잘리는 벡터 pBBR1MCS5로 클로닝된다. 그 결과로 생긴 플라스미드는 pBBR1MCS5-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-TT02라고 명명된다.
플라스미드 pMK-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-TT02는 HindIII 및 BamHI으로 소화되고 그 결과로 생긴 PtrcO1/OP01/RBS01-phaC1re-TT02를 포함하는 DNA 절편은 동일한 제한 효소로 잘리는 벡터 pUC19로 클로닝된다. 그 결과로 생긴 플라스미드는 pUC19-PtrcO1/OP01/RBS01-phaC1re-TT02라고 명명된다.
pMK
-
Ptrc01
/
OP01
/
RBS01
-
pha
C1
re
-
acs
-
TT02
,
pMK
-
Ptrc01
/
OP01
/
RBS01
-
pha
C1
re
-
prpE
-TT02의 구축
플라스미드 pSCB-acs 및 pSCB-prpE를 XbaI 및 NheI으로 소화시키고 그 결과로 생긴 acs 또는 prpE 중 어느 하나를 포함하는 DNA 절편은 동일한 제한 효소로 잘리는 벡터 pMK-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-TT02로 클로닝된다. 그 결과로 생긴 플라스미드는 pMK-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-acs-TT02 및 pMK-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-prpE-TT02라고 명명된다.
pBBR1MCS5
-
Ptrc01
/
OP01
/
RBS01
-
pha
C1
re
-
prp
E
st
-
TT02
및
pUC19
-Ptrc01/OP01/RBS01-
pha
C1
re
-
prp
E
st
-TT02의 구축
플라스미드 pSCB-prpEst를 PacI 및 NheI으로 소화시키고 그 결과로 생긴 prpEst를 포함하는 DNA 절편은 동일한 제한 효소로 잘리는 벡터 pBBR1MCS5-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-TT02로 클로닝된다. 그 결과로 생긴 플라스미드는 pBBR1MCS5-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-prpEst-TT02라고 명명된다.
플라스미드 pSCB-prpEst를 PacI 및 NheI으로 소화시키고 그 결과로 생긴 prpEst를 포함하는 DNA 절편은 동일한 제한 효소로 잘리는 벡터 pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-TT02로 클로닝된다. 그 결과로 생긴 플라스미드는 pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-prpEst-TT02라고 명명된다.
실시예
3
글리콜레이트의
존재 하에서
배앙된
경우
PGA
를 생산하는 재조합 대장균 균주의 구축 및
글리콜레이트
중합체의 제조
벡터 pMK-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-acs-TT02 및 pMK-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-prpE-TT02가 전기천공법으로 대장균 MG1655 야생주(wild-type strain) 내로 도입되어, 각각 균주 MG1655 (pMK-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-acs-TT02) 및 MG1655 (pMK-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-prpE-TT02)를 야기한다.
벡터 pBBRMCS5-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-prpEst-TT02 및 pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-prpEst-TT02는 전기천공법으로 대장균 MG1655 야생주 내로 도입되어, 각각 균주 MG1655 (pBBRMCS5-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-acs-TT02) 및 MG1655 (pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-prpE-TT02)를 야기한다.
그 결과로 생긴 균주 (도 2)는 약 5 g/L의 글리콜레이트를 함유하는 LB 또는 MM 배지 내에서 배양되고 (자세한 조건은 하기 실시예 참조), 그 뒤 원심분리로 균주를 회수한다. 회수된 균주는 동결건조되어 헥사플루오로이소프로판올 또는 클로로포름을 용매로 사용하여 세포 내에 축적된 중합체 물질을 회수한다. 얻어진 중합체가 폴리글리콜레이트라는 것을 확인하기 위해, 회수된 중합체 물질 상에서 NMR 분석을 수행하였다.
포도당에서만 배양된 경우
PGA
를 생산하는 재조합 대장균 균주의 구축 및
폴리글리콜레이트
중합체의 제조
탄소원으로써 포도당으로부터 글리콜산을 생산하도록 유전적으로 조작된 균주가 특허 WO 2007/141316 A, WO 2007/140816 A, US 61/162,712 및 EP 09155971, 6에 개시되어 있다. 균주는 여기서 포도당만으로부터 PGA의 생산을 가능하게 하는 플라스미드의 도입에 사용되었다.
벡터 pMK-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-prpE-TT02 및 pMK-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-acs-TT02는 전기천공법으로 글리콜산을 생산하도록 유전적으로 변형된 대장균 균주 내로 도입된다.
벡터 pBBRMCS5-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-prpEst-TT02 및 pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-prpEst-TT02는 전기천공법으로 글리콜산을 생산하도록 유전적으로 변형된 대장균 균주 내로 도입된다.
실시예
4
삼각 플라스크 내에서 포도당으로부터 폴리
글리콜산
중합체를 생산하는 균주의 발효
발효에 의한 PGA의 생산은 하기 유전자형을 갖는 균주 AG1122로 수행되었다.
세포 내 PGA의 생산은 500 ml 배플 삼각 플라스크 (본 실시예) 및 배치 발효기 (실시예 5) 내에서 수행되었다.
균주 AG1122는 500 ml 배플 삼각 플라스크 내에서 성장하였고, 그 자신이 5 g/L의 MOPS 및 5 g/L의 포도당을 함유하는 12.5 g/L 포도당으로 보충된 LB 브로쓰 (문헌[Bertani, 1951, J. Bacteriol. 62:293-300]) 또는 변형된 M9 배지 (문헌[Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128])를 이용하여 배양되었다. 그 뒤 배지의 pH를 pH 6.8로 조절하였다. 최종 농도 50 mg/L가 되도록 항생제 스펙티노마이신 및 카나마이신을 첨가하였다. 밤새 선배양을 사용하여 50 ml 배양물을 0.3의 OD600 nm에 접종시켰다. 배양물을 37 ℃ 및 200 rpm 진탕기에서 배지 내 포도당이 고갈될 때까지 유지시켰다. 폴리글리콜산 생산 후 아반텍 3804921 광학 현미경으로 현미경 관찰을 수행하였다.
수 시간 성장 후의 세포 사진을 도 1에 나타내었다. 세포 내 흰 부분이 중합체 과립에 해당된다.
실시예
5
배치 발효기 내에서 포도당으로부터
폴리글리콜산
중합체를 생산하는 균주의 발효
하기 균주 AG1122에 의한 PGA의 생산을 공급 배치 프로토콜을 사용하여 600 ml 발효기 내의 생산 조건에서 평가하였다.
고유의 선배양이 24시간 동안 37 ℃에서 12.5 g/l 포도당으로 보충된 200 ml의 LB 브로쓰로 채워진 2l 삼각 플라스크 내에서 수행되었다 (문헌[Bertani, 1951, J. Bacteriol. 62:293-300]). 이 선배양이 발효기의 접종에 사용되었다.
20 g/l의 포도당 및 50 mg/l의 스펙티노마이신 및 카나마이신으로 보충된 400 ml의 LB 브로쓰로 채워진 발효기가 1.5의 초기 광학 밀도에서 접종되었다. 37 ℃에서 교반하면서, 그리고 용해된 산소를 30 포화% 초과로 유지하도록 조절된 통기 하에서 배양을 수행하였다. 염기를 첨가하여 pH를 6.8로 조절하였다. 배양을 배치 모드에서 24시간 동안 또는 OD 600 nm > 10까지 수행하였다.
폴리글리콜산 중합체 생산 후 현미경 관찰을 하였다. 현미경 하의 균주 사진을 도 2에 나타내었다.
배양물에서 얻어진 글리콜산의 최종 역가(titer)는 1.5 g/l였다 (분리에 바이오래드 HPX 97H 컬럼을 사용하고 검출에 굴절계를 사용하여 HPLC로 분석된 상청액).
포도당으로 보충된 변형 M9 배지에서 동일한 발효를 수행하였다. 생산은 LB 브로쓰에서에 비해 더 느렸다.
실시예
6
삼각 플라스크 내에서
글리콜산의
생체 내 변환에 의해 폴리
글리콜산
중합체를 생산하는 균주의 발효
균주 AG1327(MG1655(pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-phaC1re-prpEst-TT02))로 PGA로의 글리콜산의 생체 내 변환을 수행하였다.
5 g/l MOPS, 5 g/l 포도당 및 5 g/l 글리콜산으로 보충되고 pH 6.8로 조절된 변형 M9 배지를 사용하여 500 ml 배플 삼각 플라스크 배양물 내에서 AG1327에 의한 생체 내 변환을 평가하였다. 생물량 성장을 향상시키기 위해 10% v/v의 LB 브로쓰 공급이 첨가되었다. 암피실린 또는 카르베니실린을 농도 100 mg/l로 첨가하였다. 밤새 선배양을 이용하여 50 ml 배양물을 0.3의 OD600 nm로 접종시켰다. 배양물을 30 ℃ 및 200 rpm 진탕기에서 유지시키고 중합체 생산 후 현미경 관찰을 하였다.
배양의 마지막 단계에서, 분리에 바이오래드 HPX 97H 컬럼을 사용하고 검출에 굴절계를 사용하여 포도당 및 글리콜산을 HPLC로 분석하였다.
글리콜산의 존재하에서 중합체 과립이 관찰되었고, 글리콜산이 첨가되지 않은 대조 배양물에서는 관찰되지 않았다 (도 3).
비록 특정 도면을 참조로 본 발명이 상세하게 설명되고 있지만, 본 개시가 바람직한 실시예일 뿐이고 본 발명의 범위를 제한하지 않는다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 및 그와 동등한 범위로 규정될 것이다.
실시예
7
살모넬라
티피무리움으로부터
프로피오닐
-
CoA
합성효소에 의한
글리콜릴
-
CoA
로의
글리콜산의
전환
재조합
BL21
(
DE3
)(
pLysS
)(
pPAL
-
prpEst
) 균주의 구축
살모넬라 엔테리카 티피무리움으로부터 유전자 prpE를 증폭하기 위해, 플라스미드 pPRP45를 주형으로 사용하고 pPAL-prpEst R 및 pPAL-prpEst F로 명명된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.
PCR 생성물을 HindIII 및 EcoRI으로 소화시키고 동일한 제한 효소로 잘리는 벡터 pPAL7(프로피니티 eXact pPAL7 벡터 바이오래드)로 클로닝하였다. 그 결과로 생긴 플라스미드를 pPAL-prpEst라고 명명하였다.
벡터 pPAL-prpEst를 화학적 적격 세포(chemically competent cell)인 대장균 BL21(DE3)(pLysS)로 도입시키고, AG1354라고 명명된 균주 BL21 (DE3) (pLysS) (pPAL-prpEst)를 야기하였다.
프로피오닐
-
CoA
합성효소,
PrpEst
의
과생산
2L 삼각 플라스크에서 단백질 PrpEst의 과생산을 수행하였다.
5 g/l의 포도당, 100 ppm의 암피실린 및 1 g/L의 MgSO4로 보충된 50 ml의 LB 브로쓰 (문헌[Bertani, 1951, J. Bacteriol. 62:293-300])으로 채워진 500 ml 삼각 플라스크에서 고유의 선배양을 수행하였다. 37 ℃, 200 rpm에서 OD600=0.5까지 선배양물을 배양하고, 그 뒤 5 g/l의 포도당, 100 ppm의 암피실린 및 1 g/L의 MgSO4로 보충된 500 mL의 LB로 채워진 2L 플라스크의 접종에 사용하였다. 첫 번째로 37 ℃ 및 200 rpm에서 OD600이 0.6-0.8이 될 때까지 배양을 수행하고, 두 번째 단계에서 500 μM IPTG로 유도하기 전 25 ℃로 이동시켰다. OD600이 약 4일 때 배양을 멈추었다. 4 ℃에서 7000 rpm, 10 분간 세포를 원심분리시키고, 그 뒤 인산염 완충액으로 세정한 뒤 -20 ℃에서 저장하였다.
단백질
PrpEst
의 정제
초음파로 세포 (45 mg)을 용혈시키고 120000g (4 ℃)에서 30분간 원심분리로 세포 잔해를 제거하였다. 제조사가 권고한 프로토콜에 따라 프로피니티 컬럼 (바이오래드, 바이오-스케일 미니 프로피니티 추출 카트리지) 상에서 친화력으로 조 세포-추출물로부터 단백질을 정제시켰다. 실온에서 30분간 100 mM 불화물로 분할하여 단백질로부터 Tag를 제거하였다. 100 mM 인산칼륨, 150 mM NaCl 및 10% 글리세롤로 구성된 용액에 대한 투석에 의해 용출 완충액을 교환시켰다.
브래드포드 단백질 검정법을 사용하여 단백질 농도 (즉, 45 mg의 건조 중량에 대해 0.23 μg/μL)를 측정하였다.
LC
-
MS
에 의한
글리콜릴-CoA
의 검출
LC-MS (어플라이드/디오넥스)로, 그 결과로 생긴 분자인 글리콜릴-CoA를 검출하여, 글리콜레이트에 대한 PrpE의 활성을 측정하였다 (도 1의 화학 구조식). 반응 혼합물 (250 μL)은 75 mM의 인산칼륨 완충액 (pH 7.5), 1.5 mM ATP, 0.75 mM CoA 및 10 내지 40 μg의 조 세포-추출물 또는 9 μg의 정제된 단백질 중 하나를 함유하였다.
다른 농도의 글리콜레이트 (20, 40 및 100 mM)로 반응 혼합물을 출발시켰다. 37 ℃에서 30분간 샘플을 인큐베이션하고 LC-MS 기계 (25 μL 또는 75 μL의 반응물이 담지됨)에 주입시켰다. 대조군으로써 3가지 반응 혼합물을 준비하였다; 1) CoA 없음, 2) 효소 없음 또는 3) 글리콜레이트 없음. 그 결과를 도 7 또는 8에 나타내었다.
도 7: 100 mM의 글리콜레이트 및 단백질 PrepEst를 과생성시키는 균주 AG1354의 조 세포-추출물 40 μg로 반응을 수행함.
도 8: 40 mM의 글리콜레이트 및 9 μg의 정제된 단백질로 반응을 수행함.
각각의 경우,
글리콜릴
-
CoA
에 해당하는 825 질량 (질량-1=824.0) 단지 하나의 피크만이 검출되었다.
[참고자료]
미국 특허 문헌
국제 특허 문헌
다른 출판물
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide
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Claims (17)
- - 탄소원을 포함하는 배지 내에서 이종 폴리히드록시알카노에이트(PHA) 신타아제를 코딩하는 유전자를 발현시키는 미생물을 배양시키는 단계 (이때 미생물은 또한 글리콜산을 글리콜릴-CoA로 형질전환시키는 효소(들)을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 발현시킴), 및
- 중합된 글리콜산(PGA)를 회수하는 단계
를 포함하는, 미생물에 의해 글리콜산을 PGA로 중합하는 방법. - 제1항에 있어서, 글리콜산이 PHA 신타아제를 코딩하는 유전자 및 글리콜산을 글리콜릴 CoA로 형질전환시키는 하나 이상의 효소를 발현시키는 동일한 미생물에 의해 생산되는 방법.
- 제1항에 있어서, 글리콜산이 배지 내에서 외인성으로 미생물에 제공되는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 글리콜릴-CoA로의 글리콜산의 형질전환이
a. 아실-CoA 합성효소
b. 아실-CoA 전이효소
c. 부티레이트 키나아제 관련 포스포트랜스부티릴라아제
중에서 선택된 하나 이상의 효소에 의해 수행되는 방법. - 제4항에 있어서, 아실-CoA 합성효소 및 아실-CoA 전이효소가 유전자 prpE 또는 acs에 의해 코딩되는 방법.
- 제4항에 있어서, 포스포트랜스부티릴라아제가 유전자 ptb에 의해 코딩되고 부티레이트 키나아제가 유전자 buk에 의해 코딩되는 방법.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 유전자가 과발현되는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 유전자가 미생물로 도입되는 플라스미드에 의해 발현되는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 유전자가 상기 미생물의 염색체로 통합되는 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 PHA 신타아제를 코딩하는 유전자가 phaC, phaEC 또는 phaCR 중에서 선택되는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 유전자가 과발현되는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 유전자가 미생물로 도입되는 플라스미드에 의해 발현되는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 유전자가 상기 미생물의 염색체로 통합되는 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 PhaR/PhaP 조절 시스템을 발현시키는 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 획득한 중합된 글리콜산.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은, 이종 PHA 신타아제를 코딩하는 유전자 및 글리콜산을 글리콜릴 CoA로 형질전환시키는 하나 이상의 효소를 발현시키는 미생물.
- 제16항에 있어서, 상기 미생물이 장내세균과인 미생물.
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