KR20120103997A - ２?하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 능력을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 ２?하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법 - Google Patents

２?하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 능력을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 ２?하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트, 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 능력을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 생분해성 신규 폴리머인 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트 및 이를 제조할 수 있는 재조합 미생물을 제공하는 효과가 있다.

Description

２？하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 능력을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 ２？하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법{Recombinant Microorganism Producing polyhydroxyalkanoate (PHA) containing 2-hydroxybutyrate (2HB) monomer and Preparing Method of PHA containing 2HB Using Thereof}
본 발명은 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트, 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 능력을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법에 관한 것이다.
Polyhydroxyalkanoates (PHAs)는 세균에서 탄소원 및/또는 환원능 저장 물질로 사용되는 여러 종류의 하이드록시카복시산(hydroxy-carboxylic acid)으로 구성된 생분해성, 생체적합성 폴리에스테르이다. PHA는 여러 종류의 하이드록시아실-CoA를 기질로 사용하는 PHA synthase에 의하여 합성된다.
하이드록시아실-CoA가 하이드록시기의 탄소위치에 비대칭 중심을 가지면, 이는 모두 (R)-configuration이 된다. 3-하이드록시아실-CoAs, 4-하이드록시아실-CoAs나 5-하이드록시아실-CoAs, 6-하이드록시아실-CoAs 등 여러 하이드록시아실-CoA 중에서 PHA synthase가 가장 선호하는 기질은 3-하이드록시아실-CoAs(3HA-CoAs) 이다.
그러나, PHA 를 생산하는 미생물에서 2-하이드록시산을 모노머로 함유하는 PHA를 생산된 보고는 아직 없다. 천연 PHA synthase는 2-하이드록시아실-CoA에 대하여, 다른 하이드록시아실-CoA보다 매우 낮은 무시할 수 있는 정도의 활성을 가진다.
최근, 본 발명자들은 글루코오스로부터 직접발효에 의해 폴리락틱산(PLA) 중합체 및 이의 폴리머를 생산할 수 있는 대사공학적으로 재조합된 대장균을 개발하였다 (Park et al., WO08/062996, 2008; Yang et al., Biotechnol. Bioeng. 105, 150-160 , 2010; Jung et al., Biotechnol. Bioeng. 105, 161-171, 2010). 상기 재조합 대장균에서, PLA 생합성은 락틸-CoA 생성과 synthase에 의한 공중합이라는 2단계로 구성된다. (D)-락틸-CoA는 상기 재조합 대장균에 아세틸-CoA를 CoA 공여체로 사용하여, (D)-락테이트를 (D) 락틸-CoA로 전환하는 Clostridium propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소(propionyl-CoA transferase)를 채용하여 생성가능하게 하였다. 락틸-CoA로 락테이트 폴리머(PLA)를 생성하기 위하여는, 락틸-CoA를 기질로 사용할 수 있도록 유전자 조작된 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase (PhaC1 ps6-19 )를 채용하였다. 또한, PLA 합성의 효율을 높이기 위하여 E. coli XL1-Blue 에서 무작위 변성(randum mutageneisis)에 의해 Clostridium propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소(propionyl-CoA transferase)의 활성을 향상시켜 락틸-CoA 생합성 능을 강화시켰다(Yang et al., Biotechnol. Bioeng. 105, 150-160 , 2010; Jung et al., Biotechnol. Bioeng. 105, 161-171, 2010).
다른 연구에서, 유사한 시스템을 사용하여 (3-하이드록시부티레이트-co-락테이트) 폴리머[P(3HB-co-LA)]를 생합성한 보고도 있다(Taguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 105, 17323-17327, 2008, Yamada et al., Biomacromolecules 10, 677-681, 2009). PhaC1 ps6-19 가 매우 다양한 기질 특이성을 가지고, 락테이트가 2-하이드록시산의 한 종류이기 때문에, 다른 2-하이드록시아실-CoA가 PhaC1 ps6-19 의 기질로 사용되어, 2-하이드록시산을 함유하는 새로운 PHA를 합성하는 것도 가능할 것이다. 이러한 여러 종류의 2-하이드록시산 중에서, 본 발명자들은 아미노산 합성 경로의 대사산물인, 2-하이드록시부티레이트(2HB)를 단량체로 하여, 폴리머 합성을 시도하였다. 최근, 1-프로파놀 및 1-부탄올을 생산하고, 피루베이트를 2-케토부티레이트로 전환하는 씨트라말레이트(citramalate) 경로가 Methanococcus jannaschii의 citramalate synthase(CimA)를 채용하는 것에 의하여 개발되었다.
이에, 본 발명자들은 새로운 PHA를 개발하고자 예의 노력한 결과, PhaC1 ps6-19 의 기질인 2-하이드록시부틸-CoA를 생산하도록 2-하이드록시부티레이트 디하이드로게나아제 유전자를 발현시키고, 시트라말레이트 경로와 함께 프로피오닐-CoA 전이효소 유전자를 발현하도록 대장균을 대사공학적으로 조작한 재조합 대장균을 제작하고, 상기 재조합 대장균을 발효시키는 경우, 새로운 폴리머인 2-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시부티레이트) 폴리머[P(2HB-co-3HB)]를 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 생분해성 신규 폴리머인 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트 및 상기 폴리머를 생산하는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락데이트디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있으며, 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 2-하이드록시부티레이트 및 3-하이드록시부티레이트 함유 배지에서 배양하여 (2-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시부티레이트-co-락테이트) 폴리머를 생산하는 단계; 및 상기 생산된 (2-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시부티레이트-co-락테이트) 폴리머를 수득하는 단계를 포함하는 (2-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시부티레이트-co-락테이트) 폴리머의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 락데이트디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자, D-2 하이드록시산 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자, 시말레이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 2-isopropylmalate synthase, 3-isopropylmalate dehydrogenase, 3-isopropylmalate/(R)-2-methylmalate dehydratase 효소를 코딩하는 유전자 (leuBCD)가 도입되어 있으며, (2-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시부티레이트-co-락테이트) 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 글루코오스 및 3-하이드록시부티레이트 함유 배지에서 배양하여 (2-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시부티레이트-co-락테이트) 폴리머를 생산하는 단계; 및 상기 생산된 (2-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시부티레이트-co-락테이트) 폴리머를 수득하는 단계를 포함하는 (2-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시부티레이트-co-락테이트) 폴리머의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (2-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시부티레이트-co-락테이트) 폴리머를 제공한다.
본 발명은 생분해성 신규 폴리머인 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트 및 이를 제조할 수 있는 재조합 미생물을 제공하는 효과가 있다.
도 1은 글루코오스 및 3HB로부터 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 합성하는 생합성경로를 나타낸 것이다.
일관점에서, 본 발명은 락데이트디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있으며, 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소는 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase 또는 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase의 변이 효소인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 PHA synthase의 변이효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K 및 Q481R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 PHA synthase의 변이효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 12의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477G 및 Q481M이 변이된 아미노산 서열(C1335); 서열번호 12의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(C1310); 및 서열번호 12의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481R이 변이된 아미노산 서열(C1312)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로피오닐-CoA 전이효소는 C. propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소 또는 C. propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소의 변이효소인 Pct540인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명자들은 변이된 PhaC1ps6-19 및 변이된 Pctcp를 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 p(3HB-co-LA)의 생산성 향상시킨 바 있다.
변이된 PhaC1ps6-19가 다양한 기질특이성을 가지고, 락테이트 역시 2-하이드록시산의 한 종류이기 때문에, PhaC1ps6-19에 의하여 2HB-CoA가 2HB 함유 폴리머에 공중합될 수 있다. 재조합 대장균에서 2HB 함유 폴리머의 합성을 용이하게 하기 위하여, 3-HB-CoA가 락테이트 함유 폴리머의 합성에서 시발자(initiator) 역할을 하기 때문에, 3HB를 두번째 단량체로 선택하였다.
본 발명자들의 이전 연구에서, 변이된 PhaC1ps6-19 및 변이된 Pctcp,, Pctcp에서 V193A 변이와 뉴클레오티드서열의 4개의 침묵변이(T78C, T669C, A1125G 및 T1158C)를 가지는 Pct540 및 PhaC1ps6-19d에서 E130D, S325T, S477G 및 Q481K의 4개의 변이를 함유하는 PhaC1437를 함유하는 재조합 대장균은 높은 락테이트 분획을 가지면서 P(3HB-co-LA) 공중합체를 효과적으로 생산하였다. 따라서, 상기 효소들을 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 생합성에 사용하였다.
본 발명에서는 락테이트 모노머가 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트로 함입되는 것을 억제하기 위하여, ldhA 유전자가 결실된 숙주세포를 사용하였다.
일 실시예에서, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 2-하이드록시부티레이트 및 3-하이드록시부티레이트 함유 배지에서 배양하면, (2-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시부티레이트-co-락테이트) 폴리머를 생산할 수 있다.
또다른 관점에서, 본 발명은 락데이트디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자, D-2 하이드록시산 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자, 시말레이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 2-isopropylmalate synthase, 3-isopropylmalate dehydrogenase, 3-isopropylmalate/(R)-2-methylmalate dehydratase 효소를 코딩하는 유전자 (leuBCD) 가 도입되어 있으며, 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소는 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase 또는 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase의 변이 효소인 PhaC1p인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 프로피오닐-CoA 전이효소는 C. propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소 또는 C. propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소의 변이효소인 Pct540인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 D-2 하이드록시산 디하이드로게나아제는 Lactobacillus lactis 유래인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 시말레이트 합성효소는 Methanococcus jannaschii 유래인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 2-isopropylmalate synthase, 3-isopropylmalate dehydrogenase, 3-isopropylmalate/(R)-2-methylmalate dehydratase 효소는 대장균 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, PHA 생합성 유전자 전사 터미네이터를 코딩하는 유전자를 추가로 도입하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 PHA 생합성 유전자 전사 터미네이터는 Ralstonia eutropha 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.
또다른 관점에서, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 글루코오스 및 3-하이드록시부티레이트 함유 배지에서 배양하여 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시 알카노에이트를 생산하는 단계; 및 상기 생산된 (2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시 알카노에이트를 수득하는 단계를 포함하는 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는, E.coli XL1-Blue의 염색체에서 ldhA 유전자를 제거한 E. coli XLdh 균주를 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트인 P(2HB-co-3HB) 공중합체 합성을 위한 숙주세포로 사용하였다.
본 발명자들은 2-케토부티레이트가 2-HB의 전구체로 사용가능하기 때문에, 2-케토부티레이트를 전구체로 사용하는 1-프로판올(1-propanol) 합성 경로를 채용하고자 하였으며, 상기 2-케토부티레이트를 생산하는 2가지 경로인, 트레오닌 분해 경로 및 시트라말레이트 경로 중 2-케토부티레이트를 가장 직접적으로 생성하는 시트라멜레이트 경로를 채용하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 상기 2-케토부티레이트 합성 경로를 구축하기 위하여, 유전자 재조합을 통하여 숙주세포에서 Methanococcus jannaschii의 cimA3.7 유전자 및 E. coli의 leuBCD 유전자를 발현시켰다.
본 발명에서 글루코오스로부터 2HB를 함유하는 폴리머의 합성경로를 구축하기 위하여는 시트라말레이트 경로를 통하여 합성된 2-케토부티레이트를 2HB로 전환시켜야 한다.
몇몇 미생물의 D-2-하이드록시산 디하이드로게나아제는 광학이성질체에 대한 선택성을 가지고, NADH를 코펙터로 사용하여, 2-케토산(keto acid)를 D-2-하이드록시산으로 환원시킨다. 상기 D-2-하이드록시산 디하이드로게나아제는 2-케토이소카프로에이트(2-ketoisocaproate), 2-케토이소발러레이트(2-ketoisovalerate), 2-케토발러레이트, 2-케토부티레이트 및 만델레이트(mandelate)를 포함하여 넓은 범위의 기질 특이성을 가지고 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 여러 D-2-하이드록시산 디하이드로게나아제 중 L. lactis subsp. lactis Il1403의 panE 유전자 및 C. difficile 630 ldhA 유전자가 코딩하는 2개의 D-2 하이드록시산 디하이드로 게나아제를 채용하여 2HB를 합성하였으며, C. difficile 630 ldhA 유전자로 형질전환된 재조합 대장균이 2HB를 함유하는 폴리머를 생산하지 못하였기 때문에, 이후, 2HB를 함유하는 폴리머의 생산에는 L. lactis subsp. lactis Il1403의 panE 유전자로 형질전환된 재조합 대장균을 사용하였다.
phaC437, pct540, cimA3.7 및 leuBCD 유전자를 발현하는 재조합 E. coli XLdh에 L. lactis subsp. lactis Il1403의 panE 유전자를 도입시키는 경우, 글루코오스로부터 18.9 중량%이상의 P(97mol%2HB-co-3mol%LA) 중합체를 제조할 수 있었다.
본 발명의 일실시예에서, 재조합 대장균을 사용하여 p(2HB-co-3HB) 중합체를 합성하는 경우, 글루코오스로부터 세포내에서 2HB가 생성되어야 하고, 생성된 Pct540에 의하여 2HB는 2HB-CoA로 전환된다. 세포 내에서 3HB-CoA를 생성시키기 위하여, 3HB가 배지에 첨가되어야 하고, 배지 내의 3HB의 농도가 증가될 수록, 합성된 폴리머에서의 2HB 단량체 분획은 감소하였다.
또다른 관점에서, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 글루코오스 함유 배지에서 배양하여 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 단계; 및 상기 생산된 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 수득하는 단계를 포함하는 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서, 글루코오스 함유 배지에서, 본 발명의 재조합 미생물을 배양할 경우, 2-하이드록시부티레이트를 모노머 및 아세토아세틸 CoA 경로에 의하여 생산된 3-하이드록시부티레이트 모노머의 공중합에 의한, 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트인 p(2HB-co-3HB) 중합체를 제조할 수 있다.
또다른 관점에서, 본 발명은 (2-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시부티레이트) 폴리머에 관한 것이다.
본 발명에서, 재조합 대장균에 의하여 무정형의 P(2HB-co-3HB)가 합성된다는 것을 확인하였으며, P(2HB-co-3HB)의 분자량은 1.69 PDI를 가지는 20,000(Mn) 및 33,800(Mw)였다. 유리상전이온도는 9.7℃였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
하기 실시예에서 사용한 균주 및 플라스미드에 대하여 표 1에 나타내었다.
Plasmid Relevant Characteristics Reference or Source
Strains
XL1-Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F' proAB lacI q Z◎15 Tn10 (TetR)] Stratagene a
XLdh XL1-Blue ◎dhA 본 발명
Plasmids
p619C1437-540 pBluescript KS II(+) derivative; R. eutropha PHA biosynthesis promoter, phaC1437 Ps 6-19, pct540 Cp ; Apr Yang et al. 2010
pBBR1MCS2 Broad host range vector; Kmr
pZE12-MCS Expression vector; P LlacO-1 promoter; Apr EXPRESSYSb
pKE12-MCS Expression vector; P LlacO-1 promoter, R. eutropha PHA biosynthesis genes transcription terminator; Apr 본 발명
pZA31-MCS Expression vector; P LtetO-1 promoter; Cmr EXPRESSYS
pKA32-MCS Expression vector; P LlacO-1 promoter, R. eutropha PHA biosynthesis genes transcription terminator; Cmr 본 발명
pKM22-MCS pBBR1MCS2 derivative　; P LlacO-1 promoter, R. eutropha PHA biosynthesis genes transcription terminator; Kmr 본 발명
p619C1437LeuBCD p619C1437-pct540 derivative; R.eutrophaPHAbiosynthesispromoter,thephaC1437 Ps 6-19gene,theE. coli leuBCD gene; Apr 본 발명
pKA32-CimA pKA32-MCS derivative; M. jannaschii cimA3.7; Cmr 본 발명
pKA32-CimALeuBCD pKA32-MCS derivative; M. jannaschii cimA3.7, E. coi leuBCD; Cmr 본 발명
pKM22PanE pKM22-MCS derivative; P LlacO-1 promoter, L. lactis subsp. lactis Il1403 PanE gene; Kmr 본 발명
pKM22LdhA pKM22-MCS derivative; P LlacO-1 promoter, C. difficile 630 ldhA gene; Kmr 본 발명
aStratagene Cloning System, La Jolla, CA, USA
bwww.expressys.com
실시예 1: 재조합 균주를 이용한 2HB 및 3HB로 부터의 (2-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시부티레이트) 폴리머 [P(2HB-co-3HB)] 생합성
본 실시예에서는 락테이트 모노머가 P(2HB-co-3HB) 공중합체로 함입되는 것을 억제하기 위하여, ldhA 유전자가 결실된 숙주세포에 변이된 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase 및 변이된 C. propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소가 도입된 재조합 균주를 2HB 및 3HB가 함유된 배지에서 P(2HB-co-3HB)를 제조하였다.
유전자 클로닝용 숙주세포로는 E. coli XL1-Blue (Stratgene Cloning System, USA)를 사용하였으며, 37℃ LB 배지에서 배양하였다.
락테이트 모노머가 P(2HB-co-3HB) 공중합체로 함입되는 것을 억제하기 위하여, E.coli XL1-Blue의 염색체에서 ldhA 유전자를 원스텝 불활성화방법(Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97, 6640-6645, 2000)으로 제거한 E. coli XLdh 균주를 P(2HB-co-3HB) 합성을 위한 숙주세포로 사용하였다(도 1).
E.coli XLdh 균주는 20g/L의 글루코오스와 원하는 농도의 2HB 및 3HB가 포함된 MR 배지를 사용하여, 30℃에서 250rpm으로 72시간동안 진탕배양하였으며, 배양 조건에 따라 2HB 및 3HB의 농도는 조절하였다.
2-하이드록시부틸-CoA 생산에 관여하는 유전자는 E. coli W3110(KCTC), Clostridium difficile 630(ATCC), 및 Lactococcus lactis subsp. lactis Il1403(ATCC),의 염색체 DNA 및 플라스미드 p619C1437-pct540(Yang et al., Biotechnol. Bioeng . 105, 150-160, 2010)으로부터 증폭하였다.
플라스미드 p619C1437-pct540는 Ralstonia eutropha의 PHA synthase 오페론 프로모터 하에, Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase에서 E130D, S325T, S477G 및 Q481K의 4개의 변이를 함유하는 PhaC1437과 C. propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소에서 V193A 변이와 뉴클레오티드서열의 4개의 침묵변이(T78C, T669C, A1125G 및 T1158C)를 가지는 Pct540를 발현하는 재조합 플라스미드이다 (Yang et al., Biotechnol. Bioeng. 105, 150-160, 2010).
재조합 E.coli XLdh에서의 재조합된 유전자의 발현 유도는 배양액의 흡광도가 600nm에서 0.5가 되었을때 1mM 농도가 되도록 IPTG를 첨가하여 수행하였다.
PhaC1437 및 Pct540를 발현하는 재조합 E. coli XLdh 균주를 20g/L의 글루코오스와 원하는 농도의 2HB 및 3HB가 포함된 MR 배지를 사용하여, 30℃에서 250rpm으로 72시간동안 진탕배양하였으며, 배양 조건에 따라 2HB 및 3HB의 농도는 조절하였다.
PhaC1437 및 Pct540를 발현하는 재조합 E. coli XLdh 균주는 10mol%~60mol%범위에서 다양한 분획의 2HB 단량체를 함유하는 P(2HB-co-3HB) 랜덤공중합체를 생산하였다(표 2).
재조합 E. coli XLdh 균주를 이용한 2HB 및 3HB로부터 P(2HB-co-3HB)의 생합성
Concentrations (g/L) of 2HB and 3HB Polymer composition (mol%) Polymer content (wt%)
2HB 3HB 2HB 3HB LA
0.5 0.5 28.2 68.4 3.4 13.4
0.5 1.0 19.1 78.3 2.6 30.4
0.5 1.5 13.9 84.5 1.6 37.2
0.5 2.0 10.6 87.1 2.3 60.8
1.0 0.5 49.1 45.7 5.2 23.1
1.0 1.0 43.2 53.9 2.9 36.9
1.0 1.5 26.5 70.6 2.9 52.1
1.0 2.0 21.6 75.9 2.5 55.5
1.5 0.5 60.8 34.7 4.5 32.3
1.5 1.0 47.0 48.1 4.9 48.4
1.5 1.5 35.7 60.8 3.5 50.6
1.5 2.0 31.2 63.9 4.9 66.9
2.0 0.5 60.3 36.1 3.6 26.8
2.0 1.0 49.1 45.3 5.6 48.2
2.0 1.5 46.8 46.9 6.3 65.8
2.0 2.0 38.5 56.7 4.8 68.3
배지 내의 2HB와 3HB의 농도를 조절하여 공중합체에서 2HB의 몰 분획을 조절할 수 있었으며, 공중합체에서의 2HB의 몰분획은 배지에 첨가되는 2HB 및 3HB의 농도에 반비례하였다.
중합체의 양은 첨가된 2HB 및 3HB의 전체 농도에 비례하여 증가하였다. 2HB와 3HB가 각각 2g/L의 농도로 첨가되었을 때, 생성된 폴리머 양이 65중량%로 가장 많았다.
실시예 2: 재조합 균주를 이용한 글루코오스로부터의 P(2HB-co-3HB)를 생합성
본 실시예에서는 phaC437, pct540, cimA3.7 및 leuBCD 유전자를 발현하는 재조합 E.coli XLdh에 L. lactis subsp. lactis Il1403의 panE 유전자를 도입시키는 켜, 글루코오스로부터 p(2HB-co-3HB)를 제조하였다.
본 실시예에서 재조합 플라스미드의 제작에 사용된 프라이머를 표 3에 나타내었다.
Primer sequence Target gene
Primer 1
(서열번호 4)		 cctgcaggtttcacacaggaaaca atgtcgaagaattaccatattg E. coli leuBCD genes
Primer 2
(서열번호 5)		 catatgttaattcataaacgcaggttg
Primer 3
(서열번호 8)		 gaattcatgagaattacaattgccgg L. lactis subsp. lactis Il1403 panE gene
Primer 4
(서열번호 9)		 ggtaccttattttgcttttaataactc
Primer 5
(서열번호 10)		 aatatt aattgtgagcggataacaat C. difficile 630 ldhA gene
Primer 6
(서열번호 11)		 ggtaccctaatttactctattagtag
Primer 7
(서열번호 3)		 caattgattaaagaggagaaa gaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagctt RBS and MCS for pKE12-MCS
Primer 8
(서열번호 1)		 gagtcgacctgcaggcatgcaagctt cctgccggcctggttcaacc R. eutropha PHA biosynthesis genes transcription terminator
Primer 9
(서열번호 2)		 cctagg gcctcgcccccgcgagggcc
Primer 10
(서열번호 6)		 aatatt aattgtgagcggataacaat P LlacO-1 promoter, MCS, and R. eutropha PHA biosynthesis genes transcription terminator for pKM22-MCS
Primer 11
(서열번호 7)		 aatatt gcctcgcccccgcgagggcc
발현용 벡터 pZE12-MCS는 pTacLac(Lee et al. Appl.Microbiol.Biotechnol. 79, 633-641, 2008)의 MCS(Muti-cloning sites) 및 Ralstonia eutropha의 PHA 생합성 유전자 전사 터미네이터를 가지도록 변형시켰다.
먼저, Ralstonia eutropha의 PHA 생합성 유전자 전사 터미네이터 유전자 단편을 p619C1437-pct540로부터 서열번호 1~2의 프라이머를 이용하여 PCR로 수득하고, 상기 수득한 유전자 단편을 주형으로 하여 서열번호 6~5의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 RBS, pTacLac MCS 및 R. eutropha의 PHA 생합성 유전자 전사 터미네이터를 수득하였따. 상기 PCR 산물을 MfeI 및 AvrII를 처리하여 절단하고, EcoRI/AvrII로 절단된 pZE12-MCS에 삽입하여, pKE12-MCS를 제조하였따.
pKE31-MCS ( EXPRESSYS)의 PLtetO - 1프로모터를 pKE12-MCS를 XhoI/EcoRI으로 절단하여 수득한 PLlacO - 1프로모터로 치환하여 pKA32-MCS를 제조하였다.
p619C1437LeuBCD는 E.coli leuBCD 유전자를 서열번호 4~5의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고, 상기 증폭산물을 주형 플라스미드의 sbfI 및NdeI 부위에 삽입하여, E. coli leuBCD 유전자를 p619C1437-pct540의 pct540 유전자와 치환하여 제작하였다.
상기 pKA32-MCS의 EcoRI 및 sbfI 부위에 합성된 cimA3.7 유전자를 삽입하여, pKA32-CimA를 제조하였다.
상기 p619C1437LeuBCD를 sbfI 및 HindIII로 절단하여 얻은 E.coli leuBCD 유전자를 상기 pKA32-CimA에 삽입하여, pKA32-CimALeuBCD를 제조하였다.
상기 pKA32-MCS를 서열번호 6~7의 프라이머를 사용하여 PCR하여, PLlacO -1 프로모터, MCS 및 R. eutropha의 PHA 생합성 유전자 전사 터미네이터를 포함하는 유전자 단편을 증폭시켰고, 상기 증폭된 유전자 단편을 pBR1MCS2(Kovach et al. Gene, 166, 175-176, 1995)의 SspI 부위에 삽입하여, pKM22-MCS를 제조하였다.
pKM22-MCS에 L. lactis의 lactisIl1403panE 유전자를 삽입하여, pKM22PanE를 제조하였고, pKM22에 C.difficile의 630ldhA 유전자를 삽입하여, pKM22LdhA를 제조하였다.
또한, M. jannaschii의 cimA3.7 유전자는 GenScript(www.genscript.com)에 기재된 서열을 기초로하여 합성하여 사용하였다. 플라스미드 pZE12-MCS 및 pZA31-MCS는 ESPRESSYS(www.expressys.com)로 부터 구입하여 수용하였다.
상기 플라스미드로 형질전환되어, phaC437, pct540, cimA3.7 ,leuBCD 및 panE 유전자를 발현하는 재조합 E.coli XLdh는 글루코오스로부터 18.9중량%이상의 P(97mol%2HB-co-3mol%LA) 중합체를 제조하였다 (표 4).
배지 내의 3HB의 농도가 증가될수록, 합성된 폴리머에서의 2HB 단량체 분획은 감소하였다.
E.coli XLdh에서 글루코오스와 3HB를 이용한 p(2HB-co-3HB)의 제조
Concentration (g/L) of 3HB Polymer composition (mol%) Polymer content (wt%)
2HB 3HB LA
0 97 0 3 18.9
0.5 68.3 29.6 2.1 39.0
1.0 47.3 48.8 3.9 46.6
1.5 39.3 58.8 1.9 57.9
2.0 32.3 65.0 2.7 59.5
실시예 3: 재조합 균주에서 합성된 폴리머의 분석
실시예 2에서 제조된 폴리머는 유기용매 세포로부터 추출방법(Jacquel et al.,Biochem. Eng. J . 39, 15-27, 2008)으로 분리하였다. 폴리머의 구조, 분자량, 열성은 각각 NMR, 겔 크로마토그래피(GPC) 및 DSC(diffrential scanning calorimetry)으로 측정하였다(Yang et al., Biotechnol. Bioeng. 105, 150-160 , 2010; Jung et al., Biotechnol. Bioeng. 105, 161-171, 2010; Lim et al., J. Mol. Struct. 886, 166-174, 2008).
P(2HB-co-3HB)에 대한 조성과 서열기여도를 1D(1H 및 13C)NMR과 2D(1H-1H)COSY NMR 스펙트럼으로 분석하였다(도 2의 A~C). 2HB와 3HB의 몰 분획은 1H NMR로 분석하였고, GC 분석을 통하여 재확인하였다. CDCl3에서의 P(2HB-co-3HB) 1H NMR 스펙트럼 을 도 2의 A에 나타내었다. 2HB의 메틸 양자는 δ0.7-1.2ppm 구간에서 나타났고, 와 메틸렌 양자는 δ1.6-2.1 ppm 구간에서 나타났다. 3HB의 메틸렌 양자는 δ2.3-2.9ppm 구간에서 나타났다. 반면, 2-HB-co-3HB의 옥시메틴(oxymethine)양자는 δ4.5-5.7ppm 부위에서 나타났다.
COSY 스펙트럼 결과는 도 2의 B에 나타내었으며, 2HB의 옥시메틴 양자와 2HB의 메틸렌 양자 사이의 시그널 ①은 δ4.9ppm/2.0ppm에서 나타났다. 2HB의 메틸렌 양자와 2HBdml 메틸 양자 사이의 커플링 ②는 δ1.8ppm/1.0ppm에서 크로스 피크로 나타났다. 3HB의 옥시메틴 양자와 3HB의 메틸렌 양자 사이의 커플링 ③은 δ5.4ppm/2.6ppm에서 크로스 피크로 나타났다. 3HB의 옥시메틴 양자 및 3HB의 나머지 메틸 양자 사이의 커플링 ④는 δ5.2ppm/1.3ppm에서 나타났다.
화학적 시프트와 카르보닐 카본 부위의 확장 스펙트럼을 가지는 P(2HB-co-3HB)의 125-MHz 13C-NMR 스펙트럼을 도 2의 C에 나타내었다.
상기 부위(168.0~170.1ppm)은 선명한 해상도의 3개 그룹의 피크로 나타났으며, 2HB*-2HB 서열에서의 카르보닐 카본은 168.7ppm의 피크에서 나타났고, 3HB*-3HB 및 3HB-3HB* 서열에서 카르보닐 공명은 169.1ppm에서 나타났다. 3HB*-2HB+2HB-3HB* 서열은 169.5ppm에서 나타났다. 2HB와 3HB의 diad-서열 분배는 카보닐 공명의 피크 면적으로부터 구하였으며, 그 결과를 표 5에 나타내었다.
2HB-co-3HB daid 서열 데이타는 통계학적인 랜덤 공중합에 적용하는 Bernoullian 통계와 비교하였다.
P(23몰%2HB-co-77몰%3HB)의 diad 서열 분배
relative intensity diad sequence distribution
3HB-3HB (3HB-2HB + 2HB-3HB) 2HB-2HB
observed 57 37 6
calculated 60 35 5
P(50a몰% 2HB-co-50몰%3HB)의 DSC 및 GPC 분석결과를 통해, 재조합 대장균에 의하여 무정형의 P(2HB-co-3HB)가 합성된다는 것을 확인하였으며, P(2HB-co-3HB)의 분자량은 1.69PDI를 가지는 20,000(Mn) 및 33,800(Mw)였다. 유리상전이온도는 9.7℃였다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology Korea Institute of Chemical Techology <120> Recombinant Microorganism Producing polyhydroxyalkanoate (PHA) containing 2-hydroxybutyrate (2HB) monomer and Preparing Method of PHA containing 2HB Using Thereof <130> P10-B323 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gagtcgacct gcaggcatgc aagcttcctg ccggcctggt tcaacc 46 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cctagggcct cgcccccgcg agggcc 26 <210> 3 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 caattgatta aagaggagaa agaattcgag ctcggtaccc ggggatcctc tagagtcgac 60 ctgcaggcat gcaagctt 78 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggtaccttat tttgctttta ataactc 27 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gaattcatga aaatactagt atttgg 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 aatattaatt gtgagcggat aacaat 26 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aatattgcct cgcccccgcg agggcc 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gaattcatga gaattacaat tgccgg 26 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ggtaccttat tttgctttta ataactc 27 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 aatattaatt gtgagcggat aacaat 26 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ggtaccctaa tttactctat tagtag 26 <210> 12 <211> 559 <212> PRT <213> Pseudomanas sp. 6-19 <400> 12 Met Ser Asn Lys Ser Asn Asp Glu Leu Lys Tyr Gln Ala Ser Glu Asn 1 5 10 15 Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Val Gly Leu Arg Gly Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Ala Ser Ala Arg Met Val Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln Pro Val His 35 40 45 Ser Val Lys His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu 50 55 60 Leu Gly Lys Ser Gly Leu Gln Pro Thr Ser Asp Asp Arg Arg Phe Ala 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr 85 90 95 Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Asp Trp Ile Asp Glu Ser Asn 100 105 110 Leu Ala Pro Lys Asp Val Ala Arg Gly His Phe Val Ile Asn Leu Met 115 120 125 Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Thr Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val 130 135 140 Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser 145 150 155 160 His Leu Ala Lys Asp Leu Val His Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val 165 170 175 Asn Met Gly Ala Phe Glu Val Gly Lys Ser Leu Gly Val Thr Glu Gly 180 185 190 Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro 195 200 205 Thr Thr Glu Gln Val Tyr Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln 210 215 220 Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Asp Lys Ser Leu Ala 225 230 235 240 Arg Phe Cys Leu Arg Asn Asn Val Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg 245 250 255 Asn Pro Thr Lys Glu Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Glu 260 265 270 Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Thr Ala Ile Thr Gly Ser Lys 275 280 285 Asp Val Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala 290 295 300 Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Ile Gly Glu Asn Lys Val Asn Ala Leu 305 310 315 320 Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Leu Asp Ser Asp Val Ala 325 330 335 Leu Phe Val Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr 340 345 350 Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp 355 360 365 Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu 370 375 380 Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp 385 390 395 400 Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Leu Phe 405 410 415 Lys Asn Asn Pro Leu Ile Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr 420 425 430 Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Phe Ser Leu Ala Gly 435 440 445 Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln 450 455 460 Leu Phe Gly Gly Asn Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile 465 470 475 480 Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met Thr 485 490 495 Ser Thr Glu Val Ala Glu Asn Ala Asp Glu Trp Gln Ala Asn Ala Thr 500 505 510 Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala Gln 515 520 525 Arg Ser Gly Glu Leu Lys Lys Ser Pro Thr Lys Leu Gly Ser Lys Ala 530 535 540 Tyr Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg 545 550 555

Claims (16)

  1. 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있으며, 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 재조합 미생물은 락데이트디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 미생물
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소는 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase 또는 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase의 변이 효소인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  4. 제3항에 있어서, PHA synthase의 변이효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 12의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K 및 Q481R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  5. 제3항에 있어서,
    PHA synthase의 변이효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 12의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477G 및 Q481M이 변이된 아미노산 서열(C1335);
    서열번호 12의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(C1310); 및
    서열번호 12의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481R이 변이된 아미노산 서열(C1312)로
    이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 프로피오닐-CoA 전이효소는 C. propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소 또는 C. propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소의 변이효소인 Pct540인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  7. 락데이트디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자, D-2 하이드록시산 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자, 시말레이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 2-isopropylmalate synthase, 3-isopropylmalate dehydrogenase, 3-isopropylmalate/(R)-2-methylmalate dehydratase (leuBCD)가 도입되어 있으며, 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소는 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase 또는 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase의 변이 효소인 PhaC1인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 프로피오닐-CoA 전이효소는 C. propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소 또는 C. propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소의 변이효소인 Pct540인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  10. 제7항에 있어서, D-2 하이드록시산 디하이드로게나아제는 Lactobacillus lactis 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  11. 제7항에 있어서, 시말레이트 합성효소는 Methanococcus jannaschii 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  12. 제7항에 있어서, 2-isopropylmalate synthase, 3-isopropylmalate dehydrogenase, 3-isopropylmalate/(R)-2-methylmalate dehydratase (leuBCD) 효소는 대장균 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  13. 제1항의 재조합 미생물을 2-하이드록시부티레이트 및 3-하이드록시부티레이트 함유 배지에서 배양하여 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 단계; 및 상기 생산된 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 수득하는 단계를 포함하는 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  14. 제7항의 재조합 미생물을 글루코오스 및 3-하이드록시부티레이트 함유 배지에서 배양하여 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 단계; 및 상기 생산된 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 수득하는 단계를 포함하는 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  15. 제7항의 재조합 미생물을 글루코오스 함유 배지에서 배양하여 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 단계; 및 상기 생산된 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 수득하는 단계를 포함하는 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  16. 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트.
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