KR100952754B1 - 토양 메타게놈에서 유래한 항생 활성을 암호화하는유전자군 - Google Patents

Abstract

본 발명은 토양 미생물 메타게놈에서 유래한 항진균 및 항세균 활성을 암호화하는 유전자 집단과 항생활성 유전자 발현을 조절하는 조절 유전자에 관한 것으로, 메타게놈으로부터 얻은 22 kb의 항생활성 유전자 집단 orf20 내지 orf39을 특징으로 한다. 본 발명은 항효모 활성과 Bacillus subtilis에 대한 길항력을 가지는 클론인 EAF66 의 유전자에 대한 것으로 이러한 유전자 집단을 대장균에 발현하여 새로운 항생제 활성의 개발이 가능하며, 항진균 및 항세균 활성을 나타내므로 항생물질 생산을 위해 유용하게 이용할 수 있다.

메타게놈, 항진균, 항세균.

Description

토양 메타게놈에서 유래한 항생 활성을 암호화하는 유전자군{A GENE CLUSTER ENCODING ANTIBIOTIC ACTIVITY FROM SOIL METAGENOME}

본 발명은 토양 미생물의 총 유전체인 메타게놈으로부터 항생 활성을 암호화하는 유전자 집단을 선발하고 그 항생 효과를 증명하는 데 관한 것이다.

미생물 자체나 미생물의 2차 대사 산물이나 단백질 등을 산업적으로 이용하려는 연구가 지난 100여 년간 여러 분야에서 폭넓게 시도되어 왔다. 이는 주로 배양이 가능한 미생물을 대상으로 하며 많은 미생물 2차 대사산물들이 산업에 이용되어 왔다(예를 들면, 항생제, 항암제, 항균제, 면역억제제, 효소억제제, 제초제, 살충제, 생장 호르몬 등).

그러나 배양이 가능한 미생물로부터의 산물은 이미 많이 연구가 되어있고, 새로운 항생제를 방선균 등으로부터 찾으려는 시도는 계속하고 있으나 기존의 발견된 물질을 반복해서 분리하게 되는 예가 흔하다(Handelsman 등 1998).

항생물질 탐색의 고전적인 방법은 항생물질을 생산하는 미생물을 탐색하고 이들 미생물의 발효에 의해 항생물질을 확보하는 것이다. 그러나 분자 미생물 생태학의 연구결과 자연계에 존재하는 미생물의 99% 이상이 전형적인 배지에서 배양이 되지 않는다는 사실이 증명되었다(Amann 등 1995, Hugenholtz 와 Pace 1996,Ward 등 1990). 따라서 실제로 배양되어 동정이 된 적이 없는 대다수의 미생물들의 산물을 찾으려는 노력이 필요하며 이는 분자생물학적인 재조합 유전자 조작과 유전자 발현을 통하여 가능하리라 여겨진다.

메타게놈 연구는 이를 위해 시도되고 있는 최근의 접근방법으로, 메타게놈이란 자연계에 존재하는 모든 미생물의 유전체를 통칭하는 것으로 정의된다. 우선 자연계로부터 미생물을 배양하지 않고 메타게놈을 분리하며 이들을 라이브러리로 작성하여 배양가능한 대장균에 도입하므로서 구성된다. 이는 미생물산물을 배양이 되지 않았던 미생물로부터 확보하려는 접근 방법이라고 할 수 있다. 이 방법으로 유전자의 유래가 되는 미생물에 대한 정보는 얻기가 어려우나 미생물 산물과 유전자를 동시에 확보할 수 있는 장점이 있다.

미국 위스콘신 대학 연구팀은 처음으로 대형의 메타게놈을 성공적으로 분리하여 bacterial artificial chromosome (BAC) vector에 클로닝하여 메타게놈 라이브러리를 구축하였고 이로부터 광범위 항생물질 및 그 생합성 관련 유전자들을 분리하였다(Gillespie 등 2002 Rondon 등2000). TIGR 연구팀에서도 해양 미생물의 총 미생물 메타게놈 라이브러리를 BAC에 구축하여 해양의 배양되지 않는 미생물의 유전자원 탐색을 시도하고 있다.

본 발명의 목적은 토양미생물의 메타게놈으로부터 항생물질 생산에 관련된 신규한 유전자 집단을 제공하는 것이다.

또한 활성 메타게놈에서 활성관련 부위를 결정하고 염기서열을 결정하여 기보고된 유전자 집단과 상동성을 비교함으로써 항생 활성을 암호화하는 신규한 유전자 집단을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 메타게놈으로부터 항생 활성이 있는 신규한 유전자 집단을 선발하여 제공한다.

본 발명자들은 토양 미생물의 메타게놈을 분리하여 포스미드를 이용하여 대장균에 메타게놈 라이브러리를 작성하고 항생 활성을 가지는 클론을 탐색하였다. 탐색의 대상인 균주는 진균인 Saccharomyces cerevisiae 와 세균인 Bacillus subtilis 였으며 항생 활성을 가지는 메타게놈 클론을 확보하였다.

활성 메타게놈에서 활성관련 부위를 결정하였고 염기서열을 결정하였는 바 기보고된 유전자 집단과 상동성이 아주 낮아 항생 활성을 암호화하는 신규한 유전자로서 본 발명을 완성하였다.

메타게놈으로부터 얻은 서열번호 1의 orf20 내지 orf39 까지의 유전자 집단으로서 항생활성을 가지는 것을 특징으로 한다. 상기 유전자 집단 중 항생활성의 발현에 직접적으로 관련되는 것은 orf29 내지 orf36 까지이다. 또한 상기 유전자 집단과 70% 이상의 상동성을 가진 유전자 집단이 가능하다.

또한 본 발명에서는 서열번호 2의 orf29 내지 orf36 까지의 항생활성 유전자가 코딩하는 단백질의 아미노산 서열을 규명하였다.

ORF20은 IclR response regulator(-frame)를, ORF28는 LysR family response regulator를 코딩한다. ORF29~ORF26은 항생활성 유전자로서, ORF30은 Ketoacyl synthase, ORF31는 ACP synthase, ORF32는 ACP synthase, ORF33은 Ketoacyl synthase, chain length, ORF34는 Aminotransferase, ORF35는 ACP reductase, ORF36은 Ketoreductase를 코딩한다.

한편, 상기 유전자 집단 중 orf20 및 orf28는 항생활성 유전자의 발현을 조절하는 조절유전자인 것을 특징으로 한다. 상기 조절유전자 orf20 및 orf28과 각각 70% 이상의 상동성을 가진 유전자가 가능하다. 서열번호 3 및 4의 orf20 및 orf28 조절 유전자는 IclR response regulator 및 LysR family response regulator을 코딩한다.

본 발명에서 제공하는 유전자의 전체 염기서열은 22,099 bp 이다. 본 유전자를 형질전환한 대장균은 벡터만 가지고 있는 대장균이 가지지 못하는 항진균 활성과 항세균 활성을 가진다. 항진균 활성은 효모인 Saccharomyces cerevisiae 에 대하여 항세균 활성은 그람 양성인 Bacillus subtilis 에 대하여 활성을 나타내었다. 그러나 그람 음성 세균인 Agrobacterium tumefaciens 에 대하여는 활성을 보이지 않았다.

이와 같은 유전자와 전체적으로 상동성을 보이는 유전자 집단은 아직 보고되 지 않았으며 아노테이션된 아미노산의 서열은 기존의 단백질들과 29-53% 정도의 상동성을 보여 신규한 유전자 집단으로 판단된다.

본 발명의 유전자 집단은 대장균에 형질전환하여 항생물질 생산에 이용할 수 있다. 본 유전자를 형질전환한 대장균은 벡터만 가지고 있는 대장균이 가지지 못하는 항진균 활성과 항세균 활성을 가진다. 항진균 활성은 효모인 Saccharomyces cerevisiae 에 대하여 항세균 활성은 그람 양성인 Bacillus subtilis에 대하여 활성을 나타내었다. 그러나 그람 음성 세균인 Agrobacterium tumefaciens 에 대하여는 활성을 보이지 않았다.

본 발명의 유전자 집단은 항진균 및 항세균 활성을 나타내므로 항생물질 생산을 위해 유용하게 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명하고자 한다.

실시예 1: 토양 메타게놈 DNA 의 분리

본 연구에 사용한 토양 시료는 대전시 유성구 일대의 산림토양으로부터 채취하여 메타게놈 라이브러리 작성에 사용하였다. 채취한 토양은 각 구멍이 1.40 mm직경인 체에 쳐서 1.5 mm 이상의 입자와 식물 잔재물 등을 제거하고 메타게놈 추출을 위하여 5g씩 사용하였다.

SDS와 proteinase K를 처리하여 DNA를 추출하였는데 좀더 자세히 기술하면 아래와 같다.

산림토양 5g을 먼저 완충용액 15 ml 에 넣어 섞어주었다.

상기 완충용액의 조성은, 100 mM 의 Tris-HCl(pH 8.0), 100 mM 의 EDTA (pH 8.0), 100 mM의 sodium-phosphate (pH 8.0), 1.5 M 의 NaCl, 1%의 CTAB의 구성으로 이루어진다.

완충용액에 현탁이 된 산림토양에 100mg/ml 농도의 proteinase K를 100 μl 첨가하고 37℃ 진탕배양기에서 150 rpm의 속도로 30분간 진탕하였다. 이후에 20%의 SDS를 1.5 ml 첨가하고 잘 흔들어 섞어주었다. 이를 65℃ 항온수조에서 30분마다 한번씩 섞어주면서 2시간 동안 유지하였다.

이후에 7,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 분리하고 같은 부피의 클로로포름/아이소 아밀 알코올 (24:1)을 첨가하여 섞어준 후 8,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 DNA가 포함된 상등액을 새 튜브로 옮긴다.

상등액의 부피의 0.6배에 해당하는 아이소프로파놀을 첨가하고 섞고 11,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 DNA 침전물을 얻었고 이를 70% 에탄올을 첨가하여 재원심분리하고 침전물을 말려서 0.5 ml의 TE 완충액(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) 에 녹여서 4℃에 보관하면서 라이브러리 작성에 이용하였다.

분리된 DNA의 양과 크기 결정은 pulsed field gel electrophoresis (PFGE) 로 확인하였다. PFGE를 수행하는 조건은 6 V/cm에서, 120° fixed angle로 1-6초 switch time 조건에서 6시간 수행하였다.

각종 토양으로부터 메타게놈을 분리하여 토양 1g 당 약 1～1.5 μg 의 DNA를 회수하였고 분리된 DNA 크기는 20~100 kb 정도로 대형으로 분리가 가능하였다.

실시예 2: 메타게놈 라이브러리의 작성

DNA의 전기영동, plasmid 분리, DNA의 절단 등은 기준이 되는 분자생물학적 방법(Sambrook 등 1989)으로 수행하였다. 시약 및 제한효소의 사용 등은 제조회사에서 추천한 방법에 따라 수행하였다.

추출해낸 메타게놈을 low melting point agarose gel에서 전기영동을 한 후 20-kb 이상의 DNA를 포함하는 agarose block만을 회수하고, 이를 GeLase 를 처리하여 DNA를 순화하였다. 이 과정을 통하여 humic acid 등을 제거할 수 있었다.

순화된 DNA 조각의 양끝 말단을 DNA end-repair 효소를 이용하여 수리하고, 20kb 이상의 메타게놈을 제한효소 Eco72I로 처리한 포스미드 벡터 pEpiFOS-5(Epicentre, USA) 에 라이게이션한 후 packagene extract (Epicentre. USA)를 이용하여 E. coli 에 도입하여 형질 전환체들을 선발하였다. 형질 전환체 들로부터 재조합 효율을 검정하기 위하여 전통적인 SDS-alkali lysis 방법으로 plasmid를 분리한 후 제한효소로 절단하여 전기영동 하였다.

검정한 80개의 형질전환체들은 모두 재조합 플라스미드로 확인되어 라이브러리가 잘 작성됨을 알 수 있었다.

채취한 산림표토 토양으로부터 라이브러리를 작성하였는데 토양 metagenomic DNA 1 μg당 25,000 ~ 60,000 클론의 확보가 가능하였다. 작성한 라이브러리는 1,000~1,500 클론씩 pool로 -80℃에 보관하였다. 유성구의 산림표토로부터 작성한 라이브러리는 총 112,000 클론이었다. 삽입된 메타게놈 DNA 의 평균 크기는 무작위로 메타게놈 라이브러리 클론 플라스미드를 추출하여 BamHI으로 절단한 후 전기영동하여 확인한 결과 35 kb 이상으로 나타났다.

실시예 3: 메타게놈 라이브러리의 항생활성 검정 및 선발

작성된 산림표토 메타게놈 라이브러리로부터 항진균, 항세균 활성 검정을 위해 효모(Saccharomyces cerevisiae)와 Agrobacterium tumefaciens, 그리고 Bacillus subtilis를 이용하였다. 먼저 작성된 라이브러리의 LB replica plate를 준비하여 각 클론들을 37℃에서 이틀간 선배양하였다. 그 위에 효모나 A. tumefaciens, 또는 B. subtilis가 포함된 탑아가(topagar)를 중층하여 30℃에서 2일간 후배양하고 효모나 세균들에 대한 생육 저해 클론 존재여부를 조사하여 항진균, 항세균 활성을 검정하였다.

선발된 활성 클론은 플라스미드를 재분리하고 대장균 EPI-100 에 형질전환하여 대상 검정 생물로 길항작용을 재검정하고 -80℃에 보관하였다.

본 발명에서 작성한 산림표토 메타게놈 라이브러리로부터 항진균 활성 클론 1종을 분리하여 재검정 결과, 항진균 활성 클론은 B. subtilis 에 대한 항세균 활성을 나타내었으나 A. tumefaciens에 대한 항생활성은 보이지 않았다.

선발된 클론들 중 항진균 활성이 우수한 클론의 유전자를 in vitro에서 트랜스포존 삽입변이 방법(insertional mutagenesis)과 염기서열 분석을 통해 항진균 관련 유전자를 분석하였다. 본 발명은 항효모 활성과 B. subtilis에 대한 길항력을 가지는 클론인 EAF66 의 유전자에 대한 것이다.

실시예 4: 항생활성 유전자 부위 결정

항진균 활성을 보이는 클론인 EAF66 에 대하여 in vitro에서 트랜스포존 삽입변이 방법(insertional mutagenesis)과 염기서열 분석을 통해 항진균 관련 유전자를 분석하였다. 트랜스포존 삽입 변이는 transposase와 GPS3 트랜스포존을 함유한 플라스미드를 제공하는 제조회사의 추천방법에 따라 수행하였다.
서로 다른 부위에 트랜스포존을 삽입한 각 변이체들을 약 200개체 선발하여 항효모 활성 및 B. subtilis에 대한 항세균 활성을 재검정하여 활성을 상실한 변이체를 19개체 선발하였다. 활성을 상실한 변이체들의 트랜스포존 삽입부위의 DNA 염기서열을 결정하기 위하여 삽입 주변부위 DNA를 PstI으로 절단하였다. 절단된 DNA들을 PstI으로 절단하고 Shrimp alkaline phosphatase 처리한 pUC119 에 라이게이션하여 클로닝하고 가나마이신이 첨가된 배지에서 선발된 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하고 염기서열을 결정하여 삽입부위를 결정하였다. 활성을 상실한 변이체들의 트랜스포존 삽입 부위는 도 1A에 "

" 로 나타나 있다.

삭제

실시예 5: 항생활성 유전자 집단 염기서열 결정

항생 활성 클론 EAF66 의 플라스미드를 분리하고 총 염기서열을 분석한 결과 삽입 DNA의 크기는 40 kb 이상이었으며 이들 중 22 kb 부위가 활성에 필요하며 최소한 8개 이상의 유전자가 생리활성 표현형에 관련되어 있는 것으로 나타났다.

이들 활성에 직접적으로 관여된 유전자는 회색의 화살표로 도 1A에 표현되었으며 이들은 orf29에서 orf36까지이다. 이들은 각 orf의 종결코돈과 연속되는 orf의 개시코돈이 서로 겹쳐 연결되어 한개의 프로모터에 의해 유전자의 발현이 조절될 한 개의 전사단위(transcriptional unit)로 추론된다. 상기 항생활성 유전자 집단의 각 유전자에 있어서, ORF29는 서열번호 4의 단백질의 아미노산 서열을 나타내며, ORF30은 서열번호 5로서 Ketoacyl synthase, ORF31은 서열번호 6의 ACP synthase, ORF 32는 서열번호 7의 ACP synthase, ORF 33은 서열번호 8의 Ketoacyl synthase, ORF34는 서열번호 9의 Aminotransferase, ORF35는 서열번호 10의 ACP reductase, ORF36는 서열번호 11의 Ketoreductase의 단백질을 각각 암호화하는 것을 특징으로 한다.

유전자 집단 내에 유전자의 기원을 판단할 만한 계통분류적 표지유전자는 포함되어 있지 않았다. 항균 활성 클론의 구성은 도 1A에 나타나 있으며 트랜스포존 삽입부위와 함께 표시하였다. DNA의 염기서열은 BLASTX 검색을 통해, 항균활성 관련 유전자들은 GenBank의 유전자들과 비교하여 그 유사도가 가장 높은 유전자들을 도 2에 표로서 표현하였다. orf29에서 orf36의 유전자들은 추론한 아미노산 수준에서 가장 높은 유사성(identity)이 29~53% 수준으로 신규 유전자 집단으로 판단되었다.

실시예 6: 항생활성 유전자 발현 조절 유전자 결정

도 1에 나타난 것처럼 두 개의 조절 유전자를 각각 XhoI 과 SphI으로 절단하 여 pUC129와 pUC119에 각각 서브 클로닝하였다. orf20을 포함하는 1.25 kb의 XhoI 으로 절단한 EAF66 DNA 조각은 pUC129에 서브클로닝하여 pEJ102로 명명하였다. 그리고 orf28을 포함하는 2.58 kb의 SphI 으로 절단한 EAF66 DNA 조각은 pUC119에 서브클로닝하여 pEJ101로 명명하였다 (도 1).

pEJ101 과 pEJ102는 각각 lac 프로모터에 의해 강하게 발현되는 LysR 계의 조절단백질과 IclR 계의 조절단백질을 암호화하는 유전자를 포함하였다. 각 플라스미드를 EAF66 이나 pEPI-FOS5를 포함하는 대장균에 형질전환하였다. 그리고 실시예 3에서 실시한 방법에 따라 효모에 대한 항진균활성을 검정하였다.

도 3에서 나타난 것처럼 EAF66과 pUC129를 가진 대장균(도 3A), EAF66과 pUC119를 가진 대장균 (도 3C)에 비해 EAF66과 함께 pEJ101이나 pEJ102 (도 3B, 도 3D) 를 가진 대장균의 항진균 활성이 증가한 것을 효모 생육저지대가 증가한 것을 보고 판단할 수 있다. 대조군인 pEPI-FOS5와 pEJ102를 가진 대장균은(도 3E) EAF66 를 함유하고 있지 않아 항진균 활성이 전혀 나타나지 않았다.

따라서 high copy number plasmid에 서브클론되어 도입된 orf20과 orf28의 유전자 산물인 두 개의 조절단백질 IclR 과 LysR은 EAF66에서 발현되는 항생활성을 양성적으로 조절함을 나타내었다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 설명하였으나 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형실시가 가능할 것이며, 이러한 변형실시는 본원발명의 보호범위에 속하는 것으로서 본원발명의 보호범위는 특허청구범위에 기재된 바에 따라 해석되어야 할 것이다.

도 1은 메타게놈에서 분리한 항진균 및 항세균 활성 유전자 집단의 유전자 지도와 조절 유전자, 그리고 트랜스포존 삽입 변이로 항생활성을 상실한 유전자를 나타낸 도면이다.

도 2는 항생활성을 보이는 유전자 집단의 각 유전자들을 GenBank의 유전자들과 상동성을 비교하여 유사한 유전자와 아미노산 수준에서 동일성 그리고 유사 유전자를 가진 미생물을 나타낸 표이다.

도 3은 두 개의 조절 유전자를 과다발현하도록 형질전환한 대장균이 항생활성 유전자의 활성을 증가시켜 항생활성이 증가한 것을 나타낸 사진이다.

<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> A GENE CLUSTER ENCODING ANTIBIOTIC ACTIVITY FROM SOIL METAGENOME <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22099 <212> DNA <213> metagenome <400> 1 ttagaaactc ccggtataac ccagggtggc tgaaatctgg gcggcggtgc cgaccaggtc 60 ttccagccac tcttcctgca ggcggtcggc gggcgccgag atcgacaggc ccgcgaccag 120 tttgccggaa tcgtcatgga tgccggccgc catgcagcgc acccccagct ccagttcctc 180 gttgtcgcgc gcatagccgc gcgtacgcac catcgacagc tcacgttcga gcttgcccag 240 gtccgtgatc gaattcttgt tgtggcccgc caggccggtg cgcgtggcgt aggcgcggat 300 cgccttcggc tcgtccaccg acaggaacag cttgccggtc gacgtcaggt gcagcggacc 360 gcgcccgccg atcgcgcgca ccacctgcat gccggagcgc tcggaaaaag cgcggtcgat 420 gtagacgatc tcgtcgccct ggcgcaccga caggttgatg gtctgctggg tcttcttgtg 480 cagcgcgcgc atgaagtcca gcgccgcctc gcgtaccgac agccggctct tgaccacatt 540 gcccagttcc agcaggcgca tgccgaggcg gtaggtgccc ggctcgacgc ggtcgacaaa 600 gcgcgtgatc accatgtcgt tgaggatgcg gtgcgcggtg gaaggatgca ggcccgatac 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Ala Cys Ser Ala Glu Val Cys Gly Ala Leu Gly 305 310 315 320 Pro Ala Ala Pro Val Leu Gly Val Leu Leu Ala Ala His Ala Ile Arg 325 330 335 Ser Gly Ala Arg Leu Arg Tyr Thr Ala Pro Gly Gln Pro Gln Arg Glu 340 345 350 Glu Ala Ala Arg Val Arg His Val Leu Val Thr Ala Arg Gly Pro Glu 355 360 365 Gly Gln Tyr Ala Ala Val Val Val Ser Lys Glu Lys Cys Asp Glu 370 375 380 <210> 7 <211> 421 <212> PRT <213> metagenome <400> 7 Met Ser Asn Arg Val Val Ile Thr Gly Leu Gly Val Val Ser Ala Leu 1 5 10 15 Gly Tyr Asp Trp Glu Thr Phe Trp Asn Ala Leu Leu Ala Gly Lys Ser 20 25 30 Gly Ile Arg Pro Trp Gln Pro Asp Glu Val Glu Gly Phe Pro Val Gln 35 40 45 Tyr Ala Ala Pro Val Asp Leu Ala Asp Phe Glu Arg Thr Phe Ala Arg 50 55 60 Ala Ala Glu Leu Ala Gln Pro Met Glu Arg Arg Ser Arg Phe Gly Leu 65 70 75 80 Met Ala Ala Arg Gly Ala Leu Ala Asp Ala Gly Leu Ala Gly Lys Val 85 90 95 Arg His Asn Thr Gly Val Ala Val Gly Ser Gly Val Pro Glu Arg Cys 100 105 110 Ser Ala Asp Met Leu Leu Ala Leu Gly Pro Ala Gly Pro Arg Trp Glu 115 120 125 Asn Leu Tyr Ala Arg Arg Ala Glu Leu Asn Ala Ser Met Arg Pro Gly 130 135 140 Asn Asp His Leu Ala Ala Leu Val Ala Arg Ser Tyr Gly Cys Asp Gly 145 150 155 160 Pro Val Leu Asn Phe Ser Thr Ala Cys Ala Gly Ala Ala His Ala Ile 165 170 175 Gly Ser Ser Phe Arg Met Ile Arg Asp Gly Glu Thr Asp Cys Met Leu 180 185 190 Ala Gly Gly Ala Asp Ser Val Leu Asn Leu Met Thr Met Leu Gly Leu 195 200 205 Asn Leu Ile Gly Ala Pro Ser Thr Ser Glu Asp His Gly Asp Lys Leu 210 215 220 Cys Arg Pro Phe Asp Ser Ala Arg Ser Gly Phe Val Ala Ala Glu Gly 225 230 235 240 Gly Ala Met Leu Val Leu Glu Ser Glu Arg Arg Ala Arg Ser Arg Gly 245 250 255 Ala Arg Ile Tyr Ala Glu Ile Cys Gly Phe Gly Ser Ser Leu Asp Ala 260 265 270 Tyr Arg Val Thr Ala Pro His Pro Glu Gly Arg Gly Ala Ala Leu Ala 275 280 285 Met Arg Lys Ala Leu Ala Asp Ala Gly Leu Gln Pro Gly Ala Ile Gly 290 295 300 Tyr Ile Asn Ala His Gly Thr Ser Thr Pro Leu Asn Asp Val Ala Glu 305 310 315 320 Thr Arg Ala Ile Lys Ser Val Phe Ala Asp Gly Gly His Tyr Arg Lys 325 330 335 Leu Met Val Ser Ala Ser Lys Ser Gln Ile Gly His Met Ile Ala Ala 340 345 350 Ala Gly Ala Pro Glu Cys Ile Ala Thr Val Leu Ala Leu His Ala Gly 355 360 365 His Val Pro Pro Thr Leu Asn Leu Asp His Pro Asp Pro Glu Cys Asp 370 375 380 Leu Asp Tyr Val Pro His Leu Ala Arg Arg Ala Pro Ile Gln Ala Ala 385 390 395 400 Leu Ser Asn Ser Phe Gly Phe Gly Gly Leu Asn Val Ser Leu Ala Leu 405 410 415 Arg Arg Tyr Gln Glu 420 <210> 8 <211> 425 <212> PRT <213> metagenome <400> 8 Met Asn Thr Ser Ala Asp Asn Thr Ile Val Ile Thr Gly Thr Gly Cys 1 5 10 15 Leu Leu Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ala Gln Phe Trp Asp Arg Leu Val 20 25 30 Gln Gly Glu Ser Gly Leu Thr Pro Tyr Ser Asp Glu Arg Ile Gly Ser 35 40 45 Arg Leu Ile Gly His Phe Gly His Leu Ser Ala Glu Gln Arg Ala Ala 50 55 60 Ala Ala Glu Ala Val Pro Phe Lys Leu Arg Arg Phe Ala Ser Ser Cys 65 70 75 80 Ser Met Trp Gly Val Lys Ala Ala Thr Asp Ala Leu Ala His Ala Gly 85 90 95 Leu Asp Leu Lys Thr Ile Pro Asp Asp Arg Cys Gly Leu Phe Thr Ala 100 105 110 Gln Gly Asp Tyr Leu His Pro Ser Val Gln Ser Phe Ala Thr Gly Leu 115 120 125 Gly Asn Ala Val Pro Asn Asp Leu Pro Ala Leu Thr Arg Glu Phe Thr 130 135 140 His His Arg Gly Met Glu Pro Phe Met Ala Ile Lys Ser Leu Ala Asn 145 150 155 160 Asn Met Leu Ala Met Ala Ser Leu Thr Leu Gly Thr Arg Gly Asp Cys 165 170 175 Gly Ala Phe Val Gln Asn Lys Ser Ala Thr Val Ala Ala Leu Arg Ser 180 185 190 Ala Ala Phe Ser Leu Arg His Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Leu Leu Ile 195 200 205 Cys Ser Gly Ser Tyr Asn Glu Val Leu Thr Leu Ala Glu Leu Gln Arg 210 215 220 Ser Gly Tyr Leu Ser Ala Gly Ala Gly Gly Ala Arg Ser Val Arg Pro 225 230 235 240 Phe Asp Arg Arg Arg Asp Gly Thr Ile Ala Gly Glu Gly Ala Val Ala 245 250 255 Phe Val Leu Glu Thr Ala Ala Asn Ala Arg Arg Arg Gly Ala Ala Val 260 265 270 Leu Ala Thr Leu Gly Gly Ile Gly Asn Leu Val Gln Gln Pro Gly Ala 275 280 285 Gln Ala Gly Ser Asp Ala Tyr Arg Arg Cys Ala Asp Lys Ala Leu Ala 290 295 300 Gly Ser Gly Val Asp Phe Gly Asp Ile Gly Ala Ile Val Ala Arg Gly 305 310 315 320 Thr Gly Gly Gln Ser His Asp Ala His Glu Ala Ser Leu Leu Ala Gln 325 330 335 Leu Gln Gln Gly Arg Gly Gly Val Pro Ile Thr Cys Ala Thr Pro Ile 340 345 350 Val Gly Ser Val Pro Ala Cys Pro Val Asp Trp Leu Ala Ser Ile Gly 355 360 365 Ile Leu Gln Glu Gly Val Val Pro Pro Ile Ala Asn Leu Glu Asp Ala 370 375 380 Leu Asp Ala Gly Leu His Phe Val His Gly Lys Pro Glu Gln Arg Asp 385 390 395 400 Ala Arg His Val Leu Ser Leu Ser Ala Gly Tyr Thr Gly Phe His Ser 405 410 415 Ala Val Leu Phe Ser Ala Ala Ser His 420 425 <210> 9 <211> 963 <212> PRT <213> metagenome <400> 9 Met Ser Asn Tyr Gln His Tyr Val Lys Thr His Leu Ser Lys Leu Leu 1 5 10 15 Ala Ala Leu Gly Leu Asp Ile Ser Tyr Thr Arg Ala Ala Gly Asp Thr 20 25 30 Leu Tyr Tyr Arg Asp Arg His Gly Glu Glu Ile Pro Val Leu Asp Leu 35 40 45 Leu Gly Gly Tyr Gly Ser Leu Ile Phe Gly His Asn His Pro Gln Ile 50 55 60 Met Ala Thr Ala Thr Asp Leu Ile Ala Gln Gln Val Pro Val His Ala 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Arg Glu Arg Ala Gly Glu Leu Ala Arg Arg Leu Ser 85 90 95 Gly Met Val Gln Arg Glu Ser Gly Ser Glu Glu Glu Phe Asn Val Thr 100 105 110 Phe Ala Asn Ser Gly Ala Glu Ala Ile Glu Val Ala Ile Lys His Ala 115 120 125 Glu Leu Asp Arg Ile Leu Lys Leu Gln Thr Leu Leu Asp Asp Val Thr 130 135 140 Leu Asn Ile Glu Arg Val Gln Lys Ala Ile Arg Asn Gly Thr Ala Lys 145 150 155 160 Val Pro Val Asp Val Tyr Arg His Ser Pro Ile Arg Glu Gln Val Phe 165 170 175 Asp Val Arg Gly Phe Glu Glu Leu Ile Val Gly Leu Val Ser His Asn 180 185 190 Thr Thr Gln Leu Val Lys Arg Pro Ile Phe Leu Val Leu Glu Lys Ser 195 200 205 Phe His Gly Lys Leu Ile Gly Ser Val Gln Leu Thr Tyr Asn Lys Asn 210 215 220 Phe Arg Arg Pro Phe Gln Tyr Phe Gly Leu Asn Thr Arg Phe Ile Ser 225 230 235 240 Pro His Asp Pro Asp Gln Leu Arg Arg Val Leu Ala Glu Glu Arg Ile 245 250 255 Val Leu Tyr Asp Leu Asp Val Gln Asp Gly Val Val Arg Val Val Glu 260 265 270 Arg Pro Ile Pro Ile Phe Ala Ala Phe Leu Val Glu Pro Ile Gln Gly 275 280 285 Glu Gly Gly Val His Met Leu Asp Ala Asp Phe Ala Lys Leu Val Arg 290 295 300 Lys Thr Cys Asn Glu Leu Asp Cys Pro Leu Ile Val Asp Glu Ile Gln 305 310 315 320 Ser Gly Met Gly Arg Ser Gly Ser Phe Leu Ala Ser Thr Leu Ile Pro 325 330 335 Leu Lys Gly Asp Tyr Tyr Thr Leu Ser Lys Ser Leu Gly Gly Gly Leu 340 345 350 Ala Lys Ile Ser Ala Thr Leu Ile Arg Lys Ser Arg Val Arg Lys Glu 355 360 365 Phe Ser Leu Val His Ser Ser Thr Phe Ala Glu Asp Asp Phe Ser Ser 370 375 380 Gly Ile Ala Leu Lys Val Leu Asp Met Leu Glu Ala Asp Asp Gly Lys 385 390 395 400 Ala Tyr His Gln Val Gln Asp Ser Ala Ala Lys Leu Phe Ala Ala Phe 405 410 415 Glu Arg Val Arg Ala Ala Phe Pro Asp Val Ile Lys Glu Val Arg Gly 420 425 430 Gln Gly Leu Phe Ile Gly Val Glu Phe His Ser Gln Lys Asn Ala Ser 435 440 445 Ser Ile Ile Ile Arg Gly Ser Ala Tyr Asn Asp Ser Phe Gly Tyr Leu 450 455 460 Leu Ser Gly Tyr Leu Leu His Gln Glu Arg Ile Arg Ile Ala Pro Pro 465 470 475 480 Gly Ser Ala Pro Asn Val Leu Arg Ile Glu Pro Ser Met Phe Leu Ser 485 490 495 Asp Ala Gln Val Ala His Val Glu Ala Ala Phe Gly Arg Leu Cys Asp 500 505 510 Ile Val Arg Lys Gln Asp Ala Leu His Phe Val Phe Pro Leu Thr Ala 515 520 525 Ser Ser Arg Ala Lys Pro Arg Arg Glu Ala Gln Asp Phe Ser Gln Ala 530 535 540 Phe Pro Ala Gln Pro Ala Ala Asp Ser Arg Phe Glu Pro Thr Arg Pro 545 550 555 560 Val Arg Lys Ile Ala Phe Ile Asn His Leu Ile Asn Pro Gln Leu Leu 565 570 575 Thr Glu Val Asp Pro Ser Leu Ala Val Leu Thr Ala Glu Glu Leu Arg 580 585 590 Gln Phe Val Leu Lys Met Asp Pro Asn Lys Lys Ala Ala Pro Tyr Pro 595 600 605 Ala Val Arg Ile His Ser Pro Leu Gly Ser Ala Val Asp Phe Ile Leu 610 615 620 Tyr Pro Leu Cys Val Ser Ser Glu Gln Met Gly Gln Tyr Leu Ala Asp 625 630 635 640 Gly Lys Leu Asp Gly Ile Arg Asp Asp Ile Gln Asp Arg Ile Lys Ala 645 650 655 Ala Ser Glu Asp Gly Cys Glu Ile Ala Gly Leu Gly Met Phe Thr Ser 660 665 670 Ile Val Thr Asn Asn Cys Leu Ser Leu Arg Val Pro Asp Thr Ala Leu 675 680 685 Thr Thr Gly Asn Ala Phe Thr Val Ala Met Ala Ile Asp Ala Ile Asp 690 695 700 Asn Ala Val Ala Ala Ala Gly Leu Pro Ile Glu Glu Leu Thr Val Val 705 710 715 720 Val Val Gly Ala Ala Gly Asn Ile Ala Ser Thr Tyr Ala Ser Leu Leu 725 730 735 Ser Glu Lys Thr Thr Arg Leu Ile Leu Leu Gly Ser Glu Arg Asn Gly 740 745 750 Ser Leu Ser Arg Leu Asn Gln Thr Leu His Ser Ile Tyr Asp Asp Thr 755 760 765 Trp Gln Glu Ile Cys Thr Leu Pro Arg Glu Lys Leu Gly Arg Leu Ala 770 775 780 Gln Arg Leu Val Arg Glu Pro Leu Val Ala Glu Trp Leu Glu Glu Gly 785 790 795 800 Thr Ala Pro Gln Arg Gly Arg Gly Lys Ala Ile Ala Gln Tyr Val Ala 805 810 815 Glu Arg His Gly His Asp Pro Tyr Ile Thr Val Ser Thr Asp Arg Ser 820 825 830 Leu Ile Arg Arg Gly His Ile Val Leu Cys Ala Ala Asn Ser Ala Glu 835 840 845 Pro Phe Leu Thr Gly Glu Asp Phe Arg Glu Asn Ala Ile Val Cys Asp 850 855 860 Ile Ala Val Pro Asn Asn Val Cys Glu Gly Ile Gly Lys Asp Arg Pro 865 870 875 880 Asp Val Val Tyr Gln Gln Gly Gly Ile Val Ala Thr Pro Asn Gly Glu 885 890 895 Ser Leu His Pro Gly Ala Arg Ala Phe Leu Gly Ala Gly Gln Leu Phe 900 905 910 Ala Cys Met Ala Glu Thr Val Ile Met Gly Leu Ala Gly Ile Asn Arg 915 920 925 His Tyr Ser Tyr Gly Ala Ile Ser Lys Gln Gln Val Arg Glu Ile Ala 930 935 940 Ala Leu Gly Arg Ala His Gly Phe Ser Leu Ala Glu Tyr Lys Thr Gly 945 950 955 960 Ser Ser Leu <210> 10 <211> 250 <212> PRT <213> metagenome <400> 10 Met Thr Val Lys Leu Ser Asp Gln Val Ala Ile Val Thr Gly Ala Ser 1 5 10 15 Arg Gly Ile Gly Arg Ala Ile Ala Val Leu Phe Ala Glu Glu Gly Cys 20 25 30 Asp Val Ala Ile Asn Tyr Arg Gly Asp Glu Ala Gly Ala Leu Glu Thr 35 40 45 Ala Ala Ala Val Glu Gln Phe Gly Arg Lys Ala Met Leu Val Lys Ala 50 55 60 Asp Val Ser Ser Phe Glu Gln Cys Glu Arg Met Ala Asp Ala Val Ala 65 70 75 80 Glu Arg Phe Gly Lys Ile Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Thr 85 90 95 Arg Asp Asn Leu Leu Val Ser Met Asp Ala Glu Asp Ile Glu Ala Val 100 105 110 Ile Arg Thr Asn Leu Leu Gly Val Ile Tyr Pro Thr Lys Ala Val Ala 115 120 125 Met His Met Val Arg Lys Arg Ser Gly Arg Ile Val Asn Met Ser Ser 130 135 140 Ser Ala Ala Ser Arg Pro Gly Lys Gly Gln Cys Asn Tyr Ala Ala Ala 145 150 155 160 Lys Gly Gly Val Glu Ser Phe Thr Arg Ala Met Ala Val Glu Leu Ala 165 170 175 Ala Arg Asn Val Leu Val Asn Ala Val Ala Pro Gly Val Ile Met Thr 180 185 190 Asp Met Ser Glu Gln Ile Arg Asp Met Gly Asp Glu Glu Ile Lys Ala 195 200 205 Arg Leu Leu Leu Lys Arg Tyr Ala Gln Pro Arg Glu Val Ala Asp Leu 210 215 220 Val Leu His Leu Ala Ser Pro Ala Asn Gln Tyr Met Thr Gly Glu Val 225 230 235 240 Leu His Leu Asn Gly Gly Leu Lys Met Ala 245 250 <210> 11 <211> 258 <212> PRT <213> metagenome <400> 11 Met Thr Met Met Leu Asp Thr Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Ala Gly 1 5 10 15 Asn Gly Ile Gly Ala Ala Ala Ala Arg Leu Leu Cys Glu Arg Lys Ile 20 25 30 His Thr Leu Ile Leu Leu Asp Leu Ser Thr Ala Ala Ile Asp Thr Leu 35 40 45 Ala Thr Glu Leu Gln Gly Ser Gly Thr Arg Val Leu Cys Cys Ser Ala 50 55 60 Asp Ile Ser Asp Arg Ala Ala Leu Arg Ala Ala Leu Lys Pro Ile Val 65 70 75 80 Ala Arg Thr Gly Lys Ile Asp Ile Leu Val Asn Ser Ala Gly Ile Ala 85 90 95 Asp Glu Asn Glu Pro Glu Gln Glu Asp Ile Trp Arg Arg Val Leu Asp 100 105 110 Val Asn Val His Gly Thr Tyr Phe Val Thr Leu Glu Ala Leu Asp Ala 115 120 125 Met Pro Asp Gly Gly Arg Ile Val Asn Val Ala Ser Ile Leu Gly Arg 130 135 140 Ala Gly Asn Val Arg Asn Thr Ala Tyr Cys Thr Ser Lys His Ala Met 145 150 155 160 Leu Gly Phe Thr Lys Ser Leu Ala Leu Asp Val Ala Ser Arg Lys Ile 165 170 175 Thr Val Asn Ala Val Leu Pro Ala Trp Val Asp Thr Pro Met Leu Arg 180 185 190 Arg Glu Met Gly Leu Gln Ala Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Asp Gln 195 200 205 Met Leu Arg Asn Ala Arg Lys Lys Ile Pro Leu Arg Ser Leu Val Gln 210 215 220 Ser Gly Glu Val Ala Ala Met Ile Gly Tyr Leu Val Ser Asp Ala Ala 225 230 235 240 Ser Ser Val Thr Ala Gln Ser Phe Thr Ile Asp Gly Gly Phe Thr Cys 245 250 255 Gly Val

Claims (8)

1. 메타게놈으로부터 얻은 서열번호 1의 항생활성 유전자 집단.
2. 제1항에 있어서,

   상기 유전자 집단은 orf20 내지 orf39로 구성되며 orf29 내지 orf36이 항생활성의 발현에 직접적으로 관련되는 것을 특징으로 하는 유전자 집단.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 항생활성의 발현에 직접적으로 관련되는 IclR response regulator 단백질.
7. 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 항생활성의 발현에 직접적으로 관련되는 LysR family response regulator 단백질.
8. 제1항의 유전자 집단에 의해 형질전환되어 항생물질을 생산 가능한 대장균.

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