BR112015003086B1 - Sequência de polinucleotídeo recombinante, vetor de expressão recombinante e célula hospedeira procariótica geneticamente engenheirada - Google Patents

Abstract

ENZIMAS DE DEGRADAÇÃO DE PECTINA DE MACROPHOMINA PHASEOLINA E USOS DAS MESMAS. A presente invenção revela enzimas codificando polinucleotídeo isolado, derivadas do fungo Macrophomina phaseolína ("M. phaseolina"), responsáveis por degradação de pectina e elas compreendem e/ou consistem em sequências de nucleotídeos estabelecidas em SEQ ID Nos. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 e 61, ou o complemento de tais sequências. A presente invenção também se refere a polipeptídeo isolado codificado pelas sequências de polinucleotídeos estabelecidas em SEQ ID Nos, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 e 63; um constructo de gene recombinante que compreende o polinucleotídeo; um transformante e um fungo transgênico compreendendo o constructo de gene recombinante com ou tendo produção intensificada de enzima de degradação de pectina. O polipeptídeo da invenção pode ser utilizado para, entre outras coisas, suco de fruta manufaturado, produtos têxteis, polpa e celulose, café, chá e extração de óleo e tratamento de água residual péctica.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

[1] Este pedido reivindica o benefício de prioridade de Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos Número de Série 61/683914, depositado em 16 de agosto de 2012; cujo conteúdo é aqui incorporado como referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[2] A presente invenção refere-se aos polipeptídeos isolados de M. phaseolina tendo atividade de pectato liase e polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos e métodos para preparar e usar estes polinucleotídeos e polipeptídeos. A invenção também se refere a constructos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos bem como os métodos para produzir e usar os polipeptídeos. Os polipeptídeos da invenção podem ser usados, entre outras coisas, na indústria têxtil para a maceração e degomagem de fibras e tecidos; na indústria alimentícia para a extração de sucos de frutas e vegetais; na indústria de papel para a produção de papel de boa qualidade; e também para a fermentação de café e chá, extração de óleo e tratamento de água de resíduos pécticos.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

[3] A pectina é um grupo de heteropolímeros complexos, presentes na lamela média da parede principal da célula vegetal e atua como cimento intercelular. Também têm uma função importante na regulação de água das plantas devido à sua natureza coloidal. As lamelas médias que se situam entre as paredes celulares são principalmente construídas de protopectina (uma forma insolúvel de pectina).

[4] A pectina é composta de duas diferentes regiões definitivas: regiões “lisa” e “em cabeleira”. A região “lisa” consiste em uma estrutura de ácido D-galacturônico α-1, 4-ligado, formando um ácido poligalacturônico com alguns dos grupos carboxil esterificados com metanol (Rouse A. Pectin: distribution, significance. In: Nagy S, Shaw P, Veldhuis Meds. Citrus Science and Technology, Vol I. Westport CT: AVI publishing Inc. 1977). Na região “em cabeleira”, a estrutura de ácido galacturônico é quebrada pela unidade de L-ramnose α-1,2- ligada.

[5] Pectina/pectato liases despolimerizam pectina na região lisa, que cliva ligações glicosídicas através de β- eliminação para produzir oligômeros que são extremidades não redutoras 4, 5-insaturadas (Lombard V, Bernard T, Rancurel C, Brumer H, Coutinho PM, Henrissat B. A hierarchical classification of polysaccharide liases for glycogenomics. Biochem J. 2 010; 432(3) :437-444) . Enquanto rhamnogalacturonase cliva dentro das regiões em cabeleira da pectina (Jensen MH, Otten H, Christensen U, Borchert TV, Christensen LL, Larsen S, Leggio LL. Structural and biochemical studies elucidate the mechanism of rhamnogalacturonan liase from Aspergillus aculeatus. J Mol Biol. 2010;404(1):100-111).

[6] Pectinesterase hidroliza a pectina em metanol e ácido poligalacturônico. Esta enzima pode ser produzida por vários fungos, incluindo Aspergillus sp, Botrytis cinerea, Fusarium monilforme, Rhizopus stolonifer, Trichoderma sp. etc. (Polizeli ML, Jorge JA, Terenzi HF. Pectinase production by Neurospora crassa: purification and biochemical characterization of extracellular polygalacturonase activity, J. Gen. Microbiol. 1991;137: 1815-1823). Mas Aspergillus é a principal fonte para a produção comercial de pectinesterase (Torres EF, Aguilar C, Esquivel JCC, Gonzales GV. Pectinase. In: Enzyme Technology, Pandey, A., Webb, C., Soccol, C.R., Larroche, C (Eds), Asiatech Publishiers Inc., New Delhi, India, 2005. pp. 273-296).

[7] Enzimas de degradação de pectina são ferramentas importantes na indústria de alimentos, principalmente para processamento de frutas e vegetais como a produção de suco de fruta ou vinificação. Outras áreas de aplicações incluem a indústria de celulose e papel (Reid I, Ricard M. Pectinase in papermaking: solving retention problems in mechanical pulps bleached with hydrogen peroxide. Enz. Microbiol. Technol. 2000;26:115-123), ração animal (Barreto de Menezes TJ, Salva JG, Baldini VL, Papini RS, Sales AM. Protein enrichment of citrus wastes by solid substrate fermentation. Proc. Biochem. 1989;23:167-171), maceração de linho e outras fibras vegetais (Hoondal GS, Tiwari RP, Tiwari R, Dahiya N, Beg QK. Microbial alkaline pectinases and their applications: a review. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000;9:409-418), fermentação de café e chá (Gar JG. Tea, coffee and cocoa. In: wood BJB, editor. Microbiology of fermented foods. 1985;vol 2. London: Elsevier Sci. Ltd. pp:133-154), extração de óleo (Scott D. Enzymes, industrial. In: Encyclopedia of Chemical Technology. Grayson M, Ekarth D and Othmer K (eds), 1978; Wiley, NY. pp: 173-224), biolimpeza de fibras de algodão (Singh R, Saxena S, Gupta R. Microbial pectinolytic enzymes: A review. Proc. Biochem. 2005;40:2931-2944), degomagem de fibras liberianas de plantas (Kapoor M, Beg QK, Bhushan B, Singh K, Dadich KS, Hoondal GS. Application of alkaline and thermostable polygalacturonase from Bacillus sp. MGcp-2 in degumming of ramie (Boehmeria nivea) and sunn hemp (Crotolaria juncia) bast fibers. Proc. Biochem. 2001;36:803-817), indústria têxtil (Karmakar SR. Chemical technology in the pretreatment processes of textiles. In: Textile science and technology series1st ed., Amsterdam: Elsevier Science B.V. 1999; p. 12) e gestão de resíduos (Kashyap DR, Vohra PK, Chopra S, Tewari R. Applications of pectinases in the commercial sector: a review. Biores. Technol. 2001;77:215-227). WO 98/45393 divulga composições detergentes contendo protopectinase com detergência notável contra sujeira barrenta.

[8] Estas enzimas são usadas individualmente ou em uma forma de coquetel (misturado) na indústria. Por exemplo, na indústria alimentícia, é usado como enzima individual como pectinesterase necessária para gelificação, bem como a combinação de diferentes enzimas como pectinesterase com poligalacturonase exigida para liquefação de material vegetal (Heldt-Hansen HP, Kofod LV, Budolfsen G, Nielsen PM, Huttel S, Bladt T. Application of tailor made pectinases. In: Visser J and Voragen AJG (eds), Pectin and Peactnases. Progress in Biotechnology. 1996;14:463-474).

[9] A clonagem e expressão de várias destas enzimas obtidas de Aspergillus niger foram relatadas. EP 0 278 355 descreve a clonagem do gene de pectina liase, a sequência da mesma e a expressão. EP 0 353 188 adiciona algumas outras pectina liases. EO 0 421 919 divulga duas poligalacturonases e outra endo-poligalacturonase é divulgada em EP 0 388 593. Ambos estes pedidos de patente usaram Aspergillus niger como a fonte do gene. WO 94/14952 descreve três enzimas com atividade endo- poligalacturonase que são obteníveis de Aspergillus aculeatus. No entanto, nenhuma publicação foi relatada sobre a clonagem de genes que codificam enzimas de degradação de pectina de M. phaseolina.

[10] A presente invenção toma uma abordagem de genômica para divulgar os genes e suas proteínas codificadas das enzimas de degradação de pectina derivadas de M. phaseolina que podem ser usadas, entre outras coisas, em processos ou para fins industriais.SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[11] Entre outras coisas, a presente invenção refere-se a pelo menos vinte e uma enzimas de degradação de pectina que são deriváveis de M. phaseolina. A invenção atual também se relaciona com o uso do fungo M. phaseolina na degradação de pectina.

[12] O principal objeto da presente invenção é divulgar os conjuntos de sequências de nucleotídeo codificam pectato liase (SEQ ID NOs. 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20,22, 23, 25 e 26), Pectato liase C (SEQ ID No. 28, 29, 31, 32,34, 35, 37, 38, 40, 41, 43 e 44), pectinesterase (SEQ ID No. 46,47, 49, 50, 52, 53, 55 e 56) e rhamnogalacturonase (SEQ ID NOs.58, 59, 61 e 62) do fungo M. phaseolina. Para cada gene da invenção, uma sequência estrutura de leitura aberta (ORF) foi derivada manualmente da sequência genômica respectiva deletando sequências de íntron previstas e processando sequências de éxon juntas. Vetores, vetores de expressão, e células hospedeiras compreendendo os genes da enzima também estão incluídos.

[13] Além disso, a invenção proporciona sequências de polipeptídeo deduzidas das sequências ORF dos genes. As sequências de polipeptídeo da invenção correspondem às de pectato liase (SEQ ID NOs. 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 e 27),Pectate liase C (SEQ ID NOs. 30, 33, 36, 39, 42 e 45), pectinesterase (SEQ ID NOs. 48, 51, 54 e 57) e rhamnogalacturonase (SEQ ID NOs. 60 e 63). A presente invenção refere-se também a um polinucleotídeo isolado compreendendo o complemento das sequências de nucleotídeos descritas acima.

[14] Outro objeto da presente invenção é proporcionar a biologia molecular e a informação genética dos genes e enzimas estabelecidas no objeto principal a ser explorado/utilizado para a regulação e a conversão da degradação de pectina para a produção de produtos industriais valiosos.

[15] Além disso, o objeto da presente invenção é facilitar a produção in vitro do polipeptídeo de degradação de pectina, a presente invenção também inclui um constructo de expressão capaz de expressar o polipeptídeo contendo pelo menos 70% de aminoácidos sequenciais conforme estabelecido em SEQ ID NOs. 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 e 63. Preferencialmente, o constructo de expressão inseriu DNA ou cDNA com nucleotídeo sequencial como estabelecido em SEQ ID NOs. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 e 61.

[16] Outro objeto da presente invenção divulga um constructo de gene recombinante compreendendo um gabarito de polinucleotídeo tendo sequência de nucleotídeo estabelecida em SEQ ID NOs. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 e 61, em que o gabarito de polinucleotídeo é expressável em uma célula hospedeira para produzir uma enzima que degrada pectina. Preferencialmente, o constructo de gene recombinante ainda compreende uma região promotora operacionalmente ligada para potencializar a expressão do molde de polinucleotídeo.

[17] Uma das modalidades preferenciais da presente invenção é a cepa ms6 do fungo M. phaseolina isolado da planta juta infectada. O polipeptídeo isolado também é preferencialmente derivado desta cepa.

[18] Além disso, o objeto da presente invenção é proporcionar uma maneira potencial comercialmente viável para isolar a enzima de degradação de pectina de M. phaseolina para continuar com a crescente demanda global por, entre outras coisas, produção de suco de fruta, produtos têxteis, celulose e papel, café, chá e extração de óleo.

[19] Outro objeto da invenção é direcionado para utilizar a substâncias de degradação de pectina no processamento de rações para animais, sucos de fruta, produtos têxteis, papel e celulose, café, chá e extração de óleo, maceração/desengomagem de fibras liberianas.

[20] Qualquer uma ou todas essas utilidades são capazes de ser desenvolvidas em um kit para comercialização como produtos de pesquisa ou como suprimentos para usos industriais e outros. Os kits podem compreender polinucleotídeos e/ou polipeptídeos correspondentes a um ou mais genes de M. phaseolina da invenção, anticorpos, e/ou outros reagentes.

[21] Um especialista na técnica irá prontamente apreciar que a presente invenção está bem adaptada para realizar os objetos e obter as finalidades e vantagens mencionadas, bem como aquelas inerentes a mesma. As modalidades aqui descritas não se destinam a serem limitações ou restrições do escopo da invenção.

[22] Estas e outras características, aspectos e vantagens da presente invenção irão se tornar mais bem compreendidas tendo como referência a seguinte descrição e reivindicações.

[23] BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[24] As figuras em anexo, que são incorporadas em e constituem uma parte deste relatório descritivo, ilustram as modalidades da presente invenção, e, juntamente com a descrição, servem para explicar os princípios da invenção.

[25] Figura 1 é a imagem de gel de agarose de eletroforese mostrando o resultado da amplificação por PCR em que a linha 1 é de polinucleotídeos de pectato liase de SEQ ID NO. 1 e a linha M é a escada de peso molecular de DNA.

[26] Figura 2 é a imagem de gel de agarose de eletroforese mostrando o resultado da amplificação por PCR em que a linha 1 é de polinucleotídeos de pectato liase de SEQ ID NO. 4 e a linha M é a escada de peso molecular de DNA.

[27] Figura 3 é a imagem de gel de agarose de eletroforese mostrando o resultado da amplificação por PCR em que a linha 1 é de polinucleotídeos de pectato liase de SEQ ID NO. 7 e a linha M é a escada de peso molecular de DNA.

[28] Figura 4 é a imagem de gel de agarose de eletroforese mostrando o resultado da amplificação por PCR em que a linha 1 é de polinucleotídeos de pectato liase de SEQ ID NO. 10 e a linha M é a escada de peso molecular de DNA.

[29] Figura 5 é a imagem de gel de agarose de eletroforese mostrando o resultado da amplificação por PCR em que a linha 1 é de polinucleotídeos de pectato liase de SEQ ID NO. 13 e a linha M é a escada de peso molecular de DNA.

[30] Figura 6 é a imagem de gel de agarose de eletroforese mostrando o resultado da amplificação por PCR em que a linha 1 é de polinucleotídeos de pectato liase de SEQ ID NO. 16 e a linha M é a escada de peso molecular de DNA.

[31] Figura 7 é a imagem de gel de agarose de eletroforese mostrando o resultado da amplificação por PCR em que a linha 1 é de polinucleotídeos de pectato liase de SEQ ID NO. 19 e a linha M é a escada de peso molecular de DNA.

[32] Figura 8 é a imagem de gel de agarose de eletroforese mostrando o resultado da amplificação por PCR em que a linha 1 é de polinucleotídeos de pectato liase de SEQ ID NO. 22 e a linha M é a escada de peso molecular de DNA.

[33] Figura 9 é a imagem de gel de agarose de eletroforese mostrando o resultado da amplificação por PCR em que a linha 1 é de polinucleotídeos de pectato liase C de SEQ ID NO. 28 e a linha M é a escada de peso molecular de DNA.

[34] Figura 10 é a imagem de gel de agarose de eletroforese mostrando o resultado da amplificação por PCR em que a linha 1 é de polinucleotídeos de pectato liase C de SEQ ID NO. 31 e a linha M é a escada de peso molecular de DNA.

[35] Figura 11 é a imagem de gel de agarose de eletroforese mostrando o resultado da amplificação por PCR em que a linha 1 é de polinucleotídeos de pectato liase C de SEQ ID NO. 34 e a linha M é a escada de peso molecular de DNA.

[36] Figura 12 é a imagem de gel de agarose de eletroforese mostrando o resultado da amplificação por PCR em que a linha 1 é de polinucleotídeos de pectato liase C de SEQ ID NO. 37 e a linha M é a escada de peso molecular de DNA.

[37] Figura 13 é a imagem de gel de agarose de eletroforese mostrando o resultado da amplificação por PCR em que a linha 1 é de polinucleotídeos de pectato liase C de SEQ ID NO. 40 e a linha M é a escada de peso molecular de DNA.

[38] Figura 14 é a imagem de gel de agarose de eletroforese mostrando o resultado da amplificação por PCR em que a linha 1 é de polinucleotídeos de pectato liase C de SEQ ID NO. 43 e a linha M é a escada de peso molecular de DNA.

[39] Figura 15 é a imagem de gel de agarose de eletroforese mostrando o resultado da amplificação por PCR em que a linha 1 é de polinucleotídeos de pectinesterase de SEQ ID NO. 46 e a linha M é a escada de peso molecular de DNA.

[40] Figura 16 é a imagem de gel de agarose de eletroforese mostrando o resultado da amplificação por PCR em que a linha 1 é de polinucleotídeos de pectinesterase de SEQ ID NO. 49 e a linha M é a escada de peso molecular de DNA.

[41] Figura 17 é a imagem de gel de agarose de eletroforese mostrando o resultado da amplificação por PCR em que a linha 1 é de polinucleotídeos de pectinesterase de SEQ ID NO. 55 e a linha M é a escada de peso molecular de DNA.

[42] Figura 18 é a imagem de gel de agarose de eletroforese mostrando o resultado da amplificação por PCR em que a linha 1 é de polinucleotídeos de rhamnogalacturonase de SEQ ID NO. 58 e a linha M é a escada de peso molecular de DNA.

[43] Figura 19 é a imagem de gel de agarose de eletroforese mostrando o resultado da amplificação por PCR em que a linha 1 é de polinucleotídeos de rhamnogalacturonase de SEQ ID NO. 61 e a linha M é a escada de peso molecular de DNA.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[44] As definições e/ou métodos proporcionados aqui definem a presente invenção e guiam os especialistas na técnica na prática da presente invenção. Salvo se indicado o contrário, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional pelos especialistas na técnica relevante. Na medida em que qualquer uma das definições e/ou métodos são encontrados como sendo inconsistentes com qualquer uma das definições e/ou métodos proporcionados em qualquer patente ou não patente incorporada aqui ou em qualquer referência encontrada em outro lugar, entende-se que a dita definição e/ou método que foi expressamente fornecido/adotado neste pedido será usado aqui. Os termos singulares “um” “uma,” “o” e “a” incluem referências no plural salvo se o contexto indicar claramente o contrário. Da mesma forma, a palavra “ou” destina-se a incluir “e” salvo se o contexto indicar claramente o contrário. Portanto, “compreendendo A ou B” significa incluindo A, ou B ou A e B. Deve ser ainda compreendido que todos os tamanhos de base ou tamanhos de aminoácido, e todos os valores de peso molecular ou massa molecular, dados por ácidos nucleicos ou polipeptídeos são aproximados, e são proporcionados para descrição. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, materiais e métodos ilustrativos são agora descritos.

[45] A presente invenção proporciona as sequências de nucleotídeos dos genes de M. phaseolina envolvidos na degradação de pectina. Os genes codificam proteínas com atividade de enzima de degradação de pectina que está em uso em uma indústria, incluindo alimentos, rações para animais, papel, extração de óleo, têxtil, águas residuais ou de interesse para uma indústria. Descritos aqui abaixo são os genes da invenção, suas identificações, caracterizações, modificações e métodos de uso em diversos processos industriais.

[46] As sequências de nucleotídeos de DNA genômico de M. phaseolina foram obtidas por um esforço de sequenciamento de DNA de shotgun aleatório de genoma inteiro. O DNA genômico foi preparado a partir de um isolado de M. phaseolina ms6 que foi isolado a partir da juta infectada (Corchorus spp.). As sequências de nucleotídeos geradas foram montadas para formar sequências contíguas e estruturas pelo montador Newbler. As sequências de nucleotídeos foram inicialmente anotadas por programas de software, tais como Augustus, Glimmer M (The Institute of Genome Research, Rockville, Md.) e Evidence Modeler (EVM), que pode identificar regiões de codificação putativas, íntrons e junções de processamento. Além disso, a realização da cura automatizada e manual das sequências de nucleotídeo foi realizada para refinar e estabelecer caracterização exata das regiões de codificação e outras características do gene.

[47] As sequências genômicas da invenção que codificam as enzimas de degradação de pectina são identificadas principalmente por comparação de sequências de nucleotídeos do DNA genômico de M. phaseolina e as sequências de nucleotídeo dos genes de enzima conhecida de outros micro-organismos. As sequências de nucleotídeo destes genes de M. phaseolina, os quadros de leitura, as posições dos éxons e íntrons, a estrutura das enzimas, e sua utilidade potencial em diversas indústrias, como os envolvidos na preparação de alimentos e rações, bebidas, têxteis e detergentes, não eram conhecidos.

[48] Mais de 14000 cDNAs de M. phaseolina foram parcialmente ou totalmente sequenciados. Entre esses, vinte e um cDNAs que codificam novas enzimas com funções putativas na degradação de pectina foram descobertos.

[49] Quadros de leitura abertos (ORFs) são analisados seguindo sequenciamento completo ou parcial de clones de bibliotecas de cDNA derivados de mRNA de M. phaseolina e são ainda analisados utilizando o software de análise de sequência e determinando a homologia de sequências conhecidas em bancos de dados (públicos/privados).

[50] No contexto da divulgação, um número de termos utilizados em toda a especificação têm o significado indicado, salvo se expressamente indicado para ter um significado diferente.

[51] O termo “gene”, como usado aqui, é definido como a sequência genômica dos fungos M. phaseolina, particularmente a sequência de polinucleotídeo que codifica polipeptídeo da série de enzimas. O termo pode incluir mais moléculas de ácido nucleico compreendendo sequências de nucleotídeos a montante, a jusante, e/ou íntron.

[52] O termo “estrutura de leitura aberta (ORF)” significa uma série de tripletos de nucleotídeos que codificam aminoácidos sem quaisquer códons de terminação e a sequência tripleto é traduzível em proteína usando as informações de uso de códon apropriadas para um organismo particular.

[53] Uma “sequência de codificação” ou “região de codificação” refere-se a uma molécula de ácido nucleico tendo informações de sequência necessárias para produzir um produto de gene, como um aminoácido ou polipeptídeo, quando a sequência é expressa. A sequência de codificação pode compreender sequências não traduzidas (por exemplo, os íntrons ou regiões não traduzidas 5’ e 3’) dentro de regiões traduzidas, ou pode não ter essas sequências não traduzidas intermediárias (por exemplo, como no cDNA).

[54] Como usado aqui, um “polinucleotídeo” é uma sequência de nucleotídeos como um fragmento de ácido nucleico. Um polinucleotídeo pode ser um polímero de RNA ou DNA que possui filamento simples ou duplo, que opcionalmente contém bases de nucleotídeos sintéticas, não naturais ou alteradas. Um polinucleotídeo sob a forma de um polímero de DNA pode ser composto de um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico, DNA sintético, ou misturas dos mesmos. Um polinucleotídeo isolado da presente invenção também pode ser derivado de SEQ ID NOs. 1, 4,7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43,46, 49, 52, 55, 58, 61, 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20,23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59 e 62, ou o complemento dessas sequências.

[55] “Isolado” significa alterado “pela mão do homem” do estado natural. Se uma composição ou substância ocorre na natureza, foi “isolada” se foi alterada ou removida do seu ambiente original, ou ambos. Por exemplo, um polinucleotídeo ou um polipeptídeo naturalmente presente em uma planta ou animal não é “isolado”, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo separado dos materiais coexistentes de seu estado natural é “isolado”, como o termo é empregado aqui.

[56] O termo “recombinante”, quando utilizado aqui para se referir a um polipeptídeo ou proteína, significa que um polipeptídeo ou proteína é derivado de sistemas de expressão recombinantes (por exemplo, microbianos ou de mamíferos). “Microbiano” se refere aos polipeptídeos ou proteínas recombinantes preparados em sistemas de expressão bacterianos ou fúngicos. Polipeptídeos ou proteínas expressos na maioria dos sistemas bacterianos, por exemplo, Escherichia coli, estarão livres de modificações de glicosilação; polipeptídeos ou proteínas expressos em fungos serão glicosilados.

[57] O “vetor” se refere a um plasmídeo, fago, cosmídeo, levedura ou vírus, ou uma sequência de replicação artificial (ARS) ou um cromossoma artificial para expressar um polipeptídeo de uma sequência de nucleotídeo. O termo “vetor” também se destina a referir-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual está ligado. Um tipo de vetor é um “plasmídeo,” que se refere a uma alça de DNA de filamento duplo circular no qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira em que são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos contendo uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamíferos epissomal). Outros vetores podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira através da introdução na célula hospedeira e, desse modo, são replicados junto com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão operacionalmente ligados. Esses vetores são referidos aqui como “vetores de expressão recombinante” (ou simplesmente, “vetores de expressão”). Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente sob a forma de plasmídeos. Na presente especificação, “plasmídeo” e “vetor” podem ser usados de modo intercambiável uma vez que o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada. No entanto, a invenção se destina a incluir outras formas de vetores de expressão, como vetores virais (por exemplo, retrovírus de replicação defeituosa, adenovírus e vírus adeno-associado), que servem de funções equivalentes.

[58] O termo “vetor de expressão” é definido aqui como uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da invenção, que está operacionalmente ligado aos nucleotídeos adicionais que fornecem para sua expressão.

[59] O termo “constructo de expressão” pode compreender uma montagem de elementos genéticos tendo um papel regulador na expressão gênica, por exemplo, promotores ou potencializadores, ou uma sequência codificadora que é transcrita em RNA, mRNA e traduzida em proteína, e que está operacionalmente ligada ao promotor ou sequências de início e término de transcrição apropriadas.

[60] O termo “operacionalmente ligado” aqui denota uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificadora da sequência de polinucleotídeo de forma que a sequência de controle direciona a expressão da sequência codificadora de um polipeptídeo.

[61] O termo “célula hospedeira”, como usado aqui, inclui qualquer tipo de célula que é suscetível à transformação, transfecção, transdução e afins com um constructo de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção.

[62] O termo “células hospedeiras recombinantes” geralmente significa células cultivadas que compreendem uma unidade transcricional recombinante, e expressará polipeptídeos ou proteínas heterólogas e RNA codificado pelo segmento de DNA ou gene sintético na unidade transcricional recombinante. As células podem ser procarióticas ou eucarióticas.

[63] “Polipeptídeo” como usado aqui é uma cadeia linear única de aminoácidos ligados por ligações peptídicas e tendo uma sequência maior que 100 aminoácidos de comprimento.

[64] O termo “promotor” como usado aqui, se refere a uma sequência de ácido nucleico que funciona para direcionar a transcrição de um gene a jusante. O promotor será geralmente apropriado para a célula hospedeira em que o gene alvo está sendo expresso. O promotor juntamente com outras sequências de ácidos nucleicos reguladoras de transcrição e tradução (também denominadas de “sequências de controle”) é necessário para expressar um determinado gene. Em geral, as sequências reguladoras de transcrição e tradução incluem, mas não são limitadas a, sequências promotoras, sítios de ligação ribossomal, sequências de início e parada da transcrição, sequências de início e parada da tradução e sequências potencializadoras ou ativadoras.

[65] O termo “in vitro” como usado aqui, se refere a uma reação biológica que ocorre em um ambiente artificial fora de um organismo vivo, que normalmente é realizada em um laboratório usando componentes de um organismo que foi isolado de seu contexto habitual biológico a fim de permitir que uma análise mais detalhada ou mais conveniente seja executada.

[66] O termo “% de homologia” é usado de modo intercambiável aqui com o termo “% de identidade” aqui e normalmente se refere ao nível de identidade de sequência de ácido nucleico ou aminoácido entre a sequência de ácido nucleico que codifica qualquer um de polipeptídeos inventivos ou sequência de aminoácido do polipeptídeo inventivo, quando alinhado usando um programa de alinhamento de sequência.

[67] Por exemplo, como usado aqui, 80% de homologia significa o mesmo que 80% de identidade de sequência determinada por um algoritmo definido, e, consequentemente um homólogo de uma determinada sequência tem mais de 80% de identidade de sequência ao longo de um comprimento da determinada sequência. Níveis exemplares da identidade de sequência incluem, mas não estão limitados a, 80, 85, 90, 95, 98% ou mais identidade de sequência para uma determinada sequência, por exemplo, a sequência de codificação para qualquer um dos polipeptídeos inventivos, conforme descrito aqui.

[68] Programas de computador exemplares que podem ser usados para determinar a identidade entre duas sequências incluem, mas não estão limitados a, o conjunto de programas BLAST, por exemplo, BLASTN, BLASTX, e TBLASTX, BLASTP e TBLASTN, acessível ao público em www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.

[69] Pesquisas de sequência são normalmente realizadas utilizando o programa BLASTN ao avaliar uma determinada sequência determinada de ácido nucleico em relação a sequências de ácidos nucleicos em Sequências de DNA do GenBank e outros bancos de dados públicos. O programa BLASTX é preferencial para a busca de sequências de ácidos nucleicos que foram traduzidas em todos os quadros de leitura contra sequências de aminoácidos em Sequências de Proteínas do GenBank e outros bancos de dados públicos.

[70] Um alinhamento preferencial de sequências selecionadas a fim de determinar a “% de identidade” entre duas ou mais sequências é realizado usando, por exemplo, o programa CLUSTAL- W.

[71] O termo “iniciador” como usado aqui é um oligonucleotídeo capaz de se ligar a uma sequência de ácido nucleico alvo e iniciar a síntese do ácido nucleico. Um oligonucleotídeo de amplificação como definido aqui terá preferencialmente de 10 a 50, mais preferencialmente de 15 a 25 nucleotídeos de comprimento. Os oligonucleotídeos de amplificação da presente invenção podem ser sintetizados quimicamente.

[72] A abreviação usada em toda a especificação para se referir aos ácidos nucleicos compreendendo sequências de nucleotídeos são as abreviaturas convencionais de uma letra. Assim, quando incluída em um ácido nucleico, os nucleotídeos de codificação de ocorrência natural são abreviados da seguinte maneira: adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T) e uracila (U). Também, salvo se especificado o contrário, as sequências de ácido nucleico apresentadas aqui são na direção 5 ' ^ 3'.

[73] Como usado aqui, o termo “complementar” e derivados do mesmo são usados em referência ao pareamento de ácidos nucleicos pelas regras bem conhecidas que A pareia com T ou U e C pareia com G. Complemento pode ser “parcial” ou “completo”. Em complemento parcial, apenas algumas das bases de ácidos nucleicos são combinadas de acordo com as regras de emparelhamento de base; enquanto em complemento completo ou total, todas as bases são combinadas de acordo com a regra de pareamento. O grau de complemento entre os filamentos de ácido nucleico pode ter efeitos significativos sobre a eficiência e a força da hibridização entre filamentos de ácido nucleico bem conhecidos na técnica. Isto pode ser particular no método de detecção que depende da ligação entre os ácidos nucleicos.

[74] As sequências de DNA da invenção foram geradas por reações de sequenciamento e podem conter pequenos erros que podem existir como nucleotídeos erroneamente identificados, inserções e deleções. No entanto, esses pequenos erros, se presentes, não devem incomodar a identificação das sequências como um gene de M. phaseolina que codifica uma enzima de interesse industrial e são especificamente incluídos no escopo da invenção.

[75] São incluídos na presente invenção sequências nucleotídicas genômicas e sequências de codificação de genes que codificam enzimas de M. phaseolina de interesse industrial. Nesse sentido, em uma modalidade, SEQ ID NOs. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59 e 62, e/ou quaisquer misturas/combinações das mesmas, são proporcionadas em que cada uma identifica uma sequência de nucleotídeo do estrutura de leitura aberta (ORF) de um gene identificado. Em outra modalidade, as sequências genômicas dos genes identificados por SEQ ID NOs. 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 e 61, e/ou quaisquer misturas/combinações das mesmas, são proporcionadas.

[76] Como usado aqui, “gene” se refere a (i) um gene compreendendo e/ou que consiste em pelo menos um de sequências de nucleotídeo e/ou fragmentos dos mesmos que são estabelecidos em SEQ ID NOs. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 e 61; (ii) qualquer sequência de nucleotídeo ou fragmento da mesma que codifica a sequência de aminoácido estabelecida em SEQ ID NOs. 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 e 63; (iii) qualquer sequência de nucleotídeo que hibridiza com o complemento das sequências de nucleotídeo estabelecidas em SEQ ID NOs. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44,47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31,34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 e 61 sob condições de rigor médio, por exemplo, hibridização com DNA ligado ao filtro uma quantidade apropriada/eficaz de 6x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a um nível apropriado/eficaz de temperatura como 45°C (aproximadamente) seguido por uma ou mais lavagens em uma quantidade apropriada/eficaz de SDS, como 0,2x SSC/0,1% SDS, em um nível apropriado/eficaz de temperatura como 50 a 65°C (aproximadamente), ou sob condições de rigor alto, por exemplo, hibridização com ácido nucleico ligado ao filtro em uma quantidade apropriada/eficaz de SSC, como 6x SSC, em um nível apropriado/eficaz de temperatura como 45°C (aproximadamente), seguido por uma ou mais lavagens em uma quantidade apropriado/eficaz de SDS, como, 0,1x SSC /0,2% SDS, em um nível apropriado/eficaz de temperatura como, 68°C (aproximadamente), ou sob outras condições de hibridização que são evidentes para os especialistas na técnica (ver, por exemplo, Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K. Current Protocols in Molecular Biology, 1994; Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York). Preferencialmente, os polinucleotídeos que hibridizam para os complementos das sequências de DNA divulgadas aqui codificam produtos de gene, por exemplo, os produtos de genes que são funcionalmente equivalentes a um produto de gene codificado por um dos genes da enzima ou fragmentos do mesmo.

[77] Conforme descrito acima, sequências de gene incluem não somente sequências de nucleotídeo degeneradas que codificam as sequências de aminoácido de 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 e 63, mas também sequências de nucleotídeo degeneradas que quando traduzidas em organismos diferentes de M. phaseolina, geraria um polipeptídeo compreendendo uma das sequências de aminoácidos 3 SEQ ID NOs. 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 e 63 ou um fragmento das mesmas. Uma especialista na técnica saberia selecionar os códons apropriados ou modificar as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOs. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 e 61, quando usando as sequências de gene em M. phaseolina ou em outros organismos. Por exemplo, em Candida albicans, o códon CTG codifica um resíduo de serina em vez de resíduo de leucina.

[78] As sequências de nucleotídeo da invenção podem ser usadas como marcadores genéticos e/ou marcadores de sequência para auxiliar no desenvolvimento de um mapa genético, físico ou de sequência do genoma de M. phaseolina. As sequências de nucleotídeo e produtos de genes correspondente da invenção também podem ser usados para detectar a presença de M. phaseolina. Hibridação e métodos baseados em anticorpos conhecidos na técnica podem ser usados para determinar a presença e a concentração das sequências de nucleotídeos e produtos de genes correspondente da invenção.

[79] As sequências de nucleotídeos também podem ser usadas para identificar inibidores de enzimas que podem ter efeitos terapêuticos, dado o fato de que as enzimas podem desempenhar um papel na invasão de um hospedeiro durante uma infecção.

[80] Em outra modalidade, além das sequências de nucleotídeo de M. phaseolina descritas acima, homólogos ou ortólogos dos genes da invenção, como podem estar presentes em M. phaseolina e outras espécies de fungos, também estão incluídos. Particularmente preferenciais são homólogos ou ortólogos em fungos filamentosos. Estes genes de enzima podem ser identificados e isolados por meio de técnicas biológicas moleculares conhecidas.

[81] O termo “Fungos” como usado aqui inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota (Hawksworth DL, Kirk PM, Sutton BC, Pegler DN. Ainsworth and Bisby’s Dictionary of Fungi (8th Ed.). 1995; CAB International, Wallingford, United Kingdom. 616 p) e levedura. Grupos representativos de Ascomycota incluem, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Aspergillus. Grupos representativos de Basidiomycota incluem cogumelos, ferrugens e ferrugens dos cereais. Grupos representativos de Chytridiomycota incluem Allomyces, Blastocladiella, Coelomomyces. Grupos representativos de Zygomycota incluem, por exemplo, Rhizopus e Mucor.

[82] O termo “fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas de fungos. Os fungos filamentosos são caracterizados por um micélio vegetativo composto de quitina, celulose, glicano, quitosana, manana e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é pelo alongamento das hifas e catabolismo de carbono é aeróbio obrigatório.

[83] Por conseguinte, a presente invenção também proporciona sequências de nucleotídeo fúngicas que são hibridizáveis para os polinucleotídeos dos genes. Em uma modalidade, a presente invenção inclui um ácido nucleico isolado compreendendo e/ou consistindo em uma sequência de nucleotídeo que é pelo menos 50% idêntica à sequência de nucleotídeo selecionada do grupo compreendendo e/ou consistindo em: SEQ ID NOs. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 e 61, e/ou quaisquer misturas/combinações da mesma.

[84] Em outra modalidade, a presente invenção inclui um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência de nucleotídeo fúngica que hibridiza sob condições de rigor médio para um segundo ácido nucleico que consiste em e/ou compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo compreendendo e/ou consistindo em SEQ ID No. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 e 61, e/ou quaisquer misturas/combinações da mesma.

[85] Ainda em outra modalidade, a presente invenção inclui um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência de nucleotídeo fúngica que codifica um polipeptídeo de sequência de aminoácido que é pelo menos 50% idêntica à sequência de aminoácido selecionada do grupo compreendendo e/ou consistindo em SEQ ID NOs. 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 e 63.

[86] As sequências de nucleotídeo da invenção ainda incluem sequências de nucleotídeo fúngicas que são pelo menos 40% idênticas às sequências de nucleotídeo estabelecidas em SEQ ID NOs. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 e 61.

[87] Para isolar os genes homólogos, a sequência do gene de M. phaseolina descrita acima pode ser marcada e usada para triar uma biblioteca de cDNA construída a partir de mRNA obtidos do organismo de interesse, incluindo, mas não limitado a, M. phaseolina. Nesse sentido, sondas de ácido nucleico, preferencialmente marcado de forma detectável, consistindo de qualquer uma das sequências de nucleotídeo de SEQ ID No. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 e 61 são incluídos. Condições dehibridização podem ser preferencialmente de um rigor menor quando a biblioteca de cDNA foi derivada de um organismo diferente do tipo de organismo do qual se derivou a sequência marcada. A triagem de cDNA também pode identificar clones derivados de transcrições alternativamente recombinantes na mesma espécie. Alternativamente, a sonda marcada pode ser usada para triar uma biblioteca genômica derivada do organismo de interesse, mais uma vez, usando apropriadamente condições rigorosas. Condições de baixo rigor serão bem conhecidas pelos especialistas na técnica, e variam de forma previsível dependendo dos organismos específicos dos quais a biblioteca e as sequências marcadas derivam. (Detalhes em Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third edition, 2001, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; and Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K. Current Protocols in Molecular Biology,1994;Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York).

[88] Além disso, uma sequência de gene homólogo pode ser isolada através da realização de uma reação em cadeia da polimerase (PCR) usando dois combinados de iniciadores de oligonucleotídeo degenerado projetadas com base em sequências de aminoácido dentro do gene de interesse. O molde para a reação pode ser cDNA obtido pela transcrição reversa do mRNA preparado a partir do organismo de interesse. O produto de PCR pode ser subclonado e sequenciado para garantir que as sequências amplificadas representam as sequências de uma sequência de gene homólogo da enzima.

[89] O fragmento de PCR então pode ser usado para isolar um clone de cDNA de comprimento completo por uma variedade de métodos conhecidos pelos especialistas na técnica. Alternativamente, o fragmento marcado pode ser usado para triar uma biblioteca genômica.

[90] Em outra modalidade da invenção, as sequências de genes de M. phaseolina podem ser usadas no desenvolvimento de enzimas modificadas ou novas que apresentam características químicas e/ou físicas particularmente desejáveis. Por causa do parentesco/semelhança aparente das sequências de aminoácido entre as enzimas de M. phaseolina e outros fungos filamentosos, a estrutura de uma enzima de outro fungo pode ser usada para prever a estrutura da enzima de M. phaseolina, e auxiliar na modificação racional da enzima de M. phaseolina para propriedades úteis e superiores. As sequências proporcionadas pela presente invenção também podem ser usadas como matérias- primas para a modificação racional ou projeto de enzimas novas com características que permitem que as enzimas tenham um melhor desempenho em processos exigentes.

[91] As sequências de nucleotídeos de gene podem ser alteradas por técnicas de mutagênese aleatória e sítio-dirigida ou técnicas de evolução molecular dirigidas, como, mas não limitado aos, métodos descritos em (Arnold FH. Protein engineering for unusal environments. Curr. Opinion Biotechnol. 1993;4:450-455), mutagênese dirigida de oligonucleotídeo (Reidhaar-Olson JF, Sauer RT. Combinatorial cassette mutagenesis as a probe of the informational content of protein sequences. Science, 1988; 241:53-57), mutagênese química (Eckert KA, Drinkwater NR. recA-dependent and recA-independent N-ethyl-N- nitrosourea mutagenesis at a plasmid-encoded herpes simplex virus thymidine kinase gene in E. coli. Mutat Res. 1987;178:1- 10), mutagênese sítio-dirigida (Kunkel TA. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985;82:488-492; Oliphant A, Nussbaum AL, Struhl K. Cloning of random-sequence oligodeoxynucleotides. Gene 1986;44 177-183), PCR propenso ao erro (Cadwell RC, Joyce GF. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods Appl. 1992;2:28-33), mutagênese de cassete (Stauss Hj, Davies H,Sadovnikova E, Chain B, Horowitz N, Sinclair C. Induction of cytotoxic T lymphocytes with peptides in vitro: identification of candidate T-cell epitopes in human papilloma virus. PNAS 1992; 89(17): 7871-7875) Métodos de embaralhamento de DNA são descritos em Stemmer WP. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution. PNAS 1994;91(22):10747-10751 e em Patentes US 5.605.793; 6.117.679; e 6.132.970 e os métodos descritos em Patentes US 5.939.250, 5.965.408, 6.171.820. As mutações na sequência de nucleotídeo podem ser determinadas pelo sequenciamento do gene nos clones.

[92] Em uma modalidade, o polinucleotídeo de 747 bp de comprimento ilustrado em SEQ ID No. 2 é o clone de cDNA de comprimento completo que codifica a proteína pectato liase apresentando um estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de 248 aminoácidos, como em SEQ ID No. 3, com uma massa molecular calculada de cerca de 26 kD. A análise SMART de SEQ ID No. 2, revela a presença do domínio de pectato liase Pfam na sequência. Pectato liase é uma enzima extracelular que catalisa a clivagem eliminativa de pectato para produzir oligossacarídeos com grupos 4-deoxi-alfa-D-gluc-4-enuronosil em suas extremidades não redutoras. Esta enzima está envolvida na degradação da pectina.

[93] Preferencialmente, o polinucleotídeo de 735 bp de comprimento ilustrado em SEQ ID No. 5 é o clone de cDNA de comprimento completo que codifica a proteína pectato liase apresentando um estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de 244 aminoácidos, como em SEQ ID No. 6, com uma massa molecular calculada de cerca de 25 kD. A análise SMART de SEQ ID No. 5, revela a presença do domínio de pectato liase Pfam na sequência. Pectato liase é uma enzima extracelular que catalisa a clivagem eliminativa de pectato para produzir oligossacarídeos com grupos 4-deoxi-alfa-D-gluc-4-enuronosil em suas extremidades não redutoras. Esta enzima está envolvida na degradação da pectina.

[94] Da mesma forma, outro aspecto, o polinucleotídeo de 756 bp de comprimento ilustrado em SEQ ID No. 8 é o clone de cDNA de comprimento completo que codifica a proteína pectato liase apresentando um estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de 251 aminoácidos, como em SEQ ID No. 9, com uma massa molecular calculada de cerca de 26 kD. A análise SMART de SEQ ID No. 8, revela a presença do domínio de pectato liase Pfam na sequência. Pectato liase é uma enzima extracelular que catalisa a clivagem eliminativa de pectato para produzir oligossacarídeos com grupos 4-deoxi-alfa-D-gluc-4-enuronosil em suas extremidades não redutoras. Esta enzima está envolvida na degradação da pectina.

[95] Em outro aspecto, o polinucleotídeo de 771 bp de comprimento ilustrado em SEQ ID No. 11 é o clone de cDNA de comprimento completo que codifica a proteína pectato liase apresentando um estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de 256 aminoácidos, como em SEQ ID No. 12, com uma massa molecular calculada de cerca de 27 kD. A análise SMART de SEQ ID No. 11, revela a presença do domínio de pectato liase Pfam na sequência. Pectato liase é uma enzima extracelular que catalisa a clivagem eliminativa de pectato para produzir oligossacarídeos com grupos 4-deoxi-alfa-D-gluc-4-enuronosil em suas extremidades não redutoras. Esta enzima está envolvida na degradação da pectina.

[96] Ainda em outro aspecto, o polinucleotídeo de 750 bp de comprimento ilustrado em SEQ ID No. 14 é o clone de cDNA de comprimento completo que codifica a proteína pectato liase apresentando um estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de 249 aminoácidos, como em SEQ ID No. 15, com uma massa molecular calculada de cerca de 26 kD. A análise SMART de SEQ ID No. 14, revela a presença do domínio de pectato liase Pfam na sequência. Pectato liase é uma enzima extracelular que catalisa a clivagem eliminativa de pectato para produzir oligossacarídeos com grupos 4-deoxi-alfa-D-gluc-4-enuronosil em suas extremidades não redutoras. Esta enzima está envolvida na degradação da pectina.

[97] Ainda em outro aspecto, o polinucleotídeo de 756 bp de comprimento ilustrado em SEQ ID No. 17 é o clone de cDNA de comprimento completo que codifica a proteína pectato liase apresentando um estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de 251 aminoácidos, como em SEQ ID No. 18, com uma massa molecular calculada de cerca de 26 kD. A análise SMART de SEQ ID No. 17, revela a presença do domínio de pectato liase Pfam na sequência. Pectato liase é uma enzima extracelular que catalisa a clivagem eliminativa de pectato para produzir oligossacarídeos com grupos 4-deoxi-alfa-D-gluc-4-enuronosil em suas extremidades não redutoras. Esta enzima está envolvida na degradação da pectina.

[98] Ainda em outro aspecto, o polinucleotídeo de 894 bp de comprimento ilustrado em SEQ ID No. 20 é o clone de cDNA de comprimento completo que codifica a proteína pectato liase apresentando um estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de 297 aminoácidos, como em SEQ ID No. 21, com uma massa molecular calculada de cerca de 30 kD. A análise SMART de SEQ ID No. 20, revela a presença do domínio de pectato liase Pfam na sequência. Pectato liase é uma enzima extracelular que catalisa a clivagem eliminativa de pectato para produzir oligossacarídeos com grupos 4-deoxi-alfa-D-gluc-4-enuronosil em suas extremidades não redutoras. Esta enzima está envolvida na degradação da pectina.

[99] Ainda em outro aspecto, o polinucleotídeo de 747 bp de comprimento ilustrado em SEQ ID No. 23 é o clone de cDNA de comprimento completo que codifica a proteína pectato liase apresentando um estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de 248 aminoácidos, como em SEQ ID No. 24, com uma massa molecular calculada de cerca de 26 kD. A análise SMART de SEQ ID No. 23, revela a presença do domínio de pectato liase Pfam na sequência. Pectato liase é uma enzima extracelular que catalisa a clivagem eliminativa de pectato para produzir oligossacarídeos com grupos 4-deoxi-alfa-D-gluc-4-enuronosil em suas extremidades não redutoras. Esta enzima está envolvida na degradação da pectina.

[100]Ainda em outro aspecto, o polinucleotídeo de 1707 bp de comprimento ilustrado em SEQ ID No. 26 é o clone de cDNA de comprimento completo que codifica a proteína pectato liase apresentando um estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de 568 aminoácidos, como em SEQ ID No. 27, com uma massa molecular calculada de cerca de 64 kD. A análise SMART de SEQ ID No. 26, revela a presença do domínio de pectato liase Pfam na sequência. Pectato liase é uma enzima extracelular que catalisa a clivagem eliminativa de pectato para produzir oligossacarídeos com grupos 4-deoxi-alfa-D-gluc-4-enuronosil em suas extremidades não redutoras. Esta enzima está envolvida na degradação da pectina.

[101] Em outro aspecto, o polinucleotídeo de 1314 bp de comprimento ilustrado em SEQ ID No. 29 é o clone de cDNA de comprimento completo que codifica a proteína pectato liase C apresentando um estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de 437 aminoácidos, como em SEQ ID No. 30, com uma massa molecular calculada de cerca de 46 kD. A análise de sequência de SEQ ID No. 29 revela presença de motivo de domínio de pectato ligação C na sequência. Pectato ligação C é uma enzima extracelular que cliva poligalacturonato, um componente importante da parede celular vegetal. Esta enzima está envolvida na degradação da pectina.

[102] Em outro aspecto, o polinucleotídeo de 972 bp de comprimento ilustrado em SEQ ID No. 32 é o clone de cDNA de comprimento completo que codifica a proteína pectato liase C apresentando um estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de 323 aminoácidos, como em SEQ ID No. 33, com uma massa molecular calculada de cerca de 34 kD. A análise de sequência de SEQ ID No. 32 revela presença de motivo de domínio de pectato ligação C na sequência. Pectato ligação C é uma enzima extracelular que cliva poligalacturonato, um componente importante da parede celular vegetal. Esta enzima está envolvida na degradação da pectina.

[103] Em outro aspecto, o polinucleotídeo de 966 bp de comprimento ilustrado em SEQ ID No. 35 é o clone de cDNA de comprimento completo que codifica a proteína pectato liase C apresentando um estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de 321 aminoácidos, como em SEQ ID No. 36, com uma massa molecular calculada de cerca de 33 kD. A análise de sequência de SEQ ID No. 35 revela presença de motivo de domínio de pectato ligação C na sequência. Pectato ligação C é uma enzima extracelular que cliva poligalacturonato, um componente importante da parede celular vegetal. Esta enzima está envolvida na degradação da pectina.

[104] Em outro aspecto, o polinucleotídeo de 1536 bp de comprimento ilustrado em SEQ ID No. 38 é o clone de cDNA de comprimento completo que codifica a proteína pectato liase C apresentando um estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de 511 aminoácidos, como em SEQ ID No. 39, com uma massa molecular calculada de cerca de 56 kD. A análise de sequência de SEQ ID No. 38 revela presença de motivo de domínio de pectato ligação C na sequência. Pectato ligação C é uma enzima extracelular que cliva poligalacturonato, um componente importante da parede celular vegetal. Esta enzima está envolvida na degradação da pectina.

[105] Em outro aspecto, o polinucleotídeo de 1137 bp de comprimento ilustrado em SEQ ID No. 41 é o clone de cDNA de comprimento completo que codifica a proteína pectato liase C apresentando um estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de 378 aminoácidos, como em SEQ ID No. 42, com uma massa molecular calculada de cerca de 39 kD. A análise de sequência de SEQ ID No. 41 revela presença de motivo de domínio de pectato ligação C na sequência. Pectato ligação C é uma enzima extracelular que cliva poligalacturonato, um componente importante da parede celular vegetal. Esta enzima está envolvida na degradação da pectina.

[106] Em outro aspecto, o polinucleotídeo de 1137 bp de comprimento ilustrado em SEQ ID No. 44 é o clone de cDNA de comprimento completo que codifica a proteína pectato liase C apresentando um estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de 378 aminoácidos, como em SEQ ID No. 45, com uma massa molecular calculada de cerca de 39 kD. A análise de sequência de SEQ ID No. 44 revela presença de motivo de domínio de pectato ligação C na sequência. Pectato ligação C é uma enzima extracelular que cliva poligalacturonato, um componente importante da parede celular vegetal. Esta enzima está envolvida na degradação da pectina.

[107] Em outro aspecto, o polinucleotídeo de 1182 bp de comprimento ilustrado em SEQ ID No. 47 é o clone de cDNA de comprimento completo que codifica a proteína pectinesterase apresentando um estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de 393 aminoácidos, como em SEQ ID No. 48, com uma massa molecular calculada de cerca de 42 kD. A análise de sequência SMART de SEQ ID No. 47, revela a presença de domínio de pectinesterase na sequência. Pectinesterase é uma enzima extracelular que catalisa a desesterificação de ligações metil éster da estrutura de galacturonana de substâncias pécticas para liberar o pectinas ácidas e metanol. A pectina resultante é então atuada por poligalacturonases e liases.

[108] Em outro aspecto, o polinucleotídeo de 975 bp de comprimento ilustrado em SEQ ID No. 50 é o clone de cDNA de comprimento completo que codifica a proteína pectinesterase apresentando um estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de 324 aminoácidos, como em SEQ ID No. 51, com uma massa molecular calculada de cerca de 35 kD. A análise de sequência SMART de SEQ ID No. 50, revela a presença de domínio de pectinesterase na sequência. Pectinesterase é uma enzima extracelular que catalisa a desesterificação de ligações metil éster da estrutura de galacturonana de substâncias pécticas para liberar o pectinas ácidas e metanol. A pectina resultante é então atuada por poligalacturonases e liases.

[109] Em outro aspecto, o polinucleotídeo de 5895 bp de comprimento ilustrado em SEQ ID No. 53 é o clone de cDNA de comprimento completo que codifica a proteína pectinesterase apresentando um estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de 1964 aminoácidos, como em SEQ ID No. 54, com uma massa molecular calculada de cerca de 206 kD. A análise de sequência SMART de SEQ ID No. 53, revela a presença de múltiplos domínios de pectinesterase na sequência. Pectinesterase é uma enzima extracelular que catalisa a desesterificação de ligações metil éster da estrutura de galacturonana de substâncias pécticas para liberar pectinas ácidas e metanol. A pectina resultante é então atuada por poligalacturonases e liases.

[110] Em outro aspecto, o polinucleotídeo de 981 bp de comprimento ilustrado em SEQ ID No. 56 é o clone de cDNA de comprimento completo que codifica a proteína pectinesterase apresentando um estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de 326 aminoácidos, como em SEQ ID No. 57, com uma massa molecular calculada de cerca de 34 kD. A análise de sequência SMART de SEQ ID No. 56, revela a presença de domínios de pectinesterase na sequência. Pectinesterase é uma enzima extracelular que catalisa a desesterificação de ligações metil éster da estrutura de galacturonana de substâncias pécticas para liberar o pectinas ácidas e metanol. A pectina resultante é então atuada por poligalacturonases e liases.

[111] Em outro aspecto, o polinucleotídeo de 1593 bp de comprimento ilustrado em SEQ ID No. 59 é o clone de cDNA de comprimento completo que codifica a proteína rhamnogalacturonase apresentando um estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de 530 aminoácidos, como em SEQ ID No. 60, com uma massa molecular calculada de cerca de 57 kD. A análise de sequência SMART de SEQ ID No. 59, revela a presença de domínios de rhamnogalacturonase na sequência. Rhamnogalacturonase cliva ligações glicosídicas alfa-1,4 entre L-ramnose e ácidos D- galacturônicos na estrutura de rhamnogalacturonan-I, um componente importante do polissacarídeo de parede celular vegetal, pectina.

[112]Ainda em outro aspecto, o polinucleotídeo de 1605 bp de comprimento ilustrado em SEQ ID No. 62 é o clone de cDNA de comprimento completo que codifica a proteína rhamnogalacturonase apresentando um estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de 534 aminoácidos, como em SEQ ID No. 63, com uma massa molecular calculada de cerca de 57 kD. A análise de sequência SMART de SEQ ID No. 62, revela a presença de domínios de rhamnogalacturonase na sequência. Rhamnogalacturonase cliva ligações glicosídicas alfa-1,4 entre L-ramnose e ácidos D- galacturônicos na estrutura de rhamnogalacturonan-I, um componente importante do polissacarídeo de parede celular vegetal, pectina.

[113]A presente invenção também se refere a (a) vetores de ácido nucleico que compreendem e/ou consistem em uma sequência de nucleotídeo compreendendo qualquer uma das sequências anteriores de genes e/ou complementos das mesmas; (b) constructos de expressão que compreendem uma sequência de nucleotídeo que compreendem e/ou consistem em qualquer uma das sequências de codificação anteriores dos genes operacionalmente ligados a um elemento regulador que direciona a expressão das sequências de codificação; e (c) células hospedeiras recombinantes que compreendem e/ou consistem em qualquer uma das sequências de gene anteriores, incluindo regiões de codificação operacionalmente ligadas com um elemento regulador que direciona a expressão das sequências de codificação nas células hospedeiras.

[114]As técnicas para modificar sequências de polinucleotídeo utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas. As várias sequências podem ser acopladas em conformidade com técnicas conhecidas, como restrição, junção de sítios de restrição complementares e ligação, extremidade romba por enchimento de saliências e ligadura romba ou afins. Poliligantes e adaptadores podem ser empregados, quando apropriado, e introduzidos ou removidos por técnicas conhecidas para permitir a facilidade de montagem de vetores de DNA e constructos de expressão. Um grande número de vetores está disponível para clonagem e manipulação genética. Normalmente, a clonagem pode ser realizada em E. coli.

[115] Em outra modalidade da invenção, vetores que compreendem uma sequência de gene de enzima da invenção ainda podem compreender funções de replicação que permitem a transferência, manutenção e propagação dos vetores em uma ou mais espécies de células hospedeiras, incluindo, mas não limitado a, células de E. coli, células de fungos filamentosos, células de levedura e células de Bacillus. O vetor pode conter quaisquer meio para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado em conjunto com o cromossomo em que foi integrado. A escolha do vetor normalmente vai depender da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor será introduzido.

[116] O constructo de expressão da invenção compreende e/ou consiste em um promotor, uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de gene da invenção, uma sequência de terminação da transcrição e marcador selecionável (opcional). Qualquer método conhecido na técnica para introduzir esse constructo de expressão em uma célula hospedeira pode ser utilizado. Células fúngicas podem ser transformadas por um processo que envolve a formação de protoplastos, transformação dos protoplastos e a regeneração da parede celular de uma forma conhecida por si. Procedimentos apropriados para a transformação de células hospedeiras Aspergillus e Trichoderma são descritas em EP 238 023 e Yelton MM, Hames JE, Timberlake WE. Transformation of Aspergillus nidulans by using a trpC plasmid. PNAS,1984; 81(5):1470-1474. Métodos apropriados para transformar espécies de Fusarium são descritos por Malardier L, Daboussi MJ, Julien J, Roussel F, Scazzocchio C, Brygoo Y. Cloning of the nitrate reductase gene (niaD) of Aspergillus nidulans and its use for transformation of Fusarium oxysporum. Gene 1989; 78:147156, e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker DM, Guarente L. High- efficiency transformation of yeast by electroporation. In: Abelson JN and Simon MI (eds), Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology,1991;194:182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. Journal of Bacteriology, 1983;153: 163-168 e Hinnen A, Hicks JB, Fink GR. Transformation of yeast. PNAS, 1978; 75 (4):1929-1933.

[117] Para aplicações industriais, as enzimas da presente invenção são produzidas por uma célula fúngica. Preferencialmente, a célula hospedeira de expressão é uma célula de fungo filamentoso que foi utilizada em fermentação industrial em grande escala. Linhagens celulares ou sistemas de hospedeiro apropriados podem ser escolhidos para assegurar a correta modificação e processamento da proteína estrangeira expressa. Preferencialmente, um hospedeiro de expressão é selecionado que é capaz da secreção eficiente de suas proteínas endógenas. Uma célula hospedeira também pode ser escolhida para deficiências em atividades de protease extracelular, uma vez que a enzima secretada pode ser degradada em meio de cultura.

[118]A presente invenção refere-se também aos métodos para produzir um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo: (i) cultivar uma célula, que na sua forma de tipo selvagem é capaz de produzir o polipeptídeo, sob condições que contribuem para a produção do polipeptídeo; e (ii) recuperar o polipeptídeo. Em um aspecto preferencial, a célula é M. phaseolina.

[119] Outra modalidade da invenção refere-se também aos métodos para produzir um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo: (i) cultivar uma célula hospedeira sob condições que contribuam para a produção do polipeptídeo, em que a célula hospedeira compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOs. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 ou 61, em que a sequência de nucleotídeo codifica um polipeptídeo que compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NOs. 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 ou 63, e (ii) recuperar o polipeptídeo.

[120] Em outra modalidade da presente invenção, as células hospedeiras de expressão ou transformantes são cultivadas em meio apropriado de nutrientes para o crescimento e expressão de proteínas usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo com frasco agitado, e fermentação de pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, de lote, de lote alimentado ou de estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais, realizada em um meio apropriado e sob condições permitindo que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. O cultivo pode ocorrer em meio adequado de nutrientes compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, utilizando procedimentos conhecidos na técnica (ver In: More Gene Manipulations in Fungi. Bennett J W, Lasure L., (eds). 1991; Academic Press, San Diego, CA). Se o polipeptídeo é secretado no meio nutritivo, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não é secretado no meio, o mesmo pode ser recuperado de lisados celulares.

[121] Os polipeptídeos podem ser detectados usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Esses métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima, ou desaparecimento de um substrato de enzima. Um ensaio de enzima pode ser usado para determinar a atividade do polipeptídeo.

[122] O polipeptídeo produzido pode ser recuperado usando os métodos conhecidos na técnica. O polipeptídeo pode ser recuperado em vários métodos do meio nutriente por procedimentos convencionais, incluindo, mas não se limitando a, filtração, centrifugação, extração, secagem por spray, evaporação e precipitação ou combinação dos mesmos.

[123] Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificados por uma variedade de procedimentos que são bem conhecidos na técnica incluindo, mas não limitando a, método de cromatografia (como a troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem e exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (como focagem isoelétrica), solubilidade diferencial (como a precipitação do sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração para obter polipeptídeos substancialmente puros (ver detalhes em Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications. Janson JC, Rydén L. (eds(). 1989; VCH Publishers Inc., New York).

[124]A presente invenção refere-se também aos produtos de genes (por exemplo, RNA ou proteínas) que são codificados por sequências de gene estabelecidas em SEQ ID NOs. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59 e 62. Os produtos de gene da enzima da invenção também incluem os RNA ou proteínas que são codificados pelas sequências genômicas dos genes como estabelecido em SEQ ID NOs. 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 e 61. As enzimas da invenção compreendem uma sequência de aminoácido selecionada do grupo compreendendo e/ou consistindo em SEQ ID NOs. 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 e 63.

[125]As enzimas da presente invenção apresentam pelo menos uma das atividades de uma enzima selecionada do grupo compreendendo e/ou que consiste em pectato liase, pectato liase C, pectinesterase e rhamnogalacturonase. Os produtos de gene da enzima da invenção podem ser facilmente produzidos, por exemplo, por técnicas sintéticas ou pelos métodos da tecnologia de DNA recombinante usando técnicas que são bem conhecidas (ver, Creighton TE. Proteins: Structures and Molecular Principles, 1983; W. H. Freeman and Co., N.Y.)

[126] Em outra modalidade, os métodos e composições da invenção incluem proteínas e polipeptídeos que representam produtos de gene funcionalmente equivalentes. Esses produtos de genes funcionalmente equivalentes incluem, mas não são limitados a, variantes natural dos polipeptídeos tendo uma sequência de aminoácido estabelecida em SEQ ID NOs. 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 e 63.

[127] Esses produtos de gene equivalentes podem conter, por exemplo, deleções, adições ou substituições de resíduos de aminoácidos dentro das sequências de aminoácidos codificadas pelas sequências de genes de enzima descritas acima, mas que resultam em uma mudança silenciosa, assim produzindo um produto funcionalmente equivalente. Substituições de aminoácido podem ser preparadas com base na semelhança de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e/ou a natureza anfipática dos resíduos envolvidos.

[128] Outras modificações das sequências de codificação do produto de gene descritas acima podem ser preparadas para gerar polipeptídeos que são mais apropriados, por exemplo, para a expressão, escalonamento, etc. em uma célula hospedeira escolhida. Por exemplo, resíduos de cisteína podem ser deletados ou substituídos com outro aminoácido a fim de eliminar as pontes dissulfeto.

[129] Outra modalidade da presente invenção ainda inclui enzimas da presente invenção em forma sólida. Enzimas em forma sólida ou granulado de enzima podem ser usado, por exemplo, em detergente sólido e em ração animal. Métodos para preparar formas sólidas de enzimas são bem conhecidos na técnica, como, mas não limitado a, peletização (refrigeração por spray em um material ceroso), extrusão, aglomeração ou granulação (diluição com material inerte e aglutinantes). Composições enzimáticas sólidas compreendendo uma forma sólida de uma enzima da invenção, sob a forma de pó misturado, comprimidos e afins, são contempladas.

[130]A presente divulgação inclui o que consta nas reivindicações anexas, bem como o descrito acima. Embora esta invenção seja descrita em sua forma preferencial, com um grau de particularidade, entende-se que a presente divulgação da forma preferencial foi feita apenas a título de exemplo, e que numerosas mudanças nos detalhes da construção e a combinação e arranjos de partes podem ser invocadas sem abandonar o escopo e o espírito da invenção e reivindicações.

[131]Várias referências são citadas aqui, cujas divulgações são incorporadas como referência em suas totalidades.

EXEMPLO

[132] O exemplo a seguir destina-se a ilustrar ainda mais a invenção, sem qualquer intenção de a invenção se limitar às modalidades específicas descritas aqui.

[133] Exemplo 1 Isolamento de DNA Genômico de M. phaseolina

[134] O DNA genômico foi isolado de M. phaseolina cepa ms6 usando os procedimentos descritos por Kieser T, Bibb MJ, Buttner MJ, Chater KF, Hopwood DA. Practical Streptomyces Genetics, 2000; John Innes Foundation, Norwich, UK, pp. 162-208. Brevemente, micélios foram raspados de uma placa de Petri estoque usando alça de inoculação e inoculados em uma meio de batata-dextrose líquido em um Erlenmeyer. O Erlenmeyer foi incubado sem agitação por cerca de 72 horas a 30°C. Os micélios crescem na superfície na interface ar-meio. Os micélios foram coletados usando um palito estéril e colocados entre toalhas de papel estéreis e lavados algumas vezes com solução fisiológica (tampão fosfato de sódio pH 7,0). Os micélios foram espremidos para remover o excesso de líquido e os micélios coletados secaram no ar por 30 minutos. Os micélios semissecos foram colocados em nitrogênio líquido e moídos para gerar pó fino e finalmente isolar o DNA seguindo o protocolo descrito em Kieser T, Bibb MJ, Buttner MJ, Chater KF, Hopwood DA. Practical Streptomyces Genetics, 2000; John Innes Foundation, Norwich, UK, pp. 162-208.

[135] Exemplo 2 Projeto e síntese de iniciadores

[136] Os iniciadores utilizados no estudo foram projetados a partir de transcriptoma curado manualmente e os “moldes de gene” previstos a partir de sequências genômicas de M. phaseolina ms6, escolhendo as sequências manualmente com ORFs completas ou usando bancos de dados onde genes similares foram isolados com sucesso de outras plantas. Análises de bioinformática comparativa das sequências de nucleotídeo obtidas de transcriptoma foram realizadas utilizando o NCBI BLAST, BLASTP, RPS-BLAST, BLASTX e PSI-BLAST para identificar os homólogos de genes relacionados e para a identificação apropriada do gene. Alinhamentos de sequência de nucleotídeo foram realizados usando clustalW versão 1.82 sempre que várias sequências foram encontradas do “combinado de gene”. O alinhamento foi então editado. Iniciadores específicos de gene (direto e reverso) foram selecionados manualmente ou através da ferramenta Primer 3 plus e os iniciadores foram sintetizados de forma customizada.

[137] Todos os oligonucleotídeos utilizados neste estudo foram sintetizados e purificados por HPLC pelo fornecedor e adquiridos de Integrated DNA Technologies (IDT). Soluções estoque de 100 pmol foram preparadas em ddH2O autoclavado e armazenadas a -20°C, em alíquotas para uso.Sequências de oligonucleotídeos usadas como iniciadores para PCR

[138] Exemplo 3 Amplificação, clonagem e sequenciamento de pectato liase, Pectato liase C, pectinesterase e rhamnogalacturonase de M. phaseolina ms6

[139] O RNA total foi isolado do micélio de três dias de idade crescido em meio líquido conforme descrito por Chomczynski P and Sacchi N, Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction (Anal Biochem 1987, 162: 156-159). A qualidade ou a integridade do RNA foi verificada pela eletroforese em gel de agarose e foi quantificada utilizando Thermo Scientific Nano Drop 2000 conforme procedimento padrão. O primeiro filamento de cDNA foi sintetizado usando a transcriptase reversa SuperScript III (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. O gene foi amplificado de cDNA por PCR utilizando iniciadores específicos de gene. A reação de PCR (50μL) continha 1 μL de cDNA, 20 pmoles de cada iniciador, 5 μL de 10x PCR Tampão, 5 μL de mistura 2,5 mM dNTP e 1,0 unidade de DNA polimerase PfuTaq. PCR foi realizado em Termociclador (Applied Biosystems) usando as seguintes condições: desnaturação inicial por 5 minutos (“min”) a 95°C seguida de 35 ciclos de desnaturação a 95°C por 30 segundos (“seg”), anelamento a 59-61°C por 30 seg e extensão a 72°C por 1 a 2,0 min dependendo do comprimento do gene alvo, com uma extensão final a 72°C por 7 min. O produto de PCR foi analisado pelo 1% gel de agarose usando 1XTAE tampão e o amplicon foi eluído do gel usando o kit de extração de gel QIAGEN seguindo as instruções do fabricante. O produto de PCR purificado foi ligado em kit de clonagem pCR®8/GW/TOPO® TA (Invitrogen) e transformado em células de E. coli competentes (Invitrogen). Os plasmídeos foram isolados de colônias putativas usando QIAprip Spin Miniprep Kit (QIAGEN) seguindo as instruções do fabricante. A presença do inserto foi verificada utilizando os iniciadores específicos de gene e plasmídeos positivos foram submetidos ao Sequenciamento.

[140] Exemplo 3 Análise da sequência

[141]A sequência de nucleotídeo e a sequência de aminoácido foram analisadas pelos programas BLASTN e BLASTP, respectivamente. As sequências relatadas de outras plantas foram alinhadas com ClustalW. A análise filogenética foi realizada utilizando Neighbour Joining (NJ).

INCORPORAÇÃO COMO REFERÊNCIA

[142] Todas as patentes US, pedidos de patente publicados US, e pedidos PCT publicados citados aqui são aqui incorporados como referência.

EQUIVALENTES

[143] Embora várias modalidades da presente invenção tenahm sido descritas e ilustradas aqui, os especialistas na técnica prontamente vislumbrarão uma variedade de outros meios e/ou estruturas para desempenhar as funções e/ou obter os resultados e/ou uma ou mais das vantagens aqui descritas, e cada uma dessas variações e/ou modificações é considerada dentro do escopo da presente invenção. Os especialistas na técnica reconhecerão, ou serão capazes de descobrir usando não mais do que a rotina de experimentação, numerosos equivalentes para as modalidades específicas da invenção descritas aqui. Deve, portanto, ser entendido que as modalidades anteriores são apresentadas a título de exemplo somente e que, dentro do escopo das reivindicações acrescentadas e equivalentes das mesmas; a invenção pode ser praticada de outra forma diferente do que como especificamente descrita e reivindicada.

Claims (3)

1. Sequência de polinucleotídeo recombinante, caracterizada pelo fato de que consiste em uma sequência de DNA complementar conforme estabelecida na SEQ ID No. 2, em que o dito polinucleotídeo codifica uma pectato-liase.

2. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de polinucleotídeo recombinante como definida na reivindicação 1.

3. Célula hospedeira procariótica geneticamente engenheirada, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de polinucleotídeo recombinante como definida na reivindicação 1.