KR20150042849A - 마크로포미나 파세올리나로부터의 펙틴 분해 효소 및 이의 용도 - Google Patents

마크로포미나 파세올리나로부터의 펙틴 분해 효소 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 마크로포미나 파세올리나 (Macrophomina phaseolina) ("엠. 파세올리나") 균류으로부터 유래되는 펙틴을 분해하는데 책임이 있는 효소를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 기재하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 및 61에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 이러한 서열의 보체를 포함하고/하거나 이들로 이루어진다. 본 발명은 또한 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 및 63에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 분리된 폴리펩티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 유전자 작제물; 상기 재조합 유전자 작제물을 포함하고 펙틴 분해 효소 생성이 증진된 형질전환체 또는 유전자전이 균류에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드는, 특히, 제조되는 과일 쥬스, 직물 제품, 펄프 및 종이, 커피, 차 및 오일 추출 및 펙틴 폐수 처리에 사용될 수 있다.

Description

마크로포미나 파세올리나로부터의 펙틴 분해 효소 및 이의 용도{Pectin degrading enzymes from Macrophomina phaseolina and uses thereof}
연관 출원
본원은 2012년 8월 16일자로 출원된 미국 임시특허출원 제61/683914호를 우선권으로 주장하며, 이의 내용이 참조로 본원에 포함된다.
기술 분야
본 발명은 펙테이트 리아제 (pectate lyase) 활성을 갖는 엠. 파세올리나 (M. phaseolina)로부터의 분리된 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 제조하는 방법 및 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물, 벡터 및 숙주 세포뿐만 아니라 상기 폴리펩티드를 제조하는 방법 및 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드는, 특히, 섬유 및 직물의 침지 및 정련을 위해 섬유 산업에서 사용되고; 과일 및 야채 쥬스 추출을 위해 식품 산업에서 사용되고; 우수한 품질의 종이를 생산하기 위해 제지 산업에서 사용되고; 또한 커피 및 차의 발효, 오일 추출 및 펙틴 폐수 처리를 위해 사용될 수 있다.
펙틴은 주요한 식물-세포벽의 중간 라멜라에 존재하는 착물 헤테로중합체의 한 그룹이며, 세포간 시멘트로서 작용한다. 이들은 또한 이들의 콜로이드 특성에 기인하여 식물의 물-조절에 중요한 기능을 한다. 세포벽 사이에 위치되는 중간 라멜라는 프로토펙틴 (펙틴의 불용성 형태)으로부터 주로 조립된다.
펙틴은 2개의 상이한 뚜렷한 영역 "매끈한" 영역 및 "털모양" 영역으로 구성된다. "매끈한" 영역은 메탄올로 에스테르화되는 일부 카복실 그룹과 함께 폴리갈락투론산을 형성하는 α-1,4-연결된 D-갈락투론산의 골격 (backbone)으로 이루어진다 [Rouse A. Pectin: distribution, significance. In: Nagy S, Shaw P, Veldhuis Meds. Citrus Science and Technology, Vol I. Westport CT: AVI publishing Inc. 1977]. "털모양" 영역에서, 갈락투론산 골격은 α-1,2-연결된 L-람노즈 단위로 분해된다.
펙틴/펙테이트 리아제는 매끈한 영역에서 펙틴을 탈중합화하며, 이는 β-제거를 통해 글리코사이드 결합을 절단하여 4,5-불포화된 비-환원 말단인 올리고머를 생성한다 [Lombard V, Bernard T, Rancurel C, Brumer H, Coutinho PM, Henrissat B. A hierarchical classification of polysaccharide lyases for glycogenomics. Biochem J. 2010;432(3):437-444]. 반면, 람노갈락투로나제는 펙틴의 털모양 영역 내를 절단한다 [Jensen MH, Otten H, Christensen U, Borchert TV, Christensen LL, Larsen S, Leggio LL. Structural and biochemical studies elucidate the mechanism of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus. J Mol Biol. 2010;404(1):100-111].
펙틴 에스테라제는 펙틴을 메탄올 및 폴리갈락투론산으로 가수분해시킨다. 이 효소는 아스퍼길루스 종 (Aspergillus sp), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 푸사리움 모닐포르메 (Fusarium monilforme), 리조푸스 스톨로니퍼 (Rhizopus stolonifer), 트리초더마 종 (Trichoderma sp) 등을 포함하는 수개의 균류에 의해 생성될 수 있다 [Polizeli ML, Jorge JA, Terenzi HF. Pectinase production by Neurospora crassa: purification and biochemical characterization of extracellular polygalacturonase activity, J. Gen. Microbiol. 1991;137: 1815-1823]. 그러나, 아스퍼길루스가 펙틴 에스테라제의 시판 생산을 위한 주요 공급원이다 [Torres EF, Aguilar C, Esquivel JCC, Gonzales GV. Pectinase. In: Enzyme Technology, Pandey, A., Webb, C., Soccol, C.R., Larroche, C (Eds), Asiatech Publishiers Inc., New Delhi, India, 2005. pp. 273-296].
펙틴-분해 효소는 식품 산업에서 주로 과일 쥬스 생산 또는 와인 제조와 같은 과일 및 야채 가공에 중요한 수단이다. 다른 적용 분야는 펄프 및 제지 산업 [Reid I, Ricard M. Pectinase in papermaking: solving retention problems in mechanical pulps bleached with hydrogen peroxide. Enz. Microbiol. Technol. 2000;26:115-123], 동물 사료 [Barreto de Menezes TJ, Salva JG, Baldini VL, Papini RS, Sales AM. Protein enrichment of citrus wastes by solid substrate fermentation. Proc. Biochem. 1989;23:167-171], 아마 및 다른 식물 섬유의 침지 [Hoondal GS, Tiwari RP, Tiwari R, Dahiya N, Beg QK. Microbial alkaline pectinases and their applications: a review. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000;9:409-418], 커피 및 차 발효 [Gar JG. Tea, coffee and cocoa. In: wood BJB, editor. Microbiology of fermented foods. 1985;vol 2. London: Elsevier Sci. Ltd. pp:133-154], 오일 추출 [Scott D. Enzymes, industrial. In: Encyclopedia of Chemical Technology. Grayson M, Ekarth D and Othmer K (eds), 1978; Wiley, NY. pp: 173-224], 면 섬유의 바이오-정련 [Singh R, Saxena S, Gupta R. Microbial pectinolytic enzymes: A review. Proc. Biochem. 2005;40:2931-2944], 식물성 인피 섬유의 정련 [Kapoor M, Beg QK, Bhushan B, Singh K, Dadich KS, Hoondal GS. Application of alkaline and thermostable polygalacturonase from Bacillus sp. MGcp-2 in degumming of ramie (Boehmeria nivea) and sunn hemp (Crotolaria juncia) bast fibers. Proc. Biochem. 2001;36:803-817], 섬유 산업 [Karmakar SR. Chemical technology in the pretreatment processes of textiles. In: Textile science and technology series1st ed., Amsterdam: Elsevier Science B.V. 1999; p. 12] 및 폐기물 관리 [Kashyap DR, Vohra PK, Chopra S, Tewari R. Applications of pectinases in the commercial sector: a review. Biores. Technol. 2001;77:215-227]를 포함한다. WO 98/45393는 진흙 오염에 대해 탁월한 세정력을 갖는 프로토펙티나제를 포함하는 세제 조성물을 기재한다.
이들 효소들은 산업에서 개별적으로 사용되거나 칵테일 (혼합) 형태로 사용된다. 예를 들어, 식품 산업에서는 겔화 (gellification)를 위해서는 개별 효소, 예컨대 펙틴 에스테라제가 사용되고, 식물 재료의 액화를 위해서는 상이한 효소의 배합, 예컨대 펙틴 에스테라제와 폴리갈락투로나제가 사용된다 [Heldt-Hansen HP, Kofod LV, Budolfsen G, Nielsen PM, Hutel S, Bladt T. Application of tailor made pectinases. In: Visser J and Voragen AJG (eds), Pectin and Peactnases. Progress in Biotechnology. 1996;14:463-474].
아스퍼길루스 니거 (Aspergillus niger)로부터 수득되는 이들 효소들 중 수개의 효소들에 대한 클로닝 및 발현이 보고되어 있다. EP 0 278 355는 펙틴 리아제 유전자의 클로닝, 이의 서열 및 발현을 기재하고 있다. EP 0 353 188은 일부 다른 펙틴 리아제를 추가한다. EO 0 421 919는 2개의 폴리갈락투로나제를 개시하며, 또 다른 엔도-폴리갈락투로나제가 EP 0 388 593에 개시되어 있다. 이들 특허원들 모두는 유전자 공급원으로서 아스퍼길루스 니거를 사용하였다. WO 94/14952는 아스퍼길루스 아쿨레아트스 (Aspergillus aculeatus)로부터 수득가능한 엔도-폴리갈락투로나제 활성을 갖는 3개의 효소들을 개시한다. 그러나, 어떠한 공개문헌도 엠. 파세올리나로부터의 펙틴 분해 효소를 암호화하는 유전자의 클로닝에 대해 보고한바 없었다.
본 발명은, 특히, 산업 공정 또는 목적에 사용될 수 있는 엠. 파세올리나로부터 유래되는 펙틴 분해 효소의 유전자 및 이에 의해 암호화되는 단백질을 밝히기 위해 게놈 접근법을 이용한다.
발명의 요지
특히, 본 발명은 엠. 파세올리나로부터 유도가능한 적어도 21개의 펙틴 분해 효소에 관한 것이다. 본 발명은 또한 펙틴 분해에 있어서의 균류 엠. 파세올리나의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제1 목적은 균류 엠. 파세올리나의 펙테이트 리아제 (서열번호 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25 및 26), 펙테이트 리아제 C (서열번호 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37, 38, 40, 41, 43 및 44), 펙틴에스테라제 (서열번호 46, 47, 49, 50, 52, 53, 55 및 56) 및 람노갈락투로나제 (서열번호 58, 59, 61 및 62)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 세트를 제공하는 것이다. 본 발명의 각각의 유전자에 대해, 개방 판독 프레임 (ORF) 서열은 예측되는 인트론 서열을 결실시키고 엑손 서열을 함께 스플라이싱함으로써 각각의 게놈 서열로부터 수동으로 유도되었다. 상기 효소 유전자를 포함하는 벡터, 발현 벡터 및 숙주 세포도 또한 포함된다.
또한, 본 발명은 상기 유전자의 ORF 서열로부터 유추되는 폴리펩티드 서열을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드 서열은 펙테이트 리아제 (서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 및 27), 펙테이트 리아제 C (서열번호 30, 33, 36, 39, 42 및 45), 펙틴에스테라제 (서열번호 48, 51, 54 및 57) 및 람노갈락투로나제 (서열번호 60 및 63)의 서열에 상응한다. 본 발명은 또한 상기된 뉴클레오티드 서열의 보체를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 가치있는 산업 제품의 생산을 위해 펙틴 분해의 조절, 전환에 활용/이용될, 제1 목적에서 제시된 유전자 및 효소에 대한 분자 생물학적 및 유전적 정보를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 펙틴 분해 폴리펩티드의 시험관내 생성을 용이하게 하는 것이며, 본 발명은 또한 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 및 63에 제시되는 바와 같은 적어도 70%의 연속적 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 작제물을 포함한다. 바람직하게는, 발현 작제물은 서열번호 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 및 61에 제시된 연속적 뉴클레오티드를 갖는 삽입된 DNA 또는 cDNA를 갖는다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 및 61에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 주형를 포함하는 재조합 유전자 작제물을 제공하는 것이며, 상기 폴리뉴클레오티드 주형은 펙틴을 분해하는 효소를 생성하도록 숙주 세포에서 발현가능하다. 바람직하게는, 재조합 유전자 작제물은 또한 폴리뉴클레오티드 주형의 발현을 향상시키도록 작동적으로 연결된 프로모터 영역을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예 중의 하나는 감염된 황마 (jute) 식물로부터 분리된 엠. 파세올리나의 ms6 균주이다. 분리된 폴리펩티드는 또한 바람직하게는 이러한 균주로부터 유도된다.
또한, 본 발명의 목적은, 특히, 과일 쥬스, 직물 제품, 펄프 및 종이, 커피, 차 및 오일 추출물의 생산을 위한 증가하는 세계적인 수요에 따르기 위해 엠. 파세올리나로부터 펙틴 분해 효소를 분리하기 위한 잠재적으로 상업적으로 실현가능한 방식을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 동물 사료, 과일 쥬스, 직물 제품, 펄프 및 종이, 커피, 차 및 오일 추출물의 가공, 인피 섬유의 침지/정련 시 펙틴 분해 물질을 사용하는 것이다.
이들 유용성 중 임의의 것 또는 모든 것들은 연구용 제품으로서 또는 산업 또는 기타 이용을 위한 자재로서 상업화하기 위한 키트로 개발될 수 있다. 키트는 본 발명의 하나 이상의 엠. 파세올리나 유전자에 상응하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드, 항체 및/또는 다른 시약을 포함할 수 있다.
당업자는 본 발명이 상기 목적들을 완수하기 위해 잘 조정되고 기재된 목표들 및 이점들뿐만 아니라 본원에 내재하는 것들을 달성한다는 것을 쉽게 알 수 있을 것이다. 본원에 기재된 구현예는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
본 발명의 이들 및 다른 특징, 구현예 및 이점은 하기 설명 및 특허청구범위를 참조로 하여 더욱 잘 이해될 것이다.
본원에 포함되고 일부를 형성하는 첨부된 도면은 본 발명의 구현예를 설명하며, 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하기 위해 제공된다.
도 1은 PCR 증폭 결과를 나타내는 전기영동된 아가로즈 겔 이미지이며, 여기서 레인 1은 서열번호 1의 펙테이트 리아제의 폴리뉴클레오티드이고, 레인 M은 DNA 분자량 래더이다.
도 2는 PCR 증폭 결과를 나타내는 전기영동된 아가로즈 겔 이미지이며, 여기서 레인 1은 서열번호 4의 펙테이트 리아제의 폴리뉴클레오티드이고, 레인 M은 DNA 분자량 래더이다.
도 3은 PCR 증폭 결과를 나타내는 전기영동된 아가로즈 겔 이미지이며, 여기서 레인 1은 서열번호 7의 펙테이트 리아제의 폴리뉴클레오티드이고, 레인 M은 DNA 분자량 래더이다.
도 4는 PCR 증폭 결과를 나타내는 전기영동된 아가로즈 겔 이미지이며, 여기서 레인 1은 서열번호 10의 펙테이트 리아제의 폴리뉴클레오티드이고, 레인 M은 DNA 분자량 래더이다.
도 5는 PCR 증폭 결과를 나타내는 전기영동된 아가로즈 겔 이미지이며, 여기서 레인 1은 서열번호 13의 펙테이트 리아제의 폴리뉴클레오티드이고, 레인 M은 DNA 분자량 래더이다.
도 6은 PCR 증폭 결과를 나타내는 전기영동된 아가로즈 겔 이미지이며, 여기서 레인 1은 서열번호 16의 펙테이트 리아제의 폴리뉴클레오티드이고, 레인 M은 DNA 분자량 래더이다.
도 7은 PCR 증폭 결과를 나타내는 전기영동된 아가로즈 겔 이미지이며, 여기서 레인 1은 서열번호 19의 펙테이트 리아제의 폴리뉴클레오티드이고, 레인 M은 DNA 분자량 래더이다.
도 8은 PCR 증폭 결과를 나타내는 전기영동된 아가로즈 겔 이미지이며, 여기서 레인 1은 서열번호 22의 펙테이트 리아제의 폴리뉴클레오티드이고, 레인 M은 DNA 분자량 래더이다.
도 9는 PCR 증폭 결과를 나타내는 전기영동된 아가로즈 겔 이미지이며, 여기서 레인 1은 서열번호 28의 펙테이트 리아제의 폴리뉴클레오티드이고, 레인 M은 DNA 분자량 래더이다.
도 10은 PCR 증폭 결과를 나타내는 전기영동된 아가로즈 겔 이미지이며, 여기서 레인 1은 서열번호 31의 펙테이트 리아제의 폴리뉴클레오티드이고, 레인 M은 DNA 분자량 래더이다.
도 11은 PCR 증폭 결과를 나타내는 전기영동된 아가로즈 겔 이미지이며, 여기서 레인 1은 서열번호 34의 펙테이트 리아제의 폴리뉴클레오티드이고, 레인 M은 DNA 분자량 래더이다.
도 12는 PCR 증폭 결과를 나타내는 전기영동된 아가로즈 겔 이미지이며, 여기서 레인 1은 서열번호 37의 펙테이트 리아제의 폴리뉴클레오티드이고, 레인 M은 DNA 분자량 래더이다.
도 13은 PCR 증폭 결과를 나타내는 전기영동된 아가로즈 겔 이미지이며, 여기서 레인 1은 서열번호 40의 펙테이트 리아제의 폴리뉴클레오티드이고, 레인 M은 DNA 분자량 래더이다.
도 14는 PCR 증폭 결과를 나타내는 전기영동된 아가로즈 겔 이미지이며, 여기서 레인 1은 서열번호 43의 펙테이트 리아제의 폴리뉴클레오티드이고, 레인 M은 DNA 분자량 래더이다.
도 15는 PCR 증폭 결과를 나타내는 전기영동된 아가로즈 겔 이미지이며, 여기서 레인 1은 서열번호 46의 펙틴에스테라제의 폴리뉴클레오티드이고, 레인 M은 DNA 분자량 래더이다.
도 16은 PCR 증폭 결과를 나타내는 전기영동된 아가로즈 겔 이미지이며, 여기서 레인 1은 서열번호 49의 펙틴에스테라제의 폴리뉴클레오티드이고, 레인 M은 DNA 분자량 래더이다.
도 17은 PCR 증폭 결과를 나타내는 전기영동된 아가로즈 겔 이미지이며, 여기서 레인 1은 서열번호 55의 펙틴에스테라제의 폴리뉴클레오티드이고, 레인 M은 DNA 분자량 래더이다.
도 18은 PCR 증폭 결과를 나타내는 전기영동된 아가로즈 겔 이미지이며, 여기서 레인 1은 서열번호 58의 람노갈락투로나제의 폴리뉴클레오티드이고, 레인 M은 DNA 분자량 래더이다.
도 19은 PCR 증폭 결과를 나타내는 전기영동된 아가로즈 겔 이미지이며, 여기서 레인 1은 서열번호 61의 람노갈락투로나제의 폴리뉴클레오티드이고, 레인 M은 DNA 분자량 래더이다.
본원에서 제공되는 정의 및/또는 방법은 본 발명을 정의하며, 당업자에 의한 본 발명의 실시를 교시한다. 달리 기술되지 않는 한, 용어는 관련 분야의 통상의 기술자에 의한 통상적인 사용에 따라 이해되어야 한다. 임의의 정의 및/또는 방법이 본원에 포함되는 임의의 특허 또는 비-특허 참조문헌 또는 다른 곳에서 확인되는 임의의 참조문헌에서 제공되는 임의의 정의 및/또는 방법과 일치하지 않는 것으로 확인되는 경우, 본원에서 명백히 제공/채택된 정의 및/또는 방법이 본원에서 사용될 것이다. 단수 형태는, 문맥이 달리 명백히 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상물을 포함한다. 유사하게, 표현 "또는"도, 문맥이 달리 명백히 지시하지 않는 한, "및"을 포함하고자 한다. 따라서, "A 또는 B를 포함하는"은 A, B 또는 A와 B를 포함하는 것을 의미한다. 또한, 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 주어지는 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기 및 모든 분자 중량 또는 분자 질량 값은 근사치이며 설명을 위해 제공되는 것이라는 것을 알 수 있을 것이다. 본원에 기재되는 방법 및 물질과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 기술의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다.
본 발명은 펙틴 분해에 수반되는 엠. 파세올리나의 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 상기 유전자는 식품, 동물 사료, 종이, 오일 추출, 직물, 폐수를 포함하는 산업에 사용되거나 산업에서 흥미있는 펙틴 분해 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화한다. 본 발명의 유전자, 이의 확인, 특성화, 변형 및 다양한 산업 공정에서의 사용 방법이 하기에 기재된다.
엠. 파세올리나 게놈 DNA의 뉴클레오티드 서열은 전체-게놈 랜덤 숏건 DNA 서열적 효과에 의해 수득되었다. 게놈 DNA는 감염된 황마 (Corchorus spp.) 식물로부터 분리된 엠. 파세올리나 ms6의 분리물로부터 제조되었다. 생성된 뉴클레오티드 서열은 뉴블러 (Newbler) 어셈블러에 의해 콘틱 (contig) 및 스캐폴드 (scaffold)를 형성하도록 어셈블링되었다. 뉴클레오티드 서열을 먼저 추정적 암호화 영역, 인트론 및 스플라이스 접합을 확인할 수 있는 소프트웨어 프로그램, 예컨대 Augustus, Glimmer M (The Institute of Genome Research, Rockville, Md.) 및 Evidence Modeler (EVM)에 의해 주석하였다(annotated). 뉴클레오티드 서열에 대한 추가의 자동 및 수동 큐레이션 (curation)을 수행하여 암호화 영역의 정확한 특성화 및 다른 유전자 특성을 정의하고 확립하였다.
펙틴 분해 효소를 암호화하는 본 발명의 게놈 서열은 먼저 엠. 파세올리나 게놈 DNA의 뉴클레오티드 서열을 다른 미생물의 공지된 효소 유전자의 뉴클레오티드 서열과 비교함으로써 확인되었다. 이들 엠. 파세올리나 유전자의 뉴클레오티드 서열, 판독 프레임, 엑손 및 인트론의 위치, 효소의 구조 및 다양한 산업에서의 잠재적 유용성, 예컨대 식품 및 사료, 음료, 직물 및 세제의 제조 시 수반되는 것들은 알려진바 없었다.
엠. 파세올리나로부터의 14000개 이상의 cDNA가 부분적으로 또는 완전히 서열분석되었다. 이들 중 펙틴 분해에서 추정적 역할을 갖는 새로운 효소를 암호화하는 21개의 cDNA가 발견되었다.
개방 판독 프레임 (ORF)은 엠. 파세올리나 mRNA로부터 유래되는 cDNA 라이브러리 클론에 대한 하기의 완전 또는 부분적 서열분석에 의해 분석되며, 또한 서열 분석 소프트웨어를 이용함으로써 또한 데이터베이스 (공개/비공개) 내의 공지된 서열에 대한 상동성을 측정함으로써 더욱 분석된다.
이러한 기재와 관련하여, 본원의 전반에 걸쳐 사용되는 다수의 용어는, 달리 명시적으로 상이한 의미를 갖는 것으로 지시되지 않는 한, 지정된 의미를 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자"는 균류 엠. 파세올리나의 게놈 서열, 특히, 일련의 효소의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열로 정의된다. 이 용어는 또한 상부, 하부 및/또는 인트론 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함할 수 있다.
용어 "개방 판독 프레임 (ORF)"은 임의의 종결 코돈 없이 아미노산을 암호화하는 일련의 뉴클레오티드 삼중자를 의미하며, 삼중자 서열은 특정 생물에 대해 적합한 코돈 사용 정보를 사용하는 단백질로 해독된다.
"암호화 서열" 또는 "암호화 영역"은, 서열 발현시 유전자 생성물, 예컨대 아미노산 또는 폴리펩티드를 생성하는데 필요한 서열 정보를 갖는 핵산 분자를 지칭한다. 암호화 서열은 해독 영역 내에 비해독 서열 (예: 인트론 또는 5' 또는 3' 비해독 영역)을 포함할 수 있거나, 이러한 개재되는 비해독 서열 (예: cDNA에서와 같은 서열)이 결실될 수 있다.
본원에서 사용되는 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 핵산 단편이다. 폴리뉴클레오티드는, 임의로 합성, 비-천연 또는 변화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는, 단일- 또는 이중-가닥의 RNA 또는 DNA의 중합체일 수 있다. DNA의 중합체 형태인 폴리뉴클레오티드는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 또는 이들의 혼합물의 하나 이상의 단편으로 구성될 수 있다. 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 또한 서열번호 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59 및 62, 또는 이러한 서열의 보체로부터 유도될 수 있다.
"분리된"은 천연 상태로부터 "인위적으로" 변화되는 것을 의미한다. 조성물 또는 물질이 자연에 존재하는 경우, 변화되거나 최초 환경으로부터 제거되거나 변화 및 제거된다면, 이는 "분리된" 것이다. 예를 들어, 살아 있는 식물 또는 동물에서 천연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "분리되지" 않으나, 천연 상태의 공존하는 물질로부터 구분된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는, 본원에서 사용되는 바와 같이, "분리된" 것이다.
폴리펩티드 또는 단백질을 지칭하기 위해 본원에서 사용되는 용어 "재조합"은, 폴리펩티드 또는 단백질이 재조합 (예: 미생물성 또는 포유동물성) 발현 시스템으로부터 유도된다는 것을 의미한다. "미생물성"은 세균 또는 균류 발현 시스템에서 제조되는 재조합 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 대부분의 세균 시스템, 예를 들어, 에쉐리키아 콜라이 (Escherichia coli)에서 발현되는 폴리펩티드 또는 단백질은 글리코실화 변형이 없을 것이다; 균류에서 발현되는 폴리펩티드 또는 단백질은 글리코실화될 것이다.
용어 "벡터"는 뉴클레오티드 서열로부터 폴리펩티드를 발현시키기 위한 플라스미드, 파아지, 코스미드, 효모, 또는 바이러스, 인위적 복제 서열 (ARS) 또는 인위적 염색체를 지칭한다. 용어 "벡터"는 또한 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하고자 한다. 일 유형의 벡터는, 추가의 DNA 단편이 연결될 수 있는 원형의 이중-가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 단편이 바이러스 게놈에 결합될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 이러한 벡터가 도입되는 숙주 세포에서 자동 복제할 수 있다 (예: 세균 복제 기원을 갖는 세균 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터). 기타 벡터는 숙주 세포로 도입시 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있으며, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동적으로 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 "재조합 발현 벡터" (또는 "발현 벡터")라 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본원에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 형태의 벡터이기 때문에 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 동등한 기능을 하는 바이러스 벡터 (예: 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)를 포함하고자 한다.
용어 "발현 벡터"는 본원에서, 발현을 돕는 추가의 뉴클레오티드에 작동적으로 연결된, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 선형 또는 원형 DNA 분자로 정의된다.
용어 "발현 작제물"은, 유전자 발현시 조절 역할을 하는 유전 요소(들), 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서, 또는 RNA인 mRNA로 전사되고 단백질로 해독되며 프로모터 또는 적합한 전사 기재 및 종결 서열에 작동적으로 연결되는 암호화 서열의 어셈블리를 포함할 수 있다.
용어 "작동적으로 연결된"은, 조절 서열이 폴리펩티드의 암호화 서열의 발현을 지시하도록 조절 서열이 폴리뉴클레오티드 서열의 암호화 서열에 대해 적합한 위치에 위치되는 배열을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물 또는 발현 벡터를 사용한 형질전환, 형질감염, 형질도입 등에 민감한 임의의 세포 유형을 포함한다.
용어 "재조합 숙주 세포"는 일반적으로 재조합 전사 단위를 포함하는 배양된 세포를 의미하며, 이종 폴리펩티드 또는 단백질 및 재조합 전사 단위 중의 DNA 단편 또는 합성 유전자에 의해 암호화되는 RNA를 발현할 것이다. 상기 세포는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다.
본원에서 사용되는 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 함께 결합되고 100개 초과의 아미노산 길이의 서열을 갖는 아미노산의 단일 선형 쇄이다.
본원에서 사용되는 용어 "프로모터"는 다운스트림 유전자의 전사를 지시하도록 기능하는 핵산 서열을 지칭한다. 프로모터는 일반적으로 표적 유전자가 발현되는 숙주 세포에 적합할 것이다. 다른 전사 및 해독 조절 핵산 서열 (또한 "조절 서열"로도 불림)과 함께 프로모터는 주어진 유전자를 발현하는데 필수적이다. 일반적으로, 전사 및 해독 조절 서열은, 이로 제한됨이 없이, 프로모터 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 기재 및 정지 서열, 해독 기재 및 정지 서열 및 인핸서 또는 활성화제 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "시험관내"는, 살아있는 생물 바깥의 인위적 환경에서 일어나는 생물학적 반응을 지칭하며, 일반적으로 보다 구체적이거나 보다 편리한 분석의 수행이 가능하도록 하기 위하여 보통의 생물학적 배경으로부터 분리된 생물의 성분을 사용하여 실험실에서 통상 수행된다.
용어 "상동성 %"은 본원에서 용어 "동일성 %"와 상호교환적으로 사용되며, 일반적으로, 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬 시, 본 발명의 폴리펩티드 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 서열 또는 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열 사이의 핵산 또는 아미노산 서열 동일성의 수준을 지칭한다.
예를 들어, 본원에서 사용되는 바와 같이, 80% 상동성은 정의된 알고리즘에 의해 결정되는 80% 서열 동일성과 같은 것을 의미하며, 따라서 주어진 서열의 동족체는 주어진 서열의 길이에 걸쳐서 80% 초과의 서열 동일성을 갖는다. 서열 동일성의 예시적 수준은, 이로 제한됨이 없이, 주어진 서열, 예를 들어, 본원에 기재되는 본 발명의 폴리펩티드 중 어느 하나에 대한 암호화 서열에 대한 80, 85, 90, 95, 98% 이상의 서열 동일성을 포함한다.
2개의 서열 사이의 동일성을 결정하는데 사용될 수 있는 예시적 컴퓨터 프로그램은, 이로 제한됨이 없이, BLAST 프로그램 세트, 예를 들어, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST에 공개적으로 이용가능한 BLASTN, BLASTX, 및 TBLASTX, BLASTP 및 TBLASTN을 포함한다.
서열 조사는 전형적으로 GenBank DNA 서열 및 다른 공개된 데이터베이스의 핵산 서열과 비교하여 주어진 핵산 서열을 평가하는 경우 BLASTN 프로그램을 이용하여 수행된다. BLASTX 프로그램은 GenBank 단백질 서열 및 다른 공개된 데이터베이스의 아미노산 서열에 대해 모든 판독 프레임에서 해독되었던 핵산 서열을 조사하는데 선호된다.
2개 이상의 서열 사이의 "동일성 (%)"을 측정하기 위한 선택된 서열의 바람직한 정렬은, 예를 들어, CLUSTAL-W 프로그램을 이용하여 수행된다.
본원에서 사용되는 용어 "프라이머"는 표적 핵산 서열에 결합하고 핵산 합성을 프라이밍할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 본원에서 정의되는 바와 같은 증폭 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 10 내지 50개 뉴클레오티드 길이, 가장 바람직하게는 15 내지 25개 뉴클레오티드 길이일 것이다. 본 발명의 증폭 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 합성될 수 있다.
뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 지칭하기 위해 본 명세서 전반을 통해 사용되는 약어는 통상적인 1-문자 약어이다. 따라서, 천연 발생 암호화 뉴클레오티드는, 핵산에 포함되는 경우, 하기와 같이 약칭된다: 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C), 티민 (T) 및 우라실 (U). 또한, 달리 명시되지 않는 한, 본원에 제시되는 핵산 서열은 5'→ 3' 방향이다.
본원에서 사용되는 용어 "상보성" 또는 이의 파생어는 A는 T 또는 U와 짝을 짓고, C는 G와 짝을 짓는 잘 알려진 규칙에 의한 핵산의 짝짓기과 관련하여 사용된다. 보체는 "부분적" 또는 "완전한" 보체일 수 있다. 부분적 보체에서는 핵산 염기 중 단지 일부가 염기 짝짓기 규칙에 따라 매칭되며, 완전 보체에서는 모든 염기가 짝짓기 규칙에 따라 매칭된다. 핵산 가닥 사이의 보체의 정도는 당해 분야에 잘 알려진 바와 같이 핵산 가닥 사이의 하이브리드화의 효율 및 세기에 상당한 효과를 가질 수 있다. 이는 핵산 사이의 결합에 의존적인 검출 방법에서 특정될 수 있다.
본 발명의 DNA 서열은 반응물을 서열분석하여 생성되었으며, 잘못 확인된 뉴클레오티드로서 존재할 수 있는 가벼운 실수, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 그러나, 이러한 가벼운 실수는, 존재하는 경우, 산업적 관심 효소를 암호화하는 엠. 파세올리나의 유전자로서의 서열 확인을 방해하지 말아야 하며, 분명히 본 발명의 범위에 포함된다.
산업적 관심의 엠. 파세올리나의 효소를 암호화하는 유전자의 게놈 뉴클레오티드 서열 및 암호화 서열이 본 발명에 포함된다. 따라서, 하나의 구현예에서, 서열번호 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59 및 62, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물이 제공되며, 이들 각각은 확인된 유전자의 개방 판독 프레임 (ORF)의 뉴클레오티드 서열을 밝힌다. 또 다른 구현예에서, 서열번호 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 및 61, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물에 의해 확인되는 유전자의 게놈 서열이 제공된다.
본원에서 사용되는 "유전자"는 하기를 지칭한다: (i) 서열번호 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 및 61에 제시된 뉴클레오티드 서열 및/또는 이의 단편 중 하나 이상을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 유전자; (ii) 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 및 63에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편; (iii) 중간 (medium) 충실성 조건(stringency conditions), 예를 들어, 적합한/유효한 수준의 온도, 예컨대 (약) 45℃에서 적합한/유효한 양의 6x 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC) 중에서 필터-결합된 DNA에의 하이브리드 과정에 이어서, 적합한/유효한 양의 SDS, 예컨대 0.2x SSC/0.1% SDS에서 적합한/유효한 수준의 온도, 예컨대 (약) 50 내지 65℃에서 1회 이상의 세척 과정 조건, 또는 고도의 충실성 조건, 예를 들어, 적합한/유효한 수준의 온도, 예컨대 (약) 45℃에서 적합한/유효한 양의 SSC, 예컨대 6x SSC 중에서 필터-결합된 핵산에의 하이브리드 과정에 이어서, 적합한/유효한 양의 SDS, 예컨대 0.lx SSC/0.2% SDS에서 적합한/유효한 수준의 온도, 예컨대 (약) 68℃에서 1회 이상의 세척 과정 조건, 또는 당업자에게 분명한 다른 하이브리드화 조건 하에서 서열번호 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 및 61에 제시된 뉴클레오티드 서열의 보체에 하이브리드화하는 임의의 뉴클레오티드 서열 [참조: 예를 들어, Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K. Current Protocols in Molecular Biology, 1994; Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York]. 바람직하게는, 본원에 기재된 DNA 서열의 보체에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드는 유전자 생성물, 예를 들어, 효소 유전자 또는 이의 단편 중 하나에 의해 암호화되는 유전자 생성물과 기능적으로 동등한 유전자 생성물을 암호화한다.
상기 기재되는 바와 같이, 유전자 서열은 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 및 63의 아미노산 서열을 암호화하는 퇴화된 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 엠. 파세올리나 이외의 생물에서 해독시 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 및 63의 아미노산 서열 또는 이의 단편 중 하나를 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 퇴화된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 당업자는 엠. 파세올리나 또는 다른 생물에서 유전자 서열을 사용하는 경우 서열번호 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 및 61의 뉴클레오티드 서열의 적합한 코돈을 선택하거나 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 방법을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 칸디다 알비칸스 (Candida albicans)에서 코돈 CTG는 류신 잔기 대신 세린 잔기를 암호화한다.
본 발명의 뉴클레오티드 서열은 엠. 파세올리나 게놈의 유전적, 물리적 또는 서열 지도의 전개를 도울 유전자 마커 및/또는 서열 마커로서 사용될 수 있다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 유전자 생성물은 또한 엠. 파세올리나의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 당해 분야에 잘 알려진 하이브리드화 및 항체-기반 방법을 본 발명의 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 유전자 생성물의 존재 및 농도를 측정하는데 사용할 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 또한 효소가 감염 동안 숙주의 침입시 역할을 할 수 있다는 사실을 감안할 때, 치료의 효과를 가질 수 있는 효소의 억제제를 확인하는데 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 기재된 엠. 파세올리나의 뉴클레오티드 서열에 추가하여, 엠. 파세올리나 및 다른 균류 종에 존재할 수 있는 본 발명의 유전자의 동족체 또는 오솔로그 (ortholog)도 포함된다. 사상균에서의 동족체 또는 오솔로그가 특히 바람직하다. 이들 효소 유전자는 당해 분야에 잘 알려진 분자 생물학적 기술로 확인되고 분리될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "균류"는 문(phyla) 아스코미코타 (Ascomycota), 바시디오미코타 (Basidiomycota), 치트리디오미코타 (Chytridiomycota) 및 지고미코타 (Zygomycota) [Hawksworth DL, Kirk PM, Sutton BC, Pegler DN. Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi (8th Ed.). 1995; CAB International, Wallingford, United Kingdom. 616p] 및 효모를 포함한다. 아스코미코타의 대표적인 그룹은, 예를 들어, 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움 (Penicillium), 아스페길루스 (Aspergillus)를 포함한다. 바시디오미코타의 대표적인 그룹은 버섯, 러스트 (rust) 및 스머트 (smut)를 포함하다. 치트리디오미코타의 대표적인 그룹은 알로마이세스 (Allomyces), 블라스토클라디엘라 (Blastocladiella), 코엘로모마이세스 (Coelomomyces)를 포함한다. 지고미코타의 대표적인 그룹은, 예를 들어, 리조푸스 (Rhizopus) 및 무코르 (Mucor)를 포함한다.
용어 "사상균"은 모든 실 모양의 균류를 포함한다. 사상균은 키틴, 셀룰로즈, 글루칸, 치토산, 만난 및 다른 착물 폴리사카이드로 구성되는 영양 균사체로 특징지어진다. 식물 생장은 균사 신장에 의하며, 탄소 대사는 완전 호기성이다.
따라서, 본 발명은 또한 유전자의 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화 가능한 진균성 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 서열번호 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 및 61, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열과 50% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 분리된 핵산을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 및 61, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지고/지거나 이들을 포함하는 제2 핵산에 대해 중간 충실성 조건 하에 하이브리드화하는 진균성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 및 63을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열과 50% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 진균성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 포함한다.
본 발명의 뉴클레오티드 서열은 또한 서열번호 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 및 61에 제시된 뉴클레오티드 서열과 40% 이상 동일한 진균성 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
상동성 유전자를 분리하기 위하여, 상기 기재된 엠. 파세올리나 유전자 서열은 표지될 수 있으며, 엠. 파세올리나를 포함하고 이로 제한되지 않는 관심 생물로부터 수득되는 mRNA로부터 작제되는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 따라서, 서열번호 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 및 61의 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것으로 이루어지고 바람직하게는 검출가능하게 표지된 핵산 프로브가 포함된다. 하이브리드화 조건은, cDNA 라이브러리가 표지된 서열이 유도되는 생물의 유형과 상이한 생물로부터 유래되는 경우, 바람직하게는 더 낮은 충실성일 수 있다. cDNA 스크리닝은 또한 동일한 종에서 대안적으로 스플라이싱되는 전사체로부터 유래되는 클론을 확인할 수 있다. 대안적으로, 표지된 프로브는 다시 적당히 충실성 조건을 이용하여 관심 생물로부터 유래되는 게놈 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 낮은 충실성 조건은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 라이브러리 및 표지된 서열이 유도되는 특정 생물에 의존적으로 예측가능하게 다양할 것이다 [Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third edition, 2001, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; and Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K. Current Protocols in Molecular Biology,1994;Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York].
또한, 상동성 유전자 서열은 관심 유전자 내의 아미노산 서열에 기초하여 디자인된 2개의 퇴화성 올리고뉴클레오티드 프라이머 풀을 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행함으로써 분리될 수 있다. 반응을 위한 주형은 관심 생물로부터 제조되는 mRNA의 역전사에 의해 수득되는 cDNA일 수 있다. PCR 생성물은 증폭된 서열이 상동성 효소 유전자 서열의 서열을 나타낸다는 것을 확인하기 위해 서브-클로닝되고 서열분석될 수 있다.
이어서, PCR 단편은 당업자에게 잘 알려진 다양한 방법에 의해 전장 cDNA 클론을 분리하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 표지된 단편이 게놈 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 엠. 파세올리나 유전자 서열은 특히 바람직한 화학적 및/또는 물리적 특성을 나타내는 변형된 또는 신규한 효소를 개발하는데 사용될 수 있다. 엠. 파세올리나 및 다른 사상균의 효소 사이의 아미노산 서열의 뚜렷한 관련성/유사성 때문에, 또 다른 균류의 효소의 구조가 엠. 파세올리나 효소의 구조를 예측하는데 사용될 수 있고, 유용하고 뛰어난 특성을 위해 엠. 파세올리나 효소를 합리적으로 변형시키는데 도움이 된다. 본 발명에 의해 제공되는 서열은 또한 효소가 요구되는 과정을 더욱 잘 수행할 수 있게 하는 특성을 갖는 신규한 효소의 합리적인 변형 또는 디자인을 위한 예비적 물질로서 사용될 수 있다.
유전자 뉴클레오티드 서열은 무작위 및 부위-지정된 돌연변이유발 기술 또는 지정된 분자 진화 (evolution) 기술, 예컨대, 비제한적으로, 문헌 [Arnold FH. Protein engineering for unusal environments. Curr. Opinion Biotechnol. 1993;4:450-455]에 기재된 방법, 올리고뉴클레오티드-지정된 돌연변이유발 [Reidhaar-Olson JF, Sauer RT. Combinatorial cassette mutagenesis as a probe of the informational content of protein sequences. Science, 1988; 241:53-57], 화학적 돌연변이유발 [Eckert KA, Drinkwater NR. recA-dependent and recA-independent N-ethyl-N-nitrosourea mutagenesis at a plasmid-encoded herpes simplex virus thymidine kinase gene in E. coli. Mutat Res. 1987;178:1-10], 부위-지정된 돌연변이유발 [Kunkel TA. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985;82:488-492; Oliphant A, Nussbaum AL, Struhl K. Cloning of random-sequence oligodeoxynucleotides. Gene 1986;44 177-183], 오류 유발 PCR (error prone PCR) [Cadwell RC, Joyce GF. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods Appl. 1992;2:28-33], 카세트 돌연변이유발 [Stauss Hj, Davies H, Sadovnikova E, Chain B, Horowitz N, Sinclair C. Induction of cytotoxic T lymphocytes with peptides in vitro: identification of candidate T-cell epitopes in human papilloma virus. PNAS 1992; 89(17): 7871-7875], DNA 셔플링 방법 [Stemmer WP. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution. PNAS 1994;91(22):10747-10751; and U.S. Pat. Nos. 5,605,793; 6,117,679; and 6,132,970] 및 미국 특허번호 5,939,250, 5,965,408, 6,171,820 기재된 방법에 의해 변화될 수 있다. 뉴클레오티드 서열 내 돌연변이는 클론 내 유전자를 서열분석함으로써 측정될 수 있다.
하나의 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 747 bp 길이의 폴리뉴클레오티드는 약 26 kD의 계산된 분자량을 갖는, 서열번호 3에서와 같은 248개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 나타내는 펙테이트 리아제 단백질을 암호화한 전장 cDNA 클론이다. 서열번호 2의 SMART 분석 시, 서열 내에 Pfam 펙테이트 리아제 도메인의 존재를 나타낸다. 펙테이트 리아제는 펙테이트의 제거 절단에 촉매작용을 미치는 비-환원 말단에 4-데옥시-알파-D-gluc-4-에누로노실 그룹을 갖는 올리고사카라이드를 생성하는 세포외 효소이다. 이러한 효소는 펙틴의 분해에 관여된다.
바람직하게는, 서열번호 5에 제시된 735 bp 길이의 폴리뉴클레오티드는 약 25 kD의 계산된 분자량을 갖는, 서열번호 6에서와 같은 244개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 나타내는 펙테이트 리아제 단백질을 암호화한 전장 cDNA 클론이다. 서열번호 5의 SMART 분석 시, 서열 내에 Pfam 펙테이트 리아제 도메인의 존재를 나타낸다. 펙테이트 리아제는 펙테이트의 제거 절단에 촉매작용을 미치는 비-환원 말단에 4-데옥시-알파-D-gluc-4-에누로노실 그룹을 갖는 올리고사카라이드를 생성하는 세포외 효소이다. 이러한 효소는 펙틴의 분해에 관여된다.
유사하게, 또 다른 구현예에서, 서열번호 8에 제시된 756 bp 길이의 폴리뉴클레오티드는 약 26 kD의 계산된 분자량을 갖는, 서열번호 9에서와 같은 251개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 나타내는 펙테이트 리아제 단백질을 암호화한 전장 cDNA 클론이다. 서열번호 8의 SMART 분석 시, 서열 내에 Pfam 펙테이트 리아제 도메인의 존재를 나타낸다. 펙테이트 리아제는 펙테이트의 제거 절단에 촉매작용을 미치는 비-환원 말단에 4-데옥시-알파-D-gluc-4-에누로노실 그룹을 갖는 올리고사카라이드를 생성하는 세포외 효소이다. 이러한 효소는 펙틴의 분해에 관여된다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 11에 제시된 771 bp 길이의 폴리뉴클레오티드는 약 27 kD의 계산된 분자량을 갖는, 서열번호 12에서와 같은 256개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 나타내는 펙테이트 리아제 단백질을 암호화한 전장 cDNA 클론이다. 서열번호 11의 SMART 분석 시, 서열 내에 Pfam 펙테이트 리아제 도메인의 존재를 나타낸다. 펙테이트 리아제는 펙테이트의 제거 절단에 촉매작용을 미치는 비-환원 말단에 4-데옥시-알파-D-gluc-4-에누로노실 그룹을 갖는 올리고사카라이드를 생성하는 세포외 효소이다. 이러한 효소는 펙틴의 분해에 관여된다.
추가의 또 다른 구현예에서, 서열번호 14에 제시된 750 bp 길이의 폴리뉴클레오티드는 약 26 kD의 계산된 분자량을 갖는, 서열번호 15에서와 같은 249개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 나타내는 펙테이트 리아제 단백질을 암호화한 전장 cDNA 클론이다. 서열번호 14의 SMART 분석 시, 서열 내에 Pfam 펙테이트 리아제 도메인의 존재를 나타낸다. 펙테이트 리아제는 펙테이트의 제거 절단에 촉매작용을 미치는 비-환원 말단에 4-데옥시-알파-D-gluc-4-에누로노실 그룹을 갖는 올리고사카라이드를 생성하는 세포외 효소이다. 이러한 효소는 펙틴의 분해에 관여된다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 17에 제시된 756 bp 길이의 폴리뉴클레오티드는 약 26 kD의 계산된 분자량을 갖는, 서열번호 18에서와 같은 251개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 나타내는 펙테이트 리아제 단백질을 암호화한 전장 cDNA 클론이다. 서열번호 17의 SMART 분석 시, 서열 내에 Pfam 펙테이트 리아제 도메인의 존재를 나타낸다. 펙테이트 리아제는 펙테이트의 제거 절단에 촉매작용을 미치는 비-환원 말단에 4-데옥시-알파-D-gluc-4-에누로노실 그룹을 갖는 올리고사카라이드를 생성하는 세포외 효소이다. 이러한 효소는 펙틴의 분해에 관여된다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 20에 제시된 894 bp 길이의 폴리뉴클레오티드는 약 30 kD의 계산된 분자량을 갖는, 서열번호 21에서와 같은 297개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 나타내는 펙테이트 리아제 단백질을 암호화한 전장 cDNA 클론이다. 서열번호 20의 SMART 분석 시, 서열 내에 Pfam 펙테이트 리아제 도메인의 존재를 나타낸다. 펙테이트 리아제는 펙테이트의 제거 절단에 촉매작용을 미치는 비-환원 말단에 4-데옥시-알파-D-gluc-4-에누로노실 그룹을 갖는 올리고사카라이드를 생성하는 세포외 효소이다. 이러한 효소는 펙틴의 분해에 관여된다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 23에 제시된 747 bp 길이의 폴리뉴클레오티드는 약 26 kD의 계산된 분자량을 갖는, 서열번호 24에서와 같은 248개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 나타내는 펙테이트 리아제 단백질을 암호화한 전장 cDNA 클론이다. 서열번호 23의 SMART 분석 시, 서열 내에 Pfam 펙테이트 리아제 도메인의 존재를 나타낸다. 펙테이트 리아제는 펙테이트의 제거 절단에 촉매작용을 미치는 비-환원 말단에 4-데옥시-알파-D-gluc-4-에누로노실 그룹을 갖는 올리고사카라이드를 생성하는 세포외 효소이다. 이러한 효소는 펙틴의 분해에 관여된다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 26에 제시된 1707 bp 길이의 폴리뉴클레오티드는 약 64 kD의 계산된 분자량을 갖는, 서열번호 27에서와 같은 568개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 나타내는 펙테이트 리아제 단백질을 암호화한 전장 cDNA 클론이다. 서열번호 26의 SMART 분석 시, 서열 내에 Pfam 펙테이트 리아제 도메인의 존재를 나타낸다. 펙테이트 리아제는 펙테이트의 제거 절단에 촉매작용을 미치는 비-환원 말단에 4-데옥시-알파-D-gluc-4-에누로노실 그룹을 갖는 올리고사카라이드를 생성하는 세포외 효소이다. 이러한 효소는 펙틴의 분해에 관여된다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 29에 제시된 1314 bp 길이의 폴리뉴클레오티드는 약 46 kD의 계산된 분자량을 갖는, 서열번호 30에서와 같은 437개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 나타내는 펙테이트 리아제 C 단백질을 암호화한 전장 cDNA 클론이다. 서열번호 29의 SMART 분석 시, 서열 내에 펙테이트 리아제 C 도메인 모티프의 존재를 나타낸다. 펙테이트 리아제 C는 식물 세포벽의 주요 성분인 폴리갈락투로네이트를 절단하는 세포외 효소이다. 이러한 효소는 펙틴의 분해에 관여된다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 32에 제시된 972 bp 길이의 폴리뉴클레오티드는 약 34 kD의 계산된 분자량을 갖는, 서열번호 33에서와 같은 323개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 나타내는 펙테이트 리아제 C 단백질을 암호화한 전장 cDNA 클론이다. 서열번호 32의 SMART 분석 시, 서열 내에 펙테이트 리아제 C 도메인 모티프의 존재를 나타낸다. 펙테이트 리아제 C는 식물 세포벽의 주요 성분인 폴리갈락투로네이트를 절단하는 세포외 효소이다. 이러한 효소는 펙틴의 분해에 관여된다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 35에 제시된 966 bp 길이의 폴리뉴클레오티드는 약 33 kD의 계산된 분자량을 갖는, 서열번호 36에서와 같은 321개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 나타내는 펙테이트 리아제 C 단백질을 암호화한 전장 cDNA 클론이다. 서열번호 35의 SMART 분석 시, 서열 내에 펙테이트 리아제 C 도메인 모티프의 존재를 나타낸다. 펙테이트 리아제 C는 식물 세포벽의 주요 성분인 폴리갈락투로네이트를 절단하는 세포외 효소이다. 이러한 효소는 펙틴의 분해에 관여된다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 38에 제시된 1536 bp 길이의 폴리뉴클레오티드는 약 56 kD의 계산된 분자량을 갖는, 서열번호 39에서와 같은 511개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 나타내는 펙테이트 리아제 C 단백질을 암호화한 전장 cDNA 클론이다. 서열번호 38의 SMART 분석 시, 서열 내에 펙테이트 리아제 C 도메인 모티프의 존재를 나타낸다. 펙테이트 리아제 C는 식물 세포벽의 주요 성분인 폴리갈락투로네이트를 절단하는 세포외 효소이다. 이러한 효소는 펙틴의 분해에 관여된다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 41에 제시된 1137 bp 길이의 폴리뉴클레오티드는 약 39 kD의 계산된 분자량을 갖는, 서열번호 42에서와 같은 378개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 나타내는 펙테이트 리아제 C 단백질을 암호화한 전장 cDNA 클론이다. 서열번호 41의 SMART 분석 시, 서열 내에 펙테이트 리아제 C 도메인 모티프의 존재를 나타낸다. 펙테이트 리아제 C는 식물 세포벽의 주요 성분인 폴리갈락투로네이트를 절단하는 세포외 효소이다. 이러한 효소는 펙틴의 분해에 관여된다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 44에 제시된 1137 bp 길이의 폴리뉴클레오티드는 약 39 kD의 계산된 분자량을 갖는, 서열번호 45에서와 같은 378개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 나타내는 펙테이트 리아제 C 단백질을 암호화한 전장 cDNA 클론이다. 서열번호 44의 SMART 분석 시, 서열 내에 펙테이트 리아제 C 도메인 모티프의 존재를 나타낸다. 펙테이트 리아제 C는 식물 세포벽의 주요 성분인 폴리갈락투로네이트를 절단하는 세포외 효소이다. 이러한 효소는 펙틴의 분해에 관여된다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 47에 제시된 1182 bp 길이의 폴리뉴클레오티드는 약 42 kD의 계산된 분자량을 갖는, 서열번호 48에서와 같은 393개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 나타내는 펙틴에스테라제 단백질을 암호화한 전장 cDNA 클론이다. 서열번호 47의 SMART 분석 시, 서열 내에 펙틴에스테라제 도메인의 존재를 나타낸다. 펙틴에스테라제는 펙틴 물질의 갈락투로난 골격에 있는 메틸 에스테르 연결의 탈-에스테르화를 촉매하여 산성 펙틴 및 메탄올을 생성하는 세포외 효소이다. 생성된 펙틴은 이어서 폴리갈락투로나제 및 리아제에 의해 처리된다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 50에 제시된 975 bp 길이의 폴리뉴클레오티드는 약 35 kD의 계산된 분자량을 갖는, 서열번호 51에서와 같은 324개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 나타내는 펙틴에스테라제 단백질을 암호화한 전장 cDNA 클론이다. 서열번호 50의 SMART 분석 시, 서열 내에 펙틴에스테라제 도메인의 존재를 나타낸다. 펙틴에스테라제는 펙틴 물질의 갈락투로난 골격에 있는 메틸 에스테르 연결의 탈-에스테르화를 촉매하여 산성 펙틴 및 메탄올을 생성하는 세포외 효소이다. 생성된 펙틴은 이어서 폴리갈락투로나제 및 리아제에 의해 처리된다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 53에 제시된 5895 bp 길이의 폴리뉴클레오티드는 약 206 kD의 계산된 분자량을 갖는, 서열번호 54에서와 같은 1964개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 나타내는 펙틴에스테라제 단백질을 암호화한 전장 cDNA 클론이다. 서열번호 53의 SMART 분석 시, 서열 내에 다수의 펙틴에스테라제 도메인의 존재를 나타낸다. 펙틴에스테라제는 펙틴 물질의 갈락투로난 골격에 있는 메틸 에스테르 연결의 탈-에스테르화를 촉매하여 산성 펙틴 및 메탄올을 생성하는 세포외 효소이다. 생성된 펙틴은 이어서 폴리갈락투로나제 및 리아제에 의해 처리된다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 56에 제시된 981 bp 길이의 폴리뉴클레오티드는 약 34 kD의 계산된 분자량을 갖는, 서열번호 57에서와 같은 326개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 나타내는 펙틴에스테라제 단백질을 암호화한 전장 cDNA 클론이다. 서열번호 56의 SMART 분석 시, 서열 내에 펙틴에스테라제 도메인의 존재를 나타낸다. 펙틴에스테라제는 펙틴 물질의 갈락투로난 골격에 있는 메틸 에스테르 연결의 탈-에스테르화를 촉매하여 산성 펙틴 및 메탄올을 생성하는 세포외 효소이다. 생성된 펙틴은 이어서 폴리갈락투로나제 및 리아제에 의해 처리된다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 59에 제시된 1593 bp 길이의 폴리뉴클레오티드는 약 57 kD의 계산된 분자량을 갖는, 서열번호 60에서와 같은 530개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 나타내는 람노갈락투로나제 단백질을 암호화한 전장 cDNA 클론이다. 서열번호 59의 SMART 분석 시, 서열 내에 람노갈락투로나제 도메인의 존재를 나타낸다. 람노갈락투로나제는 식물 세포벽 폴리사카라이드 펙틴의 주요 성분인 람노갈락투로난-I의 골격 내 L-람노즈와 D-갈락투론산 사이의 알파-1,4 글리코사이드 결합을 절단한다.
또 다른 구현예에서, 서열번호 62에 제시된 1605 bp 길이의 폴리뉴클레오티드는 약 57 kD의 계산된 분자량을 갖는, 서열번호 63에서와 같은 534개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 나타내는 람노갈락투로나제 단백질을 암호화한 전장 cDNA 클론이다. 서열번호 62의 SMART 분석 시, 서열 내에 람노갈락투로나제 도메인의 존재를 나타낸다. 람노갈락투로나제는 식물 세포벽 폴리사카라이드 펙틴의 주요 성분인 람노갈락투로난-I의 골격 내 L-람노즈와 D-갈락투론산 사이의 알파-1,4 글리코사이드 결합을 절단한다.
본 발명은 또한 (a) 유전자의 상기의 서열 및/또는 이들의 보체 중 임의의 것을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 핵산 벡터; (b) 암호화 서열의 발현을 지시하는 조절 요소에 작동적으로 연결된 유전자에 대한 상기의 암호화 서열 중 임의의 것으로 이루어지고/지거나 이들을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 작제물; 및 (c) 숙주 세포에서 암호화 서열의 발현을 지시하는 조절 요소에 작동적으로 연결된 암호화 영역을 포함하는 유전자의 상기 서열 중 임의의 것을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.
재조합 DNA 방법을 이용하여 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키기 위한 기술은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 다양한 서열을 공지된 기술, 예컨대 제한, 상보적 제한 부위의 연결 및 결합, 돌출부 메우기에 의한 비첨착 말단화(blunt ending) 및 비점착말단 연결(blunt ligation) 등에 따라 연결될 수 있다. 폴리 링커 및 어댑터를 적절한 때에 사용하고 공지된 기술에 의해 도입 또는 제거하여 DNA 벡터 및 발현 작제물의 조립을 용이하게 할 수 있다. 다수의 벡터가 클로닝 및 유전자 조작에 사용가능하다. 일반적으로, 클로닝은 이. 콜라이에서 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 효소 유전자 서열을 포함하는 벡터는 이. 콜라이 세포, 사상균 세포, 효모 세포 및 바실러스 세포를 포함하고 이로 제한되지 않는 하나 이상의 숙주 세포에서 벡터의 전달, 유지 및 증식을 가능하게 하는 복제 기능을 추가로 포함할 수 있다. 벡터는 자가-복제를 보증하기 위한 임의의 수단을 포함할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 숙주 세포로 도입시 게놈으로 통합되고 통합된 염색체와 함께 복제되는 것일 수 있다. 벡터의 선택은 벡터가 도입되는 숙주 세포와 벡터의 양립성(compatibility)에 통상적으로 의존할 것이다.
본 발명의 발현 작제물은 프로모터, 본 발명의 유전자 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 전사 종결 서열 및 선별 마커 (선택적)를 포함하고/하거나 이들로 이루어진다. 이러한 발현 작제물을 숙주 세포로 도입하기 위한 당해 분야에 알려진 임의의 방법이 이용될 수 있다. 균류 세포는 원형질체 형성, 원형질체 형질전환 및 세포벽 재생을 수반하는 과정에 의해 자체적으로 공지된 방식으로 형질전환될 수 있다. 아스퍼길루스 및 트리초더마 숙주 세포의 형질전환을 위한 적합한 절차가 하기 문헌에 기재되어 있다 [EP 238 023 and Yelton MM, Hames JE, Timberlake WE. Transformation of Aspergillus nidulans by using a trpC plasmid. PNAS,1984; 81(5):1470-1474]. 푸사리움 종을 형질전환시키기 위한 적합한 방법은 하기 문헌에 기재되어 있다 [Malardier L, Daboussi MJ, Julien J, Roussel F, Scazzocchio C, Brygoo Y. Cloning of the nitrate reductase gene (niaD) of Aspergillus nidulans and its use for transformation of Fusarium oxysporum. Gene 1989; 78:147-156; WO 96/00787]. 효모는 하기 문헌에 기재되는 절차를 이용하여 형질전환될 수 있다 [Becker DM, Guarente L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation. In: Abelson JN and Simon MI (eds), Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology,1991;194:182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. Journal of Bacteriology, 1983;153: 163-168 and Hinnen A, Hicks JB, Fink GR. Transformation of yeast. PNAS, 1978; 75 (4):1929-1933].
산업적 적용을 위해, 본 발명의 효소는 균류 세포에 의해 생성된다. 바람직하게는 발현 숙주 세포는 대규모의 산업적 발효에 사용되어온 사상균 세포이다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현되는 외인성 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장하도록 선택될 수 있다. 바람직하게는, 발현 숙주의 내인성 단백질을 효과적으로 분비할 수 있는 발현 숙주가 선택된다. 숙주 세포는 또한 분비되는 효소가 배양 배지에서 분해될 수 있으므로 세포외 프로테아제 활성에서 결함에 대하여 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 방법에 관한 것으로서, (i) 야생형 형태로 상기 폴리펩티드를 생성할 수 있는 세포를 폴리펩티드의 생성을 유도하는 조건 하에 배양하는 단계; 및 (ii) 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 세포는 엠. 파세올리나이다.
본 발명의 또 다른 구현예는 또한 본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 방법에 관한 것으로서, (i) 숙주 세포를 상기 폴리펩티드의 생성을 유도하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및 (ii) 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하고, 이때 상기 숙주 세포는 서열번호 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 또는 61의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 또는 63의 성숙한 폴리펩티드를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드를 암호화한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 발현 숙주 세포 또는 형질전환체는 당해 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 단백질의 성장 및 발현에 적합한 영양 배지 중에서 배양된다. 예를 들어, 세포는 진동 플라스크 배양, 및 적합한 배지 및 폴리펩티드가 발현되고/되거나 분리될 수 있게 하는 조건 하에서 수행되는 실험실 또는 산업적 발효기에서의 소규모 또는 대규모 발효 (연속식, 회분식, 유가식 또는 고체 상태 발효)에 의해 배양될 수 있다. 배양은 당해 분야에 알려진 절차를 이용하여 탄소 및 질소 공급원 및 무기 염을 포함하는 적합한 배양 배지에서 수행한다 [참조: More Gene Manipulations in Fungi. Bennett J W, Lasure L., (eds). 1991; Academic Press, San Diego, CA]. 폴리펩티드가 영양 배지에 분비되는 경우, 폴리펩티드는 배지로부터 직접적으로 회수될 수 있다. 폴리펩티드가 배지로 분비되지 않는 경우, 이는 세포 용해물로부터 회수될 수 있다.
폴리펩티드는 이에 대해 특정한 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 이들 검출 방법은 특이적 항체의 사용, 효소 생성물의 형성 또는 효소 기질의 소실을 포함할 수 있다. 효소 검정은 폴리펩티드의 활성을 측정하는데 이용될 수 있다.
생성된 폴리펩티드는 당해 분야에 알려진 방법을 이용하여 회수될 수 있다. 폴리펩티드는, 이로 제한됨이 없이, 여과, 원심분리, 추출, 분무-건조, 증발 및 침전 또는 이의 조합을 포함한 통상의 절차에 의해 영양 배지로부터 다양한 방법으로 회수될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는, 이로 제한됨이 없이, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 수독하기 위한 크로마토그래피 방법 (예: 이온 교화, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱 및 크기별 제외), 전기영동 절차 (예: 등전점 맞춤), 차별적 용해도 (예: 황산암모늄 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함한 당해 분야에 잘 알려진 다양한 절차에 의해 정제될 수 있다 [참조: Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications. Janson JC, Ryden L. (eds(). 1989; VCH Publishers Inc., New York].
본 발명은 또한 서열번호 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59 및 62에 제시된 유전자 서열에 의해 암호화되는 유전자 생성물 (예: RNA 또는 단백질)에 관한 것이다. 본 발명의 효소 유전자 생성물은 또한 서열번호 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 및 61에 제시된 유전자의 게놈 서열에 의해 암호화되는 RNA 또는 단백질을 포함한다. 본 발명의 효소는 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 및 63을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 효소는 펙테이트 리아제, 펙테이트 리아제 C, 펙틴에스테라제 및 람노갈락투로나제를 포함하고/하거나 이들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 효소의 활성 중 하나 이상을 나타낸다. 본 발명의 효소 유전자 생성물은, 예를 들어, 당해 분야에 널리 알려진 합성 기술에 의해 또는 재조합 DNA 기술 방법에 의해 쉽게 생성될 수 있다 [참조: Creighton TE. Proteins: Structures and Molecular Principles, 1983; W. H. Freeman and Co., N.Y.].
또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 또한 기능적으로 동등한 유전자 생성물을 나타내는 단백질 및 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 기능적으로 동등한 유전자 생성물은, 이로 제한됨이 없이, 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 및 63에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 천연 변이체를 포함함다.
이러한 동등한 유전자 생성물은, 예를 들어, 상기 기재된 효소 유전자 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열 내 아미노산 잔기의 결실, 첨가 또는 치환을 포함할 수 있으나, 이는 침묵 변화(silent change)를 초래함으로써 기능적으로 동등한 생성물을 생성한다. 아미노산 치환은 관여되는 잔기의 극성, 하전, 가용성, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽성의 유사함에 기초하여 이루어질 수 있다.
상기 기재된 유전자 생성물 암호화 서열에 대한 다른 변형이 선택된 숙주 세포에서, 예를 들어, 발현, 규모 확대 등에 적합한 폴리펩티드를 생성하기 위해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기는 이황화물 브릿지를 제거하기 위해 결실되거나 또 다른 아미노산으로 대체될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예는 추가로 고체 형태의 본 발명의 효소를 포함한다. 고체 형태의 효소 또는 효소 과립물은, 예를 들어, 고체 세제 및 동물 사료에 사용될 수 있다. 고체 형태의 효소를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 이로 제한됨이 없이, 프릴링 (prilling) (왁스 물질 중 분무-냉각), 압출, 응집화, 또는 과립화 (불활성 물질 및 결합제로 희석)를 포함한다. 고체 형태의 본 발명의 효소를 포함하는 혼합된 분말, 정제 등의 형태의 고체 효소 조성물이 고려된다.
본원은 이전에 설명에 포함된 내용들 뿐만 아니라, 첨부된 특허청구범위에 포함된 기재내용을 포함한다. 비록 본 발명은 차별성을 갖는 바람직한 형태로 기재되었지만, 바람직한 형태의 본원 개시내용은 단지 예시로써 주어진 것이며 본 발명의 범위 및 특허청구범위를 벗어나지 않으면서 상세한 구성 및 부분들의 조합 및 배열에서 수많은 변화를 가할 수 있을 것으로 이해된다.
다양한 참조문헌이 본원에 인용되며, 이의 기재내용은 전부 참조로 포함된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 본원에 기재된 특정 구현예로 제한하려는 어떠한 의도 없이 본 발명을 추가로 설명하기 위한 것이다.
실시예 1: 엠. 파세올리나로부터 게놈 DNA의 분리
게놈 DNA를 하기 문헌에 기재되는 절차를 이용하여 엠. 파세올리나 균주 ms6으로부터 분리하였다 [Kieser T, Bibb MJ, Buttner MJ, Chater KF, Hopwood DA. Practical Streptomyces Genetics, 2000; John Innes Foundation, Norwich, UK, pp. 162-208]. 간단히 설명하면, 균사를 접종 루프를 사용하여 스톡 페트리 플레이트로부터 긁어내고, 삼각 플라스크 중의 액체 감자-덱스트로즈 배지에 접종하였다. 삼각 플라스크를 약 72시간 동안 30℃에서 진동시키지 않으면서 항온처리하였다. 균사는 공기-배지 계면의 표면에서 성장한다. 균사를 멸균 이쑤시개를 사용하여 수거하고, 멸균 종이 타올 사이에 놓고, 생리학적 용액 (인산나트륨 완충액 pH 7.0)으로 수회 세척하였다. 균사를 압착하여 과량의 액체를 제거하고, 수거된 균사를 30분 동안 공기 건조시켰다. 반-건조 균사를, 하기 문헌에 기재된 프로토콜에 따라, 액체 질소 중에 넣고 분쇄하여 미세한 분말을 생성하고 최종적으로 DNA를 분리하였다 [Kieser T, Bibb MJ, Buttner MJ, Chater KF, Hopwood DA. Practical Streptomyces Genetics, 2000; John Innes Foundation, Norwich, UK, pp. 162-208].
실시예 2: 프라이머의 설계 및 합성
본 연구에 사용된 프라이머는 서열을 완전 ORF로 수동으로 선택함으로써 엠. 파세올리나 ms6 균주의 게놈 서열로부터 예측되는 수동으로 큐레이트된 전사체 및 "유전자 모델"로부터 설계하거나, 유사한 유전자가 다른 식물로부터 성공적으로 분리된 데이터베이스를 사용하여 설계되었다. 전사체로부터 수득된 뉴클레오티드 서열의 비교를 통한 생물정보 분석을 NCBI BLAST, BLASTP, RPS-BLAST, BLASTX 및 PSI-BLAST를 이용하여 수행함으로써 관련 유전자의 동족체를 확인하고 유전자의 적합한 확인을 위한 것이었다. 뉴클레오티드 서열 정렬은 다수의 서열들이 "유전자 풀"로부터 발견될 때마다 clustalW 버젼 1.82을 이용하여 수행하였다. 이어서, 정렬을 편집하였다. 유전자 특이적 프라이머 (전방 및 역방 모두)는 수동적으로 또는 Primer 3 플러스 툴을 통해 선택하고, 프라이머를 주문-합성하였다.
본 연구에 사용된 모든 올리고뉴클레오티드는 합성되었으며 공급자에 의해 HPLC 정제되었으며 IDT (Integrated DNA Technologies )로부터 입수되었다. 100 pmol의 스톡 용액을 오토클레이드된 ddH2O 중에서 제조하고, 사용을 위해 분액으로서 -20℃에서 저장하였다.
PCR 용 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드 서열
Figure pct00001
Figure pct00002

실시예 3: 엠. 파세올리나 ms6 으로부터 펙테이트 리아제 , 펙테이트 리아제 C, 펙틴에스테라제 및 람노갈락투로나제의 증폭, 클로닝 및 서열분석
총 RNA를 하기 문헌에서 이전에 기재된 바와 같이 액체 배지에서 성장된 3일된 균사로부터 분리하였다 [Chomczynski P and Sacchi N, Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction (Anal Biochem 1987, 162: 156-159)]. RNA의 품질 또는 온전함을 아가로즈 겔 전기영동으로 점검하고, 표준 절차에 따라 Thermo Scientific Nano Drop 2000을 사용하여 정량화하였다. cDNA 제1 가닥을 제조자의 교시에 따라 SuperScript III 역전사효소 (Invitrogen)를 사용하여 합성하였다. 유전자를 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 cDNA로부터 증폭시켰다. PCR 반응물 (50μL)은 1 μL의 cDNA, 20 pmole의 각각의 프라이머, 5 μL의 10X PCR 완충액, 5 μL의 2.5 mM dNTP 혼합물 및 1.0 단위의 PfuTaq DNA 폴리머라제를 포함하였다. PCR은 하기 조건을 이용하여 Thermal Cycler (Applied Biosystems)에서 수행하였다: 5분 ("min") 동안 95℃에서 초기 변성, 이어서 35회 사이클의 95℃에서 30초 ("sec") 동안의 변성, 59 내지 61℃에서 30초 동안의 어닐링 및 72℃에서 1 내지 2.0분 동안 연장 (표적 유전자의 길이에 의존), 72℃에서 7분 동안 최종 연장. PCR 생성물을 1% 아가로즈 겔에 의해 1XTAE 완충액을 사용하여 분석하고, 앰플리콘을 제조자의 교시에 따라 QIAGEN 겔 추출 키트를 사용하여 겔로부터 용출시켰다. 정제된 PCR 생성물을 pCR®8/GW/TOPO®TA 클로닝 키트 (Invitrogen)에 결합시키고, 경쟁(competent) 이. 콜라이 (E. coli) 세포 (Invitrogen)내로 형질전환시켰다. 플라스미드를 제조자의 교시에 따라 QIAprip Spin Miniprep 키트 (QIAGEN)를 사용하여 추정의 콜로니로부터 분리하였다. 삽입물의 존재를 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 점검하고, 양성 플라스미드를 서열분석하였다.
실시예 3: 서열 분석
뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 각각 BLASTN 및 BLASTP 프로그램으로 분석하였다. 다른 식물로부터의 보고된 서열을 ClustalW를 이용하여 정렬하였다. 계통발생 분석을 NJ (Neighbour Joining)을 사용하여 수행하였다.
서열번호: 1
길이: 1047 (150 bp 5' UTR 및 150 bp 3' UTR 포함)
유형: DNA
생물: 엠. 파세올리나
GAAGTCAAAAGTTTCGGTGTAC
서열번호: 2
길이: 747
유형: DNA
생물: 엠. 파세올리나
특징 명칭/키: CDS
위치: (1).....(747)
atgcagtacaagtacaccgtccttgccgccactatggccgccgttgccttcgcccagcag
M Q Y K Y T V L A A T M A A V A F A Q Q
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G N K E S P H R E P P I G A C K G P Q G
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Q L K T A P A C -
서열번호: 3
길이: 248
유형: PRT
생물: 엠. 파세올리나
MQYKYTVLAATMAAVAFAQQNLIGIPTGTKAKPFTQPETITFFDGKMMEYGRGKPCGTDDDKGDLEAVFIIKPGGTLQNAIIGADSLEGVHCEGACTIKNVWFKDVCEDAITLKGNGPYLITGGGAQHAKDKVVQHNGKGTVTISDYKIGAVGKLYRSCGNCSNNGGPRNVVLDRISSFGPGTTSDLVGINSNYNDVATISGVCGPVKNMCQEFTGIEKDGNKESPHREPPIGACKGPQGQLKTAPAC*
서열번호: 4
길이: 1167 (150 bp 5' UTR 및 150 bp 3' UTR 포함)
유형: DNA
생물: 엠. 파세올리나
AAAGCAAAACCAAACTAGAGCTTGGGCACGGATCACTCGCGTTGGATGTGGTCCGTGGAATCCTTGGTCAGTGCTCAATCGCCTGCTTCGAGTGGGAAACGGCCGTCTCAATTGATACCGGGCGAGTGTCTGCGCATGGATG
서열번호: 5
길이: 735
유형: DNA
생물: 엠. 파세올리나
특징 명칭/키: CDS
위치: (1).....(735)
atgaagttcatctacgccgctatcaccgccaccgtggctggccttgcctctgcgcagtcc
M K F I Y A A I T A T V A G L A S A Q S
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D S E K V S T T A N C K G A Q G T L S K
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L P T C -
서열번호: 6
길이: 244
유형: PRT
생물: 엠. 파세올리나
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서열번호: 7
길이: 1110 (150 bp 5' UTR 및 150 bp 3' UTR 포함)
유형: DNA
생물: 엠. 파세올리나
GGCTCGGGAGAAGAAAGTGGATGGCATTCTATTCTTGTATCGACTTCTAGTACTAGAGCATCTTCTATACCTCTAATTTACTGTG
서열번호: 8
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유형: DNA
생물: 엠. 파세올리나
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atgttctccaagcttttcctgcttcccctcctggcggcttccgccctggctgctcctgcc
M F S K L F L L P L L A A S A L A A P A
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F I L E N G A T L K N A I I G T D Q I E
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서열번호: 10
길이: 1127 (150 bp 5' UTR 및 150 bp 3' UTR 포함)
유형: DNA
생물: 엠. 파세올리나
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서열번호: 11
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유형: DNA
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atgcgttctacaaatctgctcgtcctcctcgcaacctccctcagcctggtcgcagcgagc
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길이: 256
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서열번호: 13
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유형: DNA
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ACGGTCGCTTGGGCTGGCTTTCGCGGATGCCCATTGTGAATAATCCGCTTGTTTCTTGTATGTAATTATTTTAAAGGCAAGAAGACCATTTAAATCAATAAATAGAGACGGGGCTAGACCTCGCTTGTACTACGCACAC
서열번호: 14
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유형: DNA
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atgcagtccaagatcgttctcggcctttctctcctcgccgccaccggcatggcggctccc
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D V A T F K D T C A S S V K D I C V E Y
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길이: 249
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서열번호: 17
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서열번호: 19
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서열번호: 22
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생물: 엠. 파세올리나
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서열번호: 23
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G S C G N T K T V C Q E Y V G I E K G A
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길이: 248
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서열번호: 25
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서열번호: 26
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G R R G R A E P R Y R E I P R E E H Q Y
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H P A S C S L V S T P T T A T L L P S P
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tcgatatcaagtccatcatggaattga
S I S S P S W N -
서열번호: 27
길이: 568
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생물: 엠. 파세올리나
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서열번호: 28
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유형: DNA
생물: 엠. 파세올리나
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서열번호: 29
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유형: DNA
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위치: (1).....(1314)
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M V N I A A V C R A A A F F L P V L A A
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A Q S G V V G T P S G F A A G T T G G G
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D A A A A A P S D V A E L I S W L E D E
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T P R V I L I D K E F N F L G T E G T K
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S D Q G C R P D S N K C P G K G G Q D A
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I N Q A N W C D N G N A G E G V S A V T
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V K Y D Q A A L K G I A V K S N K S I V
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G V G D K G V L K G K G L S L T G G V E
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N V I I Q N I H I T D L N P E Y I W G G
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D A I T L A G S D K V W M R F L R E H P
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T S C Y I L Y Y A F N S K T N A R N V D
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H V K I S L V G R Q M I V T G Y D K A G
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R V T I S N S E F D G Q T D W S A S C N
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G E H Y W T V L V Y G A D D Q I T F A N
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N Y M H D T S G R S P K I G G A D G A G
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I T F H A V N N V F Q T N K G H N F D I
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G S G A E V L L E G N T F N E C N Q P I
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T S K S A N E G G A I F N T P S G S E S
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S C S S Y L K R A C Q A N T L T S S G D
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F G T Y K D T S V L E G F N G A T S I W
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서열번호: 31
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서열번호: 32
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D H H K N S L V G H S D S N A G E D T G
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W G T S K N E A P E G T L T K V P Y T Y
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S G L -
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서열번호: 34
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유형: DNA
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서열번호: 35
길이: 966
유형: DNA
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M K A T T L A T F A L S A V S A L A A P
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L S I K N V L A E N G D A I G I Q A S Q
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D G L L D V T H A S D Y I T L S N N Y L
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H D H W K A S L V G H S D S N G S E D K
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F -
서열번호: 36
길이: 321
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서열번호: 37
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서열번호: 38
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P Y S G P A P D L P D R K P F G F G A A
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A T G G G T P T P N N T Y L V D N M P D
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G N E I N E T T T G N C Q F Y I D S S N
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N S K F N F T L Y I Q S Y N E T Y M G Q
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V K A A S E A G Q L F D G Q N A T E L L
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N G V N L G F N S R S N I I M R N L R I
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S S P R D C F P S P E T Y P S S W N A R
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Y D A V S M V S T T T A W L D G N I F E
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D G P V A V A P D D F A G G W K V D R Y
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D G L F D A E D G S D D I T F S H N I V
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T N H H K S L L W G G G N K E A D R D I
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G K M K F T V F G N R F V D S L S R N P
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L M R F G T F Y I V A N V F E N Y A E R
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S K N E D G E F A E G G F V I G C D G L
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서열번호: 39
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서열번호: 40
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유형: DNA
생물: 엠. 파세올리나
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서열번호: 41
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서열번호: 44
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서열번호: 46
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서열번호: 47
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서열번호: 49
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서열번호: 50
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Q R G R H Y F V N T Y I E G A T D F I F
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A R P D V L A T R I A Y G I I Q R A H S
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W R A I -
서열번호: 54
길이: 1964
유형: PRT
생물: 엠. 파세올리나
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서열번호: 55
길이: 1281 (150 bp 5' UTR 및 150 bp 3' UTR 포함)
유형: DNA
생물: 엠. 파세올리나
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서열번호: 56
길이: 981
유형: DNA
생물: 엠. 파세올리나
특징 명칭/키: CDS
위치: (1).....(981)
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I D T S Y F -
서열번호: 57
길이: 326
유형: PRT
생물: 엠. 파세올리나
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서열번호: 58
길이: 1943 (150 bp 5' UTR 및 150 bp 3' UTR 포함)
유형: DNA
생물: 엠. 파세올리나
CTATATTTCCATTTTTGGGAACGTACGCGTACGCCTTCTGTGGGGCCCCTTACTCCTGAGGTCGTGGTGCACTGGTACAACGACGACGCGCAGTACTGGACGTACGCCTCTTCGTCCGGCGCCTTCACGTCGCCCGCCATGAAGCCGGGGACCTACACCATGGCCCTGTACCAGACCGAACTCAAAGTGGCCACGTCCTCGGTGACGGTCAAGGCCGGATCGGCCACCAGCGCCAACATCGCCAGCACCTGGAGCTCCAATACCACGCTCTTCCAGATCGGCGACTGGGACGGGCAGCCGACCGGCTTCCTCAACGCGGCCAGCCAGCTGCGCATGCACCCGTCCGACTCGCGCATGGCCGACTGGGGCCCCGTCACCTACACCGTCGGCTCGTCCTCCGACAGCTCCGTCCCGATGGCGCTGTTCAAGGACGTCAACGACCCGCTGACCATCAGCTTCACGCTGGCGTCTTCGCAGGCCAGCGGCGCGGCGACGCTGCGCGTCGGCACCACGCTGTCGTTCGCGGGCGGGCGGCCGAGCGTCACCGTCAACGACTACAGCGACTCCGCCGCCGCGCCGACCAAGATCGACTCCCGGGGCGTGACGCGCGGCGCGTATCGCGGGTACGGCGAGATCTACGACTTCGAGCTGCCGGACGGGACGCTGTCGACGAGCAATACGATCACCATTTCGGTGATTTCGGGGAGCAGTGGGGCGGATTTCCTGGAGCCGAATTTTGTGAGTTCTCGCATTCCTCTTGGCCACTAGCATGTTTGAGAGGAATGTGACGCTGACGGTGTGACAGATCCTTGATGCTATTGAGCTGTGGAGATAGGGTTGATAGGTCTGCGGACGTGTTGTGGATGGTTTCGCGGGTCTGGGATCTTGATTGGTTGTTGGGATGGTATGCAGCAAAGA
서열번호: 59
길이: 1593
유형: DNA
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특징 명칭/키: CDS
위치: (1).....(1593)
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F V S S R I P L G H -
서열번호: 60
길이: 530
유형: PRT
생물: 엠. 파세올리나
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서열번호: 61
길이: 2009 (150 bp 5' UTR 및 150 bp 3' UTR 포함)
유형: DNA
생물: 엠. 파세올리나
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서열번호: 62
길이: 1605
유형: DNA
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위치: (1).....(1605)
atggctctctttgctctgtttctgacctttatctctcttttcgcaccgtcggtgctggcc
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S G S N T I T I D C I S G S S G D T Y L
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서열번호: 63
길이: 534
유형: PRT
생물: 엠. 파세올리나
MALFALFLTFISLFAPSVLAAFGVTTSSSSYVVDAGSSNPFVVTISRSSCDITSIKYRGEEFQYSGKGSHISSGLGSATVTSEIVSSTYAKITCTAGSLTHYIIVKSGESSLYMGTYFTEEPSIGEARFIARLDPAKLPLEYPYGTASTTAGSSSTVEGSDVFVVNGQTRSKFYSSQRFIDDKVQCVYRDDDAVHACMILQPLSYEGSSGGPFFRDINTNNAGDSTNLYFYMNSNHAQTESYRMGFHGPYQLQFSRSGIPNSFDASFFADLKLSGYVAESARGYVKGTASGVGSSYQKVLHWYNSNAQYWVYASSNGAFTSPAMKPGTYTQVLYQDELKVATDSVTVSAGSTVTKNIASTFSFPSTIWTIGDWDGQPFGFRNADKIERMHPSDSRMSSWGPLTYTVGSSALTDVPMALFKGVNTPFTIKFTLSSSQTGAAVLRIGTTLAFASGRPQPKINSYSPSAPAAPTKIDSRGVTRGTYRGLGEIYTFDIPAGTLVSGSNTITIDCISGSSGDTYLSPNFILDAIDLYLK*
참조문헌의 인용
본원에 인용되는 미국 특허, 미국 공개 특허출원 및 공개된 PCT 출원 모두 참조로 본원에 포함된다.
등가물
본 발명의 수개의 구현예가 본원에 기재되고 설명되었으나, 당업자는 본원에 기재되는 기능을 수행하고/하거나 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 얻기 위한 다양한 다른 수단 및 또는 구조물을 쉽게 계획할 것이며, 이러한 변화 및/또는 변형 각각은 본 발명의 범위에 속하는 것으로 여겨진다. 당업자는 단지 통상의 실험을 이용하여 본원에 기재된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 상기한 구현예는 단지 예시로 제시된 것이며, 첨부된 특허청구범위 및 이의 등가물의 범위 내에서 본 발명은 구체적으로 기재되고 청구된 것과 달리 실시될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.

Claims (30)

  1. 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 및 63의 각각에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는, 균류 엠. 파세올리나 (M. phaseolina)로부터 유래되는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물.
  2. 서열번호 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 및 61의 각각에 제시된, 균류 엠. 파세올리나로부터 유래되는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물 또는 이들 서열의 보체.
  3. 핵산 프로브에 대해 중간 충실성 조건 하에 하이브리드화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열로서, 상기 핵산 프로브는
    i. 서열번호 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 및 61을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물 또는 이들 서열의 보체; 및
    ii. 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 및 63을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물
    로 이루어지고,
    상기 중간 충실성 조건은 약 45℃에서 6x 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC) 중의 필터-결합된 DNA에 하이브리드 과정에 이어서 약 50 내지 약 65℃에서 0.2 x SSC/0.1% SDS 중에서 1회 이상의 세척 과정을 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오티드 서열.
  4. 청구항 1, 2 또는 3에 있어서, 게놈 DNA인 분리된 핵산 분자.
  5. 청구항 1, 2 또는 3에 있어서, cDNA인 분리된 핵산 분자.
  6. 청구항 1, 2 또는 3에 있어서, RNA인 분리된 핵산 분자.
  7. 청구항 1, 2 또는 3에 있어서, 단일-가닥인 분리된 핵산 분자.
  8. 이종 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 암호화 서열 내에서 정지 코돈에 의해 중단되지 않는, 청구항 1, 2 또는 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 핵산 분자.
  9. 청구항 1, 2 또는 3의 핵산 분자를 포함하고/하거나 이들로 이루어진 재조합 벡터.
  10. 청구항 1, 2 또는 3의 핵산 분자를 포함하고/하거나 이들로 이루어진 발현 벡터/작제물로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포에서 상기 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 전사 및/또는 해독 조절 시그널을 포함하는 조절 뉴클레오티드 서열과 작동적으로 연관되는, 발현 벡터/작제물.
  11. 청구항 1, 2, 3, 6 또는 7의 핵산 분자를 포함하고/하거나 이들로 이루어진 유전적으로 조작된 숙주 세포.
  12. 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서,
    i. 청구항 10의 세포를 적합한/효과적인 조건 하에서 배양하여 상기 폴리펩티드를 생성하는 단계 및
    ii. 폴리펩티드를 분리하는 단계
    를 포함하고/하거나 이들로 이루어진, 방법.
  13. 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 및 63을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 분리된 폴리펩티드, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물.
  14. 서열번호 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58 및 61을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물.
  15. 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 및 63을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고/하거나 이들로 이루어진, 분리된 폴리펩티드, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물.
  16. 청구항 15에 있어서, 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 및 63을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열의 6개 이상의 연속적 잔기를 갖는, 분리된 폴리펩티드, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물.
  17. 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 및 63을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 분리된 폴리펩티드, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물.
  18. 청구항 17에 있어서, 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 분리된 폴리펩티드.
  19. 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 및 63을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열과 60% 이상 동일하고, 그리고 펙테이트 리아제, 펙테이트 리아제 C, 펙틴에스테라제 및 람노갈락투로나제를 포함하거나 이들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 효소의 촉매 활성을 나타내는, 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물.
  20. 제2의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 공유 결합을 통해 융합된 청구항 15의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 단백질.
  21. 청구항 13, 14 또는 17의 폴리펩티드를 포함하는 효소 조성물.
  22. 청구항 19에 있어서, 상기 조성물이 고체 형태로 존재하는 효소 조성물.
  23. 청구항 19에 있어서, 하나 이상의 고체상을 추가로 포함하고, 상기 폴리펩티드가 상기 고체상에 존재하는 효소 조성물.
  24. 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 및 63을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리펩티드, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물과 60% 이상 동일하고, 그리고 펙테이트 리아제, 펙테이트 리아제 C, 펙틴에스테라제 및 람노갈락투로나제를 포함하고/하거나 이들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 효소의 촉매 활성을 나타내는 폴리펩티드가 농축된 효소 조성물, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물.
  25. 효소 조성물을 변화시켜 펙테이트 리아제의 생성을 조절하는 방법으로서, 상기 펙테이트 리아제가 (a) 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 및 27의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물, (b) 서열번호 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25 및 26을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물, 또는 (c) 상기 청구항 25(a)의 폴리펩티드의 아미노산 서열과 60% 이상 동일하고 펙테이트 리아제의 촉매 활성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로부터 유도되는, 방법.
  26. 효소 조성물을 변화시켜 펙테이트 리아제 C의 생성을 조절하는 방법으로서, 상기 펙테이트 리아제 C가 (a) 서열번호 30, 33, 36, 39, 42 및 45의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물, (b) 서열번호 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37, 38, 40, 41, 43, 44를 포함하고/하거나 이들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물, 또는 (c) 상기 청구항 26(a)의 폴리펩티드의 아미노산 서열과 60% 이상 동일하고 펙테이트 리아제 C의 촉매 활성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로부터 유도되는, 방법.
  27. 효소 조성물을 변화시켜 펙틴에스테라제의 생성을 조절하는 방법으로서, 상기 펙틴에스테라제가 (a) 서열번호 48, 51, 54, 57의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물, (b) 서열번호 46, 47, 49, 50, 52, 53, 55, 56를 포함하고/하거나 이들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물, 또는 (c) 상기 청구항 27(a)의 폴리펩티드의 아미노산 서열과 60% 이상 동일하고 펙틴에스테라제의 촉매 활성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로부터 유도되는, 방법.
  28. 효소 조성물을 변화시켜 람노갈락투로나제의 생성을 조절하는 방법으로서, 상기 람노갈락투로나제가 (a) 서열번호 48, 51, 54, 57의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물, (b) 서열번호 46, 47, 49, 50, 52, 53, 55, 56을 포함하고/하거나 이들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드, 및/또는 이의 임의의 혼합물/조합물, 또는 (c) 상기 (a)의 폴리펩티드의 아미노산 서열과 60% 이상 동일하고 람노갈락투로나제의 촉매 활성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로부터 유도되는, 방법.
  29. 변형된 화학적 및/또는 물리적 특성을 갖는 효소를 확인하는 방법으로서, (a) 상기 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 돌연변이시키는 단계; 및/또는 (b) 상기 돌연변이된 뉴클레오티드 서열의 발현 결과로 생성되는 상기 효소의 화학적 및/또는 물리적 특성을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 돌연변이 단계가 서열 정렬에서 상기 효소의 뉴클레오티드 서열에 대해 불완전하게 매칭되는 또 하나 효소의 상기 뉴클레오티드 서열의 일부들을 사용하는 것을 포함하는 방법.
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