DE60111637T2

DE60111637T2 - Biomaterial in Form von Mikropartikeln von Hyaluronsäure zur medizinischen Verwendung

Info

Publication number: DE60111637T2
Application number: DE60111637T
Authority: DE
Inventors: K. Ronald YAMAMOTO; R. Stanley CONSTON
Original assignee: Iscience Corp
Current assignee: Iscience Corp
Priority date: 2000-07-31
Filing date: 2001-07-31
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2021-08-01
Also published as: EP1305057A1; DK1305057T3; JP2004505065A; WO2002009787A1; EP1305057B1; PT1305057E; ATE298256T1; DE60111637D1; ES2244641T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung zielt auf ein injizierbares Biomaterial für die lokalisierte Behandlung von Geweben ab.
Hintergrund der Erfindung
Eine Vielzahl von biokompatiblen Materialien oder Biomaterialien wurde als medizinische Implantate eingesetzt, um als chirurgisches Hilfsmittel bei der Aufrechterhaltung eines Geweberaums zu fungieren, um Gewebe anzufügen oder um die Masse an Gewebe in einem lokalisierten Bereich zu erhöhen. Frühe Beispiele schließen den Einsatz von Silikon-Kautschukmaterialien ein, die für die permanente Weichgewebe-Rekonstruktion des Kinns und der Nase verwendet werden. Die spätere Entwicklung von bioabbaubaren Biomaterialien ermöglichte den Einsatz von Materialien, wie rekonstituiertem Rinderkollagen und hydrolytisch abbaubaren synthetischen Polymeren, wie Polymilchsäure, Polyglykolsäure und deren Copolymeren. Solche abbaubaren Biomaterialien können die langsame Absorption des Implantats durch den Körper ermöglichen, während gleichzeitig der (Hohl-)Raum mit neuem Gewebe ersetzt wird. Beispiele für solche Biomaterialanwendungen schließen poröse Kollagen-Implantate, die als künstliche Haut verwendet werden, und Polymilchsäure-Implantate, die für die Knochenfixierung verwendet werden, ein.
Biomaterialien, die injiziert werden und abbaubar sind, besitzen einen speziellen Vorteil in der Chirurgie aufgrund der Fähigkeit, zu Gewebebereichen mit minimal invasiven Operationswerkzeugen Zugang zu haben. Ein Beispiel ist die Verwendung von Kollagen-Fibril-Dispersionen (Zydem, Collagen Corporation), die in die Gewebe um den urethralen Schließmuskel bei der Behandlung von Inkontinenz injiziert werden, und auch für die Vermehrung von Weichgeweben für kosmetische Zwecke. Ähnliche injizierbare Materialien sind von einer Vielzahl an Zusammensetzungen beschrieben worden, einschließlich flüssige Copolymere in dem US-Patent 5 824 333 und Dextran-Mikropartikel in dem US-Patent 5 633 001.
Die meisten chirurgischen Anwendungen von Biomaterialien des Stands der Technik führen zur Bildung von fibrotischem Gewebe und dem nachfolgenden Einwachsen von Gewebe in den zuvor durch das Biomaterial eingenommenen Bereich. Bei bestimmten chirurgischen Anwendungen ist es erwünscht, ein Material lokal auf Gewebe aufzubringen, um (Hohl-)Raum beizubehalten, aber auch um das Einwachsen von Gewebe in den Bereich zu verhindern. Zum Beispiel kann bei der chirurgischen Reparatur von Nerven, Augen und Bauchorganen die resultierende Fibrose die Wirkung der chirurgischen Reparatur komplizieren oder zunichte machen. Es ist im Falle dieser Arten von chirurgischen Prozeduren wünschenswert, ein injizierbares Biomaterial zu haben, welches auf Gewebe zur Bildung eines Implantats aufgebracht werden kann, welche aber das Einwachsen von Gewebe oder die Proliferation von Fibroblasten und Fasergeweben verhindert.
Eine spezielle Anwendung ist eine kürzlich entwickelte chirurgische Behandlung für das Auge, bekannt als Viskoanalostomie. Die Prozedur beinhaltet das operative Öffnen eines Lappens der Sklera und das Sezieren, um vom Schlemm-Kanal die Bedeckung zu entfernen, um die Entwässerung bzw. den Abfluss von Wasser zu erhöhen. Eine hochviskose Lösung, die als Viskoelastikum bekannt ist, wird in den Kanal eingespritzt, um diesen zu erweitern, und kann dem Öffnen des trabekulären Geflechts von dem kanikulären Raum aus dienen, um den Wasserfluss zu erhöhen und den Augeninnendruck zu verringern. Das Viskoelastikum dient auch als Fibrose-Inhibitor, wodurch der Zufluss von fibroblastischen Zellen durch die Heilungsreaktion verringert wird, was die Wirkungen des Verfahrens durch Blockieren des Fluidstroms zunichte machen würde.
Das in ophthalmischen Prozeduren eingesetzte vorherrschende viskoelastische Material ist eine hochviskose Flüssigkeit, die sich aus hochmolekulargewichtiger Hyaluronsäure (HA) oder Natriumhyaluronat zusammensetzt, bei der es sich um eine Glycosoaminoglycan-Komponente handelt, die in mehreren menschlichen Geweben zu finden ist, darin eingeschlossen das Auge und das Synovialfluid der Gelenke. Aufgrund der extrem hohen Viskosität von hochmolekulargewichtigen HA-Lösungen liegen die in diesen Verfahren verwendeten Formulierungen in einem Größenbereich von 0,5–1 % HA in Lösung. HA und deren Derivate wurden in ophthalmischen Anwendungen viele Jahre lang als Lösungen für die Phakoemulsifikation des Auges während einer Kataraktentfernung verwendet. Die derzeitigen viskoelastischen Materialien sind zwar für die Erweiterung des Schlemm-Kanals und anderer Gewebe geeignet, haben aber nicht die Verweildauer in vivo und Fluidtransportcharakteristika, um die operative Reparatur über einen langen Zeitraum aufrechtzuerhalten. Es ist wünschenswert im Falle einer operativen Behandlung von Geweberäumen wie dem Schlemm-Kanal, ein injizierbares Material mit Füllmaterialeigenschaften zu haben, um eine Erweiterung zu bewirken und um den operativen Raum für den Fluidstrom, ein Langzeit-Abbauprofil und die Inhibierung der mit der Wundheilung assoziierten Fibrose aufrechtzuerhalten.
Die vorliegende Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, beschreibt biokompatible, injizierbare Mikrokugelzusammensetzungen und -formulierungen, welche auf Gewebe für solche Zwecke aufgebracht werden können.
Bekannter Stand der Technik:

US-Patent 5 985 354, 16. Nov. 1999, Mathiowitz et al. Herstellung von mehrwandigen polymeren Mikrokapseln aus hydrophilen Polymeren
US-Patent 5 922 357, 13. Juli 1999, Coombes et al. Polymer-Mikrokugeln und ein Verfahren zur Herstellung selbiger
WO 99/11196, 11. März 1999, Conston et al. Injizierbares Gewebe-Rekonstruktionsmaterial
EP 0 265 116, 3 . Nov. 1998, Della Valle et al. Vernetzter Ester von Hyaluronsäure
US-Patent 5 824 333, 20. Okt. 1998, Scopelianos et al. Injizierbare flüssige Copolymere für die Weichgewebereparatur und -verstärkung (augmentation)
US-Patent 5 633 001, 27. Mai 1997, Ågerup Zusammensetzung und Verfahren zur Gewebeverstärkung
US-Patent 5 143 724, 1. Sept. 1992, Leshchiner et al. Biokompatible viskoelastische Gelaufschlämmungen, deren Herstellung und Verwendung
WO 90/09401, 23. Aug. 1990, Malson et al. Vernetzte Hyaluronatgele, deren Verwendung und Verfahren zur Herstellung selbiger
US-Patent 4 582 640, 15. April 1986, Smestad et al. Injizierbares vernetztes Kollagen-Implantatmaterial
WO 86/00079, 3. Jan. 1986, Malson et al. Gel von vernetzter Hyaluronsäure für den Einsatz als Ersatz für Glaskörperflüssigkeit
Obstbaum, S., M.D. et al., "Glaukoma-Chirurgie der vordersten Front („Cutting edge Glaucoma Surgery": Weist die Viskoanalostomie den Weg?", Ergänzungsband zur Review of Ophthalmology, Sept. 1999.
Welsh, N.H., FRCS et al., The "Deroofing" of Schlemm's Canal in Patients with Open-Angle-Glaucoma Through Placement of a Collagen Drainage Device, Ophthalmic Surgery and Lasers (Das "Deroofing" bzw. Abdecken des Schlemm-Kanals bei Patienten mit Offen-Winkel-Glaukoma durch die Platzierung einer Kollagen-Entwässerungsvorrichtung, Augenchirurgie und Laser), März 1998, Bd. 29, 3. Nov., SS. 216-226.
Tomihata, K., Ikada, Y., Vernetzen von Hyaluronsäure mit wasserlöslichem Carbodiimid, Journal Biomedical Material Research; 1997, John Wiley & Sons, Inc., Bd. 37, SS. 243-251.
T. Malson, P. Algvere, L. Ivert, B. Lindquist, G. Selen, S. Stenkula, Vernetzte Hyaluronatgele für den Einsatz in der Glaskörperchirurgie, Biomaterials and Clinical Applications.
Elsevier Science Publishers B.V. Amsterdam, 1987, SS. 345-348.
E. Ghezzo, L. Benedetti, M. Rochirea, F. Biviano, L. Callegaro, Hyaluronanderivat-Mikrokugeln als NGF-Abgabevorrichtungen, Herstellungsverfahren und In-vitro-Freisetzungscharakterisierung, International Journal of Pharmacology, 87, SS. 21-29, 1992.

Ziel der Erfindung
Es ist ein Ziel dieser Erfindung, eine Biomaterialzusammensetzung wie in den Ansprüchen definiert für die Anwendung in der Chirurgie und im Besonderen in der Augenchirurgie bereitzustellen. Das Biomaterial besteht aus einer injizierbaren Mikrokugelformulierung, wobei die Mikrokugeln biokompatibel, bioabbaubar sind und in hoher Feststoffkonzentration abgegeben werden können. Das Material ist zur Erweiterung von Geweben und zur Bildung eines Implantats in situ fähig, während gleichzeitig der Durchfluss von Fluiden durch die resultierende Teilchenmatrix ermöglicht wird. Darüber hinaus ist es ein Ziel dieser Erfindung, eine Formulierung von Mikrokugeln bereitzustellen, welche im Wesentlichen die Gewebereaktion vermindert, um die fibrotische Heilungsantwortreaktion zu minimieren.
Aufgrund der den stabilisierten Mikrokugelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eigenen Biokompatibilität sind diese auch auf die Verkapselung oder gemeinsame Formulierung von therapeutischen und diagnostischen Verbindungen, die für die lokale oder parenterale Abgabe formuliert sind, anwendbar.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung zielt auf eine neue Mikrokugelzusammensetzung, welche stabilisierte Hyaluronsäure umfasst, zur Anwendung in direktem Kontakt mit Geweben für die Zwecke der Chirurgie. Insbesondere werden die Zusammensetzung und die Verwendung solcher Materialien zur Manipulation von Geweben ohne die Bildung einer fibrotischen Antwortreaktion beschrieben. Aufgrund der den Mikrokugelformulierungen eigenen Gewebebiokompatibilität gibt es weitere Anwendungen für solche Materialien bei der lokalisierten Arzneistoffabgabe und anderen medizinischen Anwendungen.
Es wird hierin eine Zusammensetzung bereitgestellt, welche aus einer biokompatiblen Mikrokugelformulierung besteht, die fließfähig und bioabbaubar ist, die Formulierung kann an die Operationsstelle abgegeben werden, um die Dilatation oder Beibehaltung eines Geweberaums zu bewirken und die Fluidströmung durch die Mikropartikelmatrix zu ermöglichen und darüber hinaus die Ablagerung von fibrotischem Gewebe zu verhindern. Die Formulierung kann durch Injektion für chirurgische Anwendungen, wie die Dilatation des Schlemm-Kanals im Auge für die Behandlung von Glaukoma, die Angioplastie kleiner Gefäße und als ein Hilfsmittel für die Nervenrekonstruktion abgeben werden.
Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung stellt ein fließfähiges Biomaterial wie in den Ansprüchen definiert bereit zur Anwendung in der Chirurgie durch Verabreichen des Biomaterials in einer Menge, die ausreichend ist, um einen Geweberaum beizubehalten oder um eine aus reichende Menge an Arzneistoff oder aktiver Substanz abzugeben. Insbesondere soll die Mikrokugel-Biomaterialzusammensetzung in den Schlemm-Kanal und andere anatomische Stellen innerhalb des Auges injiziert werden unter Vorsehung einer Gewebe-Dilatation und Aufrechterhaltung einer Zunahme des Abflusses von wässrigem Fluid aus der Vorkammer des Auges, ohne eine fibrotische Antwortreaktion zu bewirken, wodurch der Geweberaum verschlossen wird.
Das Biomaterial dieser Erfindung besteht aus Mikropartikeln, die im Wesentlichen in kugelförmiger Art gebildet werden, oder Mikrokugeln, die in geeigneter Weise in eine physiologisch kompatible Trägerlösung eingemischt werden. Aufgrund der sehr kleinen Kaliber von Nadeln, die für die Einführung in den Schlemm-Kanal benötigt werden, ungefähr 30 Gauge oder kleiner, sind die Fließcharakteristika des Biomaterials von Bedeutung. Um die Injizierbarkeit bei hohen Feststoffkonzentrationen zu maximieren, sind dichte Mikrokugeln gegenüber unregelmäßig geformten Partikeln oder Faserformen von Mikropartikeln bevorzugt. Die Mikrokugeln werden aus Hyaluronsäure gebildet. Die Mikrokugeln werden vernetzt, um die Bioabbauzeit in-situ zu erhöhen. Mikrokugeln dieser Erfindung haben Durchmesser zwischen 0,01 und 100 Mikrometer, vorzugsweise zwischen 1 und 20 Mikrometer. Die Mikrokugeln werden in einer physiologischen Trägerlösung, wie einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung (PBS) oder sterilem Wasser für die Injektion (WFI) suspendiert. Die Mikrokugelkonzentrationen in der Formulierung liegen im Bereich von 1 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise höher als 2 %.
Die Mikrokugeln können unter Anwendung von Standard-Sprühtrocknungstechniken hergestellt werden oder können durch Sprühkoagulation hergestellt werden. Unter Anwendung von Sprühtrocknungstechniken wird eine wässrige Dispersion oder Kolloid des Polymers in verdüster Form durch eine kleine Austrittsdüse in einen strömenden Gasstrom, in der Regel Luft oder Stickstoff, dispensiert. Während die Tröpfchen in dem Gasstrom herabfallen, kondensieren sie und trocknen zu im Wesentlichen kugelförmigen Partikeln von Biomaterial. Die Partikel werden in einem Zyklonmechanismus zur weiteren Verarbeitung gewonnen. Bei der Technik der Sprühkoagulation wird eine Dispersion oder kolloidale Lösung von Polymer in verdüster Form durch eine kleine Austrittsdüse in einen Aufnahmebehälter, welcher eine Lösung enthält, die ein Nicht-Lösungsmittel des Polymers ist, dispensiert. Beispiele schließen Isopropylalkohol oder Ethylalkohol ein. Die Tröpfchen kondensieren und trocknen durch Lösungsmittelaustausch der wässrigen Komponente. Eine angemessene Kondensation und die Lösungsmittelbedingungen sind wichtig für die Bildung dichter Mikrokugeln durch dieses Verfahren.
Die Mikrokugeln werden stabilisiert, um Nicht-Löslichkeit zu erreichen und um ihre Abbauzeit in-vivo zu erhöhen. Die Mikrokugeln können durch eine Reihe von Verfahren stabilisiert werden, darin eingeschlossen die ionische Komplexierung und die chemische Vernetzung. Die Mikrokugeln können mit Hilfe einer Reihe unterschiedlicher Chemien, zum Beispiel dem Einsatz eines Carbodiimid-Vernetzungsmittels, vernetzt werden. Mittel zur Unterstützung des Vernetzens können auch gemeinsam zu Mikrokugeln formuliert werden. Das Hyaluronsäure-Ausgangsmaterial kann teilweise vernetzt werden, um die Partikelbildung zu unterstützen. Nach der Herstellung dienen Verfahren zur chemischen Vernetzung der Mikrokugeln in einem nichthydratisierten oder teilweise hydratisierten Zustand der Erhöhung der Mikrokugeldichte. Die vernetzten Mikrokugeln werden gewaschen, um restlichen Vernetzer zu entfernen, und getrocknet. Die trockenen Mikrokugeln werden danach klassiert unter Anwendung von Standard-Sieb- oder Filtrationstechniken, um zu einer Population mit dem gewünschten Größenbereich zu gelangen.
Mikrokugeln werden in einem physiologischen Träger suspendiert, wie in einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung, Lösungen von physiologisch kompatiblen Tensiden oder verdünnten, gepufferten Lösungen von Hyaluronsäure für die Abgabe an die Operationsstelle. Es wird leicht ersichtlich, dass die Mikrokugeln der Größe nach gewählt und stabilisiert werden können, um für die angemessene Verweildauer in-vivo zu sorgen, und für eine Vielzahl an medizinischen Anwendungen formuliert werden können. In der Praxis für die chirurgische Anwendung zur Behandlung des Schlemm-Kanals und anderer Gewebe im Auge wird der Raum lokalisiert und mit einer Nadel oder einer Kanüle mit einer sehr feinen Gauge zugänglich gemacht, mit anschließender Injektion einer Aufschlämmung der vernetzten Mikrokugeln. Die halbfeste Beschaffenheit der Aufschlämmung sieht eine ausreichende Erweiterungskraft vor zur Erhöhung des ungefähren Durchmessers des Schlemm-Kanals. Der hohe Feststoffgehalt der Aufschlämmung ermöglicht ein dichtes Packen der Mikrokugeln, sodass Fluid leicht durch die Mikrokugelmatrix und zu den Abflusskanälen des Schlemm-Kanals strömen kann.
In einigen Fällen, wie bei der Behandlung des Schlemm-Kanals des Auges, kann es vorteilhaft sein, einen mit den Partikeln assoziierten farbigen Marker zu haben. Die Mikrokugeln der vorliegenden Erfindung oder alternativ das Trägerfluid können chemisch behandelt werden, um einen ionisch gebundenen oder kovalent gebundenen Chromophor oder Fluorophor zu haben. Ein auf dem Gebiet der Biokonjugation verwendetes Beispiel ist Fluoreszeinisothiocyanat, welches mit den reaktiven Gruppen von Hyaluronsäure reagieren würde unter Bildung von durch Fluoreszenz markierten Mikrokugeln.
In anderen chirurgischen Anwendungen, in welchen die Aufrechterhaltung eines Raums und antifibrotische Eigenschaften von kritischer Bedeutung sind, können die Formulierungen, wie sie für die Behandlung des Schlemm-Kanals des Auges beschrieben sind, eingesetzt werden. Zum Beispiel kann die Mikrokugelzusammensetzung in den Bereichen um Nerven angewandt werden, um durch Druck herbeigeführte Komplikationen zu vermindern oder um die chirurgische Reparatur zu erleichtern, und können ebenso in der chirurgischen Behandlung von Reproduktions-, Kreislauf- oder Verdauungsorganen, in Situationen, in welchen die aus der Wundheilung resultierende Fibrose die Wirkungen der chirurgischen Reparatur zunichte machen würde, angewandt werden. Bei einer anderen Technik können trockene Mikrokugeln, wie in der Formulierung beschrieben, durch Aerosol-Sprühen der Partikel direkt auf das feuchte Operationsfeld verabreicht werden. Die Mikrokugeln hydratisieren mit Serum und Blut in dem Feld.
Die Mikrokugelzusammensetzung kann durch eine Vielzahl chirurgischer Instrumente, wie Injektionsnadeln, Kanülen und Katheter, abgegeben werden. Die Fließeigenschaften der Zusammensetzung können für eine spezielle Anwendung durch die Regulierung der Mikrokugelgröße, des Qwellens und der Konzentration eingestellt werden. Das Fließvermögen verbessernde Mittel, wie lösliche Hyaluronsäure, wasserlösliche Polymere und Tenside, können ebenfalls zu der Zusammensetzung formuliert werden.
Arzneistoffe oder andere Wirkstoffe können verkapselt, konjugiert oder gemeinsam zu der Mikrokugelzusammensetzung formuliert werden, um eine lokale Arzneistoffabgabe vorzusehen. Der Arzneistoff kann zur Unterstützung der chirurgischen Anwendung, wie durch Vorsehen einer antiinflammatorischen, antiproliferativen oder antifibrotischen Wirksamkeit, gewählt werden.
Zusätzlich zu den chirurgischen Anwendungen sehen die Mikrokugelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung einen idealen Träger für therapeutische oder diagnostische Mittel vor aufgrund ihres hohen Maßes der Gewebe- und Blutverträglichkeit. Arzneistoffe für die systemische Behandlung können an eine lokale Stelle verabreicht werden, um vorhersagbare Arzneistoff-Freisetzungscharakteristika aufgrund der Minimierung der fibrotischen Antwortreaktion vorzusehen. Die Mikrokugeln können auch hergestellt werden, um die parenterale Verabreichung durch Klassieren der am Ende erhaltenen Teilchen zu ermöglichen, um kleiner als eine rote Blutzelle, ungefähr 7 Mikrometer, zu sein, und zwar zur Verhinderung des Einschlusses in Kapillaren. Die Mikrokugeln werden in einer physiologisch kompatiblen Lösung suspendiert und in den Blutkreislauf injiziert. Infolge der durch die gebildeten Mikrokugeln gezeigten Blutverträglichkeit der HA-Oberflächen widerstehen die Mikrokugeln der Entfernung aus dem Kreislaufsystem durch das Retikuloendothelialsystem der Leber und sind zur Vorsehung einer anhaltenden Arzneistoffabgabewirkung fähig.
Beispiele
Beispiel #1-Herstellung von HA-Mikrokugeln durch Sprühkoagulation
Aus Hyaluronsäure (HA) bestehende Mikrokugeln wurden durch Sprühbildung und Lösungsmitteltrocknen hergestellt. Eine wässrige Lösung von HA von 0,5 %iger Konzentration wird unter Verwendung von stark gereinigter HA und entionisiertem Wasser gebildet. Die Viskosität der Lösung wird zum Sprühen durch die Zusetzung von Isopropylalkohol (IPA) in einem Verhältnis zwischen 50:50 und 80:20 (IPA/wässriger Bestandteil), vorzugsweise in einem Verhältnis von 60 % Nicht-Lösungsmittel abgesenkt.
Die Mikrokugeln wurden durch Besprühen der HA-Lösung mit einem koaxialen Sprühkopf gebildet, wobei das Innenkaliber die Lösung beförderte und das Außenkaliber eine Luftströmung für die Zerstäubung vorsah. Das Innenkaliber wurde auf 0,25 mm dimensioniert, und das Außenkaliber auf einen Durchmesser von 1,37 mm. Der Sprühkopf wurde so angeordnet, um abwärts in einen Sammelbehälter zu sprühen.
Der Sammelbehälter wurde ungefähr 5 cm tief mit IPA als Nicht-Lösungsmittel der HA gefüllt. Luft bei einem Druck von 5–10 PSI wurde für die Zerstäubung vorgesehen, und die Lösung wurde mittels einer Standardspritze, die entweder durch pneumatische oder Spritzenpumpenantriebe betätigt wird, abgegeben. Die Luftströmung wurde in Gang gesetzt, bevor mit dem Strömenlassen der HA-Lösung begonnen wurde. Die Mikrokugeldurchmesser können durch den Durchmesser des Innenkalibers, die Luftströmungsrate, die Lösungsviskosität und die Lösungsströmungsrate geregelt werden. Durch Beibehaltung des Innenkalibers, der Luftströmungsrate und der Lösungsviskositäten als Konstanten wurde die Lösungsströmungsrate zur Aufrechterhaltung der Größenregulierung verwendet.
Beim Verlassen des Innenkalibers des Sprühgeräts wurde die Lösung verdüst, und die kugelförmigen Tröpfchen wurden durch den Luftstrom abwärts transportiert, um in das Lösungsmittelbad in dem Sammelbehälter zu gelangen. Das IPA-Nicht-Lösungsmittel entfernte die restliche wässrige Lösung aus den Partikeln, wodurch diese durch Koagulation fixiert wurden. Auf diese Weise gebildete Partikel waren typischerweise feste Mikrokugeln. Die Partikel waren im Wesentlichen kugelförmig mit Durchmessern im Bereich von 5–40 Mikrometer, wie durch optische Mikroskopie ermittelt.
Die Koagulationsbadlösung wurde zunächst durch ein 45-Mikrometer-Sieb filtriert, um jegliche Mikrokugeln mit Übergröße zu entfernen. Die Lösung wurde weiter filtriert, um die Fraktionen mit der gewünschten Größe zu gewinnen. Das am Ende erhaltene Filtrat der Lösung wurde danach durch einen 1,2-Mikrometer-Filter filtriert, um die Mikrokugeln zu gewinnen. Die Mikrokugeln wurden aus dem Abscheidungsfilter gewaschen und in einen Behälter gegeben. Die Mikrokugeln wurden in einer Lösung von 90 % IPA und 10 % wässriger Lösung von 10 mM 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) über einen Zeitraum von 24 Stunden chemisch vernetzt, mit IPA gewaschen und durch Lösungsmitteltrocknung getrocknet.
Beispiel #2–Herstellung von HA-Mikrokugeln durch Ultraschall-Sprühkoagulation
HA-Mikrokugeln wurden unter Anwendung einer Ultraschall-Sprüh- und Lösungsmittelkoagulation hergestellt. Es kam ein Sprühsystem, bestehend aus einem Lechler-Modell US-1-(Lechler AG, 100 kHz bei 8 Watt Maximum-)Ultraschallsprühkopf, der auf einen IPA als ein Nicht-Lösungsmittel enthaltenden Sammelbehälter gerichtet war, zum Einsatz. Der Ultraschall-Sprühkopf wurde modifiziert, um den Bohrungsdurchmesser auf 0,3 mm zur Bildung kleinerer Mikrokugeln zu verringern. Der aktive Teil des Sprühkopfes bestand aus einer Titanscheibe mit einer zentralen Bohrung für die Abgabe der Sprühlösung. Ein ringförmiger Zwischenraum zwischen dem Gehäuse und der Scheibe ermöglichte das Lenken des Sprays und den Transport der Partikel in einer gewünschten Richtung durch den Luftstrom. Der Sprühkopf wurde durch ein RF-Verstärkersystem mit variablen Leistungsstärken betrieben.
Eine wässrige Lösung von HA von 0,5 %iger Konzentration wurde mit einer identischen Menge an Isopropylalkohol (IPA) vermischt und sich gründlich mischen gelassen. IPA wurde zur ausreichenden Absenkung der Lösungsviskosität für das Sprühen hinzugefügt. Die Lösung wurde mit EDC in einer Konzentration der wässrigen Phase von 50 milliMolar (mM) über einen Zeitraum von 24 Stunden behandelt. Die EDC-Behandlung der HA-Lösung bildete Vernetzungen und erhöhte dadurch das Molekulargewicht der HA und verbesserte deren Filmbildungseigenschaften.
Die Mikrokugeln wurden durch Dispensieren der HA-Lösung durch den Sprühkopf mit Hilfe einer Spritzenpumpe gebildet. Der Sprühkopf war so angeordnet, um abwärts in den Sammelbehälter zu sprühen. Der Sammelbehälter wurde ungefähr 5 cm tief mit IPA als Nicht-Lösungsmittel der HA gefüllt. Luft bei einem Druck von 5–15 PSI wurde vorgesehen, um das Abwärtslenken des Sprays zu unterstützen. Der Ultraschall- Messwandler und die Luftströmung wurden in Gang gesetzt, bevor mit dem Strömenlassen der HA-Lösung begonnen wurde. Es wurden Strömungsraten von 0,1 bis 2,0 cm³/mm verwendet. Die Ultraschall-Leistungsstärke wurde über einen Regler eingestellt, um die konsistenteste und kleinste Partikelgröße bereitzustellen.
Während die versprühte bzw. verdüste Lösung kugelförmige Tröpfchen bildete, wurden diese durch den Luftstrom nach unten transportiert, um in das Lösungsmittelbad in dem Sammelbehälter zu gelangen. Das IPA-Nicht-Lösungsmittel entfernte die restliche wässrige Lösung aus den Partikeln, wodurch diese durch Koagulation fixiert wurden. Auf diese Weise gebildete Partikel waren typischerweise dünnwandige Mikrokugeln, die mit Flüssigkeit gefüllt waren. Die Partikel waren im Wesentlichen kugelförmig mit Durchmessern im Bereich von 1-10 Mikrometer, wie durch optische Mikroskopie ermittelt.
Die Koagulationsbadlösung wurde zunächst durch ein 20-Mikrometer-Sieb filtriert, um jegliche Mikrokugeln mit Übergröße zu entfernen. Das am Ende erhaltene Filtrat der Lösung wurde danach durch einen 1,2-Mikrometer-Filter filtriert, um die Mikrokugeln zu gewinnen.
Beispiel #3–Vernetzung von Mikrokugeln nach der Herstellung
Mikrokugeln, die in der Weise eines der Beispiele 1 oder 2 hergestellt wurden, wurden gesammelt und in IPA gehalten. Die Mikrokugeln wurden danach vernetzt, um sie zu stabilisieren. Eine 100-mM-Lösung von EDC wurde zubereitet. Die Lösung wurde den Mikrokugeln hinzugefügt, um ein Endverhältnis von 90 % IPA und 10 % EDC-Lösung zu erreichen. Die Mikrokugeln wurden bei 20°C über Zeiträume von 24 und 48 Stunden sich vernetzen gelassen.
Die vernetzten Mikrokugeln wurden danach gesammelt und dreimal mit IPA gewaschen, um restlichen Vernetzer zu entfernen. Die resultierenden Mikrokugeln wurden auf einen Glasobjektträger gegeben und unter einem Mikroskop untersucht. Die Mikrokugeln behielten ihre Gestalt und Größe während der Verarbeitung bei. Während die Objektträgerlösung trocknete, wurde ein Tropfen Wasser auf den Objektträger gegeben und die Partikel wurden untersucht. Die Partikel zeigten eine sehr geringe Veränderung über einen Zeitraum von Minuten. Ein weiterer Probenobjektträger wurde präpariert und ein Tropfen von 100 mM Chlorwasserstoffsäure (HCL) wurde auf den Objektträger gegeben und die Ergebnisse wurden in Augenschein genommen. Die Mikrokugeln zeigten Anzeichen einer Hydratation durch die Veränderung der Klarheit der Wand und das diametrische Anschwellen in einer Größenordnung von 10–30 %. Demgegenüber schwollen Mikrokugeln, die nicht nach dem Vernetzungsverfahren behandelt wurden, sofort an und begannen sich in der Säurelösung aufzulösen, wodurch der Erfolg des Vernetzungsverfahrens bei der Herstellung hochdichter Mikrokugeln angezeigt wurde.
Beispiel #4–Injizierbare Formulierung für HA-Mikrokugeln
Es wurden gemäß den Beispielen #2 und #3 erzeugte Mikrokugeln hergestellt. Die Mikrokugeln wurden zwischen 10 und 40 Mikrometer mit Hilfe einer sukzessiven Filtration fraktioniert. Die vernetzten Mikrokugeln wurden wiederholt mit IPA gewaschen, um jedwede restliche wässrige Komponente zu entfernen. Die Mikrokugeln wurden durch Filtration durch einen 1,2-Mikrometer-Filter gewonnen. Der Filter wurde in einem Niedertemperatur-Ofen bei 150–175°C über einem Bett von Trockenmittel getrocknet.
Nach dem Trocknen wurden die Mikrokugeln gesammelt und in ein Vial abgewogen. DI-Wasser wurde den Mikrokugeln zugegeben und vermischt, wodurch eine Suspension von Mikrokugeln mit einer Feststoffkonzentration von 2,6 % erhalten wurde. Die Lösung war viskos, aber immer noch zum Vermischen in dieser hohen Konzentration fähig. Die Suspension wurde durch eine Mikronadel mit einem inneren Kaliber von 150 Mikrometern ohne Probleme dispensiert.
Beispiel #5–Injizierbare Formulierung für HA-Mikropartikel
Es wurden gemäß den Beispielen #2 und #3 erzeugte Mikrokugeln hergestellt. Nach dem Vernetzen wurden die Mikrokugeln durch Filterabscheidung konzentriert. Die Mikrokugeln wurden einer Teilchengrößenfraktionierung unterzogen, sodass alle Partikel einen Durchmesser von kleiner als 4 Mikrometer in einem hydratisierten Zustand hatten, der für physiologische Bedingungen repräsentativ ist.
Die Partikel können für die Lagerung getrocknet werden. Die konzentrierte IPA-Lösung, die Mikrokugeln enthält, wird auf -20°C abgekühlt und bis zum kritischen Punkt getrocknet. Der zurückbleibende Kuchen besteht aus hohlen Mikrokugeln. Die Mikrokugeln werden in einer Lösung von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung erneut suspendiert zur Bildung einer injizierbaren Formulierung.
Beispiel #6–Fluidströmung durch Mikrokugeln
Mikrokugeln wurden durch Sprühkoagulation einer Lösung von 1 %iger HA durch das in Beispiel #1 beschriebene Verfahren hergestellt. Die Mikrokugeln wurden mit 50 mM EDC unter Verwendung eines Lösungsmittel/wässriger Bestandteil-Verhältnisses von 95:5 über einen Zeitraum von 118 h vernetzt. Die Mikrokugeln wurden gewaschen, filtriert unter Erhalt einer Größenfraktion von 20–45 Mikrometer und danach getrocknet.
Eine Lösung der Mikrokugeln mit 12,5 % Feststoffgehalt wurde in entionisiertem Wasser formuliert. Die Mikrokugeln wurden gründlich gemischt und vollständig hydratisieren gelassen. Nach der Hydratation wurde ein Aliquot von Mikrokugeln in das Ende des Luer-Röhren-Adapters von ungefähr 4 mm Durchmesser gepackt, um einen Kuchen von etwa 3 mm Dicke zu bilden. Ein Stück Nylonmaschenfilter mit 10-μm-Poren wurde zurechtgeschnitten und über das Ende des Röhrenadapters ausgebreitet und mit einem Silikon-O-Ring um die Außenseite fixiert, um die Extrusion der Partikelmatrix zu verhindern. Der Röhrenadapter wurde an einer 60-cm³-Spritzenhülse festgemacht, welcher durch eine Ringgestellklemme in vertikaler Position gehalten wurde. Die Spritze wurde bis zur 60-cm³-Marke mit DI-Wasser gefüllt, wobei darauf zu achten ist, dass der Röhrenadapter zuerst befüllt wird, um keine Luftblase einzuschließen. Das Fluid wurde lediglich unter dem Einfluss der Schwerkraft und des Atmosphärendrucks strömen gelassen.
Innerhalb etwa 5 Minuten war zu beobachten, wie Feuchtigkeit durch die Nylonmaschen sickerte. Innerhalb 60 Minuten hatte sich ein voller Wassertropfen auf dem Sieb angesammelt. Die Strömung blieb an diesem Punkt schwach, ging aber beständig weiter.
Das Experiment zeigt, dass eine dicht gepackte Matrix von vernetzten HA-Mikrokugeln Fluid mit minimalem Druck fließen lässt. Der Fluidtransport in den Zwischenräumen zwischen Partikeln sowie durch die hydratisierten Partikel etabliert einen beständigen Fluidstrom durch die Matrix.
Beispiel #7–Chirurgische Anwendung von HA-Mikrokugeln
Es wurde eine Mikrokugelformulierung gemäß Beispiel 4 hergestellt und in eine 1-ml-Spritze gefüllt. Mit Hilfe einer 20-Gauge-Nadel wurde das Material in eine Ex-vivo-Probe von Muskelgewebe injiziert, was eine lokale Gewebe-Dilatation und -Dehnung um die Injektionsstelle bewirkte. Die Untersuchung der Injektionsstelle durch Sezie rung und Mikroskopie wies eine Ansammlung von Mikrokugeln nach, die ein zusammenhängendes Massenimplantat an der Injektionsstelle bilden.
Beispiel #8–Arzneistoff-Abgabereservoir-Anwendung von HA-Mikrokugeln
Es wird eine Mikrokugelformulierung gemäß Beispiel 4 hergestellt und in eine 1-ml-Spritze gefüllt. Mit einer Spritzennadel wird das Material in das weiche Bindegewebe eines Säugers injiziert, um eine Implantatmasse zu erzeugen, die zur langsamen Freisetzung von Arzneistoff, der in die Mikrokugelformulierung eingebunden ist, in der Lage ist.
Beispiel #9–Parenterale Anwendung von HA-Mikrokugeln
Eine Mikrokugelformulierung gemäß Beispiel 5 wurde mit einer resultierenden Mikrokugelkonzentration von ungefähr 1 Gew.-% hergestellt. Die injizierbare Formulierung wird intravenös in ein Versuchstier injiziert, wodurch sich eine zeitabhängige Konzentration zirkulierender Mikrokugeln im Blutstrom ohne einen nachteiligen physiologischen Effekt ergibt.

Claims

Injizierbare Zusammensetzung zur Anwendung in direktem Gewebekontakt, umfassend Mikrokugeln aus stabilisierter Hyaluronsäure, wobei die Mikrokugeln im wesentlichen kugelförmig und gleichförmig sind, so dass Regeln der dichten Packung für eine Masse dieser Mikrokugeln gelten, wobei bei Injektion in Gewebe ein Implantat mit verbundener Porosität bereitgestellt wird, wobei diese verbundene Porosität den freien Transport von Fluid in vivo ermöglicht, und das resultierende Implantat antifibrotische Eigenschaften zeigt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Mikrokugeln mindestens einen hohlen Kern aufweisen.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Mikrokugeln mittels Sprühtrocknung hergestellt werden.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Mikrokugeln mittels Koagulation einer Lösung eines Biomaterials, das in ein Nicht-Lösungsmittel dieses Biomaterials eingeführt wurde, hergestellt werden.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Mikrokugeln ionisch vernetzt werden.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Mikrokugeln chemisch vernetzt werden.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Mikrokugeln in einer Lösungsmittelmischung, die ein organisches Lösungsmittel umfasst, chemisch vernetzt werden.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, worin die vernetzten Mikrokugeln eine Fluidaufnahme zwischen 10 Gew.-% und 1000 Gew.-% aufweisen.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Mikrokugeln zusätzlich Vernetzungsmittel umfassen.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Mikrokugeln unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimid-Vernetzungsmittels chemisch vernetzt werden.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Mikrokugeln einen durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 0,5 bis 100 μm aufweisen.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Mikrokugeln einen durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 0,5 bis 20 μm aufweisen.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung zusätzlich Protease-Inhibitoren, antiproliferative Mittel, antifibrotische oder antiinflammatorische Mittel umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Mikrokugeln ferner ein therapeutisches oder diagnostisches Mittel enthalten.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Mikrokugeln in einem Fluidmedium in einer Konzentration zwischen 2 Gew.-% und 50 Gew.-% suspendiert werden.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, wobei das Fluidmedium Wasser umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, wobei das Fluidmedium auf einen ungefähr physiologischen pH gepuffert ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, wobei das Fluidmedium eine gepufferte Dispersion von nichtvernetzter Hyaluronsäure umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, worin die Mikrokugeln eine Dilatation eines Geweberaums ermöglichen, wenn sie mittels einer Spritzennadel oder Kanüle injiziert werden.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Zusammensetzung durch eine Spritzennadel oder Kanüle injizierbar ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Zusammensetzung durch eine 30-Gauge-Nadel oder -Kanüle injizierbar ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Zusammensetzung zusätzlich einen farbigen oder fluoreszierenden Farbstoff enthält.
Kit zur chirurgischen Manipulation von Geweben durch lokalisierte Injektion von Mikrokugeln, umfassend – die injizierbare Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22, – Mittel zum Injizieren dieser Zusammensetzung in einen lokalen Bereich eines Gewebes.
Kit gemäß Anspruch 23, worin das Mittel zum Injizieren der Zusammensetzung eine Nadel mit einem 30-Gauge-Durchmesser oder weniger umfasst.
Kit gemäß Anspruch 23 oder 24, worin es sich bei dem Mittel zum Injizieren der Zusammensetzung um eine Mikrokanüle handelt, die zur Injektion dieser Zusammensetzung in den Schlemm-Kanal des Auges konfiguriert ist.
Kit gemäß Anspruch 25, worin ein farbiger Marker mit der injizierbaren Zusammensetzung aus Mikrokugeln assoziiert ist.