ES2251971T3 - Peptido colagenico reticulado para la prevencion de las adherencias post-quirurgicas. - Google Patents

Peptido colagenico reticulado para la prevencion de las adherencias post-quirurgicas.

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ES2251971T3 ES00909403T ES00909403T ES2251971T3 ES 2251971 T3 ES2251971 T3 ES 2251971T3 ES 00909403 T ES00909403 T ES 00909403T ES 00909403 T ES00909403 T ES 00909403T ES 2251971 T3 ES2251971 T3 ES 2251971T3
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Abstract

Medio para la prevención de las adherencias post-quirúrgicas, caracterizado por contener al menos un péptido colagénico modificado por injertación de funciones tiol libres o substituidas, entrecruzable y/o al menos en parte entrecruzado y cuyas funciones tiol son aportadas por restos mercaptoaminados exclusivamente injertados sobre los ácidos aspártico y glutámico de las cadenas colagénicas por medio de uniones amida.

Description

Péptido colagénico reticulado para la prevención de las adherencias post-quirúrgicas.
El campo de la invención es el de los biomateriales medicamentosos o quirúrgicos biocompatibles y biorreabsorbibles útiles en la prevención de las adhesiones post-operatorias, más particularmente como consecuencia de intervenciones quirúrgicas intraperitoneales y pelvianas.
La invención se relaciona con un medio, más especialmente, aunque sin limitación, una película, un gel o un líquido (aplicable, v.g., por pulverización) para la prevención de estas adherencias post-quirúrgicas, constituido por un péptido colagénico específico, químicamente modificado, entrecruzado in situ o utilizado en estado entrecruzado.
La invención también contempla un procedimiento de obtención, entre otros, del medio antes citado.
Uno de los principales problemas encontrados en cirugía, especialmente digestiva abdominal y ginecológica, está ligado a la formación de adherencias post-quirúrgicas (unión anormal entre dos superficies o segmentos de tejido normalmente separadas) que resulta de una actividad inflamatoria y/o cicatricial automáticamente generada por un traumatismo de los tejidos engendrado por la intervención. Dichas adhesiones deslocalizadas pueden tener repercusiones molestas. Así, en cirugía abdominal, estas adhesiones pueden producir obstrucciones. En cirugía ginecológica, las adhesiones pelvianas post-operatorias son una de las causas reconocidas de la falta de eficacia del tratamiento quirúrgico de la esterilidad.
Para intentar remediar este problema, se han propuesto aproximaciones químicas y/o terapéuticas. La aproximación química consiste en aplicar sobre las heridas quirúrgicas agentes de tratamiento químico, aptos para refrenar los fenómenos fisiológicos de inflamación y de cicatrización que se hallan en el origen de las adhesiones. Estos agentes de tratamiento son enzimas, tales como fibrinolisina y papasa, o también productos tales como fenilbutazona, prednisolona, polivinilpirrolidona o dextranos.
La aproximación física consiste en aislar la herida quirúrgica del tejido vecino intercalando una barrera física, que puede ser una película o cura fibrosa o no fibrosa, tejida o no tejida o en forma de gel. Esta barrera física impide la adhesión en el curso de la cicatrización. Pero, dado que esta última ya no se usa y como los riesgos de adhesión son inexistentes, esta barrera física no representa más que un cuerpo extraño inútil, incluso molesto, por no decir peligroso en ciertos casos.
Se deduce de ello que los medios antiadhesivos conocidos en materiales poliméricos del tipo politetrafluoroetileno o silicona, aun habiendo sido probados en material de antiadhesión, no permanecen biodegradables y deben ser, pues, retirados en una segunda operación quirúrgica. Esta práctica doblemente traumática para el paciente tiene también el inconveniente de desplazar el problema de la adhesión post-quirúrgica de una región tisular a otra lesionada en la segunda operación (laparotomía).
Así, para no quedarse ahí, se ha tratado de desarrollar medios de prevención de las adherencias quirúrgicas post-operatorias, constituidos por materiales biodegradables (o biorreabsorbibles), en términos de cicatrización, por cumplir su función de barrera y no persistir ningún riesgo de adhesión.
Conociendo las presuntas propiedades de biodegradabilidad y biocompatibilidad de los polímeros naturales y de sus derivados, algunos investigadores propusieron usar péptidos colagénicos (colágeno, gelatina), polisacáridos (celulosa-almidón y derivados) y mucopolisacáridos, entre otros, como material constitutivo de implantes o de prótesis quirúrgicas y especialmente de barreras contra las adhesiones post-quirúrgicas.
La Sociedad Johnson & Johnson Products Inc. ha puesto a punto un material biorreabsorbible a base de celulosa regenerada, oxidada, útil como barrera contra la adhesión post-operatoria y que se presenta en forma de tejido que tiene una densidad de 8 a 15 mg/cm^{2} y una porosidad del 10 al 20%. (EP-A-0.213.563). La Sociedad JOHNSON & JOHNSON ha desarrollado también un procedimiento para la preparación de celulosa oxidada neutralizada cuya integridad y resistencia a la tracción se conservan, en vista a su utilización, especialmente, como medio para la prevención de las adherencias post-quirúrgicas (EP-A-0.437.095). Como continuación de ello, esta Sociedad ha puesto también a punto una película de múltiples capas de celulosa oxidada y de celulosa, útil como barrera anti-adhesión o como cura (EP-A-0.815.881).
En las patentes US-A-5.017.229 y US-A-5.527.893, los inventores BURNS y col., de la Sociedad GENZYME CORPORATION, describen una barrera para la prevención de las adherencias post-quirúrgicas constituida por un polisacárido polianiónico, a saber, la carboximetilcelulosa, asociado a ácido hialurónico, para formar un gel.
De forma general, las aplicaciones de los materiales colagénicos como películas quirúrgicas son conocidas desde hace mucho tiempo. Así, la patente inglesa GB-A-1.095.552 de 1964 describe una película de colágeno formada por una multiplicidad de filamentos no tejidos.
La patente francesa FR-A-2.628.634 describe un parche de cirugía visceral realizado a partir de un biomaterial formado por dos capas de colágeno superpuestas y asociadas íntimamente, a saber, una capa porosa adherente de colágeno fibroso y una película de colágeno y/o de gelatina. Este parche pretende permitir una buena cicatrización de las vísceras. Se trata de una cura destinada a reemplazar temporalmente la pared visceral que se ha de reconstituir. Se presenta como enteramente biodegradable y como apta para realizar un excelente efecto de confinamiento y de hemostasis. No se trata específicamente de una aplicación de prevención de las adherencias post-quirúrgicas.
La solicitud de patente PCT WO 96/08.277 se relaciona con la utilización de membranas colagénicas como prótesis de regeneración peritoneal. El material colagénico considerado es un gel de colágeno eventualmente entrecruzado, transparente, biocompatible, suturable o injertable y biorreabsorbible. El colágeno utilizado es un colágeno con o sin telopéptidos, eventualmente asociado a un glicosaminoglicano. Hay que hacer notar que el agente entrecruzante eventualmente utilizado es un compuesto químico reactivo (glutaraldehído, difenilfosforilazida, carbodiimida) que no es neutro en términos de toxicidad.
En la patente FR-A-2.628.634, el parche está formado por dos capas de colágeno superpuestas y asociadas íntimamente. La primera capa está formada por colágeno fibroso, lo que le confiere una naturaleza porosa y adherente. La segunda capa es obtenida por adherencia de una película de colágeno o de gelatina sobre la primera capa de colágeno fibroso. Este parche presenta, según los inventores de la patente PCT WO 96/08277, una resistencia mecánica relativamente débil. El documento FR-A-2.628.634 no dice nada sobre la prevención de las adherencias post-quirúrgicas.
La solicitud de patente Europea EP-A-0.686.402 divulga una membrana colagénica para la prevención de las adherencias post-quirúrgicas, que consiste en un soporte a base de colágeno revestido de una capa de gelatina no mezclada con el soporte. Esta membrana se presenta, preferiblemente, en forma liofilizada. El colágeno utilizado puede ser entrecruzado con ayuda de difenilfosforilazida ("DPPA"). También aquí la elección de este género de colágeno entrecruzado no resulta una buena aliada debido a los problemas de toxicidad que subtiende.
La solicitud de patente francesa FR-A-2.759.083 describe un material colagénico útil especialmente para la prevención de adherencias post-operatorias. Este material colagénico sería, según los inventores, biocompatible, no tóxico, potencialmente adhesivo y biodegradable en menos de una semana. Este material colagénico contiene colágeno modificado por escisión oxidativa y calentamiento por encima de 37ºC y entrecruzado en presencia de al menos un aditivo hidrófilo macromolecular químicamente no reactivo con el colágeno. El agente hidrófilo es, por ejemplo, polietilenglicol o un polisacárido, tal como el almidón, el dextrano o la celulosa.
Se deduce de esta revisión de la técnica anterior que ninguno de los materiales biodegradables, especialmente celulósicos o colagénicos, utilizados hasta entonces en la prevención de las adherencias post-quirúrgicas da satisfacción, especialmente por las razones enunciadas a continuación.
\bullet
Algunos pueden tener una toxicidad residual, teniendo en cuenta su modo de entrecruzamiento químico, por ejemplo con ayuda de aldehídos.
\bullet
La biodegradabilidad no es suficientemente controlable para poder adecuarla con el mantenimiento de su función de barrera física entre los tejidos durante, y únicamente durante, la duración de la cicatrización, en el curso de la cual existen los riesgos de adherencia quirúrgica.
\bullet
Algunos tienen una resistencia mecánica inicial muy baja.
\bullet
Tratándose de materiales colagénicos, no pueden ponerse en forma de soluciones filtrables sobre filtros cuya porosidad sea lo suficientemente débil como para permitir la retención de contaminantes biológicos (esterilización).
Uno de los objetivos esenciales de la presente invención es proporcionar un medio, a base de colágeno, para la prevención de las adherencias post-quirúrgicas, debiendo satisfacer este medio un pliego de condiciones que remedien los inconvenientes antes contemplados de los materiales de la técnica anterior.
Otro objetivo esencial de la invención es proporcionar un medio para la prevención de las adherencias post-quirúrgicas que contiene un material colagénico y apto para poder servir de soporte para uno o varios agentes químicos de lucha contra las adherencias post-quirúrgicas.
Otro objetivo esencial de la invención es proporcionar un medio para la prevención de las adherencias post-quirúrgicas, que contiene un colágeno modificado y entrecruzado que puede ser fabricado en forma de película o de membrana. Esta película o membrana puede estar constituida por un material compuesto que contenga, por una parte, colágeno modificado químicamente y entrecruzado que satisfaga las exigencias antes contempladas y, por otra parte, un material de refuerzo, tejido o no, preferiblemente biodegradable, de naturaleza colagénica o no colagénica.
Otro objetivo esencial de la invención es proporcionar un medio para la prevención de las adherencias post-quirúrgicas constituido por una forma líquida (v.g.: líquido pulverizable o gel) de viscosidad adaptada que contiene colágeno modificado, al menos en parte no entrecruzado, entrecruzable in situ sobre los tejidos biológicos.
Otro objetivo esencial de la invención es proporcionar un medio para la prevención de las adherencias post-quirúrgicas que sea económico y fácil de obtener, de manipular y de utilizar.
Llevados por estos objetivos, los inventores han conducido largas y laboriosas investigaciones y experimentaciones al término de las cuales han podido poner a punto de forma totalmente sorprendente e inesperada un nuevo péptido colagénico, modificado químicamente, entrecruzable y/o entrecruzado por medio de puentes disulfuro unidos a las unidades carboxílicas de los ácidos aspártico y glutámico de las cadenas colagénicas por uniones amida. Este nuevo colágeno entrecruzable/entrecruzado ha mostrado ser particularmente apropiado como elemento constitutivo esencial de un medio -de hecho, nuevo él también- para la prevención de las adherencias post-quirúrgicas.
De donde se deduce que la presente invención satisface los objetivos antes contemplados, entre otros, proporcionando un medio para la prevención de las adherencias post-quirúrgicas, caracterizado por contener al menos un péptido colagénico modificado por injertación de funciones tiol libres o substituidas, entrecruzable y/o al menos en parte entrecruzado y cuyas funciones tiol son aportadas por restos mercaptoaminados exclusivamente injertados sobre los ácidos aspártico y glutámico de las cadenas colagénicas por medio de uniones amida.
En el sentido de la presente invención, el término "péptido colagénico" designa especialmente el colágeno con (natural) o sin telopéptido y el colágeno desnaturalizado, así como la gelatina.
La patente US 5.412.076 describe también colágeno entrecruzable modificado por injertación de funciones tiol pertenecientes a restos mercaptoaminados fijados sobre el colágeno por medio de un espaciador de tipo ácido dicarboxílico. Las funciones carboxílicas de este último reaccionan con los grupos alcohol o amina libres del colágeno. El resto mercaptoaminado, por su parte, reacciona por medio de su función amina libre con los grupos carboxílicos presentes sobre la cadena colagénica. Estos grupos son así de dos tipos: los aportados por el espaciador y los existentes en el estado natural en el colágeno, es decir, portados por los ácidos aspárticos y glutámicos.
Contrariamente a la patente US 5.412.076, el péptido colagénico seleccionado según la invención tiene de particular que las funcionalidades de entrecruzamiento son portadas exclusivamente por restos carboxilo de los ácidos aspártico y glutámico de la cadena colagénica. Esto confiere propiedades ventajosas inesperadas en el plano de la mecánica, de la solubilidad en medio acuoso, de la adherencia y de la biología (biodegradación). Este péptido colagénico químicamente modificado puede existir en al menos tres formas diferentes:
A.
precursor con funciones tiol substituidas,
B.
precursor entrecruzable con funciones tiol libres y
C.
forma entrecruzada -S-S-.
La forma B puede ser obtenida a partir de A y la forma C a partir de la forma B.
El medio de prevención de las adherencias según la invención comprende al menos una de las formas A, B o C. Está claro que las formas A y B corresponden más especialmente al medio en estado de acondicionamiento y de almacenamiento del medio antes de la aplicación en el sitio en el que está destinado a expresar su función de antiadherencia. Y es en la forma entrecruzada C que dicho medio expresa mejor esta función.
En la forma entrecruzada C, el péptido colagénico, químicamente modificado, que entra en la composición del medio según la invención, puede tener grandes densidades de puentes disulfuro, que le procuran una excelente estabilidad, así como buenas propiedades elásticas y una gran resistencia mecánica. Otra ventaja de este péptido colagénico juiciosamente seleccionada está en el hecho de que su nivel de entrecruzamiento puede ser controlable. Finalmente, la modificación química por injertación de restos mercaptoaminados del péptido colagénico considerado no presenta perjuicios, o presenta pocos, sobre su biocompatibilidad.
La utilización de este péptido colagénico al menos en parte entrecruzado (C) como medio para la prevención de las adherencias post-quirúrgicas es muy juiciosa y original. Permite disponer de un nuevo medio de antiadhesión que hace barrera entre los tejidos, de forma muy eficaz y siendo perfectamente tolerado por el organismo de los pacientes. Su biorreabsorbibilidad puede ser regulada de tal forma que el medio conserve su función de efecto barrera durante el tiempo necesario para la cicatrización.
El medio según la invención puede dar lugar a diferentes productos manufacturados de tipo película, gel, líquido pulverizable, cura, gasa, compresa, emplasto, etc.
Otra disposición ventajosa de este medio resulta del hecho de que las formas A y B intermediarias pueden presentarse en estado de solución filtrable sobre mallas inferiores a 0,22 micras. Ello permite efectuar rápida y fácilmente una esterilización, a la que no se pueden aproximar los productos destinados a implantación in vivo.
Ventajosamente, al menos una parte del péptido colagénico modificado constitutivo del medio según la invención está en forma de un precursor A sobre el cual están injertados restos mercaptoaminados portadores de funciones tiol substituidas, respondiendo al menos una parte de estos restos mercaptoaminados a la fórmula general (I) siguiente:
(I)--- NH --- 
\delm{C}{\delm{\para}{R ^{1} }}
H --- (--- CR^{0}_{2} ---)_{x} --- SR^{2}
donde:
\bullet
x = 1 ó 2;
\bullet
R^{0} = H o CH_{3};
\bullet
R^{1} representa H o COOR^{3}, correspondiendo R^{3} a un radical hidrocarbonado de tipo alifático, aromático o alicíclico, preferiblemente alquílico, alquenílico, arílico, aralquílico, alquilarílico, aralquenílico, alquenilarílico y, más preferiblemente aún, de tipo metílico o etílico;
\bullet
R^{2} es un radical alifático y/o alicíclico y/o aromático, preferiblemente un alquilo o un acilo eventualmente azufrado y/o aminado, y más preferiblemente aún R^{2} responde a la fórmula (II) siguiente:
(II)--- S --- (--- CR^{00}_{2} ---)_{y} --- 
\delm{C}{\delm{\para}{R ^{4} }}
H --- NH_{2}
\bullet
donde y, R^{00} y R^{4} responden a la misma definición que la dada en la leyenda de la fórmula (I) para x, R^{0} y R^{1}.
En la práctica, los restos mercaptoaminados, injertados sobre la forma A del péptido colagénico, son seleccionados entre el grupo de los radicales siguientes:
(L1)-NH-(-CH_{2}-)_{2}-S-S-(-CH_{2}-)_{2}-NH_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
(L2)--- NH --- 
\delm{C}{\delm{\para}{COOCH _{3} }}
H --- CH_{2} --- S --- S --- CH_{2} --- 
\delm{C}{\delm{\para}{COOCH _{3} }}
H --- NH_{2} 
\vskip1.000000\baselineskip
(L3)--- NH --- 
\delm{C}{\delm{\para}{COOCH _{2} CH _{3} }}
H --- CH_{2} --- S --- S --- CH_{2} ---
\delm{C}{\delm{\para}{COOCH _{2} CH _{3} }}
H --- NH_{2}
Para transformar el precursor A en el cual R^{2} corresponde a: -S-radical hidrocarbonado (tioles substituidos), en precursor entrecruzable B intermediario de tipo tiol, se procede a una reducción con ayuda de agentes reductores conocidos, tales como mercaptanos (mercaptoetanol, ácido mercaptoacético, mercaptoetilamina, bencilmercaptano, tiocresol, ditiotreitol...) y/o de sales reductoras (NaBH_{4}, Na_{2}SO_{3}...) y/o de reductores orgánicos (fosfina).
Así, según una característica preferida de la invención, al menos una parte del péptido colagénico modificado está en una forma B de precursor entrecruzable intermediario de tipo tiol, sobre el cual están injertados restos mercaptoaminados, al menos una parte de los cuales responde a la fórmula general (I) dada anteriormente y en la cual el substituyente R^{2} corresponde a hidrógeno y donde R^{3} puede representar hidrógeno o una sal (Na^{+}, K^{+}, Li^{+}), además de los grupos hidrocarbonados, tales como los definidos anteriormente en la leyenda de la fórmula (I), para mientras se desprotege el éster.
Tratándose de los precursores entrecruzables B de tipo tiol correspondientes a la fórmula (I) en la cual R^{2} = H, su transformación en péptido colagénico entrecruzado C (entrecruzamiento) se realiza por oxidación de los tioles en puentes disulfuro. Ello permite obtener una red colagénica tridimensional insoluble en los medios fisiológicos y soluble en los medios reductores capaces de reducir los puentes disulfuro. Esta oxidación puede intervenir espontáneamente en presencia del oxígeno del aire, ventajosamente en medio débilmente básico y eventualmente en presencia de agentes auxiliares oxidantes, tales como el agua oxigenada o los derivados yodados (solución de yodo, Betadine).
Así, según una modalidad preferida del medio según la invención, al menos una parte del péptido colagénico modificado está en una forma C entrecruzada que contiene cadenas colagénicas unidas entre sí por puentes disulfuro, cuyos átomos de azufre constitutivos pertenecen a restos mercaptoaminados exclusivamente injertados sobre los ácidos aspártico y glutámico de las cadenas colagénicas por medio de uniones amida.
De forma aún más preferida, el péptido colagénico en forma C es obtenido a partir del péptido colagénico B.
Estos péptidos colagénicos entrecruzados C tienen un nivel de entrecruzamiento controlable actuando sobre la razón de substitución de las unidades carboxílicas de los residuos de ácido aspártico y glutámico de las cadenas colagénicas. Se dispone así de un cierto margen de maniobra para seleccionar la calidad mecánica de los materiales apropiados para la aplicación contemplada.
Los puentes disulfuro de estos péptidos colagénicos entrecruzados C pueden reducirse con ayuda de agentes reductores apropiados, ejemplos de los cuales se han dado anteriormente.
Según una variante de la invención, el péptido colagénico A, entrecruzable B y/o al menos en parte entrecruzado C, constitutivo del medio reivindicado es también portador de injertos G fijados sobre la menos una parte de las unidades de amina libres de la cadena colagénica por medio de uniones amida, siendo G un acilo que contiene una entidad hidrocarbonada, CON EXCLUSIÓN de los restos mercaptoaminados, especialmente de aquéllos como los definidos anteriormente, que contiene eventualmente heteroátomos (ventajosamente O y/o N), preferiblemente seleccionada entre alquilos y/o alquenilos y/o alicíclicos y/o aromáticos, y más preferiblemente aún entre grupos que tienen una cadena de alquilo, eventualmente insaturada y que tiene de 1 a 22 átomos de carbono o que responde a la fórmula (III) siguiente:
(III)--- CO --- (--- CH_{2} ---)_{z} --- (--- O --- CH_{2} --- 
\uelm{C}{\uelm{\para}{R ^{5} }}
H ---)_{n} --- O --- R^{6}
donde:
\bullet
R^{5} = H o CH_{3};
\bullet
R^{6} = H, un radical alquilo lineal o ramificado y preferiblemente un metilo;
\bullet
z = 0, 1 ó 2 y n > 0.
Esta funcionalización suplementaria sobre los sitios amina de las lisinas puede conferir a los péptidos colagénicos modificados una aptitud suplementaria para el entrecruzamiento o también un carácter hidrófilo o hidrófobo, incluso tensoactivo. Es también concebible que esta funcionalización tenga fines terapéuticos gracias al anclaje de un principio activo, que podría ser, por ejemplo, en la aplicación en cuestión, uno o varios agentes químicos de tratamiento de la anti-adhesión.
Según una característica interesante de la invención, este injerto G, fijado sobre las aminas libres de la cadena colagénica del péptido colagénico entrecruzado, modifica el carácter hidrófilo/hidrófobo del producto, lo que permite modular las propiedades de hinchamiento, de resistencia mecánica y de cinética de degradación.
En lo que concierne a la obtención de un precursor colagénico A portador de restos mercaptoaminados (I), consiste esencialmente en hacer reacción en solución al péptido colagénico con al menos un precursor de un resto mercaptoaminado cuya función tiol y la eventual función carboxílica están bloqueadas, en presencia de al menos una gente de injertación, preferiblemente seleccionado entre el grupo de los productos que activan los grupos carboxílicos, preferiblemente entre las carbodiimidas. Las condiciones de obtención son seleccionadas de tal forma que la injertación del resto mercaptoaminado se realiza sobre las unidades de ácido carboxílico libres de los restos de ácido aspártico y glutámico de la cadena colagénica.
Con este fin, el precursor que se va a injertar debe poseer una función amina libre apta para reaccionar con los COOH colagénicos y formar una unión amida. Este precursor es, por ejemplo, una cisteína, una homocisteína o una cisteamina, cuya función tiol y la eventual función ácido carboxílico está(n) correctamente protegida(s). Un medio eficaz de protección de la función tiol es seleccionar como residuo cisteico que se va a injertar la cistina, la homocistina o la cistamina, que contienen las tres un puente disulfuro estabilizador de la función mercapto. Como otro medio de protección de esta última, se puede seleccionar cualquier función clásica de protección de los tioles conocida en la técnica anterior (véase, por ejemplo, "Greene: Protecting Groups in Organic Chemistry, WILEY, 1975").
Las funciones COOH pueden, por su parte, ser protegidas con ayuda de un grupo protector o cualquier otra función orgánica que pueda aportar una propiedad cualquiera interesante (los PEG, grupos hidrofóbicos o hidrofílicos o cargados).
Según una disposición ventajosa de la invención, el precursor del resto mercaptoaminado que se va a injertar responde a una fórmula (IV) correspondiente a la fórmula (I) dada anteriormente y en la cual la valencia libre está substituida por un substituyente apto para reaccionar con las funciones carboxílicas de los ácidos aspártico y glutámico de la cadena colagénica, siendo este substituyente preferiblemente hidrógeno, de tal forma que la función reactiva sea una amina primaria. Los precursores de fórmula (IV) muy especialmente preferidos son la cistamina (I.1), el éster dimetílico de cistina (I.2) y el éster dietílico de cistina (I.3), que contienen todos un puente disulfuro que protege la función mercapto.
En la práctica, la injertación del resto mercaptoaminado se efectúa procediendo a la disolución del péptido colagénico y después del precursor del resto mercaptoaminado que se va a injertar en un solvente apropiado. Puede tratarse, por ejemplo, de agua (preferiblemente) o de un solvente orgánico, como el sulfóxido de dimetilo ("DMSO"), la N-metilpirrolidona (NMP) u otros. El precursor del resto mercaptoaminado que se va a injertar está siempre presente en gran exceso, con el fin de evitar que el colágeno activado reaccione con las aminas contenidas en su propio esqueleto.
Se añade luego a la solución de reacción un agente copulante, tal como una carbodiimida, y se deja que se produzca la injertación manteniendo el medio en agitación durante varias horas a temperatura ambiente.
Estos péptidos colagénicos A substituidos por restos mercaptoaminados precursores de los restos tiol entrecruzables son nuevos productos intermediarios estables y solubles en agua. Pueden ser aislados y purificados, por ejemplo, por diálisis, diafiltración y luego liofilización, o por precipitación en medio orgánico y secado después.
Los precursores colagénicos intermediarios B de tipo tiol en los cuales R^{2} = H pueden ser obtenidos por un procedimiento consistente esencialmente en desproteger (transformación en tioles) las funciones mercapto de los restos mercaptoaminados injertados sobre los péptidos colagénicos A modificados como se ha indicado anteriormente.
En el caso en que se asegura la protección o el enmascaramiento de las funciones mercapto por un puente disulfuro (es decir, cuando los precursores de los injertos son, v.g., la cistamina o la cistina), la regeneración de la función tiol se hace por reducción. Esta última puede ser realizada con ayuda de agentes reductores, tales como mercaptanos (mercaptoetanol, ácido mercapto-acético, mercaptoetilamina, bencilmercaptano, tiolcresol, ditiotreitol...) y/o sales reductoras (NaBH_{4}, Na_{2}SO_{3}...) y/o reductores orgánicos (fosfina).
Ventajosamente, se procede a una reducción del puente disulfuro de protección en medio acuoso básico con ayuda de ditiotreitol. Después de esta etapa, el colágeno tiolado obtenido es purificado por diálisis/diafiltración y puede ser aislado, v.g., por liofilización.
Como se deduce ya de lo que antecede, los péptidos colagénicos entrecruzados C son preparados por oxidación de las funciones tiol del péptido colagénico modificado entrecruzable B, para formar puentes disulfuro intercatenarios.
Tratándose de la funcionalización de dichos péptidos colagénicos mediante injertos G de naturaleza diferente de la de los injertos de fórmula (I) (eventualmente hidrogenados) fijados al COOH de los ácidos aspártico y glutámico, ésta consiste esencialmente en:
\bullet
proceder a una acilación de al menos una parte de las funciones amina libres de la cadena colagénica para fijar sobre éstas injertos G que comprenden una entidad hidrocarbonada, CON EXCLUSIÓN de los restos mercaptoaminados, especialmente como los definidos anteriormente, conteniendo esta entidad eventualmente heteroátomos (ventajosamente O y/o N), preferiblemente seleccionada entre alquilos y/o alquenilos y/o alicíclicos y/o aromáticos y, más preferiblemente aún, entre grupos que contienen una cadena de alquilo, eventualmente insaturada o que responde a la fórmula (III) siguiente:
(III)--- CO --- (--- CH_{2} ---)_{z} --- (--- O --- CH_{2} --- 
\uelm{C}{\uelm{\para}{R ^{5} }}
H ---)_{n} --- O --- R^{6}
donde:
\diamondsuit
R^{5} = H o CH_{3};
\diamondsuit
R^{6} = H, un radical alquilo lineal o ramificado y preferiblemente un metilo;
\diamondsuit
z = 0, 1 ó 2 y n > 0;
\bullet
hacer reaccionar en solución al péptido colagénico con al menos un precursor de un resto mercaptoaminado cuya función tiol y la eventual función carboxílica están bloqueadas, en presencia de al menos un agente de injertación, preferiblemente seleccionado entre el grupo consistente en compuestos capaces de activar los grupos carboxílicos, preferiblemente carbodiimidas.
Para poder reaccionar por acilación con las funciones amina libres de las lisinas de la cadena colagénica, los precursores de los injertos G deben llevar al menos una función ácido carboxílico activable.
Las reacciones de acilación y de copulación de funciones amina con sitios carboxílicos pertenecientes a proteínas son conocidas por el experto en la técnica en el campo de la bioquímica de las proteínas. Para más detalles en este sentido, se hará referencia especialmente a las obras siguientes:
- "Techniques in protein chemistry", R.L. LUNDBLAD, Capítulos 10-14;
- "Chemistry of protein conjugation and cross-linking", S.S. WONG, Boca Ratón, CRC Press, 1993, Capítulo 2.
Después de esta descripción del producto constitutivo esencial del medio según la invención, se dan a continuación indicaciones precisas en cuanto a los caracteres físicos, al método de preparación y al modo de utilización de dicho medio para la prevención de las adherencias post-quirúrgicas.
Conforme a un primer modo de realización del medio según la invención, éste se presenta en forma de película.
Mediante el término "película", se entiende, en el sentido de la presente invención, un material en forma de hoja cuya superficie es sensiblemente mayor que el espesor.
Según un segundo modo de realización del medio según la invención, éste se presenta en forma de materia fibrosa, tejida o no tejida, preferiblemente tejida y más preferiblemente aún tejida con mallas tricotadas.
A modo de ejemplos de medios según la invención constituidos por materiales colagénicos fibrosos, se pueden citar las telas tejidas y/o tricotadas y/o trenzadas, o bien los fieltros y las esteras.
Según un tercer modo de realización del medio según la invención, éste puede presentarse en forma de película (o de tela) de material compuesto no homogéneo, en el cual se incluye un refuerzo de polímero biodegradable, de naturaleza colagénica o no, en la matriz constituida por el péptido colagénico antes definido. El polímero que constituye el refuerzo puede ser el péptido colagénico seleccionado según la invención, colágeno no modificado u otros polímeros biocompatibles y biodegradables, tales como polímeros de ácidos \alpha-hidroxicarboxílicos (v.g., ácido poliláctico y/o poliglicólico), celulosas o almidones, modificados o no. No hay que excluir que estos polímeros de inclusión sean polímeros sintéticos o naturales no biodegradables, pero biocompatibles (v.g., siliconas,...).
El material de refuerzo puede presentarse bajo diferentes formas físicas, v.g.: cargas particuladas o fibrosas, esteras, fieltros, materiales tejidos, tricotados, trenzados,... En la práctica, el medio según la invención puede estar, por ejemplo, constituido por una película compuesta que contiene una matriz de péptido colagénico que se presenta al menos parcialmente en una forma entrecruzada C, tal como se ha definido antes, y un material de refuerzo constituido por un tejido o una estera que contiene fibras de polímeros de ácidos \alpha-hidroxicarboxílicos (ácido poliláctico y/o ácido poliglicólico).
Este material de refuerzo fibroso presenta, v.g., la misma forma que la matriz (por ejemplo, rectangular), teniendo al mismo tiempo dimensiones ligeramente más reducidas.
Según una forma de realización particular, el medio según la invención puede presentarse en forma de una película que contiene un refuerzo fibroso sobre una parte únicamente de su superficie. En la práctica, el material de refuerzo fibroso puede estar vaciado en su región central.
En cualquier caso, es ventajoso que el refuerzo fibroso esté presente sobre al menos una parte de los bordes de la película compuesta, de forma que ofrezca una zona adecuada para recibir hilos de sutura.
Partiendo del péptido colagénico entrecruzado en forma de película (eventualmente compuesta), es posible fabricar, conforme a la invención, membranas suturables eficaces en la prevención de las adherencias post-quirúrgicas.
Preferiblemente, el medio según la invención es una película compuesta cuya matriz es de péptido colagénico entrecruzado y donde el material de refuerzo se presenta en forma de materia fibrosa, tejida o no tejida, preferiblemente tejida y más preferiblemente aún tejida con mallas tricotadas, siendo seleccionado además ventajosamente este material de refuerzo entre los (co)polímeros de ácidos \alpha-hidroxicarboxílicos, preferiblemente los polilácticos y/o glicólicos.
Pero es totalmente concebible según la invención que el medio de prevención de las adherencias post-quirúrgicas sea dispuesto (aplicado) y/o implantado sobre el sitio en el que está destinado a hacer función de barrera, no en forma sólida, sino en forma líquida (fluida o viscosa). De ello se deduce que, según un cuarto modo de realización del medio de la invención, éste se presenta en forma no sólida, entrecruzable y/o al menos en parte entrecruzada, aplicable y/o implantable sobre y/o en un soporte.
En este caso, la forma no sólida es, por ejemplo, una solución de péptido colagénico entrecruzable (precursor B). Se aplica directamente sobre un soporte (por ejemplo, tejidos biológicos) y se somete después a un entrecruzamiento que permita su endurecimiento en gel. El entrecruzamiento puede ser obtenido in situ por acción de un agente químico oxidante aceptado desde el punto de vista médico, por el oxígeno del aire o por cualquier otro medio de oxidación fácilmente utilizable en el curso de una operación quirúrgica (UV, electrocoagulación...).
En este cuarto modo de realización, la forma no sólida del péptido colagénico, contenida en el medio según la invención, puede presentarse ventajosamente en forma de un líquido susceptible de gelificarse, especialmente por oxidación y/o físicamente en forma de gel destinado a ser aplicado así sobre un soporte (v.g., tejidos biológicos), donde ejercerá su acción antiadherente.
En esta forma no sólida gelificada, el péptido colagénico puede, eventual, pero no necesariamente, encontrarse parcialmente en forma entrecruzada. Pero es obvio que, en esta hipótesis, las proporciones de péptido colagénico entrecruzado C con respecto a su precursor no entrecruzado B son seleccionadas de tal forma que no se alcance el estado sólido.
La forma no sólida (es decir,, líquida) del precursor del péptido colagénico, a saber, v.g., una solución colagénica líquida, puede ser aplicada directamente con ayuda de un utensilio, preferiblemente una jeringa o un pulverizador (spray). Es así que, según una variante ventajosa del cuarto modo de realización del medio según la invención, este último incluye al menos un utensilio, preferiblemente una jeringa o un pulverizador, de almacenamiento y de aplicación en y/o sobre un soporte, de la forma no sólida del péptido colagénico entrecruzable y/o al menos en parte entrecruzado, tal como se ha definido anteriormente.
En el caso en el que el medio según la invención es un pulverizador de péptido colagénico modificado en forma líquida (spray), se puede asegurar la pulverización por un sistema de bomba/conducto y/o por un agente propulsor gaseoso.
El soporte puede entenderse aquí como tejidos biológicos (por ejemplo animales) que se desea curar y/o que se tratan, v.g., in vivo con vistas a prevenir las adherencias post-quirúrgicas.
Eventualmente, las propiedades reológicas de la solución colagénica pueden ser ajustadas por adición de un polímero natural o sintético biocompatible, preferiblemente biodegradable (como, por ejemplo, los polisacáridos, los glicosaminoglicanos, las proteínas o glicoproteínas, los polímeros etoxilados tales como el polietilenglicol...).
Cuando se utiliza el agente químico para entrecruzar la solución, éste es seleccionado, ventajosamente, entre los oxidantes empleados habitualmente en medicina, como, por ejemplo, el agua oxigenada.
Se puede asociar a este cuarto modo de realización del medio de la invención (líquido/gel de péptido colagénico) un procedimiento de realización de un medio de prevención de las adherencias post-quirúrgicas sobre tejido vivos, caracterizado por consistir, esencialmente, en:
\bullet
utilizar un fluido colagénico, v.g., una solución, del péptido colagénico del tipo antes definido,
\bullet
aplicar este fluido sobre tejidos biológicos, por ejemplo con ayuda de una jeringa o de un pulverizador, y
\bullet
hacer que intervenga un entrecruzamiento del fluido colagénico in situ, por ejemplo con ayuda de un oxidante biocompatible (v.g., oxígeno del aire, H_{2}O_{2}...).
Según una primera forma de utilización de este procedimiento, se puede realizar la mezcla entre el oxidante y el fluido, por ejemplo la solución colagénica, antes del depósito. En este caso, la solución aplicada está ya parcialmente entrecruzada en el momento del depósito. La homogeneidad de la mezcla de solución/oxidante puede quedar asegurada por un dispositivo de aplicación tal como un sistema de doble jeringa equipada con un cabezal de mezcla (dispositivo similar al utilizado para las colas biológicas a base de fibrina) y un doble pulverizador equipado con un conducto de mezcla o cualquier otro dispositivo que permita asegurar una mezcla homogénea.
Según una segunda forma de utilización de este procedimiento, se realiza la aplicación en dos tiempos. Preferiblemente, se efectúa el depósito del fluido, por ejemplo de la solución colagénica líquida, en primer lugar y se procede luego al depósito de la solución oxidante. Pero también se puede utilizar el orden inverso de adición.
Según un quinto modo de realización del medio según la invención, este último se presenta en forma de bloque homogéneo o compuesto, no asimilable en una película.
Según otro de sus aspectos, la presente invención se relaciona con un procedimiento de preparación de los medios para la prevención de las adherencias post-quirúrgicas tales como los descritos anteriormente.
Según una primera vía de utilización correspondiente a la preparación de las formas sólidas (por ejemplo, películas o bloques homogéneos o compuestos: 1º, 3º y 5º modos de realización), el procedimiento comprende las etapas esenciales siguientes:
1.
realizar una solución, preferiblemente acuosa, de precursor entrecruzable de péptido colagénico modificado;
2.
eventualmente filtrar esta solución para extraer de ella los elementos de tamaño superior o igual a 0,8 \mum, preferiblemente a 0,45 \mum y más preferiblemente aún a 0,2 \mum;
3.
dar forma al filtrado en la configuración contemplada para el medio de prevención de las adherencias post-quirúrgicas que se ha de preparar;
\newpage
4.
eventualmente gelificar la solución a la que se ha dado forma, en una fase de maduración, por disminución de su temperatura por debajo de su temperatura de gelificación;
5.
eventualmente eliminar el solvente, preferiblemente por evaporación;
6.
hacer que intervenga el entrecruzamiento, preferiblemente por oxidación;
7.
según el caso, eliminar por lavados sucesivos el eventual agente oxidante empleado;
8.
eventualmente impregnar el material entrecruzado o en el curso del entrecruzamiento con ayuda de una solución de al menos un agente plastificante (por ejemplo: glicerol, polietilenglicol de baja masa molecular);
9.
eventualmente secar el material entrecruzado;
10.
eventualmente recortar el material a las dimensiones de la aplicación, y
11.
eventualmente esterilizar por radiación el material entrecruzado.
Uno de los intereses del procedimiento de preparación según la invención reside en que puede ser practicado de forma simple, estéril y económica.
La etapa 1 de disolución se efectúa, por ejemplo, con ayuda de un solvente constituido por agua estéril, a una temperatura comprendida entre 20 y 50ºC y un pH comprendido entre 6 y 8. Según una característica preferida de esta primera vía del procedimiento según la invención, la solución realizada en la etapa 1 tiene un título de precursor entrecruzable de péptido colagénico superior o igual al 1% y preferiblemente comprendido entre el 1 y el 15%.
La etapa 2, facultativa, pero no obstante preferida, de filtración es un medio de purificación, incluso de esterilización, de la solución preparada en la etapa 1. Gracias a la cualidad de solubilidad en agua del precursor del péptido colagénico entrecruzado, seleccionado según la invención, es posible filtrar las soluciones de precursor sobre filtros cuya porosidad es inferior a 0,8 micras, preferiblemente \leq0,45 micras y más preferiblemente aún del orden de 0,2 micras. Esta facultad de poder esterilizar por filtración es un logro importante en el plano industrial.
La etapa 3 consiste en dar forma a la solución filtrada para obtener un objeto entrecruzado de forma y de dimensión controladas. Para la realización de la etapa 3, se puede verter, por ejemplo, la solución filtrada en moldes, preferiblemente estériles. Según una variante de esta etapa, también se puede depositar la solución filtrada sobre un soporte plano estéril por impregnación. Según otra variante, se puede asegurar la dotación de forma por extrusión de la solución a través de una hilera de forma apropiada para el medio contemplado, por ejemplo rectangular. En este último caso, debe intervenir una cierta solidificación en la extrusión para que ésta sea posible.
La maduración facultativa, pero no obstante preferida, de la etapa 4 (o gelificación física) de la solución consiste en dejar reposar durante varias horas, incluso varios días, la solución a la que se dio forma a una temperatura inferior a su temperatura de gelificación o temperatura de transición gel/sólido, que puede estar, por ejemplo, comprendida entre 20 y 30ºC, en el caso de una solución acuosa de péptido colagénico.
La eliminación del solvente, preferiblemente agua, según la etapa 5 es una fase facultativa, que puede ser efectuada durante o después de la gelificación, preferiblemente después. Puede tratarse, preferiblemente, de una evaporación a una temperatura dada en la presencia eventual de agentes desecantes.
El entrecruzamiento según la etapa 6 es realizado sobre artículos conformados, eventualmente gelificados, que se presentan ventajosamente en forma seca. El entrecruzamiento consiste en oxidar el precursor de tipo tiol del péptido colagénico con ayuda de un oxidante, tal como el yodo o el H_{2}O_{2}. Después de varios minutos de contacto con el oxidante, es preferible realizar (etapa 7) lavados sucesivos de los artículos así trabajados. Éstos pueden ser entonces transformados según se desee en diferentes medios para la prevención de las adherencias post-quirúrgicas.
Como resultado de estas etapas, los materiales entrecruzados obtenidos están en un estado hidratado. Pueden ser eventualmente impregnados (etapa 8) con ayuda de un material plastificante habitualmente utilizado para dar forma a materiales colagénicos (glicerol, polietilenglicol de baja masa molecular). El material plastificante puede ser también introducido después de la etapa 1 de preparación de la solución.
Finalmente, los materiales colagénicos cargados o no de plastificante(s) pueden ser secados (etapa 9).
Aunque el procedimiento puede ser realizado con ayuda de medios estériles e incluir eventualmente una etapa de filtración esterilizante, se puede prever una etapa suplementaria de esterilización (etapa 10), por ejemplo por rayos \beta.
Los artículos obtenidos, por ejemplo las películas, son estables en estado seco durante largos períodos y son manipulables tras rehidratación en cualquier líquido acuoso apropiado.
Según una variante de esta primera vía de preparación del medio de la invención, se puede, por ejemplo, incluir un refuerzo en el curso de la etapa 3, ya sea vertiendo la solución filtrada de colágeno sobre el refuerzo depositado en el molde o sobre el soporte, ya sea depositando el refuerzo sobre la solución ya vertida y eventualmente gelificada. En este último caso, se puede depositar de nuevo una segunda capa de solución colagénica. Según el modo de introducción del refuerzo, se puede así obtener una membrana que presente una cara de "péptido colagénico" y una cara de "refuerzo" o una membrana de tres capas de "péptido colagénico/refuerzo/péptido colagénico" Estos ejemplos no son limitativos y se pueden contemplar otras variantes del procedimiento que permitan obtener materiales compuestos a partir del péptido colagénico antes definido.
Según una segunda vía de realización, correspondiente a las formas no sólidas (líquidas) de los medios según la invención, el procedimiento comprende las etapas esenciales siguientes:
1.
realizar una solución, preferiblemente acuosa, de precursor entrecruzable de péptido colagénico modificado;
2.
eventualmente filtrar esta solución para extraer de ella los elementos de un tamaño superior o igual a 0,8 \mum, preferiblemente a 0,45 \mum y más preferiblemente aún a 0,22 \mum;
3.
eventualmente concentrar la solución, y
4.
acondicionar de forma estéril la solución en una atmósfera inerte.
Según una característica preferida de esta segunda vía del procedimiento según la invención, la solución realizada en la etapa 1 tiene un título de precursor entrecruzable de péptido colagénico superior o igual al 1% y preferiblemente comprendido entre el 1 y el 15%, y un pH comprendido entre 4 y 10 y preferiblemente comprendido entre 6 y 8.
En el curso de la etapa 1, es posible añadir a la solución polímeros sintéticos o naturales biocompatibles o pequeñas moléculas biocompatibles que puedan modificar la reología de la solución y retardar la gelificación del material (por ejemplo, urea).
En la práctica, las cantidades de polímeros incorporadas son tales que dichos polímeros representan, en la forma final entrecruzada del medio de prevención, entre el 1 y el 50% de la materia seca total, y preferiblemente entre el 1 y el 20%. La etapa 1 es preferiblemente realizada en condiciones estériles, a partir de polímeros (precursores de péptido colagénico y eventuales polímeros aditivos) estériles.
La etapa 2 de filtración es facultativa y no necesaria si la etapa 1 ha sido realizada en condiciones estériles. En caso de que tenga lugar la filtración, ésta es realizada a una temperatura superior a 35ºC y preferiblemente comprendida entre 40 y 50ºC.
La etapa 3 de concentración es facultativa. Es realizada en condiciones estériles por evaporación parcial del solvente, para obtener soluciones concentradas con un título de precursor entrecruzable de péptido colagénico comprendido entre el 5 y el 30%, y preferiblemente entre el 10 y el 20%.
La etapa 4 de acondicionamiento es realizada de forma estéril bajo una atmósfera inerte (nitrógeno o argón). La solución es acondicionada en un recipiente que puede ser la forma definitiva de aplicación (jeringa o pulverizador) o un frasco de almacenamiento.
Hay que hacer notar que, a temperatura ambiente, la forma líquida del medio puede presentarse en forma gelificada. Este gel, característico de los productos colagénicos, puede ser refluidificado tras agitar durante varios segundos a 40ºC.
Esta solución puede luego ser entrecruzada por oxidación en un gel químico.
Según una tercera vía de realización, que combina las dos primeras, se aplica la solución acondicionada obtenida en la etapa 4 de la segunda vía sobre un soporte y se hace que intervenga un entrecruzamiento, preferiblemente con ayuda de un oxidante biocompatible.
Otro aspecto de la invención cubre la utilización de los medios antes descritos (película, líquido/gel a base del péptido colagénico) para la prevención de las adherencias post-operatorias.
Los medios de la invención tienen como ventaja que su colocación, en el curso del acto quirúrgico, resulta facilitada. Depende de la forma física y química del medio (membrana entrecruzada o forma líquida no entrecruzada).
Las membranas pueden ser recortadas extemporáneamente a las dimensiones de la zona lesionada que se ha de proteger. Las membranas son aplicadas entre los tejidos biológicos susceptibles de dar adherencias quirúrgicas. Pueden ser colocadas en forma seca o pueden ser hidratadas justo antes de su colocación en suero fisiológico. Su mantenimiento puede quedar asegurado por suturas o por aplicación previa de una cola quirúrgica (a base de fibrina o de materiales colagénicos).
Según una variante de utilización, la membrana puede ser enrollada sobre sí misma e introducida con ayuda de un trócar, según una técnica clásica de cirugía bajo celioscopia.
Tratándose de medios no sólidos (líquidos/geles) de prevención de las adherencias post-quirúrgicas, éstos pueden ser aplicados especialmente de dos maneras que se definen a continuación.
Según una primera manera de aplicación, la forma líquida puede ser depositada directamente sobre los tejidos lesionados con una jeringa, un pulverizador o cualquier otro dispositivo de aplicación. Según la composición de la formulación y el modo de aplicación, puede ser necesario recalentar la solución a 40ºC durante varios segundos antes de la aplicación. Se asegura entonces el entrecruzamiento in situ por aplicación en un segundo tiempo de un agente químico oxidante aceptable en cirugía, tal como una solución diluida de agua oxigenada. Según variantes de este modo de aplicación, se pueden utilizar el oxígeno del aire, los rayos UV u otras fuentes de energía que puedan conducir a una oxidación.
Según una segunda manera de aplicación, la forma líquida (precursor) del péptido colagénico no entrecruzado es mezclada justo antes de la aplicación con un agente químico oxidante, con ayuda de un dispositivo apropiado (doble jeringa equipada con un cabezal de mezcla, doble pulverizador con conducto de mezcla u otro dispositivo de mezcla).
Estas dos maneras de aplicación pueden ser igualmente adaptadas para su utilización en cirugía celioscópica.
De forma más general, la invención se relaciona con un procedimiento de prevención de las adherencias post-quirúrgicas caracterizado por aplicar (inyección o pulverización, por ejemplo) la solución acondicionada sobre un soporte (tejidos biológicos) y por hacer intervenir un entrecruzamiento, preferiblemente gracias a un oxidante biocompati-
ble.
Se deduce de la descripción que antecede que los medios para la prevención de las adherencias post-quirúrgicas según la invención son, por ejemplo:
\bullet
o bien medios sólidos, tales como películas o membranas eventualmente compuestas y/o de múltiples capas, que contienen esencialmente el péptido colagénico al menos parcialmente entrecruzado tal como se ha definido anteriormente,
\bullet
o bien medios no sólidos (líquidos/geles) que contienen el mismo material colagénico en forma no entrecruzada y destinado a ser aplicado y a entrecruzarse in vivo, para formar in situ, sobre el sitio de acción (tejidos biológicos), los medios sólidos de prevención de las adherencias post-quirúrgicas.
Gracias a la naturaleza de su material constitutivo esencial, estos medios están dotados, en forma entrecruzada, de excelentes propiedades de resistencia mecánica, de barrera física contra la adhesión, de biocompatibilidad, de biorreabsorbibilidad, de no toxicidad y de producción de preparaciones industriales, siendo estas propiedades de todo punto superiores a las de los medios según la técnica anterior.
Los ejemplos que siguen permitirán comprender bien la invención en todos sus aspectos y hacer resaltar todas sus ventajas y sus variantes de utilización.
Ejemplos
Parte I
Síntesis de los medios Ejemplo 1 Síntesis de un péptido colagénico (forma b) cuyos ácidos carboxílicos están substituidos por éster etílico de cisteína (razón de substitución que representa un 7% molar de los aminoácidos)
1) Etapa I
Copulación (obtención de la forma A)
Se ponen 25 g de atelocolágeno (tipos I + III, extracto de pieles de terneras, 1,3 mmol de COOH/g) en 2,5 l de agua y se lleva la temperatura del medio a 50ºC con agitación. Se filtra la solución al 1% así obtenida sobre 0,22 \mum.
Una vez ha bajado la temperatura a 30ºC, se añaden 46,5 g de éster dietílico de cistina y se ajusta el pH a 4,2. Se añaden entonces 12 g de 1-(3-dimetilami-nopropil)-3-etilcarbodiimida HCl y se deja que la reacción se desarrolle durante 2 h a 30ºC con agitación. Se concentra el medio de reacción al 5% p/v y se dializa contra agua para eliminar el exceso de reactivos y los subproductos de la reacción.
El producto obtenido es un intermediario estable de síntesis. Se trata de un péptido colagénico (forma A), una fracción de cuyos ácidos aspárticos y glutámicos están substituidos por éster dietílico de cistina. Puede ser aislado por liofilización o ser reducido para obtener el colágeno tiol correspondiente (forma B).
2) Etapa II
Reducción (obtención de la forma B)
Se añaden al péptido colagénico modificado en solución al 5% p/v en agua obtenido en la etapa I 7,6 g de glicina, 5,8 g de 1,4-ditiotreitol y csp de NaOH 4 N para alcanzar un pH de 9,0. Se mantiene el medio de reacción durante tres horas en agitación a 35ºC. En este estado, se acidifica la solución a pH 2 con HCl 6 N, se dializa contra HCl 0,012 N para eliminar cualquier traza de reactivos y de subproductos de reacción y se filtra después sobre 0,22 \mum. Se aísla el producto así purificado por liofilización.
Se mide la razón de substitución por dosificación con ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB), reactivo específico de las funciones tiol. Esta dosificación está descrita en: "Ellman G.L., Tissue sulfhydryl groups, Archives of Biochemistry and Biophysics, 1959, 82, 70-77".
[SH]: 0,706 mmol/g de producto seco, o sea, un 7% molar de aminoácidos substituidos.
Toda la síntesis puede ser realizada asépticamente para obtener in fine el producto en forma de un liofilizado estéril.
Ejemplo 2 Preparación de una película de colágeno modificado, entrecruzado con yodo, para la prevención de las adherencias post-operatorias
Etapa 1
Se prepara una solución de 20 g/l de péptido colagénico precursor según el ejemplo 1 por disolución del liofilizado en agua estéril. En este ejemplo, se disuelven 2,0 g de liofilizado en 98 g de agua estéril. Se agita la solución en un recipiente cerrado a 40ºC durante 15 minutos, con el fin de obtener una disolución completa. El pH de la solución es ajustado a 6,5 con sosa 1 N a 25ºC. Se vuelve a agitar la solución a 40ºC durante 10 minutos.
Etapa 2
Se filtra la solución a 40ºC sobre membranas de 0,45 mm de porosidad y luego sobre membranas de 0,2 \mum de porosidad. Se efectúa la última filtración encima de moldes estériles (se pueden utilizar placas de Petri de poliestireno).
Etapa 3
Se vierten 40,0 g de solución filtrada en dos moldes de 12 x 12 cm^{2}. Se cierran los moldes.
Etapa 4
Se realiza la maduración de la solución, que se traduce por una gelificación física, durante 24 h a una temperatura de 16ºC ± 1. Esta temperatura es necesariamente inferior a la temperatura de transición gel/sol. Se efectúa la maduración en un recinto a temperatura regulada y los moldes reposan sobre una placa horizontal.
Etapa 5
Después de 24 h, se retiran las tapas de los moldes y se efectúa la evaporación de las soluciones gelificadas a lo largo de 24 horas a la misma temperatura en un recinto confinado, en presencia de agentes desecantes (típicamente, pastillas de sosa). Al cabo de 24 h, las películas obtenidas están secas, límpidas y lisas.
Etapa 6
Se efectúa el entrecruzamiento de las películas secas a 20ºC, vertiendo 30 g de solución yodoalcohólica obtenida por disolución de 1,0 g de yodo en 100 ml de etanol y son necesarios 30 g de agua para obtener una película entrecruzada.
Se retira la película entrecruzada de la solución yodada.
Etapa 7
Se efectúan lavados sucesivos con soluciones de etanol al 80% y luego tampón fosfato hasta la decoloración total de la película.
Todas las soluciones utilizadas son estériles.
Etapa 8
En este ejemplo, no se realiza ninguna etapa de impregnación con un agente plastificante.
Etapa 9
Se deja secar entonces a la película bajo una campana de flujo laminar durante 24 h. La película seca obtenida contiene un porcentaje de agua residual del 10% aproximadamente.
Etapa 10
Se recorta entonces la película fácilmente a las dimensiones adecuadas para la aplicación.
Etapa 11
Cada pieza es acondicionada individualmente en una bolsita para esterilizarla por rayos \beta. Las películas obtenidas son estables a temperatura ambiente durante varios meses. Permanecen estables y manipulables después de 24 h en agua o en un tampón fosfato.
Ejemplo 3 Preparación de una película de colágeno modificado, entrecruzado con peróxido de hidrógeno, para la prevención de las adherencias post-operatorias
El procedimiento es idéntico sea cual sea la naturaleza de la materia prima (colágeno) y la razón de injertación del péptido colagénico precursor. Se retoman aquí las etapas 1 a 5 del ejemplo 3 hasta la obtención de las películas secas no entrecruzadas.
Etapa 6'
Se efectúa el entrecruzamiento de las películas secas a 20ºC vertiendo 30 g de solución de peróxido de hidrógeno al 0,3% en una solución acuosa decimolar de acetato de amonio.
Etapa 7
Se retira la película entrecruzada y se lava sucesivamente con 30 g de tampón fosfato a pH 7,4 y 30 g de agua. Todas las soluciones utilizadas son estériles.
Etapa 8
En este ejemplo, no se realiza ninguna etapa de impregnación con un agente plastificante.
Etapa 9
Se deja entonces que la película se seque bajo una campana de flujo laminar durante 24 h. La película seca obtenida contiene un porcentaje de agua residual del 10% aproximadamente.
Etapa 10
Se recorta entonces la película fácilmente a las dimensiones adecuadas para la aplicación.
Etapa 11
Cada pieza es acondicionada individualmente en una bolsita para su esterilización con rayos beta. Las películas obtenidas son estables a temperatura ambiente. Permanecen estables y manipulables después de 24 h en agua o en un tampón fosfato.
Ejemplo 4 Propiedades mecánicas de tracción de las películas obtenidas según el ejemplo 2
Se efectúan las mediciones de propiedades mecánicas de películas de colágeno entrecruzado con ayuda de un aparato de ensayos universal de tipo DY34 de la marca Adamel Lhomargy. Se hidratan las películas a temperatura ambiente en un tampón fosfato salino (PBS, pH = 7,4) durante 2 h. Se recortan luego en bandas de 4 mm por 30 mm con un sacabocados muy cortante. Se mide el espesor sobre las muestras hidratadas. Se fijan las muestras sobre un marco de cartón que ayuda a la colocación en las mordazas. Se mantiene hidratada la muestra de película. Se corta el marco justo antes del ensayo de tracción, que se desarrolla a velocidad constante de 2 mm/min.
Se calcula el módulo en el origen, así como la tensión a la ruptura por las curvas de tracción utilizando las secciones de las muestras hidratadas.
Las propiedades de tracción de las películas obtenidas según el procedimiento descrito en el ejemplo 3 dependen de la materia prima (colágeno o gelatina) y de la razón de injertación de los péptidos colagénicos precursores.
La tabla siguiente describe las propiedades de una película obtenida a partir del ejemplo 2.
Espesor seco Espesor húmedo Fmáx Alargamiento \sigma máx Módulo inicial
(\muM) (\muM) (N) (%) (MPA) (MPA)
45 80 5,4 42,5 16,7 25,8
Leyenda: Fmax = fuerza máxima a la ruptura
\hskip1.3cm \sigma máx = tensión máxima a la ruptura
Ejemplo 5 Preparación de una película compuesta entrecruzada de colágeno modificado/entramado sintético para la prevención de las adherencias post-operatorias
El procedimiento de preparación de la película es idéntico sea cual sea la naturaleza de la materia prima (colágeno) y la razón de injertación del péptido colagénico precursor. Las etapas 1 y 2 son idénticas a las descritas en el ejemplo 3. La etapa 3 es modificada de la forma siguiente.
Se dispone un entramado sintético (por ejemplo, entramado de poliéster biodegradable disponible en el comercio, de 10 x 10 cm^{2} de dimensión y 200 mm de espesor aproximadamente) en cada uno de los moldes (12 x 12 cm^{2}).
Se vierten 40,0 g de solución filtrada sobre el entramado. Se cierran los moldes.
Las etapas 4 y 5 son idénticas a las descritas en el ejemplo 3.
Se puede realizar la oxidación mediante una solución yodada o peróxido de hidrógeno. Las etapas 6 a 11 son según el método seleccionado idénticas a las del ejemplo 3 o del ejemplo 4.
Las películas obtenidas son estables a temperatura ambiente. Permanecen estables y manipulables después de 24 h en agua o en un tampón fosfato. Presentan propiedades mecánicas superiores a las de las membranas no reforzadas. Presentan además una muy buena resistencia al desgarro, que permite una gran comodidad de suturación. Pueden ser enrolladas sobre sí mismas, lo que permite introducirlas en trócares.
Ejemplo 6 Preparación de una forma líquida a partir de colágeno modificado, entrecruzable in situ, para la prevención de las adherencias post-operatorias
El procedimiento de preparación de la forma líquida es idéntico sea cual sea la naturaleza de la materia prima (colágeno) y la razón de injertación del péptido colagénico precursor.
Para este ejemplo, el péptido colagénico precursor (ejemplo 1) se presenta en forma de liofilizado estéril.
Etapa 1
Se prepara una solución de colágeno modificado a 85 g/l por disolución en condiciones estériles del liofilizado (ejemplo 1) en agua estéril. En este ejemplo, se disuelven 1,50 g de liofilizado al 11% de proporción de humedad en 8,3 g de agua estéril (previamente desgasificada por corriente estéril de nitrógeno). Se agita la solución en un recipiente cerrado a 45ºC durante 15 minutos para obtener una disolución completa. El pH de la solución es ajustado a 7 con 5,9 ml de sosa 0,1 N esterilizada por filtración sobre 0,2 micras.
Etapas 2 y 3
Las etapas de filtración y concentración no tienen lugar para este ejemplo, dado que el liofilizado de partida es estéril y está disuelto a la concentración final contemplada en condiciones estériles.
\newpage
Etapa 4
Se reparte la solución en jeringas estériles de 1 ml, cerradas herméticamente.
Ejemplo 7
Se reproduce con la diferencia de que, en la etapa 4, se acondiciona la solución de forma estéril, no en jeringas sino en un frasco pulverizador.
Parte II
Evaluación biológica Ejemplo 8 Experimentación de una película de colágeno según la invención, tal como se obtiene en el ejemplo 3
Este estudio tiene por objeto evaluar las propiedades de prevención de las adherencias post-quirúrgicas de una película de colágeno según la invención, tal como la obtenida en el ejemplo 3.
Se realiza este estudio en rata, en localización peritoneal, para un período de observación de 2 semanas como mínimo.
Se estima la eficacia del producto por observación macroscópica de las eventuales adherencias sobre los lugares de aplicación. Se estudiarán: la frecuencia, la extensión y la gravedad de las adherencias desarrolladas.
Se practican lesiones traumáticas de la serosa peritoneal a nivel de los cuernos uterinos y de una ventana parietal en rata.
Se coloca la película de forma que separe las lesiones parietales y uterinas engendradas para un período mínimo de 2 semanas. En cada rata, se realiza un sitio control y un sitio de ensayo.
Pasado el mínimo de 2 semanas, los animales son sacrificados por inyección de una dosis letal de barbitúricos.
Se evalúa la gravedad de las adherencias por puntuación de 0 a 3:
\bullet
0: ausencia de adherencia;
\bullet
1: adherencias discretas, laminables por disección roma;
\bullet
2: adherencias moderadas, que necesitan una disección por corte parcial;
\bullet
3: adherencias graves, no laminables sin disección de corte extensa.
Para expresar los resultados se suman las puntuaciones de 10 sitios control y se determina luego la media. Este valor medio corresponde, pues, a la gravedad media de las adhesiones.
Para los controles, la puntuación media obtenida es de 2,2. Además, todos los sitios estudiados presentan adhesiones sobre el 95% de la superficie de la lesión.
Para los sitios de ensayo, la puntuación media es de 0,22.
Se observará que sólo 3 sitios de 10 sitios estudiados presentaban adhesiones y que estas adhesiones no estaban presentes más que sobre aproximadamente un 10% de la superficie de la lesión.
En conclusión, se obtiene una disminución del 90% de la fuerza de las adhesiones, así como una disminución muy importante del número y de la superficie de estas adhesiones.
Ejemplo 9 Experimentación de una película de colágeno modificado/entramado según la invención, tal como se obtiene en el ejemplo 5
Este estudio tiene por objeto evaluar las propiedades de prevención de las adherencias post-quirúrgicas de la película de colágeno modificado/entramado según la invención descrita en el ejemplo 5.
Este estudio es realizado en rata, en localización peritoneal, para un periodo de observación de un mínimo de 2 semanas.
Se estima la eficacia del producto por observación macroscópica de las eventuales adherencias sobre los lugares de aplicación. Se estudiarán: la frecuencia, la extensión y la gravedad de las adherencias desarrolladas.
Se practican lesiones traumáticas de la serosa peritoneal a nivel de los cuernos uterinos y de una ventana parietal en rata. Se coloca entonces la película de colágeno modificado/entramado de forma que separe las lesiones parietales y uterinas engendradas para un período mínimo de 2 semanas. En cada rata, se realiza un sitio control y un sitio de ensayo.
Pasado el mínimo de 2 semanas, los animales son sacrificados por inyección de una dosis letal de barbitúricos.
Se evalúa la gravedad de las adherencias por puntuación de 0 a 3:
\bullet
0: ausencia de adherencia;
\bullet
1: adherencias discretas, laminables por disección roma;
\bullet
2: adherencias moderadas, que necesitan una disección por corte parcial;
\bullet
3: adherencias graves, no laminables sin disección de corte extensa.
Para expresar los resultados se suman las puntuaciones de 10 sitios control y se determina luego la media. Este valor medio corresponde, pues, a la gravedad media de las adhesiones.
Para los controles, la puntuación media obtenida es de 2,2. Además, todos los sitios estudiados presentan adhesiones sobre el 0% de la superficie de la lesión.
Para los sitios de ensayo, la puntuación media es de 0,1.
Se observará que sólo 3 sitios de 20 sitios estudiados presentaban adhesiones y que estas adhesiones no estaban presentes más que sobre aproximadamente un 10% de la superficie de la lesión.
En conclusión, se obtiene una disminución del 96% de la fuerza de las adhesiones, así como una disminución muy importante de la superficie de las adhesiones presentes.
Ejemplo 10 Experimentación de la forma líquida según la invención, tal como se obtiene en el ejemplo 6
Este estudio tiene por objeto evaluar las propiedades de prevención de las adherencias post-quirúrgicas de la forma líquida según la invención descrita en el ejemplo 6.
Este estudio es realizado en rata, en localización peritoneal, para un periodo de observación de un mínimo de 2 semanas.
Se estima la eficacia del producto por observación macroscópica de las eventuales adherencias sobre los lugares de aplicación. Se estudiarán: la frecuencia, la extensión y la gravedad de las adherencias desarrolladas.
Se practican lesiones traumáticas de la serosa peritoneal a nivel de los cuernos uterinos y de una ventana parietal en rata. Antes de utilizar la solución, se calientan las jeringas al baño maría a 37ºC con el fin de recuperar una solución viscosa. Esta solución puede ser aplicada sobre un soporte. La viscosidad de esta solución le permite formar un depósito, garantizando un espesor suficiente. Se colocan entonces 300 \mul de esta solución de forma que se separen las lesiones parietales y uterinas engendradas para un período mínimo de 2 semanas. Se efectúa el entrecruzamiento del depósito por vaporización de una solución al 1% de peróxido de hidrógeno. La gelificación del depósito es casi instantánea. Se obtiene un hidrogel de colágeno homogéneo. En cada rata, se realiza un sitio control y un sitio de ensayo.
Pasado el mínimo de 2 semanas, los animales son sacrificados por inyección de una dosis letal de barbitúricos.
Se evalúa la gravedad de las adherencias por puntuación de 0 a 3:
\bullet
0: ausencia de adherencia;
\bullet
1: adherencias discretas, laminables por disección roma;
\bullet
2: adherencias moderadas, que necesitan una disección por corte parcial;
\bullet
3: adherencias graves, no laminables sin disección de corte extensa.
Para expresar los resultados se suman las puntuaciones de 10 sitios control y se determina luego la media. Este valor medio corresponde, pues, a la gravedad media de las adhesiones.
Para los controles, la puntuación media obtenida es de 2,2. Además, todos los sitios estudiados presentan adhesiones sobre el 90% de la superficie de la lesión.
Para los sitios de ensayo (300 \mul de hidrogel de colágeno), la puntuación media es de 0,7. Se observará que sólo 7 sitios de 10 sitios estudiados presentaban adhesiones y que estas adhesiones no estaban presentes más que sobre aproximadamente un 30% de la superficie de la lesión.
En conclusión, se obtiene una disminución del 70% de la fuerza de las adhesiones, así como una disminución muy importante de la superficie de las adhesiones presentes.

Claims (34)

1. Medio para la prevención de las adherencias post-quirúrgicas, caracterizado por contener al menos un péptido colagénico modificado por injertación de funciones tiol libres o substituidas, entrecruzable y/o al menos en parte entrecruzado y cuyas funciones tiol son aportadas por restos mercaptoaminados exclusivamente injertados sobre los ácidos aspártico y glutámico de las cadenas colagénicas por medio de uniones amida.
2. Medio según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que al menos una parte del péptido colagénico modificado está en forma de precursor A sobre el cual están injertados restos mercaptoaminados portadores de funciones tiol substituidas, respondiendo al menos una parte de estos restos mercaptoaminados a la fórmula general (I) siguiente:
(I)--- NH --- 
\delm{C}{\delm{\para}{R ^{1} }}
H --- (--- CR^{0}_{2} ---)_{x} --- SR^{2}
donde:
\bullet
x = 1 ó 2;
\bullet
R^{0} = H o CH_{3};
\bullet
R^{1} representa H o COOR^{3}, correspondiendo R^{3} a un radical hidrocarbonado de tipo alifático, aromático o alicíclico, preferiblemente alquílico, alquenílico, arílico, aralquílico, alquilarílico, aralquenílico, alquenilarílico y, más preferiblemente aún, de tipo metílico o etílico;
\bullet
R^{2} es un radical alifático y/o alicíclico y/o aromático, preferiblemente un alquilo o un acilo eventualmente azufrado y/o aminado, y más preferiblemente aún R^{2} responde a la fórmula (II) siguiente:
(II)--- S --- (--- CR^{00}_{2} ---)_{y} --- 
\delm{C}{\delm{\para}{R ^{4} }}
H --- NH_{2}
\bullet
donde y, R^{00} y R^{4} responden a la misma definición que la dada en la leyenda de la fórmula (I) para X, R^{0} y R^{1}.
3. Medio según la reivindicación 2, caracterizado por seleccionar los restos mercaptoaminados injertados sobre la forma A del péptido colagénico entre el grupo de los radicales siguientes:
(L1)-NH-(-CH_{2}-)_{2}-S-S-(-CH_{2}-)_{2}-NH_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
(L2)--- NH --- 
\delm{C}{\delm{\para}{COOCH _{3} }}
H --- CH_{2} --- S --- S --- CH_{2} --- 
\delm{C}{\delm{\para}{COOCH _{3} }}
H --- NH_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
(L3)--- NH --- 
\delm{C}{\delm{\para}{COOCH _{2} CH _{3} }}
H --- CH_{2} --- S --- S --- CH_{2} --- 
\delm{C}{\delm{\para}{COOCH _{2} CH _{3} }}
H --- NH_{2}
4. Medio según la reivindicación 1, caracterizado por estar al menos una parte del péptido colagénico en una forma B de precursor entrecruzable intermediario de tipo tiol sobre el cual están injertados restos mercaptoaminados, una parte al menos de los cuales responden a la fórmula general (I) dada en la reivindicación 2 y donde R^{2} = H y donde R^{3} puede representar, además, hidrógeno o un catión apto para formar una sal con COO^{-}, siendo este catión preferiblemente Na^{+}, K^{+} o Li^{+}.
5. Medio según la reivindicación 1, caracterizado por ser al menos una parte del péptido colagénico modificado una forma C entrecruzada que contiene cadenas colagénicas unidas entre sí por puentes disulfuro, cuyos átomos de azufre constitutivos pertenecen a restos mercaptoaminados exclusivamente injertados sobre los ácidos aspártico y glutámico de las cadenas colagénicas por medio de uniones amida.
\newpage
6. Medio según la reivindicación 5, caracterizado por obtener el péptido colagénico en forma C a partir del péptido colagénico B según la reivindicación 4.
7. Medio según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por el hecho de que al menos una parte del péptido colagénico (A y/o B y/o C) es también portadora de injertos G fijados sobre al menos una parte de las unidades amina libres de la cadena colagénica por medio de uniones amida, siendo G un acilo que contiene una entidad hidrocarbonada, CON EXCLUSIÓN de los restos mercaptoaminados, especialmente de aquéllos tales como los definidos anteriormente, conteniendo esta entidad eventualmente heteroátomos (ventajosamente O y/o N) y siendo preferiblemente seleccionada entre alquilos y/o alquenilos y/o alicíclicos y/o aromáticos, y más preferiblemente aún entre grupos que contienen una cadena de alquilo, eventualmente insaturada, o que responden a la fórmula (III) siguiente:
(III)--- CO --- (--- CH_{2} ---)_{z} --- (--- O --- CH_{2} --- 
\uelm{C}{\uelm{\para}{R ^{5} }}
H ---)_{n} --- O --- R^{6}
donde:
\bullet
R^{5} = H o CH_{3};
\bullet
R^{6} = H, un radical alquilo lineal o ramificado y preferiblemente un metilo;
\bullet
z = 0, 1 ó 2 y n > 0.
8. Medio según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por presentarse en forma de película.
9. Medio según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por incluir un compuesto que lleva, por una parte, una matriz que contiene el péptido colagénico tal como se ha definido en las reivindicaciones 1 a 7 y, por otra parte, un material de refuerzo incluido en esta matriz, siendo seleccionado este refuerzo entre polímeros biodegradables.
10. Medio según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por presentarse el refuerzo en forma de materia fibrosa, tejida o no tejida, preferiblemente tejida y más preferiblemente aún tejida con mallas tricotadas.
11. Medio según la reivindicación 9 ó la reivindicación 10, caracterizado por seleccionar el material de refuerzo entre los (co)polímeros de ácidos \alpha-hidroxicarboxílicos, preferiblemente los polilácticos y/o glicólicos.
12. Medio según la reivindicación 9, caracterizado por presentarse en forma de una película que contienen un refuerzo fibroso sobre una parte únicamente de su superficie.
13. Medio según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por presentarse en forma no sólida, entrecruzable y/o al menos en parte entrecruzado, aplicable y/o implantable sobre y/o en un soporte.
14. Medio según la reivindicación 13, caracterizado por contener péptido colagénico en forma líquida.
15. Medio según la reivindicación 13, caracterizado por contener péptido colagénico en forma de gel.
16. Medio según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado por incluir al menos un utensilio -preferiblemente una jeringa o un pulverizador- de almacenamiento y de aplicación en y/o sobre un soporte de una forma no sólida (tal como se ha definido en la reivindicación 13) del péptido colagénico entrecruzable y/o al menos en parte entrecruzado.
17. Medio según la reivindicación 16, caracterizado por contener un agente de oxidación que permite el entrecruzamiento del péptido colagénico.
18. Procedimiento de preparación del medio para la prevención de las adherencias post-quirúrgicas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por incluir las etapas esenciales siguientes:
1.
realizar una solución, preferiblemente acuosa, de precursor entrecruzable de péptido colagénico modificado;
2.
eventualmente filtrar esta solución para extraer de ella los elementos de tamaño superior o igual a 0,8 \mum, preferiblemente a 0,45 \mum y más preferiblemente aún a 0,2 \mum;
3.
dar forma al filtrado en la configuración contemplada para el medio de prevención de las adherencias post-quirúrgicas que se ha de preparar;
\newpage
4.
eventualmente gelificar la solución a la que se ha dado forma, en una fase de maduración, por disminución de su temperatura por debajo de su temperatura de gelificación;
5.
eventualmente eliminar el solvente, preferiblemente por evaporación;
6.
hacer que intervenga el entrecruzamiento, preferiblemente por oxidación;
7.
según el caso, eliminar por lavados sucesivos el eventual agente oxidante empleado;
8.
eventualmente impregnar el material entrecruzado o en el curso del entrecruzamiento con ayuda de una solución de al menos un agente plastificante (por ejemplo: glicerol, polietilenglicol de baja masa molecular);
9.
eventualmente secar el material entrecruzado;
10.
eventualmente recortar el material a las dimensiones de la aplicación, y
11.
eventualmente esterilizar por radiación el material entrecruzado.
19. Procedimiento de preparación del medio para la prevención de las adherencias post-quirúrgicas según la reivindicación 13, caracterizado por incluir las etapas esenciales siguientes:
1.
realizar una solución, preferiblemente acuosa, de precursor entrecruzable de péptido colagénico modificado;
2.
eventualmente filtrar esta solución para extraer de ella los elementos de un tamaño superior o igual a 0,8 \mum, preferiblemente a 0,45 \mum y más preferiblemente aún a 0,22 \mum;
3.
eventualmente concentrar la solución, y
4.
acondicionar de forma estéril la solución en una atmósfera inerte.
20. Procedimiento según la reivindicación 18 ó 19, caracterizado por el hecho de que la solución realizada en la etapa 1 tiene un título de precursor entrecruzable de péptido colagénico modificado:
\bullet
superior o igual al 1% y
\bullet
preferiblemente comprendido entre el 1 y el 15%.
21. Procedimiento según la reivindicación 19 ó 20, caracterizado por aplicar la solución acondicionada sobre un soporte y por hacer que intervenga un entrecruzamiento, preferiblemente gracias a un oxidante biocompatible.
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