KR20070119694A - 생물학적 활성 분자 투여 시스템으로서의 키토산 및폴리에틸렌 글리콜 나노입자 - Google Patents

생물학적 활성 분자 투여 시스템으로서의 키토산 및폴리에틸렌 글리콜 나노입자 Download PDF

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KR20070119694A
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엠 호세 알론소 페르난데스
케빈 자네스
노에미 사바
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어드밴스드 인 비트로 셀 테크놀로지스, 에스.엘
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Abstract

본 발명은 폴리에틸렌 글리콜에 의해 화학적으로 개질되고 가교제로 가교된 키토산 중합체 또는 그의 유도체를 포함하는 생물학적 활성 분자 방출용 나노입자 시스템에 관한 것이다. 상기 시스템은 약제학적 조성물, 백신 및 화장 제형물에 특히 유용하다.

Description

생물학적 활성 분자 투여 시스템으로서의 키토산 및 폴리에틸렌 글리콜 나노입자{NANOPARTICLES OF CHITOSAN AND POLYETHYLENEGLYCOL AS A SYSTEM FOR THE ADMINISTRATION OF BIOLOGICALLY-ACTIVE MOLECULES}
본 발명은 생물학적 활성 분자 방출용 나노입자 시스템을 목적으로 한다. 구체적으로는, 생물학적 활성 분자가 위치될 수 있는, 이온 가교된 키토산-폴리에틸렌 글리콜 콘쥬게이트에 의해 형성되는 나노입자 시스템, 및 그의 수득 방법을 목적으로 한다.
생물학적 활성제 방출 시스템은 계속 개발 중인 연구 분야를 형성한다. 상이한 투여 경로에 의한 동물 또는 인체에 대한 활성 성분의 투여에는 어려움이 있음이 공지되어 있다. 펩티드, 단백질 및 다당류를 포함하는 일부 약물은 상피 장벽의 제한된 투과능이 제공되는 점막 표면을 통해 유효하게 흡수되지 않는다. 예를 들어, 현재 피하로 투여되어 환자에게는 탐탁치 않은 인슐린은, 비강 또는 장 점막 장벽과 같은 점막 장벽 통과에 대해 열악한 역량을 가진 활성 성분들 중 하나로, 피하 투여에 대한 대안적인 경로가 발견된다면 상기 활성 성분의 더 나은 흡수를 가능케 할 투여 시스템을 개발할 필요가 있다.
작은 크기 입자에서의 활성 성분의 혼입은 약물들이 접하게 되는 생물학적 장벽 극복을 위한 최근 제안되는 가능성들 중에서도 특히 강조되고 있다. 상기 입자들의 점막 멤브레인과의 상호작용은, 다른 인자들 중에서도 특히 상기 입자의 크기에 의해 영향을 받는데, 입자 크기 감소와 함께 상기 상호작용은 증가한다.
이에 따라, 특허 출원 US2004138095 은, 다른 활성 성분들 중에서도 특히 인슐린 방출을 위한, 3-블록 폴리에틸렌 글리콜/친수성 폴리아미노산/ 소수성 폴리아미노산 공중합체 기재의 수성 나노입자 현탁액을 기재한다. 이어서, 특허 US 5,641,515 는 인슐린이 포획되어 복합체를 형성하는 생분해성 폴리시아노아크릴레이트에 의해 형성되는 나노입자를 포함하는, 인슐린의 제어방출을 위한 약제학적 제형물을 기재한다.
친수성 중합체 기재의 나노입자 시스템은 또한 약물 방출을 위한 시스템으로서의 그의 적용을 위해 개발되어 왔다. 이는 당업계에 존재하는 방대한 문헌에 의해 나타난다. 알부민 나노입자 (W. Lin 등, Pharm. Res., 11, 1994) 및 젤라틴 (H.J. Watzke 등, Adv. Colloid Interface Sci., 50, 1-14, 1994) 과 같은 천연 기원인 거대분자 기재, 및 알기네이트 (M. Rajaonarivonvy 등, J. Pharm. Sci., 82, 912-7, 1993) 와 같은 다당류 기재의 친수성 나노입자의 여러가지 제조 방법을 기재한 몇몇 저작물이 공개되었다. 그러나, 상기 방법들 대부분은 유기 용매, 오일 및 고온을 이용해야 하며, 이는 상기 시스템의 이용을 크게 제한하는 측면이다. 칼슘 존재 하에서의 이온 겔화 방법을 기본으로 하는 알기네이트 나노입자의 제조 후, 양이온성 복수위치전해질 폴리-L-라이신 존재 하에서의 후속적인 고화를 제안한 것이 상기 방법들 중 가장 해(害)없는 것이다. 그러나, 상기 나노입자들은 전 신 독성 및 고가의 폴리-L-라이신과 관련된 단점이 있다.
상기 시스템의 대안은 키토산 나노입자의 개발인데, 활성 성분 투여에 대한 그의 유용성 및 그의 수득 방법을 기재한 당업계 상태의 출판물들이 있다 (J. Appl. Polym. Sci. 1997, 63, 125-132; Pharm. Res. 14, 1997b, 1431-6; Pharm. Res. 16, 1991a, 1576-81; S.T.P. Pharm. Sci. 9, 1999b, 429-36, Pharm. Res. 16, 1999, 1830-5; J. Control Release 74, 2001, 317-23 및 US5,843,509). 상기 나노입자의 단점은 특정 pH 및 이온 세기 조건에서의 그의 제한된 안정성이다.
문헌 WO-A-01/32751 은 키토산 또는 유도체를 수성 매질에 용해시키고, 후속하여 표면 개질제의 존재 하에 키토산이 침전될 정도까지 pH 를 상승시키는 것으로 이루어진, 나노입자 형태의 키토산 또는 키토산 유도체의 제조 방법에 관한 것이다.
문헌 WO-A-99/47130 은 하나 이상의 다가양이온 (키토산일 수 있다) 및 하나 이상의 다가음이온을 비롯하여 활성 성분으로부터 생체친화성의 생분해성 복수위치전해질 복합체가 있는 나노입자에 관한 것으로, 상기 나노입자는 하나 이상의 가교제 (글리옥살, TSTU 또는 EDAP) 로 그의 형성 도중 또는 이후 복수위치전해질 복합체를 추가적으로 처리함으로써 수득될 수 있다.
치료용 또는 항원성 거대분자일 수 있는 활성 성분에 더하여, 폴리옥시에틸렌과 배합된 키토산 나노입자를 수득하는 것이 또한 공지되어 있다 (ES 2098188 및 ES 2114502). 상기 나노입자의 형성은 트리폴리포스페이트와 같은 염기성 시약의 첨가로 인한, 키토산 및 중합체성 나노응집물 형태의 활성 거대분자의 공동 침전 프로세스로 인해 일어난다.
추가로, 키토산은, PEG화(PEGylation)로 공지되어 있는, 아미노 관능기를 통한 폴리에틸렌 글리콜과의 공유결합에 의해 개질될 수 있다. 특허 EP 1304346 및 US 6,730,735 는 키토산 및 PEG 콘쥬게이트를 포함하며, 이들 두가지 모두 키토산 아미노기를 통해 공유결합되어 있는 점막 멤브레인을 통한 약물 투여를 위한 조성물을 기재한다.
특허 출원 US2004/0156904 는 약제학적 약제의 방출 시스템을 기재하는데, 여기서 활성제는 키토산-PEG 및 수불용성 중합체, 예컨대 폴리(락트-코-글리콜산) (PLGA) 을 포함하는 조성물로부터 제조되는 매트릭스에 혼입된다.
특허 출원 WO01/32751 는, 폴리에틸렌 글리콜을 포함하여 계면활성제의 존재 하에, 이들이 위치한 용액의 pH 가 상승될 때 침전하는 키토산 나노입자의 수득을 기재한다. 그러나, PEG 는 키토산에 공유결합하지 않는다.
약물 방출 시스템 개발을 목적으로 한 다수의 공보에도 불구하고, 여전히 생물학적 활성 분자로의 회합에 대한 큰 용량을 갖고 제어되는 속도로 그의 방출을 제공하는 유형의 나노입자 시스템을 제공해야 할 필요가 있다.
발명의 간단한 설명
본 발명자들은 키토산의 가교를 제공하는 성분 존재 하에서의 이온 겔화 방법을 수단으로 하여 수득되는, PEG-개질 키토산 나노입자에 의해 형성되는 시스템이, 생물학적 활성 분자들의 유효한 회합을 제공할 뿐만 아니라, 적합한 생물학적 환경에서 그의 후속적인 방출을 제공한다는 것을 발견했다. PEG-개질 키토산 나노입자는, 예를 들어 비강 인슐린 투여에서 또는 비강 디프테리아 변성독소 투여에 대한 응답으로서의 면역원성에서 비-PEG화 키토산 나노입자에 비해 괄목할 특징을 갖는다.
이에 따라, 본 발명의 목적은, 나노입자가 a) 50중량% 이상의 키토산 또는 그의 유도체 및 b) 50중량% 미만의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 그의 유도체를 함유하는 콘쥬게이트를 포함하며, 여기서 두 구성성분 a) 및 b) 가 키토산 아미노기를 통해 공유결합되어 있는, 생물학적 활성 분자 방출을 위한 나노입자를 포함하는 시스템으로서, 상기 나노입자가 가교제를 수단으로 하여 가교되는 것을 특징으로 하는 시스템을 목표로 한다.
표현 "생물학적 활성 분자" 는 광의의 의미를 갖고, 저분자량 약물, 다당류, 단백질, 펩티드, 지질, 올리고뉴클레오티드 및 핵산 및 이들의 조합과 같은 분자를 포괄한다. 본 발명의 변형예에서, 생물학적 활성 분자의 기능은 질환을 예방, 완화, 치료 또는 진단하는 것이다. 본 발명의 또다른 변형예에서, 생물학적 활성 분자는 화장 기능(cosmetic function)을 갖는다.
본 발명의 제 2 국면은 상기 정의된 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물 또는 백신에 관한 것이다. 바람직한 국면에서, 조성물 또는 백신은 점막 투여용이다.
또다른 국면에서, 본 발명은 상기 정의된 나노입자를 함유하는 화장 조성물을 목적으로 한다.
본 발명의 또다른 국면은 하나 이상의 생물학적 활성 분자, 예컨대 약물, 백신 또는 유전자 물질이 그 안에서 유지될 수 있는 키토산-PEG 나노입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 자체로는 생물학적 활성 분자로 간주되지 않으나, 투여 시스템의 효능에 기여할 수 있는 펩티드, 단백질 또는 다당류도 또한 나노구조에 포획될 수 있다.
본 발명의 최종 국면은, 하기 단계를 포함하는, 정의된 바와 같은 생물학적 활성 분자 방출 시스템을 수득하는 방법에 의해 이루어진다:
a) 키토산-PEG 콘쥬게이트 수용액의 제조 단계;
b) 가교제 수용액의 제조 단계; 및
c) 키토산-PEG 나노입자들이 이온 겔화 및 후속 침전화로써 자발적으로 수득되도록, 단계 a) 및 b) 의 용액을 교반하면서 혼합하는 단계.
방법의 한 변형예에서, 두 상을 혼합하기 전에 활성 성분이 키토산 수용액 또는 가교제 수용액에 혼입된다.
도면의 상세한 설명
도 1A: 나노입자 크기에 대한, 키토산 PEG화도, 중합체 용액의 pH 및 키토산-PEG/TPP 비율의 영향.
도 1B: 나노입자 크기에서의 다중분산성(polydispersity)에 대한, 키토산 PEG화도, 중합체 용액의 pH 및 키토산-PEG/TPP 비율의 영향.
도 2A: 아세테이트 완충액 (pH: 4 및 7.4) 및 정제수 (MQ) 에서의 인큐베이션 1 일 후 키토산 및 키토산-PEG 나노입자에 회합된 플라스마 DNA 의 아가로스 겔 전기영동 분석.
도 2B: 아세테이트 완충액 (pH: 4 및 7.4) 및 정제수 (MQ) 에서의 인큐베이션 4 주 후 키토산 및 키토산-PEG 나노입자에 회합된 플라스마 DNA 의 아가로스 겔 전기영동 분석.
도 3: 키토사나아제(chitosanase) 존재 하에서의 키토산 및 키토산-PEG 나노입자에 회합되는 플라스마 DNA 의 아가로스 겔 전기영동 분석
도 4A: 고분자량 키토산 (CS) 나노입자의 트랜스펙션에서의 효능에 대한 PEG화도의 영향.
도 4B: 고분자량 키토산 (CS) 나노입자의 트랜스펙션에서의 효능에 대한 pDNA 로딩의 영향.
도 5A: 저분자량 키토산 (CS) 나노입자의 트랜스펙션에서의 효능에 대한 pDNA 로딩의 영향.
도 5B: 저분자량 키토산 (CS) 나노입자의 트랜스펙션에서의 효능에 대한 PEG화도의 영향.
도 6: 상이한 제형물 또는 아세테이트 완충액 (대조군) 에 포함된 인슐린 10 U/kg 의 비강내 투여 후 혈당. 혈당은 평균값 ± S.E.M.으로, 기준값에 대해 % 로 나타낸다. 하기의 값들은 상이한 투여 전의 기준값이다: 아세테이트 완충액 (■): 423±16 mg/dl (n=7); 인슐린 (□): 430±15 mg/dl (n=7); 키토산 용액 중 인슐린 (●): 439±12 mg/dl (n=8); 키토산 나노입자 (◆): 469±14 mg/dl (n=7); 키토산-PEG 나노입자 (○): 458±21 mg/dl (n=8).
도 7: 밤새 절식한 당뇨병 래트에서의 인슐린 또는 아세테이트 완충액을 포함한 제형물의 비강내 투여후 수행된 내당능 시험. 글루코오스 (2 g/체중 kg) 를 시간 0 에서 위내 투여하고, 1 시간 후 비강내투여했다: 아세테이트 완충액 (■) (n=10); 인슐린 (□) (n=6); 키토산 용액 중 인슐린 (●) (n=6); 키토산 나노입자 (◆) (n=6); 키토산-PEG 나노입자 (○) (n=6).
도 8: 0, 7 및 14 일째에 상이한 키토산 및 키토산-PEG 나노입자 제형물에 혼입된 10 ㎍ 의 TD 의 비강내 투여후 마우스 혈청내 IgG 항-TD 의 최종 역가 (n = 6). IN: 비강내; IP: 복강내.
* 통계적 유의차 (α<0.5).
발명의 상세한 설명
본 발명의 시스템은 나노입자를 포함하는데, 그의 구조는 활성 성분이 혼입되어 있을 수 있는, 가교된 키토산 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 콘쥬게이트를 포함한다.
용어 "나노입자" 는 키토산 아미노기를 통한 키토산 및 PEG 사이의 공유 결합의 결과인 콘쥬게이트를 포함하는 구조로 이해되는데, 여기서 상기 콘쥬게이트는 음이온성 가교제의 작용에 의한 이온 겔화를 수단으로 하여 추가로 가교된다. 공유 결합 형성 및 시스템의 후속적인 이온성 가교는, 1 ㎛ 미만, 즉 1 내지 999 nm 를 포함하는 평균 크기의, 독립적이며 관찰가능한 특징적인 물리적 존재를 제공한다.
"평균 크기" 는 나노입자가 형성되는 수성 매질에서 함께 움직이는 나노입자 집단의 평균 직경으로 이해된다. 상기 시스템의 평균 크기는, 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 하기 실험 부분에 기재되어 있는 표준 과정으로 측정될 수 있다.
시스템의 나노입자는 1 ㎛ 미만의 평균 입자 크기를 갖는 것을 특징으로 하며, 이들은 바람직하게는 1 내지 999 nm, 바람직하게는 50 내지 800 nm, 더욱 바람직하게는 50 nm 내지 500 nm 를 포함하는 평균 크기를 갖는다. 평균 입자 크기는 키토산 대 PEG 의 비율, 키토산 탈아세틸화도 및 입자 형성 조건 (키토산-PEG 농도, 가교제 농도 및 이들 사이의 비율) 에 의해 주로 영향을 받는다. PEG 의 존재로 인해, 비-PEG화 키토산으로 형성된 시스템에 비해 평균 입자 크기가 감소한다.
추가로, 나노입자는 전하 (Z 퍼텐셜로 측정됨) 를 가질 수 있는데, 그의 크기는 언급된 변수들 및, 특히 키토산의 PEG 로 인한 관능화 정도에 따라 +0.1 mV 내지 +50 mV, 바람직하게는 +1 내지 +40 mV 일 수 있다. 나노입자의 양의 전하는 점막 표면과 그의 상호작용에 유리하여 관심대상이 될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 그의 비경구 투여를 위해 중성 전하가 더욱 관심대상이 될 수 있다.
상기 정의된 생물학적 활성 분자 방출용 나노입자를 포함하는 시스템은 콘쥬게이트 중 키토산 함량이 50 중량% 초과, 바람직하게는 75중량% 초과이다. 그의 부분에 대해서는, 콘쥬게이트 내 PEG 함량이 50% 미만, 바람직하게는 25% 미만이다.
키토산은 키틴(폴리-N-아세틸-D-글루코사민)에서 유도된 천연 중합체로, N 의 아세틸기의 중요 부분은 가수분해에 의해 제거되었다. 탈아세틸화도의 범위는 일반적으로 30 내지 95% 이며, 바람직하게는 60 내지 95% 로, 여기서 아미노기의 5 내지 40% 는 아세틸화되어 있음을 나타낸다. 따라서, 아미노다당류 구조 및 양이온성 특징을 갖는다. 이는 화학식 I 의 단량체성 단위체의 반복을 포함한다:
[화학식 I]
Figure 112007073466692-PCT00001
식 중, n 은 정수이며, 추가로 m 개의 단위체에서는 아미노기가 아세틸화되어 있다. 합계 n+m 은 중합도, 즉 키토산 사슬 내의 단량체성 단위체의 갯수를 나타낸다.
본 발명의 키토산-PEG 콘쥬게이트를 수득하기 위해 사용되는 키토산은 분자량이 5 내지 2000 kDa, 바람직하게는 10 내지 500 kDa, 더욱 바람직하게는 10 내지 100 kDa 이다. 사용될 수 있는 시판 키토산의 예시는 UPG 113, UP CL 213 및 UP CL113 으로, 이들은 NovaMatrix, Drammen, Norway 로부터 입수가능하다.
키토산-PEG 콘쥬게이트 수득에 이용되는 키토산을 포함하는 단량체성 단위체의 갯수는 30 내지 3000 단량체, 바람직하게는 60 내지 600 이다.
키토산 유도체가 또한 키토산에 대한 대안으로서 이용될 수 있으며, 이는 상기 키토산에서 하나 이상의 히드록실기 및/또는 하나 이상의 아미노기가 키토산 용해도의 상승 또는 그의 점막접착 특성 증가를 목적으로 개질된 것으로 이해된다. 상기 유도체에는, 다른 것들 중에서도 특히 [Roberts, Chitin Chemistry, Macmillan, 1992, 166] 에 기재된 바와 같이 아세틸화, 알킬화 또는 술폰화 키토산, 티올화 유도체가 포함된다. 유도체가 사용되는 경우, 바람직하게는 O-알킬 에테르, O-아실 에스테르, 트리메틸 키토산, 폴리에틸렌 글리콜로 개질된 키토산 등으로부터 선택된다. 기타 가능한 유도체는 염, 예컨대 시트레이트, 니트레이트, 락테이트, 포스페이트, 글루타메이트 등이다. 어떤 경우라도, 당업자는 최종 제형물의 상업적 수명 및 안정성에 영향을 주지 않고 키토산 상에서 수행될 수 있는 개질을 식별하는 방법을 알 것이다.
그의 일부로서, 가장 일반적인 형태로, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 은 화학식 II 의 중합체이다:
[화학식 II]
Figure 112007073466692-PCT00002
식 중, p 는 PEG 중합도를 나타내는 정수이다. 본 발명에서, PEG 중합도는 50 내지 500 을 포함하는 범위에 있으며, 이는 2 내지 20 kDa, 바람직하게는 5 내지 10 kDa 의 분자량에 대응한다.
1 또는 2 개의 말단 히드록실기가 개질된 개질 PEG 가 반드시 키토산-PEG 복합체 형성에 이용되어야 한다. 키토산-PEG 콘쥬게이트 수득에 이용될 수 있는 개질된 PEG 에는 화학식 III 을 가진 것이 포함된다:
[화학식 III]
Figure 112007073466692-PCT00003
식 중, X1 은 후속 반응을 위해 OH 관능기를 블로킹하는 히드록실 라디칼 보호기이다. 히드록실 보호기는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 대표적인 보호기 (보호할 산소를 이미 포함)는 실릴 에테르, 예컨대 트리메틸실릴 에테르, 트리에틸실릴 에테르, tert-부틸디메틸실릴 에테르, tert-부틸디페닐실릴 에테르, 트리이소프로필실릴 에테르, 디에틸이소프로필실릴 에테르, 텍실디메틸실릴 에테르, 트리페닐실릴 에테르, 디-tert-부틸메틸실릴 에테르; 알킬 에테르, 예컨대 메틸 에테르, tert-부틸 에테르, 벤질 에테르, p-메톡시벤질 에테르, 3,4-디메톡시벤질 에테르, 트리틸 에테르, 알릴 에테르; 알콕시메틸 에테르, 예컨대 메톡시메틸 에테르, 2-메톡시에톡시메틸 에테르, 벤질옥시메틸 에테르, p-메톡시벤질옥시메틸 에테르, 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸 에테르; 테트라히드로피라닐 에테르 및 연관된 에테르; 메틸티오메틸 에테르, 에스테르, 예컨대 아세테이트 에스테르, 벤조에이트 에스테르; 피발레이트 에스테르, 메톡시아세테이트 에스테르; 클로로아세테이트 에스테르; 레불리네이트(levulinate) 에스테르; 카르보네이트, 예컨대 벤질 카르보네이트, p-니트로벤질 카르보네이트, tert-부틸 카르보네이트, 2,2,2-트리클로로에틸 카르보네이트, 2-(트리메틸실릴)에틸 카르보네이트, 알릴 카르보네이트이다. 히드록실 보호기의 추가 예시는 Greene 및 Wuts 의 ["Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999] 와 같은 참고 서적에서 찾을 수 있다. 바람직한 구현예에서, 보호기는 알킬 에테르, 더욱 바람직하게는 메틸 에테르이다.
X2 는 수소이거나 또는 키토산 아미노기에 대한 고착화를 제공하는 가교기이다. 사용되는 가교 분자들 중 바람직하지만 독점적이지는 않은 형태로 숙신이미드 또는 그의 유도체를 들 수 있다.
대안적으로, X1 는 또한 아미노기 이외의 기타 기에 고착화를 제공하는 기일 수 있다. 예를 들어, 말레이미드가 SH 기를 이용한 결합을 제공하는 가교 분자로서 이용된다.
PEG 와 반응하는 키토산 아미노기의 갯수, 또는 달리 말하면, PEG화로 공지된 PEG 에 의한 키토산 아미노기의 관능화도는 0.1% 내지 5%, 바람직하게는 0.2% 내지 2%, 더욱 바람직하게는 0.5% 내지 1% 를 포함한다.
결과로서 수득되는 키토산-PEG 콘쥬게이트의 분자량은 5 내지 3000 kDa, 바람직하게는 10 내지 500 kDa 이다.
본 발명의 나노입자 시스템은 키토산-PEG 콘쥬게이트의 이온 가교로 형성된다는 것을 특징으로 한다. 가교제는 나노입자의 자발적인 형성에 유리한, 이온 겔화를 수단으로 하는 키토산-PEG 콘쥬게이트의 가교를 제공하는 음이온성 염이다. 본 발명에서, 가교제는 폴리포스페이트 염이며, 나트륨 트리폴리포스페이트 (TPP) 를 사용하는 것이 바람직하다. 나노입자 시스템을 제공하기 위한 가교는 단순하며, 배경기술에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 제 2 국면은 상기 정의된 나노입자를 함유하는 약제학적 조성물에 의해 구현된다. 약제학적 조성물의 예시에는 그의 경구, 협측, 설하 또는 국소 투여를 위한 임의의 액체 조성물 (물에서, 또는 점도증가제 (viscosifying agent), pH 완충액 등과 같은 첨자제가 있는 물에서의 나노입자 현탁액) 또는 고체 조성물 (동결건조 또는 분말화 나노입자, 이는 과립, 정제 또는 캡슐 제조에 이용될 수 있는 분말을 형성함) 또는 그의 경피, 안내, 비강, 질내 또는 비경구 투여를 위한 액체 또는 반고체 형태가 포함된다. 비경구 투여 경로의 경우, 나노입자와 피부 또는 점막 멤브레인의 접촉은 입자들에, 상기 언급된 음(negative)으로 하전된 표면에 대한 그의 상호작용을 유리하게 하는, 상당한 양(positive)의 전하를 제공함으로써 개선될 수 있다. 비경구 투여 경로, 더 구체적으로는 정맥내 투여 경로의 경우, 이들 시스템은 그와 회합된 약물 또는 분자의 생체내 분배를 조절할 수 있는 가능성을 제공한다.
바람직한 국면에서, 제형물의 투여는 점막이다. 키토산-PEG 콘쥬게이트의 양의 전하는 음으로 하전된 상피 세포의 표면 및 점막 멤브레인과 그의 상호작용을 통해 점막 표면 상에서의 약물의 더 나은 흡수를 제공한다.
키토산-PEG 나노입자는 생물활성 분자에 대한 높은 회합 역량을 가진 시스템이다. 상기 회합 역량은 혼입된 분자의 유형 뿐만 아니라 표시된 제형물 파라미터에 좌우된다. 따라서, 본 발명의 또다른 국면은 하나 이상의 생물학적 활성 분자 및 상기 정의된 것과 같은 키토산-PEG 나노입자를 함유하는 조성물에 의해 구현된다.
용어 "생물학적 활성 분자" 는 질환의 처치, 치료, 예방 또는 진단에 이용되거나 또는 인간 및 동물의 신체적 및 정신적 복리 개선에 이용되는 임의의 물질과 관련된 것이다. 상기 생물학적 활성 분자에는 저분자량 약물에서 다당류, 단백질, 펩티드, 지질, 올리고뉴클레오티드 및 핵산 및 이들의 조합의 유형인 분자에 이르기까지 포함될 수 있다. 상기 나노입자에 회합되는 분자의 예시에는, 파상풍균 변성독소 및 디프테리아 변성독소와 같은 단백질, 헤파린과 같은 다당류, 인슐린과 같은 펩티드 뿐만 아니라 각종 단백질을 코딩하는 플라스미드가 포함된다.
바람직한 구현예에서, 생물학적 활성 분자는 인슐린이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 생물학적 활성 분자는 디프테리아 또는 파상풍균 변성독소이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 생물학적 활성 분자는 헤파린이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 생물학적 활성 분자는 DNA 플라스미드이다.
본 발명의 나노입자 시스템에는 또한 치료적 유효성은 없지만 화장 조성물을 제공하는 기타 활성 분자가 혼입될 수 있다. 상기 화장 조성물에는 그의 국소 적용을 위한 임의의 액체 조성물 (나노입자 현탁액) 또는 에멀전이 포함된다. 나노입자에 혼입될 수 있는 활성 분자에는, 다른 것들 중에서도 특히 항여드름제, 항진균제, 항산화제, 데오도란트, 제한제, 항비듬제, 피부 미백제, 태닝제, UV 광 흡수제, 효소, 화장용 살생물제가 포함된다.
본 발명의 또다른 국면은 항원 및 상기 정의된 나노입자를 함유하는 백신에 의해 구현된다. 나노입자에 의해 구현된 시스템에 의한 항원의 투여는 면역 응답성 달성을 가능하게 한다. 백신은 단백질, 다당류를 포함할 수 있거나 또는 DNA 백신일 수 있다. 엄격하게 하자면, DNA 백신은 면역 응답성을 제공하는 항원의 발현을 코딩하는 DNA 분자이다. 바람직한 구현예에서, 항원은 파상풍균 변성독소 및 디프테리아 변성독소이다.
본 발명의 또다른 국면은, 하기 단계를 포함하는, 상기 정의된 것과 같은 키토산-PEG 나노입자의 제조 방법에 관한 것이다:
a) 키토산-PEG 콘쥬게이트 수용액의 제조 단계;
b) 가교제 수용액의 제조 단계; 및
c) 키토산-PEG 나노입자들이 이온 겔화 및 후속 침전화로써 자발적으로 수득되도록, 단계 a) 및 b) 의 용액을 교반하면서 혼합하는 단계.
최초 키토산-PEG 콘쥬게이트 용액의 pH 는, 두 용액을 혼합하기 전에 수산화나트륨을 첨가함으로써 4.5 내지 6.5 에 포함되는 값에 도달할 때까지 변경시킨다.
방법의 변형예에서, 결과로서 수득되는 키토산-PEG/가교제 비율은 2/1 내지 8/1 를 포함하며, 3/1 비율이 바람직한데, 이는 제형물에 비교적 낮은 다중분산성을 제공한다. 그럼에도 불구하고, 더 높은 키토산-PEG/가교제 비율의 이용 뿐만 아니라 더욱 산성인 매질에서의 입자 제조가 또한 가능하다.
가교제의 존재로 메쉬가 형성되도록 키토산-PEG 콘쥬게이트가 가교되는데, 상기 메쉬에는 추후 방출될 수 있는 생물학적 활성 분자가 삽입될 수 있다. 가교제는 나노입자에 추가로 이들이 생물학적 활성 분자 투여를 위한 시스템으로서 적합하게 되도록 하는 크기, 퍼텐션 및 구조적 특징을 부여한다.
생물학적 활성 분자는 단계 a) 또는 b) 의 용액에 직접 혼입되거나, 또는 이온 겔화 및 후속하는 침전으로 인해 키토산-PEG 나노입자가 자발적으로 생물학적 활성 분자를 포함하여 수득되도록, 수상 또는 유기상으로 용해되기 전에 혼입될 수 있다.
따라서, 생물학적 활성 분자는 하기 방법에 따라 혼입될 수 있다:
a) 활성 분자를 가교제 또는 키토산-PEG 용액에 직접 용해시킴;
b) 활성 분자를 가교제 또는 키토산-PEG 용액에 혼입시키기 전에 산성 또는 염기성 수용액에 용해시킴; 또는
c) 활성 분자를 가교제 또는 키토산-PEG 용액에 혼입시키기 전에 수혼화성, 극성 유기 용매에 용해시킴.
키토산-PEG 나노입자의 제조 방법은 추가로 추가적인 단계를 포함할 수 있는데, 여기서 상기 나노입자는 동결건조된다. 약제학적 관점에서, 동결건조된 형태의 나노입자가 되는 것이 중요한데, 이는 그로 인해 그의 저장 동안에 안정성이 개선되기 때문이다. 키토산-PEG 나노입자(상이한 PEG화도의 것)는 농도 5% 인 글루코오스와 같은 동해방지제(cryoprotector)의 존재 하에 동결건조될 수 있다. 기타 일반적인 첨가제도 존재할 수 있다. 사실상, 동결건조 이전 및 이후 입자 크기의 측정값은 유의하게 변화되지 않는다. 달리 말하면, 나노입자는 그것에 변화를 초래하지 않고도 동결건조되고 재현탁될 수 있다 (표 I).
표 I: 동결건조 이전 및 이후 CS-PEG 나노입자의 특징
제형물 크기 (nm) P.I.* 크기 (nm) P.I.
동결건조 이전 5% 글루코오스와 동결건조됨
키토산-0.5% PEG 74.7 ±9.5 0.231 78.6 ±18.3 0.224
키토산-1% PEG 76.9 ±6.0 0.500 87.7 ±22.3 0.418
*P.I.: 다중분산성 지수
본 발명의 특징 및 장점을 보여주지만 본 발명의 대상 한정으로서 해석되어서는 안되는, 몇가지 예증이 되는 실시예를 하기에 기재한다.
실시예 1
키토산- PEG 나노입자 제조에서의 최적화
키토산-PEG 나노입자는 예를 들어 WO 9804244 에서의 키토산에 대해 기재된 이온 겔화 기술에 따라 제조했다. 구체적으로, 0.5% 또는 1% PEG화도(PEG 로 관능화된 아미노기의 백분율)의 키토산을 먼저 초정수(ultrapure water)에 1 mg/mL 의 농도로 용해시켰다. 나노입자 형성에 대한 그의 가능한 영향을 연구하려는 목적으로, 키토산-PEG 용액의 초기 pH 는 입자 제조 전에 NaOH 첨가로써 4.5 내지 6.5 를 포함하는 값에 도달할 때까지 변화시켰다. 나트륨 트리폴리포스페이트 (TPP) 를 또한 키토산-PEG/TPP 비율이 2/1, 3/1 및 4/1 가 되도록 하려는 목적으로 상이한 농도로 물에 용해시켰다. 고정된 부피의 키토산-PEG 용액 (1.5 mL) 에 고정된 부피의 TPP 용액 (0.6 mL) 을 자석 교반과 함께 첨가한 후 나노입자 형성은 자발적으로 일어났다.
나노입자 크기 및 다중분산성에 대한 키토산 PEG화도, 중합체 용액의 pH 및 키토산-PEG/TPP 비율로 인한 영향은 도 1A 및 1B 에 나타낸다. 수득된 결과를 바탕으로, 0.5 내지 1% 의 PEG화도의 키토산-PEG 나노입자는 광범위한 실험 조건으로 용이하게 제조될 수 있다고 결론지을 수 있으며, 나노입자 크기에 있어서 pH 가 가장 영향력 있는 파라미터이다. 더욱이, pH 의 영향은 PEG화도가 0.5 에서 1% 로 증가될 때에 더욱 더 강조된다 .
추가로, 나노입자 크기 분포는 또한 키토산 PEG화도 뿐만 아니라 키토산-PEG 용액의 pH 에 의해 영향을 받는다. 상대적으로 낮은 분산성을 가진 제형물 수득을 위한 최적의 키토산-PEG/TPP 비율은 명백하게 3/1 이다.
나노입자 크기는 측정 목적으로 Zetasizer III (Malvern Instruments, Malvern, UK) 를 이용한 광자 상관 분광법 (photon correlation spectroscopy) 으로 측정한다. 키토산-PEG 나노입자 크기는 70 내지 310 nm 의 범위였다.
실시예 2
키토산 나노입자 및 키토산- PEG 입자의 비교
표 II 에서 볼 수 있듯이, PEG화는 키토산의 용해도를 변화시킨다. 이는 나노입자의 형성에 영향을 준다. 전형적으로 6/1 내지 4/1 에 위치하는 최적 키토산/TPP 비율은, 키토산-PEG 의 경우 더 작은 값으로 변동되어 전형적으로 4/1 내지 2/1 이다. 이러한 차이점은 아마도, 이온투과성(ionotropic) 겔화 조건을 변경시킬 수 있는, 상호작용할 수 있는 가능한 기들의 변화 하에서의 키토산의 화학적 개질로 인한 것이다.
표 II
키토산 키토산-0.5% PEG 키토산-1% PEG
초기 pH 4.7-4.8 4.6-4.7 4.6-4.7
용해도 한계 6.4-6.5 6.9-7.1 7.1-7.2
나노입자와 관련하여, PEG화 키토산으로부터 제조된 나노입자는 순수 키토산으로부터 제조된 것과 상당히 상이하다는 것이 관찰될 수 있다. 이는, 키토산, 0.5% 및 1% PEG화도 (초기 pH 값에서의 그의 최적 중합체 비율에서) 의 키토산-PEG 에 의해 형성된 나노입자의 특징을 보여주는 표 III 에 나타나 있다.
PEG화는 나노입자 크기 및 표면 전하에서 현격한 감소를 초래한다. 후자의 경우, PEG화도는 또한 큰 영향력을 갖는데, 이는, PEG화도가 0.5% 에서 1% 로 증가할 때 표면 전하가 더욱 더 감소하기 때문이다.
표 III
크기 (nm) P.I. 퍼텐셜 (mV)
키토산, 4/1 265±10 0.363 +29.1±1.1
키토산-0.5% PEG, 3/1 74±9 0.231 +12.1±1.8
키토산-1% PEG, 3/1 77±6 0.500 +1.6±0.6
P.I.=다중분산성 지수
실시예 3
DNA - 로딩된 , 상이한 PEG화도의 키토산 나노입자의 형성 및 특징
캡슐화를 위해, 나노입자 형성 전에 플라스미드 DNA 를 TPP 용액에 혼입시켰다. DNA 를 포함하는 상기 TPP 용액은 이후 키토산-PEG 용액에 첨가하여 자석 교반으로 유지했다. 이론적인 DNA 로딩량은 나노입자 제조에 사용되는 키토산-PEG 의 총량 (1 mg) 에 대해 5, 10 또는 20% 였다. 플라스미드 DNA 의 캡슐화 효능은, 형광 (Pico Green dsDNA 염료) 및 아가로스 겔 전기영동 검정에 의해 확인된 바와 같이 언제나 90% 를 초과했다.
표 IV, V 및 VI 은 상이한 키토산 및 키토산-PEG 나노입자의 특징들을 보여 준다. 로딩되지 않은 나노입자와 유사하게, PEG 를 포함하는 DNA-로딩된 제형물은 PEG 없는 제형물에 비해 훨씬 더 작고, 더 적은 양(positive)의 표면 전하를 갖는다.
모든 경우에 있어서, DNA 의 존재성은 또한, 특히 높은 DNA 백분율에서 담체의 특징에 있어서의 변화를 초래하는데, 여기서 표면 전하는 일반적으로 저하된다. 나노입자 크기에 있어서, 많은 DNA 로딩은 더욱 더 가교된 구조 형성이 유도되도록 하는데, 이는 입자 크기 감소를 초래한다. 이는 비-PEG화 담체의 경우에서 관찰되는데, 여기서 그 크기는 약 270 내지 300 nm 에서 220 nm 으로 감소한다.
그러나, PEG화 담체의 크기는, 특히 0.5% PEG화도의 키토산-PEG 가 사용되는 경우 DNA 로딩과 함께 증가한다.
표 IV
PEG 없는 키토산, 4/1 크기 (nm) P.I. 퍼텐셜 (mV)
블랭크 265±10 0.363 29.1±1.1
+5% DNA 278±17 0.340 40.5±5.6
+10%DNA 309±2 0.378 41.6±0.8
+20%DNA 216±7 0.363 35.2±1.8
표 V
키토산-0.5% PEG, 3/1 크기 (nm) P.I. 퍼텐셜 (mV)
블랭크 74±9 0.231 +121±1.8
+5% DNA 115±14 0.227 +13.4±2.1
+10%DNA 131±13 0.207 +11.3±3.9
+20%DNA 181±8 0.209 +5.7±1.6
표 VI
키토산-1% PEG, 3/1 크기 (nm) P.I. 퍼텐셜 (mV)
블랭크 77±6 0.500 +1.6±0.6
+5% DNA 78±7 0.485 +3.7±0.4
+10%DNA 78±10 0.256 +1.3±2.1
+20%DNA 105±2 0.229 -0.6±0.4
실시예 4
시험관내 플라스미드 DNA 방출
플라스미드 DNA 는 키토산 및 키토산-PEG 입자에서 모두 유효하게 회합되었다. 도 2A 및 2B 에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 DNA-로딩된 나노입자가 아세테이트 완충액 (pH:4, pH:7.4) 및 정제된 물 (MQ) 에서 모두, 1 개월 초과하여 인큐베이션된 경우, 플라스미드 DNA 방출이 검출되지 않는다 (아가로스 겔 전기영동 분석에 따름).
실시예 5
효소 존재 하에서의 시험관내 플라스미드 DNA 방출
전기영동 분석에서 관찰되는 바와 같이 (도 3), 키토사나아제 (0.6 mg/mL) 의 존재 하에 pH 6 의 아세테이트 완충액에서 플라스미드 DNA-로딩된 나노입자가 인큐베이션될 때 플라스미드 DNA 는 키토산 및 키토산-PEG 나노입자로부터 방출될 수 있다.
이러한 결과는, 플라스미드 DNA 가 나노입자와 유효하게 회합되었지만, 중합체 담체가 효소적으로 분해될 때에는 방출되기 때문에, 이것에 비가역적으로 결합되어 있지는 않다는 것을 보여준다.
실시예 6
키토산- PEG 나노입자에 회합된 ( GFP ) 플라스미드 DNA 의 트랜스펙션에서의 효능
키토산 및 키토산-PEG 나노입자에 의한 트렌스펙션의 효능을 HEK 293 세포주 모델에서의 GFP 플라스미드 코딩에 대해 평가했다.
도 4 는 20% 플라스미드 DNA (pDNA) 로딩을 포함하는 고분자량 키토산 나노입자 (125 kDa, HMW CS NP) 의 트랜스펙션에서의 효능에 대한 키토산 PEG화도 (0.5% 및 1%) 로 인한 영향을 보여준다. 웰 당 플라스미드 투여량 (plasmie dose per well) 은 1 ㎍ 였다. 결과는 0.5% PEG화도가 상기 나노입자의 트랜스펙션 역량에 대해 양(positive)의 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 상기 PEG화도는 후속되는 실험에서 선택되었다. 도 4B 에 나타낸 결과는 트랜스펙션의 효능이 나노입자의 pDNA 로딩과 함께 증가한다는 것을 나타낸다. 이러한 관찰사항은 흥미를 끄는데, 이는 플라스미드 투여량은 일정했고 (1 ㎍), 따라서 pDNA 로딩이 증가하면서 나노입자 투여량이 감소했기 때문이다.
트랜스펙션의 효능에 대한 플라스미드 로딩의 영향을 또한 저분자량 키토산-PEG 나노입자 (10 kDa, LMW CS-PEG NP) 에 대해 평가했다. 이 경우, 더 적은 로딩 (5%)에서 더 높은 발현 수준이 관찰되었다 (도 5A). 추가로, 이러한 적은 로딩 (5% pDNA) 에서, PEG화는 트랜스펙션의 효능에 대해 부정적인 영향력을 가졌다 (도 5B).
이들 실험들의 주된 결론은 키토산의 분자량에 좌우되어 키토산 PEG화는 양(positive)으로 (HMW CS-PEG NP), 또는 음(negative)으로 (LMW CS-PEG NP) 유효성을 갖는다는 것이다.
실시예 7
농도 10 U/ kg 에서의 캡슐화 인슐린 및 유리된 ( free ) 인슐린의 비강내 투여의 생물학적 유효성
키토산 나노입자에 인슐린을 캡슐화하기 위해, 2.4 mg 의 인슐린을 먼저 NaOH 용액에 용해시킨 후, 1.2 mL 의 TPP 를 첨가했다. 이후, 상기 혼합물을 3 mL 의 키토산에 첨가했다. 자석 교반하며 5 분 후, 제제를 10,000 g 에서 40 분 동안 원심분리했다. 상청액을 제거하고, 침전물을 완충액에 용해시켰다. 그 일부에 대해, 동일한 프로세스를 수행하여 키토산-PEG 나노입자를 제조했는데, 단 10 mg/mL 의 PEG 400 을 2 mg/mL 의 키토산에 첨가했다.
광자 상관 분광법으로 측정한 키토산 나노입자의 최종 크기는 605±15 nm 였고, 키토산-PEG 나노입자의 경우 590±6 nm 였다.
먼저 200 내지 220 g 로 칭량된 수컷 Wistar 래트에 pH 4.5 의 시트레이트 완충액 중의 스트렙토조토신 주사 (65 mg/kg i.v.) 로 당뇨병을 유도했다. 스트렙토조토신 처리 3 주 후 혈당 농도가 400 mg/dl 를 초과했을 때 래트를 당뇨로 간주했다.
금식 래트를 본 실험 수행에 이용했다. 이들을 그들에게 투여할 제형물에 따라 상이한 군으로 나누었다. 상이한 제형물은 하기로 이루어졌다: 대조군 용액 (아세테이트 완충액, pH 4.3), 아세테이트 완충액에 용해된 인슐린, 키토산 용액에 용해된 인슐린 및 키토산 나노입자에 회합된 인슐린 및 키토산-PEG 나노입자에 회합된 인슐린), 인슐린 농도는 체중 kg 당 10 U 였다. 상기 제형물들은 에펜도르프 (Eppendorf) 피펫을 이용하여 각각의 비강 오리피스에 그의 소량씩 (10 내지 20 ㎕) 위치시켜 투여했고, 래트는 배를 위쪽으로 한 자세에서 에테르로 마취시켰다. 이어서, 마취가 제공할 수도 있는 혈당 수준에 대한 임의의 영향을 배제하기 위해 전체 실험 동안 동물들의 의식을 유지했다.
혈당 수준 측정을 위해, 혈액 시료를 비강 투여 이전 및 90분 완료 때까지 매 15 분마다 꼬리 정맥으로부터 수집했다. 후속적으로, 이를 비강 투여 후 2 내지 7 시간 동안은 매 시간, 그리고 최종적으로 24 시간째에 수집했다. 혈당 수준은 글루코오스 분석기 (Chronolysis 의 Prestige) 를 이용하여 바로 측정했다. 실험 동안에는 래트를 금식으로 유지했다.
도 6 에 제시된 바와 같이, 아세테이트 완충액, pH 4.3 의 비강 투여는 경시적으로 혈당의 느린 점진적인 감소를 초래했고, 최대 감소는 투여 6 시간 후 대조군에 대해 28% 였다. 아세테이트 완충 용액 중 10 U/kg 의 인슐린의 비강 투여는 이전의 결과를 유의하게 변화시키지 않았다. 그러나, 인슐린이 키토산-PEG 나노입자에 회합되는 경우, 혈당 수준은 투여 15 분만에 18% (p<0.01) 감소하여, 상기 투여 45 분후에 45 내지 50% (각각 p<0.01 및 p<0.001) 의 최대 감소에 도달했다. 비강투여로부터 7 시간 이상 경과한 후에도 상기 감소가 유지된다는 것이 강조되어야 한다. 혈당 수준에서의 현격한 감소가 또한 키토산 나노입자에 회합된 인슐린이 비강내 투여되는 경우에 관찰되었다. 상기 경우, 혈당은 30 분부터 시작하여 현저하게, 구체적으로는 16% (p<0.01) 감소하고, 최대 감소는 비강내 투여 후 2 시간째에 관찰된 32% (p<0.001) 였다. 혈당은 또한 인슐린을 키토산 용액에 용해시켰을 때 감소하나, 인슐린이 키토산-PEG 나노입자에 회합되는 경우보다는 훨씬 더 적은 정도로 감소한다.
실시예 8
경구 글루코오스 투여에 대한 혈당증 응답성에 미치는 인슐린을 포함한 나노입자의 효과
밤새 금식한 당뇨병 래트를 본 실험 수행에 이용했다. 실시예 7 에 기재된 각각의 제제를 이들에게 비강투여했다. 1 시간 후, 각 군의 래트에게 체중 kg 당 2 g 의 경구 글루코오스 투여를 제공했다. 혈당은 글루토오스 투여 이전 및 10, 20, 30, 60, 90 및 120 분 후 꼬리 정맥에서 수집한 시료 유래의 혈액에서 측정했다.
도 7 은 경구 글루코오스 투여에 대한 혈당증 응답성에 미치는 인슐린을 포함하는 나노입자의 유효성을 보여준다. 아세테이트 완충액을 수용한 대조군 래트에서, 경구 글루코오스 투여에 혈당 증가가 후속되었고, 최대값 105% (p<0.001) 는 30 분 후 도달했다. 후속하여 혈당은 2 시간 동안 점진적으로 감소했다. 이 부분에 대해서, 아세테이트 완충액에 용해된 인슐린 (10 U/kg) 이 그 결과를 유의하게 변화시키지는 않았다.
그러나, 키토산 용액 중의 동일한 양의 인슐린은 글루코오스에 대한 혈당증 응답성을 189% (p<0.05) 로 증가시켰고, 키토산 또는 키토산-PEG 나노입자에 회합된 인슐린은 각각 193% (p<0.01) 및 225% (p<0.01) 까지 증가시켰다.
따라서, 분석된 상이한 제형물을 기준으로 한 A.U.C.(곡선 아래 면적) 를 비교하면, 가장 유효한 제제는 키토산-PEG 나노입자에 회합된 인슐린에 해당하는 제제이며, 이어서 키토산 나노입자에 회합된 인슐린이고, 최종적으로는 키토산 용액 중의 인슐린에 해당하는 제제이다.
상기 결과들은 본 발명에 기재된 키토산-PEG 나노입자의 이용이 당뇨병 래트에서 인슐린 비강 흡수를 증강시킨다는 것을 보여준다. 실험 결과는 키토산-PEG 나노입자에 회합된 인슐린 (10 U/체중 kg) 이 비강내 방출 후 15 분째부터 시작하여 7 시간 이상 될 때까지 혈당을 상당히 감소시키며, 경구적 글루코오스 로딩이 있을 때 혈당증 응답성을 개선시킨다는 것을 보여준다. 상기 나노입자에 회합된 4 U/kg 의 인슐린으로는 덜 현격한 유효성이 검출된다.
인슐린이 키토산으로만 형성된 나노입자에 회합되는 경우 또는 인슐린이 키토산이 있는 용액 중에 존재하는 경우, 키토산-PEG 나노입자에 회합되는 경우보다 효능이 더 적고, 유리된 (free) 인슐린은 당뇨병 래트에서의 그의 비강내 방출 후 생물학적 파라미터에 대해 아무런 유의한 유효성을 갖지 않는다는 결론이 도출된다.
실시예 9
디프테리아 변성독소-로딩 나노입자로 인한 면역 응답성의 생체내 평가
키토산 또는 키토산-PEG 나노입자에 대한 디프테리아 변성독소 (DT) 의 회합은 DT 를 TPP 수용액에 혼입시켜 수행했다 (300 ㎍ 의 DT). 상이한 부피의 TPP 수용액 (1 mg/mL) 을 3 mL 의 키토산 또는 키토산-PEG 용액 (1 mg/mL) 에 자석 교반과 함께 첨가하여 나노입자가 자발적으로 형성되었다. TPP 용액의 부피는 키토산:TPP 비율을 8:1 내지 2:1 이 되도록 하려는 목적으로 계산했다. 키토산은 그의 히드로클로라이드 염으로서, 86% 탈아세틸화도의 Protosan Cl
Figure 112007073466692-PCT00004
213 및 Protosan Cl
Figure 112007073466692-PCT00005
113 로 시판된다. 키토산 나노입자는 5℃ 로 10,000 g 에서 40 분 동안 원심 분리하여 분리했다. 키토산-PEG 의 경우, 나노입자는 3800 g 에서 30 분 동안 원심분리 울트라필터 (Amicon
Figure 112007073466692-PCT00006
ultra-4 100000 NMWL, Millipore) 상에서 수집했다. 상청액을 제거하고, 마우스에서의 그의 투여를 위해 나노입자를 pH 7.4 의 포스페이트 완충 식염수에 재현탁시켰다.
키토산 및 키토산-PEG 제형물의 면역원성은 비강내 면역화로 수행했다. 6 주령의 체중 22 내지 25 g 의 수컷 BALB/c 마우스를 사용했다. 마우스를 5 개의 군으로 나누었다. 2 개의 군은 DT-로딩된 키토산 나노입자 (CS-113 Cl, CS-213 Cl) 로 처리하고, 1 개의 군은 DT-로딩된 키토산-PEG 나노입자로 처리했다. 사용된 투여량은 100 ㎍ 의 나노입자 중에 혼입된 10 ㎍ 의 DT 로, pH 7.4 인 10 ㎕ 의 포스페이트 완충액에 취해진 것이고, 5 ㎕ 를 각각의 비강 오리피스에 투여했다. 또다른 군은 pH 7.4 인 포스페이트 완충 식염수 중의 유리된 (free) 변성독소 (10 ㎍/마우스) 로 처리했다. 더욱이, 대조군으로서, 1 개의 군에는 알루미늄 포스페이트에 흡수시킨 DTP (디프테리아, 파상풍균 및 백일해) 백신을 복강내 투여했다 (10 ㎍/마우스). 그 투여량을 의식있는 래트에게 제 0 일, 제 7 일 및 제 14 일째에 투여했다.
혈액 시료를 마우스의 꼬리에서 생체내 면역 응답성 검정을 수행하기 위한 첫번째 투여량 투여 후 제 14, 28, 42, 56 및 70 일째에 취했다. 이어서, 소장, 기관지폐포 및 타액 세척 시료를 또한 제 70 일째에 수집했다. 필로카르핀 (50 ㎕, 1 mg/mL) 을 복강내 주사하여 타액분비를 유도했다. 각각의 마우스에서 100 ㎕ 분취량의 초기 타액을 수집했다. 이어서, 마우스를 펜토바르비탈로 안락사시 키고 희생시켰다. 5 mL 의 세척 매질을 호흡관에 주사하여 빨아들이도록 해 정맥내 캐뉼라로 폐를 부풀게하여 기관지폐포 세척물을 수득했다. 이어서, 소장 세절 (십이지장, 공장, 회장) 을 방부처리하여 떼어내어 1 mM PMSF, 1 mM 요오도아세트산 및 10 mM EDTA 의 용액 4 mL 에서 균질화시켰다. 시료는 원심분리로 정화하고, 보존제로서 나트륨 아자이드, PMSF 및 우혈청을 첨가했다. 항체 농도 검정을 수행할 때까지 모든 시료를 -20℃ 에서 저장했다.
혈청 및 점막 조직에서의 항체의 응답성 평가는 ELISA 시험으로 수행했다. 마이크로플레이트 (DYNEX, immulon
Figure 112007073466692-PCT00007
)를 먼저 pH 가 9.6 인 0.05 M 의 카르보네이트 완충액 중의 DT (4 ㎍/웰) 100 ㎕ 로 코팅하고 4℃ 에서 밤새 인큐베이션했다. 단계 사이에서, 웰을 pH 7.4 인 PBST (0.01 M PBS, 또는 5% v/v 의 Tween
Figure 112007073466692-PCT00008
20 를 포함하는 포스페이트 완충액) 로 3 회 세척했다. 비특이적인 반응을 최소화하기 위한 목적으로, 100 ㎕ 의 PBSTM (5% w/v 의 탈지분유 및 보존제로서의 0.1% w/v 의 나트륨 아자이드를 함유하는 PBST) 를 모든 웰에 첨가하고, 이들을 1 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션했다. PBST 로 세척 후, 시료는 PBSTM 중에 일련의 2 단계에서 희석하고, 플레이트를 37℃ 에서 2 시간 더 인큐베이션했다. 후속적으로, 100 ㎕ 의 염소 항-마우스 IgG 면역글로불린 퍼옥시다아제 콘쥬게이트를 PBSTM 중에 1:2000 로 희석하고, 웰에 첨가하고, 37℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션했다. 플레이트를 세척하고, 기질로서 pH 가 5.0 인 0.05 M 의 시트레이트-포스페이트 완충액에 50 ㎕ 의 o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드 (0.45 mg/mL) 를 첨가했다. 발색 (37℃ 에서 30 분) 후, 플레이트를 마이크로플레이트 검독기 (3350-UV, Biorad) 상에서 450 nm 로 검독했다.
비강내 면역화에 후속하여 DT-로딩된 나노입자 및 대조군 DT 용액에 의해 제공되는 항-디프테리아 IgG 수준을 도 8 에 나타낸다. 상기 도면은 또한 복강내 투여된 상용 제형물 (알루미늄 포스페이트에 흡수시킨 DT) 에 해당하는 결과도 보여준다. 일반화하면, 상기 결과는, 첫달 후, DT-로딩된 나노입자에 대해 관찰된 IgG 수준이 유체 백신에 해당하는 것보다 훨씬 더 낫다는 것을 나타낸다 (p<0.05). 사실, 상기 값들은 복강내로 투여된 아쥬반트 (알루미늄 포스페이트에 흡수시킨 DT) 로서 사용된 제형물에 대해 수득된 것과 비교될 수 있다. 결과적으로, 상기 결과는 나노입자를 포함하는 제형물의 아쥬반트 효과를 명백하게 보여준다. 강조되어야 할 또다른 관찰사항은 경시적으로 증가하면서 지속되는 면역 응답성이다. 최종적으로, 나노입자 조성물의 영향력과 관련하여, 키토산의 분자량이 키토산 나노입자에 의해 도달되는 면역 응답성에 대해서는 영향이 없으나, 키토산 PEG화는 나노입자의 효능에 대해 확연한 영향력을 갖는다는 점을 시사한다는 점이 흥미롭다. 사실, 1 개월 후, IgG 수준은 키토산 나노입자에 대한 것보다 키토산-PEG 나노입자에 대해서 현저하게 더 컸다.

Claims (28)

  1. 나노입자가 a) 50중량% 이상의 키토산 또는 그의 유도체 및 b) 50중량% 미만의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 그의 유도체를 함유하는 콘쥬게이트를 함유하며, 두 구성성분 a) 및 b) 가 키토산 아미노기를 통해 공유결합되어 있는, 생물학적 활성 분자 방출용 나노입자를 포함하는 시스템으로서, 상기 나노입자가 가교제를 수단으로 하여 가교되어 있는 것을 특징으로 하는 시스템.
  2. 제 1 항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜에 대한 키토산 또는 그의 유도체의 비율이 바람직하게는 75중량% 초과인 시스템.
  3. 제 1 항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜의 비율이 바람직하게는 25중량% 미만인 시스템.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 키토산 중합도 또는 키토산 또는 그의 유도체를 함유하는 단량체성 단위체의 갯수가 30 내지 3000, 바람직하게는 60 내지 600 인 시스템.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 키토산 또는 그의 유도체의 분자량이 5 내지 2000 kDa, 바람직하게는 10 내지 500 kDa, 더욱 바람직하게는 10 내지 100 kDa 인 시스템.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 키토산 또는 그의 유도체의 탈아세틸화도가 30% 내지 95%, 바람직하게는 60% 내지 95% 인 시스템.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, PEG 는 화학식 III 의 개질 PEG 인 시스템:
    [화학식 III]
    X1-(O-CH2-CH2)p- O- X2
    식 중, X1 은 히드록실 라디칼 보호기이며, X2 는 수소이거나 또는 키토산 아미노기에 고착화되도록 하는 가교기이며, p 는 중합도이다.
  8. 제 7 항에 있어서, X1 는 알킬기, 바람직하게는 메틸인 시스템.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, PEG 의 중합도가 50 내지 500 인 시스템.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, PEG 의 분자량이 2 내지 20 kDa, 바람직하게는 5 내지 10 kDa 인 시스템.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, PEG 로 인한 키토산 아미노기 또는 키토산 유도체의 아미노기의 관능화가 0.1% 내지 5%, 바람직하게는 0.5% 내지 1% 인 시스템.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 저분자량 약물, 다당류, 단백질, 펩티드, 지질, 올리고뉴클레오티드 및 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 활성 분자를 추가로 포함하는 시스템.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 가교제가 폴리포스페이트 염, 바람직하게는 나트륨 트리폴리포스페이트 염인 시스템.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 평균 나노입자 크기가 1 내지 999 나노미터, 바람직하게는 50 내지 800 nm 인 시스템.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 전하 (Z 퍼텐셜) 가 +0.1 mV 내지 +50 mV, 바람직하게는 +1 내지 +40 mV 인 시스템.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에서 정의된 것과 같은 시스템 및 질환을 예방, 완화 또는 치료할 수 있는 생물학적 활성 분자를 포함하는 약제학적 조성 물.
  17. 제 16 항에 있어서, 경구, 협측, 설하, 국소, 경피, 안내, 비강, 질내 또는 비경구 투여용의 조성물.
  18. 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 생물학적 활성 분자가 다당류, 단백질, 펩티드, 지질, 올리고뉴클레오티드, 핵산 및 이들의 조합으로부터 선택되는 조성물.
  19. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 활성 분자가 인슐린, 헤파린, 단백질 항원 또는 DNA 플라스미드인 조성물.
  20. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에서 정의된 것과 같은 생물학적 활성 분자 방출 시스템을 포함하는 화장 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서, 활성 분자가 항여드름제, 항진균제, 항산화제, 데오도란트, 제한제, 항비듬제, 피부 미백제, 태닝제, UV 광 흡수제, 효소 및 화장용 살생물제로부터 선택되는 화장 조성물.
  22. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에서 정의된 것과 같은 생물학적 활성 분자 방출 시스템 및 항원을 포함하는 백신.
  23. 제 22 항에 있어서, 항원이 단백질, 다당류 및 DNA 분자로부터 선택되는 백신.
  24. 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 항원이 파상풍균 변성독소 또는 디프테리아 변성독소인 백신.
  25. 하기 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 생물학적 활성 분자의 제어 방출 시스템의 수득 방법:
    a) 키토산-PEG 콘쥬게이트 수용액의 제조 단계;
    b) 가교제 수용액의 제조 단계; 및
    c) 키토산-PEG 나노입자들이 이온 겔화 및 후속 침전화로써 자발적으로 수득되도록, 단계 a) 및 b) 의 용액을 교반하면서 혼합하는 단계.
  26. 제 25 항에 있어서, 가교제가 트리폴리포스페이트, 바람직하게는 나트륨 트리폴리포스페이트인 나노입자의 수득 방법.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 생물학적 활성 분자가 단계 a) 또는 단계 b) 에서, 또는 단계 a) 또는 단계 b) 에 첨가되는 또다른 수상 또는 유기상에 먼저 용해되는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 생물학적 활성 분자가 인슐린, 헤파린, 플라스미드 DNA, 파상풍균 변성독소 및 디프테리아 변성독소로부터 선택되는 방법.
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