CN111388452B - 脂肪组织靶向肽p3-壳聚糖寡聚乳酸-聚乙二醇递送系统及其在核酸药物递送上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了脂肪组织靶向肽P3‑壳聚糖寡聚乳酸‑聚乙二醇递送系统及其在核酸药物递送上的应用,本发明所述递送系统可有效地包裹核酸类物质并通过血液运输将其靶向递送至周身脂肪组织的血管系统,使其可被脂肪组织所吸收;本发明在发现Vanin‑1调控脂肪组织脂质水解的前提下,对脂肪组织进行Vanin‑1 mRNA/siRNA的靶向递送,起到通过调控脂肪组织中Vanin‑1的表达进而影响脂肪组织脂质代谢的效果;且利用脂肪组织血管中具有的高渗透长滞留效应,避免纳米材料在体内非脂肪组织中的积累,增强递送效率。其使用不会造成肝损伤和肾损伤,安全性高,极具医用与药用价值,为临床上的药物靶向递送的提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体地说明脂肪组织血管靶向肽P3(CKGGRAKDC)-壳聚糖寡聚乳酸-聚乙二醇在靶向脂肪组织进行Vanin-1mRNA/siRNA递送调控脂肪组织脂质水解上的应用。
背景技术
脂肪组织是人和动物体内重要的代谢和内分泌器官,具有储存能量、维持体温、缓冲保护、支持填充、参与免疫反应、分泌生物活性物质调控机体代谢等多种功能,在维持生命体稳态中起着不可或缺的作用。脂肪组织主要分为白色脂肪组织和褐色脂肪组织。根据解剖学位置的不同,白色脂肪组织主要分为皮下脂肪组织和内脏脂肪组织,而内脏脂肪组织又可以细分为肠系膜脂肪组织、子宫脂肪组织、肾周脂肪组织和腹膜后脂肪组织。白色脂肪组织是机体内主要的能量储存场所,在人体摄入食物后将能量以甘油三酯的形式储存在脂滴之中。当机体需要能量时(如禁食、饥饿和长期的肌肉工作状态)释放甘油三酯被水解为游离脂肪酸,被血液运送至身体各处,以确保身体处于有足够能量的状态。与白色脂肪组织相比,褐色脂肪组织中脂滴体积小,数量更多,具有更为丰富的线粒体和毛细血管。褐色脂肪组织将储存在体内的化学能转化为热能,维持着机体温度。此外,寒冷刺激可以导致部分白色脂肪产生“褐化”反应,这一类白色脂肪组织被称为为米色脂肪,与褐色脂肪组织共同发挥产热功能。除此之外,脂肪组织作为重要的内分泌器官,通过分泌脂联素、瘦素、抵抗素等多种脂肪因子维持生物体的代谢稳态。因此,脂肪组织一旦发生功能紊乱将造成全身性的代谢失衡。引发肥胖、高血压、动脉粥样硬化、2型糖尿病和慢性肾病等一系列代谢性疾病。
脂肪组织由于其独特的储存脂质的能力,因此在维持全身能量稳态中起着至关重要的作用,因此可以防止体内异位脂质堆积以及脂毒性的产生。如果脂质存储和动员之间的精确平衡被破坏,将导致全身性脂质分布异常,这是肥胖和脂肪营养不良等代谢性疾病的重要发病原因。在细胞中,完全的脂解水解反应可以分为三个步骤。脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)是第一步的限速脂解酶,催化初始步骤并将甘油三酯转化为二酰基甘油,释放出一分子游离脂肪酸。然后,激素敏感性脂肪酶(HSL)将DAG水解为单酰基甘油,再次释放一分子游离脂肪酸。最终,单酰基甘油被降解为甘油和最后的游离脂肪酸。一系列反应受到中枢神经系统和营养信号的严格调控。在静止状态下,脂滴包被蛋白(PLIN1)与CGI-58(ATGL的激活因子)结合形成沉默复合物,HSL在细胞质中游离分布且酶活性较低。然而,当儿茶酚胺与β-肾上腺素受体结合后,激活cAMP依赖蛋白激酶,进而促进PLIN1和HSL的磷酸化。磷酸化的PLIN1失去与CGI-58结合的能力,使ATGL被CGI-58所激活。同时,磷酸化的HSL转位至脂滴表面且活性被显著提高。
鉴于脂肪组织在维持人体代谢中的重要作用,在进行相关代谢性疾病治疗的时候,脂肪组织已经被认为是重要的靶器官。虽然许多药物在治疗脂肪组织代谢紊乱中有着显著的效果,但这些这些药物的靶点往往不止一个,往往同时影响细胞内多条代谢通路;另一方面,血液循环系统中药物会被多种非脂肪组织吸收并对这些组织中正常的生理进程产生影响,即使它们被设计为单独靶点,也会导致显著的副作用。例如目前常用于治疗二型糖尿病的噻唑烷二酮类(thiazolidinediones,TZDs)药物,虽然可以调控脂肪中过氧化物酶增殖物受体γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptorγ,PPARγ),增强胰岛素敏感性。但不可避免的是,TZDs药物会引起水肿、骨质疏松和心衰,增加体重等副作用。因此单纯的使用药物治疗往往难以实现预期的靶向性。除了使用传统药物进行治疗外,核酸类药物也是时下兴起的治疗手段,但首先目前并未公开适合的针对脂肪组织调控的核算类药物;其次,其同样缺点明显,核酸类药物在体内稳定性较差,使用时递送效率极低。这些缺点大大降低了核酸类药物的生物利用度,造成其直接给药难以被用于进行靶向治疗。除此之外,利用腺病毒(adenovirus,AV)或腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)介导的递送虽然具有一定的稳定性和生物靶向性,但这种方法的生物安全性仍然是它们潜在应用的一个主要问题。此外,虽然AV能够成功地将基因导入脂肪组织中,但该载体具有的高免疫原性使转入的基因无法长期表达。而另一方面,尽管腺相关病毒系统更安全,但由于其包装容量较低而严重限制了其递送基因的选择。单链AAV的包装容量不超过5kb,双链则更短,这意味着很多基因无法通过该系统递送。更重要的是,目前生产和纯化高滴度AAV仍未实现技术突破,其实际应用仍然面临着巨大的挑战。
相比之下,纳米靶向药物则具有更高的生物安全性和靶向性。同时,纳米材料还可以增强药物在体内的稳定性,尤其是核酸类药物,并在此基础上缓释药物,增强生物利用度。在2016年,美国麻省理工学院和布列根和妇女医院的研究人员开发了一种直接将抗肥胖药物送达脂肪组织的靶向纳米颗粒。研究人员将罗格列酮(PPAR-γ激动剂)包裹至聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)和聚乙二醇(PEG)构成的纳米颗粒中,并用靶向脂肪组织血管的肽段对纳米材料进行修饰。这些“精准制导”的纳米颗粒自动会与血管周围脂肪组织衬里的蛋白质结合。达到靶向脂肪进行药物递送的目的。此外,该材料安全无毒,受试小白鼠超过25天未表现出任何副作用。目前,PLGA已被美国食品药品监督管理局批准,可用于制备缓释微球注射剂的生物降解骨架材料。该实验的成功为以纳米材料为载体进行药物递送的治疗方案提供了极高的参考价值。更进一步的,利用纳米材料靶向脂肪组织进行核酸药物的递送则是更为精准的治疗手段,将极大改善临床上治疗相关代谢性病症的艰难困境。因此,建立更为精准的纳米材料递送系统进行核酸类药物靶向递送的研究刻不容缓。
发明内容
本发明目的之一提供一种对脂肪组织脂代谢具有调控作用的靶点Vanin-1。
本发明的目的之二提供一种纳米颗粒递送系统及其在靶向脂肪组织血管进行核酸类药物递送的应用,本发明所述的纳米颗粒不会对肝脏组织和肾脏组织造成损伤,同时利用该纳米颗粒包载Vanin-1mRNA/siRNA并递送至脂肪组织中,成功调控脂肪组织的脂质水解,为治疗脂肪组织代谢紊乱提供了一种新型纳米靶向治疗药物。
本发明的目的通过以下技术方案实现:
本发明第一方面提供Vanin-1酶或编码其的核酸在用于制备跟脂代谢有关的药物中的应用。
在一些实施例中,本发明提供Vanin-1酶或编码其的核酸在用于制备跟脂代谢紊乱有关疾病的药物中的应用。
本发明所述的“编码其的核酸”不仅包含Vanin-1酶的编码基因,还包含其相关的Vanin-1mRNA/siRNA。编码其的核酸序列可通过现有公开文献查询获得,例如其mRNA序列的genebank编号:NM_011704.3;或者通过Vanin-1酶的氨基酸序列进行优化设计,在一些实施例中,本发明提供一些优选的Vanin-1 siRNA,序列如SEQ ID NO.2/SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4/SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6/SEQ ID NO.7所示。
发明人经过研究发现Vanin-1在脂肪组织脂质水解过程中发挥重要作用,并以Vanin-1为分子靶点,对脂肪组织中脂质水解过程进行调控,达到改善脂肪组织代谢并治疗相关代谢性疾病的目的。
本发明所述的脂肪组织脂代谢紊乱有关疾病可以包括但不限于葡萄糖不耐受、胰岛素抵抗、肥胖、高血压、动脉粥样硬化、2型糖尿病和慢性肾病等。
本发明第二方面提供Vanin-1酶的siRNA,序列如SEQ ID NO.2/SEQ ID NO.3、SEQID NO.4/SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6/SEQ ID NO.7所示。
本发明第三方面提供一种纳米颗粒递送系统,所述递送系统包括脂肪组织血管靶向肽P3-壳聚糖寡聚乳酸-聚乙二醇(P3-COL-PEG,PCP)纳米颗粒,其化学结构如式(I)所示:
其中,m为40~50,n为10~20;P3序列如SEQ ID NO.1所示。。
在一些实施例中,m为42~47,n为12~17;在一种具体的实施例中,m为45,n为15。
本发明首次提出了壳聚糖寡聚乳酸(chitosan oligolactic acid,COL)作为纳米颗粒合成的核心材料对mRNA/siRNA对白色脂肪组织进行核酸高效递送。本发明采用的COL是一种改性的天然甲壳素基衍生物,来源于龙虾、螃蟹或其他海洋无脊椎动物。作为一种天然聚合物,具有无毒、生物相容性和生物降解性。COL可溶于去离子水中,释放自由氨基,从而在聚合物链上形成正电荷。本发明通过带有正电荷COL与核酸药物形成离子相互作用,并为负载核酸药物的降解提供了保护,提高了药物的包载率。
本发明第四方面提供本发明所述的纳米颗粒递送系统的制备方法,通过温和的酰胺化反应在室温条件下制备P3-COL-PEG。具体为,将聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、壳聚糖寡聚乳酸(chitosan oligolactic acid,COL)和脂肪组织血管靶向肽P3通过酰胺化反应偶联,然后通过离子交联法,让带有正电荷的聚合物与带有负电荷的三聚磷酸根离子发生离子交联反应,形成大小均一的球形纳米颗粒。在本发明的一种具体的实施例中,所述的纳米颗粒递送系统的制备方法,包括如下步骤:
(1)配方量的COL溶于去离子水中,加入碳二亚胺(carbodiimide,EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide,NHS),室温条件下搅拌反应25~35min,形成活化的COL;
(2)步骤(1)形成活化的COL中加入PEG,室温条件下遮光反应24-36h,,产物进行透析、真空冷冻干燥,得到COL-PEG聚合物;
(3)将COL-PEG聚合物配置成3~4mg/ml的溶液,室温下添加P3、EDC和NHS,室温条件下遮光搅拌反应36-48h;;产物进行透析、真空冷冻干燥,获得P3和PEG共修饰的壳聚糖寡聚乳酸聚合物P3-COL-PEG;
(4)将步骤(3)获得的聚合物P3-COL-PEG与带负电荷的三聚磷酸根离子按(8~12):1的质量比通过离子交联法进行离子交换,获得本发明所述的纳米颗粒递送系统。
在一些实施例中,本发明步骤(1)中COL:NHS:EDC的质量比为(8~12):(1.5~2.5):1,在一种具体的实施例中,质量比为10:2:1。
在一些实施例中,本发明步骤(2)和步骤(3)的透析具体为将反应后的产物置于截留分子量为2000-3500Da的透析袋进行透析。
在一些实施例中,本发明步骤(2)中COL:PEG质量比为(1.5~2.5):1,在一种具体的实施例中,质量比为2:1。
在一些实施例中,本发明步骤(3)中P3、碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺质量比为(4~6):4:(4~6),在一种具体的实施例中,质量比为5:4:5。
在一些实施例中,本发明步骤(4)中三聚磷酸根离子可以为本领域常规的含有三聚磷酸根离子的盐,例如三聚磷酸钠(sodium tripolyphosphate,TPP)。
本发明第五方面提供本发明所述纳米颗粒递送系统在用于制备跟脂代谢有关的药物中的应用。
在一些实施例中,本发明提供所述纳米颗粒递送系统在用于制备跟脂代谢紊乱有关疾病的药物中的应用。
在本发明的一些实施例中,所述应用具体为将与脂代谢有关的有效药物成分包裹在本发明所述的纳米颗粒递送系统中。
本发明所述的有效药物可以为现有技术中常用的跟脂肪代谢有关的药物,在本发明一种优选的实施例中,为Vanin-1酶的mRNA或Vanin-1酶的siRNA。
本发明将与脂代谢有关的有效药物成分包裹在本发明所述的纳米颗粒递送系统中可以采用本领域的常规方法,在本发明的一种具体的实施例中,是将mRNA或siRNA溶解于纳米颗粒递送系统制备过程中的带负电荷的三聚磷酸根离子溶液中,使纳米颗粒在合成过程中包载mRNA或siRNA,形成mRNA-PCP纳米颗粒或siRNA-PCP纳米颗粒。
本发明第六方面提供一种包载Vanin-1酶的mRNA或siRNA的纳米颗粒,所述颗粒将Vanin-1酶的mRNA或siRNA包载在本发明所述的纳米颗粒递送系统中。
本发明第七方面提供本发明所述包载Vanin-1酶的mRNA或siRNA的纳米颗粒在用于制备跟脂代谢有关的药物中的应用。
在一些实施例中,本发明提供包载Vanin-1酶的mRNA或siRNA的纳米颗粒在用于制备跟脂代谢紊乱有关疾病的药物中的应用。
本发明的有益效果:
(1)在发现Vanin-1对脂肪组织脂代谢具有调控作用的基础上,本发明提供了一种纳米颗粒递送系统在靶向脂肪组织血管进行核酸类药物递送的应用,并证明该纳米颗粒不会对肝脏组织和肾脏组织造成损伤,同时利用该纳米颗粒包载Vanin-1mRNA/siRNA并递送至脂肪组织中,成功调控脂肪组织的脂质水解,为治疗脂肪组织代谢紊乱提供了一种新型纳米靶向治疗药物(原理如图144所示)。具体来说,我们首先利用Vanin-1敲除小鼠对脂肪组织中的Vanin-1的功能进行研究,发现了Vanin-1对脂肪组织中脂质水解的调控作用,随后利用PCP纳米颗粒包载Vanin-1的mRNA或siRNA并将其递送至脂肪组织,使Vanin-1的表达受到调控,通过调控脂肪组织中Vanin-1的表达进而影响脂肪组织脂质代谢的效果,从而改善脂肪组织脂质代谢稳态,同时,利用脂肪组织血管中具有的高渗透长滞留效应(enhancedpermeability and retention effect,EPR),避免纳米材料在体内非脂肪组织中的积累,增强递送效率。
(2)本发明所述的纳米颗粒递送系统,PEG的使用可使纳米颗粒在不同pH值和温度的缓冲液体系以及血清中均表现良好的稳定性,此外,修饰有PEG的纳米颗粒能够逃避网状细胞系统的非特异性摄取,从而延长静脉注射后的循环时间,提高递送效率。COL作为可降解的生物高分子材料,具有很好的组织相容性,此外,其表面带有大量的正电荷,能吸附带负电荷的mRNA或siRNA。除了纳米颗粒上修饰的靶向肽P3所起到的主动选择效果外,我们研发的纳米颗粒的大小完全符合脂肪组织血管所具有的EPR效应,除了脂肪组织外,难以透过其他组织的血管壁,使纳米颗粒具被了被动选择的效果,形成了双重保障机制,虽然本发明以为例,但鉴于本发明所述的纳米颗粒递送系统本身所具有的优势,利用PCP纳米颗粒靶向脂肪组织递送其他化合物的应用也均在本发明的保护范围中。
(3)本发明中PCP纳米颗粒可有效地包裹核酸类物质并通过血液运输将其靶向递送至周身脂肪组织的血管系统,使其可被脂肪组织所吸收。对mRNA和siRNA的递送效果仅限于脂肪组织中,在体内代谢活动旺盛的肝脏和肾脏组织中并没有检测到Vanin-1表达的变化,即材料载体的使用不会造成肝损伤和肾损伤,安全性高,极具医用与药用价值,为临床上的药物靶向递送的提供了新的思路。
(4)本发明发现的Vanin-1酶核酸类药物的优势在于生物安全性高,基因靶向性强,可以针对单一分子进行干预,最为符合我们针对脂肪组织中Vanin-1进行调控的需求。
附图说明
图1是试验1中随意进食小鼠和禁食24小时小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中Vanin-1的mRNA表达相对水平柱状图;
图2是试验1中随意进食小鼠和禁食24小时小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中Vanin-1的蛋白质表达相对水平蛋白质印迹曝光图;
图3是试验1中随意进食小鼠和禁食24小时小鼠模型体内腹部白色脂肪组织的H&E染色图;
图4是试验1中随意进食小鼠和禁食24小时小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中Vanin-1的酶活性相对水平柱状图。
图5是试验1中正常饮食小鼠和高脂饮食小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中Vanin-1的mRNA表达相对水平柱状图;
图6是试验1中正常饮食小鼠和高脂饮食小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中Vanin-1的蛋白质表达相对水平蛋白质印迹曝光图;
图7是试验1中正常饮食小鼠和高脂饮食小鼠模型体内腹部白色脂肪组织的H&E染色图;
图8是试验1中正常饮食小鼠和高脂饮食小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中Vanin-1的酶活性相对水平柱状图。
图9是试验1中WT小鼠和db/db小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中Vanin-1的mRNA表达相对水平柱状图;
图10是试验1中WT小鼠和db/db小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中Vanin-1的蛋白质表达相对水平蛋白质印迹曝光图;
图11是试验1中WT小鼠和db/db小鼠模型体内腹部白色脂肪组织的H&E染色图;
图12是试验1中WT小鼠和db/db小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中Vanin-1的酶活性相对水平柱状图。
图13是试验2中WT小鼠和Vanin-1-/-小鼠模型基因型检测的琼脂糖凝胶图;
图14是试验2中WT小鼠和Vanin-1-/-小鼠模型的体型对照图;
图15是试验2中WT小鼠和Vanin-1-/-小鼠模型体内腹部核磁共振监测分析相对示意图;
图16是试验2中WT小鼠和Vanin-1-/-小鼠模型的体脂分析柱状图;
图17是试验2中WT小鼠和Vanin-1-/-小鼠模型体内腹部白色脂肪组织相对大小示意图;
图18是试验2中WT小鼠和Vanin-1-/-小鼠模型体内腹部白色脂肪组织相对重量柱状图;
图19是试验2中WT小鼠和Vanin-1-/-小鼠模型体内腹部白色脂肪组织的H&E染色相对示意图;
图20是试验2中WT小鼠和Vanin-1-/-小鼠模型体内腹部白色脂肪组织的细胞大小统计数据相对柱状图;
图21是试验3中WT小鼠和Vanin-1-/-小鼠模型体内血清生长激素含量相对水平柱状图;
图22是试验3中WT小鼠和Vanin-1-/-小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中脂肪生成相关基因的mRNA表达相对水平柱状图;
图23是试验3中WT小鼠和Vanin-1-/-小鼠模型体内血清脂联素含量相对水平柱状图;
图24是试验3中小鼠原代脂肪细胞分化过程中Vanin-1的mRNA表达相对水平折线图;
图25是试验3中正常和Vanin-1-/-小鼠原代脂肪细胞分化过程中的油红O染色相对示意图;
图26是试验3中正常和Vanin-1-/-小鼠原代脂肪细胞分化过程中脂肪生成相关基因的mRNA表达相对水平折线图;
图27是试验3中WT小鼠和Vanin-1-/-小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中甘油三酯合成过程相关基因的mRNA表达相对水平柱状图;
图28是试验3中WT小鼠和Vanin-1-/-小鼠模型体内血清甘油三酯和总胆固醇含量相对水平柱状图;
图29是试验3中WT小鼠和Vanin-1-/-小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中炎症相关基因的mRNA表达相对水平柱状图;
图30是试验3中WT小鼠和Vanin-1-/-小鼠模型体内血清炎症因子含量相对水平柱状图;
图31是试验3中WT小鼠和Vanin-1-/-小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中线粒体生成相关基因的mRNA表达相对水平柱状图;
图32是试验3中WT小鼠和Vanin-1-/-小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中线粒体DNA含量相对水平柱状图;
图33是试验3中WT小鼠和Vanin-1-/-小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中脂质水解相关基因的mRNA表达相对水平柱状图;
图34是试验3中WT小鼠和Vanin-1-/-小鼠模型体内血清游离脂肪酸含量相对水平柱状图;
图35是试验3中WT小鼠和Vanin-1-/-小鼠模型体内血清游离甘油含量相对水平柱状图;
图36是试验3中人腹部白色脂肪组织样本中VANIN-1的mRNA相对表达水平与肥胖患者体重指数相关性分析图;
图37是试验3中人腹部白色脂肪组织样本中VANIN-1与脂质水解相关基因ATGL的mRNA相对表达水平相关性分析图;
图38是试验3中人腹部白色脂肪组织样本中VANIN-1与脂质水解相关基因HSL的mRNA相对表达水平相关性分析图;
图39是试验4中WT禁食小鼠和Vanin-1-/-禁食小鼠模型的体脂组成相对分析柱状图;
图40是试验4中WT禁食小鼠和Vanin-1-/-禁食小鼠模型体内腹部白色脂肪组织相对大小示意图;
图41是试验4中WT禁食小鼠和Vanin-1-/-禁食小鼠模型体内腹部白色脂肪组织相对重量柱状图;
图42是试验4中WT禁食小鼠和Vanin-1-/-禁食小鼠模型体内腹部白色脂肪组织的H&E染色相对示意图;
图43是试验4中WT禁食小鼠和Vanin-1-/-禁食小鼠模型体内腹部白色脂肪组织的细胞大小统计数据相对柱状图;
图44是试验4中WT禁食小鼠和Vanin-1-/-禁食小鼠模型体内血清游离脂肪酸含量相对水平柱状图;
图45是试验4中WT禁食小鼠和Vanin-1-/-禁食小鼠模型体内血清游离甘油含量相对水平柱状图;
图46是试验4中WT禁食小鼠和Vanin-1-/-禁食小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中脂质水解相关基因的mRNA表达相对水平柱状图;
图47是试验4中WT禁食小鼠和Vanin-1-/-禁食小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中脂质水解相关基因的蛋白质表达相对水平蛋白质印迹曝光图;
图48是试验4中WT禁食小鼠和Vanin-1-/-禁食小鼠模型体内肝脏组织中脂质水解相关基因的mRNA表达相对水平柱状图;
图49是试验5中WT高脂饮食小鼠和Vanin-1-/-高脂饮食小鼠模型体重增长相对示意图;
图50是试验5中WT高脂饮食小鼠和Vanin-1-/-高脂饮食小鼠模型的体脂组成相对分析柱状图;
图51是试验5中WT高脂饮食小鼠和Vanin-1-/-高脂饮食小鼠模型体内腹部白色脂肪组织相对大小示意图;
图52是试验5中WT高脂饮食小鼠和Vanin-1-/-高脂饮食小鼠模型体内腹部白色脂肪组织相对重量柱状图;
图53是试验5中WT高脂饮食小鼠和Vanin-1-/-高脂饮食小鼠模型体内腹部白色脂肪组织的H&E染色相对示意图;
图54是试验5中WT高脂饮食小鼠和Vanin-1-/-高脂饮食小鼠模型体内腹部白色脂肪组织的细胞大小统计数据相对柱状图;
图55是试验5中WT高脂饮食小鼠和Vanin-1-/-高脂饮食小鼠模型体内血清游离脂肪酸含量相对水平柱状图;
图56是试验5中WT高脂饮食小鼠和Vanin-1-/-高脂饮食小鼠模型体内血清游离甘油含量相对水平柱状图;
图57是试验5中WT高脂饮食小鼠和Vanin-1-/-高脂饮食小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中脂质水解相关基因的mRNA表达相对水平柱状图;
图58是试验5中WT高脂饮食小鼠和Vanin-1-/-高脂饮食小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中脂质水解相关基因的蛋白质表达相对水平蛋白质印迹曝光图;
图59是试验5中WT高脂饮食小鼠和Vanin-1-/-高脂饮食小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中F4/80的免疫组化染色相对示意图;
图60是试验5中WT高脂饮食小鼠和Vanin-1-/-高脂饮食小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中巨噬细胞标志基因的mRNA表达相对水平柱状图;
图61是试验5中WT高脂饮食小鼠和Vanin-1-/-高脂饮食小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中炎症相关基因的mRNA表达相对水平柱状图;
图62是试验5中WT高脂饮食小鼠和Vanin-1-/-高脂饮食小鼠模型体内葡萄糖耐受相对水平折线图;
图63是试验5中WT高脂饮食小鼠和Vanin-1-/-高脂饮食小鼠模型体内胰岛素敏感相对水平折线图;
图64是试验5中WT高脂饮食小鼠和Vanin-1-/-高脂饮食小鼠模型体内葡萄糖耐受和胰岛素敏感相对水平统计柱状图;
图65是试验6中PCP纳米颗粒合成的化学反应关系图;
图66是试验7中PCP纳米颗粒的核磁共振氢谱图;
图67是试验7中未修饰P3的COL-PEG纳米颗粒和修饰了P3的PCP纳米颗粒的透射电镜相对示意图;
图68是试验7中未修饰P3的COL-PEG纳米颗粒的纳米颗粒平均粒径图;
图69是试验7中修饰了P3的PCP纳米颗粒的纳米颗粒平均粒径图;
图70是试验7中未修饰P3的COL-PEG纳米颗粒和修饰了P3的PCP纳米颗粒的平均粒径和其表面电荷数据表格图;
图71是试验8中PCP纳米颗粒在含有10%血清的PBS中放置不同时间后的纳米颗粒平均粒径相对水平折线图;
图72是试验9中不同浓度的PCP纳米颗粒处理原代肝脏细胞的细胞毒性相对水平柱状图;
图73是试验9中不同浓度的PCP纳米颗粒处理原代脂肪细胞的细胞毒性相对水平柱状图;
图74是试验9中不同浓度的PCP纳米颗粒的溶血实验相对示意图;
图75是试验9中不同浓度的PCP纳米颗粒的溶血相对百分比柱状图;
图76是试验9中注射PCP纳米颗粒的实验组和对照组小鼠模型体重相对变化水平折线图;
图77是试验9中注射PCP纳米颗粒的实验组和对照组小鼠模型的食物摄取量相对水平柱状图;
图78是试验9中注射PCP纳米颗粒的实验组和对照组小鼠模型体内血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量相对水平柱状图;
图79是试验9中注射PCP纳米颗粒的实验组和对照组小鼠模型体内血液肌酐含量相对水平柱状图;
图80是试验9中注射PCP纳米颗粒的实验组和对照组小鼠模型体内血液尿素氮含量相对水平柱状图;
图81是试验9中注射PCP纳米颗粒的实验组和对照组的小鼠小鼠模型体内腹部白色脂肪组织、腹股沟白色脂肪组织、褐色脂肪组织、皮下白色脂肪组织、肝脏和肾脏的H&E染色相对示意图;
图82是试验10中使用带有Cy5荧光标记的PCP纳米颗粒和菲律宾霉素、氯丙嗪及5-(N-乙基-异丙基)阿米洛利共同处理小鼠原代脂肪细胞的激光共聚焦扫描显微镜相对示意图;
图83是试验11中带有Cy5荧光标记的COL-PEG纳米颗粒和PCP纳米颗粒在小鼠小鼠模型体内腹部白色脂肪组织、皮下白色脂肪组织、褐色白色脂肪组织和腹股沟白色脂肪组织分布检测示意图;
图84是试验11中带有Cy5荧光标记的COL-PEG纳米颗粒和PCP纳米颗粒在小鼠模型体内肝脏、心脏、脾脏、肾脏和肺脏组织分布检测示意图;
图85是试验12中Vanin-1 siRNA和Vanin-1 siRNA-PCP纳米颗粒的琼脂糖凝胶图;
图86是试验12中注射了Vanin-1 siRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了scrasiRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠小鼠模型体内腹部白色脂肪组织、肝脏和肾脏中Vanin-1的mRNA表达相对水平柱状图;
图87是试验12中注射了Vanin-1 siRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了scrasiRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织、肝脏和肾脏中Vanin-1的蛋白表达相对水平蛋白质印迹曝光图;
图88是试验13中注射了Vanin-1 siRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了scrasiRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型的体脂组成相对分析柱状图;
图89是试验13中注射了Vanin-1 siRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了scrasiRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织相对大小示意图;
图90是试验13中注射了Vanin-1 siRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了scrasiRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织相对重量柱状图;
图91是试验13中注射了Vanin-1 siRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了scrasiRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织的H&E染色相对示意图;
图92是试验13中注射了Vanin-1 siRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了scrasiRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织的细胞大小统计数据相对柱状图;
图93是试验13中注射了Vanin-1 siRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了scrasiRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内血清游离脂肪酸含量相对水平柱状图;
图94是试验13中注射了Vanin-1 siRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了scrasiRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内血清游离甘油含量相对水平柱状图;
图95是试验13中注射了Vanin-1 siRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了scrasiRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织体外培养液中脂肪酸含量相对水平柱状图;
图96是试验13中注射了Vanin-1 siRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了scrasiRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织体外培养液中甘油含量相对水平柱状图;
图97是试验13中注射了Vanin-1 siRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了scrasiRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中脂质水解相关基因的mRNA表达相对水平柱状图;
图98是试验13中注射了Vanin-1 siRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了scrasiRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中脂质水解相关基因的蛋白质表达相对水平蛋白质印迹曝光图;
图99是试验13中注射了Vanin-1 siRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了scrasiRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内肝脏组织的H&E染色和油红O染色相对示意图;
图100是试验13中注射了Vanin-1 siRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了scrasiRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内肝脏组织内总甘油三酯和总胆固醇含量水平相对柱状图;
图101是试验14中Vanin-1mRNA和Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的琼脂糖凝胶图;
图102是试验14中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织、肝脏和肾脏中Vanin-1的mRNA表达相对水平柱状图;
图103是试验14中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织、肝脏和肾脏中Vanin-1的蛋白表达相对水平蛋白质印迹曝光图;
图104是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型的体脂组成相对分析柱状图;
图105是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织相对大小示意图;
图106是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织相对重量柱状图;
图107是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织的H&E染色相对示意图;
图108是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织的细胞大小统计数据相对柱状图;
图109是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内血清游离脂肪酸含量相对水平柱状图;
图110是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内血清游离甘油含量相对水平柱状图;
图111是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织体外培养液中脂肪酸含量相对水平柱状图;
图112是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织体外培养液中甘油含量相对水平柱状图;
图113是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中脂质水解相关基因的mRNA表达相对水平柱状图;
图114是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中脂质水解相关基因的蛋白质表达相对水平蛋白质印迹曝光图;
图115是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组db/db小鼠模型的体脂组成相对分析柱状图;
图116是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组db/db小鼠模型体内腹部白色脂肪组织相对大小示意图;
图117是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组db/db小鼠模型体内腹部白色脂肪组织相对重量柱状图;
图118是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组db/db小鼠模型体内腹部白色脂肪组织的H&E染色相对示意图;
图119是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组db/db小鼠模型体内腹部白色脂肪组织的细胞大小统计数据相对柱状图;
图120是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组db/db小鼠模型体内血清游离脂肪酸含量相对水平柱状图;
图121是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组db/db小鼠模型体内血清游离甘油含量相对水平柱状图;
图122是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组db/db小鼠模型体内腹部白色脂肪组织体外培养液中脂肪酸含量相对水平柱状图;
图123是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组db/db小鼠模型体内腹部白色脂肪组织体外培养液中甘油含量相对水平柱状图;
图124是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组db/db小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中脂质水解相关基因的mRNA表达相对水平柱状图;
图125是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组db/db小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中脂质水解相关基因的蛋白质表达相对水平蛋白质印迹曝光图;
图126是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组db/db小鼠模型体内葡萄糖耐受相对水平折线图;
图127是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组db/db小鼠模型体内胰岛素敏感相对水平折线图;
图128是试验15中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组db/db小鼠模型体内葡萄糖耐受和胰岛素敏感相对水平统计柱状图;
图129是试验16中转染了空白质粒载体和编码Vanin-1的质粒载体的原代脂肪细胞中ATGL和HSL启动子的相对转录活性水平柱状图;
图130是试验16中分别给予异丙肾上腺素处理的WT和Vanin-1-/-原代脂肪细胞中,ATGL和HSL启动子的相对转录活性水平柱状图;
图131是试验16中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中核因子PPARγ、Egr-1、C/EBPα和GR的mRNA表达相对水平柱状图;
图132是试验16中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中核因子PPARγ、Egr-1、C/EBPα和GR的蛋白质表达相对水平蛋白质印迹曝光图;
图133是试验16中注射了Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了EGFPmRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中PPARγ的免疫组化染色相对示意图;
图134是试验16中注射了Vanin-1 siRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了scrasiRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中核因子PPARγ、Egr-1、C/EBPα和GR的mRNA表达相对水平柱状图;
图135是试验16中注射了Vanin-1 siRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了scrasiRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中核因子PPARγ、Egr-1、C/EBPα和GR的蛋白质表达相对水平蛋白质印迹曝光图;
图136是试验16中注射了Vanin-1 siRNA-PCP纳米颗粒的实验组和注射了scrasiRNA-PCP纳米颗粒的对照组小鼠模型体内腹部白色脂肪组织中PPARγ的免疫组化染色相对示意图;
图137是试验16中分别给予GW9662处理的转染了编码Vanin-1的质粒载体的原代脂肪细胞中,ATGL和HSL启动子的相对转录活性水平柱状图;
图138是试验16中分别给予GW9662处理的转染了编码Vanin-1的质粒载体的原代脂肪细胞中,脂质水解相关基因的mRNA表达相对水平柱状图;
图139是试验16中分别给予GW9662处理的转染了编码Vanin-1的质粒载体的原代脂肪细胞中,脂质水解相关基因的蛋白质表达相对水平蛋白质印迹曝光图;
图140是试验16中分别给予异丙肾上腺素处理的转染了编码PPARγ的质粒载体的Vanin-1-/-原代脂肪细胞中,ATGL和HSL启动子的相对转录活性水平柱状图;
图141是试验16中分别给予异丙肾上腺素处理的转染了编码PPARγ的质粒载体的Vanin-1-/-原代脂肪细胞中,脂质水解相关基因的mRNA表达相对水平柱状图;
图142是试验16中分别给予异丙肾上腺素处理的转染了编码PPARγ的质粒载体的Vanin-1-/-原代脂肪细胞中,脂质水解相关基因的蛋白质表达相对水平蛋白质印迹曝光图;
图143是试验16中人腹部白色脂肪组织样本中VANIN-1与PPARγ的mRNA相对表达水平相关性分析图;
图144是本发明所述的载药纳米颗粒作用示意图;
图145是纳米颗粒递送系统制备的示意图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
由于脂肪组织在机体内分布十分广泛,将体内全部脂肪组织进行检测难以实现,但相对于其他部位的脂肪组织来说,腹部脂肪组织与疾病的发生关系最为密切,且难以被体内代谢信号或药物所调控,因此我们主要将腹部脂肪组织作为主要研究目标进行验证。
实施例1脂肪组织中Vanin-1响应外界营养信号的基因表达模式检测
为了探究Vanin-1在小鼠腹部白色脂肪中调节能量稳态中的作用,实验中利用动物模型检测了脂肪组织中的Vanin-1在营养匮乏或营养过剩条件下的表达情况。
选用实验动物为雄性C57BL/6J小鼠和db/db小鼠(C57BKS背景)(均购自南京大学模式动物研究所),按照小鼠标准饲养流程(美国国立卫生研究院和中国药科大学实验动物饲养及使用指导章程)进行饲养。所有小鼠均置于12小时光照/12小时黑暗、温度及湿度恒定的标准环境下饲养,待小鼠适应环境后,进行后续相关实验的操作。
为构建营养匮乏模型,实验中选取置于标准环境下饲养的8周龄雄性C57BL/6J小鼠,将所选小鼠随机分为两组,实验组为24小时禁食,对照组为随意进食组。在模型构建完成后,将小鼠处死,收集小鼠组织样品进行检测。如图1-3所示,在禁食24h小鼠腹部白色脂肪组织中Vanin-1的表达量显著升高。更重要的是,Vanin-1作为泛酰巯基乙胺酶,其生物学功能和其酶活性密切相关。脂肪组织中Vanin-1的酶活变化的检测结果与基因表达的变化相类似,Vanin-1的酶活在禁食小鼠腹部白色脂肪组织中显著升高(图4)。
为构建营养过剩模型,实验中选取置于标准环境下饲养的8周龄雄性C57BL/6J小鼠,将所选小鼠随机分为两组,实验组为高脂饮食组(HFD),给予高脂饲料喂养16周(脂肪含量60%,购自美国Research Diets公司),对照组为正常饮食组。同时,另选取置于标准环境下饲养的8周龄雄性db/db小鼠和野生型小鼠,分别作为实验组和对照组。以此建立环境型营养过剩模型和基因型营养过剩模型。在模型构建完成后,将小鼠处死,收集小鼠组织样品进行检测。如图5-12所示,在HFD小鼠和db/db小鼠的腹部白色脂肪组织中,Vanin-1的表达量在mRNA和蛋白水平均显著降低,酶活性也相应地减少。
实施例2 Vanin-1敲除小鼠的脂肪表型分析
实验动物为雄性Vanin-1敲除小鼠(C57BL/6J背景)和野生型C57BL/6J小鼠(通过南京大学模式动物所引进自法国艾克斯—马赛第二大学F.Galland教授课题组),将小鼠置于上述标准实验室环境中进行饲养。
实验选取置于标准环境下饲养的10周龄雄性Vanin-1敲除小鼠和野生型小鼠(WT小鼠),进行形态学观察、小动物组分核磁共振分析(体脂分析)和核磁共振分析将小鼠。如图13-16所示,WT小鼠相比,Vanin-1敲除小鼠体型更大,体重及体脂含量显著增加,腹部脂肪堆积明显增多。将小鼠处死后,收集小鼠血液和各组织器官样品并对小鼠腹部白色脂肪组织进行观察和称重。结果显示,Vanin-1敲除小鼠腹部白色脂肪组织显著增大,约为WT小鼠的1.62倍(图17和图18)。苏木精-伊红染色(H&E染色)后观察并统计脂肪细胞体大小,如图19和图20所示,Vanin-1敲除小鼠的脂肪细胞直径明显增大。
实施例3 Vanin-1敲除小鼠脂肪细胞肥大机制探究
一般情况下,机体内脂肪细胞过度肥大与血清中生长激素升高、脂肪生成或甘油三酯合成增加、炎性因子的分泌、线粒体功能障碍以及脂质水解降低等因素密切相关。为了探究Vanin-1敲除小鼠腹部脂肪堆积的原因,实验对上述潜在原因进行逐一排查。取试验2中小鼠血清,检测其中生长激素的含量。如图21所示,在两组小鼠血清中生长激素的含量并无显著变化。对Vanin-1敲除小鼠和WT小鼠腹部白色脂肪组织中脂肪生成相关基因的表达(Pparγ,C/ebpα,Fabp4和Adipoq)的mRNA水平进行检测发现,除脂肪生成关键基因PPARγ的mRNA表达量微弱下降,其余基因均没有显著差异(图22)。检测发现血清中脂肪组织特异性分泌蛋白脂联素的含量同样也没有发生变化(图23)。体外实验选取置于标准环境下饲养的3周龄雄性Vanin-1敲除小鼠和WT小鼠进行原代前脂肪细胞分离,在体外诱导称为成熟的脂肪细胞。研究表面,在小鼠原代脂肪细胞分化过程中,Vanin-1的表达逐渐增加(图24)。油红染色显示,与正常原代脂肪细胞相比,Vanin-1敲除的原代脂肪细胞中脂质积累更为旺盛(图25)。出人意料的是,在Vanin-1敲除原代脂肪细胞中,脂肪生成相关基因的表达水平显著降低(图26)。上述结果表明脂肪细胞增大并不是由于脂肪新生作用活化所引起的。对甘油三酯合成过程的检测发现,部分甘油三酯合成过程中的关键基因(Acaca和Fasn)的mRNA表达量呈现下降趋势(图27)。血清学检测发现,Vanin-1敲除小鼠血清中的甘油三酯和总胆固醇含量均没有显著变化(图28)。表明脂肪细胞增大同样不是由于脂质合成过程所引起的。除此之外,Vanin-1敲除小鼠脂肪中及血清中炎症因子(IL-6和TNF-α)的含量也未发生明显变化(图29和图30)。同样的,腹部白色脂肪组织中线粒体生成相关基因(Tfam,Nrf1,Cycs,Acadm)mRNA表达水平及线粒体DNA的含量均未发生改变(图31和图32)。不同的是,经过检测发现,Vanin-1敲除小鼠腹部白色脂肪组织中脂质水解相关基因(Atgl和Hsl)及血清中NEFAs和甘油的含量显著降低(图33-35),表明Vanin-1敲除小鼠腹部白色脂肪组织中脂质水解过程可能被抑制,而体脂含量的增加则可能与脂质水解障碍相关。在人的腹部白色脂肪组织样本中进行检测,结果显示,Vanin-1的表达与肥胖患者体重指数(BMI)呈负相关(R=-0.451和P=0.052,图36)。相反,Vanin-1的表达则和脂质水解相关基因的mRNA水平正相关(图37和图38)。
实施例4禁食条件下Vanin-1敲除小鼠的脂肪动员检测
为了探究Vanin-1对腹部白色脂肪组织脂质水解中的作用,实验中选取按照标准饲养流程进行饲养的8周龄雄性Vanin-1敲除小鼠和雄性WT小鼠,对其进行24小时禁食处理。对两组禁食小鼠进行体脂分析,实验结果如图39所示,Vanin-1敲除小鼠的脂肪含量显著多于WT小鼠。取出脂肪组织观察并称重后发现,24小时禁食后WT小鼠的腹部白色脂肪组织较Vanin-1敲除小鼠相比明显减小,约为Vanin-1敲除小鼠的1/2倍(图40和图41)。随后处死小鼠,收集小鼠血液和组织器官样品。取腹部白色脂肪组织进行H&E染色,观察并统计发现,禁食后Vanin-1敲除小鼠仍有较大的脂肪细胞存在,而WT小鼠的脂肪细胞显著减小(图42和图43)。血清学检测发现,24小时禁食处理后,与WT小鼠相比,Vanin-1敲除小鼠血清中NEFAs和甘油的含量显著降低(图44和45)。分子学检测发现,脂质水解相关基因的表达量在24小时禁食的Vanin-1敲除小鼠脂肪中明显减少(图46和图47)。此外,取小鼠肝脏进行检测发现,Vanin-1敲除小鼠肝脏中脂质水解相关基因的表达并未发生改变,表明Vanin-1在调节脂质水解过程中的组织特异性(图48)。
实施例5高脂饮食条件下Vanin-1敲除小鼠的代谢变化检测
与禁食条件相反,在喂养高脂饮食过程中,小鼠脂肪组织中的基础脂质分解被显著抑制。因此,为了进一步探讨脂肪组织中Vanin-1在肥胖相关的代谢紊乱中的重要作用。实验中选取按照标准饲养流程进行饲养的8周龄雄性Vanin-1敲除小鼠以及雄性WT小鼠,对其进行高脂饲料喂养16周。在造模过程中对小鼠体重进食记录,如图49所示,Vanin-1敲除小鼠的体重增长速度与WT组相比明显加快。体脂分析的结果显示,Vanin-1敲除小鼠的脂肪含量显著多于WT小鼠(图50)。随后处死小鼠,收集小鼠血液和组织器官样品,对两组小鼠的腹部白色脂肪组织的形态变化进行比较,发现WT小鼠和Vanin-1敲除小鼠的腹部白色脂肪组织在经过16周的高脂饮食饲喂后体积均明显增大,但Vanin-1敲除小鼠的脂肪重量比WT小鼠重约36%(图51和图52)。H&E染色观察和统计显示,Vanin-1敲除小鼠脂肪细胞远大于WT小鼠(图53和图54)。血清学检测发现,Vanin-1敲除小鼠血清中NEFAs含量较WT小鼠相比,并未发生显著改变,而甘油的含量显著降低(图55和图56)。进一步的检测发现,脂质水解相关基因(ATGL和HSL)的表达量在Vanin-1敲除小鼠腹部白色脂肪组织中显著下降(图57和图58)。除此之外,脂肪组织中的巨噬细胞浸润也是导致慢性炎症和胰岛素抵抗的重要因素。如图59所示,免疫组化染色(IHC)发现HFD喂养Vanin-1敲除小鼠腹部白色脂肪组织中F4/80含量明显增加,暗示着巨噬细胞浸润的发生和脂肪局部炎症的产生。与IHC结果一致的是,HFD喂养Vanin-1敲除小鼠腹部白色脂肪组织中巨噬细胞标志基因(Cd11b,Cxcl2,Cd48)和炎症基因(Tnf-α,Mcp-1)的mRNA水平均显著升高(图60和图61)。GTT和ITT检测显示,Vanin-1敲除小鼠的葡萄糖耐受和胰岛素敏感性均显受到不同程度的损坏(图62-64)。
实施例6 PCP纳米颗粒合成
如图145所示,称取适量COL溶于去离子水中,搅拌使其充分溶解。然后分别取碳二亚胺(carbodiimide,EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide,NHS)加入COL溶液中,在室温条件下搅拌反应30min,形成活化的COL,称取的COL:NHS:EDC的质量比为10:2:1。待反应结束后,按照质量比2:1(COL:PEG)加入PEG,在室温条件下遮光反应24h。随后,将反应后的产物置于截留分子量为3500kDa的透析袋中使用去离子进行透析,以除去产物中未反应的试剂,每隔4h更换去离子水,连续透析3天。将透析后获得的产物进行真空冷冻干燥,得到的白色絮状物即为COL-PEG聚合物。
称取150mg COL-PEG聚合物溶于50mL去离子水中,然后在室温下向溶液中添加25mg P3、20mg EDC和25mg NHS,在室温条件下遮光搅拌反应48h。将反应后的产物置于截留分子量为3500kDa的透析袋中使用去离子进行透析,以除去产物中未反应的试剂,每隔4h更换去离子水,连续透析3天。将透析后的产物进行真空冷冻干燥,获得的白色絮状物即为P3和PEG共修饰的壳聚糖寡聚乳酸聚合物(P3-COL-PEG)(图65)。
先将P3-COL-PEG聚合物与三聚磷酸钠(sodium tripolyphosphate,TPP)分别溶于去离子水中,分别用0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤除去杂质,按照10:1(TPP:PCP)的质量比将TPP溶液缓慢滴加到PCP溶液中,边滴加边搅拌,搅拌反应30min。然后进行低速离心,在4℃下,500rpm离心10min,吸取上清,并用0.22μm的滤膜过滤,获得PCP纳米颗粒溶液。
实施例7 PCP纳米颗粒表征检测
如图66所示,经过核磁共振检测,化学位移4.7、3.5和2.7ppm所在的峰,分别对应于COL的-CH、PEG的-CH2和形成的酰胺键上氢的吸收峰;P3在化学位移1.3-2.0ppm处的峰,在聚合物P3-PEG-COL也出现了相同化学位移的峰。因此,每个组分特有的特征峰验证了P3、PEG和COL的成功共轭。
将制备好的纳米颗粒滴加至铜网碳膜上并在透射电镜下观察纳米颗粒的形状,如图67所示,未修饰P3的纳米颗粒(COL-PEG纳米颗粒)在透射电镜下呈圆球状、表面光滑、大小均匀且单独分散。相比之下,由于被修饰上了P3,PCP纳米颗粒形成不规则球状结构,表面粗糙。
使用马尔文粒度分析仪测量纳米颗粒的平均粒径与纳米颗粒表面电荷。实验结果如图68-70所示,未修饰P3的纳米颗粒平均粒径为172.8±5.64nm,Zeta电位为9.28±3.87mV;PCP纳米颗粒的平均粒径为179±5.64nm,Zeta电位为-2.76±3.77mV。
实施例8 PCP纳米颗粒血清稳定性实验
为了检测纳米颗粒在血清中的稳定性,将PCP纳米颗粒置于含有10%牛血清的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中,在37℃条件下以100rpm的转速分别放置0、3、6、12、24、48小时。而后使用马尔文粒度分析仪测量纳米颗粒的平均粒径,如图71所示,PCP纳米颗粒的粒径在48小时内没有明显变化,证明PCP纳米颗粒在血清中的稳定性良好。
实施例9 PCP纳米颗粒生物安全性实验
为了验证PCP纳米颗粒的潜在毒性,选取按照标准饲养流程进行饲养的6周龄雄性C57BL/6J小鼠和3周龄雄性C57BL/6J小鼠分别进行原代肝细胞的分离和原代脂肪细胞的分离与诱导。随后,使用不同浓度的PCP纳米颗粒(0μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL)分别对两种细胞进行处理,处理24小时后进行细胞增殖毒性检测(CCK-8法)。实验结果如图72和图73所示,PCP纳米颗粒并没有对肝细胞和脂肪细胞产生细胞毒性。
取小鼠的新鲜血液,利用溶血实验检测PCP纳米颗粒对红细胞的毒性。离心除去血浆,将得到的血红细胞用等渗的PBS溶液洗涤,而后分别加入去离子水(阳性对照)、等渗的PBS溶液(阴性对照)以及溶有不同浓度PCP纳米颗粒的PBS溶液(50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL)。在摇床中37℃孵育30分钟后,离心并收集上清溶液。观察上清中液体颜色,并用紫外分光光度仪在541nm波长处检测其吸光值,并根据公式计算出溶血率。
如图74和图75所示,在加入了去离子水的阳性对照组中血红细胞胀破,上清液呈深红色;在加入等渗PBS溶液的阴性对照中血红细胞几乎没有胀破,离心后上清呈无色;PCP纳米颗粒处理组的上清液同样呈无色。结合紫外吸光度检测结果分析,证明浓度达到500μg/mL后PCP纳米颗粒仍不具有红细胞毒性。
为了进一步的检测PCP纳米颗粒的生物安全性,选取按照标准饲养流程进行饲养的6周龄雄性C57BL/6J小鼠,通过尾静脉注射的方式将PCP纳米颗粒(20mg/kg小鼠体重)注射至小鼠体内,每2天注射一次,共注射21天,期间对小鼠的体重和进食量进行记录。实验结束后处死小鼠,对小鼠血液和各组织器官进行收集。如图76和图77所示,对小鼠进行PCP纳米颗粒注射并不影响小鼠的体重和进食量。对小鼠血清中肝脏损伤生物标志物(谷丙转氨酶和谷草转氨酶)和肾脏损伤标志物(肌酐和尿素氮)的含量进行检测,实验结果如图78-80所示,与对照组相比,PCP纳米颗粒处理组的血清中这四种损伤标志物的变化微乎其微,表明PCP纳米颗粒既不会引起肝损伤也不会引起肾损伤。此外,取小鼠肝脏、肾脏、腹部(附睾)白色脂肪组织、腹股沟白色脂肪组织、褐色脂肪组织以及皮下白色脂肪组织进行苏木精-伊红染色(H&E染色),对这些组织器官进行形态学观察。结果显示,小鼠肝脏和肾脏细胞形态清晰完整,各脂肪组织中细胞大小没有显著变化,在各组织器官中均没有发现病变的组织结构(图81)。上述结果表明,PCP纳米颗粒具有良好的生物安全性。
实施例10 PCP纳米颗粒细胞摄取方式检测
研究表明,细胞外的物质通过多种细胞运输方式被哺乳动物细胞内化。为了探究脂肪细胞对PCP纳米颗粒的摄取机制,按照试验3所述分离诱导小鼠原代脂肪细胞,使用荧光分子Cy5标记的PCP纳米颗粒(100μg/mL)与多种细胞跨膜运输抑制剂处理小鼠原代脂肪细胞。这些抑制剂包括菲律宾菌素(胞膜窖依赖的胞饮作用抑制剂)(1μg/mL)、氯丙嗪(网格蛋白依赖的胞饮作用抑剂)(10μg/mL)、5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利(巨胞饮作用抑制剂)(10μg/mL)。使用纳米颗粒与不同抑制剂共处理24小时后,更换细胞培养基,继续培养24小时,而后使用与DNA强力结合的荧光染料DAPI标记细胞核。实验结果如图82所示,细胞对PCP纳米颗粒的摄取部分受到菲律宾菌素和氯丙嗪的影响,5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利则显著地抑制了细胞对PCP纳米颗粒的摄取。上述结果表明,巨胞饮作用是细胞摄取PCPNPs主要途径。
实施例11 PCP纳米颗粒的生物体组织分布检测
为了检测PCP纳米颗粒在体内的组织分布,选取按照标准饲养流程进行饲养的6周龄雄性C57BL/6J小鼠,将Cy5标记的PCP纳米颗粒、Cy5标记的COL-PEG纳米颗粒以及PBS溶液通过尾静脉注射的方式分别注射到小鼠体内。1小时后,对小鼠组织器官中的荧光信号进行检测。如图83所示,Cy5标记的PCP纳米颗粒处理组小鼠的腹部白色脂肪组织、皮下白色脂肪组织、褐色脂肪组织以及腹股沟白色脂肪组织中均检测到荧光信号。而在没有P3修饰的纳米颗粒处理组中由于存在被动选择的作用,荧光信号仍可在多种脂肪组织中被检测到,但由于其缺乏P3的主动选择效果,其荧光信号则显著弱于Cy5标记的PCP纳米颗粒处理组。相应地,在PBS处理组中并没有检测到荧光信号。上述结果证明,PCP纳米颗粒可以有效地靶向聚集在脂肪组织中。此外,对肝脏、心脏、脾脏、肾脏以及肺脏的荧光检测结果显示,在三个组别小鼠的心脏和脾脏中均没有检测到荧光信号,在纳米颗粒处理组小鼠的肝脏和肺脏中则检测到较弱的荧光信号,这是由于肝脏和肺脏中丰富的血管结构滞留了少量的纳米颗粒。同时,由于排泄作用的影响,在纳米颗粒处理组小鼠的肾脏中检测到显著的荧光信号(图84)。值得注意的是,PCP纳米颗粒处理组小鼠肾脏中的荧光信号要显著弱于无P3修饰的纳米颗粒处理组。这是由于PCP纳米颗粒具有更好的靶向性,从而更多的聚集于脂肪组织中,而无P3修饰的COL-PEG纳米颗粒则更多的随尿液排出体外。
实施例12 Vanin-1-siRNA-PCP纳米颗粒的动物水平干扰效率检测
为了验证PCP纳米颗粒靶向递送核酸药物进行基因编辑的作用效果,将siRNA溶解于TPP溶液中(siRNA购自上海吉玛制药技术有限公司),使PCP纳米颗粒在合成过程中包载siRNA,形成siRNA-PCP纳米颗粒。琼脂糖凝胶电泳对siRNA-PCP纳米颗粒的稳定性进行检测,如图85所示,经过PCP纳米材料包载后,siRNA随纳米颗粒一起被滞留在胶孔中,而泳道中没有明显的siRNA条带。随后,选取按照标准饲养流程进行饲养的6周龄雄性C57BL/6J小鼠,随机将所选小鼠分为两组,分别注射Vanin-1-siRNA-PCP纳米颗粒(实验组)和Scra-siRNA-PCP纳米颗粒(对照组),注射方式如试验9所述。实验结束后将小鼠处死,收集小鼠各组织器官样品,检测目标基因的表达状况。如图86和图87所示,实时定量基因扩增荧光检测和蛋白质免疫印迹技术检测的结果表明,相比于对照组,Vanin-1-siRNA-PCP纳米颗粒处理组小鼠的脂肪组织中目标基因Vanin-1的表达在mRNA水平和蛋白质水平均显著下降,而肝脏和肾脏组织中的Vanin-1表达则没有显著变化。证明PCP纳米颗粒可以有效地将siRNA靶向递送至脂肪组织中,抑制目的基因的表达,而并不影响目标基因在其他组织器官中的表达水平。
实施例13 Vanin-1-siRNA-PCP纳米颗粒对禁食条件下脂质水解的作用效果检测
按照试验12所描述方法对小鼠进行处理。实验结束后,对小鼠进行体脂分析,如图88所示,脂肪组织特异性干扰Vanin-1后减弱了禁食导致的小鼠腹部白色脂肪组织质量的降低。随后处死小鼠,收集小鼠血液和组织器官样本进行检测。组织学分析表明,在禁食状态下,Vanin-1-siRNA-PCP纳米颗粒处理小鼠脂肪细胞的体积明显多于对照组(图89-92)。取小鼠血清进行检测后发现,Vanin-1-siRNA-PCP纳米颗粒处理小鼠的血清中NEFAs和甘油水平也显著低于对照组小鼠(图93和图94)。为了进一步验证Vanin-1-siRNA-PCP纳米颗粒处理小鼠的脂肪组织脂质分解能力,取上述两组小鼠新鲜的脂肪组织进行组织块体外培养。将20mg组织块置于含有10%BSA的PBS缓冲液中,于37℃孵育3小时,随后离心取上清液检测NEFAs和甘油的含量。实验结果如图95和图96所示,干扰Vanin-1的表达显著降低了了NEFAs和甘油在腹部白色脂肪组织组织块中的释放。提取脂肪组织总RNA和蛋白质检测发现,抑制Vanin-1的表达在转录和翻译水平上抑制了脂质水解相关基因(ATGL和HSL)的表达(图97和图98)。此外,禁食在引起脂肪组织脂质水解增加的同时往往也对会造成短暂的生理性肝脏脂质堆积。取小鼠肝脏组织进行H&E和ORO染色分析以及肝脏TG和TC含量检测,实验结果如图99和图100所示,Vanin-1-siRNA-PCP-NPs的处理减少了禁食诱导小鼠肝脏脂质积聚。
实施例14 Vanin-1-mRNA-PCP纳米颗粒的动物水平过表达效率检测
为了构建脂肪组织特异性过表达Vanin-1的小鼠模型,利用试剂盒合成Vanin-1的mRNA并将其包载于PCP纳米颗粒中,形成mRNA-PCP纳米颗粒。通过琼脂糖凝胶电泳对mRNA-PCP纳米颗粒的稳定性检测,如图101所示,经过PCP纳米材料包载后,mRNA同样随纳米颗粒一起被滞留在胶孔中。随后,选取按照标准饲养流程进行饲养的6周龄雄性C57BL/6J小鼠,随机将所选小鼠分为两组,分别注射Vanin-1-mRNA-PCP纳米颗粒(实验组)和EGFP-mRNA-PCP纳米颗粒(对照组),注射方式如试验9所述。实验结束后将小鼠处死,收集小鼠各组织器官样品,检测目标基因的表达状况。实验结果如图102和图103所示,实时定量基因扩增荧光检测和蛋白质免疫印迹技术检测的结果表明,相比于对照组(EGFP mRNA-PCP纳米颗粒处理组),Vanin-1mRNA-PCP纳米颗粒处理组小鼠的脂肪组织中目标基因Vanin-1的表达在mRNA水平和蛋白质水平均显著升高,而肝脏和肾脏组织中的Vanin-1表达则没有显著变化。证明PCP纳米颗粒可以有效地将mRNA靶向递送至脂肪组织中,提高目的基因的表达,且对目标基因在其他组织器官中的表达水平无影响。
实施例15 Vanin-1-mRNA-PCP纳米颗粒对脂质水解的作用效果检测
实验中选取标准环境中饲养的6周龄雄性C57BL/6J小鼠,按照试验13所描述方法对小鼠进行处理。实验结束后,对小鼠进行体脂分析,实验结果如图104所示,使用纳米颗粒过表达Vanin-1显著降低小鼠的体重和脂肪重量。随后处死小鼠,收集小鼠的血液和各组织器官样品,对腹部白色脂肪组织进行形态学观察并称取重量。实验结果如图105和图106所示,Vanin-1-mRNA-PCP纳米颗粒的处理显著降低了小鼠腹部白色脂肪组织的大小。H&E染色实验表明,Vanin-1-mRNA-PCP纳米颗粒组小鼠脂肪组织中小型脂肪细胞的数量显著增加(图107和图108)。血清学分析显示,注射Vanin-1-mRNA-PCP纳米颗粒的小鼠血清中NEFAs和甘油水平显著升高(图109和图110)。此外,组织块体外培养实验表明,注射Vanin-1-mRNA-PCP纳米颗粒组小鼠的组织块中NEFAs和甘油的释放量也显著增加(图111和图112)。提取脂肪组织的总RNA和蛋白质进行检测发现,脂肪分解相关基因(ATGL和HSL)的mRNA和蛋白质表达水平随着Vanin-1的外源表达而升高(图113和图114)。
另一方面,为了探究Vanin-1-mRNA-PCP纳米颗粒对于病理性肥胖动物模型的作用,实验中选取置于标准环境下饲养的8周龄雄性db/db小鼠和野生型小鼠,按照试验13所描述方法对小鼠进行处理。实验结束后,对小鼠进行体脂分析,实验结果如图115所示,Vanin-1-mRNA-PCP纳米颗粒显著降低了db/db小鼠的体重和脂肪组织重量。随后处死小鼠,收集小鼠的血液和各组织器官样品,对腹部白色脂肪组织进行形态学观察并称取重量。实验结果如图116和117所示,Vanin-1-mRNA-PCP纳米颗粒的处理显著降低了小鼠腹部白色脂肪组织的大小。H&E染色实验表明,Vanin-1-mRNA-PCP纳米颗粒组小鼠脂肪组织中小型脂肪细胞的数量显著增加(图118和图119)。血清学分析显示,注射Vanin-1-mRNA-PCP纳米颗粒的小鼠血清中NEFAs和甘油水平显著升高(图120和121)。此外,组织块体外培养实验表明,注射Vanin-1-mRNA-PCP纳米颗粒组小鼠的组织块中NEFAs和甘油的释放量也显著增加(图122和图123)。提取脂肪组织的总RNA和蛋白质进行检测发现,脂肪分解相关基因(ATGL和HSL)的mRNA和蛋白质表达水平随着Vanin-1的外源表达而升高(图124和图125)。更重要的是,Vanin-1-mRNA-PCP纳米颗粒的处理还改善了db/db小鼠的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗(图126-128)。
实施例16 Vanin-1调控脂肪组织脂质分解的机制研究
为了进一步研究Vanin-1对脂质水解基因的转录调控机制,构建了含有小鼠ATGL和HSL近端启动子的荧光素酶报告载体,利用原代脂肪细胞进行荧光素酶报告基因分析实验。利用脂质体3000将空白质粒载体(对照组)或编码Vanin-1的质粒载体(实验组)分别与ATGL或HSL启动子报告载体共转染至原代脂肪细胞中,48小时后裂解细胞,离心并对上清液中荧光素酶活性进行检测。实验结果如图129所示,Vanin-1的过表达增加了ATGL和HSL启动子的转录活性。
分别分离和培养Vanin-1敲除小鼠的原代脂肪细胞和WT小鼠的原代脂肪细胞,利用脂质体将ATGL或HSL启动子报告载体共转染至原代脂肪细胞中,转染44小时后使用异丙肾上腺素处理细胞4小时,而后裂解细胞,离心并对上清液中荧光素酶活性进行检测。实验结果如图130所示,Vanin-1缺失减弱了ISO诱导的ATGL和HSL启动子的转录激活。
我们对这两个基因启动子进行了生物信息学分析,发现在这两个基因的启动子上都存在包括PPARs、Egr-1、C/EBPα和GR在内的多个经典核因子结合域。我们检测了试验13和试验15动物模型的腹部白色脂肪组织中上述核因子mRNA的表达水平。如图131所示在这些核因子中,我们发现只有PPARγ的表达模式与RNA-PCP-NPS介导的脂肪特异性Vanin-1表达调控呈正相关。这一结果在蛋白质免疫印迹实验和免疫组化染色实验中同样得到证实(图132-136)。
利用脂质体将编码Vanin-1的质粒载体分别与ATGL或HSL启动子报告载体共转染至WT小鼠的原代脂肪细胞中,并使用GW9662处理细胞(PPARγ抑制剂),48小时后裂解细胞,离心并对上清液中荧光素酶活性进行检测。实验结果如图137所示,GW9662的处理抑制了Vanin-1诱导的脂质水解相关基因的激活。
利用脂质体将编码Vanin-1的质粒载体转染至WT小鼠的原代脂肪细胞中,并使用GW9662处理细胞(PPARγ抑制剂),48小时后裂解细胞,检测脂质水解相关基因的表达水平。实时定量基因扩增荧光检测和蛋白质免疫印迹技术检测的结果表明,GW9662的处理抑制了Vanin-1诱导的脂质水解相关基因的激活(图138和图139)。
利用脂质体将编码PPARγ的质粒载体分别与ATGL或HSL启动子报告载体共转染至Vanin-1敲除小鼠的原代脂肪细胞中,转染44小时后使用异丙肾上腺素处理细胞4小时。而后裂解细胞,离心并对上清液中荧光素酶活性进行检测。实验结果如图140所示,PPARγ的过表达提高了Vanin-1缺失条件下脂质水解相关基因的启动子转录活性。
利用脂质体将编码PPARγ的质粒载体转染至Vanin-1敲除小鼠的原代脂肪细胞中,转染44小时后使用异丙肾上腺素处理4小时,随后裂解细胞,检测脂质水解相关基因的表达水平。实时定量基因扩增荧光检测和蛋白质免疫印迹技术检测的结果表明,PPARγ的过表达促进了Vanin-1缺乏条件下的脂质水解相关基因的mRNA和蛋白质的表达(图141和图142)。
取人的腹部脂肪组织进行进一步检测发现,Vanin-1和PPARγ的mRNA表达水平同样也呈正相关,这与我们所发现的结果相一致(图143)。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 脂肪组织靶向肽P3-壳聚糖寡聚乳酸-聚乙二醇递送系统及其在核酸药物递送上的应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ckggrakdc 9
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcauauacgg ugugcguuu 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaacgcacac cguauaugc 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgauucucc aagggucuu 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagacccuug gagaaucgg 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcgagcagau gagguuuau 19
<210> 7
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
auaaaccuca ucugcucgc 19
Claims (12)
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,m为42~47,n为12~17。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,m为45,n为15。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述纳米颗粒递送系统的制备方法是将聚乙二醇、壳聚糖寡糖乳酸和脂肪组织血管靶向肽P3通过酰胺化反应偶联,然后通过离子交联法,让带有正电荷的聚合物与带有负电荷的三聚磷酸根离子发生离子交联反应,形成所述的纳米颗粒递送系统。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,纳米颗粒递送系统的制备方法包括如下步骤:
(1)配方量的COL溶于去离子水中,加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺,室温条件下搅拌反应25~35min,形成活化的COL;
(2)步骤(1)形成活化的COL中加入PEG,室温条件下遮光反应24-36h,产物进行透析、真空冷冻干燥,得到COL-PEG聚合物;
(3)将COL-PEG聚合物配置成3~4mg/ml的溶液,室温下添加P3、EDC和NHS,室温条件下遮光搅拌反应36-48h;产物进行透析、真空冷冻干燥,获得P3和PEG共修饰的壳聚糖寡糖乳酸聚合物P3-COL-PEG;
(4)将步骤(3)获得的聚合物P3-COL-PEG与带负电荷的三聚磷酸根离子按(8~12):1的质量比通过离子交联法进行离子交换,获得所述的纳米颗粒递送系统。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,步骤(1)中COL:NHS:EDC的质量比为(8~12):(1.5~2.5):1,步骤(2)中COL:PEG质量比为(1.5~2.5):1,步骤(3)中P3、碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺质量比为(4~6):4:(4~6)。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,步骤(1)中COL:NHS:EDC的质量比为10:2:1。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,步骤(2)中COL:PEG的质量比为2:1。
9.权利要求6所述的应用,其特征在于,步骤(3)中P3、碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺质量比为5:4:5。
11.根据权利要求10所述的纳米颗粒,其特征在于,m为42~47,n为12~17。
12.权利要求10所述的纳米颗粒,其特征在于,m为45,n为15。
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