CN110101681B

CN110101681B - 提高火龙果γ-生育酚生物利用度的微粒制备方法

Info

Publication number: CN110101681B
Application number: CN201910405239.XA
Authority: CN
Inventors: 赵进; 葛建
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2019-05-16
Filing date: 2019-05-16
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2039-05-16
Also published as: CN110101681A

Abstract

本发明公开了一种提高火龙果γ‑生育酚生物利用度的微粒制备方法，包括以下步骤：配制聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖溶液，配制γ‑生育酚溶液，将γ‑生育酚溶液加入聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖溶液中，再加入多聚磷酸钠水溶液，均匀搅拌，得提高火龙果γ‑生育酚生物利用度的微粒混悬液。采用该方法能制备出包封率、稳定性显著增高的γ‑生育酚微粒。

Description

提高火龙果γ-生育酚生物利用度的微粒制备方法

技术领域

生育酚为火龙果(红心和白心火龙果)中最主要的天然活性成分，具有多种药理活性和保健功能。本发明涉及一种可提高火龙果中γ-生育酚生物利用度的微粒制备方法。

背景技术

火龙果果皮颜色鲜红艳丽，果肉清甜爽口，在我国是一种深受大家喜爱的热带水果。火龙果原产于中美洲的热带、亚热带，在亚洲主要分布在越南和我国台湾地区。随着近些年水果引种培育和设施农业的发展，在我国广东、广西、海南、云南、贵州以及浙江等地也进行了大规模种植。火龙果籽为镶嵌在火龙果果肉中的种仁，外形非常类似黑芝麻。人们在直接食用火龙果时，通常会将火龙果籽连同果肉一起吞咽下去，但是在我国一些水果加工厂在火龙果加工过程中，尤其是在加工生产果汁、果酒、果醋等饮料时，会产生大量的副产物，其中这些火龙果籽就是一种副产物，不能存在于火龙果饮料中。但是如果将这些火龙果籽遗弃就是一种资源的巨大浪费。

现代食品加工和食品科学以及药理学研究表明，火龙果籽中含有大量的不饱和脂肪酸及多种氨基酸。火龙果富含糖类、有机酸、蛋白质、氨基酸和多种矿物质元素及膳食纤维，还含有甜菜苷类天然色素和各种功能性物质，经常食用能降血压、降血脂、润肺、解毒、养颜、明目等功能，同时对便秘和糖尿病还具有一定的辅助治疗作用，具有较高的保健功能和营养价值。其中火龙果籽油对HepG2、HT-29人体癌细胞的增殖还具有显著性、持续性的抑制作用。近年来，国内外大量研究也表明了火龙果籽油中含有大量预防和治疗心脑血管类疾病的天然活性成分。有研究分析了红心火龙果籽在-80℃冷冻干燥后水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、灰分及碳水化合物的含量，检测结果表明100g火龙果籽冷冻干燥粉末中水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、灰分及碳水化合物的含量分别为6.48g、24.84g、31.79g、13.38g、2.58g和20.39g。同时检测发现具有较强抗氧化活性的生育酚类化合物含量分别为16.28mg/100g红龙果籽。此外，火龙果籽中含有丰富的不饱和脂肪酸(占脂肪酸总含量的75.23％)和多种人体所需的必需氨基酸(占氨基酸总含量的26.62％)。

生育酚主要结构是一个氢醌基团加一个类异戊二烯的饱和脂肪酸侧链，生育酚有四种同分异构体。生育酚呈脂溶性，具有较强的抗氧化活性，对氧敏感，不溶于水，对热和酸稳定，对碱不稳定。现代药理学研究表明生育酚具有多种生理和药理功能，能促进性激素分泌，使男子精子活力和数量显著增加，使女性雌激素浓度增高，提高生育能力，预防流产。因此，生育酚多被用于防治不孕不育症及女性更年期综合征的防治。此外，研究还表明生育酚对烧伤、冻伤、毛细血管出血以及美容等方面也具有功效。近几年研究还发现，生育酚可抑制肿瘤，具有防癌、抗癌功效。近来还发现维生素E可抑制眼睛晶状体内的过氧化脂质反应，使末梢血管扩张，改善血液循环，预防近视眼发生和发展。维生素E苯环上的酚羟基被乙酰化，酯水解为酚羟基后的产物即为生育酚。

由于生育酚不溶于水，很难应用于临床或者食品、保健品领域，又因为其结构的特异性，较为易于被氧化破坏，使得生育酚生物利用率较低，甚至很容易失去生物活性。因此，生育酚在储藏和临床或食品保健应用领域存在显著局限性。因此，采用纳米体系对其进行保护是目前解决这一问题最有效的手段之一。纳米粒是纳米技术中较为常用的载体之一，在微粒给药系统以及活性包装领域的应用研究日趋普遍。基于不同方法制备的纳米颗粒具有较好的生物相容性、靶向性和缓释性，能有效提高诸多生物活性物质的稳定性及生物利用率。在食品领域，纳米粒已经作为氨基酸、蛋白质、维生素等功能性营养补充剂的新型输送载体，具有提高生物活性成分物理靶向性，增加其稳定性，控制缓释等优势。尤其对难溶性活性成分具有良好的增溶作用。纳米粒也常作为防腐剂、抗氧化剂、抑菌剂的载体制备具有抗氧化抑菌活性的缓释包装膜。

有研究采用壳聚糖包埋技术制备了α-生育酚纳米粒(微粒)，采用乳化-离子凝胶两步法制备方法，通过单因素正交试验考察了壳聚糖质量浓度、α-生育酚质量浓度、壳聚糖与三聚磷酸钠质量比、pH值、搅拌速率等因素对纳米粒(微粒)的影响，确定最优制备工艺。作为一种引人注目的纳米载体材料，壳聚糖分子结构规整，为直链线型高分子聚合物，分子内以及分子间存在着大量的氢键作用，结晶性高，水溶性差，使得壳聚糖的应用受到了一定限制。因此，对传统壳聚糖进行改性修饰，并利用修饰后的壳聚糖制备生育酚的新型纳米粒，并对其包封率、载药率、体内血药浓度水平等进行考察，目前有关这方面的研究尚未见报道。

γ-生育酚的特性为具有抗氧化能力，能清除自由基、促进人体新陈代谢、增强机体耐力以及提高免疫力等功能，但是生育酚对紫外光、温度、氧气、金属离子敏感，易被氧化破坏。目前现有的γ-生育酚壳聚糖包埋技术有普通壳聚糖纳米粒(微粒)、酪蛋白纳米粒以及玉米肽-麦芽糊精糖基化产物纳米粒等。由于普通壳聚糖水溶性较低，从而使得包封率和载药率相对较低，生物利用度欠佳。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种提高γ-生育酚生物利用度的微粒制备方法，采用该方法能制备出包封率、稳定性显著增高的γ-生育酚微粒。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种提高火龙果γ-生育酚生物利用度的微粒制备方法，包括以下步骤，

1)、在1～3g聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖(mPEG750-g-CS)中加水定容至80.0mL均匀搅拌，然后调节pH至4.5±0.2；得聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖溶液；

2)、将γ-生育酚溶于无水乙醇中，配制浓度为(2.0±0.2)mg/mL的γ-生育酚溶液；

3)、取步骤2)所得的γ-生育酚溶液10mL加入(滴加，滴加时间约为5±1分钟)至步骤1)所得的聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖溶液中；

4)、配制质量浓度为1.8～2.2％(优选2.0％)的多聚磷酸钠水溶液；

5)、取步骤4)所得的多聚磷酸钠水溶液10ml滴入至步骤3)所得液中，滴加时间为20±5分钟，滴加完毕继续搅拌30～50min，得提高火龙果γ-生育酚生物利用度的微粒混悬液(γ-生育酚微粒混悬液)。

作为本发明的提高火龙果γ-生育酚生物利用度的微粒制备方法的改进，聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖(mPEG750-g-CS)的制备方法为采用壳聚糖作为原料，包括以下步骤：

①、在0.5g琥珀酸酐(丁二酸酐)、9.5～10.5g的聚乙二醇750单甲醚(mPEG750)中加入二氯甲烷(无水二氯甲烷)磁力搅拌均匀混合(琥珀酸酐被溶解)，然后再加入作为催化剂的4-二甲氨基吡啶0.9～1.1mol，回流反应5±0.5h；

②、将步骤①的反应所得物干燥(50～70℃干燥至恒重)，采用饱和碳酸氢钠溶液进行溶解；再加入乙酸乙酯进行萃取，收集水相；

③、将水相调节pH至2±0.3，用二氯甲烷萃取，向所得的二氯甲烷萃取相中加入无水硫酸钠，过滤后所得滤液浓缩(35～45℃浓缩至近干)后加入乙醚(无水乙醚)，于4±0.5℃静置12～16h(过夜)，所得的结晶为mPEG750-COOH；

④、将0.5g的壳聚糖溶于质量浓度为1.8～2.2％(优选2％)的醋酸溶液中，调节pH6.0±0.3；

然后加入(2±0.1)g的mPEG750-COOH、(0.5±0.05)g的N-羟基琥珀酰亚胺、(0.5±0.05)g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，磁力搅拌12～16h(过夜)后，将反应液转入透析袋中，于去离子水透析(48±5)h；

留置在透析袋的所得物冷冻干燥，将所得的冷冻干燥物加入乙醇(无水乙醇)中，形成的沉淀干燥，得聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖(mPEG750-g-CS)。

作为本发明的提高火龙果γ-生育酚生物利用度的微粒制备方法的改进：所述步骤④中，透析膜截留分子量100kD。

在上述聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖(mPEG750-g-CS)的制备方法中，

所述步骤①中，二氯甲烷的用量为(200±50)mL；所述步骤②中，饱和碳酸氢钠溶液的用量为(100±20)mL，乙酸乙酯的用量为(50±10)mL；所述步骤④中，醋酸溶液的用量为(50±10)mL。

作为本发明的提高火龙果γ-生育酚生物利用度的微粒制备方法的进一步改进：所述步骤1)中聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖(mPEG750-g-CS)的用量为1.6g。

在本发明中，壳聚糖：分子量约11万、脱乙酰度＞80％、壳聚糖纯度＞99％。

pH的调节方式为常规方式，例如可采用1～2mol/L盐酸进行调节。

本发明的用法为：口服，用量约为2～4mgγ-生育酚/kg体重。

本发明是为了解决γ-生育酚体内生物利用度较低和稳定性低的问题，从而提供一种提高γ-生育酚生物利用度和化学稳定性的微粒制备方法。

本发明采用多聚磷酸钠(TPP)离子交联法制备γ-生育酚微粒，并考察γ-生育酚微粒体外包封率、化学稳定性以及体内生物利用度。

本发明在发明过程中，使用了如下的检测方法：

方法一、血浆中γ-生育酚的定量分析方法

采用向0.2mL空白血浆中加入γ-生育酚标准品的方法，配制浓度范围为0.01-10mg/L的γ-生育酚标准样品，再向其中加入20μL20％(质量百分浓度)的抗坏血酸，再加入20μL 20.0mg/Lα-生育酚作为内标，混合后加入3mL正己烷进行萃取，振荡1min，6000r/min高速离心5min，分别得有机相(位于上层)和水相(位于下层)；将水相(位于下层)用3mL正己烷重复萃取一次(萃取条件同上)，合并两次萃取有机相，于45℃水浴中氮气流吹干，所得残渣用0.2mL流动相溶解，超声振荡后，18000r/min高速离心3min，取20μL上清液HPLC进样分析。

具体为：美国Waters e2695高效液相色谱系统，原装色谱工作站，检测器为原装2473荧光检测器，Thermo BDS C₁₈柱(5μm,250mm×4.6mm)，流动相为甲醇∶水＝85∶15；柱温30℃，激发波长295nm，发射波长325nm；流速为1.0mL·min^-1；进样量为20μL。

备注说明：空白血浆即为没有加入γ-生育酚的纯血浆。

根据HPLC检测结果，以γ-生育酚峰面积与内标α-生育酚峰面积之比(Y)为纵坐标，以γ-生育酚的质量浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，求出曲线方程和相关系数(r)。同时制备含γ-生育酚曲线范围内高、中、低浓度血浆样品0.05，0.5，5.0mg/L作为质控样品(QC)，分别按照上述样品处理方法处理后进样分析，每个浓度样品重复5次，以样品中γ-生育酚峰面积与直接溶于流动相下所测峰面积之比，计算高、中、低3种浓度下方法回收率(即，样品中γ-生育酚峰面积与直接溶于流动相下所测峰面积之比＝γ-生育酚回收率)。比较以上样品于日内5次和日间5次测定的峰面积的变化，计算日内精密度和日间精密度。

备注说明：“日内精密度和日间精密度”主要用于评价上述方法(即HPLC检测方法)的精密度和准确性，以此来判断最终检测结果的可靠性。

结果为：

按照上述方法所得处理血浆中γ-生育酚在0.01-10.0mg/L浓度范围内标准曲线为Y＝0.0027x+0.0012(r＞0.999)，在标准曲线范围内高、中、低浓度γ-生育酚回收率均大于85％以上，日内精密度和日间精密度均小于10％，见表1。

表1.血浆中γ-生育酚的回收率和精密度

根据上述结果，能得知：本发明所设置的上述检测方法能满足本发明的γ-生育酚生物利用度的检测的要求。

方法二、评估γ-生育酚包封率

在本发明中，将一定体积(约2mL)的γ-生育酚微粒混悬液用超滤离心管(10000MWCO,密理博中国有限公司)在4000r/min下离心10min，取滤膜(10000MWCO孔径滤膜，即，为留在滤膜上的化合物最小分子量为10000的超滤膜)下层的滤液1mL，置于离心管中，按照方法一中相同色谱条件，取离心管中的超速离心(6000r/min离心5min)后得到的过滤液进样分析。计算脂质体包封率，包封率(％)＝{(γ-生育酚初始含量-滤液中γ-生育酚含量)/γ-生育酚初始含量}×100％。

方法三、评估血浆中γ-生育酚的生物利用度

80只SPF级ICR雄性小鼠购于杭州师范大学实验动物中心，合格证：SYXK(浙)2016-0014，体重25±1.5g，于实验前适应性养殖一周，口灌前12h禁食、不禁水。

实验组一、γ-生育酚口灌对照组：γ-生育酚羧甲基纤维素钠溶液(采用0.5％羧甲基纤维素钠水溶液溶解γ-生育酚，浓度为0.2mg/mL)，按照4.0mgγ-生育酚/kg体重口灌；将40只小鼠随机分为8组，每组5只，于实验前适应性养殖一周，口灌前12h禁食、不禁水。

实验组二、γ-生育酚微粒混悬液组：将本发明制备的γ-生育酚微粒混悬液(浓度为0.2mg/mL)，按照4.0mgγ-生育酚/kg体重口灌；将40只小鼠随机分为8组，每组5只，于实验前适应性养殖一周，口灌前12h禁食、不禁水。

实验一和实验二分别于口灌后5min、10min、15min、30min、60min、120min、180min和240min眼球取血，每组采血5只小鼠，然后将所取血液于肝素化离心管中，6000r/min离心后，每个时间点分别取0.2mL血浆于10mL离心管中，同时参照上述方法一处理后进HPLC分析。将所测血浆中γ-生育酚和内标峰面积之比代入上述标准曲线方程(方法一所得)中，计算血浆中γ-生育酚浓度，绘制γ-生育酚血药浓度——时间曲线，比较γ-生育酚微粒混悬液(本发明)和γ-生育酚羧甲基纤维素钠水溶液的血药浓度，以此来评价γ-生育酚微粒制剂对溶液中γ-生育酚在机体内生物利用度的影响。

即，本发明实验组一和实验组二利用实验动物整体小肠吸收模型，通过定量检测本发明所得的γ-生育酚微粒混悬液在体内生物利用度。

方法四、评估γ-生育酚微粒稳定性

准备具塞玻璃离心管若干支，分别向其中加入本发明所制备的γ-生育酚微粒混悬液1mL，同时设立等浓度、等体积的γ-生育酚羧甲基纤维素钠溶液对照组，将对照组和微粒实验组离心管分别放置于4℃、室温、40℃、60℃以及80℃实验条件下48h，考察不同处理温度下对照组和微粒实验组γ-生育酚含量变化。同时设立氧化剂处理组，分别向1.0mL对照组和微粒实验组溶液中准确加入1.0mL 20.0mg/L的三氯化铁溶液，于室温下避光保存48h。以上不同处理组分别计算γ-生育酚保留率。

保留率/％＝(处理后样品中包埋的γ-生育酚量)/(处理前样品中包埋的γ-生育酚量)×100％

即，本发明利用不同处理温度和氧化剂，分别考察不同处理条件下对照组和微粒组混悬液中γ-生育酚的稳定性。

综上所述，采用本发明方法制备而得的微粒，能够增强γ-生育酚生物利用度，保持γ-生育酚化学稳定性，从而实现其在食品和医药领域的应用。

本发明采用聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖(mPEG750-g-CS)，使得包埋载体壳聚糖部分水溶性大大提高、自组装能力增强。而酪蛋白和玉米肽-麦芽糊精糖基化产物均来自于食品原料，虽然食用安全性和营养性较好，但也易于被各种微生物所腐败，产生各种异味，因此在食品保鲜领域难以广泛使用。而mPEG750-g-CS为化学纯化产品和衍生后产物，安全性也较高，尤其应用于食品保鲜方面具有独特优势。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是γ-生育酚的标准色谱图；

图2是空白血浆的色谱图；

图3是服用实施例1所述的γ-生育酚微粒混悬液后小鼠血浆色谱图；

其中峰1为γ-生育酚色谱峰；峰2为内标。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

以下案例，没有明确告知的均是在20～25℃的室温下进行；

磁力搅拌的转速(800±50)r/min；其余搅拌转速为(200±50)r/min。

pH的调节方式属于常规技术，例如可采用1～2mol/L盐酸溶液进行调节。

案例1、聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖(mPEG750-g-CS)的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、准确称取10g聚乙二醇750单甲醚(mPEG750)和0.5g琥珀酸酐于500mL圆底烧瓶内，加入200mL无水二氯甲烷磁力搅拌溶解，然后加入作为催化剂的4-二甲氨基吡啶1mol，于回流条件下反应5h；

2)、将步骤1)的反应所得物于60℃旋转干燥至恒重，冷却至4℃加入100mL饱和碳酸氢钠溶液进行溶解；再加入50mL乙酸乙酯进行萃取，收集位于下层的水相；

3)、将水相调pH至2，加入500ml的二氯甲烷萃取，向所得的二氯甲烷萃取相(位于下层)中加入无水硫酸钠(约50g)，过滤后滤液于约40℃浓缩至近干，加入100mL无水乙醚后于4℃静置过夜(约14h)，所得的白色结晶自然干燥至恒重后为mPEG750-COOH；

4)、采用壳聚糖(分子量约11万、脱乙酰度＞80％、壳聚糖纯度＞99％)作为原料，

将0.5g的壳聚糖溶于质量浓度为2％的醋酸溶液50mL中，调节pH6.0；

然后加入2g的mPEG750-COOH、0.5g的N-羟基琥珀酰亚胺、0.5g的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，磁力搅拌过夜(约14h)后，将反应液转入透析袋(透析膜截留分子量100kD)中，去离子水透析48h，上述透析过程中每12小时更换一次去离子水；

留置在透析袋内的所得物先于-60℃冷冻干燥12小时；将所得的冷冻干燥物加入至50ml的无水乙醇中，形成的沉淀于50℃干燥至恒重，得聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖(mPEG750-g-CS)。

该得聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖(mPEG750-g-CS)的取代度为约为20.6％。

实施例1、一种提高γ-生育酚生物利用度和化学稳定性的微粒制备方法，包括以下步骤：

1)、在500mL圆底烧瓶中加入1.6g的聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖(mPEG750-g-CS)，并加水定容至80.0mL，于25℃温度下进行磁力搅拌30-40分钟，转速800r/min，然后调节pH至4.5。

2)、准确称取γ-生育酚，溶于无水乙醇中，配制成10mL质量浓度为2.0mg/mL的γ-生育酚溶液。

3)、将步骤2)所得的γ-生育酚溶液滴入步骤1)配制的聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖(mPEG750-g-CS)溶液中，边滴入边搅拌，约5分钟滴加完毕。

4)、准确称取多聚磷酸钠粉末，用超纯水溶解，配制10mL质量浓度为2.0％的多聚磷酸钠水溶液。

5)、将步骤4)所得的多聚磷酸钠水溶液滴入至步骤3)所得液中，滴加时间为20分钟，滴加完毕继续搅拌30～50min，即得提高火龙果γ-生育酚生物利用度的微粒混悬液(简称：γ-生育酚微粒混悬液)。

实施例2、

将实施例1中聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖(mPEG750-g-CS)的用量由1.6g改成1.0g，其余等同于实施例1。

实施例3、

将实施例1中聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖(mPEG750-g-CS)的用量由1.6g改成3.0g，其余等同于实施例1。

实验1、检测微粒包封率：

将上述实施例1、2、3所得物，即，γ-生育酚微粒混悬液，按照上述方法二进行检测，结果如下：

实施例1所得的悬浮液的包封率(％)＝81.65％；

实施例2所得的悬浮液的包封率(％)＝46.52％；

实施例3所得的悬浮液的包封率(％)＝55.37％。

实验2、将上述实施例1所得的γ-生育酚微粒混悬液按照上述方法三所述的方法进行检测。

具体为：

按照4.0mgγ-生育酚/kg体重给小鼠口灌配制。

上述结果表明：本发明中所制备的γ-生育酚微粒混悬液在不同采血时间点血液中生育酚浓度均显著高于γ-生育酚0.5％羧甲基纤维素钠溶液，说明γ-生育酚微粒组混悬液口服生物利用度显著高于普通γ-生育酚羧甲基纤维素钠溶液。

最终结果如下表2(取平均值)。

表2、不同实施例中γ-生育酚血药浓度——时间数据(mg/L)

时间(min)	实施例1	γ-生育酚口灌对照组
			5	0.12	0.041
10	0.72	0.32
			15	1.64	0.96
30	3.16	2.68
			60	1.93	1.17
120	0.96	0.53
			180	0.41	0.13
240	0.054	0.022

实验3、将实施例1、实施例2、实施例3所得的γ-生育酚微粒混悬液按照上述方法四所述的方法进行检测。

上述结果表明：本发明中所制备的γ-生育酚微粒混悬液在不同处理条件下保留率(％)均高于羧甲基纤维素钠组，说明γ-生育酚微粒混悬液在不同贮存条件下均较普通羧甲基纤维素钠组稳定。

最终结果如下表3。

表3、不同实施例中γ-生育酚保留率(％)

对比例1、将步骤4)中多聚磷酸钠水溶液的浓度由2.0％改成1.5％，体积量不变，仍为10mL，其余等同于实施例1。

对比例2、将实施例1步骤1)中的pH4.5改成pH为6.0，其余等同于实施例1。

对比例3、参照案例1所述方法，以聚乙二醇400(PEG400)为原料，制备获得相应的PEG400-g-CS；

以PEG400-g-CS替代mPEG750-g-CS，用量保持不变；其余等同于实施例1。

对比实验1、检测微粒包封率：

将上述对比例所得物按照上述方法进行检测，所得结果如下：

对比例1所得的混悬液的包封率(％)＝53.08％；

对比例2所得的混悬液的包封率(％)＝38.66％；

对比例3所得的混悬液的包封率(％)＝31.62％。

将上述所有对比例所得的γ-生育酚微粒混悬液按照上述方法进行γ-生育酚保留率的检测；最终结果如下表4。

表4、不同对比例中γ-生育酚保留率(％)

上述所有案例所得的γ-生育酚微粒混悬液按照上述方法三进行检测，γ-生育酚血药浓度——时间的对比如下表5所述。

表5、不同案例中γ-生育酚血药浓度——时间数据的对比(mg/L)

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明中γ-生育酚组成微粒混悬液的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.提高火龙果γ-生育酚生物利用度的微粒制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）、在1.6g聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖中加水定容至80.0mL均匀搅拌，然后调节pH至4.5±0.2；得聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖溶液；

聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖的制备方法为采用壳聚糖作为原料，包括以下步骤：

①、在0.5g琥珀酸酐、9.5~10.5g的聚乙二醇750单甲醚中加入二氯甲烷磁力搅拌均匀混合，然后再加入作为催化剂的4-二甲氨基吡啶0.9~1.1mol，回流反应5±0.5h；

②、将步骤①的反应所得物干燥，采用饱和碳酸氢钠溶液进行溶解；再加入乙酸乙酯进行萃取，收集水相；

③、将水相调节pH至2±0.3，用二氯甲烷萃取，向所得的二氯甲烷萃取相中加入无水硫酸钠，过滤后所得滤液浓缩后加入乙醚，于4±0.5℃静置12~16h，所得的结晶为mPEG750-COOH；

④、将0.5g的壳聚糖溶于质量浓度为1.8~2.2%的醋酸溶液中，调节pH6.0±0.3；

然后加入（2±0.1）g的mPEG750-COOH、（0.5±0.05）g的N-羟基琥珀酰亚胺、（0.5±0.05）g的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐，磁力搅拌12~16h后，将反应液转入透析袋中，于去离子水透析（48±5）h；

留置在透析袋的所得物冷冻干燥，将所得的冷冻干燥物加入乙醇中，形成的沉淀干燥，得聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖；

透析膜截留分子量100kD；

所述壳聚糖的分子量11万、脱乙酰度＞80%、壳聚糖纯度＞99%；

2）、将γ-生育酚溶于无水乙醇中，配制浓度为2.0mg/mL的γ-生育酚溶液；

3）、取步骤2）所得的γ-生育酚溶液10mL加入至步骤1）所得的聚乙二醇750单甲醚接枝壳聚糖溶液中；

4）、配制质量浓度为2%的多聚磷酸钠水溶液；

5）、取步骤4）所得的多聚磷酸钠水溶液10ml滴入至步骤3）所得液中，滴加时间为20±5分钟，滴加完毕继续搅拌30~50min，得提高火龙果γ-生育酚生物利用度的微粒混悬液。