CN1297301C

CN1297301C - 可可茶提取物用于制备预防及改善肥胖及其临床症状的药物及食品的应用

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Publication number: CN1297301C
Application number: CNB2004100267254A
Authority: CN
Inventors: 栗原博; 姚新生; 叶创兴
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University; University of Jinan
Priority date: 2004-04-01
Filing date: 2004-04-01
Publication date: 2007-01-31
Anticipated expiration: 2024-04-01
Also published as: CN1562280A

Abstract

本发明公开了可可茶提取物及其活性成分GCG、1，2，4，6——GA-glc、GC-3，5-diGA、山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol3-rhamnosyl-rutinoside)及山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol 3-rutinoside)用于制备预防及改善肥胖及其临床症状的药物及食品的应用。本发明是基于可可茶提取物及其活性成分在脂肪负荷实验、胸淋巴管脂肪吸收抑制作用的测定、抑制脂肪酶活性的测定等实验中显示有意义的效果中得以确认和证明的。

Description

可可茶提取物用于制备预防及改善肥胖及其临床症状的药物及食品的应用

技术领域

本发明涉及天然植物提取及应用领域，尤其是涉及可可茶提取物的应用。

背景技术

近年来随着物质生活的丰富，人们的脂肪消费水平也在逐年上升。这已被认为是导致肥胖、高血脂症、动脉硬化及糖尿病等生活习惯病增加的一个原因。肥胖尽管受遗传因素、饮食因素、生活习惯因素、精神因素、中枢性因素、代谢性因素、运动不足等多种因素的影响，但对多数肥胖者来讲还是由于营养摄取过度，致使过多的能量蓄积在体内造成的一种代谢不平衡状态。根据流行病学调查证明，与正常人相比，多数肥胖者的体内组织脂肪蓄积异常。高血脂症已被证明是诱发糖尿病、动脉硬化及高血压等生活习惯病的主要原因之一。因此，肥胖早已不是富裕的象征。由肥胖导致的各种生活习惯病已成为人们十分关注的社会问题。已知食品成分中脂肪含有的热量最高，过量摄取脂肪是导致肥胖的直接原因。脂肪的吸收需要通过胰脏分泌的脂肪酶的作用，分解成游离脂肪酸后经小肠吸收，在体内再合成中性脂肪被蓄积和利用。中性脂肪在肝脏中过量蓄积会诱发脂肪肝。中性脂肪酸在肝脏中转换成超低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)进入血液，血液中过量的VLDL又称高脂血症。高脂血症不仅是动脉硬化的主要病因，还会引起血栓症，又是诱发脑梗塞、心肌梗塞等循环系统疾患的原因之一。对于预防动脉硬化，一般认为通过限制脂肪吸收或促进体内脂肪代谢来减少血液脂质，特别是减少VLDL是非常有效的方法。因此可以说，过量摄取脂肪引起的肥胖是多种生活习惯病的主要成因并不过分。

近年来，人们已充分认识到肥胖可以引起多种生活习惯病。减肥也早已成为一个不陌生的话题。肥胖尽管受遗传、饮食、生活习惯、运动不足等多种因素的影响，但多数肥胖症者还是起因于摄取过度或代谢的不平衡。人们发现运动可以减肥，但持续运动并非易事。因此，通过促进脂肪代谢或减少脂肪吸收达到减肥无疑是最基本的方法。

迄今为止，减肥剂的开发主要是基于对脂肪或糖在吸收、代谢等不同环节的调控。当然，抑制脂肪酶的活性可以阻止脂肪分解，减少脂肪吸收，无疑可以达到预防和治疗肥胖及高脂血症的作用。现在，常用的减肥剂阿卡波糖(acarbose)是Bayer Pharma公司研制的α-葡萄糖苷酶抑制剂(alpha-glucosidaseinhibitors)，其减肥机制主要通过抑制糖的吸收。阿卡波糖同时也作为糖尿病治疗剂用于临床。此外，还有氯苯咪吲哚(mazindol)、苯丁胺(phentermine)等交感神经系统兴奋剂(adrenergic agent)和芬氟拉碱(dezfenfluramine)、氟西汀(fluoxetine)等5-羟色胺兴奋剂通过抑制食欲来减肥。但这些减肥剂一般需要在医生的指导下使用，而且多数药品具有一定的副作用。在现代社会，防治肥胖往往并非通过药物治疗，而更多的是通过控制日常饮食、减少脂肪吸收，或通过运动促进脂肪燃烧。但是这些方法也很难长期坚持实行。因此，具有减肥作用或者对肥胖有预防效果的健康食品对于减肥消费者来讲无疑是极为理想的，同时也是现在社会受人关注和急需解决的课题之一。

茶的故乡在中国南部，其根据之一是中国南部自然分布生长着茶的多种变种及野生种。可可茶(Camellia ptilophylla Chang)是一种野生茶，在植物分类学上是传统茶叶(Camellia sinensis)的近缘种植物，被人们发现后又称为新种茶。根据近年的调查结果，野生可可茶主要自然分布在广东省龙门地区的狭窄范围，长期以来被当地人们通过杀青、半发酵、发酵等不同方法制成绿茶、乌龙茶及红茶等茶叶日常饮用。可可茶是一种饮用安全的日常饮料，长期以来被当地人们用作健康茶饮用，迄今为止没有发现任何副作用及不安全的现象。与传统茶叶中的甲基黄嘌呤(methyxanthine)类物质代谢途径不同，可可茶中不含有咖啡因(caffeine)，而含有可可豆碱(可可碱(Theobromine))(为巧克力的原料-可可豆cacao的主要活性成分)，因此被称为可可茶(cocoa tea)。与咖啡因的化学结构不同，可可豆碱在咖啡因化学结构的1位上没有甲基取代，因而表现出与咖啡因不同的生理作用，不仅不显示咖啡因特有的中枢兴奋作用，相反显示出镇静等功能。因此，可可茶又被称作睡前可以饮用的休息茶，适用于老年、孕妇、儿童、胃肠功能低下或心脏不健康等人的饮用。

近年来，人们非常关心天然物质生理活性的研究，对茶类所具有生物功能更是特别关注。茶和咖啡、可可被并称为世界三大嗜好饮料，为世界绝大多数人所喜爱。人类饮茶已有数千年的历史。茶叶对健康的种种调节功能自古以来早以为人们所知，例如茶叶的抗氧化作用(antioxidant)、抗菌作用、对血中胆固醇的调节作用等更是令人注目。传统茶叶的提取物及所含主要活性成分多酚类(polyphenols)物质对糖的吸收抑制作用等已有报道。尽管可可茶是传统茶叶的近缘种植物，但对于可可茶的生物活性及其中主要活性成分对脂肪吸收及脂肪酶的抑制活性尚无任何应用方面的探讨。

发明内容

本发明的发明目的在于提供以可可茶(Camellia ptilophylla Chang)提取物及可可茶有效成分为原料，制备一种安全性高、无副作用的脂肪酶抑制药物，以及通过抑制脂肪酶活性用于减少、改善或抑制肥胖、高血脂症、血脂代谢异常及上述疾患引起的各种临床不良症状的药物，并可以预防因肥胖引起的多种生活习惯病的药物的用途。所述的药物包括有效治疗剂量的可可茶提取物，以及药学上可接受的载体。

本发明的另一发明目的在于提供以可可茶提取物及可可茶有效成分为原料，制备用于预防、改善肥胖、高血脂及血脂代谢异常，用于减肥、降低血脂，无副作用、安全性高的健康食品、食品及食品添加剂的用途。

本发明所述的可可茶提取物是采用热水或水与甲醇、乙醇等低级醇类、丙酮等极性溶剂的一种或二种以上的任意混合溶剂进行提取的。

因为可可茶中的生物碱(alkaloid)及儿茶酚类(catechins)都属于小分子化合物，一般用水提取即可，也可用不同浓度的低级醇类、丙酮等极性溶剂或任意混合溶剂来提取。在提取时，随着醇的添加，可可茶中活性成分的回收率会有所增加。尽管用水提取效果不如用醇添加提取，但随着水温增加，以及提取时间的延长，也可以达到与醇提取法相当的结果。因此，对可可茶中活性成分的提取而言，上述提取方法及其任意组合都可得到本发明所述的提取物。

鉴于可可茶提取物是以药剂或饮料作为最终产品开发，故从安全性角度考虑提取溶剂尽量选择乙醇为宜。提取时可可茶与溶剂的比率没有特定限制，但一般可可茶与溶剂的比例以5∶1～50范围为宜。本发明对提取温度没有特定限制，从室温到溶剂沸点范围都可适用。当然室温、常压及在溶剂沸点范围内提取最为理想。提取时间从10秒到24小时范围都可以。在提取可可茶提取物时，根据需要也可以在溶剂中添加碳酸氢钠、抗坏血酸钠盐(sodium ascorbate)等物质。这些提取方法不会影响可可茶本来具有的生物活性。

本发明提供的可可茶提取物固形剂使用量一般在0.1％至40％(W/W)，因为通常饮料添加浓度一般在0.1％至40％(W/W)范围较为适宜。在这个浓度范围内，可可茶提取物适于直接服用，容易被消费者接受。当然，作为添加物的可可茶提取物随着加入量的增大，可能会出现苦涩感觉。其解决办法可以根据市场需要及消费者的心理要求改换剂型，例如使用片剂、颗粒剂、胶囊剂等剂型。低浓度可可茶提取物溶液可以作为日常饮料提供给消费者。

本发明提供的可可茶及可可茶活性成分，可以用于各种口服剂型投放市场，提供以预防、改善或治疗肥胖、高血脂症、动脉硬化症、血栓症、血脂代谢异常，及因上述疾患引起的各种临床症状为目的的医药品、健康食品、食品或食品添加剂。当然，可可茶提取物也可以与常用的赋形剂等医药用载体结合做成制剂。必要时，还可以加入一些防腐剂、抗氧化剂、色素、甜味剂等添加物用于各种制剂。

比较适宜的可可茶赋形剂，一般考虑有乳糖、白糖、D-甘露醇、淀粉、结晶纤维素等。润滑剂一般应采用硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石粉等。溶剂通常使用精制水、乙醇、丙二醇等。防腐剂一般采用氯丁醇、苄醇、二羟基乙酸等。抗氧化剂通常以亚硫酸盐、抗坏血酸等比较适宜。

本发明提供的可可茶提取物，可以其原型、提取物或粉末添加到制品中用于口服。可可茶提取物也可与其它饮料原料结合制成一定的饮料制品，如可可茶饮料、炭酸饮料、果汁饮料、乳酸菌饮料、运动饮料、豆乳等。可可茶提取物食品还可以考虑制成饼干、巧克力类、糖果类、口香糖类、快餐点心类、果冻点心类、面包、豆腐、酸奶酪等日常食品。

本发明提供的可可茶提取物及其所含活性成分可以作为医药品、健康食品、食品或食品添加剂，用于预防、改善或治疗肥胖、高血脂症、动脉硬化症、血栓症、血脂代谢异常以及由之引起的各种临床症状。其在日常生活中的应用已经通过发明人的实验予以证明。该可可茶提取物对高血脂症的预防、改善作用，包括降低空腹时的血脂含量、抑制进食后血脂含量的急剧上升以及对脂肪负荷的改善作用。其对血脂值的改善效果可以通过彻夜禁食后的血脂值测定得到确认，也可以通过对进食后血脂值的测定以及脂肪负荷试验得以确认。本发明提供的可可茶提取物用量，可以根据使用者的相对健康状态、年龄、性别及体重等条件适当选择。成人平均体重以60公斤计算，一天口服可可茶提取物一般可以考虑在3g至10g范围内，可以分次服用。当然10g以上也不存在副作用等问题。

本发明所述的可可茶提取物含有以下活性成分：

儿茶素没食子酸酯(gallogatechin-gallate)(GCG)、1，2，4，6-四没食子酰葡萄糖(1，2，4，6-GA-glc)及儿茶素-3，5-二没食子酸酯(GC-3，5-diGA)，以及山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside)(黄酮苷A)与山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol 3-rutinoside)(黄酮苷B)。

每克可可茶提取物中，上述活性成分GCG、1，2，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA的含量至少为40mg、25mg及100mg，黄酮苷A的含量至少为0.10mg，黄酮苷B的含量至少为0.20mg。

发明人首次从可可茶提取物中分离得到三个成分，经核磁共振(NMR)等波谱学方法测定化学结构，确认为以下三种已知化合物：

1)儿茶素没食子酸酯(gallogatechin-gallate)(GCG)

2)1，2，4，6-四没食子酰葡萄糖(1，2，4，6-GA-glc)

3)儿茶素-3，5-二没食子酸酯(GC-35diGA)

上述三种成分在传统茶叶品种中尚无报道，可能是含量很少或很难检测出的。

可可茶提取物中还分离得到了A、B两种黄酮苷类成分。通过盐酸水解，采用HPLC分析方法(层析条件：Shimpak-SPR-Pb柱，7.8mm×250mm，80℃；水用作流动相，流速1ml/min；示差检测器simadzu RID-10A)检测水解液中的糖类物质，与标准品对照确认该两种黄酮苷类成分均含有葡萄糖(R.T.＝7.7m)及鼠李糖(R.T.＝8.8m)。此外，苷元部分检出为山奈酚(Kaempferol)。质谱分析(m/z)：苷A可见740[M+H]⁺，763[M+Na]⁺离子峰；苷B可见594[M+H]⁺以及180(葡萄糖)、164(鼠李糖)碎片。500MHz NMR谱的测定及解析确认该两种黄酮苷类化合物为已知化合物，即山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside)与山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol3-rutinoside)(Natural product Letters，14：233-238，2000)。发明人将上述两种结构近似的黄酮苷类化合物区分为黄酮苷A和黄酮苷B。

本发明以5ml/kg猪油(lard oil)脂肪负荷小鼠为实验动物模型，评价可可茶提取物的降血脂效果。结果证明可可茶提取物对猪油脂肪负荷小鼠表现出有统计学意义的脂肪吸收抑制作用，对大鼠淋巴管脂肪吸收显示有抑制作用。此外，本发明也确认可可茶提取物及其所含活性成分1，2，4，6-GA-glc、GC-3，5-diGA、山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside)及山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol 3-rutinoside)对脂肪酶的活性具有明显的抑制效果。

通过抑制脂肪酶活性的测定实验，结果表明：可可茶活性成分1，2，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA对脂肪酶显示出很强的抑制活性。GCG及山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside)也具有较强的脂肪酶抑制活性，山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol 3-rutinoside)的作用不显著，但加大用量也能产生相当于山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside)的抑制效果。因此，本发明确认GCG、1，2，4，6-GA-glc、GC-3，5-diGA、山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside)及山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol 3-rutinoside)是可可茶中抑制脂肪吸收，降高血脂症及抗肥胖的活性成分。

本发明提供和证明可可茶中含有的下列成分GCG、1，2，4，6-GA-glc、GC-3，5-diGA、山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol3-rhamnosyl-rutinoside)及山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol 3-rutinoside)具有显著的抑制脂肪酶的活性。胰脏脂肪酶是体内消化系统中主要的消化酶。抑制脂肪酶的活性无疑可以减少摄取的脂肪在小肠内的消化、分解和吸收，从而可以改善高血脂症，降低血中胆固醇的含量，并达到减肥效果。对因上述疾患引起的动脉硬化症、血栓症等各种临床症状也有预防及改善作用。另外，可可茶中的有效成分1，2，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA对脂肪酶活性的抑制作用等于或者强于绿茶的有效成分EGEG。

发明人已通过实验证明：本发明所提供的可可茶提取物及其活性成分GCG、1，2，4，6-GA-glc、GC-3，5-diGA、山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol3-rhamnosyl-rutinoside)及山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol 3-rutinoside)是安全性高、来自天然的一种通过抑制胰脏脂肪酶活性，从而达到抑制脂肪分解、减少脂肪从肠管吸收的抗肥胖剂。特别是摄取前后服用效果更好。可可茶及其所含活性成分GCG、1，2，4，6-GA-glc、GC-3，5-diGA、山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside)、及山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol3-rutinoside)也可以有效的改善和抑制中性脂肪肝、脂肪蓄积症、高脂血症、血栓症、动脉硬化症，并可降低血中胆固醇的含量。当然，也还可用于预防、改善及治疗由上述疾患引起的各种临床症状。可可茶及其所含活性成分GCG、1，2，4，6-GA-glc、GC-3，5-diGA、山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol3-rhamnosyl-rutinoside)、及山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol 3-rutinoside)可以单独作为改善肥胖、中性脂肪肝、脂肪蓄积症、高脂血症、血栓症、动脉硬化，降低血中胆固醇含量以及由之发生的并发症，也可配合其它治疗药物使用。由于本发明提供的脂肪吸收抑制物质可可茶是天然来源的物质，民间有长期作为饮料饮用的经验，且不含有咖啡因等特点，不仅可适用于一般成年人，而且作为一种作用缓和的健康茶也适用于老年人、儿童及体力低下者。因此，可可茶及其所含活性成分GCG、1，2，4，6-GA-glc、GC-3，5-diGA、山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside)及山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol3-rutinoside)可以作为健康食品、食品添加剂、健康茶，供给消费者用于减肥、抗高血脂质症等的应用。尽管GCG、1，3，4，6-GA-glc、GC-3，5diGA、山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside)、及山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol 3-rutinoside)是已知化合物，但是这些化合物对脂肪酶的抑制活性是通过本发明所初次证实的。

附图说明

图1为可可茶提取物的HPLC分析图谱。

图2为脂肪负荷实验的血浆中性脂肪的测定的结果分析图，图中1为对照组，2为给药可可茶250mg/kg，3为给药可可茶125mg/只。

图3为脂肪负荷实验的血浆中性脂肪的测定的结果分析图，图中1为对照组，2为给药可可茶250mg/只，3为给药可可茶125mg/只。

图4为胸淋巴管脂肪吸收抑制作用实验的不同时间内淋巴液中性脂肪量的结果分析图，图中1为对照组，2为灌流可可茶100mg/只，3为灌流可可茶200mg/只。

图5为胸淋巴管脂肪吸收抑制作用实验的淋巴液中性脂肪积累量的结果分析图，图中1为对照组，2为灌流可可茶100mg/只，3为灌流可可茶200mg/只。

具体实施方式

本发明可以通过以下实施例进行详细说明，但并不仅仅局限于以下实施例。

实施例一：可可茶提取物的制备

取可可茶干燥叶100g，加入90℃热水2000ml浸提4分钟。提取液经纱布滤过后，将滤液在1000rpm、5分钟离心分离，回收上清液冷冻干燥即成。可可茶叶的上述冷冻干燥提取物用于本发明的下列实施例。

实施例二：可可茶提取物的HPLC分析

将上述可可茶提取物配制成1％水溶液后，经Sep-PaktC18 Cartridge(5ml，Waters制)吸附过滤，水洗净后，用乙腈洗脱分离。随后，将250mg所得分离组分在Develosil C30-UG-5(20mm×250mm，野村化学制)柱上，在0.05％三氟乙酸(TFA)存在条件下，用5-30％乙腈按线性梯度洗脱方式(5ml/mim，180分钟，220nm紫外检测)洗脱分离。回收得到的分离组分，再用YMC-Pak ODS(20×250mm、YMC制)柱，在0.1％TFA存在下，用20-25％乙腈按线性梯度洗脱方式(6ml/mim、60分钟，280nm紫外检测)洗脱精制。从中分离得到与传统茶叶不同的三个组分。

可可茶提取物的HPLC分析条件。层析柱：资生堂capcell pak C18(φ4.6mm×150mm)，流动相：A＝0.05％TFA/水；B＝90％CH₃CN/0.05％TFA/水。B5→B35％(13分钟)，B35％→B70％(7分钟)，B70％(5分钟)。检测：A280nm峰面积定量。PDA 220～500nm检测。

从可可茶提取物中分离得到三个成分，经核磁共振(NMR)等波谱学方法测定化学结构，确认为以下三种在传统茶叶品种中含量很少或很难检测出的已知化合物：儿茶素没食子酸酯(gallogatechin-gallate)(GCG)、1，2，4，6-四没食子酰葡萄糖(1，2，4，6-GA-glc)及儿茶素-3，5-二没食子酸酯(GC-3，5-diGA)。

左侧为EGCG的结构式右侧为儿茶素没食子酸酯

(gallogatechin-gallate)(GCG)的结

构式

传统茶主要含有EGCG。

1，2，4，6-四没食子酰葡萄糖(1，2，4，6-GA-glc)的结构式

儿茶素-3，5-二没食子酸酯(GC-3，5-diGA)的结构式

可可茶提取物中分离得到了A、B两种黄酮苷类成分。通过盐酸水解，采用HPLC分析方法(层析条件：Shimpak-SPR-Pb柱，7.8mm×250mm，80℃；水用作流动相，流速1ml/分钟；示差检测器simadzu RID-10A)检测水解液中的糖类物质，与标准品对照确认该两种黄酮苷类成分均含有葡萄糖(R.T.＝7.7m)及鼠李糖(R.T.＝8.8m)。此外，苷元部分检出为山奈酚(Kaempferol)。质谱分析(m/z)：苷A可见740[M+H]⁺，763[M+Na]⁺离子峰；苷B可见594[M+H]⁺以及180(葡萄糖)、164(鼠李糖)碎片。500MHz NMR谱的测定及解析确认该两种黄酮苷类化合物为已知化合物，即山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside)与山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol3-rutinoside)(Natural product Letters，14：233-238，2000)。

黄酮苷A 黄酮苷B

(山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol (山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol

3-rhamnosyl-rutinoside)) 3-rutinoside))

实施例一所得到的可可茶提取物中各成分的含量如下：

可可碱(Theobromine) 278.75

EGC 43.25

(+)C 62.75

EC 14.50

EGCG 37.25

GCG 199.00

1，2，4，6-GA-glc 54.75

GC-3，5-diGA 32.50

Flavonol-A 0.173

(山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside))

Flavonol-B 0.208

(山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol 3-rutinoside))

由于用水提取、用醇提取、用其他极性溶剂提取，或者混合法提取，每克可可茶提取物中，上述活性成分GCG、1，2，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA的含量有或多或少的差别，但发明人的不同实验多次表明，活性成分GCG、1，2，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA的含量至少为40mg、25mg及100mg，黄酮苷A的含量至少为0.10mg，黄酮苷B的含量至少为0.20mg。

实施例三：脂肪负荷实验

使用动物为7周龄雄性ICR小鼠，由日本CLEA公司购入。

饲养条件：饲养温度23+1～2℃，湿度55±5％，换气次数12～15次/小时，照明时间12小时/日(上午7点开灯，下午7点关灯)。

饲育条件：固形饲料CE-2(CLEA公司)，自由饮水。

经1周饲养后进行实验。小鼠每组5只，禁食一夜后，按250mg/kg或125mg/kg剂量口服给药方式给与可可茶提取物水溶液(10ml/10g)。对照组给与等体积蒸馏水。小鼠在给药前后1.5小时、3小时及4.5小时分别在乙醚麻酔下由心脏采血，测定血浆中中性脂肪(triacylgycerol；TG)及游离脂肪酸(freefatty acid；FFA)的浓度。实验结果以student t-test作统计学处理，结果如图2和图3所示。与蒸馏水对照组相比，给与可可茶提取物的小鼠的血浆游离脂肪酸含量在统计学上末能显示有意义的上升趋势，但血浆中性脂肪含量则明显减少，并有统计学意义(^*p＜0.05)。结果证明可可茶提取物可以抑制脂肪吸收，并有一定的量效相关性。

实施例四：胸淋巴管脂肪吸收抑制作用的测定

实验动物为7周龄雄性SD(IGS)大鼠，由日本CLEA公司购入。

饲养条件：室温23±1～2℃，湿度55±5％，换气次数12～15次/时，照明时间12小时/天(上午7点开灯，下午7点关灯)。

饲育条件：固形饲料CE-2(CLEA公司)，自由饮水。

经1周饲养后进行试验。将大鼠固定在专用的固定容器中，用戊巴比妥钠(pentobarbital sodium)麻酔后，经胸淋巴管及胃作导管插入手术。随后，经胃导管以3ml/hr速度连续灌流139mM glucose-85mM NaCl等渗溶液，同时将139mM glucose-85mM NaCl作为饮料水由大鼠自由摄取。经过一夜灌流，待淋巴管流量稳定后，首先收集2小时的淋巴液。然后将可可茶提取物与天然的甘油三油酸酯(triolein，200mg/只)经胃导管同时灌流，在24小时内定时采取淋巴液，用7070血液自动分析装置(日立)测定不同时间淋巴液中的中性脂肪(TG)含量。结果如图3和图4所示，证明可可茶提取物对脂肪吸收有明显的抑制作用，并呈剂量依存关系(^***p＜0.0001，^**p＜0.001，^*p＜0.005 by student t-test)。

实施例五：抑制脂肪酶活性的测定

脂肪酶活性测定原理：以4-甲基伞形油酸酯(4-methylumbelliferyl oleate)(4-MU oleate，Sigma M2639)作为基质，经脂肪酶作用切断上面的油酸盐(oleate)部分，生成的荧光性物质4-methylumbelliferyl的含量可用以表示脂肪酶的活性。

试验用的缓冲溶液为含有150mM NaCl及1.36mM CaCl₂-2H₂O的13mMTris-HCl溶液，基质溶液是用DMSO将4-MU oleate调整为0.1M浓度后，再用上述缓冲溶液稀释1000倍至最终浓度为50μM即可。

脂肪酶溶液是将脂肪酶(lipase，Sigma L0382，100,000units)用1ml PBS溶解，再用上述缓冲溶液稀释至中浓度为100U/ml。

反应终止液为pH 4.2的0.1M柠檬酸钠溶液。

实验前先将上述溶液预热至室温后，再将50μ14-MU oleate溶液、25μ10检体水溶液及25μ1ipase溶液加入到96孔板的穴中，室温下反应30分钟后，加入100μ10.1M柠檬酸钠溶液使反应终止。用荧光光度计(激发波长355nm、发射波长460nm)测定反应生成的4-methylumbelliferyl荧光强度。以加入脂肪酶及不加入脂肪酶两组的吸光度分别作为100％及0％，计算加入检体溶液使抑制率达到50％时的浓度(IC₅₀)。

实验结果如表一：

表1 脂肪酶的抑制活性

序号	化合物名称	脂肪酶抑制活性IC₅₀μg/ml
序号	化合物名称	脂肪酶抑制活性IC₅₀μg/ml	1	EGCG	0.16

2	GCG	0.24
2	GCG	0.24	3	1，2，4，6-GA-glc	0.16
4	GC-3，5-diGA	0.13	3	1，2，4，6-GA-glc	0.16
4	GC-3，5-diGA	0.13	5	山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol3-rhamnosyl-rutinoside)	0.23
6	山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol3-rutinoside)	＞6.25	5	山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol3-rhamnosyl-rutinoside)	0.23

从表1可以看出，可可茶活性成分1，2，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA对脂肪酶显示出很强的抑制活性。GCG及山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol3-rhamnosyl-rutinoside)也具有较强的脂肪酶抑制活性，山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol 3-rutinoside)的作用不显著，但加大用量也能产生相当于山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside)的抑制效果。因此，本发明确认GCG、1，2，4，6-GA-glc、GC-3，5-diGA、山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside)及山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol3-rutinoside)是可可茶中抑制脂肪吸收，降高血脂症及抗肥胖的活性成分。

根据上述实验可以证明本发明提供可可茶及其活性成分GCG、1，2，4，6-GA-glc、GC-3，5-diGA、山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol3-rhamnosyl-rutinoside)及山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol 3-rutinoside)是安全性高、来自天然的一种通过抑制胰脏脂肪酶活性，从而达到抑制脂肪分解、减少脂肪从肠管吸收的抗肥胖剂。特别是摄取前后服用效果更好。可可茶及其所含活性成分GCG、1，2，4，6-GA-glc、GC-3，5-diGA、山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside)及山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol3-rutinoside)也可以有效的改善和抑制中性脂肪肝、脂肪蓄积症、高脂血症、血栓症、动脉硬化症，并可降低血中胆固醇的含量。当然，也还可用于预防、改善及治疗由上述疾患引起的各种临床症状。可可茶及其所含活性成分GCG、1，2，4，6-GA-glc、GC-3，5-diGA、山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol3-rhamnosyl-rutinoside)及山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol 3-rutinoside)可以单独作为改善肥胖、中性脂肪肝、脂肪蓄积症、高脂血症、血栓症、动脉硬化，降低血中胆固醇含量以及由之发生的并发症，也可配合其它治疗药物使用。由于本发明提供的脂肪吸收抑制物质可可茶是天然来源的物质，民间有长期作为饮料饮用的经验，且不含有咖啡因等特点，不仅可适用于一般成年人，而且作为一种作用缓和的健康茶也适用于老年人、儿童及体力低下者。因此，可可茶及其所含活性成分GCG、1，2，4，6-GA-glc、GC-3，5-diGA、山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside)及山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol3-rutinoside)可以作为健康食品、食品添加剂、健康茶，供给消费者用于减肥、抗高血脂质症等的应用。再有，尽管GCG、1，3，4，6--GA-glc、GC-3，5diGA、山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷(kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside)及山奈酚3-芸香糖苷(kaempferol 3-rutinoside)是已知化合物，但是这些化合物对脂肪酶的抑制活性是通过本发明所初次证实的。

Claims

1、可可茶提取物用于制备预防及改善肥胖及其临床症状的药物的用途，所述的可可茶提取物是采用热水或水与低级醇类、极性溶剂的一种或二种以上的任意混合溶剂进行提取的。

2、可可茶提取物用于制备预防及改善肥胖及其临床症状的食品的用途，所述的可可茶提取物是采用热水或水与低级醇类、极性溶剂的一种或二种以上的任意混合溶剂进行提取的。

3、根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的可可茶提取物含有活性成分儿茶素没食子酸酯，即GCG，每克可可茶提取物中GCG的含量至少为40毫克。

4、根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的可可茶提取物含有活性成分1，2，4，6-四没食子酰葡萄糖，即1，2，4，6-GA-glc，每克可可茶提取物中1，2，4，6-GA-glc的含量至少为25毫克。

5、根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的可可茶提取物含有活性成分儿茶素-3，5-二没食子酸酯，即GC-3，5-diGA，每克可可茶提取物中GC-3，5-diGA的含量至少为100毫克。

6、根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的可可茶提取物含有活性成分山奈酚3-鼠李糖苷-芸香糖苷，即黄酮苷A，每克可可茶提取物中黄酮苷A的含量至少为0.10毫克。

7、根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的可可茶提取物含有活性成分山奈酚3-芸香糖苷，即黄酮苷B，每克可可茶提取物中黄酮苷B的含量至少为0.20毫克。

8、根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物包括有效治疗剂量的可可茶提取物，以及药学上可接受的载体。

9、根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的可可茶提取物的固形剂使用量为0.1％至40％重量比。