CN102670673A - 秋葵活性成分在制备防治代谢性疾病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及秋葵活性成分在制备防治代谢性疾病的药物中的应用。首次揭示秋葵的一些提取物具有极其优异的降血糖或降血脂作用，可预防、改善和/或治疗代谢性疾病如糖尿病。

Description

秋葵活性成分在制备防治代谢性疾病的药物中的应用

技术领域

本发明属于药物学领域，更具体地，本发明涉及秋葵活性成分(包括秋葵的水提取物、水性有机溶剂提取物、秋葵多糖或活性化合物)在制备防治代谢性疾病的药物中的应用。 

背景技术

代谢性综合征是指肥胖(Obesity)、高脂血症、糖尿病、高血压及动脉粥样硬化等与代谢相关疾病的总称。代谢综合征最初的发病原因为肥胖和体重增加。肥胖已成为严重的全球性医疗问题和社会问题。 

高血脂症是指血中胆固醇(TC)和／或甘油三脂(TG)过高或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)过低。高血脂症包括高胆固醇血症(Hypercholesterolemia)、高甘油三脂血症(Hyper-triglyceridemia)及二者都高的复合性高血脂症。 

糖尿病(DM，Diabetes Mellitus)是一种多病因的代谢疾病，特点是慢性高血糖，伴随因胰岛素(Insulin)分泌和/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱，是由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合征(慢性、全身性、代谢性疾病)。多数是由于人体内胰岛素绝对或相对缺乏所致，以高血糖为主要特征。是一种终生疾病。糖尿病主要有1型和2型两大类型。2型糖尿病的危害更大，其患者占糖尿病患者总数的90%以上。由于肥胖和缺少运动常常导致2型糖尿病，因此2型糖尿病在发达国家的发病率呈迅速上升趋势。2型糖尿病通常表现为高血糖症，导致体内代谢功能紊乱，继而引发包括神经系统疾病、肾病、视网膜病、高甘油三酯血症、肥胖症和心血管疾病等被称为代谢功能综合症的并发症。由于糖尿病通常引起血液循环和神经系统的并发症，它已经成为世界第五大致死性疾病。 

目前市场上销售的减肥降脂降糖药均存在一定的副作用，开发新药仍为临床所需要。尤其是从植物或食品中开发安全可长期使用的降糖、降脂和减肥药为一种趋势。 

发明内容

本发明的目的在于提供秋葵活性成分在制备防治代谢性疾病的药物中的应用。 

在本发明的第一方面，提供秋葵的水提取物、水性有机溶剂提取物、秋葵多糖或活性化合物的用途，用于制备预防、改善和/或治疗代谢性疾病的组合物(如药物)； 

其中，所述的活性化合物包括： 

异槲皮苷，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖(6→1)-β-D-葡萄糖苷，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖(6→1)-α-D-葡萄糖苷，槲皮素-3-O-α-D-葡萄糖苷，槲皮素-3-O-β-D-半乳糖(6→1)-β-D-葡萄糖苷，或它们的异构体、外消旋体或药学上可接受的盐。 

在一个优选例中，所述的代谢性疾病包括(但不限于)：代谢综合征，糖尿病(更佳地为2型糖尿病)，胰岛素抵抗，高脂血症，肥胖症，动脉粥样硬化，脂肪肝，和/或它们的并发症。 

在另一优选例中，所述的组合物还用于： 

降低血液中低密度脂蛋白水平； 

降低血液中甘油三酯水平； 

降低血液中总胆固醇水平； 

改善葡萄糖耐受；和/或 

促进脂肪酸氧化。 

在另一优选例中，所述的组合物包括(但不限于)：药物组合物、食品组合物(包括功能性食品)、保健品组合物。 

在另一优选例中，所述的水性有机溶剂提取物选自：乙醇提取物或水提取物。 

在本发明的另一方面，提供一种秋葵多糖，其通过以下方法制备获得：将秋葵进行乙醇提取收获药渣，将药渣进行脱脂(较佳地，利用乙醇脱脂)，之后用水提取多糖类物质，收集水提液，再进行乙醇沉淀，收集沉淀，干燥，获得秋葵多糖。 

在另一优选例中，所述的秋葵多糖的制备方法中： 

乙醇提取收获药渣的过程如下：秋葵粉碎，用按照体积95%±5%的乙醇热 提取2-5次，每次1-3小时，收获药渣；或 

所述的用水提取多糖类物质及收集水提液的过程如下：用按照体积3-6倍量的水提取多糖类物质，提取1-4次，每次1-3小时，收集水提液，浓缩，除去不溶杂质；或 

所述的乙醇沉淀的过程如下：在水提液中加入按照体积3-6倍量的95%±5%(体积比)的乙醇进行沉淀。 

在本发明的另一方面，提供一种秋葵醇提取物，其通过以下方法制备获得：秋葵粉碎，加入乙醇(较佳地为按照体积75%±5%的乙醇)进行加热回流或超声提取。 

在另一优选例中，乙醇提取时，加热回流或超声提取2-6小时/次，提取1-5次，合并提取液，减压浓缩。 

在本发明的另一方面，提供一种秋葵水提取物，其通过以下方法制备获得：秋葵粉碎，加入水进行加热回流或超声提取。 

在另一优选例中，水提取时，加热回流或超声提取2-6小时/次，提取1-5次，合并提取液，减压浓缩。 

在本发明的另一方面，提供一种组合物，其包括：有效量的所述的秋葵多糖、秋葵醇提取物或秋葵水提取物；以及食品学或药学上可接受的载体。 

在另一优选例中，所述的组合物的剂型选自(但不限于)：粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、口服液或片剂。 

在另一优选例中，所述的组合物可以选自(但不限于)以下食品品种：饮料、酸奶、冰激凌或点心。 

在另一方面，提供所述组合物的用途，用于降血脂，降血糖或减肥。 

在本发明的另一方面，提供一种减肥、降血糖或降血脂的方法(较佳地，为非治疗性的方法)，包括步骤：给需要的对象施用有效量的秋葵的水提取物、水性有机溶剂提取物、秋葵多糖或活性化合物； 

其中，所述的活性化合物包括：异槲皮苷，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖(6→1)-β-D-葡萄糖苷，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖(6→1)-α-D-葡萄糖苷，槲皮 素-3-O-α-D-葡萄糖苷，槲皮素-3-O-β-D-半乳糖(6→1)-β-D-葡萄糖苷，或它们的异构体、外消旋体或药学上可接受的盐。 

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。 

附图说明

图1、秋葵水提取物(或简称：水提)指纹图谱。 

图2、秋葵乙醇提取物(或简称：醇提取物或醇提)指纹图谱。 

图3、秋葵水提取物降低高脂诱导的C57BJ/6小鼠高血糖。*，与对照组比较，P<0.05。 

图4、秋葵水提取物降低高脂诱导的C57BJ/6小鼠葡萄糖耐受试验。*，与对照组比较，P<0.05。 

图5、秋葵多糖降低高脂诱导的C57BJ/6小鼠葡萄糖耐受试验。*，与对照组比较，P<0.05。 

图6、秋葵多糖改善高脂诱导的C57BJ/6小鼠胰岛素耐受试验。*，与对照组比较，P<0.05。 

图7、异槲皮苷、QK1、QK2、QK3和QK4降低高脂饲料诱导的C57BJ/6肥胖小鼠小鼠空腹血糖，改善葡萄糖耐受试验。*，与对照组比较，P<0.05。 

图8、秋葵水提取物降低高脂诱导的C57BJ/6小鼠血脂水平。*，与对照组比较，P<0.05。 

图9、秋葵多糖降低高脂诱导的C57/BJ6小鼠甘油三酯和低密度脂蛋白水平。*，与对照组比较，P<0.05。 

图10、异槲皮苷、QK1、QK2、QK3和QK4降低小鼠血脂水平。*，与对照组比较，P<0.05。 

具体实施方式

本发明人经过大量的摸索总结以及深入的研究，首次揭示秋葵的一些提取物具有极其优异的降血糖或降血脂作用，可预防、改善和/或治疗代谢性疾病如糖尿病，在此基础上完成了本发明。 

秋葵及其提取物 

秋葵(Abelmoschus esculentus(L.)Moench，Hibiscus esculentus Linn.，Okra)为锦葵科，秋葵属植物。又名羊角豆、咖啡黄葵、毛茄，原产于非洲，20世纪初引入我国。秋葵的根在中医上有清热解毒、去脓和疏通血脉的功效，还能治筋骨损伤。目前黄秋葵已成为营养保健蔬菜，在非洲国家为运动员食用之首选蔬菜，更是老年人的保健食品。秋葵嫩果中含有一种黏性液质及阿拉伯聚糖、鼠李聚糖、等，经常食用帮助消化、增强体力、保护肝脏、健胃整肠。秋葵含有特殊的具有药效的成分，能强肾补虚，对男性器质性疾病有辅助治疗作用，是一种适宜的营养保健蔬菜，享有“植物伟哥”之美誉。同时秋葵嫩荚的粘液能很好地帮助胃肠蠕动，保护胃壁的作用，并促进胃液分泌，提高食欲，改善消化不良，降低胆固醇，预防心血管疾病等。并且，秋葵含胡萝卜素及维生素A，对眼睛、皮肤都有帮助。 

本发明人长期致力于秋葵活性部分的研究，先后采取了多种多样的方式来从秋葵中提取活性部分并进行细胞水平上和动物水平上的试验。最终发现，秋葵的水性有机溶剂提取物，包括乙醇提取物和水提取物以及秋葵多糖具有较好的预防、缓解、治疗代谢性疾病的功能，其中，秋葵多糖的效果尤为理想。 

作为本发明的优选方式，所述的秋葵多糖通过以下方法制备获得：将秋葵进行乙醇提取收获药渣，将药渣进行脱脂，之后用水提取多糖类物质，收集水提液，再进行乙醇沉淀，收集沉淀，干燥，获得秋葵多糖。 

作为本发明的更优选方式，所述方法中：乙醇提取收获药渣的过程如下：秋葵粉碎，用按照体积95%±5%的乙醇热提取2-5次，每次1-3小时，收获药渣；或所述的用水提取多糖类物质及收集水提液的过程如下：用按照体积3-6倍量的水提取多糖类物质，提取1-4次，每次1-3小时，收集水提液，浓缩，除去不溶杂质；或所述的乙醇沉淀的过程如下：在水提液中加入按照体积3-6倍量的95%±5%的乙醇进行沉淀。 

经过本发明人验证，上述方法获得的秋葵多糖，活性成分含量高、质量可控、稳定且降血糖和降血脂地效果极其显著，疗效比秋葵的乙醇提取物或水提取物更优异，且可适用于工业化大规模生产。 

作为本发明的优选方式，所述的秋葵醇提取物通过以下方法制备获得：秋 葵粉碎，加入乙醇(较佳地为按照体积75%±5%的乙醇)进行加热回流或超声提取。较佳地，乙醇提取时，加热回流或超声提取2-6小时/次，提取1-5次，合并提取液，减压浓缩。 

作为本发明的优选方式，所述的秋葵水提取物通过以下方法制备获得：秋葵粉碎，加入水进行加热回流或超声提取。较佳地，水提取时，加热回流或超声提取2-6小时/次，提取1-5次，合并提取液，减压浓缩。 

经过本发明人验证，上述方法获得的秋葵水性有机溶剂提取物，活性成分含量高、质量可控、稳定且降血糖和降血脂的效果较为显著，可适用于工业化大规模生产。 

本发明所提供的提取物具有显著的抑制脂肪细胞分化、降低血糖血脂、减肥等作用，可应用于防治代谢综合征药物的制备。 

来自秋葵的活性化合物 

本发明还提供了来自秋葵的活性化合物，包括秋葵的水提取物、水性有机溶剂提取物、秋葵多糖或活性化合物，这些化合物可用于制备预防、改善和/或治疗代谢性疾病的组合物(如药物)。 

作为本发明的优选方式，所述活性化合物选自：异槲皮苷，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖(6→1)-β-D-葡萄糖苷，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖(6→1)-α-D-葡萄糖苷，槲皮素-3-O-α-D-葡萄糖苷，槲皮素-3-O-β-D-半乳糖(6→1)-β-D-葡萄糖苷。 

本发明还包括上述化合物的异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体。 

所述的“药学上可接受的盐”是本发明的活性化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、延胡索酸、葡萄糖酸、安息香酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、草酸、丁二酸、酒石酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，铵盐或水溶性的胺盐(如N-甲基葡糖胺盐)、低级的烷醇铵盐以及其它药学上可接受的胺盐(比如甲胺盐、乙胺盐、丙胺盐、二甲基胺盐、三甲基胺盐、二乙基胺盐、三乙基胺盐、叔丁基胺盐、乙二胺盐、羟乙胺盐、二羟乙胺盐、三羟乙 胺盐，以及分别由吗啉、哌嗪、赖氨酸形成的胺盐)，或其它常规的“前体药物”的形式。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。 

所述的“化合物的前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成本发明的活性化合物，或本发明的活性化合物所组成的盐或溶液。化合物的前体包括但不局限于所述化合物的羧酸酯、碳酸酯、磷酸酯、硝酸酯、硫酸酯、砜酯、亚砜酯、氨基化合物、氨基甲酸盐、偶氮化合物、磷酰胺、葡萄糖苷、醚、乙缩醛等形式。 

本领域人员应理解，在得知了本发明化合物的结构以后，可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发明的化合物，比如化学合成或从植物中提取的方法，这些方法均包含在本发明中。 

各种合成的化合物可以进一步通过柱色谱法、高效液相色谱法或结晶等方式进一步纯化。合成化学改造、保护官能团方法学(保护或去保护)对合成应用化合物是很有帮助的，并且是现有技术中公知的技术，如R.Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,3^rd Ed.,John Wiley and Sons(1999)中都有公开。 

用途 

基于本发明人的新发现，本发明提供了秋葵的水提取物、水性有机溶剂提取物、秋葵多糖或活性化合物的用途，用于制备预防、改善和/或治疗代谢性疾病的组合物(如药物)。 

作为本发明的优选方式，所述的代谢性疾病包括但不限于：代谢综合征，糖尿病(包括：1型糖尿病或2型糖尿病；更佳地为2型糖尿病)，胰岛素抵抗，高脂血症，肥胖症，动脉粥样硬化，脂肪肝，和/或它们的并发症。 

作为本发明的优选方式，所述的秋葵的水提取物、水性有机溶剂提取物、秋葵多糖或活性化合物还用于：降低血液中低密度脂蛋白水平；降低血液中甘油三酯水平；降低血液中总胆固醇水平；改善葡萄糖耐受；和/或促进脂肪酸氧化。 

本发明的秋葵的水提取物、水性有机溶剂提取物、秋葵多糖或活性化合物还可用于制备糖尿病相关病症，包括(但不限于)：视网膜病、神经病、肾病、延迟性伤口愈合、胰岛素抗性、葡萄糖体内平衡受损、糖耐量异常、高血糖症、高胰岛素血症、高血脂肪酸或甘油水平(包括高甘油三酯血症)、肥胖、高脂血症、脂肪肝、高尿酸血症、X综合症(又称代谢综合症)、高血压、动脉粥样硬化、痛风、高胆固醇血症。这些病症的共同特点均是糖、脂肪和/或蛋白质的代谢失常。 

组合物 

如本文所用，术语“本发明的组合物”包括(但不限于)：药物组合物、饮食补充剂、食品组合物、保健品组合物，只要它们含有或基本上由秋葵的水提取物、水性有机溶剂提取物、秋葵多糖或活性化合物构成。 

本发明提供了一种组合物，含有：(a)有效量的秋葵的水提取物、水性有机溶剂提取物、秋葵多糖或活性化合物，或它们的混合物；和(b)食品学或药学上可接受的载体或赋形剂。 

如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。术语“基本上由……构成”指在组合物中，除了含有主要活性成分(选自：秋葵的水提取物、水性有机溶剂提取物、秋葵多糖或活性化合物)之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。例如，可以含有甜味剂以改善口味、抗氧化剂以防止氧化，以及其它本领域常用的添加剂。 

本发明中，“食品学或药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。 

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。来自于丹参、三七的除必要成分(丹参总酚酸、三七总皂 苷)之外的非必要成分，以及其它非必要成分(例如其它辅助性药材)，也包括在药学上可接受的载体的定义中。 

本发明所述的组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自：片剂、胶囊剂、粉末、颗粒剂、糖浆、溶液、悬浮液、注射剂、酊剂、口服液、或气雾剂。其中本发明的秋葵的水提取物、水性有机溶剂提取物、秋葵多糖或活性化合物可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中。 

所述化合物或组合物可通过口服以及静脉内、肌内或皮下等途径给药。从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。药物组合物的口服给药是优选的。而且可以用如下形式口服给药：剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含有如约0.05-5%悬浮剂)、糖浆(含有如约10-50%糖)、和酏剂(含有如约20-50%乙醇)，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式(在等渗介质中含有约0.05-5%悬浮剂)进行非肠胃给药。例如，这些药物制剂可含有与载体混合的约0.1-50%(重量)，通常约为1-40%(重量)的活性成分。 

适应于注射的药物形式包括：无菌水溶液或分散液和无菌粉(用于临时制备无菌注射溶液或分散液)。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器排出流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生物(如细菌和真菌)的污染影响。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有如水、醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、它们的适当混合物和植物油。 

本发明的化合物或其组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。在本发明的药物组合物中，通常活性成分占总重量的0.1-50%(较佳地1-40%，更佳地2-30%)，其余为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。 

本发明还提供了一种预防、改善和/或治疗代谢性疾病，或减肥、降血糖或降血脂的方法，包括步骤：给需要的对象施用有效量的秋葵的水提取物、水性有机溶剂提取物、秋葵多糖或活性化合物。 

所用的活性成分的有效施用剂量可随所用的化合物、给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明的化合物每天以约0.01-500mg/kg动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以1-3次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每 天的总剂量约为0.5-6000mg，较佳地约为10-1000mg。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态载体密切混合的活性化合物。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。 

本发明的秋葵的水提取物、水性有机溶剂提取物、秋葵多糖或活性化合物或其组合物可以以非治疗的方式给予哺乳动物(包括人)，从而发挥降血脂、降血糖的功效。 

本发明的组合物还可以与其它的一种或多种对于防治代谢性疾病有效的物质联合应用。例如，所述的组合物中还可含有：选自以下的一种或多种的药物：抗糖尿病药物、降脂药物、减肥药物、抗高血压药物、抗动脉粥样硬化药物或抗凝血药物。当两种或者两种以上的药物联合给药时，一般具有优于分别单独给药的效果。 

本发明的主要优点在于： 

本发明的秋葵的水提取物、水性有机溶剂提取物、秋葵多糖或活性化合物含有纯天然成分，更安全，无明显的副作用。 

本发明的秋葵多糖，秋葵水或醇提取物制备工艺经济、简便、适用于工业化大规模生产，所得提取物具有显著的抑制脂肪细胞增殖、降低血脂血糖的作用，可应用于减肥降糖组合物(如食品或药物)的制备。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。 

I.材料和方法 

1.植物和动物 

8周龄C57/BJ6小鼠，体重约22-25个克。饲养条件为SPF级，饲养温度22-23℃。12小时昼夜交替。动物饲料购自Research Diet(高脂D12492，低脂D12450B)。 

秋葵：新鲜秋葵，购自中国云南。 

2.实验仪器 

血糖仪及试纸购自Roche(全力康)。 

3.秋葵水抽提或乙醇提取 

1)取新鲜秋葵，粉碎得原料； 

2)加入75%(v/v)的乙醇或水(固液比为1∶10)加热回流或超声提取； 

3)提取时间为4～5h/次，提取3次； 

4)合并提取液，减压浓缩至无醇味，浓缩至所需浓度。 

4.秋葵多糖和单体的提取分离 

1)秋葵30公斤，粉碎机粉碎，用95%(v/v)乙醇120升热提取三次，每次两小时，收集药渣备用，合并滤液减压浓缩为5L，得流状浸膏。将流状浸膏于55℃水浴锅上挥发至无乙醇味后真空减压干燥48小时，得浸膏1.0KG左右。用蒸馏水溶解为6L(无块状沉淀)，分装于两个5L的分液漏斗中，依次用石油醚，二氯甲烷，正丁醇充分萃取至萃取液无色，分别浓缩，得石油醚段约150g，二氯甲烷段约100g，正丁醇段约250g，水层约500g；发现水层中富含果胶类物质，黄色粘性状态。 

2)将前述获得的药渣用乙醇(75%的乙醇)脱脂，用按照体积4倍量的水提取多糖类物质，每次2小时，提取2次。收集水提液，浓缩至15L，离心除去不溶杂质后加入4倍体积95%(v/v)乙醇沉淀，再次离心收集沉淀，冷冻干燥10天，得到总糖(秋葵多糖)80g左右。 

3)前述获得(即前面1中)的水层使用MCI柱，分别依次用蒸馏水，30%(v/v)甲醇，60%(v/v)甲醇，90%(v/v)甲醇洗脱。果胶类主要集中在水层，收集。60%(v/v)甲醇段经HPLC检测有QK1-4，所以再次使用MCI柱，依次使用蒸馏水，20%(v/v)甲醇，40%(v/v)甲醇，60%(v/v)甲醇，90%(v/v)甲醇洗脱后分别经HPLC检测，QK1-4主要集中于40%(v/v)甲醇段。浓缩后反复上SephadexLH-20(凝胶)去除色素。纯化后经HPLC检测，得QK1-4(每个化合物约400-500mg)。 

4)正丁醇段减压干燥后用蒸馏水溶解，先用MCI柱分段，分为纯水，30%(v/v)甲醇，60%(v/v)甲醇和90%(v/v)甲醇段。经HPLC检测，水层依旧主 要含有果胶类，30%甲醇段和60%甲醇段主要含异槲皮苷。合并30%和60%甲醇段，经减压浓缩，使用ODS flesh(中压柱)柱，依次使用纯水，20%甲醇，40%甲醇，60%甲醇，80%甲醇，纯甲醇洗脱，收集为5个段，经HPLC检测，QK3大多集中于40%段(也含有部分QK1-2)，QK4集中于60%段。由于40%段较纯，所以使用Sephadex LH-20(凝胶)纯化，得QK2纯品800mg，其他馏分和60%甲醇段合并，再次使用MCI柱子，用20%甲醇冲10个柱体积左右，去掉杂质，用40%甲醇得到较纯的异槲皮苷，之后使用Sephadex LH-20(凝胶)纯化，得异槲皮苷纯品1.7g。 

5)二氯甲烷段经HPLC检测，有少量QK1和QK2和异槲皮苷。使用硅胶(200-300目)，依次用二氯甲烷比甲醇，极性由小到大依次洗脱。先得到QK3，用Sephadex LH-20(凝胶)纯化，得0.3g，HPLC检测，与在正丁醇段得到的QK3保留时间一致，合并为2g。后纯化得到QK1100mg，与正丁醇段的QK1同样的保留时间，故合并为900mg。 

5.动物与分组 

高脂食物喂养的C57BL/6小鼠在16-20周时出现肥胖型II型糖尿病的典型症状，其发病机制及血糖水平与人类肥胖、高脂血症及II型糖尿病接近。通过动物口服给药，观察糖尿病动物血浆葡萄糖水平，血浆胰岛素，血脂，体内脂肪含量，葡萄糖耐受试验，胰岛素耐受试验等，比较中药单体与罗格列酮类药物的治疗效应。发现具有良好疗效，低毒副作用的糖尿病治疗药物。 

小鼠饲养至8周，8周小鼠用含60%(w/w)脂肪的饲料喂养，至5月龄时根据体重和空腹血糖分组。用含60%脂肪的饲料喂养小鼠，治疗组将药物混入饲料，小鼠自由进食、饮水。共治疗2周。 

隔日记录小鼠体重和摄食量。 

6.血脂测定 

小鼠禁食12小时，心脏采血，静置2小时，3000rpm离心15min，收集小鼠血清，全自动生化仪测甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白水平。 

肝脏组织切片，观察组织形态学。油红染色，观察肝脏组织脂肪含量，以判断脂肪肝程度。 

测肝脏甘油三酯和胆固醇水平：肝脏匀浆，氯仿抽提，氯仿层干燥后异丙醇溶解，测甘油三酯和胆固醇水平。 

7.血糖测定 

治疗结束测小鼠空腹血糖、随机血糖。 

测小鼠葡萄糖耐受试验：小鼠腹腔注射1g/kg体重葡萄糖，0、15、30、60、90min时测小鼠尾静脉血糖值。 

测小鼠胰岛素糖耐受试验：小鼠休息3天，注射胰岛素10U/kg体重，分别于0、15、30、60、90min时测小鼠尾静脉血糖值。 

8.统计 

两组数据采用T检验，多组数据采用ANOVA统计处理。数据以均数±标准误表示，P<0.05表示显著差异。 

II.实施例 

实施例1、秋葵提取物的鉴定 

秋葵水提取物鉴定见图1，秋葵乙醇提取物鉴定见图2。 

异槲皮苷和QK1、QK2、QK3、QK4结构式以及核磁(1H-NMR和13C-NMR)数据如下： 

异槲皮苷： 

QK1： 

名称：槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖(6→1)-β-D-葡萄糖苷(4H-1-Benzopyran-4-one，2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3-[(6-O-α-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy]-5，7-dihydroxy-) 

¹H-NMR(DMSO,400MHz):7.57(1H,dd,J=8.8,2.0Hz,H-6′),7.55(1H,d,J=2.0Hz,H-2′),6.87(1H,d,J=8.8Hz,H-5′),6.43(1H,brs,H-8),6.19(1H,br s,H-6),5.38(1H,d,J=7.2Hz,H-1″),3.97(1H,d,J=7.0Hz,H-1),3.79～2.89(12H,m,H-2″～6″,2～6)。¹³C-NMR(DMSO,100MHz):177.3(s,C-4),164.1(s,C-7),161.2(s,C-5),156.5(s,C-2),156.2(s,C-9),148.4(s,C-4′),144.8(s,C-3′),133.3(s,C-3),121.9(d,C-6′),121.1(s,C-1′),116.3(d,C-2′),115.2(d,C-5′),104.9(s,C-10),103.7(d,C-1),100.8(d,C-1″),98.6(d,C-6),93.4(d,C-8),76.8(d,C-5″,5),76.3(d,C-3″),73.9(d,C-2″),72.4(d,C-3),70.5(d,C-2),70.0(s,C-4),67.3(d,C-4″),67.2(t,C-6″),64.8(t,C-6) 

QK2： 

名称：槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖(6→1)-α-D-葡萄糖苷(4H-1-Benzopyran-4-one，2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3-[(6-O-α-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy]-5，7-dihydroxy-) 

¹H-NMR(DMSO,400MHz):7.59(1H,dd,J=8.8,2.0Hz,H-6′),7.57(1H,d,J=2.0Hz,H-2′),6.87(1H,d,J=8.8Hz,H-5′),6.39(1H,brs,H-8),6.19(1H,br s,H-6),5.38(1H,d,J=4.8Hz,H-1″),3.97(1H,d,J=7.0Hz,H-1),3.79～2.89(12H,m,H-2″～6″,2～6)。¹³C-NMR(DMSO,100MHz):177.3(s,C-4),164.1(s,C-7),161.2(s,C-5),156.3(s,C-2),156.2(s,C-9),148.4(s,C-4′),144.8(s,C-3′),133.3(s,C-3),121.6(d,C-6′),121.1(s,C-1′),116.1(d,C-2′),115.2(d,C-5′),103.9(s,C-10),102.7(d,C-1),100.8(d,C-1″),98.6(d,C-6),93.4(d,C-8),76.8(d,C-5″,5),76.3(d,C-3″),73.9(d,C-2″),72.4(d,C-3),70.4(d,C-2),70.0(s,C-4),67.3(d,C-4″),67.2(t,C-6″),64.8(t,C-6) 

QK3： 

槲皮素-3-O-α-D-葡萄糖苷(Quercetin-3-O-α-D-glucoside)， 

¹H-NMR(DMSO,400MHz):7.66(1H,d,J=8.8,2.0Hz,H-6′),7.56(1H,d,J=2.0Hz,H-2′),6.88(1H,d,J=8.8Hz,H-5′),6.44(1H,d,J=2.0Hz,H-8),6.23(1H,d,J=2.0Hz,H-6),5.46(1H,d,J=4.8Hz,H-1″),3.68(1H,d,J=12.0,4.5Hz,H-6″),3.37(1H,m,H-6″),3.23(2H,m,H-2″,3″)，3.06(2H,m,H-5″,4″)。¹³C-NMR(DMSO,100 MHz):177.5(s,C-4)164.1(s,C-7),161.2(s,C-5),156.3(s,C-2),156.5(s,C-9),148.4(s,C-4′),144.4(s,C-3′),133.6(s,C-3),121.6(d,C-6′),121.5(s,C-1′),116.3(d,C-2′),115.7(d,C-5′),104.0(s,C-10),100.9(d,C-1″),98.6(d,C-6),93.7(d,C-8),77.5(d,C-5″),76.5(d,C-3″),74.1(d,C-2″),69.9(d,C-4″),61.0(t,C-6″) 

QK4： 

槲皮素-3-O-β-D-半乳糖(6→1)-β-D-葡萄糖苷(4H-1-Benzopyran-4-one，2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3-[(6-O-β-D-glucopyranosyl  -β-D-galactopyranosyl)oxy]-5,7-dihydroxy-) 

¹H-NMR(DMSO,400MHz):7.62(1H,dd,J=8.8,2.0Hz,H-6′),7.49(1H,d,J=2.0Hz,H-2′),6.87(1H,d,J=8.8Hz,H-5′),6.40(1H,brs,H-8),6.19(1H,br s,H-6),5.41(1H,d,J=4.8Hz,H-1″),3.97(1H,d,J=7.0Hz,H-1),3.79～2.89(12H,m,H-2″～6″,2～6)。¹³C-NMR(DMSO,100MHz):177.3(s,C-4),164.1(s,C-7),160.2(s,C-5),156.3(s,C-2),156.5(s,C-9),148.4(s,C-4′),144.8(s,C-3′),133.3(s,C-3),122.7(d,C-6′),121.1(s,C-1′),116.3(d,C-2′),115.2(d,C-5′),103.9(s,C-10),102.7(d,C-1),100.8(d,C-1″),98.8(d,C-6),93.5(d,C-8),76.8(d,C-5″,5),76.5(d,C-3″),73.9(d,C-2″),72.4(d,C-3),70.4(d,C-2),70.0(s,C-4),67.3(d,C-4″),67.2(t,C-6″),64.5(t,C-6) 

实施例2、秋葵提取物、秋葵多糖、异槲皮苷和QK1、QK2、QK3、QK4具有降血糖作用 

1.秋葵提取物给药小鼠的空腹血糖试验 

C57BJ/6小鼠经高脂饲料(Research Diet，D12492)饲养3个月后，经灌胃秋 葵水提取物或醇提取物(相当于1克秋葵/公斤体重/天)，连续给药2周，测空腹血糖。小鼠在上午9时给药，测血糖前小鼠禁食过夜。对照小鼠喂食低脂饲料(Research Diet，D 12450B)。 

结果显示，高脂饲料饲养的小鼠空腹血糖显著高于低脂对照小鼠。秋葵水提取物喂食2周的小鼠空腹血糖显著降低，但秋葵醇提物喂食的小鼠空腹血糖未见显著降低，如图3。 

2.秋葵提取物给药小鼠的葡萄糖耐受试验 

C57BJ/6小鼠经高脂饲料(Research Diet，D12492)饲养3个月后，经灌胃秋葵水提取物或醇提取物(相当于1克秋葵/公斤体重/天)，连续给药2周，进行葡萄糖耐受试验；测血糖前小鼠禁食过夜，测空腹血糖前2小时灌胃给药1次。对照小鼠喂食低脂饲料(Research Diet，D12450B)。 

结果如图4，0min为空腹血糖，经腹腔注射1克葡萄糖/公斤体重后15，30，60，90min时分别测血糖，显示在30，60min时血糖显著下降。 

葡萄糖耐受试验显示，秋葵醇提取物喂食的小鼠在药后两小时进行的测试中，小鼠在30和60min时血糖明显下降，表明秋葵醇提取物改善了高脂饲料诱导的小鼠胰岛素抵抗。 

3、秋葵多糖给药小鼠的葡萄糖耐受试验 

C57BJ/6小鼠经高脂饲料(Research Diet，D12492)饲养3个月后，在饲料中加入秋葵多糖(相当于5克秋葵多糖)/公斤饲料)，连续给药2周，测血糖前小鼠禁食过夜。对照小鼠喂食低脂饲料(Research Diet，D12450B)。 

结果如图5，0min为空腹血糖，经腹腔注射1克葡萄糖/公斤体重后15，30，60，90min时分别测血糖，显示在30，60min时血糖显著下降。 

葡萄糖耐受试验显示，秋葵多糖2周治疗显著改善了高脂饲料诱导的小鼠15、30和60min时的葡萄糖耐受水平。 

4.秋葵多糖给药小鼠的胰岛素耐受试验 

C57BJ/6小鼠经高脂饲料(Research Diet，D12492)饲养3个月后，在饲料中加入秋葵多糖(相当于5克秋葵多糖/公斤饲料)，连续给药2周，测血糖前小鼠禁食过夜。对照小鼠喂食低脂饲料(Research Diet，D12450B)。 

结果如图6，0min为随机血糖，经腹腔注射0.75U胰岛素/公斤体重后15，30，60，90min时分别测血糖，显示随机血糖值和60，90min时血糖显著低于对照组。 

随机血糖测试证明，小鼠随机血糖也显著下降，胰岛素耐受试验中，小鼠30min和60min的血糖明显下降，表明秋葵多糖可增加高脂饲料诱导的小鼠胰岛素敏感性，显著改善胰岛素抵抗。 

5.异槲皮苷和QK1、QK2、QK3和QK4给药小鼠的葡萄糖耐受试验 

C57BJ/6小鼠经高脂饲料(Research Diet，D12492)饲养3个月后，在饲料中加入异槲皮苷、QK1、QK2、QK3和QK4(相当于1克化合物/公斤饲料)，连续给药2周，测血糖前小鼠禁食过夜。对照小鼠喂食低脂饲料(Research Diet，D12450B)。 

结果如图7，0min为空腹血糖，经腹腔注射1克葡萄糖/公斤体重后15，30，60，90min时分别测血糖，显示在0min和15min时异槲皮苷、QK1、QK2、QK3和QK4组血糖明显降低，30min时异槲皮苷、QK1、QK2、和QK4组血糖降低。 

异槲皮苷和QK1、QK2、QK3和QK4降低小鼠空腹血糖水平(0min)，降低葡萄糖耐受试验的15min和30min血糖水平，如图7。 

秋葵多糖与提取物对高脂饲料诱导的肥胖小鼠空腹血糖和葡萄糖耐受的影响的横向比较数据如表1。 

表1 

表中，血糖(mmol/l)以均数±标准误表示。各组N=7。 

由表1可见，秋葵多糖、秋葵水提物和秋葵醇提物治疗组均有一定的降血 糖作用。其中，秋葵多糖治疗组的空腹血糖(0分钟)及葡萄糖耐受试验90分钟时血糖明显低于秋葵水提物和秋葵醇提物治疗组，可见秋葵多糖的治疗效果最佳。 

实施例3、秋葵提取物、秋葵多糖、异槲皮苷和QK1、QK2、QK3、QK4具有降血脂作用 

1.秋葵醇提取物给药小鼠的血脂水平测定 

C57BJ/6小鼠经高脂饲料(Research Diet，D12492)饲养3个月后，经灌胃秋葵提取物(相当于1克秋葵/公斤体重/天)，连续给药2周。对照小鼠喂食低脂饲料(Research Diet，D12450B)。 

结果如图8，高脂组小鼠总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)水平均高于低脂对照小鼠。而2周秋葵醇提取物喂食的小鼠甘油三酯(TG)明显下降。 

因此，秋葵醇提物显著降低小鼠血清甘油三酯水平，对总胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白水平略为降低。 

2.秋葵多糖给药小鼠的血脂水平测定 

C57BJ/6小鼠经高脂饲料(Research Diet，D12492)饲养3个月后，在饲料中加入秋葵多糖(相当于5克秋葵多糖/公斤饲料，连续给药2周，测血脂前小鼠禁食过夜。对照小鼠喂食低脂饲料(Research Diet，D12450B)。 

结果如图9，秋葵多糖显著降低小鼠血清总胆固醇和低密度脂蛋白，但对甘油三酯水平和高密度脂蛋白水平没有明显的影响。 

秋葵多糖与秋葵提取物对高脂饲料诱导的肥胖小鼠血脂水平的影响的横向数据比较见表2。 

表2 

表中，血脂(mmol/l)以均数±标准误表示。各组N=7。 

由表2可见，秋葵多糖和秋葵醇提物治疗组均有一定的降甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白的作用。其中，秋葵多糖治疗组的血清胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平明显低于秋葵醇提物治疗组，可见秋葵多糖的治疗效果最佳。 

4.异槲皮苷和QK1、QK2、QK3、QK4给药小鼠的血脂水平 

C57BJ/6小鼠经高脂饲料(Research Diet，D12492)饲养3个月后，在饲料中加入异槲皮苷、QK1、QK2、QK3和QK4(相当于1克化合物/公斤饲料)，连续给药2周，测血脂前小鼠禁食过夜。对照小鼠喂食低脂饲料(Research Diet，D12450B)。 

结果如图10，异槲皮苷和QK1、QK2、QK3、QK4显著降低小鼠血清总胆固醇水平。异槲皮苷、QK1、QK3、QK2和QK4降低了甘油三酯水平，其中QK3对血清甘油三酯的影响程度最低，QK4效果最好。 

而QK1、QK2、QK3和QK4显著降低小鼠血清低密度脂蛋白水平，QK3效果最好。 

综上，高脂饲料饲养的小鼠总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白水平均高于低脂对照小鼠。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

Claims (10)

1.秋葵的水提取物、水性有机溶剂提取物、秋葵多糖或活性化合物的用途，用于制备预防、改善和/或治疗代谢性疾病的组合物；

其中，所述的活性化合物包括：

异槲皮苷，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖(6→1)-β-D-葡萄糖苷，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖(6→1)-α-D-葡萄糖苷，槲皮素-3-O-α-D-葡萄糖苷，槲皮素-3-O-β-D-半乳糖(6→1)-β-D-葡萄糖苷，或它们的异构体、外消旋体或药学上可接受的盐。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的代谢性疾病包括：代谢综合征，糖尿病，胰岛素抵抗，高脂血症，肥胖症，动脉粥样硬化，脂肪肝，和/或它们的并发症。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于：

降低血液中低密度脂蛋白水平；

降低血液中甘油三酯水平；

降低血液中总胆固醇水平；

改善葡萄糖耐受；和/或

促进脂肪酸氧化。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的水性有机溶剂提取物选自：乙醇提取物或水提取物。

5.一种秋葵多糖，其通过以下方法制备获得：将秋葵进行乙醇提取收获药渣，将药渣进行脱脂，之后用水提取多糖类物质，收集水提液，再进行乙醇沉淀，收集沉淀，干燥，获得秋葵多糖。

6.如权利要求5所述的秋葵多糖，所述制备方法中：

乙醇提取收获药渣的过程如下：秋葵粉碎，用按照体积95%±5%的乙醇热提取2-5次，每次1-3小时，收获药渣；或

所述的用水提取多糖类物质及收集水提液的过程如下：用按照体积3-6倍量的水提取多糖类物质，提取1-4次，每次1-3小时，收集水提液，浓缩，除去不溶杂质；或

所述的乙醇沉淀的过程如下：在水提液中加入按照体积3-6倍量的95%±5%的乙醇进行沉淀。

7.一种秋葵醇提取物，其通过以下方法制备获得：秋葵粉碎，加入乙醇进行加热回流或超声提取。

8.一种秋葵水提取物，其通过以下方法制备获得：秋葵粉碎，加入水进行加热回流或超声提取。

9.一种组合物，其包括：有效量的权利要求5-8任一所述的秋葵多糖、秋葵醇提取物或秋葵水提取物；以及食品学或药学上可接受的载体。

10.一种减肥、降血糖或降血脂的方法，包括步骤：给需要的对象施用有效量的秋葵的水提取物、水性有机溶剂提取物、秋葵多糖或活性化合物；

其中，所述的活性化合物包括：异槲皮苷，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖(6→1)-β-D-葡萄糖苷，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖(6→1)-α-D-葡萄糖苷，槲皮素-3-O-α-D-葡萄糖苷，槲皮素-3-O-β-D-半乳糖(6→1)-β-D-葡萄糖苷，或它们的异构体、外消旋体或药学上可接受的盐。

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