CN113041269A - 草本植物发酵物用于制备预防肥胖的组合物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物提取物领域，尤其是关于一种草本植物发酵物用于制备预防肥胖的组合物的用途。本发明提供一种草本植物发酵物用于制备预防肥胖的组合物的用途，其中所述草本植物发酵物为一秋葵发酵物，且所述秋葵发酵物是调控一个体的血糖及/或血脂。本发明的发酵制程能提升该草本植物发酵物中总多糖的含量，并有效提高该草本植物发酵物的淀粉酶抑制率及葡萄糖苷酶抑制率，而可有效地抑制淀粉及葡萄糖苷的分解与吸收，本发明的该草本植物发酵物亦能有效减低个体饭后血糖值，且能够有效地降低个体的体重、BMI值、腰围、内脏脂肪、平均全身体脂率、及平均躯干体脂率，而能够有效地应用于调控血糖与血脂及预防肥胖的用途。

Description

草本植物发酵物用于制备预防肥胖的组合物的用途

技术领域

本发明涉及植物提取物领域，尤其是关于一种草本植物发酵物用于制备预防肥胖的组合物的用途。

背景技术

近年来全球肥胖的发病率已经逐渐的增加，世界卫生组织(World HealthOrganization,WHO)更以「传染病」形容快速蔓延的肥胖，并称其为「全球肥胖症」(Globesity)，根据2014年世界卫生组织的估计，全球约有39％的人口超重(约19亿人)，更有13％的人口肥胖(约6亿人)。

肥胖的个体会使多种健康问题的风险增加，并可能导致多种并发症的发生，包括高血压、高血脂、心血管疾病、睡眠呼吸中止、狭心症、退化性关节炎、尿酸过高骨关节炎、第二型糖尿病、及癌症等疾病。其中，由于体内脂肪细胞过多，会分泌阻碍胰岛素作用的有害物质，使得胰岛素功能受阻，便无法有效控制上升的血糖，因而导致高血糖的症状，若身体长期处于高血糖的情况，将使胰脏疲于分泌更多的胰岛素来降低血糖，一旦胰脏超过负荷便会发展成第二型糖尿病。另外，血脂是指血液中的脂肪，主要包括胆固醇及三酸甘油酯，当血液中流通的胆固醇或三酸甘油酯的浓度高于正常值时，称为高血脂症；而胆固醇或三酸甘油酯值过高，或高密度脂蛋白浓度过低时，又称为血脂异常。高血脂症除会导致心脏疾病之外，也与脑中风、高血压、糖尿病、肾病等慢性疾病息息相关。

因此，肥胖会降低生活质量并可能导致过早的死亡，因此病态性肥胖病患的平均寿命比起正常体重者少了许多。虽然，基因可能参与肥胖的发展，但肥胖流行病主要归因于高热量饮食和久坐的生活方式。因此，生活方式的改变可以预防肥胖及其并发症。

虽然低卡路里饮食和定期运动能够用于减轻体重和治疗肥胖，但这些方法难以实施且其功效受到限制，主要是因为维持体内能量储存的适应性生理机制导致。另外，有部分药物已被批准用于长期肥胖症治疗(例如奥利司他、芬特明、或托吡酯)，然而该些药物常造成严重的副作用，因而限制了治疗功效及患者依从性；再者，减肥手术能够大幅的造成体重减轻，但这种干预式的手术并不适合所有超重的人；基于以上该些原因，研究安全且有效的方式减少体重及脂肪积累确实有其需求性。

综上所述，因应现代人因生活及饮食习惯改变所面临的肥胖及因肥胖造成的整体健康问题，且基于现代人生活水平提高且对于保健概念提高，研发一种能有效地控制个体血糖及血脂，以减缓肥胖所导致的并发症，及从根本减少导致肥胖的过度摄入的养分的分解与吸收，以减少脂肪的形成且减少肥胖机会的有效成分组成的组合物，着实有其必要性。

发明内容

缘此，本发明的一目的在提供一种草本植物发酵物用于制备预防肥胖的组合物的用途，其中该草本植物发酵物为一秋葵(Abelmoschus esculentus)发酵物，且该秋葵发酵物是调控一个体的血糖及/或血脂。

本发明的又一目的在提供一种草本植物发酵物，其中该草本植物发酵物为一秋葵发酵物，其是将一秋葵经由一溶剂萃取所得的秋葵萃取物，再将该秋葵萃取物经由一酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)及一乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)同时进行发酵而获得。

本发明的另一目的在提供一种草本植物发酵物的制备方法，其中该草本植物发酵物为一秋葵发酵物，包含：将一秋葵经由一溶剂萃取所得的秋葵萃取物，再将该秋葵萃取物经由一酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)及一乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)同时进行发酵而获得。

在本发明的一实施例中，该秋葵发酵物是抑制该个体的淀粉及/或葡萄糖的吸收；且该秋葵发酵物是抑制该个体的淀粉酶的活性及/或抑制一葡萄糖苷酶的活性。

在本发明的又一实施例中，该秋葵发酵物是提升其中总多糖含量。

在本发明的又一实施例中，该秋葵发酵物的浓度为至少5％(v/v)。

在本发明的又一实施例中，该秋葵发酵物是降低该个体的体重、BMI值、腰围、内脏脂肪、平均全身体脂率、及/或平均躯干体脂率。

在本发明的另一实施例中，该秋葵发酵物是将一秋葵经由一溶剂萃取所得的秋葵萃取物，再将该秋葵萃取物经由一酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)及一乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)同时进行发酵而获得；该秋葵萃取物是以水为溶剂萃取该秋葵所获得；该秋葵与水的重量比为1-3:5-29；该酵母菌的添加量为0.01-0.5％(v/v)及该乳酸杆菌的添加量为0.01-0.25％(v/v)；且该发酵的时间为1-7天。

本发明将秋葵水萃取物以酵母菌及乳酸杆菌同时进行发酵所得的秋葵发酵物，能藉由该微生物发酵制程显著提高本发明秋葵发酵物中总多糖的含量，能使本发明的秋葵发酵物能更加有效的应用于调节血糖及血脂的用途；且本发明的发酵方法可有效提高本发明秋葵发酵物的淀粉酶以及葡萄糖苷酶的抑制率，使得本发明的秋葵发酵物可有效地抑制淀粉以及葡萄糖苷的分解，并可从源头阻断淀粉以及葡萄糖的分解，以达到抑制淀粉以及葡萄糖吸收的功效，而能够有效地应用于预防肥胖的功效；本发明的秋葵发酵物亦能有效减低个体饭后血糖值，能够有效调控血糖，而能够有效地应用于预防肥胖的功效；且本发明的秋葵发酵物还可有效地降低个体的体重、BMI值、腰围、内脏脂肪、平均全身体脂率、及平均躯干体脂率，而能够有效地应用于预防肥胖的功效。因此，本发明的秋葵发酵物可用于制备调控血糖与血脂及/或预防肥胖的组合物的用途，且该组合物是一医药品、一保养品、或一食品，可藉由口服、涂抹等方式给予一个体。

以下将进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1是本发明的一实施例的秋葵发酵物提升总多糖的功效的柱形图；

图2是本发明的一实施例的秋葵发酵物提升淀粉酶抑制率的功效的柱形图；

图3是本发明的一实施例的秋葵发酵物提升葡萄糖苷酶抑制率的功效的柱形图；

图4是本发明的一实施例的秋葵发酵物降低一个体饭后血糖值的功效的折线图；

图5是本发明的一实施例的秋葵发酵物降低一个体的体重的功效的柱形图；**p<0.01；

图6是本发明的一实施例的秋葵发酵物降低一个体的BMI值的功效的柱形图；**p<0.01；

图7是本发明的一实施例的秋葵发酵物降低一个体的腰围的功效的柱形图；

图8是本发明的一实施例的秋葵发酵物降低一个体的内脏脂肪的功效的柱形图；*p<0.05；

图9是本发明的一实施例的秋葵发酵物降低一个体的平均全身体脂率的功效的柱形图；***p<0.001；

图10是本发明的一实施例的秋葵发酵物降低一个体的平均躯干体脂率的功效的柱形图；**p<0.01。

具体实施方式

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。

使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，个此之间的差异以学生t检验(student's t-test)分析。

秋葵(Abelmoschus esculentus)为锦葵科(Malvaceae)秋葵属(Abelmoschus)的一年或多年生草本植物，又称为黄蜀葵、角豆、毛茄、阿苹田、倭克拉、欧克拉、越南芝麻、羊角豆等别名。原产于非洲东北部阿比西尼、埃及及加勒比海一带或热带亚洲，并于1901年引进中国台湾，产地分布在彰化、云林、嘉义等县境内，每年四到九月是盛产期。秋葵植株为直立性，高约一公尺，全株被有绒毛，茎部为木质化，花为完全花且呈现淡黄色，花谢后三至四天左右便可采收嫩果，秋葵的果实为蒴果，长约十公分，细长似羊角或辣椒，果皮薄且呈现革质，先端尖细，果色从淡绿至深绿色，亦有紫红色者。秋葵果实含有特殊黏滑物质，更具有特殊香气或风味。秋葵果实可供食用，已知具有改善消化不良及消水肿的功效。

如本文中所使用的，用语「秋葵发酵物」意为秋葵与溶剂以1-3:5-29的重量比混合后经一特定时间与温度萃取而得的秋葵萃取物，再以酵母菌及乳酸杆菌同时进行一发酵而获得，其中该酵母菌的添加量为0.01-0.5％(v/v)；该乳酸杆菌的添加量为0.01-0.25％(v/v)。

本文所述的「有效浓度」是表示能有效提高淀粉酶的抑制率、提供葡萄糖苷酶的抑制率、减低个体饭后血糖值、并有效降低个体的体重、BMI值、腰围、内脏脂肪、平均全身体脂率、及平均躯干体脂率所需本发明的秋葵发酵物的浓度。有效浓度依所作用的对象而可能不同，但可藉由例如剂量递增试验(dose escalation)以实验决定其有效浓度。

依据本发明，有关萃取的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，有关微生物发酵反应的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型，这包括，但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(external preparation)以及类似物。

依据本发明，医药品可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该医药上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，该医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它们的组合。

依据本发明，该医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)以及病灶内注射(intralesional injection)。

依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于局部地施用于皮肤上的外部制剂(external preparation)，这包括，但不限于：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、贴片(patch)、擦剂(liniment)、粉末(powder)、气溶胶(aerosol)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、乳浆(serum)、糊剂(paste)、泡沫(foam)、滴剂(drop)、悬浮液(suspension)、油膏(salve)以及绷带(bandage)。

依据本发明，该外部制剂是藉由将本发明的医药品与一为熟习此项技艺者所详知的基底(base)相混合而被制备。

依据本发明，该基底可包含有一或多种选自于下列的添加剂(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氢化合物(hydrocarbons)[诸如石油胶(petroleum,jelly)以及白凡士林(white petrolatum,)]、蜡(wax)[诸如石蜡(paraffin)以及黄蜡(yellowwax)]、保存剂(preserving agents)、抗氧化剂(antioxidants)、界面活性剂(surfactants)、吸收增强剂(absorption enhancers)、安定剂(stabilizing agents)、胶凝剂(gelling agents)[诸如

974P(

974P)、微结晶纤维素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纤维素(carboxymethylcellulose)]、活性剂(active agents)、保湿剂(humectants)、气味吸收剂(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH调整剂(pH adjusting agents)、螯合剂(chelating agents)、乳化剂(emulsifiers)、闭塞剂(occlusive agents)、软化剂(emollients)、增稠剂(thickeners)、助溶剂(solubilizing agents)、渗透增强剂(penetration enhancers)、抗刺激剂(anti-irritants)、着色剂(colorants)以及推进剂(propellants)等。有关这些添加剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，保养品可进一步包含有一被广泛地使用于保养品制造技术的可接受的佐剂(acceptable adjuvant)。例如，该可接受的佐剂可包含有一或多种选自于下列的试剂：溶剂、胶凝剂、活性剂、防腐剂、抗氧化剂、遮蔽剂(screening agent)、螯合剂、界面活性剂、染色试剂(coloring agent)、增稠剂(thickening agent)、填料(filler)、香料以及气味吸收剂。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，保养品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于护肤(skincare)或化妆(makeup)的形式，这包括，但不限于：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或复合型的乳剂、凝胶、软膏、乳霜、面膜(mask)、贴片、贴布(pack)、擦剂、粉末、气溶胶、喷雾、乳液、乳浆、糊剂、泡沫、分散液、滴剂、慕斯(mousse)、防晒油(sunblock)、化妆水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妆产品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身体清洁产品(body cleansingproducts)等。

依据本发明，保养品亦可与一或多种选自于下列的已知活性的外用剂(externaluse agents)一起合并使用：美白剂(whitening agents)[诸如维生素A酸(tretinoin)、儿茶素(catechin)、曲酸、熊果苷以及维生素C]、保湿剂、抗发炎剂(anti-inflammatoryagents)、杀菌剂(bactericides)、紫外线吸收剂(ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[诸如芦荟萃取物(aloe extract)]、皮肤营养剂(skin nutrients)、麻醉剂(anesthetics)、抗痘剂(anti-acne agents)、止痒剂(antipruritics)、止痛剂(analgesics)、抗皮肤炎剂(antidermatitis agents)、抗过角化剂(antihyperkeratolytic agents)、抗干皮肤剂(anti-dry skin agents)、抗汗剂(antipsoriatic agents)、抗老化剂(antiaging agents)、抗皱剂(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出剂(antiseborrheic agents)、伤口治疗剂(wound-healing agents)、皮质类固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有关这些外用剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，食品产品可被当作食品添加物(food additive)，藉由习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。

依据本发明，食品产品的种类包括但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)。

如本文中所使用的，用语「酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)」以及「乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)」分别意欲涵盖那些为熟习此项技术人士可易于获得的啤酒酵母菌以及胚芽乳酸菌(例如，可购自于国内或国外寄存机构者)，或者利用本技艺中所惯用的微生物分离方法而从天然来源中所分离纯化出的啤酒酵母菌以及胚芽乳酸菌菌株。

本发明提供一种草本植物发酵物用于制备预防肥胖的组合物的用途，本发明的秋葵发酵物是将秋葵与溶剂以1-3:5-29(w/w)比例经一特定时间与温度萃取而得的秋葵萃取物，再以酵母菌及乳酸杆菌同时进行发酵而获得。本发明的发酵步骤能有效提升秋葵中的总多糖含量，而本发明的秋葵发酵物可有效提高淀粉酶的抑制率、提供葡萄糖苷酶的抑制率、减低个体饭后血糖值、并有效降低个体的体重、BMI值、腰围、内脏脂肪、平均全身体脂率、及平均躯干体脂率而能够有效地应用于预防肥胖的功效。

同时，本发明用于预防肥胖的组合物，亦可包含一有效量的秋葵发酵物及一医药上可接受的载体，该组合物是一医药品、一保养品、或一食品。

以下将详细说明本发明秋葵发酵物的详细制备方法、本发明发酵方法提升该秋葵发酵物中总多糖的功效的测试、本发明发酵方法提升该秋葵发酵物于淀粉酶抑制率的功效的测试、本发明发酵方法提升该秋葵发酵物于葡萄糖苷酶抑制率的功效的测试、本发明的秋葵发酵物减低个体饭后血糖值的功效的测试、及本发明的秋葵发酵物降低个体的体重、BMI值、腰围、内脏脂肪、平均全身体脂率、及平均躯干体脂率的功效的测试，以证实本发明的秋葵发酵物具有调控血糖与血脂的功效，而能够有效地应用于预防肥胖的用途。

实施例1本发明的秋葵发酵物的制备方法

在本发明一实施例中，将中国台湾产的秋葵与水、醇、或醇水混合物的萃取溶剂以1-3:5-29(w/w)的比例均匀混合，萃取溶剂较佳为水，并于50-100℃下同时灭菌萃取0.5-3小时后，即获得一秋葵萃取物，在本发明一较佳实施例中，萃取溶剂为水而得到一秋葵水萃取物，再将该秋葵萃取物冷却至室温供后续发酵使用。接着，于该秋葵萃取物中同时植入0.01-0.5％(w/w)的酵母菌(Saccharomyces cerevisiae，购买于生物资源保存与研究中心，中国台湾，编号为BCRC20271)、及0.01-0.25％(w/w)的乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum，购买于生物资源保存与研究中心，中国台湾，编号为BCRC910760)，于25-35℃下进行发酵1-7天，实际时间视发酵状态而异。最后在不移除此该二种菌的情况下，使用设定的糖度范围2-4°、pH<4、酒精>5％等规格，如检验符合该规格，则判定发酵完成并得到粗发酵液。接着，将该粗发酵液于45-70℃进行减压浓缩，并以200-400目的网筛进行过滤，再添加40-70％异麦芽寡糖调整规格后，于95-105℃下加热70-90分钟进行灭菌，即得到本发明的秋葵发酵物。

实施例2本发明的秋葵发酵物提升总多糖含量的效果

本发明的一实施例为进行本发明的发酵方法提升秋葵发酵物中总多糖含量的功效的测试实验，使用苯酚－硫酸法(Phenol-sulfuric acid assay)来定量样品中总多糖的浓度，其中当糖类遇到强酸时，结构式上的羟基会与酚结合，并产生橘黄色液体，因此可用比色法(特别是样品于490nm的吸光值)检测其中的总多糖的浓度。首先，精密秤取10mg的D-葡萄糖(D-Glucose，购自J.T.Baker，美国，编号为1916-01)置于10mL的容量瓶中，再加入ddH₂O至总体积达10mL，并完成D-葡萄糖的标准品(D-Glucose stock,1mg/mL)，接着将上述标准品以表一的配方进行系列稀释，以dd H₂O稀释为0μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、及200μg/mL的D-Glucose。另外，取1.25g的苯酚(购自Merck，德国，编号1.00206.0250)于容量瓶中，再加入ddH₂O至总体积达25mL，以完成5％苯酚的作用溶液。

表一、系列稀释d-葡萄糖标准品的配方

接着绘制标准溶液的回归曲线，取各浓度的标准溶液100μL于玻璃试管中，分别加入500μL的5％苯酚溶液，并缓慢地加入2.5mL硫酸溶液(95.5％的H₂SO4，购自Showa，日本，编号1970-5250)于各试管中，以震荡仪混合均匀后静置20分钟，接着取200μL各组混合液于96孔培养盘中，测量于490nm的吸光值，以绘制标准溶液的回归曲线公式。接着，分别取100μL的秋葵水萃取物(参见实施例1)、及本发明的秋葵发酵物于玻璃试管中，分别加入500μL的5％苯酚溶液，并缓慢地加入2.5mL硫酸溶液于各试管中，以震荡仪混合均匀后静置20分钟，接着取200μL各组混合液于96孔培养盘中，测量于490nm的吸光值，并以上述的标准溶液的回归曲线公式，以内差法算出浓度后再回乘稀释倍数以取得原秋葵水萃取物及本发明的秋葵发酵物中总多糖的浓度。

本发明的秋葵发酵物中总多糖含量上升的结果如图1所示。

秋葵水萃取物的总多糖含量为3135ppm，而本发明的秋葵发酵物的总多糖含量则为3738ppm，为未经发酵的秋葵水萃取物的1.2倍。此结果显示本发明的发酵步骤能有效提升秋葵中的总多糖含量，且能使本发明的秋葵发酵物能更加有效的应用于调节血糖及血脂的用途。

实施例3本发明的秋葵发酵物抑制淀粉酶的功效

本发明的一实施例为进行本发明的发酵方法提升秋葵发酵物抑制淀粉酶(Amylase)的功效的测试实验，因此利用淀粉酶会将淀粉水解产生还原糖(例如葡萄糖、麦芽糖等)的特性，其中该些还原糖具有醛基(-CHO)或酮基(-C＝O)的官能基，因此具有还原性，而在碱性溶液下可将3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitr osalicylic acid,DNS)还原成3-氨基-5-硝基水杨酸(3-amino-5-nitrosa licylic acid)，而3-氨基-5-硝基水杨酸可吸收540nm波長的光，且吸光值与3-氨基-5-硝基水杨酸的浓度成正比，因此可用此原理以测定待测物中淀粉酶的相对活性或相对含量。

首先，先配置以下溶液：0.02M的磷酸钠缓冲液(Sodium phosphate buffer，pH为6.9，且含有6mM的氯化钠(NaCl)，以下简称Pi缓冲溶液)，为溶于500mL水(H₂O)的0.7356g的磷酸氢钠(Sodium hydrogen phosphate,Na₂HPO₄，购自J.T.Baker，美国，编号3828-01)、0.5492g的磷酸二氢钠(Sodium dihydrogen phosphate,NaH₂PO₄，购自Sigma，美国，编号04270)、及1.7532g的氯化钠所配制而成；2N的氢氧化钠(Sodium hydroxide,NaOH，购自Macron，美国，编号7708-10)溶液，为溶于100mL水中的8g的氢氧化钠所配制而成；将1g的3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid，购自Sigma，美国，编号D0550)加入50mL去离子水中，并缓慢地加入30g的酒石酸钾钠(Sodium potassium tartrate tetrahydrate，购自Sigma，美国，编号32312)，再缓慢地加入20mL的2N氢氧化钠，最后以去离子水定量至100mL，即为二硝基水杨酸显色试剂(Dinitrosalicylic acid color reagent)，此试剂为本反应的终止剂，其保存期限为两周；秤取1g的淀粉(Starch，购自Sigma，美国，编号S9765)溶于100mL的Pi缓冲溶液中，并缓慢加热使之完全溶解后，降至室温再以H₂O定量至100mL，即为1％的淀粉溶液，储存于4℃，使用前则至少要置于室温下4-5分钟回温；秤取0.0096g的α-淀粉酶(α-amylase，购自sigma，美国，编号A3176，保存于4℃)，并以25mL的Pi缓冲溶液进行溶解，即为5units/mL的α-淀粉酶溶液，储存于4℃可存放2-3天。

以下列实验组作为第10分钟的最终组别：首先，取出新的微量试管分别加入200μL的经相同倍率稀释的秋葵水萃取物(参见实施例1)、及本发明的秋葵发酵物，其中每组进行三重复。接着，分别于每一个试管中加入200μL的溶于Pi缓冲溶液的5units/mL的α-淀粉酶溶液，再以震荡仪(Vortex)将溶液混合均匀，并于25℃下作用10分钟后，分别于每个试管中加入200μL的1％淀粉溶液，再以震荡仪将溶液混合均匀，并于25℃下作用10分钟后，于每个试管中加入400μL的反应终止剂，即二硝基水杨酸显色试剂，再以震荡仪将溶液混合均匀，并于沸水中作用5分钟后将其冷却至室温后，再以适当的水稀释至可测定吸光值的范围，例如150μL的反应后的溶液加上850μL的H₂O。最后，分别取200μL各个稀释后的反应溶液至96孔培养盘中，测量其于540nm的吸光值。其中，以加入200μL的Pi缓冲溶液的组别做为控制组。

以下列实验组作为第0分钟的起始组别：首先，取出新的微量试管分别加入200μL的经相同稀释倍率的秋葵水萃取物(参见实施例1)、及本发明的秋葵发酵物，并分别于每一个试管中加入200μL的溶于Pi缓冲溶液的5units/mL的α-淀粉酶溶液，再以震荡仪将溶液混合均匀，并于25℃下作用10分钟后，为了避免α-淀粉酶继续反应，需先于每个试管中加入400μL的反应终止剂，并以震荡仪将溶液混合均匀后，于沸水中作用5分钟后将其冷却至室温后，再分别于每个试管中加入200μL的1％淀粉溶液，再以震荡仪将溶液混合均匀，并于25℃下作用10分钟；其中，因为时间为关键因素，所以加入的间隔亦须控制妥当。最后，再以适当的水稀释至可测定吸光值的范围，并分别取200μL各个稀释后的反应溶液至96孔培养盘中，测量其于540nm的吸光值。其中，以加入200μL的H₂O的组别做为控制组。

接着，以下列公式分别计算秋葵水萃取物、及本发明的秋葵发酵物的淀粉酶抑制率，作为抑制淀粉酶的功效的标准：

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本发明的发酵方法提升秋葵发酵物抑制淀粉酶的功效的测试结果如图2所示。秋葵水萃取物的淀粉酶抑制率仅有29.9％，而本发明的秋葵发酵物的淀粉酶抑制率则高达52.8％，相较于未经发酵的秋葵水萃取物能够提高22.9％的淀粉酶抑制率。此结果显示本发明的发酵方法可有效提高本发明秋葵发酵物的淀粉酶抑制率，使得本发明的秋葵发酵物可有效地抑制淀粉的分解，并可从源头阻断淀粉的分解，以达到抑制淀粉吸收的功效，而能够有效地应用于预防肥胖的功效。

实施例4本发明的秋葵发酵物抑制葡萄糖苷酶的功效

本发明的一实施例为进行本发明的发酵方法提升秋葵发酵物抑制葡萄糖苷酶(Glucosidase)的功效的测试实验，因此利用葡萄糖苷酶会将人造基质-对硝基苯基α-d-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-α-D-Glucopyranoside,pNPG)进行水解，并产生产生葡萄醣醛酸(Glucuronic acid)及黄色的对硝基苯酚(p-nitrophenol)的特性，而对硝基苯酚可吸收405nm波长的光，且吸光值与对硝基苯酚的浓度成正比，因此可用此原理以测定待测物中葡萄糖苷酶的相对活性或相对含量。

首先，先配置以下溶液：0.1M的磷酸钠缓冲液(pH为7.0)，以下简称Pi缓冲溶液，将4.7283g的磷酸氢钠及2.0028g的磷酸二氢钠以400mL的RO水溶解后，再以定量瓶将溶液定量至500mL；2.5mM的pNPG溶液，为0.0377g的pNPG(购自Sigma，美国，编号N1377)以RO水定量至100mL，并冷藏3-4日进行保存，使用前须注意，若溶剂变为淡黄色，则表示溶剂已氧化，则需再重新配置；取2.1198g的碳酸钠(Sodium carbonate,Na₂CO₃，购自Sigma，美国，编号31432)以RO水定量至100mL，即为0.2M的碳酸钠溶液，此溶液为本实验的终止剂；以0.1M的Pi缓冲溶液配置0.2units/mL的α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，购自Sigma，美国，编号G5003-100UN，购入时为26units/mg solid，且共有3.85mg个solid)溶液；其中，本实施例中的α-葡萄糖苷酶溶液以下列方法所配置：将2.0mL的Pi缓冲溶液加入容量瓶中，并加入0.1mL所购入的50U/mL的酵素原液(储存于-20℃备用)，并以RO水定量至25mL，即为0.2units/mL的α-葡萄糖苷酶。

以下列实验组作为第15分钟的最终组别：首先，分别将160μL的经相同倍率稀释的秋葵水萃取物(参见实施例1)、及本发明的秋葵发酵物置入96孔培养盘中，其中每组进行三重复。接着，分别于每一个孔洞中加入20μL的溶于0.1M的Pi缓冲溶液的0.2units/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，再将溶液混合均匀，并于25℃下作用10分钟后，再分别于每一个孔洞加入20μL的2.5mM的pNPG溶液，再将溶液混合均匀，并于37℃下作用10分钟后，于每一个孔洞中加入80μL的反应终止剂，再将溶液混合均匀后，测量每一个孔洞中溶液于405nm的吸光值。其中，以加入160μL的Pi缓冲溶液的组别做为控制组。

以下列实验组作为第0分钟的起始组别：首先，分别将160μL的经相同倍率稀释的秋葵水萃取物(参见实施例1)、及本发明的秋葵发酵物置入96孔培养盘中，其中每组进行三重复。接着，分别于每一个孔洞中加入20μL的溶于0.1M的Pi缓冲溶液，再将溶液混合均匀，并于25℃下作用10分钟后，再分别于每一个孔洞加入20μL的2.5mM的pNPG溶液，再将溶液混合均匀，并于37℃下作用10分钟后，于每一个孔洞中加入80μL的反应终止剂，再将溶液混合均匀后，测量每一个孔洞中溶液于405nm的吸光值。其中，以加入160μL的Pi缓冲溶液的组别做为控制组。

接着，以下列公式分别计算秋葵水萃取物、及本发明的秋葵发酵物的葡萄糖苷酶抑制率，最为抑制葡萄糖苷酶的功效的标准：

本发明的发酵方法提升秋葵发酵物抑制葡萄糖苷酶的功效的测试结果如图3所示。秋葵水萃取物的葡萄糖苷酶抑制率仅有95.5％，而本发明的秋葵发酵物的葡萄糖苷酶抑制率则高达109.6％，相较于未经发酵的秋葵水萃取物能够提高14.1％的葡萄糖苷酶抑制率。此结果显示本发明的发酵方法可有效提高本发明秋葵发酵物的葡萄糖苷酶抑制率，使得本发明的秋葵发酵物可有效地抑制葡萄糖苷的分解，并可从源头阻断葡萄糖的分解，以达到抑制葡萄糖吸收的功效，而能够有效地应用于预防肥胖的功效。

实施例5本发明的秋葵发效物降低个体饭后血糖值的功效

本发明的一实施例为进行本发明的秋葵发酵物于降低个体饭后血糖值的功效的测试实验，以交叉试验的方式进行测试。首先，募集7位成人为受试者，并分成两天进行试验，试验前受试者需要空腹八个小时，并于试验起始时间点测量血糖值，作为餐前血糖值，接着于测试的第一天，让每位受试者食用三片白吐司后，每经过三十分钟测量一次餐后血糖值，测量至两小时结束，并以此结果作为对照组；并于第一次测试的二天后，每位受试者同样需要保持试验前空腹八个小时，并于试验起始时间点测量血糖值，作为餐前血糖值，接着再饮用一瓶含有5-10％本发明的秋葵发酵物的饮品，并于饮用后静待十五分钟，再于十分钟内食用完三片白吐司，之后每经过三十分钟测量一次餐后血糖值，测量至两小时结束。最后将两天的测试结果做比较，以观察本发明的秋葵发酵物于降低个体饭后血糖值的功效。

本发明的秋葵发酵物于降低个体饭后血糖值的功效的测试结果如图4所示。未饮用本发明的秋葵发酵物时，受试者的餐前血糖值为93mg/dL，而食用完白吐司的饭后第三十分钟的血糖值为145mg/dL、第六十分钟的血糖值为126.7mg/dL、第九十分钟的血糖值为111.8mg/dL、而第一百二十分钟的血糖值为112.0mg/dL；在饮用本发明的秋葵发酵物时，受试者的餐前血糖值同样为93mg/dL，然而食用完白吐司的饭后第三十分钟的血糖值为137.1mg/dL、第六十分钟的血糖值为114.9mg/dL、第九十分钟的血糖值为109.6mg/dL、而第一百二十分钟的血糖值为107.7mg/dL，分别较未饮用本发明的秋葵发酵物的控制组低10.4％、14.4％、3.9％、及6.1％。此结果显示本发明的秋葵发酵物能有效减低个体饭后血糖值，能够有效调控血糖，而能够有效地应用于预防肥胖的功效。

实施例6本发明的秋葵发效物预防肥胖的功效

本发明的一实施例为进行本发明的秋葵发酵物于促进预防肥胖的功效的测试实验。首先，募集男性或女性受试者共十位，其中该些受试者的BMI值≥24、体脂肪则为男性＞25％、女性＞30％、空腹血糖值偏高但非为糖尿病患者、且皆未服用控制血糖药物的个体；使该十位受试者于每日饭前饮用一瓶含有5-10％本发明的秋葵发酵物的饮品，并分别于服用前、及服后两周后，对受试者进行体重指标的测定，其中包含测量体重、身高体重指数(Body Mass Index，以下简称为BMI值)、腰围、内脏脂肪、全身体脂率、及躯干体脂率。

本发明的发酵方法提升秋葵发酵物降低个体体重的功效的测试结果如图5所示。饮用本发明的秋葵发酵物前，受试者的平均体重为70.7公斤；而在饮用本发明的秋葵发酵物两周后，受试者的平均体重显著降低为70公斤，相较于饮用前共降低0.7公斤。此结果显示本发明的秋葵发酵物可有效地降低个体的体重，而能够有效地应用于预防肥胖的功效。

本发明的发酵方法提升秋葵发酵物降低个体BMI值的功效的测试结果如图6所示。饮用本发明的秋葵发酵物前，受试者的平均BMI值为25.5；而在饮用本发明的秋葵发酵物两周后，受试者的平均BMI值显著降低为25.2，相较于饮用前共降低0.3。此结果显示本发明的秋葵发酵物可有效地降低个体的BMI值，而能够有效地应用于预防肥胖的功效。

本发明的发酵方法提升秋葵发酵物降低个体腰围的功效的测试结果如图7所示。饮用本发明的秋葵发酵物前，受试者的平均腰围为84.2公分；而在饮用本发明的秋葵发酵物两周后，受试者的平均腰围有效降低为83.9公分，相较于饮用前共降低0.3公分。此结果显示本发明的秋葵发酵物可有效地降低个体的腰围，而能够有效地应用于预防肥胖的功效。

本发明的发酵方法提升秋葵发酵物降低内脏脂肪的功效的测试结果如图8所示。饮用本发明的秋葵发酵物前，受试者的平均内脏脂肪为7.4单位；而在饮用本发明的秋葵发酵物两周后，受试者的平均腰围显著降低为7.1单位，相较于饮用前共降低0.3单位。此结果显示本发明的秋葵发酵物可有效地降低个体的内脏脂肪，而能够有效地应用于预防肥胖的功效。

本发明的发酵方法提升秋葵发酵物降低个体全身体脂率的功效的测试结果如图9所示。饮用本发明的秋葵发酵物前，受试者的平均全身体脂率为35.4％；而在饮用本发明的秋葵发酵物两周后，受试者的平均全身体脂率显著降低为34.4％，相较于饮用前共降低1％。此结果显示本发明的秋葵发酵物可有效地降低个体的平均全身体脂率，而能够有效地应用于预防肥胖的功效。

本发明的发酵方法提升秋葵发酵物降低平均躯干体脂率的功效的测试结果如图10所示。饮用本发明的秋葵发酵物前，受试者的平均躯干体脂率为36.2％；而在饮用本发明的秋葵发酵物两周后，受试者的平均躯干体脂率显著降低为35.3％，相较于饮用前共降低0.9％。此结果显示本发明的秋葵发酵物可有效地降低个体的平均躯干体脂率，而能够有效地应用于预防肥胖的功效。

综上所述，本发明将秋葵水萃取物以酵母菌及乳酸杆菌同时进行发酵所得的秋葵发酵物，能藉由该微生物发酵制程显著提高本发明秋葵发酵物中总多糖的含量，能使本发明的秋葵发酵物能更加有效的应用于调节血糖及血脂的用途；且本发明的发酵方法可有效提高本发明秋葵发酵物的淀粉酶以及葡萄糖苷酶的抑制率，使得本发明的秋葵发酵物可有效地抑制淀粉以及葡萄糖苷的分解，并可从源头阻断淀粉以及葡萄糖的分解，以达到抑制淀粉以及葡萄糖吸收的功效，而能够有效地应用于预防肥胖的功效；本发明的秋葵发酵物亦能有效减低个体饭后血糖值，能够有效调控血糖，而能够有效地应用于预防肥胖的功效；且本发明的秋葵发酵物还可有效地降低个体的体重、BMI值、腰围、内脏脂肪、平均全身体脂率、及平均躯干体脂率，而能够有效地应用于预防肥胖的功效。因此，本发明的秋葵发酵物可用于制备调控血糖与血脂及/或预防肥胖的组合物的用途，且该组合物是一医药品、一保养品、或一食品，可藉由口服、涂抹等方式给予一个体。

Claims (8)

1.一种草本植物发酵物用于制备预防肥胖的组合物的用途，其中所述草本植物发酵物为一秋葵发酵物，且所述秋葵发酵物是调控一个体的血糖及/或血脂。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述秋葵发酵物是抑制该个体的淀粉及/或葡萄糖的吸收。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述秋葵发酵物是抑制该个体的淀粉酶的活性及/或抑制一葡萄糖苷酶的活性。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述秋葵发酵物是提升其中总多糖含量。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述秋葵发酵物的浓度为至少5％(v/v)。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述秋葵发酵物是降低该个体的体重、BMI值、腰围、内脏脂肪、平均全身体脂率、及/或平均躯干体脂率。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述秋葵发酵物是将一秋葵经由一溶剂萃取所得的秋葵萃取物，再将所述秋葵萃取物经由一酵母菌及一乳酸杆菌同时进行发酵而获得。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述秋葵萃取物是以水为溶剂萃取该秋葵所获得；所述秋葵与水的重量比为1-3:5-29；所述酵母菌的添加量为0.01-0.5％(v/v)及所述乳酸杆菌的添加量为0.01-0.25％(v/v)；且所述发酵的时间为1-7天。

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