CN114831918B - 中药组合物发酵液、其制备方法以及应用 - Google Patents

中药组合物发酵液、其制备方法以及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种中药组合物发酵液、其制备方法以及应用，该中药组合物发酵液的制备主要步骤为：每1000mL纯水中加入20‑50g石斛、10‑50g玫瑰花，匀浆破壁提取5‑10min并过滤，浓缩；按0.5‑5％接种酵母菌株，于26‑30℃培养1‑2d，高温灭活，获得中药组合物发酵液。本发明将石斛和玫瑰花结合，通过筛选得到的特定酵母菌进行发酵，获得的发酵液易被人体吸收利用，可应用于护肤品中，具有较好的保湿、美白、抗衰老、光防御、调节皮肤pH等多重生物学功效。

Description

中药组合物发酵液、其制备方法以及应用
技术领域
本发明属于化妆品技术领域，特别涉及一种中药组合物发酵液及其制备方法，还涉及该中药组合物发酵液在化妆品领域的应用。
背景技术
中药化妆品作为中草药美容的重要组成部分，其组分大部分取自天然精华。不同于其他化妆品，中药化妆品是以中药理论为指导的，具有明显的功能性，其绿色天然，安全可靠；并且中药来源于大自然，纯正温和，毒副作用小，并且中药化妆品的剂型丰富多彩，具有很好的针对性。
石斛作为我国传统名贵药材之一，被称为“中华九大仙草之首”，为兰科植物石斛的干燥茎。在安徽、广西、云南、浙江等地均有分布。其性甘，味微寒；具有益胃生津，滋阴清热的功效；主要用于热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕、病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨痿软等证。临床上主要用于增强免疫力、改善胃肠道功能、治疗糖尿病、高血脂及抗肿瘤等方面。研究表明石斛具有抗降血脂、降血糖、增强免疫、抗肿瘤、抗凝血、抗炎等生物活性，主要包括多糖、氨基酸类、生物碱、菲类等。其中，多糖是石斛中主要化学成分及生物活性物质，2020版《中国药典》规定其含量(按干燥品计)不得少于25％，现有文献表明多糖含量一般在25-35％之间，最高可达40％左右。多糖(Polysaccharide)是由10个以上的单糖通过糖苷键结合而成的聚合糖高分子碳水化合物，是存在于多种植物中的一种高分子化合物。随着我国化妆品行业的快速发展，多糖在其中也扮演着重要的角色，由于多糖中的多羟基和羧基结构，可与水分子形成氢键网络而锁住水分，促进水通道蛋白、中间丝聚蛋白表达增加，从而维护皮肤表皮屏障结构和水合功能。
此外，玫瑰花是我国传统十大名花之一，兼有观赏、食用和药用价值。其性甘、微苦而温，入肝经、脾经，具有行气解郁、活血止痛的功效；主要用于食少呕恶、肝胃气痛、月经不调、跌扑伤痛等。玫瑰花主要成分有黄酮类、挥发油类和芳香类、多糖类、脂肪酸类等，黄酮类是玫瑰花的主要活性成分；其中，玫瑰干花蕾中的黄酮类化合物含量高达3.3％，包含有黄酮醇、儿茶酸、表儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、没食子酸、芦丁、槲皮素、槲皮苷、金丝桃花苷等。现代药理学研究表明其具有抗氧化、提高免疫力、抑菌、改善微循环、抗心肌缺血等作用。其中，槲皮素和没食子酸是主要的酚类物质。玫瑰花多酚的酚羟基具有很强的还原性，可作为天然抗氧化活性成分。另外，玫瑰花中多酚及鞣质均可抑制酪氨酸酶活性，起到美白的功效。
因此，将石斛、玫瑰花或其提取物通过一系列处理后应用于中药化妆品中方案较多，但对皮肤改善效果有限。为了提升中药化妆品的效果，已有研究表明，采用微生物发酵的方式对中药组合物进行发酵处理，利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为所需要的产物，这一过程能够提高各组分的活性，从而提高作用效果。但由于石斛、玫瑰花的木质素含量较高，分子量较大被人体吸收利用有限，不能极大程度的发挥其功效。
发明内容
有鉴于此，本发明有必要提供一种中药组合物发酵液的制备方法，将石斛和玫瑰花结合，通过筛选得到的特定酵母菌进行发酵，获得的发酵液易被人体吸收利用，具有较好的保湿、美白、抗衰老、光防御、调节皮肤pH等多重生物学功效。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明首先提供了一种中药组合物发酵液的制备方法，包括以下步骤：每1000mL纯水中加入20-50g石斛、10-50g玫瑰花，匀浆破壁提取5min-10min并过滤，浓缩；
按体积比0.5-5％接种酵母菌株，于26-30℃培养1-2d，高温灭活，获得中药组合物发酵液。
进一步方案，所述接种酵母菌株的具体步骤为：浓缩液加入YM培养基，高温灭菌后，按0.5-5％接种酵母菌株。
进一步方案，所述酵母菌株选自普鲁兰类酵母、酿酒酵母、毕赤酵母、克鲁维酵母、棉病针孢酵母、光滑球拟酵母中的至少一种。
进一步方案，所述酵母菌株为棉病针孢酵母。
进一步方案，所述中药组合物发酵液中还添加有增效成分，所述增效成分为银耳、枸杞子和红景天，具体步骤为：待石斛和玫瑰花匀浆破壁提取后，加入所述增效成分加热煎煮，过滤。
本发明进一步提供了一种中药组合物发酵液，采用前述任一项所述的制备方法制得。
本发明进一步提供了如前所述的中药组合物发酵液在护肤品中的应用。
本发明进一步提供了一种护肤品，包括如前所述的中药组合物发酵液。
进一步方案，所述护肤品为水剂、乳液类、膏霜类、啫喱类、面膜、喷雾类、精华类或洗护类。
进一步方案，所述护肤品中，中药组合物发酵液的质量分数为2-20％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
通过对石斛、玫瑰花的纤维性强采用破壁匀浆技术，使其充分破碎匀浆，从而使得组合物中的活性成分更好的溶出；进一步的，本发明中采用高纤维素降解活性的酵母菌，能够很好地对石斛和玫瑰花中所含的纤维素进行酶解，也可利用其进行代谢，从而获得更多的活性成分。
通过本发明制备方法获得的中药组合物发酵液可用于预防或处理由生理或物理条件造成的皮肤皱纹、细纹；还可以用于预防或处理皮肤干燥、粗糙。
附图说明
图1为DPPH自由基清除率实验结果，图中不同字母是表示组间之间的显著差异，相同字母表示没有差异，不同表示有差异(p<0.05)；
图2为酪氨酸酶抑制率实验结果，图中不同字母是表示组间之间的显著差异，相同字母表示没有差异，不同表示有差异(p<0.05)。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，下面参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明第一方面提供了一种中药组合物发酵液的制备方法，包括以下步骤：
每1000mL纯水中加入20-50g石斛、10-50g玫瑰花，匀浆破壁提取5min-10min并过滤，浓缩。
该步骤中通过匀浆破壁使得组合物中活性成分更好的溶出。本文中可以根据需要匀浆破壁提取多次，具体的说，在本发明的一些实施例中，匀浆破壁提取后过滤，残渣加10-15倍量水，重复匀浆破壁提取多次后，合并滤液；从而提高活性成分的提取量，优选的，该步骤重复2-3次。
本文中所述的浓缩为本领域中的常规手段，将获得的滤液进行浓缩，获得浓缩液，具体的浓缩程度可根据实际情况进行调整，这里不再具体限定。
随后将浓缩液按0.5-5％(体积百分数)接种酵母菌株，于26-30℃培养1-2d，高温灭活，获得中药组合物发酵液。
在本发明的一些实施例中，接种的具体步骤为：浓缩液加入YM培养基，高温灭菌后，按0.5-5％接种酵母菌株。
其中，高温灭菌和高温灭活温度可根据实际情况如菌种等的不同进行调整，在本发明的一些具体的实施例中，高温灭菌温度为120-125℃，高温灭活温度为80-100℃。
本发明中的以石斛和玫瑰花作为主要活性成分，通过具有纤维素降解能力的酵母菌株发酵，从而提高中药组合物的生物活性，提高中药组合物发酵液的功效。
进一步方案，本发明中采用的酵母菌株均为具有优异纤维素降解能力的酵母菌株，具体可提及的实例包括但不限于普鲁兰类酵母、酿酒酵母、毕赤酵母、克鲁维酵母、棉病针孢酵母、光滑球拟酵母中的至少一种，这些酵母菌株具有较强的分解纤维素能力，能够增强植物细胞壁的降解能力，释放植物内含物，增强生物活性和功效。
其中，在本发明的一些具体的实施例中，采用棉病针孢酵母时取得的效果明显优于其他酵母菌株，分析其原因在于：棉病针孢酵母在提高酵母的纤维素降解活性、增强植物细胞壁的降解能力的基础上，还可对石斛和玫瑰花组合物产生针对性增效作用，可充分脱除石斛和玫瑰花所含木质素，释放内含物，提升石斛中多羟基和羧基结构的生物活性，进而显著提升水合功能。
进一步方案，在本发明一个或多个实施例中，在制备中药组合物发酵液的过程中，还添加有增效成分，所述的增效成分为银耳、枸杞子和红景天。
通过在中药组合物发酵液中添加上述由银耳、枸杞子和红景天组成的组合成分，结合加热回流提取技术，可进一步提高中药组合物发酵液的功效，特别是持久保湿、美白和抗氧化效果的提升。在本发明的一个或多个实施例中，具体的添加在步骤S1中进行，具体为：每1000mL纯水中加入20-50g石斛、10-50g玫瑰花，匀浆破壁提取5min-10min后，加入5-30g银耳、枸杞子2-20g、2-15g红景天加热煎煮，过滤，得滤液。
本发明中第二方面提供了一种中药组合物发酵液，采用如本发明第一方面所述的制备方法制得。
本发明第三方面提供了如本发明第二方面所述的中药组合物发酵液在护肤品中的应用。
本发明第四方面提供了一种护肤品，包括如本发明第二方面所述的中药组合物发酵液。
进一步方案，所述护肤品为水剂、乳液类、膏霜类、啫喱类、面膜、喷雾类、精华类或洗护类。
进一步方案，所述护肤品中，中药组合物发酵液的质量分数为2-20％。
下面通过具体实施例对本发明进行说明，需要说明的是，下面的具体实施例仅仅是用于说明的目的，而不以任何方式限制本发明的范围，另外，如无特别说明，未具体记载条件或者步骤的方法均为常规方法，所采用的试剂和材料均可从商业途径获得。
酵母的菌株筛选
将已活化好的酵母菌株(此处分别选取了酿酒酵母、毕赤酵母和棉病针孢酵母)在YM固体培养基(蛋白胨0.5％、酵母提取物0.3％、麦芽提取物0.3％、葡萄糖1.1％、琼脂2.5％)中划线培养2天；从平板培养基中挑选一个单菌落，接种到YM液体培养基(蛋白胨0.5％、酵母提取物0.3％、麦芽提取物0.3％、葡萄糖1.1％)中培养2天，得到酵母菌液。
配置筛选培养基(w/v)：羧甲基纤维素钠(CMC)0.6％，蛋白胨1.0％，酵母粉0.5％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.02％，琼脂2.0％。将获得的酵母菌液涂布到筛选培养基上，在28℃培养2d长出单菌落后，挑取单菌落点种在筛选培养基平板上，再培养3d，用0.1％的刚果红染液覆盖30min，然后用自来水冲洗，再用1.0mol/L的HCl覆盖，用自来水冲洗后观察形成水解圈的情况；比较水解圈的大小，筛选出对纤维素具有较强酶解作用的酵母菌株。
将上述初筛得到的酵母菌株分别接种到50mL培养基(w/v)(蛋白胨0.5％、酵母提取物0.3％、麦芽提取物0.3％、葡萄糖1.1％)中进行摇瓶发酵，摇床转速160r/min，28℃发酵24h，取上清液作为粗酶液进行纤维素酶活测定。用0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝5.6)溶解CMC配成0.5％的溶液作为反应底物。取500μL发酵液上清，加入2mL底物，在40℃反应1h后，沸水浴5min终止反应，将粗酶液置于沸水浴中灭活5min作为对照组。释放出的还原糖用Nelson—Somogyi法测定。在上述条件下，以每分钟水解羧甲基纤维素钠释放出相当于1.0μmol葡萄糖含量时所需的酶量为1个酶活力单位(U/mL)。CMC酶比活力单位定义为发酵液上清中每毫克蛋白中的CMC酶活力单位(U/mg)。
需要说明的是，以下实施例和对比例中接种酵母菌株采用的YM培养基的组成相同，均为蛋白胨0.5％、酵母提取物0.3％、麦芽提取物0.3％、葡萄糖1.1％。
实施例1酿酒酵母菌株中药组合物发酵液的制备
(1)将石斛除去杂质、洗净、剪成小段备用；
(2)分别称取石斛小段50g、玫瑰花15g，加入纯水1000mL，匀浆破壁提取5min，过滤，得滤液；
(3)残渣加10倍量水，按(2)中操作重复2-3次，合并滤液；
(4)滤液进行浓缩，浓缩至1000mL，获得浓缩液；
(5)取100mL浓缩液倒入500mL锥形瓶中，加入YM培养基，置入高压杀菌锅121℃，灭菌15min，取出，放冷；
(6)按1％比例接种酿酒酵母菌株，在28℃培养箱中培养1-2d；
(7)将培养好的培养液高温灭活，离心，取上清，即得中药组合物发酵液。
对比例1发酵前中药组合物溶液的制备
(1)将石斛除去杂质、洗净、剪成小段备用；
(2)分别称取石斛小段50g、玫瑰花15g，加入纯水1000mL，匀浆破壁提取5min，过滤，得滤液；
(3)残渣加10倍量水，按(2)中操作重复2-3次，合并滤液；
(4)滤液进行浓缩，浓缩至1000mL，即得发酵前中药组合物溶液。
对比例2酿酒酵母菌株石斛发酵液的制备
(1)将石斛除去杂质、洗净、剪成小段备用；
(2)称石斛小段50g，加入纯水1000mL，匀浆破壁提取5min，过滤，得滤液；
(3)残渣加10倍量水，按(2)中操作重复2-3次，合并滤液；
(4)滤液进行浓缩，浓缩至1000mL，获得浓缩液；
(5)取100mL浓缩液倒入500mL锥形瓶中，加入YM培养基，置入高压杀菌锅121℃，灭菌15min，取出，放冷；
(6)按1％比例接种酿酒酵母菌株，在28℃培养箱中培养1-2d；
(7)将培养好的培养液高温灭活，离心，取上清，即得石斛发酵液。
对比例3酿酒酵母菌株玫瑰花发酵液的制备
(1)将玫瑰花除去杂质，备用；
(2)称取玫瑰花15g，加入纯水1000mL，匀浆破壁提取5min，过滤，得滤液；
(3)残渣加10倍量水，按(2)中操作重复2-3次，合并滤液；
(4)滤液进行浓缩，浓缩至1000mL，获得浓缩液；
(5)取100mL浓缩液倒入500mL锥形瓶中，加入YM培养基，置入高压杀菌锅121℃，灭菌15min，取出，放冷；
(6)按1％比例接种酿酒酵母菌株,在28℃培养箱中培养1-2d；
(7)将培养好的培养液高温灭活，离心，取上清，即得玫瑰花发酵液。
实施例2酿酒酵母菌株中药组合物发酵液的制备
(1)将石斛除去杂质、洗净、剪成小段备用；
(2)分别称取石斛小段50g、玫瑰花15g，加入纯水1000mL，匀浆破壁提取5min，加入银耳10g、枸杞子5g、红景天5g加热煎煮，过滤，得滤液；
(3)残渣加10倍量水，按(2)中煎煮操作重复2-3次，合并滤液；
(4)滤液进行浓缩，浓缩至1000mL，获得浓缩液；
(5)取100mL浓缩液倒入500mL锥形瓶中，加入培养基，置入高压杀菌锅121℃，灭菌15min，取出，放冷；
(6)按1％比例接种酿酒酵母菌株,在28℃培养箱中培养1-2d；
(7)将培养好的培养液高温灭活，离心，取上清，即得中药组合物发酵液。
实施例3毕赤酵母菌株中药组合物发酵液的制备
(1)将石斛除去杂质、洗净、剪成小段备用；
(2)分别称取鲜铁皮石斛小段50g、玫瑰花15g，加入纯水1000mL，匀浆破壁提取5min，加入银耳10g、枸杞子5g、红景天5g加热煎煮，过滤，得滤液；
(3)残渣加10倍量水，按(2)中煎煮操作重复2-3次，合并滤液；
(4)滤液进行浓缩，浓缩至1000mL，获得浓缩液；
(5)取100mL浓缩液倒入500mL锥形瓶中，加入培养基，密闭，蒸汽灭菌，放冷；
(6)按1％比例接种毕赤酵母菌株,在28℃培养箱中培养1-2d；
(7)将培养好的培养液高温灭活，离心，取上清，即得中药组合物发酵液。
实施例4棉病针孢酵母菌株中药组合物发酵液的制备
(1)将石斛除去杂质、洗净、剪成小段备用；
(2)分别称取鲜铁皮石斛小段50g、玫瑰花15g，加入纯水1000mL，匀浆破壁提取5min，加入银耳10g、枸杞子5g、红景天5g加热煎煮，过滤，得滤液；
(3)残渣加10倍量水，按(2)中煎煮操作重复2-3次，合并滤液；
(4)滤液进行浓缩，浓缩至1000mL，获得浓缩液；
(5)取100mL浓缩液倒入500mL锥形瓶中，加入培养基，密闭，蒸汽灭菌，放冷。
(6)按1％比例接种棉病针孢酵母菌株,在28℃培养箱中培养1-2d；
(7)将培养好的培养液高温灭活，离心，取上清，即得中药组合物发酵液。
对比例4棉病针孢酵母菌株中药组合物发酵液的制备
本对比例采用同实施例4相同的实施方式，不同之处在于：将银耳替换为等量的枸杞子。
对比例5棉病针孢酵母菌株中药组合物发酵液的制备
本对比例采用同实施例4相同的实施方式，不同之处在于：将枸杞子替换为等量的红景天。
对比例6棉病针孢酵母菌株中药组合物发酵液的制备
本对比例采用同实施例4相同的实施方式，不同之处在于：将红景天替换为等量的银耳。
实施例5棉病针孢酵母菌株中药组合物发酵液的制备
(1)将石斛除去杂质、洗净、剪成小段备用；
(2)分别称取鲜铁皮石斛小段45g、玫瑰花20g，加入纯水1000mL，匀浆破壁提取5min，加入银耳5g、枸杞子20g、红景天15g加热煎煮，过滤，得滤液；
(3)残渣加12倍量水，按(2)中煎煮操作重复2-3次，合并滤液；
(4)滤液进行浓缩，浓缩至1000mL，获得浓缩液；
(5)取100mL浓缩液倒入500mL锥形瓶中，加入培养基，密闭，蒸汽灭菌，放冷。
(6)按0.5％比例接种棉病针孢酵母菌株,在28℃培养箱中培养1-2d；
(7)将培养好的培养液高温灭活，离心，取上清，即得中药组合物发酵液。
实施例6棉病针孢酵母菌株中药组合物发酵液的制备
(1)将石斛除去杂质、洗净、剪成小段备用；
(2)分别称取鲜铁皮石斛小段40g、玫瑰花100g，加入纯水2L，匀浆破壁提取5min，加入银耳20g、枸杞子10g、红景天5g加热煎煮，过滤，得滤液；
(3)残渣加15倍量水，按(2)中煎煮操作重复2-3次，合并滤液；
(4)滤液进行浓缩，浓缩至2L，获得浓缩液；
(5)取100mL浓缩液倒入500mL锥形瓶中，加入培养基，密闭，蒸汽灭菌，放冷。
(6)按3％比例接种棉病针孢酵母菌株,在28℃培养箱中培养1-2d；
(7)将培养好的培养液高温灭活，离心，取上清，即得中药组合物发酵液。
实施例7棉病针孢酵母菌株中药组合物发酵液的制备
(1)将石斛除去杂质、洗净、剪成小段备用；
(2)分别称取鲜铁皮石斛小段50g、玫瑰花10g，加入纯水1000mL，匀浆破壁提取5min，加入银耳30g、枸杞子2g、红景天2g加热煎煮，过滤，得滤液；
(3)残渣加10倍量水，按(2)中煎煮操作重复2-3次，合并滤液；
(4)滤液进行浓缩，浓缩至1000mL，获得浓缩液；
(5)取100mL浓缩液倒入500mL锥形瓶中，加入培养基，密闭，蒸汽灭菌，放冷。
(6)按5％比例接种棉病针孢酵母菌株,在28℃培养箱中培养1-2d；
(7)将培养好的培养液高温灭活，离心，取上清，即得中药组合物发酵液。
本发明功效评价实验
功效评价1人体皮肤保湿功效实验
经表皮水分流失(Trans Epidermal Water Loss,TEWL)是指通过表皮蒸发出的水分。TEWL评估皮肤屏障功能的重要参数，皮肤屏障越完好，TEWL值就越低，本实验使用CK公司Tewameter TM 300，测定皮肤表面经表皮失水率，其单位为g/hm2。
皮肤中的含水量主要与角质层保持水分能力有密切关系，皮肤含水量一般在10％-60％之间。本实验使用Corneometer CM 825型皮肤水分检测探头进行检测分析。
试液的配置：
取实施例1-4和对比例1-6中发酵液10mL分别置50mL容量瓶中，各加水定容至刻度，摇匀，分别标记为YP1-YP4和DP1-DP6。
实验方法：
采用Tewameter TM 300、Corneometer CM 825测试系统分别对皮肤经皮水分散失状况、皮肤水分含量进行测试。测试房间室温控制在25℃左右，相对湿度在35-55％之间恒定，测试前受试者应保持机体为稳定状态，将健康志愿受试者30名，随机分成5组。使用35℃左右的清水擦拭受试者双臂后，于测试环境下静坐30min后开始测试。在受试者手臂内侧距手腕8cm处为中心画一个直径为3cm的圆形标记作为受测区域；左臂区域分别涂抹YP1-YP4和DP1-DP6溶液1mL；右前臂相同位置涂抹1mL蒸馏水作为空白对照组，分别在使用前、0.5h、1h、2h、4h、8h测定受试区域的皮肤水分散失量值、皮肤水分含量值，各组求平均值。具体数据如下：
表1不同组别涂抹前后皮肤水分散失值
水份流失结果分析：通过表1中可以看出涂抹前后水分经表皮散值发生显著变化，采用酿酒酵母菌株对石斛和玫瑰花组合(YP1)进行发酵，相较于未进行发酵的石斛和玫瑰花组合(DP1)明显具有更优异的持久保湿效果；DP1和DP2组证明石斛和玫瑰花需要同时添加，才能发挥效果。作为本发明中的优选方案，在发酵液中添加银耳、枸杞子和红景天组合(YP2)的持久保持效果明显更优于未添加的YP1。本发明进一步的改进方案，以棉病针孢酵母菌株对石斛和玫瑰花组合(YP4)，其持久保持效果最佳，明显优于其他酵母菌株(YP2和YP3)。
表2不同组别溶液涂抹前后皮肤含水量
皮肤含水量结果分析：通过表2中可以看出涂抹前后皮肤含水量发生显著变化，其中，YP1组和YP2组在8h含水量均保持在40以上，具有优异的效果；而YP4组的效果最好，这是由于其在YP1组的基础上添加了其他中药成分与其配合，并采用棉病针孢酵母菌株进行发酵，可获得效果上的明显提升，故为最佳实施方案。
功效评价2体外抗氧化实验(DPPH·自由基法)
DPPH·是以氮为中心稳定的自由基，其无水乙醇溶液置于517nm波长处出现最大吸收。
存在自由基清除剂时，可结合或替代DPPH·使自由基数量减少导致吸光度减小。
试液配制：精密称取DPPH 3.0mg置10mL容量瓶中，加少量无水乙醇使其溶解，并定容至刻度，摇匀。另取2mL至100mL容量瓶中，定容摇匀，得浓度为0.006mg/mL DPPH。
取实施例1-4和对比例1-6中发酵液5mL分别置50mL容量瓶中，各加水定容至刻度，摇匀，分别标记为YP1-YP4和DP1-DP6。
实验内容：
样品管中加入3.0mL DPPH溶液和0.5mL受试溶液；对照管中加入3.0mL乙醇溶液和0.5mL受试溶液；空白管中加入3.0mL DPPH溶液和0.5mL纯水，混匀避光30min后，用3.0mL乙醇和0.5mL蒸馏水调零，在517nm波长处测吸光值；设3个平行，求平均值。按下式计算自由基清除率(％)：
结果如图1所示的，由图1中的测试结果可知，不同组别的DPPH·自由基清除率存在差异，与石斛、玫瑰花单品发酵液(DP2组和DP3)相比，YP1组中药组合物发酵液的DPPH·自由基清除效果相对较好；而YP2-4组相较于YP1组效果更佳，其中，以YP4组的DPPH·自由基清除效果最佳。
功效评价3酪氨酸酶活性抑制实验
黑色素的形成过程中，酪氨酸酶起了关键酶的作用，黑色素产生量与酪氨酸酶的活性有直接的关系。酪氨酸酶与其底物酪氨酸可发生催化反应。当在反应体系中加入酪氨酸酶活性抑制后，对催化反应可产生抑制作用，通过测定加入试剂前后于475nm处的吸光度，来评价实施例1-4和对比例1-6中的中药组合物发酵液对酪氨酸酶活性的抑制率。
实验所需溶液配制：
1：准确称取17.91g十二水磷酸氢二钠溶于蒸馏水中，用500mL容量瓶定容；
2：准确称取7.8g二水磷酸二氢钠溶于蒸馏水中，用500mL容量瓶定容；
3：取1中溶液92.6mL，2中溶液107.4mL，配成200mL pH＝6.8PBS缓冲溶液；
4：0.05％酪氨酸溶液：准确称取0.05g酪氨酸，先用少量0.1mol/L的盐酸溶解，待其溶解后用pH＝6.8的磷酸缓冲溶液(PBS)定容至100mL；
5：酪氨酸酶：酶活为100U/mL。取粉末用PBS配成浓度为16.3μg/mL，分装至-20℃保存；
6：样品的配制：将原先所配5mg/mL的溶液用甲醇稀释到2mg/mL；
7：阳性对照：取熊果苷粉末0.01g，溶于10mL的甲醇溶液，即得1mg/mL的对照品溶液。
用微量移液器分别按表3的体积准确吸取T1、T2、T3、T4中的酪氨酸、PBS及样品的反应液分别置于4个PE管中，混匀，37℃恒温10min，然后在T2、T4中分别加入1mL的酪氨酸酶，反应10min，快速用酶标仪在475nm处测定其吸光度AT1、AT2、AT3、AT4。
表3反应液组成
按以下公式计算样品抑制酪氨酸酶的活性：
其中，AT1：未加样品且未加酪氨酸酶的反应液在475nm处测得的吸光度；
AT2：未加样品加酪氨酸酶的反应液在475nm处测得的吸光度；
AT3：加样品而未加酪氨酸酶的反应液在475nm处测得的吸光度；
AT4：加样品和加酪氨酸酶的反应液在475nm处测得的吸光度；
酪氨酸酶活性抑制结果见图2，通过图2中的测试结果可以看出，不同组别的酪氨酸酶抑制率存在差异，其中，与石斛、玫瑰花单品发酵液(DP2组和DP3组)相比，YP1组中药组合物发酵液的酪氨酸酶抑制效果较好；而YP2-4组相较于YP1组效果明显提升，其中，以YP4组的酪氨酸酶抑制效果最佳。
通过上述可以看出，通过筛选特定的酵母菌株对石斛和玫瑰花组合进行发酵，能够明显提高发酵液的功效，应用在护肤品上，能够持久保持、抗氧化和美白效果得到明显提升。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种中药组合物发酵液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
每1000mL纯水中加入20-50g石斛、10-50g玫瑰花，匀浆破壁提取5-10min，加入银耳、枸杞子和红景天加热煎煮，过滤，浓缩；
按体积比0.5-5％接种酵母菌株，所述酵母菌株为棉病针孢酵母，于26-30℃培养1-2d，高温灭活，获得中药组合物发酵液。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述接种酵母菌株的具体步骤为：将浓缩液加入YM培养基，高温灭菌后，按0.5-5％接种酵母菌株。
3.一种中药组合物发酵液，其特征在于，采用如权利要求1-2任一项所述的制备方法制得。
4.一种如权利要求3所述的中药组合物发酵液在护肤品中的应用。
5.一种护肤品，其特征在于，包括如权利要求3所述的中药组合物发酵液。
6.如权利要求5所述的护肤品，其特征在于，所述护肤品为水剂、乳液类、膏霜类、啫喱类、面膜、喷雾类、精华类或洗护类。
7.如权利要求5或6所述的护肤品，其特征在于，所述护肤品中，中药组合物发酵液的质量分数为2-20％。
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