CN112891283A - 一种铁皮石斛发酵提取液、护肤品及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛发酵提取液、护肤品及其制备方法，其中铁皮石斛发酵提取液对·OH、DPPH、ABTS三种自由基的清除力高、对酪氨酸酶抑制力强，具有很好的广谱紫外吸收性；本发明护肤品以铁皮石斛发酵提取液为主要活性成分，添加少量的防晒成分以及对皮肤有益的成分，从抗自由基抗氧化、紫外线吸收、紫外线屏蔽、抗酪氨酸酶等角度增强皮肤对紫外线的防护能力、修复能力、水油平衡能力，有效降低防晒美白乳霜潜在的刺激性，解决皮肤防晒、保湿、美白、修复等问题。本发明护肤品的防晒指数高，涂抹后皮肤的自然性大大优越于同防晒指数的其他现有防晒产品，同时产品具有涂抹舒适性好、涂抹后肤色靓丽自然、稳定性好的特征。

Description

一种铁皮石斛发酵提取液、护肤品及其制备方法

技术领域

本发明涉及日用化妆品领域，具体是一种铁皮石斛发酵提取液、护肤品及其制备方法。

背景技术

皮肤的日常护理主要是防晒、保湿、抗氧化，对应的护肤品常用的有防晒霜、保湿霜、美白霜等。

日常防晒护肤品开发的关键是防晒剂的选择，常用的防晒剂分为紫外线屏蔽剂、紫外线吸收剂、生物防晒剂。紫外线屏蔽剂常用的是二氧化钛和氧化锌，虽然对皮肤无刺激性，但使用的舒适性和自然性有待提高；紫外线吸收剂多数为人工合成的有机化合物，如UVA吸收剂(如邻氨基苯甲酸酯类和二苯甲酰甲烷类等)、UVB吸收剂(如肉桂酸酯、水杨酸酯类)和广谱吸收剂(如二苯酮类、双-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪等)，这类物质对敏感性皮肤存在一定的安全隐患；生物防晒剂主要是通过抗自由基抗氧化、对紫外线的吸收综合发挥防晒作用，多为从天然动植物原料中得到的提取物，如芦荟、葡萄籽提取物、余甘果等，安全性高。

保湿是皮肤最基础的护理，皮肤含水量充盈，不仅看起来好看而且能增强皮肤对环境的抵抗力。常用的保湿成分是多羟基类化合物，如甘油、丙二醇、透明质酸等。

皮肤美白最常用的方法是抑制酪氨酸酶活性、抗自由基抗氧化、阻断黑色素合成过程中的信号传导通路的细胞因子等。常用的如维生素C及其衍生物、曲酸、熊果苷、谷胱甘肽等。

如果能开发一款具备上述3种功能的日常护肤产品，无凝会受到消费者的青睐。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术的不足，提供一种铁皮石斛发酵提取液、护肤品及其制备方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种铁皮石斛发酵提取液，其制备方法包括以下步骤：

1)发酵剂的制备

菌种活化：称取0.5g酵母菌溶于灭菌的25mL 2％糖水中，于35℃活化15～30min，得到活化的酵母菌菌液；称取0.5g枯草芽孢杆菌溶于灭菌的25mL 6％红糖水中，于37℃活化2h，得到活化的枯草芽孢杆菌菌液；称取0.5g乳酸菌溶于灭菌的25mL 2％糖水中，于37℃活化2h，得到活化的乳酸菌菌液；

将活化的酵母菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、乳酸菌菌液按1:1:1的质量比混合，得到混合菌菌液，备用；

2)铁皮石斛发酵提取液的制备

称取铁皮石斛鲜条7.5g，用0.8％NaCl溶液清洗后，切成3～5cm小段，置匀浆机中；加入100mL 100℃蒸馏水，以10000rpm破碎5～10min，得到铁皮石斛破碎液；取铁皮石斛破碎液放入250mL锥形瓶中，于115℃灭菌20min，冷却后备用；

按照2％接种量向锥形瓶中加入步骤1)中得到的混合菌菌液，置摇床150r/min、35℃连续发酵培养4天，取出锥形瓶，100℃灭菌20min，4000r/min离心10min后取上清液，即作为铁皮石斛发酵提取液。

铁皮石斛是传统名贵药材，其主要活性成分为多糖、黄酮、多酚、石斛碱、氨基酸及其衍生物等。铁皮石斛所含的有效成分多且彼此有协同效应，一般的提取方法很难兼顾不同性质的活性物质同时被提取。本发明人发现，铁皮石斛经过微生物发酵，微生物产生的酶系能够破坏药材的细胞壁，促进活性物质的释放，还可能产生次生代谢物如多酚、黄酮等；同时，微生物发酵还可以促进大分子物质如铁皮石斛多糖的适当降解，更有利于皮肤吸收。混合菌发酵存在菌种之间的协同增效作用，可以弥补单一菌株发酵不足的缺点。本发明人对铁皮石斛进行微生物液态发酵，实验测定其发酵提取液的功效，在此基础上，以铁皮石斛发酵提取液为原料，开发一款具有良好防晒性、保湿性、清除自由基的多功能性的皮肤日常护肤产品，满足市场对安全有效多功能性的护肤产品需求。

一种含有铁皮石斛发酵提取液的护肤品，该护肤品为乳霜型，其组成包括油相、水相、乳化剂和芳香剂，该护肤品的质量百分比组成中，所述的油相的含量为16～40％，所述的水相的含量为60～80％，所述的乳化剂的含量为0.5～5％，所述的芳香剂的含量为0.01～0.5％，所述的油相、水相、乳化剂和芳香剂的含量之和为100％，其中：所述的油相包括坚果油、葡萄籽油、橄榄油、辛葵酸甘油酯、合成蚕丝油、角鲨烷、维生素E、聚乙二醇二硬脂酸酯中的若干种以及紫外吸收剂，所述的紫外吸收剂为甲氧基肉桂酸乙基己酯和双-乙基氧苯酚甲氧苯基三嗪；所述的水相包括铁皮石斛发酵提取液、二氧化钛、甘油、戊二醇、己二醇、对羟基苯乙酮、尿囊素、蚕丝蛋白肽、抗坏血酸苷、EDTA二钠、柠檬酸、氯化钠和水；所述的乳化剂为600型乳化剂；所述的芳香剂为香精。

从本发明护肤品的功效性角度：

防晒成分包括：铁皮石斛发酵提取液(即生物防晒剂)、二氧化钛(即紫外遮光剂)、甲氧基肉桂酸乙基己酯(即紫外吸收剂)、双-乙基氧苯酚甲氧苯基三嗪(即紫外吸收剂)等，这些成分相互配合、协同增效，从紫外线吸收、屏蔽、抗自由基抗氧化、降低皮肤过敏率等方面增强皮肤对紫外线的防护与修复性能。在达到适宜SPF值、PF值的前提下，铁皮石斛发酵提取液的添加可以减少二氧化钛和甲氧基肉桂酸乙基己酯、双-乙基氧苯酚甲氧苯基三嗪的使用量，提高防晒效率和乳霜涂抹后皮肤的自然性，降低防晒霜的刺激性。

调理成分包括：铁皮石斛发酵提取液、尿囊素、角鲨烷、蚕丝蛋白肽、抗坏血酸苷、维生素E等，这些成分通过清除皮肤中自由基、提高对酪氨酸酶的抑制率，达到对皮肤晒后的修复和美白的效果。

保湿成分包括：铁皮石斛发酵提取液、甘油、己二醇、戊二醇、角鲨烷、尿囊素、氯化钠等的组合，这些成分可改善皮肤角质层的含水量。

从本发明护肤品乳霜的制备工艺角度：

油相是形成乳霜的必备成分，也是紫外吸收剂良好的载体，同时对皮肤有一定的滋润保湿效果。本申请中以坚果油、葡萄籽油、橄榄油、辛葵酸甘油酯、合成蚕丝油(异壬酸异壬酯)、角鲨烷、维生素E、聚乙二醇二硬脂酸酯中的若干种以及紫外吸收剂作为油相，其中，坚果油、葡萄籽油、橄榄油、辛葵酸甘油酯、合成蚕丝油、角鲨烷彼此可以替换，控制油相总含量即可。乳化剂也是形成乳霜的必备成分，本申请中采用的乳化剂为600型乳化剂(聚丙烯酰胺+聚乙二醇二丙烯酸酯)，600型乳化剂为主乳化剂，油相成分中的聚乙二醇二硬脂酸酯为辅助乳化剂。本申请中以铁皮石斛发酵提取液、二氧化钛、甘油、戊二醇、己二醇、对羟基苯乙酮、尿囊素、蚕丝蛋白肽、抗坏血酸苷、EDTA二钠、柠檬酸、氯化钠和水作为水相，水相同样是形成乳霜的必备成分。

从本发明护肤品作为日常护肤产品的角度：

抑菌剂包括：对羟基苯乙酮、己二醇、戊二醇等成分，其组合可以有效防止产品被微生物污染以及防止微生物生长，保证产品在使用储存期的卫生指标符合要求。

抗氧化剂包括：铁皮石斛发酵提取液、维生素E、EDTA二钠盐、尿囊素、抗坏血酸苷等成分，这些组合对于产品的抗氧化稳定性、延长储存期有很好的效果。

芳香成分包括：茉莉香精、玫瑰香精、玉兰花香精等，以增强产品使用过程的体验效果。

作为优选，该护肤品的质量百分比组成为：坚果油1％，葡萄籽油1％，橄榄油4％，辛葵酸甘油酯8％，合成蚕丝油1％，角鲨烷1％，维生素E1％，聚乙二醇二硬脂酸酯0.5％，甲氧基肉桂酸乙基己酯2～6.5％，双-乙基氧苯酚甲氧苯基三嗪1～4％；铁皮石斛发酵提取液26.15％，二氧化钛3％，甘油5％，戊二醇0.8～4％，己二醇2.0～2.5％，对羟基苯乙酮0.2％，尿囊素0.1％，蚕丝蛋白肽0.5～2％，抗坏血酸苷0.5％，EDTA二钠0.05％，柠檬酸0.05％，氯化钠0.1％，水25～35％；600型乳化剂1.5％；香精适量。

进一步地，该护肤品的质量百分比组成为：坚果油1％，葡萄籽油1％，橄榄油4％，辛葵酸甘油酯8％，合成蚕丝油1％，角鲨烷1％，维生素E1％，聚乙二醇二硬脂酸酯0.5％，甲氧基肉桂酸乙基己酯6.5％，双-乙基氧苯酚甲氧苯基三嗪3.5％；铁皮石斛发酵提取液26.15％，二氧化钛3％，甘油5％，戊二醇2.15％，己二醇2.15％，对羟基苯乙酮0.2％，尿囊素0.1％，蚕丝蛋白肽1.5％，抗坏血酸苷0.5％，EDTA二钠0.05％，柠檬酸0.05％，氯化钠0.1％，水30％；600型乳化剂1.5％；香精0.05％。

上述含有铁皮石斛发酵提取液的护肤品的防晒指数SPF值为44.00±3.62、PF值为17.74±4.27。

上述含有铁皮石斛发酵提取液的护肤品的制备方法，包括以下步骤：

①二氧化钛的分散：将适量的甘油、戊二醇、己二醇混合并搅拌均匀，得到混合液，用该混合液研磨分散二氧化钛，再加入纯化水均质二氧化钛得到二氧化钛分散液；

②水相的配制：将余下的甘油、戊二醇、己二醇以及铁皮石斛发酵提取液、对羟基苯乙酮、尿囊素、蚕丝蛋白肽、EDTA二钠、柠檬酸、氯化钠加入到纯化水中，搅拌至各物质溶解得到透明溶液，再加热到60～75℃，然后将步骤①中得到的二氧化钛分散液加到透明溶液中，混匀并保温，得到水相；

③油相的配制：将坚果油、葡萄籽油、橄榄油、辛葵酸甘油酯、合成蚕丝油、角鲨烷、维生素E、聚乙二醇二硬脂酸酯、甲氧基肉桂酸乙基己酯、双-乙基氧苯酚甲氧苯基三嗪和600型乳化剂混合，并加热到60～75℃，得到油相；

④乳化：在不断搅拌下将配制的水相倒入配制的油相中，保温60～75℃搅拌均质15～30min，当温度降到40～50℃，再加入抗坏血酸苷和香精，搅匀，真空脱泡，即得到护肤品。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明铁皮石斛发酵提取液的多糖、黄酮、多酚等活性成分含量高，对·OH、DPPH、ABTS三种自由基的清除力高，对酪氨酸酶抑制力强，对紫外线吸收性好，且随混合菌的发酵时间延长(0→4天)，得到的铁皮石斛发酵提取液的上述性能总体呈增强的趋势。

(2)本发明含有铁皮石斛发酵提取液的护肤品，以铁皮石斛发酵提取液为主要活性成分，添加少量的防晒成分以及一些对皮肤有益的成分如蚕丝蛋白肽、尿囊素等，从抗自由基抗氧化、紫外线吸收、紫外线屏蔽、抗酪氨酸酶等角度增强皮肤对紫外线的防护能力、修复能力、水油平衡能力，有效降低防晒美白乳霜潜在的刺激性，解决皮肤防晒、保湿、美白、修复等问题。同时产品具有涂抹舒适性好、涂抹后肤色靓丽自然的特征，产品具有良好的稳定性。

(3)本发明含有铁皮石斛发酵提取液的护肤品，其防晒指数高，SPF值为44.00±3.62、PF值为17.74±4.27，防晒效果好，涂抹后皮肤的自然性大大优越于同防晒指数的其他现有防晒产品。

附图说明

图1为不同菌种不同发酵时间对铁皮石斛发酵提取液中多糖含量的影响；

图2为不同菌种不同发酵时间对铁皮石斛发酵提取液中黄酮含量的影响；

图3为不同菌种不同发酵时间对铁皮石斛发酵提取液中多酚含量的影响；

图4为不同菌种不同发酵时间的铁皮石斛发酵提取液对·OH自由基的清除力；

图5为不同菌种不同发酵时间的铁皮石斛发酵提取液对DPPH自由基的清除力；

图6为不同菌种不同发酵时间的铁皮石斛发酵提取液对ABTS自由基的清除力；

图7为不同菌种不同发酵时间的铁皮石斛发酵提取液对酪氨酸酶的抑制力；

图8为经混合菌发酵后的铁皮石斛发酵提取液的紫外吸收光谱图；

图9为不含铁皮石斛的对比例4的乳霜的SPF值、PF值测定结果；

图10为含铁皮石斛提取液的对比例5的乳霜的SPF值、PF值测定结果；

图11为含铁皮石斛发酵提取液的实施例2的乳霜的SPF值、PF值测定结果；

图12为涂抹含铁皮石斛发酵提取液乳霜产品后皮肤表皮层水分的变化；

图13为涂抹含铁皮石斛发酵提取液乳霜产品后皮肤表皮层油分的变化。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：一种铁皮石斛发酵提取液，其制备方法包括以下步骤：

1)发酵剂的制备

菌种活化：称取0.5g酵母菌溶于灭菌的25mL 2％糖水中，于35℃活化15～30min，得到活化的酵母菌菌液；称取0.5g枯草芽孢杆菌溶于灭菌的25mL 6％红糖水中，于37℃活化2h，得到活化的枯草芽孢杆菌菌液；称取0.5g乳酸菌溶于灭菌的25mL 2％糖水中，于37℃活化2h，得到活化的乳酸菌菌液；

将活化的酵母菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、乳酸菌菌液按1:1:1的质量比混合，得到混合菌菌液，备用；

2)铁皮石斛发酵提取液的制备

称取铁皮石斛鲜条7.5g，用0.8％NaCl溶液清洗后，切成3～5cm小段，置匀浆机中；加入100mL 100℃蒸馏水，以10000rpm破碎5～10min，得到铁皮石斛破碎液；取铁皮石斛破碎液放入250mL锥形瓶中，于115℃灭菌20min，冷却后备用；

按照2％接种量向锥形瓶中加入步骤1)中得到的混合菌菌液，置摇床150r/min、35℃连续发酵培养4天，取出锥形瓶，100℃灭菌20min，4000r/min离心10min后取上清液，即作为铁皮石斛发酵提取液。

对比例1：一种铁皮石斛发酵提取液，与实施例1的区别在于，对比例1中发酵剂以酵母菌作为单一菌种，培养温度为28℃。

对比例2：一种铁皮石斛发酵提取液，与实施例1的区别在于，对比例2中发酵剂以枯草芽孢杆菌作为单一菌种，培养温度为37℃。

对比例3：一种铁皮石斛发酵提取液，与实施例1的区别在于，对比例2中发酵剂以乳酸菌作为单一菌种，培养温度为37℃。

一、4种铁皮石斛发酵提取液的活性成分含量测定

分别对实施例1、对比例1-3这4种铁皮石斛发酵提取液进行活性成分含量测定，包括多糖含量、黄酮含量、多酚含量测定。不同菌种发酵第4天铁皮石斛发酵提取液中3种活性成分含量的变化见表1。

(1)多糖含量

采用苯酚-硫酸法测定。4种铁皮石斛发酵提取液中多糖含量如图1。铁皮石斛经不同菌种发酵后，铁皮石斛多糖含量随发酵时间而减少，总趋势是4d＜3d＜2d＜1d＜0d(枯草芽孢杆菌除外，0d代表未发酵组)。与单一菌种比较，混菌发酵后铁皮石斛多糖含量减少幅度最多。由表1可知，第4d与0d比较，铁皮石斛多糖含量减少了32.89％。

(2)黄酮含量

采用芦丁比色法测定。铁皮石斛发酵提取液中黄酮含量如图2。铁皮石斛经不同菌种发酵后，黄酮含量随发酵时间而增加，总趋势是4d＞3d＞2d＞1d＞0d(乳酸菌除外)。由表1可知，不同微生物发酵对铁皮石斛发酵提取液中黄酮含量的影响是：混菌>枯草芽孢杆菌>酵母菌>乳酸菌，与未发酵组0d比较，其中，混菌发酵4d的铁皮石斛液中黄酮含量提高了125.65％。

(3)多酚含量

采用Folin-Ciocalte比色法测定。铁皮石斛发酵提取液中多酚含量如图3。铁皮石斛经不同菌种发酵后，多酚含量随发酵时间而增加，总趋势是4d＞3d＞2d＞1d＞0d。由表1知，混菌发酵对铁皮石斛发酵提取液中多酚含量提高明显，影响是：混菌>枯草芽孢杆菌>乳酸菌>酵母菌，与未发酵组0d比较，其中，混菌发酵4d的铁皮石斛液中多酚含量提高了199.02％。

表1不同菌种发酵第4天铁皮石斛发酵提取液中3种活性成分含量的变化

二、4种铁皮石斛发酵提取液对自由基的清除力

自由基清除率计算公式：自由基清除率(％)＝[1-(A_待测-A_本底)/A_空白]×100

不同菌种发酵第3天铁皮石斛发酵提取液对三种自由基清除力的变化比较见表2。

(1)羟自由基(·OH)

采用水杨酸法测定。向试管中依次加入1mL铁皮石斛发酵提取液、1mL 9mmoL/LFeSO₄·7H₂O、2mL 9mmoL/L水杨酸、0.1mL 9mmoL/L H₂O₂和5mL去离子水至总体积9.10mL作为待测组，于37℃恒温水浴10min，冷却至室温，用0.8μm滤膜过滤后，用去离子水调零，于510nm处测定A_待测。以去离子水代替铁皮石斛液作为空白组测定A_空白，去离子水代替水杨酸作为本底组测定A_本底，计算自由基清除率。图4为不同菌种不同发酵时间的铁皮石斛发酵提取液对·OH自由基的清除力。由图4可知，经不同菌种发酵的铁皮石斛提取液对·OH的清除能力随发酵时间而增强，总趋势是4d＞3d＞2d＞1d＞0d(酵母菌除外)。由表2可知，发酵第3天，铁皮石斛发酵提取液对·OH清除率是：混菌＞枯草芽孢杆菌＞乳酸菌＞酵母菌。与未发酵空白组比较，混菌发酵的铁皮石斛液对·OH清除率提高了43.03％。

(2)DPPH自由基

向试管中依此加入1mL铁皮石斛发酵提取液、0.5mL 0.8mmoL/L DPPH溶液和4mL去离子水至总体积5.50mL作为待测组，常温避光反应30min，再用0.8μm滤膜过滤后，以去离子水调零，于517nm处测定A_待测。以去离子水代替铁皮石斛液作为空白组，95％乙醇代替DPPH溶液作为本底组。图5为不同菌种不同发酵时间的铁皮石斛发酵提取液对DPPH自由基的清除力。由图5可知，经不同菌种发酵的铁皮石斛提取液对DPPH自由基的清除能力随发酵时间呈先增强再降低的变化，发酵第3天达到峰值，对DPPH自由基的清除率是：混菌＞枯草芽孢杆菌＞乳酸菌＞酵母菌。由表2可知，与未发酵空白组比较，混菌发酵3天铁皮石斛液对DPPH自由基清除率提高了60.05％。

(3)ABTS自由基

精密移取5mL7mmol/LABTS溶液和88μL过硫酸钾于棕色瓶内进行混合，常温避光静置过夜，形成ABTS自由基储备液，适当稀释至A_734nm为0.7±0.02范围内。向试管中加入0.2mL样液、6mL ABTS溶液和0.2mL去离子水至总体积6.40mL作为待测组，用去离子水调零，于734nm处测定A_待测。以去离子水代替铁皮石斛液作为空白组，去离子水代替ABTS溶液作为本底组。图6不同菌种不同发酵时间的铁皮石斛发酵提取液对ABTS自由基的清除力。由图6可知，经不同菌种发酵的铁皮石斛提取液对ABTS自由基的清除能力随发酵时间呈先增强再降低的变化，发酵第3天达到峰值(枯草芽孢杆菌除外)，对ABTS自由基的清除率是：混菌＞枯草芽孢杆菌＞酵母菌≈乳酸菌。由表2可知，与未发酵空白组比较，混菌发酵3天的铁皮石斛液对ABTS自由基清除率提高了94.80％。

表2不同菌种发酵第3天铁皮石斛发酵提取液对三种自由基清除力的变化比较

综上可见，铁皮石斛发酵提取液对·OH、DPPH、ABTS三种自由基的清除能力总体随发酵时间呈先增强(0→3天)再降低(4天)的趋势。其中经混菌与枯草芽孢杆菌发酵的铁皮石斛发酵提取液对三种自由基的清除率强于乳酸菌和酵母菌。

三、4种铁皮石斛发酵提取液对酪氨酸酶的抑制作用

每组实验由四只试管A、B、C、D组成，每只试管按表3从上往下的顺序依次加入各试剂，混匀，于37℃恒温水浴锅中避光保温30分钟。用去离子水调零，测定并计算表3中各试管溶液于475nm处的A，计算公式如下：

图7为不同菌种不同发酵时间的铁皮石斛发酵提取液对酪氨酸酶的抑制力比较。由图7可知，经不同菌种发酵得到的铁皮石斛发酵提取液随发酵时间延长对酪氨酸酶的抑制作用增强，第3天达到相对高点，表现为：混菌(88.17±1.61％)＞乳酸菌(86.69±1.22％)＞酵母菌(82.92±1.98％)＞枯草芽孢杆菌(39.21±0.32％)。表明微生物发酵有助于增强铁皮石斛对酪氨酸酶的抑制力。

表3对酪氨酸酶抑制率测定的反应液组成

四、4种铁皮石斛发酵提取液对紫外线的吸收作用

将不同微生物发酵的石斛提取物置于1cm×1cm×5cm石英色皿中，以蒸馏水为空白，用紫外可见分光光度计在250～400nm范围内进行光谱扫描，280～320nm属于紫外线B区，320～400nm属于紫外线A区。读取290、295、300、305、310、315和320nm波长处的吸光度值。根据曼苏尔方程计算对紫外线B的SPF值：

式中，CF为校正系数(10)、EE(λ)为红斑作用光谱、I(λ)为太阳强度光谱、Abs(λ)为波长λ处的吸收值。290、295、300、305、310、315、320nm对应EE(λ)×I(λ)值分别为0.0150、0.0817、0.2874、0.3278、0.1864、0.0837和0.0180。

图8为经混合菌发酵后的铁皮石斛发酵提取液的紫外吸收光谱图。由图8可知，铁皮石斛发酵提取液主要吸收区域是280～300nm和370～400nm范围内，表明铁皮石斛发酵提取液对紫外线B与A区都有吸收，且发酵后吸收率大大提高，见表4。

表4铁皮石斛的混菌发酵提取液的SPF值

SPF值越高，抗紫外线B的效果越好。表4表明，经混合菌发酵后的铁皮石斛发酵提取液的SPF值与未发酵液相比较，发酵4天后抗紫外线B的效果提高了80.09％。

由上述实验结果可知：铁皮石斛经微生物发酵后，黄酮、多酚活性成分的含量增加，抗自由基和抗酪氨酸酶的活性增强，对紫外线B、紫外线A的吸收效果提高。同时，铁皮石斛含有丰富的多糖类物质，经微生物发酵后降解为分子量较小的多羟基糖类或寡糖，是很好的保湿成分。这些物质基础为其作为功效性原料开发防晒、美白、保湿类化妆品提供了依据。

实施例2：一种含有铁皮石斛发酵提取液的护肤品，该护肤品为乳霜型，其质量百分比组成见表5。

表5含有铁皮石斛发酵提取液的乳霜的配方

注：100mL铁皮石斛发酵提取液相当于7.5g铁皮石斛鲜条。

实施例2的含有铁皮石斛发酵提取液的护肤品的制备方法包括以下步骤：

①二氧化钛的分散：将适量的甘油、戊二醇、己二醇混合并搅拌均匀，得到混合液，用该混合液研磨分散二氧化钛，再加入纯化水均质二氧化钛得到二氧化钛分散液；

②水相的配制：将余下的甘油、戊二醇、己二醇以及铁皮石斛发酵提取液、对羟基苯乙酮、尿囊素、蚕丝蛋白肽、EDTA二钠、柠檬酸、氯化钠加入到纯化水中，搅拌至各物质溶解得到透明溶液，再加热到70℃，然后将步骤①中得到的二氧化钛分散液加到透明溶液中，混匀并保温，得到水相；

③油相的配制：将坚果油、葡萄籽油、橄榄油、辛葵酸甘油酯、合成蚕丝油、角鲨烷、维生素E、聚乙二醇二硬脂酸酯、甲氧基肉桂酸乙基己酯、双-乙基氧苯酚甲氧苯基三嗪和600型乳化剂混合，并加热到70℃，得到油相；

④乳化：在不断搅拌下将配制的水相倒入配制的油相中，保温70℃搅拌均质20min，当温度降到45℃，再加入抗坏血酸苷和香精，搅匀，真空脱泡，即得到护肤品。

对比例4：一种乳霜，与实施例2的区别在于，对比例4将表5中的铁皮石斛发酵提取液用同量的纯净水代替，其他成分不变，制备乳霜。

对比例5：一种乳霜，与实施例2的区别在于，对比例5将表5中的铁皮石斛发酵提取液用同量的铁皮石斛提取液(即未经微生物发酵的提取液)代替，其他成分不变，制备乳霜。五、3种乳霜产品的SPF值和PF值测定

实施例2、对比例4-5这3种乳霜产品的SPF值和PF值测定结果如图9～11和表6所示。图9～11中，实线代表在同一样品板的六个不同位置处测定的紫外吸收光谱图，虚线代表这六个位置测定的平均紫外吸收光谱图。

由表6可知，含铁皮石斛发酵提取液的乳霜大大增强了产品的防紫外线B、紫外线A的效果，测得实施例2的乳霜产品的SPF值为44.00±3.62、PF值为17.74±4.27。与对比例4比较，SPF值和PF值分别提高了82.42％、107.24％，与对比例5比较，SPF值和PF值分别提高了28.96％、72.07％。

表6 3种乳霜产品的SPF值和PF值

六、含铁皮石斛发酵提取液乳霜产品涂抹后对皮肤的水油保持性测试

每一志愿者以左臂相同地区做为测试区、对应右臂区域为空白区。测试前统一洗净测试部位，5分钟后，于测试区均匀涂抹适量(2mg/cm²)实施例2的乳霜产品，利用数字皮肤水份检测仪检测志愿者涂抹区域皮肤水分以及油分随时间的变化，评价乳霜的对皮肤水分与油分的保湿性能。如图12、13。从时间柱可以看出涂抹一段时间后，涂抹组的皮肤水分、油分含量始终高于对照组，表现出较强的对皮肤水分油分的保湿功效，

可见，实施例2的含有铁皮石斛发酵提取液的乳霜产品防晒效果好，特别是在SPF值达到44.00±3.62情况下，涂抹后皮肤的自然性大大优越于同防晒指数的其他现有防晒产品。七、实施例2的含铁皮石斛发酵提取液的乳霜产品的皮肤刺激性试验

将实施例2的乳霜产品涂抹于20名健康志愿者的手背及耳部，连续涂抹7天，均未发现发红、过敏等异常现象。

八、实施例2的含铁皮石斛发酵提取液的乳霜产品的基础理化指标和微生物指标

实施例2的乳霜产品的基础理化指标和微生物指标见表7。

表7实施例2的乳霜产品的基础理化指标和微生物指标

其中，菌落总数测定，采用的样品是将实施例2的乳霜产品置于40℃烘箱中放置10天后，取样测定的结果。

Claims (6)

1.一种铁皮石斛发酵提取液，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：

1)发酵剂的制备

菌种活化：称取0.5g酵母菌溶于灭菌的25mL 2％糖水中，于35℃活化15～30min，得到活化的酵母菌菌液；称取0.5g枯草芽孢杆菌溶于灭菌的25mL 6％红糖水中，于37℃活化2h，得到活化的枯草芽孢杆菌菌液；称取0.5g乳酸菌溶于灭菌的25mL 2％糖水中，于37℃活化2h，得到活化的乳酸菌菌液；

将活化的酵母菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、乳酸菌菌液按1:1:1的质量比混合，得到混合菌菌液，备用；

2)铁皮石斛发酵提取液的制备

称取铁皮石斛鲜条7.5g，用0.8％NaCl溶液清洗后，切成3～5cm小段，置匀浆机中；加入100mL 100℃蒸馏水，以10000rpm破碎5～10min，得到铁皮石斛破碎液；取铁皮石斛破碎液放入250mL锥形瓶中，于115℃灭菌20min，冷却后备用；

按照2％接种量向锥形瓶中加入步骤1)中得到的混合菌菌液，置摇床150r/min、35℃连续发酵培养4天，取出锥形瓶，100℃灭菌20min，4000r/min离心10min后取上清液，即作为铁皮石斛发酵提取液。

2.一种含有铁皮石斛发酵提取液的护肤品，其特征在于，该护肤品为乳霜型，其组成包括油相、水相、乳化剂和芳香剂，该护肤品的质量百分比组成中，所述的油相的含量为16～40％，所述的水相的含量为60～80％，所述的乳化剂的含量为0.5～5％，所述的芳香剂的含量为0.01～0.5％，所述的油相、水相、乳化剂和芳香剂的含量之和为100％，其中：所述的油相包括坚果油、葡萄籽油、橄榄油、辛葵酸甘油酯、合成蚕丝油、角鲨烷、维生素E、聚乙二醇二硬脂酸酯中的若干种以及紫外吸收剂，所述的紫外吸收剂为甲氧基肉桂酸乙基己酯和双-乙基氧苯酚甲氧苯基三嗪；所述的水相包括铁皮石斛发酵提取液、二氧化钛、甘油、戊二醇、己二醇、对羟基苯乙酮、尿囊素、蚕丝蛋白肽、抗坏血酸苷、EDTA二钠、柠檬酸、氯化钠和水；所述的乳化剂为600型乳化剂；所述的芳香剂为香精。

3.根据权利要求2所述的一种含有铁皮石斛发酵提取液的护肤品，其特征在于，该护肤品的质量百分比组成为：坚果油1％，葡萄籽油1％，橄榄油4％，辛葵酸甘油酯8％，合成蚕丝油1％，角鲨烷1％，维生素E1％，聚乙二醇二硬脂酸酯0.5％，甲氧基肉桂酸乙基己酯2～6.5％，双-乙基氧苯酚甲氧苯基三嗪1～4％；铁皮石斛发酵提取液26.15％，二氧化钛3％，甘油5％，戊二醇0.8～4％，己二醇2.0～2.5％，对羟基苯乙酮0.2％，尿囊素0.1％，蚕丝蛋白肽0.5～2％，抗坏血酸苷0.5％，EDTA二钠0.05％，柠檬酸0.05％，氯化钠0.1％，水25～35％；600型乳化剂1.5％；香精适量。

4.根据权利要求3所述的一种含有铁皮石斛发酵提取液的护肤品，其特征在于，该护肤品的质量百分比组成为：坚果油1％，葡萄籽油1％，橄榄油4％，辛葵酸甘油酯8％，合成蚕丝油1％，角鲨烷1％，维生素E1％，聚乙二醇二硬脂酸酯0.5％，甲氧基肉桂酸乙基己酯6.5％，双-乙基氧苯酚甲氧苯基三嗪3.5％；铁皮石斛发酵提取液26.15％，二氧化钛3％，甘油5％，戊二醇2.15％，己二醇2.15％，对羟基苯乙酮0.2％，尿囊素0.1％，蚕丝蛋白肽1.5％，抗坏血酸苷0.5％，EDTA二钠0.05％，柠檬酸0.05％，氯化钠0.1％，水30％；600型乳化剂1.5％；香精0.05％。

5.根据权利要求4所述的一种含有铁皮石斛发酵提取液的护肤品，其特征在于，该护肤品的防晒指数SPF值为44.00±3.62、PF值为17.74±4.27。

6.权利要求2-5中任一项所述的一种含有铁皮石斛发酵提取液的护肤品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

①二氧化钛的分散：将适量的甘油、戊二醇、己二醇混合并搅拌均匀，得到混合液，用该混合液研磨分散二氧化钛，再加入纯化水均质二氧化钛得到二氧化钛分散液；

②水相的配制：将余下的甘油、戊二醇、己二醇以及铁皮石斛发酵提取液、对羟基苯乙酮、尿囊素、蚕丝蛋白肽、EDTA二钠、柠檬酸、氯化钠加入到纯化水中，搅拌至各物质溶解得到透明溶液，再加热到60～75℃，然后将步骤①中得到的二氧化钛分散液加到透明溶液中，混匀并保温，得到水相；

③油相的配制：将坚果油、葡萄籽油、橄榄油、辛葵酸甘油酯、合成蚕丝油、角鲨烷、维生素E、聚乙二醇二硬脂酸酯、甲氧基肉桂酸乙基己酯、双-乙基氧苯酚甲氧苯基三嗪和600型乳化剂混合，并加热到60～75℃，得到油相；

④乳化：在不断搅拌下将配制的水相倒入配制的油相中，保温60～75℃搅拌均质15～30min，当温度降到40～50℃，再加入抗坏血酸苷和香精，搅匀，真空脱泡，即得到护肤品。

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