CN113181088A - 胶原酶抑制剂及其制备方法和包含该胶原酶抑制剂的透肌水 - Google Patents
胶原酶抑制剂及其制备方法和包含该胶原酶抑制剂的透肌水 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种胶原酶抑制剂及其制备方法和包含该胶原酶抑制剂的透肌水。所述胶原酶抑制剂包括：野菊花提取物和金盏花提取物，以所述胶原酶抑制剂的总质量计，所述野菊花提取物的加入量为26.2‑73.8％，所述金盏花提取物的加入量为26.2‑73.8％。本发明的胶原酶抑制剂对胶原酶活性的抑制作用优异，且对人体无副作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种胶原酶抑制剂及其制备方法和包含该胶原酶抑制剂的透肌水，属于化妆品领域。
背景技术
胶原蛋白主要由真皮层的成纤维细胞产生，是真皮层的主要成分，能够维持皮肤的结构，赋予皮肤韧性和弹性。胶原蛋白的含量及分布决定了皮肤的年轻与否。然而，胶原蛋白含量的异常减少会造成真皮层变薄，皮肤松弛，失去弹性，出现皱纹，影响人们的生活质量。随着对胶原蛋白研究的不断深入，研究者发现胶原酶在皮肤胶原蛋白的动态平衡中扮演重要角色，它的过量表达和异常激活是导致皮肤衰老的主要原因之一。因此，抑制胶原酶的活性可以阻断皮肤胶原蛋白的降解，增加胶原蛋白的含量，实现抗衰的效果。
针对影响皮肤胶原蛋白含量的因素，皮肤抗衰和皮肤护理的主要途径包括以下几个方面：(1)通过刺激真皮层成纤维细胞的增殖，增加胶原蛋白的合成；(2)通过活性因子刺激成纤维细胞合成胶原蛋白的速度，增加真皮层胶原蛋白的总量；(3)通过抑制真皮层中胶原蛋白降解的关键酶-胶原酶的催化活性，减缓胶原蛋白的降解速度，达到抗衰的目的；(4)通过防晒，防止阳光中紫外线对皮肤中胶原蛋白的破坏，减缓皮肤光老化；(5)通过使用抗氧剂清除皮肤中的过量氧自由基，减缓其对胶原酶的诱导表达和生物大分子的异常交联。
现有技术中，为了防止皮肤松弛，失去弹性，出现皱纹等，保持皮肤年轻，人们提出了混合有水解胶原蛋白、玻尿酸、多肽、视黄醇及其衍生物等各种成分的抗衰产品。可是，如果大量使用这些成分，在抗衰真实效果、使用肤感和安全性上产生诸多问题。如水解胶原蛋白分子量过大，不易透过人体的肌肤屏障到达真皮层；玻尿酸无法从本质上减缓胶原蛋白的流失；多肽和视黄醇对皮肤有一定的刺激性和安全风险等等。
随着人们对皮肤健康关注度的增高，开发具有安全稳定、效果明显且性价比高的天然抗衰剂，已成为当前医药和化妆品行业的主要研究方向之一，具有非常好的发展前景。
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术中，水解胶原蛋白分子量过大，不易透过人体的肌肤屏障到达真皮层；玻尿酸无法从本质上减缓胶原蛋白的流失；多肽和视黄醇对皮肤有一定的刺激性和安全风险等问题，本发明首先提供了一种胶原酶抑制剂及其制备方法。
进一步地，本发明还提供一种包含该胶原酶抑制剂的透肌水，本发明的透肌水具有优异的抗衰效果。
进一步地，本发明还提供一种透肌水的制备方法，该制备方法操作简单，原料易于获取。
用于解决问题的方案
本发明提供一种胶原酶抑制剂，其包括：野菊花提取物和金盏花提取物，以所述胶原酶抑制剂的总质量计，所述野菊花提取物的加入量为26.2-73.8％，所述金盏花提取物的加入量为26.2-73.8％。
根据本发明的胶原酶抑制剂，其中，所述野菊花提取物与所述金盏花提取物的质量比为1:0.36～2.8，优选1:0.365～2.6，更优选1:0.37～2.5，进一步优选为1:0.375～2.4，更进一步优选1:0.38～2.3，再进一步优选1:0.385～2.1。
根据本发明的胶原酶抑制剂，其中，所述胶原酶为间质胶原酶。
本发明还提供一种根据本发明的胶原酶抑制剂的制备方法，其包括将所述胶原酶抑制剂的各组分混合的步骤。
本发明又提供一种透肌水，其包括根据本发明的胶原酶抑制剂以及促渗透剂，以所述透肌水的总质量计，所述胶原酶抑制剂的加入量为0.01-10％；所述促渗透剂的加入量为0.01-10％。
根据本发明的透肌水，其中，所述促渗透剂包括丙二醇、双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯以及壳聚糖中的一种或两种以上的组合。
根据本发明的透肌水，其中，所述透肌水还包括保湿剂、增稠剂、防腐剂、皮肤调理剂、增溶剂、皮肤美白剂、舒敏剂、芳香剂中的一种或两种以上的组合；其中，
以所述透肌水的总质量计，所述保湿剂的加入量为0.01-20％；所述增稠剂的加入量为0.02-0.8％；所述防腐剂的加入量为0.01-1.5％；所述皮肤调理剂的加入量为0.01-5％；所述增溶剂的加入量为0.01-0.5％；所述皮肤美白剂的加入量为0.01-5％；所述舒敏剂的加入量为0.01-5％；所述芳香剂的加入量为0.005-0.5％。
根据本发明的透肌水，其中，所述皮肤调理剂包括三角褐指藻提取物、巨藻提取物、南极洲丛梗藻提取物、勃那特螺旋藻提取物、墨角藻提取物、小球藻发酵产物、水解胶原蛋白、绿藻提取物、红藻门藻提取物、棕榈酰三肽-5、乙酰基六肽-8、褐藻提取物、尿囊素、白果槲寄生叶提取物、白茅根提取物、天冬氨酸镁、仙人掌提取物中的一种或两种以上的组合。
根据本发明的透肌水，其中，所述皮肤美白剂包括烟酰胺、甘草酸二钾、天女木兰提取物、曲酸及其衍生物、熊果苷、维生素C及其衍生物中的一种或两种以上的组合；和/或，
所述舒敏剂包括北美金缕梅花水、积雪草提取物、姜根提取物、红没药醇中的一种或两种以上的组合。
本发明再提供一种根据本发明的透肌水的制备方法，其包括：将所述透肌水的各组分混合的步骤。
发明的效果
本发明的胶原酶抑制剂对胶原酶活性的抑制作用优异，且对人体无副作用。
本发明的透肌水的配方温和，能够有效改善皮肤弹性，从而起到抗衰的作用。
本发明的透肌水的制备方法的操作简单，原料易于获取，且能够批量生产。
附图说明
图1示出了本发明对比例1-5的金盏花提取物的对数质量浓度-胶原酶活性抑制率的关系图；
图2示出了本发明对比例6-10的野菊花提取物的对数质量浓度-胶原酶活性抑制率的关系图；
图3示出了本发明实施例1-5的胶原酶抑制剂的对数质量浓度-胶原酶活性抑制率的关系图；
图4示出了本发明实施例1-5的胶原酶抑制剂中金盏花提取物的含量与相互作用系数的关系图。
图5示出了本发明应用实施例1-5以及应用对比例1-8的皮肤弹性变化率的对比图。
具体实施方式
以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
需要说明的是：
本说明书中，使用“可以”或“可”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
如无特殊声明，本发明所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所允许的误差。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
<第一方面>
本发明的第一方面提供了一种胶原酶抑制剂，所述胶原酶抑制剂包括：野菊花提取物和金盏花提取物，以所述胶原酶抑制剂的总质量计，所述野菊花提取物的加入量为26.2-73.8％，所述金盏花提取物的加入量为26.2-73.8％。
本发明的发明人发现，使用金盏花提取物和野菊花提取物的组合，可以产生优异的协同作用，从而可以抑制胶原酶的活性，以实现抗衰的作用。
具体地，在本发明中，所述野菊花提取物与所述金盏花提取物的质量比为1:0.36～2.8，优选1:0.365～2.6，更优选1:0.37～2.5，进一步优选为1:0.375～2.4，更进一步优选1:0.38～2.3，再进一步优选1:0.385～2.1。当野菊花提取物与所述金盏花提取物的质量比在上述范围内时，能够进一步具有协同作用，抑制胶原酶活性的效果优异。
对于本发明的胶原酶抑制剂的制备方法，不作特别限定，可以是本领域常用的方式，具体可以包括将胶原酶抑制剂的各组分混合的步骤。例如采用常规混合的方式，使野菊花提取物与金盏花提取物混合均匀。
胶原酶
胶原酶属于基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase,MMPs)中的一类。基质金属蛋白酶是一类生物活性依赖于锌离子、有降解细胞外基质(Extra-Cellar Matrix,ECM)能力的内肽酶家族。胶原酶的主要作用是降解真皮中的胶原蛋白及弹性蛋白，它的组织型抑制剂(Tissue Inhibitors of Metalloproteinase,TIMPs)通过与其高度保守的锌结合位点共价结合而特异性抑制胶原酶的活性，共同调节基质代谢，维持真皮层的结构。
胶原酶包括间质胶原酶(MMP-1)、多形核胶原酶(MMP-8)以及胶原酶3(MMP-13)。其中，间质胶原酶的又称胶原酶-1，间质胶原酶具有多种功能，能作用于不同的底物。间质胶原酶能降解一些基质分子，如聚集蛋白聚糖、多能聚糖、基膜蛋白聚糖、酪蛋白、巢蛋白、丝氨酸蛋白抑制剂和黏蛋白-C。因此，间质胶原酶在细胞外基质的生理修复中起关键作用。本发明主要是基于间质胶原酶在皮肤衰老过程中的重要作用，将抑制间质胶原酶活性，从而减少皮肤炎症反应及皱纹，作为延缓衰老的途径，以实现抗衰的作用。
需要说明的是，本发明的胶原酶抑制剂的目的是抑制胶原酶的活性，例如：抑制间质胶原酶的活性，而非胶原酶的表达。
野菊花提取物
野菊(Dendranthema indicum(L.)Des Moul.)为菊科(Compositae)菊属(Dendranthema)多年生草本植物。野菊的叶、花及全草入药。味苦、辛、凉，清热解毒，疏风散热，散瘀，明目，降血压。野菊具有抗炎、免疫调节、抗焦虑、抑菌和抗病毒等多种作用。
野菊花含萜类成分较多，主要有单萜、倍半萜、二倍半萜、三萜及其含氧衍生物，其大部分存在于挥发油中。黄酮类化合物是野菊花中含量最多、最主要的活性成分。野菊花还含有绿原酸、多糖、鞣质等成分。野菊花水提液对离体大鼠心、脑、肝、肾LPO均有不同程度的抑制作用，且能提高体内氧化酶的活力。
在本发明中，以所述胶原酶抑制剂的总质量计，野菊花提取物的加入量为26.2-73.8％。当野菊花提取物的加入量在26.2-73.8％时，可以有效抑制胶原酶的活性。当野菊花提取物的加入量为26.2-73.8％时，可以有效抑制胶原酶的活性。具体地，所述野菊花提取物的加入量可以是30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％等。
金盏花提取物
金盏花(Calendula officinalis L.)属菊科(Compositae)金盏花属(Calendula)一年生草本植物。原产于欧洲南部及地中海沿岸，现在我国四川、贵州、广东、广西等省均有栽培，可用于食品、医药和化妆品业。
金盏花主要含有挥发油、总皂苷类、多酚、色素类、黄酮等多种有效成分，有健胃、收敛、止血和愈伤的功效，对皮肤有滋润、抗炎和促进细胞再生等作用。其中，金盏花总黄酮提取液在UVA和UVB有强吸收，对紫外线有一定的防护能力；金盏花黄色素有明显地抗油脂氧化效果。
在本发明中，以所述胶原酶抑制剂的总质量计，金盏花提取物的加入量为26.2-73.8％。当金盏花提取物的加入量为26.2-73.8％时，可以有效抑制胶原酶的活性。具体地，所述金盏花提取物的加入量可以是30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％等。
<第二方面>
本发明的第二方面提供了一种透肌水，其包括根据本发明第一方面所述的胶原酶抑制剂以及促渗透剂；本发明通过添加合适含量的胶原酶抑制剂，能够抑制胶原酶的活性，特别是间质胶原酶的活性，使得本发明的透肌水具有优异的抗衰效果，能够改善皮肤弹性。为了促进皮肤对胶原酶抑制剂的吸收，本发明的透肌水还使用促渗透剂。通过使用促渗透剂，可以使本发明的胶原酶抑制剂得到更大程度的发挥。
其中，以所述透肌水的总质量计，所述胶原酶抑制剂的加入量为0.01-10％，例如：0.5％、1％、2％、3％、5％、6％、7％、8％等。当胶原酶抑制剂的加入量在0.01-10％之间时，使用胶原酶抑制剂后的皮肤弹性增加。当胶原酶抑制剂的加入量小于0.01％时，不能起到抗衰的作用；当胶原酶抑制剂的加入量大于10％时，胶原酶抑制剂的含量过高，成本过高，且相应的抗衰效果的提升不明显。
以所述透肌水的总质量计，所述促渗透剂的加入量为0.01-10％，例如：0.5％、1％、2％、3％、5％、6％、7％、8％等。当促渗透剂的加入量小于0.01％时，促渗透效果不明显。当促渗透剂的加入量大于10％时，不能进一步起到促渗透的作用。
在本发明中，所述促渗透剂包括丙二醇、双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯以及壳聚糖中的一种或两种以上的组合。本发明优选使用丙二醇和双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯的组合，丙二醇和双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯之间具有协同作用，能够使得胶原酶抑制剂的吸收效果更加优异。
当使用丙二醇和双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯的组合作为促渗透剂时，以所述透肌水的总质量计，丙二醇的加入量为0.01-5％，双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯的加入量为0.01-5％。当丙二醇的加入量为0.01-5％，双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯的加入量为0.01-5％时，可以有效改善胶原酶抑制剂的吸收效果。举例而言：丙二醇的加入量为0.1％、0.5％、1％、1.5％、2.5％、3.5％、4.5％等，双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯的加入量为0.1％、0.5％、1％、1.5％、2.5％、3.5％、4.5％。
除胶原酶抑制剂和促渗透剂以外，所述透肌水还包括保湿剂、增稠剂、防腐剂、皮肤调理剂、增溶剂、皮肤美白剂、舒敏剂、芳香剂中的一种或两种以上的组合。本发明的透肌水的配方组成温和，可以使本发明的胶原酶抑制剂的功效得到充分发挥。具体而言：
其中，以所述透肌水的总质量计，所述保湿剂的加入量为0.01-20％，能够起到保湿作用。为了使保湿剂的功效能够进一步发挥，作为优选，本发明的保湿剂的加入量可以是1-19％，可以是3-18％，可以是5-16％，可以是7-15％，可以是8-14％等。当保湿剂的含量低于0.01％时，保湿作用不明显；当保湿剂的含量高于20％时，会使透肌水有黏腻感。
在本发明中，所述保湿剂包括丁二醇、1,2-戊二醇、泛醇、双丙甘醇、甜菜碱、甘油聚醚-26、甘油、甘油聚丙烯酸酯、透明质酸钠、海藻糖中的一种或两种以上的组合。
以所述透肌水的总质量计，所述增稠剂的加入量为0.02-0.8％。当增稠剂的加入量小于0.02％时，透肌水的质地较稀；当增稠剂的加入量大于0.8％时，透肌水过于厚重，其有效成分不易被皮肤吸收。
本发明的透肌水中，所述增稠剂包括丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、羟乙基纤维素、黄原胶、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、卡波姆和丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物中的一种或两种以上。
以所述透肌水的总质量计，所述增溶剂的加入量为0.01-0.5％。通过添加增溶剂，可以使本发明的透肌水的原料更易溶解。所述增溶剂的加入量可以为0.02-0.2％，0.04-0.2％等。在本发明中，所述增溶剂包括聚山梨醇酯-20、PEG-40氢化蓖麻油和PPG-26-丁醇聚醚-26中的一种或两种以上。
为了进一步提高本申请的透肌水的功效，本发明的透肌水还包含有所述皮肤调理剂。通过添加皮肤调理剂，进一步为皮肤补充水分，并且可以减少皱纹的产生。皮肤调理剂中有效成分，可以渗透到肌肤深处，被皮肤吸收，从而改善皮肤的状态。
以所述透肌水的总质量计，所述皮肤调理剂的加入量为0.01-5％。具体而言，所述皮肤调理剂的加入量可以是0.05-4％，可以是0.08-3％，可以是0.1-2％等。当皮肤调理剂的加入量小于0.01％时，无法起到相应的功效；当皮肤调理剂的加入量大于5％时，成本过高。
本发明的所述皮肤调理剂包括三角褐指藻提取物、巨藻提取物、南极洲丛梗藻提取物、勃那特螺旋藻提取物、墨角藻提取物、小球藻发酵产物、水解胶原蛋白、绿藻提取物、红藻门藻提取物、棕榈酰三肽-5、乙酰基六肽-8、褐藻提取物、尿囊素、白果槲寄生叶提取物、白茅根提取物、天冬氨酸镁、仙人掌提取物中的一种或两种以上的组合。
本发明的透肌水还可添加少量皮肤美白剂。通过添加皮肤美白剂，可以起到提亮肤色的作用，达到一定的美白效果。以所述透肌水的总质量计，所述皮肤美白剂的加入量为0.01-5％；例如可以是0.5％、1％、2％、3％、4％等。当皮肤美白剂的加入量小于0.01％时，含量过低，无法起到相应的功效；当皮肤美白剂的加入量大于5％时，成本过高。
具体地，在本发明中，所述皮肤美白剂包括烟酰胺、甘草酸二钾、天女木兰提取物、曲酸及其衍生物、熊果苷、维生素C及其衍生物中的一种或两种以上的组合，其中，维生素C及其衍生物例如可以是抗坏血酸乙基醚等。
为了进一步提高本申请的透肌水的功效，本发明的透肌水还包含有所述舒敏剂。舒敏剂可以镇定皮肤，从而对脸部肌肤受伤红肿有一定舒缓作用。
以所述透肌水的总质量计，所述舒敏剂的加入量为0.01-5％。具体而言，所述舒敏剂的加入量可以是0.1-4％，可以是0.15-3％，可以是0.2-2％等。当舒敏剂的加入量小于0.01％时，无法起到相应的功效；当舒敏剂的加入量大于5％时，成本过高。
所述舒敏剂包括北美金缕梅花水、积雪草提取物、姜根提取物、红没药醇中的一种或两种以上的组合。
本发明的透肌水还可以适当添加有抗氧化剂和螯合剂。一般而言，以所述透肌水的总质量计，所述抗氧化剂的加入量为0-2％；所述螯合剂的加入量为0-1％。所述抗氧化剂可以是维生素E、生育酚乙酸酯、丁羟甲苯、番茄红素等中的一种或两种以上的组合。所述螯合剂可以是EDTA二钠和/或EDTA四钠等。
另外，本发明的透肌水中还包含有防腐剂和芳香剂。以所述透肌水的总质量计，所述防腐剂的加入量为0.01-1.5％；所述芳香剂的加入量为0.005-0.5％。所述防腐剂可以包括苯氧乙醇、羟苯甲酯、羟苯丙酯、苯甲酸及其盐中的一种或两种以上的组合。所述芳香剂可以是香精等。
本发明的透肌水能够起到抗衰的作用，其有效成分容易被肌肤吸收。另外，其配方中的多种成分均可以带给肌肤丰富的营养，使肌肤细嫩柔滑。
<第三方面>
本发明的第三方面提供了一种第二方面的透肌水的制备方法，包括将所述透肌水的各组分混合的步骤。
具体而言，所述的透肌水的制备方法包括以下步骤：
1、将水、保湿剂、增稠剂、部分促渗透剂、任选存在的螯合剂、部分皮肤调理剂、部分防腐剂原料加入搅拌锅，搅拌并加热至75-85℃；
2、冷却至40-50℃，加入增溶剂、芳香剂、任选存在的抗氧化剂、胶原酶抑制剂、舒敏剂、皮肤美白剂、剩余的皮肤调理剂、剩余的促渗透剂、剩余的防腐剂搅拌均匀；
3、冷却至30-40℃，检验合格后出料，静置12-48小时；
4、检验合格后，分装、包装，再检验，成品入库。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
野菊花提取物购自：衢州市展宏生物科技有限公司；
金盏花提取物购自：衢州市展宏生物科技有限公司。
对比例1-5
提供金盏花提取物作为胶原酶抑制剂。将金盏花提取物溶于与对比例1-5对应体积的5组去离子水中，得到5组测试溶液，5组测试溶液的浓度分别为4000μg/mL、3200μg/mL、2400μg/mL、1600μg/mL、800μg/mL。则金盏花提取物的对数质量浓度如下表2或图2所示。
对比例6-10
提供野菊花提取物作为胶原酶抑制剂。将野菊花提取物溶于5组不同体积的去离子水中，得到5组测试溶液，5组测试溶液的浓度分别为4000μg/mL、3200μg/mL、2400μg/mL、1600μg/mL、800μg/mL。则野菊花提取物的对数质量浓度如下表2或图1所示。
实施例1-5
提供野菊花提取物和金盏花提取物作为胶原酶抑制剂。将金盏花提取物和野菊花提取物按质量比3:1(实施例1)、2:1(实施例2)、1:1(实施例3)、1:2(实施例4)、1:3(实施例5)混合后，得到胶原酶抑制剂。
将实施例1-5的胶原酶抑制剂分别溶于5组与对比例1-5对应体积的去离子水中。实施例1-5可以得到5组与对比例1-5对应浓度的测试溶液。其中，胶原酶抑制剂中，金盏花提取物和野菊花提取物的含量(质量％)如下表1所示，胶原酶抑制剂的对数质量浓度如下表3所示。
表1
抑制胶原酶活性测试
福林酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应，因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，酪蛋白被胶原酶水解，经一段时间后用三氯乙酸终止酶解反应，经离心或过滤除去酪蛋白沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比，用分光光度计在650nm波长处测定，从而计算出胶原酶的活力。
测试中，所使用有胶原酶为基质胶原酶(MMP-1)，购自：上海泽叶生物科技有限公司。
胶原酶活性以催化酪蛋白生成酪氨酸的胶原酶活力来衡量。具体为：
①取1支试管，分别加入去离子水0.25mL和胶原酶0.25mL(32U/mL)，随后加入底物酪蛋白溶液0.5mL(1.0％,w/v)并立即混匀，37℃水浴保温10min，然后加入三氯乙酸溶液1mL(6.5％,w/v)混匀，静置10min后10000rpm离心5min，取该试管中的上清液样品0.5mL于另一支试管中，分别加入碳酸氢钠试液0.5ml(质量浓度：10％)，摇匀。10分钟后各加入福林酚试液0.5ml(1mol/L酸浓度的福林酚试液稀释2倍)，立即混匀，室温放置30分钟；得到实验组上清液1，在650nm的波长处检测吸光度，记作A1。
②另取1支试管，分别加入去离子水0.25mL和胶原酶0.25mL(32U/mL)，随后加入三氯乙酸溶液1mL(6.5％,w/v)并立即混匀，37℃水浴保温10min，然后加入底物酪蛋白溶液0.5mL(1.0％,w/v)混匀，静置10min后10000rpm离心5min，取该试管中的上清液样品0.5mL于另一支试管中，分别加入碳酸氢钠试液0.5ml(质量浓度：10％)，摇匀。10分钟后各加入福林酚试液0.5ml(1mol/L酸浓度的福林酚试液稀释2倍)，立即混匀，室温放置30分钟；得到对照组上清液2，在650nm的波长处检测吸光度，记作A2。
③分别在35支试管中加入胶原酶0.25mL(32U/mL)，然后分别加入0.25mL对比例1-10和实施例1-5的测试溶液并混匀，随后加入底物酪蛋白溶液0.5mL(1.0％,w/v)并立即混匀，37℃水浴保温10min后，然后加入三氯乙酸溶液1mL(6.5％,w/v)混匀，静置10min后10000rpm离心5min，分别取该35支试管中的上清液样品0.5mL于另外35支试管中，分别加入碳酸氢钠试液0.5ml(质量浓度：10％)，摇匀。10分钟后各加入福林酚试液0.5ml(1mol/L酸浓度的福林酚试液稀释2倍)，立即混匀，室温放置30分钟；得到35组实验组上清液3，分别在650nm的波长处检测吸光度，记作A3。
④分别在35支试管中加入胶原酶0.25mL(32U/mL)，然后分别加入0.25mL对比例1-10和实施例1-5的测试溶液并混匀，随后加入三氯乙酸溶液1mL(6.5％,w/v)并立即混匀，37℃水浴保温10min后，然后加入底物酪蛋白溶液0.5mL(1.0％,w/v)混匀，静置10min后10000rpm离心5min，分别取该35支试管中的上清液样品0.5mL于另外35支试管中，分别加入碳酸氢钠试液0.5ml(质量浓度：10％)，摇匀。10分钟后各加入福林酚试液0.5ml(1mol/L酸浓度的福林酚试液稀释2倍)，立即混匀，室温放置30分钟；得到35组对照组上清液4，分别在650nm的波长处检测吸光度，记作A4。
抑制率＝[1-(A3-A4)/(A1-A2)]×100％
式中：A1为不添加胶原酶抑制剂，实验组上清液1的吸光度；
A2为不添加胶原酶抑制剂，对照组上清液2的吸光度；
A3为含有胶原酶抑制剂，实验组上清液3的吸光度；
A4为含有胶原酶抑制剂，对照组上清液4的吸光度。
分别计算得到金盏花提取物(对比例1-5)和野菊花提取物(对比例6-10)各自的对胶原酶活性的抑制率。并结合对数质量浓度-胶原酶抑制率的关系图(图1和图2)，换算求得金盏花提取物的抑制率为50％时对应的质量浓度(IC50A)和野菊花提取物的抑制率为50％时对应的质量浓度(IC50B)，结果如表2所示。
表2
然后测出实施例1-5的胶原酶抑制剂的胶原酶抑制率。并结合对数质量浓度-胶原酶抑制率的关系图(图3)，换算求得野菊花提取物和金盏花提取物复合作用产生等效抑制率(50％)时，金盏花提取物的质量浓度(IC50a)，野菊花提取物和金盏花提取物复合作用产生等效抑制率(50％)时，野菊花提取物的质量浓度((IC50b)，结果如表3所示。
野菊花提取物和金盏花提取物的复合作用的效应，可以用相互作用系数γ来评价，具体结果如表3所示。
γ＝IC50a/IC50A+IC50b/IC50B
其中，IC50A表示金盏花提取物的抑制率为50％时对应的质量浓度；
IC50B表示野菊花提取物的抑制率为50％时对应的质量浓度；
IC50a表示野菊花提取物和金盏花提取物复合作用产生等效抑制率(50％)时，金盏花提取物的质量浓度；
IC50b表示野菊花提取物和金盏花提取物复合作用产生等效抑制率(50％)时，野菊花提取物的质量浓度。
其中，γ＝1，表示野菊花提取物和金盏花提取物表现为简单相加效应；γ＜1为野菊花提取物和金盏花提取物表现为协同效应，γ值越小，协同效应越强；γ＞1为野菊花提取物和金盏花提取物表现为拮抗效应，γ值越大，拮抗效应越大。
表3
注：表3中，实施例1和实施例5在本发明中作为参考例1和参考例5体现的，其可以与实施例2-4形成对比。
由表3可以看出，本发明的胶原酶抑制剂中的相互作用系数小于1，且其相互作用系数值可以在0.8以下，甚至可以在0.7以下，因此野菊花提取物和金盏花提取物可以表现为优异的协同效应。
应用实施例1-5
根据下表4中的应用实施例1-5的透肌水配方中各组分的含量(质量百分比)，并按照下述生产工艺步骤制备得到透肌水。生产工艺步骤如下：
1、将A、B相原料加入搅拌锅，搅拌并加热至82-85℃；
2、冷却至42℃，加入C、D相搅拌均匀；
3、冷却至37℃，检验合格后出料，静置24小时；
4、检验合格后，分装、包装，再检验，成品入库。
注：工艺中的A、B、C、D相分别为A相：水；
B相：丁二醇、丙二醇、双丙甘醇、甘油聚醚-26、甘油、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、尿囊素、甜菜碱、丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物、透明质酸钠、羟苯甲酯；
C相：PEG-40氢化蓖麻油、香精；
D相：野菊花提取物、金盏花提取物、南极洲丛梗藻提取物、北美金缕梅花水、甘草酸二钾、勃那特螺旋藻提取物、苯氧乙醇、双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯。
其中，丁二醇、双丙甘醇、甘油聚醚-26、甘油、甜菜碱、透明质酸钠是保湿剂；
丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物是增稠剂；
丙二醇、双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯是促渗透剂；
PEG-40氢化蓖麻油是增溶剂；
野菊花提取物、金盏花提取物是胶原酶抑制剂；
南极洲丛梗藻提取物、勃那特螺旋藻提取物、尿囊素是皮肤调理剂；
甘草酸二钾是皮肤美白剂；北美金缕梅花水是舒敏剂；
羟苯甲酯、苯氧乙醇是防腐剂；香精是芳香剂。
表4
应用对比例1-8
根据下表5中的应用对比例1-8的透肌水配方中各组分的含量(质量百分比)，并按照与应用实施例1-5相同的方法，制备得到透肌水。
表5
皮肤弹性测试
皮肤弹性的测试方法：测试原理是基于吸力和拉伸原理，在被测试的皮肤表面产生一个负压将皮肤吸进一个特定测试探头内，皮肤被吸进测试探头内的深度是通过一个非接触式的光学测试系统测得的。测试探头内包括光的发射器和接收器，光的比率(发射光和接收光之比)同被吸入皮肤的深度成正比，这样就得到了一条皮肤被拉伸的长度和时间的关系曲线。
采用德国CK公司的探头PVM600和皮肤弹性测量仪MPA580对受试者进行皮肤弹性的测定，选择参数R2作为比较指标(R2：无负压时皮肤回弹量与有负压时的最大拉伸量之比，比值越接近1，皮肤弹性越好)，共测量3次，取平均值；通过测量产品使用前后皮肤弹性值R2的变化来评估该产品对受试区域皮肤弹性的改善作用。
受试者人数为33人，试验周期为8周，试验选取应用实施例1-5的透肌水以及应用对比例1-8的透肌水作为测试样品，在受试者的前臂划分13个不同区域，每天早晚将应用实施例1-5的透肌水以及应用对比例1-8的透肌水涂抹于前臂内侧的不同区域，涂抹量约为2mg/cm2，且试验周期内每种测试样品的涂抹位置均保持不变，然后分别测定实验前和使用8周时的受试区域的皮肤弹性，进而表征皮肤弹性的变化率，具体弹性变化率(取平均值)的结果如表6和图5所示。
表6
由表6和图5可以看出，本申请的应用实施例1-5的皮肤弹性的变化率较大，即皮肤弹性增强，因此，使用野菊花提取物和金盏花提取物能够有效改善皮肤衰老。
本申请的应用对比例1-8中，其皮肤弹性变化率小，因此，应用对比例1-8的抗衰效果相对较差。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种胶原酶抑制剂，其特征在于，包括：野菊花提取物和金盏花提取物，以所述胶原酶抑制剂的总质量计，所述野菊花提取物的加入量为26.2-73.8％，所述金盏花提取物的加入量为26.2-73.8％。
2.根据权利要求1所述的胶原酶抑制剂，其特征在于，所述野菊花提取物与所述金盏花提取物的质量比为1:0.36～2.8，优选1:0.365～2.6，更优选1:0.37～2.5，进一步优选为1:0.375～2.4，更进一步优选1:0.38～2.3，再进一步优选1:0.385～2.1。
3.根据权利要求1或2所述的胶原酶抑制剂，其特征在于，所述胶原酶为间质胶原酶。
4.一种根据权利要求1-3任一项所述的胶原酶抑制剂的制备方法，其特征在于，包括将所述胶原酶抑制剂的各组分混合的步骤。
5.一种透肌水，其特征在于，包括根据权利要求1-3任一项所述的胶原酶抑制剂以及促渗透剂，以所述透肌水的总质量计，所述胶原酶抑制剂的加入量为0.01-10％；所述促渗透剂的加入量为0.01-10％。
6.根据权利要求5任一项所述的透肌水，其特征在于，所述促渗透剂包括丙二醇、双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯以及壳聚糖中的一种或两种以上的组合。
7.根据权利要求5或6所述的透肌水，其特征在于，所述透肌水还包括保湿剂、增稠剂、防腐剂、皮肤调理剂、增溶剂、皮肤美白剂、舒敏剂、芳香剂中的一种或两种以上的组合；其中，
以所述透肌水的总质量计，所述保湿剂的加入量为0.01-20％；所述增稠剂的加入量为0.02-0.8％；所述防腐剂的加入量为0.01-1.5％；所述皮肤调理剂的加入量为0.01-5％；所述增溶剂的加入量为0.01-0.5％；所述皮肤美白剂的加入量为0.01-5％；所述舒敏剂的加入量为0.01-5％；所述芳香剂的加入量为0.005-0.5％。
8.根据权利要求7所述的透肌水，其特征在于，所述皮肤调理剂包括三角褐指藻提取物、巨藻提取物、南极洲丛梗藻提取物、勃那特螺旋藻提取物、墨角藻提取物、小球藻发酵产物、水解胶原蛋白、绿藻提取物、红藻门藻提取物、棕榈酰三肽-5、乙酰基六肽-8、褐藻提取物、尿囊素、白果槲寄生叶提取物、白茅根提取物、天冬氨酸镁、仙人掌提取物中的一种或两种以上的组合。
9.根据权利要求7或8所述的透肌水，其特征在于，所述皮肤美白剂包括烟酰胺、甘草酸二钾、天女木兰提取物、曲酸及其衍生物、熊果苷、维生素C及其衍生物中的一种或两种以上的组合；和/或，
所述舒敏剂包括北美金缕梅花水、积雪草提取物、姜根提取物、红没药醇中的一种或两种以上的组合。
10.一种根据权利要求5-9任一项所述的透肌水的制备方法，其特征在于，包括：将所述透肌水的各组分混合的步骤。
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