CN106074495A - 降低黄曲霉毒素生物利用度的儿茶素纳米粒的制备方法 - Google Patents

降低黄曲霉毒素生物利用度的儿茶素纳米粒的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降低黄曲霉毒素生物利用度的儿茶素纳米粒的制备方法，包括以下步骤：1)、在0.4～0.6g的壳聚糖中加水定容至100ml，磁力搅拌后，调节pH为4.0～5.0；2)、在20mL质量浓度为1.2～1.8％的多聚磷酸钠溶液中加入儿茶素，从而配制成儿茶素浓度为60～65mg/mL的儿茶素‑‑多聚磷酸钠溶液；3)、将步骤2)所得的儿茶素‑‑多聚磷酸钠溶液全部加至步骤1)所得物中，所得的反应体系于20～30℃持续搅拌30～50min，得儿茶素纳米粒混悬液。

Description

降低黄曲霉毒素生物利用度的儿茶素纳米粒的制备方法
技术领域
儿茶素为茶叶中最主要的天然活性成分，具有多种药理和保健活性。本发明涉及一种能够降低黄曲霉毒素生物利用度的儿茶素纳米粒的制备方法。
背景技术
茶多酚(Tea Polyphenols,TP)是茶叶中多酚类及其衍生物的总称，主要有儿茶素、黄酮类、花青素和酚酸等物质组成，其中儿茶素类占茶多酚总量60％-90％。儿茶素具有很强的生物活性，大量研究均表明儿茶素具有抗氧化清除自由基、抗心血管疾病、抑菌消炎等多种保健和药理作用。美国医学基金会主席认为：“茶多酚(儿茶素)是21世纪对人类健康产生巨大效果的化合物”。目前，国内外对于茶多酚(儿茶素)方面的研究和应用层出不穷，已经将其应用于日常生活的方方面面，除了做出传统的片剂和胶囊用于口服发挥保健功能外，尚有研究人员将其制成膜剂用于慢性皮肤溃疡治疗，发挥儿茶素抗菌消炎、抗溃疡、抗烧伤性组织损伤等局部保护作用。还有制成儿茶素凝胶剂用于口腔细菌杀灭作用；制成栓剂用于治疗常见阴道致病菌抑制作用；制成乳膏剂用于临床痤疮的治疗。国外有研究人员将其用于鞋垫、衣服等预防虫蛀和杀菌方面。
黄曲霉毒素(AFT)是黄曲霉、寄生曲霉菌等产毒菌株产生的次生代谢产物，广泛存在于污染的食品中，尤其以霉变的花生、玉米及谷类含量最多。AFT微溶于水，易溶于油脂、氯仿和甲醇等有机溶剂。AFT对温度的敏感性差，280℃才能裂解，因此一般的烹饪条件下不易被破坏。1993年AFT就被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构列为I类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。天然污染的食物中黄曲霉毒素B1(AFB1)最多，是目前已知最强的化学致癌物之一，因此AFT一般以AFB1为代表，在食品监测中作为污染监测指标。大量研究均表明AFT是肝癌最强烈的致癌物。
目前由于经济快速发展、人们生活节奏的加快，加之生活水平的提高、饮食结构的改变，导致的高尿酸血症和各种心脑血管慢性病逐渐呈现升高的趋势，往往相伴有高血压、高血脂、高血糖等现代内分泌、代谢紊乱性疾病。由于生活和工作压力过大，往往导致内分泌发生紊乱，从而导致机体机能和各种复合疾病进一步发生和加剧，大部分人都处于亚健康状态。加之各种快餐饮食和食品安全问题突出，从而使得人们在不知不觉中体内积聚了大量的自由基，同时可能会慢慢滋生各种疾病，尤其是肝脏损伤风险处于高危状态。一旦饮食中有大量黄曲霉毒素摄入，肝脏的解毒和抗损伤能力不堪一击，更加易于导致肝癌的发生。因此，开发符合现代人生活方式并能够抵抗黄曲霉毒素吸收和代谢所致肝损伤的新型保健品，具有重要意义和市场前景。
目前与儿茶素或茶多酚相关的保健品层出不穷，传统保健品剂型有片剂、胶囊，新型保健品剂型有微球、微囊、脂质体、环糊精包合剂及固体分散剂等，其中部分剂型(如茶多酚片剂、茶多酚胶囊等)在临床进行了推广和应用，但临床效果并不十分理想。这些制剂均以单一的儿茶素作为主要活性成分，然而关于儿茶素和其他药品或保健品组成的复方制剂，鲜见报道。结合本实验室前期研究积累和大量文献报道可知，由于儿茶素类化合物极性较大、水溶性较高，生物膜渗透性较差，加之小肠上皮细胞膜中转运蛋白(p-糖蛋白、多药耐药相关蛋白等)对儿茶素发挥“外排”作用，从而使得该类化合物口服后难以通过小肠上皮细胞进入全身血液循环，以致儿茶素类化合物在机体内的生物利用度较低，大部分在肠道中被各种酶或微生物所代谢和降解，或随粪便排泄到体外，从而使得该类化合物难以在体内发挥有效作用。因此，如何提高部分儿茶素类化合物生物膜转运，同时能够在肠道中吸附黄曲霉毒素，从而抑制其吸收，降低其生物利用度，是解决限制儿茶素临床应用和保护黄曲霉毒素肝损伤的关键“瓶颈”问题。
目前在提高儿茶素生物膜转运方面的研究主要集中在儿茶素衍生化物的制备和应用上，近来年也有学者开展了儿茶素/茶多酚纳米粒制剂或注射用纳米乳剂的研究，但此类研究主要是针对如何促进儿茶素跨膜转运进行的有益探索。然而关于儿茶素微囊制备以及通过降低抗黄曲霉毒素生物利用度来发挥抗损伤方面的研究尚未见报道。虽然有文献报道了不同浓度绿茶及茶叶渣对黄曲霉毒素B1导致大鼠肝癌作用的影响，同时也有研究报道了茶多酚在树鼩肝癌形成中的化学预防作用，但是上述研究只是从肝脏损伤角度来研究茶多酚对黄曲霉毒素损伤的保护或干预作用，然而从新剂型和降低黄曲霉毒素生物利用度视角来研究对黄曲霉毒素保护功能，尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种降低黄曲霉毒素生物利用度的儿茶素纳米粒的制备方法，采用该方法能制备出显著降低黄曲霉毒素生物利用度的儿茶素纳米粒混悬液。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种能降低黄曲霉毒素生物利用度的儿茶素纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
1)、在0.4～0.6g的壳聚糖中加水定容至100ml，磁力搅拌后，调节pH为4.0～5.0(较佳为4.5)；
2)、在20mL质量浓度为1.2～1.8％(较佳1.5％)的多聚磷酸钠溶液中加入儿茶素，从而配制成儿茶素浓度为60～65mg/mL(较佳为60mg/mL)的儿茶素--多聚磷酸钠溶液；
3)、将步骤2)所得的儿茶素--多聚磷酸钠溶液全部加至步骤1)所得物中，所得的反应体系于20～30℃(较佳为25℃)持续搅拌30～50min，得儿茶素纳米粒混悬液。
作为本发明的能降低黄曲霉毒素生物利用度的儿茶素纳米粒的制备方法的改进：
所述步骤3)中，将步骤2)所得的儿茶素--多聚磷酸钠溶液于10～15分钟内均匀滴加至步骤1)所得物中。
作为本发明的能降低黄曲霉毒素生物利用度的儿茶素纳米粒的制备方法的改进：所述步骤1)中，磁力搅拌的转速为800～1000r/min。
在本发明中：
选用满足以下条件的壳聚糖：分子量为11万，脱乙酰度＞80％，含量＞99％。选用满足以下条件的儿茶素：总多酚含量＞98％，其中儿茶素EGCG＞80％。
步骤3)中的搅拌为200～400r/min。
步骤1)中，根据实际需要，配制1mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液，通过边滴加边测pH方法来达到目的pH值。
本发明采用多聚磷酸钠(TPP)离子交联法制备儿茶素/壳聚糖载药纳米粒，并考察儿茶素纳米粒对黄曲霉毒素体内生物利用度的降低作用。
本发明在发明过程中，使用了如下的检测方法：
方法一、血浆中儿茶素EGCG的定量分析方法
采用向0.3mL空白血浆中加入儿茶素EGCG标准品的方法，配制浓度范围为0.1-200mg/L的儿茶素EGCG标准样品，再向其中加入30μL 20％(质量百分浓度)的抗坏血酸，再加入30μL100μg/mL香兰素作为内标，混合后加入3mL乙酸乙酯进行萃取，振荡1min，6000r/min高速离心5min，分别得有机相(位于上层)和水相(位于下层)；将水相(位于下层)用3mL乙酸乙酯重复萃取一次(萃取条件同上)，合并两次萃取有机相，于45℃水浴中氮气流(弱氮气流)吹干，所得残渣用0.1mL 20％(体积％)的乙腈水溶液溶解，超声振荡后，18000r/min高速离心3min，取20μL上清液HPLC进样分析。
具体为：以日本岛津高效液相色谱，两元高压泵，紫外检测器，大连伊利特Hypersil BDS C18柱(5μm,250mm×4.6mm)，流动相为乙腈∶0.1％(质量％)柠檬酸水溶液＝10∶90；柱温30℃，波长280nm；流速为1.0mL·min-1；进样量为20μL。
备注说明：空白血浆即为没有加入EGCG的纯血浆。
根据HPLC检测结果，以儿茶素EGCG峰面积与内标香兰素峰面积之比(Y)为纵坐标，以儿茶素EGCG浓度的质量浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，求出曲线方程和相关系数(r)。同时制备含儿茶素EGCG曲线范围内高、中、低浓度血浆样品0.2，10.0，50.0mg/L作为质控样品(QC)，分别按照上述样品处理方法处理后进样分析，每个浓度样品重复5次，以样品中EGCG峰面积与直接溶于流动相下所测峰面积之比，计算高、中、低3种浓度下方法回收率(即，样品中EGCG峰面积与直接溶于流动相下所测峰面积之比＝EGCG回收率)。比较以上样品于日内5次和日间5次测定的峰面积的变化，计算日内精密度和日间精密度。
备注说明：“日内精密度和日间精密度”主要用于评价上述方法(即HPLC检测方法)的精密度和准确性，以此来判断最终检测结果的可靠性。
结果为：
按照上述方法所得处理血浆中EGCG在0.1-200mg/L浓度范围内标准曲线为Y＝0.004x+0.0002(r＞0.999)，在标准曲线范围内高、中、低浓度儿茶素EGCG回收率均大于85％以上，日内精密度和日间精密度均小于10％，见表1。
表1.血浆中儿茶素EGCG的回收率和精密度(n＝5)
根据上述结果，我们能得知：本发明所设置的上述检测方法能满足本发明的儿茶素生物利用度的检测的要求。
方法二、评估儿茶素包封率
在本发明中，将一定体积(约2mL)的儿茶素纳米粒混悬液用超滤离心管(10000MWCO,密理博中国有限公司)在4000r/min下离心10min，取滤膜(10000MWCO孔径滤膜，即，为留在滤膜上的化合物最小分子量为10000的超滤膜)下层的滤液1mL，置于离心管中，按照方法一中相同色谱条件，取离心管中的超速离心(6000r/min离心5min)后得到的过滤液进样分析。计算脂质体包封率，包封率(％)＝{(儿茶素初始含量-滤液中儿茶素含量)/儿茶素初始含量}×100％。
方法三、血浆中黄曲霉毒素B1的定量分析方法
采用向0.3mL空白血浆中加入黄曲霉毒素B1标准品的方法，配制浓度范围为0.1-100ng/mL的黄曲霉毒素B1标准样品，混合后加入3mL正己烷进行萃取，振荡1min，6000r/min高速离心5min，分别得有机相(位于上层)和水相(位于下层)；将水相(位于下层)用3mL二氯甲烷重复萃取一次，分别得有机相(位于下层)和水相(位于上层)；将有机相(位于下层)与上述所得正己烷有机相合并，于45℃水浴中氮气流(弱氮气流)吹干，所得残渣用0.3mL流动相45％(体积％)的乙腈水溶液溶解，超声振荡后，18000r/min高速离心3min，取20μL上清液HPLC进样分析。
具体为：美国Waters e2695高效液相色谱系统，原装色谱工作站，检测器为原装2473荧光检测器，Thermo BDS C18柱(5μm,250mm×4.6mm)，流动相为乙腈∶水＝45∶55；柱温30℃，激发波长360nm，发射波长450nm；流速为1.0mL·min-1；进样量为20μL。
备注说明：空白血浆即为没有加入黄曲霉毒素B1的纯血浆。
根据HPLC检测结果，以黄曲霉毒素B1峰面积(Y)为纵坐标，以黄曲霉毒素B1浓度的质量浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，求出曲线方程和相关系数(r)。同时制备含黄曲霉毒素B1曲线范围内高、中、低浓度血浆样品0.5，1.0，10.0mg/L作为质控样品(QC)，分别按照上述样品处理方法处理后进样分析，每个浓度样品重复5次，以样品中黄曲霉毒素B1峰面积与直接溶于流动相下所测峰面积之比，计算高、中、低3种浓度下方法回收率(即，样品中黄曲霉毒素B1峰面积与直接溶于流动相下所测峰面积之比＝黄曲霉毒素B1回收率)。比较以上样品于日内5次和日间5次测定的峰面积的变化，计算日内精密度和日间精密度。
备注说明：“日内精密度和日间精密度”主要用于评价上述方法(即HPLC检测方法)的精密度和准确性，以此来判断最终检测结果的可靠性。
结果为：
按照上述方法所得处理血浆中黄曲霉毒素B1在0.1-100ng/mL浓度范围内标准曲线为Y＝2×107X–1646.4(r＞0.9999)，在标准曲线范围内高、中、低浓度黄曲霉毒素B1回收率均大于90％以上，日内精密度和日间精密度均小于10％，见表2。
表2.血浆中黄曲霉毒素B1的回收率和精密度
根据上述结果，我们能得知：本发明所设置的上述检测方法能满足本发明的黄曲霉毒素B1生物利用度的检测的要求。
方法四、评估儿茶素和黄曲霉毒素的生物利用度改变
160只SPF级ICR雄性小鼠购于浙江省医学科学院实验动物中心，体重25±2g，实验分为4组，每组40只小鼠。将每组40只小鼠随机分为8个小鼠笼中，每笼5只，于实验前适应性养殖一周，口灌前12h禁食、不禁水。
实验组一、儿茶素对照组：儿茶素生理盐水溶液(浓度为10mg/mL)，按照100mg/kg体重口灌；将40只小鼠随机分为8组，每组5只，于实验前适应性养殖一周，口灌前12h禁食、不禁水。
实验组二、儿茶素纳米粒组：将本发明制备的儿茶素纳米粒混悬液(例如浓度为10mg/mL)，按照100mg/kg体重口灌(上述100mg为儿茶素纳米粒混悬液中的儿茶素量)；将40只小鼠随机分为8组，每组5只，于实验前适应性养殖一周，口灌前12h禁食、不禁水。
实验组三、黄曲霉毒素组：按照5mg黄曲霉毒素B1/kg体重给小鼠口灌配制的黄曲霉毒素溶液；将40只小鼠随机分为8组，每组5只，于实验前适应性养殖一周，口灌前12h禁食、不禁水。
实验组四、黄曲霉素毒素+儿茶素纳米粒组：按照100mg儿茶素/kg体重给小鼠口灌配制的儿茶素纳米粒混悬液(即，本发明所得的儿茶素纳米粒混悬液，上述100mg为儿茶素纳米粒混悬液中的儿茶素量)，30min后同时按照5mg黄曲霉毒素B1/kg体重给小鼠口灌配制的黄曲霉毒素溶液；将40只小鼠随机分为8组，每组5只，于实验前适应性养殖一周，口灌前12h禁食、不禁水。
将上述实验组和对照组，分别按照上述剂量口灌，均于口灌后5min、10min、15min、30min、60min、120min、180min和240min眼球取血，每组采血5只小鼠，然后将所取血液于肝素化离心管中，6000r/min离心后，实验组一和实验组二每个时间点分别取0.3mL血浆于10mL离心管中，同时参照上述方法一处理后进HPLC分析。将所测血浆中儿茶素EGCG峰面积代入上述标准曲线方程(方法一所得)中，计算血浆中儿茶素EGCG浓度，绘制血药浓度——时间曲线，比较儿茶素纳米粒混悬液(本发明)和儿茶素生理盐水溶液的血药浓度，以此来评价儿茶素纳米粒混悬液中儿茶素在机体内生物利用度的影响。
实验三和实验四每个时间点分别取0.3mL血浆于10mL离心管中，同时参照上述方法三处理后进HPLC分析。将所测血浆中黄曲霉毒素B1峰面积代入上述标准曲线方程(方法三所得)中，计算血浆中黄曲霉毒素B1浓度，绘制血药浓度——时间曲线，比较黄曲霉毒素B1+儿茶素纳米粒混悬液(本发明)和黄曲霉毒素B1溶液的血药浓度，以此来评价儿茶素纳米粒混悬液对黄曲霉毒素B1在机体内生物利用度的影响。
即，本发明利用实验动物整体小肠吸收模型，通过定量检测本发明所得的儿茶素纳米粒混悬液和黄曲霉毒素B1在体内生物利用度，制备一种能够发挥增强儿茶素生物利用度、同时降低黄曲霉毒素生物利用度的新型制剂，发挥黄曲霉毒素损伤的保护作用。
综上所述，本发明采用了RP-HPLC方法分析检测了血浆等生物样品中儿茶素EGCG和黄曲霉毒素B1的准确、定量检测手段，检测限分别达到微克级和纳克级，完全能够满足小鼠血样中儿茶素EGCG和黄曲霉毒素B1的检测。
即，本发明在制备儿茶素纳米溶液基础上，探索儿茶素在生物利用度和黄曲霉毒素B1生物利用度方面的协同保护作用，从而拓展儿茶素新型功效和应用领域，充分发挥儿茶素的生物活性，服务于临床。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是儿茶素EGCG的标准色谱图；
图2是空白血浆的色谱图；
图3是服用实施例1所述的儿茶素纳米粒混悬液后小鼠血浆色谱图；
其中峰1为儿茶素EGCG色谱峰；峰2为内标。
图4是实施例1所述的儿茶素纳米粒混悬液与普通生理溶液组EGCG浓度——时间曲线对比图；
图5是黄曲霉毒素B1的标准色谱图；
图6是空白血浆的色谱图；
图7是口灌黄曲霉毒素B1后的血浆色谱图；
其中峰1为黄曲霉毒素B1。
图8是口灌黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B1+实施例1儿茶素纳米粒混悬液后，黄曲霉毒素B1浓度——时间曲线对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、一种能降低黄曲霉毒素生物利用度的儿茶素纳米粒的制备方法，依次进行以下步骤：
1)、在500mL圆底烧瓶中加入0.5g的壳聚糖，并加水定容至100mL，于25℃温度下进行磁力搅拌30分钟，转速900r/min，同时调节pH为4.5；
2)、准确配制20mL质量浓度为1.5％的多聚磷酸钠溶液，用该多聚磷酸钠溶液再配制儿茶素浓度为60mg/mL的儿茶素--多聚磷酸钠溶液；
3)、将步骤2)所得的儿茶素--多聚磷酸钠溶液全部逐滴均匀的缓慢滴加至1)中的圆底烧瓶中，滴加时间为10分钟(滴加速度约40滴/分钟)；
所得反应体系于25℃温度下继续搅拌50min(转速400r/min)，即得儿茶素纳米粒混悬液。
实施例2、一种能降低黄曲霉毒素生物利用度的儿茶素纳米粒的制备方法，依次进行以下步骤：
1)、在500mL圆底烧瓶中加入0.2g的壳聚糖，并加水定容至100mL，于25℃温度下进行磁力搅拌30分钟，转速500r/min，同时调节pH为3.0；
2)、准确配制20mL质量浓度为1.0％的多聚磷酸钠溶液，用该多聚磷酸钠溶液再配制儿茶素浓度为60mg/mL的儿茶素--多聚磷酸钠溶液；
3)、将步骤2)所得的儿茶素--多聚磷酸钠溶液全部逐滴均匀的缓慢滴加至1)中的圆底烧瓶中，滴加时间为10分钟；
所得反应体系于25℃温度下继续搅拌10min，即得儿茶素纳米粒混悬液。
实施例3、一种能降低黄曲霉毒素生物利用度的儿茶素纳米粒的制备方法，依次进行以下步骤：
1)、在500mL圆底烧瓶中加入1.5g的壳聚糖，并加水定容至100mL，于25℃温度下进行磁力搅拌60分钟，转速1500r/min，同时调节pH为7.0；
2)、准确配制20mL质量浓度为2.5％的多聚磷酸钠溶液，用该多聚磷酸钠溶液再配制儿茶素浓度为60mg/mL的儿茶素--多聚磷酸钠溶液；
3)、将步骤2)所得的儿茶素--多聚磷酸钠溶液全部逐滴均匀的缓慢滴加至1)中的圆底烧瓶中，滴加时间为5分钟；
所得反应体系于25℃温度下继续搅拌80min，即儿茶素纳米粒混悬液。
实验1、检测纳米粒包封率：
将上述实施例1、2、3所得物--儿茶素纳米粒悬浮液按照上述方法二进行检测，结果如下：
实施例1所得的悬浮液的包封率(％)＝80.67％；
实施例2所得的悬浮液的包封率(％)＝58.84％；
实施例3所得的悬浮液的包封率(％)＝42.94％。
实验2、将上述所有案例所得的儿茶素纳米粒混悬液按照上述方法进行检测。
具体为：
按照100mg儿茶素/kg体重给小鼠口灌配制。
上述结果表明：本发明中所制备的儿茶素纳米粒混悬液在不同采血时间点血液中EGCG浓度均显著高于儿茶素生理盐水溶液，说明儿茶素纳米溶液口服生物利用度显著高于普通儿茶素生理盐水溶液。
最终结果如下表3(为平均值)。
表3不同实施例中儿茶素EGCG血药浓度——时间数据(mg/L)
时间(min) 实施例1 实施例2 实施例3
5 3.24 2.57 1.98
10 9.81 6.91 3.93
15 3.64 2.43 2.14
30 2.71 1.91 1.43
60 1.96 1.27 1.01
120 1.27 0.88 0.80
180 1.47 1.19 1.09
240 0.55 0.33 0.31
实验3、将实施例1、实施例2、实施例3所得的儿茶素纳米粒混悬液按照上述方法四所述的方法进行检测。
具体为：
按照100mg儿茶素/kg体重给小鼠口灌配制的实施例1所得的儿茶素纳米粒混悬液+黄曲霉毒素口灌，
按照100mg儿茶素/kg体重给小鼠口灌配制的实施例2所得的儿茶素纳米粒混悬液+黄曲霉毒素口灌，
按照100mg儿茶素/kg体重给小鼠口灌配制的实施例3所得的儿茶素纳米粒混悬液+黄曲霉毒素口灌，
上述结果表明：本发明中所制备的儿茶素纳米溶液+黄曲霉毒素口灌，在不同采血时间点血液中黄曲霉毒素B1浓度均显著低于单独黄曲霉毒素口灌组，说明儿茶素纳米溶液口服能够显著降低黄曲霉毒素生物利用度。
最终结果如下表4(为平均值)。
表4、不同实施例中黄曲霉毒素B1浓度——时间数据(ng/mL)
时间(min) 实施例1 实施例2 实施例3
5 1.08 1.57 2.24
15 2.53 4.01 4.21
30 1.23 1.61 1.71
60 0.95 1.27 1.31
120 0.68 0.98 1.17
180 0.26 0.59 0.77
240 0.15 0.40 0.45
对比例1-1、将实施例1步骤2)中的20mL质量浓度为1.5％的多聚磷酸钠溶液改成20ml水，其余等同于实施例1。
对比例1-2、将实施例1步骤2)中的多聚磷酸钠溶液改成海藻酸钠溶液，质量浓度不变，仍为1.5％，体积量不变，仍为20mL，其余等同于实施例1。
对比例1-3、将实施例1步骤2)中的多聚磷酸钠溶液改成三聚磷酸钠溶液，质量浓度不变，仍为1.5％，体积量不变，仍为20mL，其余等同于实施例1。
对比例2-1、将实施例1步骤1)中的壳聚糖的用量由0.5g改成0.1g，其余等同于实施例1。
对比例2-2、将实施例1步骤1)中的壳聚糖的用量由0.5g改成1g，其余等同于实施例1。
对比例2-3、将实施例1步骤1)中的壳聚糖改成磺酸化壳聚糖，用量不变，其余等同于实施例1。
对比实验1、检测纳米粒包封率：
将上述对比例1-1、1-2、1-3和对比例2-1、2-2、2-3所得物按照上述方法二进行检测，结果如下：
对比例1-1所得的混悬液的包封率(％)＝10.26％；
对比例1-2所得的混悬液的包封率(％)＝21.68％；
对比例1-3所得的混悬液的包封率(％)＝42.47％。
对比例2-1所得的混悬液的包封率(％)＝48.93％；
对比例2-2所得的混悬液的包封率(％)＝61.28％；
对比例2-3所得的混悬液的包封率(％)＝44.29％。
对比实验2、将上述所有对比例所得的儿茶素纳米溶液替代实施例所得的儿茶素纳米混悬液，其余同实验2(即，按照上述方法三所述的方法进行检测。)
最终结果如下表5。
表5不同对比例中儿茶素EGCG浓度——时间数据(mg/L)
时间(min) 对比例1-1 对比例1-2 对比例1-3 对比例2-1 对比例2-2 对比例2-3
5 1.21 1.42 1.95 2.11 2.61 2.08
10 2.99 3.33 3.90 4.10 7.01 4.03
120 0.60 0.68 0.80 0.87 0.90 0.82
240 0.18 0.21 0.30 0.33 0.37 0.32
对比实验3、将上述所有对比例所得的儿茶素纳米溶液替代实施例所得的儿茶素纳米混悬液，其余同实验3(即，按照上述方法四所述的方法进行检测。)
最终结果如下表6。
表6不同对比例中黄曲霉毒素B1浓度——时间数据(ng/mL)
时间(min) 对比例1-1 对比例1-2 对比例1-3 对比例2-1 对比例2-2 对比例2-3
5 2.51 2.33 2.26 2.15 1.47 2.20
15 4.53 4.40 4.24 4.05 3.90 4.15
120 1.42 1.35 1.19 1.01 0.90 1.09
240 0.80 0.69 0.47 0.45 0.38 0.45
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明中儿茶素组成纳米口服溶液的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.降低黄曲霉毒素生物利用度的儿茶素纳米粒的制备方法，其特征是包括以下步骤：
1)、在0.4～0.6g的壳聚糖中加水定容至100ml，磁力搅拌后，调节pH为4.0～5.0；
2)、在20mL质量浓度为1.2～1.8％的多聚磷酸钠溶液中加入儿茶素，从而配制成儿茶素浓度为60～65mg/mL的儿茶素--多聚磷酸钠溶液；
3)、将步骤2)所得的儿茶素--多聚磷酸钠溶液全部加至步骤1)所得物中，所得的反应体系于20～30℃持续搅拌30～50min，得儿茶素纳米粒混悬液。
2.根据权利要求1所述的降低黄曲霉毒素生物利用度的儿茶素纳米粒的制备方法，其特征是：
所述步骤3)中，将步骤2)所得的儿茶素--多聚磷酸钠溶液于10～15分钟内均匀滴加至步骤1)所得物中。
3.根据权利要求1或2所述的降低黄曲霉毒素生物利用度的儿茶素纳米粒的制备方法，其特征是：
所述步骤1)中，磁力搅拌的转速为800～1000r/min。
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