CN103054810A - 一种高包封率姜黄素白蛋白纳米药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种姜黄素和白蛋白纳米颗粒的药物组合物及其制备方法，所述白蛋白可以是人血清白蛋白或牛血清白蛋白制备，也可以卵清蛋白为原料，优选为人血清白蛋白。使用本发明制备得到的药物组合物具有更好的包封率。

Description

一种高包封率姜黄素白蛋白纳米药物组合物

发明领域

本发明涉及医药技术领域，具体为姜黄素和白蛋白制成的纳米颗粒的药物组合物、制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

姜黄素(curcumin)是从姜科姜黄属(curcuma L.)植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一种多酚类化合物，结构式如下：

药理实验表明，姜黄素具有多种药理作用，包括抗炎、抗癌、抗氧化、保护肾脏、抑制肺纤维化、抑制肝纤维化、帮助肌肉损伤修复、治疗白内障、抗寄生虫病等，特别是在肿瘤预防和治疗方面，由于疗效显著，且毒副作用小，使用安全，可能成为非常有前景的候选药物【Yallapu MM,et al.Curcumin nanoformulations:a future nanomedicine for cancer.Drug Discov Today 2011 Sep 18.doi:10.1016/j.drudis.2011.09.009】。姜黄素对肿瘤癌变的三个阶段均有很强的防治作用，为一具有多靶点特征的天然肿瘤化学预防剂和治疗剂【Thangapazham RL,et al.Multiple molecular targets in cancer chemoprevention bycurcumin.AAPS J 2006;8:E443–9.】。姜黄素通过调节与肿瘤增殖、凋亡、浸润和新生血管生成的相关基因实现抗肿瘤作用【Goel A,et al.Curcumin as“Curecumin”:from kitchento clinic.Biochem Pharmacol 2008;75:787–809】。

但是，姜黄素目前在国际上尚未有相关药品上市，一方面是因为其口服吸收差和严重的肝首过效应，口服给药不能满足治疗所要求的血药浓度，这一点已经被诸多的动物体内药代动力学试验所证实【Pan MH,et al.Biotransformation of curcumin through reduction andglucuronidation in mice.Drug Metab Dispos 1999;27:486-94；Yang KY,et al.Oralbioavailability of curcumin in rat and the herbal analysis from Curcuma longa byLC-MS/MS.J Chromatogr 2007;853:183-9；Cheng AL,et al.Phase I clinical trial ofcurcumin,a chemopreventive agent,in patients with highrisk or pre-malignantlesions.Anticancer Res 2001;21:2895-900；Sharma RA,et al.Phase I clinical trialof oral curcumin:biomarkers of systemic activity and compliance.Clin Cancer Res2004;10:6847–54；Garcea G,et al.Detection of curcumin and its metabolites inhepatic tissue and portal blood of patients following oral administration.Br J Cancer2004;90:1011–5.】。文献报道，姜黄素的口服生物利用度小于1%【Anand P,et al.Bioavailability of curcumin:problems and promises.Mol Pharm 2007;4:807-18.】。特别有说服力的例子是，在美国进行的姜黄素治疗胰腺癌的Ⅱ期临床研究中，试验者给患者每天口服8.0克姜黄素，而患者能达到的血药浓度仅为22～41ng/mL【Navneet D,et al.PhaseII trial of curcumin in patients with advanced pancreatic cancer.Clin Cancer Res2008;14(14):4491-9.】。

另一方面的重要原因是姜黄素在体内代谢太快，采用常规增溶技术制成注射剂仍然难以有效的降低其在血液中的代谢速度从而保持有效的血药浓度，如姜黄素的甘油缩甲醛溶液注射到小鼠体内半小时后血液中已难检测到姜黄素的存在【Ireson C,et al.Characterizationof metabolites of the chemopreventive agent curcumin in human and rat hepatocytesand in the rat in vivo，and evaluation of their ability to inhibit phorbolester-induced prostaglandin E2 production.Cancer Res 2001;61:1058.】。

基于以上姜黄素普通制剂的缺陷，本发明利用姜黄素这一多酚类化合物具有高蛋白结合率的特点，采用人白蛋白制成一种纳米粒制剂，在解决水溶性问题的同时实现药物的缓释，从而降低了姜黄素在血液中的的代谢速度。

白蛋白纳米颗粒是人或动物白蛋白与药物一起制成的一种微球制剂。白蛋白微球安全无毒、无免疫原性、可生物降解、生物相容性好，具独特靶向性、药物缓控释性、提高难溶药物的溶解率和吸收率、提高药物疗效、降低毒副作用和保护药物等作用【张志清,等.中国药师1999;2(4):182-3；程宇慧,廖工铁.白蛋白微球的体内研究概况.华西药学杂志1991;6(3):150-4.】，是一种理想的药物载体。白蛋白纳米颗粒进入血液很快作为异物被巨噬细胞吞噬，故能被动靶向至巨噬细胞丰富的组织、器官，如肝、脾和肾，具有高度的靶向性。此外，肿瘤细胞代谢旺盛，肿瘤新生血管的通透性好，肿瘤部位血液丰富，均能使纳米颗粒被动靶向至肿瘤部位。因此，白蛋白纳米颗粒作为药物载体能够在提高药物抗肿瘤活性的同时有效降低药物的毒副作用。这种靶向性对肿瘤化疗十分必要。白蛋白微球多应用于静脉注射的被动靶向和抗体引导的主动靶向运输。在静脉注射制剂的研究中，包埋的药物多为抗癌的化学药物【王恺,马光辉.白蛋白微球的制备、改性和应用的研究进展.国外医学:药学分册2003;30(6):366-70.】。

发明内容

本发明提供一种含有姜黄素和白蛋白的药物组合物，其特征在于含有姜黄素和白蛋白的纳米颗粒。

上述药物组合物，其中所述白蛋白可以是人血清白蛋白或牛血清白蛋白制备，也可以卵清蛋白为原料，优选为人血清白蛋白。

上述药物组合物，姜黄素与白蛋白的比例为1：140，优选为1：1～20，更优选为1：10。

本发明提供一种制备包含姜黄素和人血清白蛋白纳米颗粒药用组合物的制备方法。取处方量人血清白蛋白，溶于水相，置于30℃恒温水浴，在持续搅拌（480rpm）的同时，向水相中滴加姜黄素的无水乙醇溶液至处方量，加入2％戊二醛水溶液，继续搅拌固化24小时，于35℃旋转蒸发去除有机溶剂，残留水相过0.22μm微孔滤膜，冻干，即得固体粉末。

与现有技术相比，本发明制备的药物组合物具有更好的包封率。检测结果显示，其包封率高于55%。

本发明所述的药物组合物具有良好的水溶性和稳定性，能够制备用于抗肿瘤的药物。其中，白蛋白可以是人血清白蛋白（HAS）或牛血清白蛋白（BSA）制备，也可以卵清蛋白为原料，优选人血清白蛋白。该组合物为水溶性混合物，在与可获得的类似药物制剂比较时，具有增加药物的生物利用度、增强药物靶向性及缓释的功能作用。

本发明中优选的药用载体包含蛋白质，可以使用任何适当的蛋白质。适当的蛋白质的实例包括白蛋白，IgA的免疫球蛋白，脂蛋白，载脂蛋白B，β-2-巨球蛋白，甲状腺球蛋白等。最优选的药用载体为白蛋白，最优选人血清白蛋白。适合于本发明的包括白蛋白的蛋白质可以是天然来源的或者合成制备的。

本发明中药物组合物优选的药用载体包括白蛋白、表面改性的白蛋白。表面改性的白蛋白包括：（1）经过修饰的白蛋白作原料来制备微球，从而使其具有新的表面性质；（2）可以在白蛋白微球制备好以后再进行表面修饰以达到表面改性。结合到白蛋白上的分子有甲氧基聚乙二醇（mPEG）、含巯基的分子等。在微球表面结合特定的抗体可以使微球对某种细胞具有特异的结合能力，从而将药物导向该细胞，实现特异性杀伤。

本发明药物组合物中白蛋白的量可根据药物活性、其它赋形剂和预期给药的途径和给药部位的不同进行调整。

本发明所涉及的药物组合物在临床上可用于抗肿瘤的治疗。包括但不限于人体恶性黑色素癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、消化道癌、头颈部癌、白血病、淋巴癌、前列腺癌。

附图说明

图1姜黄素人血清白蛋白纳米颗粒灭菌前的粒径分布；

图2姜黄素人血清白蛋白纳米颗粒灭菌后的粒径分布；

图3姜黄素人血清白蛋白纳米颗粒灭菌前的Zeta电位；

图4姜黄素人血清白蛋白纳米颗粒灭菌后的Zeta电位；

图5姜黄素人血清白蛋白纳米颗粒iv给药的大鼠血浆药时曲线；

图6姜黄素DMSO溶解分散iv给药的大鼠血浆药时曲线；

图7姜黄素白蛋白纳米颗粒对裸小鼠荷人胰腺癌实体瘤的抑瘤效果。

具体实施方式

以下实施例和试验例，不以任何方式限制本发明，本发明的宗旨和范围不限于这些实施例中所描述的具体条件或细节，而是由权利要求保护范围限定。

实施例1

试剂与材料：人血清白蛋白（Amresco分装，生物试剂）；25%戊二醛溶液（上海化学试剂采购供应站，生化试剂）；姜黄素（山东靶点药物研究有限公司提供，HPLC测定纯度>99.0%）。其它试剂为国产分析纯。

称取18.0g HSA于烧杯中，加入0.9％生理盐水50ml，搅拌，溶解，形成HSA生理盐水溶液，备用；另称取600.3mg姜黄素于烧杯中，加入10ml无水乙醇，溶解制成姜黄素无水乙醇溶液；将25%戊二醛溶液稀释为2%的戊二醛溶液。将HSA生理盐水溶液置于30℃恒温水浴，在持续搅拌（480rpm）的同时，向HSA生理盐水溶液中滴加姜黄素无水乙醇溶液10ml，继续滴加无水乙醇120ml；将2%戊二醛水溶液缓慢滴加至上述溶液中，继续搅拌固化24小时，于35℃旋转蒸发去除有机溶剂，残留水相过0.22μm微孔滤膜，冻干，即得固体粉末。测定结果显示，其平均粒径为135nm（见图1），包封率60.1%，灭菌前后的平均粒径和Zeta电位均无明显改变（见图1～4）。

实施例2

试剂与材料：人血清白蛋白（Amresco分装，生物试剂）；25%戊二醛溶液（上海化学试剂采购供应站，生化试剂）；姜黄素（山东靶点药物研究有限公司提供，HPLC测定纯度>99.0%）。其它试剂为国产分析纯。

称取9.0g HSA于烧杯中，加入0.9％生理盐水50ml，搅拌，溶解，形成HSA生理盐水溶液，备用；另称取600.1mg姜黄素于烧杯中，加入10ml无水乙醇，溶解制成姜黄素无水乙醇溶液；将25%戊二醛溶液稀释至2%的戊二醛溶液。将HSA生理盐水溶液置于30℃恒温水浴，在持续搅拌（480rpm）的同时，向HSA生理盐水溶液中滴加姜黄素无水乙醇溶液10ml，继续滴加无水乙醇120ml；将2%戊二醛水溶液缓慢滴加至上述溶液中，继续搅拌固化24小时，于35℃旋转蒸发去除有机溶剂，残留水相过0.22μm微孔滤膜，冻干，即得固体粉末。测得包封率为58.3%。

实施例3

试剂与材料：人血清白蛋白（Amresco分装，生物试剂）；25%戊二醛溶液（上海化学试剂采购供应站，生化试剂）；姜黄素（山东靶点药物研究有限公司提供，HPLC测定纯度>99.0%）。其它试剂为国产分析纯。

称取6.0g HSA于烧杯中，加入0.9％生理盐水50ml，搅拌，溶解，形成HSA生理盐水溶液，备用；另称取400.5mg姜黄素于烧杯中，加入10ml无水乙醇，溶解制成姜黄素无水乙醇溶液；将25%戊二醛溶液稀释至2%的戊二醛溶液。将HSA生理盐水溶液置于30℃恒温水浴，在持续搅拌（480rpm）的同时，向HSA生理盐水溶液中滴加姜黄素无水乙醇溶液10ml，继续滴加无水乙醇120ml；将2%戊二醛水溶液缓慢滴加至上述溶液中，继续搅拌固化24小时，于35℃旋转蒸发去除有机溶剂，残留水相过0.22μm微孔滤膜，冻干，即得固体粉末。测得包封率为57.9%。

实施例4

试剂与材料：人血清白蛋白（Amresco分装，生物试剂）；25%戊二醛溶液（上海化学试剂采购供应站，生化试剂）；姜黄素（山东靶点药物研究有限公司提供，HPLC测定纯度>99.0%）。其它试剂为国产分析纯。

称取9.0g BSA于烧杯中，加入0.9％生理盐水50ml，搅拌，溶解，形成BSA生理盐水溶液，备用；另称取600.2mg姜黄素于烧杯中，加入10ml无水乙醇，溶解制成姜黄素无水乙醇溶液；将25%戊二醛溶液稀释至2%的戊二醛溶液。

将BSA生理盐水溶液置于30℃恒温水浴，在持续搅拌（480rpm）的同时，向BSA生理盐水溶液中滴加姜黄素无水乙醇溶液10ml，继续滴加无水乙醇120ml；将2%戊二醛水溶液缓慢滴加至上述溶液中，继续搅拌固化24小时，于35℃旋转蒸发去除有机溶剂，残留水相过0.22μm微孔滤膜，冻干，即得固体粉末。测得包封率为59.2%。

试验例1 姜黄素人血清白蛋白纳米粒和姜黄素DMSO溶液静脉注射给药的大鼠血药浓度比较试验

试验药物：姜黄素人血清白蛋白纳米粒，按实施例1制备；姜黄素DMSO溶液，按常规方法制得，每1ml含姜黄素10mg。

试验动物：SD大鼠，体重200~220g，8只，雌雄各半，随机分为两组，每组4只。

试验仪器：Agilent 1100-ThermoTSQ Quantum Access液-质联用分析仪，包括四元梯度泵，自动进样器，柱温箱，电喷雾离子化接口，串联四极杆质谱检测器，Xcalibur色谱工作站。其中，Agilent 1100高效液相分析系统为美国Agilent公司产品，Thermo TSQ Quantum Access三重四级杆串级质谱系统为美国Thermo Fischer公司产品。

试验方法：8只大鼠，分别肌肉注射5mg/kg试验药物和对照药物，并于给药前（0h）和给药后4h，8h，12h,18h,24h,36h,2d，3d，5d，7d，9d，由大鼠眼内眦取血400μl，置经肝素处理的离心管中，离心分离血浆，-20℃冰箱中保存。LC-MS/MS法检验各血浆样品中的姜黄素浓度。

结果与结论：两种姜黄素制剂静脉注射的大鼠血浆药时曲线分别见图5和图6。结果表明，姜黄素以DMSO溶液形式注射给药，在大鼠体内迅速代谢消除，维持有效血药浓度的时间很短；本发明制备的姜黄素人血清白蛋白纳米粒，肌肉注射9天内在大鼠血浆中均可检测到较高水平的姜黄素，且血药浓度波动较小，处于平缓释放状态。

试验例2 姜黄素白蛋白纳米颗粒体内抗肿瘤试验

观察受试物静脉注射对小鼠U14宫颈癌、Lewis肺癌的抑瘤活性。实验选用SPF级C57BL/6小鼠。设阴性对照组、阳性对照（环磷酰胺）组和姜黄素白蛋白纳米颗粒（按实施例1制备）高（30mg/kg）、中（15mg/kg）、低（7.5mg/kg）剂量组。采用腋下接瘤方法，接瘤后次日随机分组，连续静脉给药10天，每天1次。于末次给药24小时后，脱颈椎处死小鼠，剥取瘤组织，称重，计算抑瘤率。

表1数据表明，姜黄素白蛋白纳米颗粒静脉给药对小鼠U14宫颈癌及Lewis肺癌均显示显著的体内抑瘤作用。

表1 姜黄素白蛋白纳米颗粒对小鼠U14宫颈癌及Lewis肺癌的抑瘤率

试验例3 姜黄素白蛋白纳米颗粒对裸小鼠荷人胰腺癌实体瘤的抑制作用

观察受试物静脉注射对裸小鼠荷人胰腺癌实体瘤的抑制作用。实验选用4～6周龄雄鼠（SPF/VAF BALB/cAn/nu，山东靶点药物研究有限公司），设阴性对照组、阳性对照（吉西他滨）组和姜黄素白蛋白纳米颗粒组（按实施例1制备，给药剂量以姜黄素计30mg/kg）。取密度为5×10⁶的人胰腺癌细胞DMEM培养液0.1ml，经右侧腋窝皮下注射接瘤。接瘤后次日随机分组，连续静脉给药10天，每天1次。给药期间，每两天测量一次肿瘤体积，依据下式计算肿瘤体积：

肿瘤体积=4/3×3.14×(L/2×W/2×W/2)

其中，L为瘤长，W为瘤宽。

于末次给药24小时后，测量肿瘤体积和体重，处死动物，剥瘤，称重，计算体内肿瘤相对增殖率。

所有结果都以平均值±标准偏差表示；采用方差分析统计组间差异，P<0.05时认为差异显著。

如图7所示，在给药周期内，姜黄素白蛋白纳米粒组可显著抑制裸小鼠荷人胰腺癌实体瘤的体内增殖，体内肿瘤的相对增殖率为34.06%，显著低于阴性对照组差异显著，与阳性对照（吉西他滨）组的结果（38.15%）无统计学差异。

Claims (8)

1.一种以白蛋白为药用载体的药物组合物，其特征在于含有姜黄素和白蛋白。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述白蛋白选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白以及卵清蛋白。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述白蛋白是人血清白蛋白。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中姜黄素与白蛋白的比例为1：1～40。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中姜黄素与白蛋白的比例为1：1～20。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中姜黄素与白蛋白的比例为1：10。

7.一种制备包含姜黄素和人血清白蛋白的药用组合物的制备方法，取处方量人血清白蛋白溶于水相，置于30℃恒温水浴，在持续搅拌（480rpm）的同时，向水相中滴加姜黄素无水乙醇溶液至处方量，加入2％戊二醛水溶液，继续搅拌固化24小时，于35℃旋转蒸发去除有机溶剂，残留水相过0.22μm微孔滤膜，冻干，即得固体粉末。

8.权利要求1～6任一所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤选自人体恶性黑色素癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、消化道癌、头颈部癌、白血病、淋巴癌、前列腺癌。

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