CN110496111B - 一种白蛋白纳米复合结构及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种白蛋白纳米复合结构及其制备方法和应用，所述纳米复合结构包括疏水性种子内核和白蛋白分子外壳；其中，所述疏水性种子内核包括阿霉素和姜黄素，所述疏水性种子内核与白蛋白分子为非缀合的位置关系；本发明通过优化制备工艺，简化反应条件和步骤，将白蛋白纳米分子和药物混合物相结合，各步骤各条件协同增效，牵一发而动全身，最终成功制备得到白蛋白纳米复合结构，产物性能优异，粒径适中且可控，不需要高压反应，能搭载多种药物，有效抑制癌细胞的生产，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

Description

一种白蛋白纳米复合结构及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米药物技术领域，尤其涉及一种白蛋白纳米复合结构及其制备方法和应用。
背景技术
阿霉素又名多柔比星和羟基柔红霉素，是一种用于癌症化疗的药物。它是一种天然柔红霉素类的蒽环类抗生素，通常用于治疗血液恶性肿瘤等多种癌症。目前，已经确定的阿霉素的抗癌机制有两种。第一种机制是指阿霉素通过插入DNA并随后破坏拓扑异构酶-II介导的DNA修复，与拓扑异构酶-II相关的候选药物基因有TOP2A，MLH1，MSH2，TP53和ERCC2等基因。第二种机制涉及细胞膜、DNA、蛋白的氧化应激反应，与其相关的基因有NADH脱氢酶，一氧化氮合酶，黄嘌呤氧化酶，谷胱甘肽过氧化物酶，过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等。阿霉素的应用，并不是一帆风顺的，其在使用时表现出较严重的剂量依赖性和心脏毒性使其临床应用受到限制。另外，还有其他的常见的阿霉素毒性包括骨髓抑制，急性恶心和呕吐，脱发，口腔炎和外渗反应等。
姜黄素(diferuloylmethane)是香料姜黄的主要成分，源自东印度姜黄的根茎。姜黄素作为膳食补充剂已被使用了数个世纪，其具有安全的药理特性。姜黄素发挥其抗癌作用的机制是全面和多样的，其靶向细胞生长和凋亡过程中的许多调节水平。由于姜黄素对细胞生长调节过程具有深远的影响，它有望成为许多人类癌症的潜在化学治疗剂。姜黄素的强效抗氧化性和自由基猝灭性质在化合物对癌发生的初始阶段的抑制作用中起重要作用。已经显示姜黄素具有抑制UV辐射诱导的DNA诱变和诱导细胞SOS功能的能力。在不同肿瘤(口腔癌，乳腺癌和肠肿瘤)的几种动物模型中也证明了姜黄素对肿瘤的抑制作用。另外，姜黄素也可作为其他抗癌药物在治疗人类乳腺癌细胞，特别是多药耐药(MDR)乳腺癌细胞中的化学增敏剂。
白蛋白是可用于制备不同种类纳米颗粒的最丰富的血浆蛋白质。市售紫杉醇制剂Abraxane是被FDA批准用于治疗乳腺癌的白蛋白类药物。白蛋白是天然的聚合物，具有良好的生物相容性，可生物降解，无毒且无免疫原性，并且白蛋白纳米粒子可以以简单易行的制备程序以各种尺寸制备。
通常有两种类型的白蛋白用于构建纳米粒子：人血清白蛋白(HSA)和牛血清白蛋白(BSA)。两种白蛋白都是血清白蛋白(分别来自人血清和牛血清)，并且具有很多特性，包括在水中的高溶解度，在血液中的长半衰期，相似的分子量(65-70kDa)，相似的数量的氨基酸残基(HSA为585个氨基酸，BSA为583个氨基酸)。两种类型的白蛋白在构建纳米医学上没有观察到明显的性质差异。白蛋白分子对多种药物的独特结合能力使其成为使用广泛的药物载体。这种显着的结合能力来自蛋白质的疏水性和亲水性结构域以及不同带电荷的氨基酸。白蛋白中不同氨基酸的存在使其成为与多种化合物缀合的合适候选物，这两种白蛋白已被广泛用于设计多功能纳米颗粒。
市售紫杉醇白蛋白制剂ABRAXANE在制备时采用的是Nab技术，Nab技术中需要将药物缀合到白蛋白分子上并且在制备时需要加高压来获得较小尺寸的纳米粒子。CN1448128提供了一种制备有抗肿瘤性质的紫杉醇和白蛋白的纳米颗粒的方法，用此方法，将通过向白蛋白与氯仿的水溶液中加入粉末状紫杉醇得到的混合物进行高压均质处理而制备得到。CN104189916A提供一种多聚体白蛋白纳米球，所述多聚体白蛋白纳米球包括含巯基和/或二硫键的白蛋白分子，所述白蛋白分子之间通过二硫键相互连接，所述多聚体白蛋白纳米球的粒径为10～1000nm。CN107669660A提供一种由加压震动包裹法制作的胃肠道肿瘤靶向磁性阿霉素白蛋白纳米粒，包括内核为磁性阿霉素白蛋白纳米粒，外层为高分子高分子聚合物包裹层，磁性阿霉素白蛋白纳米粒表面的高分子聚合物包裹层高低不平，且单个磁性阿霉素白蛋白纳米粒表面有些局部包裹有高分子聚合物层、有些局部未包裹高分子聚合物层；现有技术对白蛋白纳米结构的制备方法条件苛刻，抑或得到的载体产物应用范围窄，只能搭载单一药物。
因此，将白蛋白分子与药物分子的结合方式进行改造和优化，研发一种既能高效发挥药效，制备方法又简便的纳米复合机构，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种白蛋白纳米复合结构，所述白蛋白纳米复合结构性能高效，制备工艺简洁，反应条件温和，能搭载多种药物，有效抑制癌细胞生存，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种白蛋白纳米复合结构，所述纳米复合结构包括疏水性种子内核和白蛋白分子外壳；
其中，所述疏水性种子内核包括阿霉素和姜黄素，所述疏水性种子内核与白蛋白分子为非缀合的位置关系。
白蛋白蛋白质中疏水性和亲水性结构域和带电氨基酸(如谷氨酸和赖氨酸)的存在使其能够包载多种药物，它是一个首选的药物载体，可以包封几种不同类型的药物形成强大的结构。常规方法通常将白蛋白用于递送一种分子缀合的药物并且将药物与白蛋白缀合是一个耗时费力的过程，如果可以直接用白蛋白包载药物将省时省力。本发明中，发明人在Nab技术的基础上进行了改进，以阿霉素与姜黄素作为疏水性种子内核，白蛋白分子包围在种子内核周围而形成白蛋白纳米复合结构(CurDox NPs)，对制备方法进行优化，多步骤多条件协同增效，制备过程不需要将药物分子缀合到白蛋白分子上，这样既方便药物分子在靶部位更好的发挥药效，同时又不需要施加高压即可得到粒径适中的白蛋白纳米粒子，能够对多种药物进行包载，灵活性显著提高，联合疗法也将有助于联合利用药物的协同效应。
白蛋白纳米粒中包载有阿霉素和姜黄素两种药物，阿霉素又名多柔比星和羟基柔红霉素，是一种用于癌症化疗的药物。姜黄素是香料姜黄的主要成分，源自东印度姜黄的根茎，也是一种可用于抗癌的药物。与单载药相比，联合载药将有助于增加药物功效因为它提供了更多潜在的癌细胞靶位点。同时，与单一载药相比，联合载药可以减少单一药物的使用，因此可以减少单一药物的副作用；使用双载药递送体系，癌症的转移风险要远低于单一给药。
优选地，所述白蛋白纳米复合结构为球形，常态尺寸为20-30nm，例如可以是20nm、22nm、24nm、26nm、28nm或30nm，平均水合粒径为90-100nm，例如可以是90nm、92nm、94nm、96nm、98nm或100nm。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的白蛋白纳米复合结构用于制备抗癌药物的用途。
第三方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的白蛋白纳米复合结构的方法，包括如下步骤：
(1)将BSA溶于双蒸水中，姜黄素和阿霉素分别溶解于DMSO中，得到BSA溶液、阿霉素溶液和姜黄素溶液；
(2)向步骤(1)得到的阿霉素溶液中加入肼溶液，振荡混合均匀；
(3)向步骤(2)得到的产物中加入步骤(1)得到的姜黄素溶液，振荡混合，得到阿霉素-姜黄素混合液；
(4)将步骤(3)得到的混合液逐滴加入步骤(1)得到的BSA溶液中，边加边搅拌；
(5)向步骤(4)得到的溶液中逐滴加入戊二醛溶液，避光搅拌后洗涤过滤，得到所述白蛋白纳米复合结构。
本发明中，发明人为了将白蛋白分子与阿霉素和姜黄素的混合物相结合，发挥药物分子和白蛋白分子的理化特性，优化制备工艺和反应条件，经过复杂实验摸索验证，所提供的上述制备方法，各步骤各条件协同增效，缺一不可，牵一发而动全身，最终成功制备得到性能优异的白蛋白纳米复合机构。
优选地，步骤(1)所述BSA溶液的体积百分比为0.2-0.3％，例如可以是0.2％、0.22％、0.24％、0.26％、0.28％或0.3％。
优选地，所述阿霉素溶液的浓度为13-15mg/mL，例如可以是13mg/mL、13.5mg/mL、14mg/mL、14.5mg/mL或15mg/mL。
优选地，所述姜黄素溶液的浓度为6-10mg/mL，例如可以是6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL或10mg/mL。
优选地，步骤(2)所述肼溶液的体积百分比为0.05-0.15％，例如可以是0.05％、0.1％、0.12％或0.15％，体积为70-90μL，例如可以是70μL、75μL、80μL、85μL或90μL。
优选地，步骤(2)所述振荡的方法为涡旋振荡1-3min，例如可以是1min、1.2min、1.4min、1.6min、1.8min、2min、2.5min、2.7min或3min。
优选地，步骤(3)所述振荡的方法为涡旋振荡20-40秒，例如可以是20秒、22秒、24秒、26秒、28秒、30秒、32秒、34秒、36秒、38秒或40秒。
优选地，步骤(4)所述搅拌的转速为800-1200rpm，例如可以是800rpm、900rpm、1000rpm、1100rpm或1200rpm。
优选地，步骤(5)所述戊二醛的体积百分比为0.03-0.07％，例如可以是0.03％、0.04％、0.05％、0.06％或0.07％，体积为180-220μL，例如可以是180μL、190μL、200μL、210μL或220μL。
本发明中，为了使白蛋白纳米粒稳定存在，使用戊二醛对白蛋白分子中暴露的氨基进行交联。
优选地，步骤(5)所述搅拌的转速为800-1200rpm，例如可以是800rpm、900rpm、1000rpm、1100rpm或1200rpm。
优选地，步骤(5)所述洗涤的方法为采用超滤管在6000-8000rpm的转速下洗涤2-4次，例如可以是6000rpm、7000rpm、7500rpm或8000rpm，洗涤2次、3次或4次，每次8-10min，例如可以是8min、9min或10min。
作为优选技术方案，一种制备如第一方面所述白蛋白纳米复合结构的方法，具体包括如下步骤：
(1)将BSA溶于双蒸水中，姜黄素和阿霉素分别溶解于DMSO中，得到体积百分比为0.2-0.3％的BSA溶液、浓度为13-15mg/mL的阿霉素溶液和浓度为6-10mg/mL的姜黄素溶液；
(2)向步骤(1)得到的阿霉素溶液中加入体积百分比为0.05-0.15％，体积为70-90μL的肼溶液，涡旋振荡1-3min混合均匀；
(3)向步骤(2)得到的产物中加入步骤(1)得到的姜黄素溶液，振荡混合20-40秒，得到阿霉素-姜黄素混合液；
(4)将步骤(3)得到的混合液逐滴加入步骤(1)得到的BSA溶液中，边加边搅拌，搅拌的转速为800-1200rpm；
(5)向步骤(4)得到的溶液中逐滴加入体积百分比为0.03-0.07％，体积为180-220μL的戊二醛溶液，避光按800-1200rpm的转速搅拌后，采用超滤管在6000-8000rpm的转速下洗涤2-4次，每次8-10min，得到所述白蛋白纳米复合结构。
进一步优选地，本发明的白蛋白纳米粒(CurDox NPs)的制备方法，包括如下步骤：
第一步：储备液的配制：
将BSA溶解于双蒸水(DDW)中制得BSA储备溶液，浓度为100mg/mL。8.5mg姜黄素溶解在1mLDMSO中得姜黄素储备液，浓度为8.5mg/mL，15mg阿霉素溶解1毫升DMSO中得阿霉素储备液，浓度为15mg/mL；
第二步：将BSA储备液制成0.25％(v/v)的溶液，取3mL加入到小瓶中；
第三步：取80μL肼溶液(0.1％)加入到100μL阿霉素(15mg/mL)溶液中，将混合物涡旋振荡2min；
第四步：将上一步制备的阿霉素溶液加入到150μL姜黄素(8.5mg/mL)溶液中，涡旋振荡30秒，得到阿霉素-姜黄素混合物；
第五步：将阿霉素-姜黄素混合物在1000rpm速度的搅拌下逐滴加入到装有BSA溶液的小瓶中；
第六步：将200μL戊二醛(0.05％)逐滴加入到上述搅拌的溶液中，避光持续搅拌6h；
第七步：收集溶液，用超滤管洗涤三次(每次10分钟，7000rpm)以除去游离药物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的白蛋白纳米复合结构制备方法简洁高效，反应条件温和易操作，不需要将药物分子缀合到白蛋白分子上，这样既方便药物分子在靶部位更好的发挥药效，同时又不需要施加高压即可得到粒径适中的白蛋白纳米粒子，能够对多种药物进行包载，灵活性显著提高，有理由利用联合药物的协同作用；而且，本发明提供的白蛋白纳米复合结构具有优异的细胞毒性，有效地抑制耐药癌细胞的生存活力。
附图说明
图1为本发明提供的CurDox NPs的TEM图像；
图2为本发明提供的CurDox NPs的水合半径图；
图3为本发明提供的CurDox NPs的FTIR结果图；
图4为本发明提供的CurDox NPs的UV-Vis吸收光谱图；
图5为本发明提供的CurDox NPs中的Cur和Dox在PBS缓冲液(pH 5.5和pH 7.4)中的时间依赖性释放图；
图6为本发明提供的游离CurDox与CurDox NPs细胞毒性图，其中图6(A)为在MCF-7抗性细胞作用24h的细胞毒性图，图6(B)为在MCF-7敏感细胞作用24h的细胞毒性图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1白蛋白纳米复合结构的制备
第一步，将BSA溶解于双蒸水(DDW)中制得BSA储备溶液，浓度为100mg/mL；8.5mg姜黄素溶解在1mL DMSO中得姜黄素储备液，浓度为8.5mg/mL。15mg阿霉素溶解1毫升DMSO中得阿霉素储备液，浓度为15mg/mL；利用BSA储备液配置成0.25％(v/v)的BSA溶液后，取3mL加入到小瓶中；
第二步，取80μL肼溶液(0.1％)加入到100μL阿霉素储备液中，混合物涡旋振荡2min充分混合后，将其加入到150μL姜黄素储备溶液中，涡旋振荡30秒充分混合得到阿霉素-姜黄素混合物；
第三步，将阿霉素-姜黄素混合物在1000rpm速度的搅拌下逐滴加入到提前装有BSA溶液的小瓶中，滴加完毕后，将200μL戊二醛(0.05％)逐滴加入到上述搅拌的溶液中，避光持续搅拌6h；6h后，收集小瓶中溶液，用超滤管洗涤三次(每次10分钟，7000rpm)以除去游离药物。
实施例2
利用透射电镜照片和动态光散射对最终制得的白蛋白纳米粒的粒径进行表征，结果见图1和图2；
由图1所示，透射电镜图像显示CurDox纳米粒呈现球状且分散性良好，尺寸在20-30nm之间；由图2可知，动态光结果显示该纳米粒平均水合粒径约为96nm。
实施例3
采用紫外可见分光光度计和傅里叶变换红外光谱来验证两种药物均包裹在白蛋白纳米颗粒内部，结果见图3和图4所示；
如图3和图4所示，紫外可见光谱中，CurDox NPs显示出姜黄素和阿霉素两种紫外吸收峰；傅里叶变换红外光谱也显示CurDox NPs在430nm处显示出与姜黄素和阿霉素混合物一致的峰型；两种结果均证明了姜黄素和阿霉素被同时包裹在白蛋白纳米颗粒中。
实施例4
利用透析方法对BSA纳米颗粒中的两种药物(Cur和Dox)在酸性和中性条件下进行了释放研究；达到预设点时，将样品取出后通过UV-Vis光谱进行含量测定，结果如图5所示；
如图5所示，CurDox NPs在酸性和中性条件下均能够释放Cur和Dox。CurDox NPs在pH5.5条件下的释放要快于pH7.4的条件；可能是由于酸性环境中蛋白质构象会发生强烈变化，也暗示着酸性环境会破坏纳米颗粒的稳定性而释放药物。
实施例5
利用MTT实验测定了游离药物和CurDox NPs对MCF-7抗性细胞和MCF-7敏感性细胞的细胞毒性。用多模板读数器(PerkinElmer)在570nm波长下分别测量每组细胞的吸光度；用与药物共孵育的细胞的吸光度除以空白细胞的吸光度并以百分比值表示来计算细胞活力，结果见图6(A)和图6(B)；
如图6(A)和图6(B)所示，与游离药物相比，CurDox NPs对MCF-7抗性细胞显示更高的细胞毒性而对MCF-7敏感细胞的细胞毒性作用较低，结果表明纳米颗粒可以有效地抑制耐药癌细胞的生存活力。
综上所述，本发明提供的白蛋白纳米复合结构具有优异且高效的性能，制备工艺简洁，反应条件温和易操作，不需要高压反应，粒径大小适中且可控，能搭载多种药物发挥协同作用，能够有效地抑制耐药癌细胞的生存活力，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (4)

1.一种白蛋白纳米复合结构，其特征在于，所述纳米复合结构包括疏水性种子内核和白蛋白分子外壳；
其中，所述疏水性种子内核包括阿霉素和姜黄素，所述疏水性种子内核与白蛋白分子为非缀合的位置关系；
所述白蛋白纳米复合结构的制备方法包括如下步骤：
(1)将BSA溶于双蒸水中，姜黄素和阿霉素分别溶解于DMSO中，得到体积百分比为0.2-0.3％的BSA溶液、浓度为13-15mg/mL的阿霉素溶液和浓度为6-10mg/mL的姜黄素溶液；
(2)向步骤(1)得到的阿霉素溶液中加入体积百分比为0.05-0.15％，体积为70-90μL的肼溶液，涡旋振荡1-3min混合均匀；
(3)向步骤(2)得到的产物中加入步骤(1)得到的姜黄素溶液，振荡混合20-40秒，得到阿霉素-姜黄素混合液；
(4)将步骤(3)得到的混合液逐滴加入步骤(1)得到的BSA溶液中，边加边搅拌，搅拌的转速为800-1200rpm；
(5)向步骤(4)得到的溶液中逐滴加入体积百分比为0.03-0.07％，体积为180-220μL的戊二醛溶液，避光按800-1200rpm的转速搅拌后，采用超滤管在6000-8000rpm的转速下洗涤2-4次，每次8-10min，得到所述白蛋白纳米复合结构。
2.根据权利要求1所述的白蛋白纳米复合结构，其特征在于，所述白蛋白纳米复合结构为球形，TEM尺寸为20-30nm，平均水合粒径为90-100nm。
3.一种如权利要求1或2所述的白蛋白纳米复合结构用于制备抗癌药物的用途。
4.一种制备如权利要求1或2所述的白蛋白纳米复合结构的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将BSA溶于双蒸水中，姜黄素和阿霉素分别溶解于DMSO中，得到体积百分比为0.2-0.3％的BSA溶液、浓度为13-15mg/mL的阿霉素溶液和浓度为6-10mg/mL的姜黄素溶液；
(2)向步骤(1)得到的阿霉素溶液中加入体积百分比为0.05-0.15％，体积为70-90μL的肼溶液，涡旋振荡1-3min混合均匀；
(3)向步骤(2)得到的产物中加入步骤(1)得到的姜黄素溶液，振荡混合20-40秒，得到阿霉素-姜黄素混合液；
(4)将步骤(3)得到的混合液逐滴加入步骤(1)得到的BSA溶液中，边加边搅拌，搅拌的转速为800-1200rpm；
(5)向步骤(4)得到的溶液中逐滴加入体积百分比为0.03-0.07％，体积为180-220μL的戊二醛溶液，避光按800-1200rpm的转速搅拌后，采用超滤管在6000-8000rpm的转速下洗涤2-4次，每次8-10min，得到所述白蛋白纳米复合结构。
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