CN112618497B - 一种单宁酸姜黄素纳米粒子及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种单宁酸姜黄素纳米粒子及其制备方法和用途，属于生物医用材料领域。该纳米粒子是由如下重量配比的原料制备而成：人血清白蛋白80～100份，京尼平10～50份，药物1～20份，单宁酸10～50份。该药物优选为姜黄素。本发明单宁酸载药纳米粒子原料来源于食品级材料，其毒性远低于其他合成的化学纳米材料；该纳米粒子稳定性好，包封率和载药率高；更重要的是，本发明纳米粒子对病变结肠具有靶向功能，该纳米粒子可以免受胃环境的破坏性影响，使其效果优于以往报道的其他纳米递药系统。因此，本发明为结肠部位，特别是溃疡性结肠炎的治疗提供了一种更具前景的口服给药系统。

Description

一种单宁酸姜黄素纳米粒子及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种单宁酸姜黄素纳米粒子及其制备方法和用途。
背景技术
溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性、反复发作的炎症性疾病。它位于远端肠，主要涉及直肠、结肠粘膜和粘膜下层。溃疡性结肠炎发病率在欧洲和美国最高；近年来亚洲和低收入国家的发病率也最近急剧上升。溃疡性结肠炎的一线治疗主要集中在氨基水杨酸、皮质类固醇和免疫抑制药物。但是，这些药物的疗效有限，并会导致严重的副作用，包括腹泻、骨质疏松或感染。鉴于此，对找到更好的治疗方案和筛选天然生物活性化合物具有更高的要求，这已成为一种有前途的替代策略。
姜黄素(CUR)是一种疏水多酚衍生物，通常从姜科植物中提取，已经得到了世界卫生组织(WHO)和美国食品和药物管理局(FDA)的批准。近年来，临床前动物研究和临床人体试验均显示了CUR对UC具有一定的治疗作用，如抑制相关的炎症信号通路(NF-κB,TLR4-MyD88-NF-κB,MAPK,JAK/STAT,PI3K-AKT-mTOR等)、调节免疫反应、维护和修复肠上皮屏障、调节肠道菌群、抗氧化剂和其他机制。尽管CUR具有这些很有前途的发现，但由于其自身的局限性限制了其临床应用，包括较差的溶解度和低生物利用度。重要的是，口服姜黄素后，进入结肠炎症病灶药物含量低、停留时间短，进而影响其疗效。为了解决上述问题，研究人员使用纳米药物传递系统(NDDS)——如脂质体、聚合物-药物偶联物、颗粒、纳米颗粒和胶束——已被用于装载CUR，为UC提供更有效的治疗。然而，目前很少使用安全、绿色材料的NDDSs装载CUR用于结肠递药。
人血清白蛋白(HSA)是美国FDA批准的一种纳米材料，具有生物相容性好、药物包封效率高、毒性低、水溶性好、无免疫原性等优点。值得注意的是，HSA已被临床用作静脉注射的癌症药物
Figure BDA0002880436370000011
的递送载体。对于NDDS口服治疗UC来讲，其主要目的是增强HSA的载药包封能力、胃肠道(GI)的稳定性和靶部位的结肠堆积。通常戊二醛等交联剂常用于蛋白类-纳米粒(NPs)，通过交联能改善靶标药物溶解度的能力，但也存在常规交联剂戊二醛引起的潜在毒性的问题。寻找一种安全、绿色材料的用于结肠的纳米药物传递系统具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种单宁酸姜黄素纳米粒子及其制备方法和用途。
本发明提供了一种单宁酸载药纳米粒子，它是由如下重量配比的原料制备而成：人血清白蛋白80～100份，京尼平10～50份，药物1～20份，单宁酸10～50份。
进一步地，前述的单宁酸载药纳米粒子是由如下重量配比的原料制备而成：人血清白蛋白90～100份，京尼平20～40份，药物1～10份，单宁酸20～40份；
优选地，所述人血清白蛋白和药物的质量比为100:(3～9)；
更优选地，所述人血清白蛋白和药物的质量比为100:(3～5)；
进一步优选地，所述人血清白蛋白和药物的质量比为100:5；
更进一步优选地，所述单宁酸载药纳米粒子是由如下重量配比的原料制备而成：人血清白蛋白100份，京尼平20份，药物5份，单宁酸20份。
进一步地，所述药物为治疗溃疡性结肠炎的天然药物或合成药物；
优选地，所述药物为姜黄素、绿原酸、大黄素、芦荟大黄素、布地奈德；
更优选地，所述药物为姜黄素。
本发明还提供了一种单宁酸纳米粒子，它是由如下重量配比的原料制备而成：人血清白蛋白80～100份，京尼平10～50份，单宁酸10～50份；
优选地，它是由如下重量配比的原料制备而成：人血清白蛋白90～100份，京尼平20～40份，单宁酸20～40份；
更优选地，它是由如下重量配比的原料制备而成：人血清白蛋白100份，京尼平20份，单宁酸20份。
本发明还提供了一种制备前述的单宁酸载药纳米粒子的方法，它包括如下步骤：
(1)将人血清白蛋白溶于去离子水中，得人血清白蛋白溶液；然后将京尼平和药物溶于有机溶剂中，得有机相；
(2)将有机相加入人血清白蛋白溶液中，超声，形成水包油乳液；
(3)将步骤(2)所得的水包油乳液室温下搅拌消除残留有机溶剂，进行高压匀质，交联，过滤，得药物纳米粒子；
(4)将单宁酸添加到药物纳米粒子中，搅拌、离心、洗涤、冻干，即得。
进一步地，
步骤(1)中，所述有机溶液为丙酮；
和/或，步骤(2)中，所述将有机相加入人血清白蛋白溶液中为在恒速搅拌下滴入人血清白蛋白溶液中；
和/或，步骤(2)中，所述超声为以70％的振幅功率超声6～10分钟；
和/或，步骤(3)中，所述室温下搅拌为室温下以400转/分钟搅拌6小时；
和/或，步骤(3)中，所述高压匀质条件为在700-800bar的室温下进行10～15次匀质循环；
和/或，步骤(3)中，所述交联为400rpm的室温下连续搅拌16小时；
和/或，步骤(3)中，所述过滤为0.85μm过滤器过滤；
和/或，步骤(4)中，所述搅拌为在室温下以400转/分钟恒速搅拌30～60分钟，
和/或，步骤(4)中，所述离心为以12000转/分的转速离心15分钟。
本发明还提供了前述的单宁酸纳米粒子在制备药物递送系统中的用途；
优选地，所述药物递送系统为口服药物递送系统。
进一步地，所述药物递送系统为用于结肠的药物递送系统；
优选地，所述药物递送系统为治疗溃疡性结肠炎的药物递送系统；
更优选地，所述药物递送系统是对溃疡性结肠炎有粘附作用的药物递送系统。
本发明还提供了前述的载药纳米粒子在制备药物中的用途；
优选地，所述药物为口服药物。
进一步地，所述药物为治疗结肠疾病的药物；
优选地，所述药物为治疗溃疡性结肠炎的药物；
更优选地，所述药物是对溃疡性结肠炎有粘附作用的药物。
本发明开发了一种稳定的药物递送系统用于UC的治疗，能够依附黏附于结肠炎症的部位，该药物递送系统为单宁酸载药纳米粒子。具体的，本发明制备了一种单宁酸姜黄素纳米粒子(TA/CUR-NPs)，本发明TA/CUR-NPs具有良好的尺寸可控性能，粒径分布均匀，形态大小均一，表面带负电，较高的CUR包封效率。Gnp和TA对维持TA/CUR NPs的稳定性都具有显著贡献。更具体地说，Gnp有助于稳定HSA，并通过交联提高其包封率。相比之下，TA可防止胃肠道对于NPs破坏。体外研究表明，TA/CUR NPs能够以时间和剂量依赖的方式提高细胞摄取效率。与游离CUR或CUR-NPs相比，TA/CUR-NPs具有更高的细胞摄取效率。体内研究进一步证实，TA/CUR-NPs对结肠病变部位具有良好的黏附能力。重要的是，TA/CUR-NPs可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，抑制TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS等促炎性细胞因子的表达，改善DSS诱导的小鼠结肠炎。TA/CUR-NPs治疗UC的效果显著优于游离CUR和CUR-NPs，TA/CUR-NPs是治疗UC的一种有前途的口服给药系统。
目前治疗UC的药物主要有5-氨基水杨酸(5-ASA)、糖皮质激素、免疫调节剂和生物制剂等，临床上常有严重的副作用。姜黄素是一种功能性食品衍生化合物，具有良好的生物相容性，具有抗炎、抗氧化、杀菌等多种药理活性。为了提高姜黄素治疗UC的疗效，人们设计了多种纳米系统。与以往的研究相比，本发明研究了一种单宁酸载药纳米粒子，特别制备了单宁酸姜黄素纳米粒子，该纳米粒子具有几个明显的优点：首先，纳米粒子(NPs)来源于食品级材料，其毒性远低于其他合成的化学纳米材料。其次，NPs的稳定和药物包封率有显著提高。同时，NPs可以被递送并黏附到目标病灶，具有靶向作用。此外，经口给药后，本发明NPs更稳定，NPs可以免受胃环境的破坏性影响，其工作性能优于以往报道的其他纳米递药系统。特别地，本发明TA/CUR-NPs能够有效治疗UC，且治疗UC的效果显著优于游离CUR和CUR-NPs。因此，本发明有别于以往的纳米系统研究，为UC的治疗提供了一种更具前景的口服给药系统。
总之，本发明单宁酸载药纳米粒子原料来源于食品级材料，其毒性远低于其他合成的化学纳米材料；该纳米粒子稳定性好，包封率和载药率高；更重要的是，本发明纳米粒子对病变结肠具有靶向功能，该纳米粒子可以免受胃环境的破坏性影响，使其效果优于以往报道的其他纳米递药系统。因此，本发明为结肠部位，特别是溃疡性结肠炎的治疗提供了一种更具前景的口服给药系统。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为HSA与Gnp交联度随交联时间变化曲线图。
图2为TA/CUR-NPs的表征及稳定性评价：(A)为TA/CUR-NPs的透射电镜和粒径分布；(B)为不同样品的X射线衍射谱；(C)为不同样品的红外光谱图；(D)为不同样品在7天稳定性试验中随时间的粒径变化曲线；(E)为不同样品在第3天的图像和DLS曲线；(F)为PBS和模拟胃液中的CUR-NPs稳定性；(G)为PBS和模拟胃液中的TA/CUR-NPs稳定性；(H)为37℃下含1％吐温-80的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中游离CUR和TA/CUR-NPs组的体外释放曲线(n＝3)；图中，a表示HSA，b表示游离CUR，c表示游离TA，d表示空白纳米粒，e表示TA/CUR-NPs，f表示游离CUR和空白纳米粒的混合物；数据表示为平均值±标准差(n＝3)。
图3为用Caco-2细胞系评价不同CUR制剂的细胞摄取：(A)不同浓度(2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL和16μg/mL)孵育80min后细胞摄取TA/CUR-NPs的定量测量；(B)CUR浓度为16μg/mL的不同孵育时间点(0min、20min、40min、60min和80min)细胞摄取TA/CUR-NPs的定量测量；(C)16μg/mL的CUR浓度孵育80min后，对不同1制剂(空白对照、游离CUR和TA/CUR-NPs)的TA/CUR-NPs的细胞摄取进行定量测量。(D)16μg/mL的CUR浓度孵育80min后，对游离CUR和TA/CUR-NPs的细胞摄取进行定性分析；数据表示为平均值±标准差(n＝3)；**p<0.01vs对照；##p<0.01vs游离CUR。
图4为利用Caco-2细胞系进行细胞摄取的流式细胞术分析和不同CUR制剂的定性评价：(A)TA/CUR-NPs的剂量依赖性细胞摄取(2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL和16μg/mL)的流式细胞仪摄取曲线；(B)TA/CUR-NPs的时间依赖性细胞摄取(0分钟、20分钟、40分钟、60分钟和80分钟)的流式细胞仪摄取曲线。(C)不同组(对照组、游离CUR组和TA/CUR-NPs组)在16μg/mLCUR浓度下孵育80分钟后细胞摄取的流式细胞仪分析。
图5为TA/CUR-NPs体内外黏附实验：(A)37℃孵育30min、60min和90min后不同样品大鼠结肠的离体荧光图像；(B)不同时间点各样品大鼠结肠荧光信号分析直方图。(C)溃疡性结肠炎小鼠在3小时、6小时、12小时和24小时口服不同剂型后的荧光图像；(D)在最终时间点不同剂型后的结肠荧光图像；(E)在最终时间点不同剂型上的小鼠结肠荧光信号分析直方图；数据表示为平均值±标准差(n＝6)。*p<0.05vs游离IR780；**p<0.01vs游离IR780；##p<0.01vs IR780-NPs。
图6为TA/CUR-NPs在小鼠溃疡性结肠炎的体内疗效：(A)口服不同样品后小鼠结肠的照片；(B)不同样品间结肠长度的直方图分析；(C)五种样品DAI评分曲线图分析；(D)五种样品中小鼠体重随时间变化的曲线图，标准化为零日体重的百分比；(E)五种样品结肠切片的H&E染色；数据表示为平均值±标准差(n＝6)；*p<0.01,**p<0.01。
图7为不同制剂组的心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏H&E染色切片。
图8为TA/CUR-NPs治疗溃疡性结肠炎后结肠炎性细胞因子变化及蛋白表达结果：(A)五种样品小鼠结肠MPO表达的直方图分析；(B)五种样品小鼠结肠炎性细胞因子(IL-6、TNF-α、IL-1β和iNOS)变化的直方图分析；(C)免疫印迹分析结果和5种样品小鼠结肠蛋白表达(TLR4、MyD88、NF-κB p65和β-actin)的直方图分析；数据表示为平均值±标准差(n＝6)；*p<0.01,**p<0.01。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1、本发明单宁酸姜黄素纳米粒子的制备
本发明主要采用水包油(O/W)单乳液-溶剂蒸发技术制备单宁酸姜黄素纳米粒子(TA/CUR-NPs)，具体方法如下：
(1)姜黄素纳米粒子的制备：将100mg人血清白蛋白(HSA)溶于50mL去离子水中制备HSA溶液；同时，将20mg京尼平(Gnp)和5mg姜黄素(CUR)分别完全溶解于1mL丙酮中，得有机相；上述两种有机相分别在恒速磁力搅拌下滴入HSA溶液中；然后混合物置于冰浴中，并使用探头超声波仪以70％的振幅功率超声处理6分钟以形成水包油乳液。该乳液在室温下以400转/分钟进一步搅拌6小时，以消除残留丙酮。然后将乳液引入高压匀质机中，在700-800bar的室温下进行15次匀质循环，然后在400rpm的室温下连续搅拌16小时，发生交联，交联后用0.85μm过滤器过滤纳米悬浮液以去除任何游离分子，得到姜黄素纳米粒子(CUR-NPs)。
(2)单宁酸姜黄素纳米粒子的制备：将20mg单宁酸(TA)添加到姜黄素纳米粒子(CUR-NPs)中，将CUR-NPs在室温下以400转/分钟恒速搅拌30分钟，搅拌后以12000转/分的转速离心15分钟，洗涤三次，然后冻干，回收即得单宁酸姜黄素纳米粒子(TA/CUR-NPs)。
制备得到的单宁酸姜黄素纳米粒子在-20℃下储存。
实施例2、本发明单宁酸大黄素纳米粒子的制备
本发明主要采用水包油(O/W)单乳液-溶剂蒸发技术制备单宁酸大黄素纳米粒子(TA/EM-NPs)，具体方法如下：
(1)大黄素纳米粒子的制备：将100mg人血清白蛋白(HSA)溶于50mL去离子水中制备HSA溶液；同时，将20mg京尼平(Gnp)和10mg大黄素(EM)分别完全溶解于1mL丙酮中，得有机相；上述两种有机相分别在恒速磁力搅拌下滴入HSA溶液中；然后混合物置于冰浴中，并使用探头超声波仪以70％的振幅功率超声处理6分钟以形成水包油乳液。该乳液在室温下以400转/分钟进一步搅拌6小时，以消除残留丙酮。然后将乳液引入高压匀质机中，在700-800bar的室温下进行15次匀质循环，然后在400rpm的室温下连续搅拌16小时，发生交联，交联后用0.85μm过滤器过滤纳米悬浮液以去除任何游离分子，得到大黄素纳米粒子(EM-NPs)。
(2)单宁酸大黄素纳米粒子的制备：将20mg单宁酸(TA)添加到大黄素纳米粒子(EM-NPs)中，将EM-NPs在室温下以400转/分钟恒速搅拌30分钟，搅拌后以12000转/分的转速离心15分钟，洗涤三次，然后冻干，回收即得单宁酸大黄素纳米粒子(TA/EM-NPs)。
制备得到的单宁酸大黄素纳米粒子在-20℃下储存。
以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。
试验例1、本发明单宁酸姜黄素纳米粒子制备工艺的筛选
一、人血清白蛋白(HSA)和京尼平(Gnp)交联时间的筛选
采用实施例1步骤(1)所述方法制备姜黄素纳米粒子(CUR-NPs)，仅改变人血清白蛋白(HSA)和京尼平(Gnp)的交联时间(2h、4h、8h、16h和32h)。采用茚三酮法进行交联度实验。结果如图1所示。
由图1可知HSA与Gnp的交联程度随交联时间增加而增加。值得注意的是，交联16h(47.14±1.24％)与32h(48.42±0.46％)的交联度值相近，说明交联度在16h时达到饱和。因此，选用16h的交联时间制备姜黄素纳米粒子(CUR-NPs)。
二、人血清白蛋白(HSA)和姜黄素(CUR)重量比的筛选
采用实施例1所述方法制备单宁酸姜黄素纳米粒子(TA/CUR-NPs)，仅改变人血清白蛋白(HSA)和姜黄素(CUR)的重量比。本发明研究表明：当HSA与CUR的重量比大于100:9时，纳米颗粒体系具有聚集沉淀的特点且药物的包封率(EE)小于50％；当重力比例小于100:3时，载药率很低(低于1.84±0.16％)，不利于提高姜黄素的生物利用度。因此，采用HSA和CUR重量比为100:3、100:5、100:7和100:9对制备单宁酸姜黄素纳米粒子(TA/CUR-NPs，简写NPs)的工艺进行优化。检测所得单宁酸姜黄素纳米粒子的基本特性：粒径、Zeta电位、包封率(EE)和载药率(LE)。结果如表1所示。
表1.不同HSA/CUR重量比下TA/CUR-NPs的基本特性
Figure BDA0002880436370000071
表1中，数据表示为平均值±标准差(n＝3)。
由表1可知，随着HSA/CUR重量比的增加，NPs的水动力平均粒径从约201nm显著增大到443nm，NPs的Zeta电位变化范围为-25.5mv至-33.0mv。这一结果表明，所有的比例制备得到的NPs的粒径均满足口服纳米粒子的要求，可以接受。但是，随着HSA和CUR重量比增加，EE从86.0％±6.0％(100:5)下降到73.1％±2.0％(100:7)和71.0±0.1(100:9)，包封率显著减少。因此，由于较低的EE，HSA/CUR重量比为100:7和100:9都没有被选择。此外，HSA/CUR重量比为100:3和100:5之间的EE没有显著差异，但是HSA/CUR重量比为100:5时的载药率(LE)比为100:3时高得多。在综合分析粒径、zeta电位、包封效率、载药量的基础上，选择重量比为100:5的TA/CUR-NPs为最佳制备工艺比例。
试验例2、本发明单宁酸姜黄素纳米粒子的表征。
采用实施例1制备单宁酸姜黄素纳米粒子(TA/CUR-NPs，或者NPs)，该纳米粒子使用动态激光光散射(DLS)测试粒径、zeta电位，并进行透射电镜图像(TEM)观察、X射线衍射和傅里叶变换红外光谱。
TA/CUR-NPs的平均粒径分布为220.4±4.3nm(图2A)，zeta电位为-28.8±0.4mV。NPs具有绝对值相对较大的负zeta电位，表明纳米体系稳定性良好，可以避免颗粒聚集，具有的负电位能与结肠上皮细胞带正电荷的蛋白能较好的通过电荷吸附相结合。因此，这些NPs的粘附和药物积累能力有望在结肠炎症组织中得到展现。
从形态学上看，TA/CUR-NPs的透射电镜图像(TEM)呈圆形，表面光滑，大小均一(图2A)。动态激光光散射(DLS)测出的水动力直径和TEM测量的直径差异是由于NPs在DLS过程中在水溶液中膨胀，而在TEM测试之前在脱水过程中收缩造成的。
为了确定CUR是否已被包裹在TA/CUR-NPs中，研究TA/CUR-NPs(实施例1)、纯的HSA、游离的CUR(free CUR)、游离的TA(free TA)、空白纳米粒(blank NPs，仅使用人血清白蛋白和京尼平作为原料，按照实施例1类似方法制备而得)、游离的CUR和空白纳米粒混合物对应的X射线衍射图(XRD)和傅里叶变换红外光谱(FTIR)。如图2B所示，游离的CUR的代表性XRD衍射图显示出许多尖锐的峰，表明其具有结晶性质。相反，HSA、游离TA、空白纳米粒和TA/CUR-NPs粉末没有这些代表性的峰，表明CUR与其HSA基质之间没有形成结晶复合物。这些结果提供了清晰的证据，表明晶体CUR在HSA基质中被转化为非晶态分子，表明CUR被封装在TA/CUR NPs中。如图2C所示，在CUR中，O-H键在3502cm-1处的特定峰值消失，这可能是由于CUR和HSA的酚羟基之间形成氢键所致。在CUR图谱中，1234cm-1处的峰为CUR的芳香环，已经移动到1282cm-1，这表明HSA和CUR之间存在疏水相互作用。此外，在空白纳米粒和TA/CURNPs观察到位移为1319/1321cm-1的C-N键，而游离的TA没有。这一结果可能是由于TA的五醛葡萄糖与HSA的脯氨酸残基之间的疏水相互作用。
试验例3、本发明单宁酸姜黄素纳米粒子的稳定性评价
纳米粒的稳定性是评价纳米粒的一个重要指标，对动物实验具有指导意义。因此，观察了三种不同的纳米粒(三种纳米粒分别为：①没有经过Gnp交联的CUR-NPs，即采用实施例1制备CUR-NPs的方法，但是在制备过程中不添加京尼平得到的纳米粒子；②经过Gnp交联的CUR-NPs，即实施例1制备得到的CUR-NPs；③经过Gnp交联的TA/CUR-NPs，即实施例1制备得到的TA/CUR-NPs)一周时间，结果如图2D所示。三种NPs在第一天的大小约为200nm，没有很大的变化。然而没有经过Gnp交联的CUR-NPs在第二天开始随着时间的增加，粒径发生急剧地变化。相反，经过Gnp交联的两个组CUR-NPs组和TA/CUR-NPs组在七天内的粒径变化并不明显。这一结果表明，Gnp的交联能力提高了HSA装载CUR的稳定性。此外，在第3天记录了这三种纳米粒子的大小和PDI，如图2E所示。在没有经过Gnp交联的CUR-NPs具有较高的PDI(0.303±0.025)时，并检测到两个峰，说明了该组NPs的不稳定性。在Gnp交联的条件下，通过与没有经过Gnp交联的CUR-NPs相比，CUR-NPs具有更好的水动力平均直径(219.4±6.4nm)和更低的PDI(0.190±0.052)。值得注意的是，与其他两组相比，TA/CUR-NPs组的PDI最低(0.102±0.018)。这说明TA可以帮助纳米系统更均匀地分布药物装载。
接下来评估了实施例1制备得到的CUR-NPs和TA/CUR-NPs在模拟胃环境下的稳定性。胃环境，包括低pH值和胃酶的存在，可能会对口服时TA/CUR-NPs的稳定性产生负面影响。如图2F和图2G所示：在胃环境下孵育2小时后，CUR-NPs组出现两个峰，颗粒大小大于400nm，PDI>0.3；但在相同条件下，TA/CUR-NPs的粒径略有增大，对应的PDI相对较低(0.138±0.03)(图2G)。因此，TA可以帮助CUR-NPs均匀分布，防止粒径进一步增大。
综上所述，通过稳定性研究，得出结论：HSA、Gnp和TA的组合对CUR负载很有帮助，有助于TA/CUR-NPs的稳定性。更具体地说，HSA是载CUR的良好载体，Gnp通过交联化学反应使HSA变得更稳定。最后，TA使NPs更稳定，并防止口服后胃环境的破坏性影响。
试验例4、本发明单宁酸姜黄素纳米粒子的体外释放
纳米粒的连续释药是药物传递系统的一个重要参数。如图2H所示，当暴露于pH值为7.4的含1％吐温-80的磷酸盐缓冲液中时，与游离CUR相比，TA/CUR-NPs释放更慢。特别是，CUR在大约10小时内几乎完全释放。然而，经过24小时的培养，只有大约30％的CUR从TA/CUR-NPs释放，并且在100小时内达到超过60％的CUR累积释放。在本发明中，TA/CUR-NPs在100h内可以持续释放CUR，实现4d以上的CUR控释。
试验例5、本发明单宁酸姜黄素纳米粒子的细胞摄取能力
采用流式细胞仪(FCM)对NPs进行定性分析，以确定TA/CUR-NPs的对Caco-2细胞的摄取效果并评价其摄取方式。流式细胞术也证实了TA/CUR-NPs在Caco-2细胞中的浓度和时间依赖性。如图3A所示，随着TA/CUR-NPs中CUR浓度从2μg/mL增加到16μg/mL(实施例中CUR为86μg/Ml，直接稀释到2μg/mL～16μg/mL)，TA/CUR-NPs中的CUR的荧光强度增强(姜黄素荧光波长是450-700nm，利用FITC通道成像即可，荧光增强，表明摄取的量更多，进入细胞的更多，生物利用度更高)，呈现出浓度依赖性。如图3B所示，在四个不同的时间点上，TA/CUR-NPs中CUR的荧光强度(16μg/mL)随时间的增加而增强，表现出时间依赖性。在四个时间点，随着强度的增加，在观察从60到80分钟荧光强度略有增加，表明在80分钟吸收达到饱和。以16μg/mL的CUR浓度将Caco-2细胞与游离CUR或TA/CUR NPs孵育80min后，TA/CUR NPs的荧光强度明显强于通过FCM检测的游离CUR(图3C，p<0.05)。说明TA/CUR-NPs的细胞摄取能力优于游离CUR。FCM曲线如图4。
共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)是定性分析NPs细胞摄取的典型方法。有效的细胞内化是改善UC治疗的前提。图像中染料的强度间接反映了Caco-2细胞对CUR的摄取浓度。同样，将Caco-2细胞与游离CUR或TA/CUR-NPs以16μg/mL的CUR浓度孵育80min，然后用CLSM测定荧光强度。正如所料，游离CUR在Caco-2细胞中显示弱绿色荧光，而在经TA/CUR-NPs处理的细胞中检测到更高的CUR强度(图3D)。这些结果表明TA/CUR-NPs比游离CUR向Caco-2细胞传递更多CUR。总体而言，定性和定性分析都证实TA/CUR-NPs比游离CUR更容易被Caco-2细胞摄取。
试验例6、本发明单宁酸姜黄素纳米粒子的黏附能力评价
黏附于结肠炎症部位是高效UC治疗的一种重要方式。本发明以单宁酸为基础，成功研制出具有抗UC活性的可降解黏附材料TA/CUR-NPs。
为观察TA/CUR-NPs纳米粒对炎症黏膜的黏附能力，由于姜黄素自身荧光弱，引入强荧光剂IR780替代主药姜黄素，按照相同工艺(与实施例1类似)制备出了IR780-NPS和TA/IR780-NPs。先采用TNBS法从UC大鼠模型中取出炎症结肠。然后使用活体成像系统对结肠进行离体成像。如图5A所示，连续三次灌流后，游离IR780强度迅速下降，而接受TA/IR780-NPs或IR780-NPs的组下降更慢。然而，在三个观察时间点内，TA/CUR-NPs的平均荧光强度明显强于IR780-NPs或游离IR780(p<0.05)(图5B)。这些结果表明TA对炎症粘膜具有良好的黏附能力。
除体外实验外，体内研究直接证实了TA/IR780-NPs的黏附能力。采用DSS诱导的UC小鼠进行评价。口服给相同剂量药物后不同时间点荧光图像由活体成像系统采集。为了排除结肠组织的自身荧光，从给予生理盐水的结肠组织中获得背景荧光。如图5C所示，灌胃3h或6h后各组平均荧光强度无显著差异。12h后，TA/IR780-NPs的平均荧光强度最强，其次是IR780-NPs和游离IR780。三组间的差异保持到终点(24小时)。此外，灌胃给药后24小时，取结肠，荧光图像和直方图如图5D和5E所示，表明TA/IR780-NPs的平均荧光强度明显高于其他两组(p<0.05)。综上所述，这些结果表明TA可以提高NPs对炎症结肠的体内和体外黏附能力。
试验例7、本发明单宁酸姜黄素纳米粒子的体内治疗效果评价
DSS诱导的结肠炎小鼠模型与人类UC相似，包括随后的体重减轻、结肠长度缩短、结肠上皮破坏和炎性细胞浸润。因此，本发明采用DSS诱导的UC小鼠来评价TA/CUR-NPs的体内治疗效果。
选25g左右的BALB/C实验小鼠分为5组，每组6只，分为模型组、空白组(健康组)、游离CUR组、CUR-NPs组和TA/CUR-NPs组。除健康组外，其余各组实验第1天将饮用水换成3％DSS水溶液，自由饮用7天后停止，换成灭菌一次水。实验第3天开始给药。姜黄素溶解在含10％吐温-80的生理盐水中，制备成游离姜黄素溶液，用于游离大黄酸组灌胃。游离大黄酸给药组(游离CUR组)和载药纳米组(CUR-NPs组和TA/CUR-NPs组)采用相同的给药量，为50mg(姜黄素)/kg(小鼠体重)，共给药7天，每日记录大鼠体重变化，观察大便性状，便血情况，计算DAI(DAI评分标准见表2)，DAI＝(体重下降分数+大便性状分数+便血分数)。
表2.DAI评分标准
Figure BDA0002880436370000111
在第10天点取出小鼠结肠，然后成像和测量。如图6A和6B所示，对NPs治疗后的离体结肠及其长度的大体观察表明，它们明显长于DSS处理的模型组。值得注意的是，无论给药途径如何，TA/CUR-NPs组的结肠长度均明显长于游离CUR和CUR-NPs组(*p<0.05；**p<0.01)。这些结果表明TA/CUR-NPs对DSS诱导的典型结肠缩短有良好的抑制作用。
用DAI评分评估炎症严重程度，包括体重减轻、血尿、大便稠度和其他参数。图6C清楚地显示，从第5天开始，模型组的DAI评分显著高于正常组(p<0.05)，表明模型已经成功建立。此外，从第6天到第10天，TA/CUR-NPs组的DAI评分低于其他三组(模型组、游离CUR组和CUR-NPs组)。特别是在终点时，TA/CUR-NPs组小鼠的DAI评分为1.17±0.41，与正常组相似。这表明TA/CUR-NPs具有良好的疗效。另外，体重也是评价某种药物对DSS诱导的UC小鼠模型疗效的重要指标。如图6D所示，由于DSS对小鼠的负面影响，模型组在10天后体重下降了30％，但值得注意的是，经TA/CUR-NPs处理的小鼠体重与初始体重几乎相同，只有轻微变化。相比之下，用游离CUR或CUR-NPs治疗的小鼠的体重下降总是高于TA/CUR-NPs组。总的来说，这些发现表明了TA/CUR-NPs的良好疗效，效果显著优于用游离CUR或CUR-NPs治疗。
为进一步证实上述结果和TA/CUR-NPs的毒性，进行了结肠及其他器官的H&E染色分析。如图6E所示，与正常组相比，DSS引起了严重的粘膜损伤，包括炎性细胞的局部内流、隐窝丢失和结肠组织坏死。相反，CUR-NPs组和TA/CUR-NPs组小鼠的隐窝更完整，表明CUR-NPs和TA/CUR-NPs均能改善结肠炎症的症状和体征。值得注意的是，治疗后，所有小鼠的主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)均未显示任何损伤的组织病理学证据(图7)。这些结果表明TA/CUR-NPs具有良好的生物相容性和低毒性。
采用ELISA试剂盒对小鼠结肠进行评价，以确定TA/CUR-NPs治疗UC的疗效。首先，MPO主要由活化的中性粒细胞分泌，经常被用作判断炎症程度的指标。如图8A所示，模型组结肠MPO活性明显高于正常组。值得注意的是，TA/CUR-NPs组的结肠MPO活性在所有治疗组中最低，与模型组相比差异显著(p<0.01)。此外，肠粘膜的炎症包含一系列复杂的炎症介质，包括一氧化氮诱导酶(iNOS)和与炎症程度相关的细胞因子(如白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β))。如图8B所示，模型组IL-6、TNF-α、IL-1β和iNOS的分泌水平显著升高。同时，TA/CUR-NPs能有效降低IL-6、TNF-α、IL-1β和iNOS的分泌水平，与游离CUR、CUR-NPs和模型组相比，明显降低。(*p<0.05；**p<0.01)。总的来说，这些结果表明TA/CUR-NPs在抑制UC的炎症作用方面具有极好的能力。
TLR4信号通路是涉及一系列蛋白质和细胞因子的经典通路。该信号通路介导炎症反应，在UC发病机制中起关键作用。姜黄素被证实为活性化合物在通过TLR4/NF-κB信号通路治疗UC。因此通过免疫印迹分析评估典型蛋白(如TLR4、MyD88和NF-κB)来探讨TA/CUR-NPs在这一途径中的作用。结果如图8C所示，结肠炎诱导模型组结肠组织TLR4、MyD88和NF-κB p65总蛋白表达显著高于正常组(p<0.01)。然而，TA/CUR-NPs组与其他三组相比，这三种蛋白的表达显著降低(*p<0.05；**p<0.01)。综上所述，这些结果表明CUR-NPs和TA/CUR-NPs通过TLR4信号途径具有良好的抑制作用，且TA/CUR-NPs效果更优。TA/CUR-NPs对DSS诱导的小鼠结肠炎的抗炎作用可能与TLR4连接的NF-κB信号的抑制有关。
综上，本发明开发了一种稳定的药物递送系统用于UC的治疗，能够依附黏附于结肠炎症的部位，该药物递送系统为单宁酸载药纳米粒子。具体的，本发明制备了一种单宁酸姜黄素纳米粒子(TA/CUR-NPs)，本发明TA/CUR-NPs具有良好的尺寸可控性能，粒径分布均匀，形态大小均一，表面带负电，较高的CUR包封效率。Gnp和TA对维持TA/CUR NPs的稳定性都具有显著贡献。更具体地说，Gnp有助于稳定HSA，并通过交联提高其包封率。相比之下，TA可防止胃肠道对于NPs破坏。体外研究表明，TA/CUR NPs能够以时间和剂量依赖的方式提高细胞摄取效率。与游离CUR或CUR-NPs相比，TA/CUR-NPs具有更高的细胞摄取效率。体内研究进一步证实，TA/CUR-NPs对结肠病变部位具有良好的黏附能力。重要的是，TA/CUR-NPs可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，抑制TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS等促炎性细胞因子的表达，改善DSS诱导的小鼠结肠炎。TA/CUR-NPs治疗UC的效果显著优于游离CUR和CUR-NPs，TA/CUR-NPs是治疗UC的一种有前途的口服给药系统。
目前治疗UC的药物主要有5-氨基水杨酸(5-ASA)、糖皮质激素、免疫调节剂和生物制剂等，临床上常有严重的副作用。姜黄素是一种功能性食品衍生化合物，具有良好的生物相容性，具有抗炎、抗氧化、杀菌等多种药理活性。为了提高姜黄素治疗UC的疗效，人们设计了多种纳米系统。与以往的研究相比，本发明研究了一种单宁酸载药纳米粒子，特别制备了单宁酸姜黄素纳米粒子，该纳米粒子具有几个明显的优点：首先，纳米粒子(NPs)来源于食品级材料，其毒性远低于其他合成的化学纳米材料。其次，NPs的稳定和药物包封率有显著提高。同时，NPs可以被递送并黏附到目标病灶，具有靶向作用。此外，经口给药后，本发明NPs更稳定，NPs可以免受胃环境的破坏性影响，其工作性能优于以往报道的其他纳米递药系统。特别地，本发明TA/CUR-NPs能够有效治疗UC，且治疗UC的效果显著优于游离CUR和CUR-NPs。因此，本发明有别于以往的纳米系统研究，为UC的治疗提供了一种更具前景的口服给药系统。

Claims (13)

1.一种单宁酸载药纳米粒子，其特征在于：它是由如下重量配比的原料制备而成：人血清白蛋白80～100份，京尼平10～50份，药物1～20份，单宁酸10～50份；所述药物为姜黄素；
所述单宁酸载药纳米粒子通过如下步骤制备而成：
(1)将人血清白蛋白溶于去离子水中，得人血清白蛋白溶液；然后将京尼平和药物溶于有机溶剂中，得有机相；
(2)将有机相加入人血清白蛋白溶液中，超声，形成水包油乳液；
(3)将步骤(2)所得的水包油乳液室温下搅拌消除残留有机溶剂，进行高压匀质，交联，过滤，得药物纳米粒子；
(4)将单宁酸添加到药物纳米粒子中，搅拌、离心、洗涤、冻干，即得；
步骤(1)和步骤（3）中，所述有机溶剂为丙酮。
2.根据权利要求1所述的单宁酸载药纳米粒子，其特征在于：它是由如下重量配比的原料制备而成：人血清白蛋白90～100份，京尼平20～40份，药物1～10份，单宁酸20～40份。
3.根据权利要求2所述的单宁酸载药纳米粒子，其特征在于：所述人血清白蛋白和药物的质量比为100:(3～9)。
4.根据权利要求3所述的单宁酸载药纳米粒子，其特征在于：所述人血清白蛋白和药物的质量比为100:(3～5)。
5.根据权利要求4所述的单宁酸载药纳米粒子，其特征在于：所述人血清白蛋白和药物的质量比为100:5。
6.根据权利要求5所述的单宁酸载药纳米粒子，其特征在于：所述单宁酸载药纳米粒子是由如下重量配比的原料制备而成：人血清白蛋白100份，京尼平20份，药物5份，单宁酸20份。
7.一种制备权利要求1～6任一项所述的单宁酸载药纳米粒子的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)将人血清白蛋白溶于去离子水中，得人血清白蛋白溶液；然后将京尼平和药物溶于有机溶剂中，得有机相；
(2)将有机相加入人血清白蛋白溶液中，超声，形成水包油乳液；
(3)将步骤(2)所得的水包油乳液室温下搅拌消除残留有机溶剂，进行高压匀质，交联，过滤，得药物纳米粒子；
(4)将单宁酸添加到药物纳米粒子中，搅拌、离心、洗涤、冻干，即得；
步骤(1)和步骤（3）中，所述有机溶剂为丙酮。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
步骤(2)中，所述将有机相加入人血清白蛋白溶液中为在恒速搅拌下滴入人血清白蛋白溶液中；
和/或，步骤(2)中，所述超声为以70％的振幅功率超声6～10分钟；
和/或，步骤(3)中，所述室温下搅拌为室温下以400转/分钟搅拌6小时；
和/或，步骤(3)中，所述高压匀质条件为在700-800bar的室温下进行10～15次匀质循环；
和/或，步骤(3)中，所述交联为400rpm的室温下连续搅拌16小时；
和/或，步骤(3)中，所述过滤为0.85μm过滤器过滤；
和/或，步骤(4)中，所述搅拌为在室温下以400转/分钟恒速搅拌30～60分钟，
和/或，步骤(4)中，所述离心为以12000转/分的转速离心15分钟。
9.权利要求1～6任一项所述的载药纳米粒子在制备药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述药物为口服药物。
11.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述药物为治疗结肠疾病的药物。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于：所述药物为治疗溃疡性结肠炎的药物。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于：所述药物是对溃疡性结肠炎有粘附作用的药物。
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